CZ20031982A3 - Izolované molekuly zahrnující epitopy obsahující sulfatované sloučeniny, protilátky proti takovým epitopům a jejich použití - Google Patents

Description

IZOLOVANÉ MOLEKULY ZAHRNUJÍCÍ EPITOPY OBSAHUJÍCÍ

SULFATOVANÉ SLOUČENINY, PROTILÁTKY PROTI TAKOVÝM EPITOPŮM A

JEJICH POUŽITÍ

OBLAST TECHNIKY [1.] Předkládaný vynález se týká epitopů, které jsou přítomny na buňkách, metastatických buňkách, leukemických buňkách a destičkách, a které jsou významné v tak odlišných fyziologických fenoménech, jako je buněčné rolování (rolling, zpomalený pohyb), metastáza, zánět, autoimunitní onemocnění, jako je idiopatická trombocytopenická purpura (ITP), adheze, trombóza a/nebo restenóza a agregace. Předkládaný vynález se týká terapeutických a diagnostických metod a kompozicí používajících protilátky namířené proti takových epitopům. Předkládaný vynález se rovněž týká oblasti tkáňového cílení a identifikace, s využitím metody fágového displeje (phage display technology), peptidů a polypeptidů, které se specificky vážou k cílovým buňkám. Takovými peptidy a polypeptidy jsou protilátky a jejich antigen vázající fragmenty, jejich konstrukty, fragmenty jak konstruktů, tak fragmentů. Konkrétněji, peptidy a polypeptidy mohou mít protirakovinnou aktivitu a/nebo aktivitu proti jiným nemocím, jako jsou zánětlivá onemocnění, onemocnění zahrnující abnormální nebo patogenní adhezi, trombózu a/nebo restenózu, onemocnění zahrnující abnormální nebo patogenní agregaci, autoimunitní onemocnění, kardiovaskulární nemoci, jako je infarkt myokardu, retinoplastické nemoci, nemoci způsobené interakcemi protein dependentní na sulfatovaném tyrosinu-protein, a nemocné buňky všeobecně.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY [2.] Tkáňové selektivní cílení terapeutických látek je nově vznikající disciplínou ve farmaceutickém průmyslu.

Nová léčba rakoviny na základě cílení byla navržena ke zvýšení specifičnosti a účinnosti léčby za snížení toxicity, a tím zvýšení celkové účinnosti. Byly vyvinuty myší monoklonální protilátky (MAb's) proti antigenům asociovaným s nádory ve snaze o cílení toxinu, radionukleotidu a chemoterapeutických konjugátů na nádory. Kromě toho byly diferenciační antigeny, jako CD19, CD20, CD22 a CD25, využity jako nádorově specifické cíle v ošetřování hematopoetických malignit. Ačkoliv byl tento postup rozsáhle studován, má několik omezení. Jedním z omezení je obtížnost izolace vhodných monoklonálních protilátek, které vykazují selektivní vazbu. Druhým omezením je potřeba vysoké protilátkové imunogenity, jako předpokladu pro úspěšnou izolací protilátky. Třetím omezením je vyvolání imunitní odpovědi u pacienta proti myším protilátkám (human anti-mouse antibody - HAMA response), která má často za následek kratší biologický poločas myší protilátky v séru, brání opakovaným ošetřením, čímž snižuje terapeutickou hodnotu protilátky. Poslední uvedené omezení stimulovalo zájem jak o konstruování chimérických nebo humanizovaných monoklonálních protilátek myšího původu, tak i o nalezení lidských protilátek. Dalším omezením tohoto přístupu je skutečnost, že umožňuje izolaci pouze jednoho druhu protilátky proti pouze známým a purifikovaným antigenům. Kromě toho, tento způsob až dosud nebyl selektivní, neboť umožňuje izolaci protilátek proti markérům buněčného povrchu přítomným na normálních, stejně jako na maligních buňkách.

[3.] Existuje mnoho faktorů, které ovlivňují terapeutickou účinnost monoklonálních protilátek (Mab's) pro léčbu rakoviny. Tyto faktory zahrnují specifičnost exprese antigenu na nádorové buňce, hladinu exprese, antigenní heterogenitu a dostupnost hmoty nádoru. Leukemie a lymfomy jsou obecně citlivější na léčbu protilátkami, než pevné nádory, jako jsou karcinomy. Mab's se rychle vážou k leukemickým a lymfatickým buňkám v krevním řečišti a snadno penetrují k maligním buňkám v lymfatických tkáních, čímž se lymfoidní nádory stávají vynikajícími kandidáty na léčbu s pomocí monoklonálních protilátek. Ideální systém by měl přinášet identifikaci Mab, která rozpoznává markéry na buněčném povrchu kmenových buněk, jež produkují maligní buněčné potomstvo.

[4.] Fágové knihovny byly použity pro selekci náhodných jednořetězcových Fv's (scFv's), které se vážou k izolovaným, predeterminovaným cílovým proteinům, jako jsou protilátky, hormony a receptory. Kromě toho, použití protilátkových displejových (expozičních) knihoven (antibody display libraries) obecně a fágových scFv knihoven obzvláště napomáhá alternativnímu způsobu nalezení jedinečných molekul pro cílení na specifické, dosud nerozpoznané a neurčené látky buněčného povrchu.

[5.] Leukemie, lymfomy a myelomy jsou nádory, které vznikají v kostní dřeni a lymfatických tkáních a jsou zapojeny do nekontrolovaného růstu buněk. Akutní lymfoblastická leukemie („ALL) je heterogenní onemocnění, které je definováno specifickými klinickými a imunologickými znaky. Tak, jako u jiných forem ALL, nejsou rozhodující příčiny většiny případů B-buněčné ALL („B-ALL) známy, ačkoliv v mnoha případech vzniká onemocnění na • · · základě získaných genetických změn v DNA jedné buňky, které způsobují, že se buňka stává abnormální a kontinuálně se množící. Prognóza pacientů postižených B-ALL je signifikantně horší, než prognóza pacientů s jiným typem leukemie, jak u dětí, tak u dospělých.

[6.] Akutní myeloidní leukemie (AML) je heterogenní skupina neoplazmat (novotvarů) s progenitorovou buňkou, která za normálních podmínek dává vzniknout terminálně diferencovaným buňkám z myeloidní řady (erytrocytům, granulocytům, monocytům a destičkám). Podobně jako u jiných forem neoplasie, je AML spojena se získanými genetickými změnami, které vedou v záměnu normálně diferencovaných myeloidních buněk relativně nediferencovanými blasty, které vykazují jeden nebo více typů časné myeloidní diferenciace. Obecně se AML vyvíjí v kostní dřeni a v menším stupni v sekundárních hematopoetických orgánech. AML primárně postihuje dospělé s vrcholem incidence mezi 15. až 40. rokem věku, ale je rovněž známo, že postihuje jak děti, tak starší dospělé jedince. Téměř všichni pacienti s AML vyžadují léčbu bezprostředně po diagnóze, aby bylo dosaženo klinické remise, ve které nejsou prokazatelné abnormální hladiny cirkulujících nediferencovaných blastických buněk.

[7.] Až dosud byla připravena řada monoklonálních protilátek, které indukují cytolytickou aktivitu proti nádorovým buňkám. Humanizovaná verze monoklonální protilátky MuMAb4D5, směrovaná na extracelulární doménu receptoru růstového faktoru P185 (HER2), byla povolena FDA (Food and Drug Administration) a používána k léčbě lidských nádorů prsu (US Patenty č. 5 821 337 a 5 720 954). Po navázání je protilátka schopna inhibovat růst nádorových buněk, který je závislý na receptoru růstového faktoru « · • · · · · · • · · · · · • · ·· · · · · ·

HER2. Kromě toho byla nedávno FDA povolena chimérická protilátka proti CD20, která způsobuje rychlou depleci periferních B buněk, včetně těch, které jsou spojeny s lymfomem (US Patent č. 5 843 439). Vazba této protilátky na cílové buňky vyúsťuje v lyži dependentní na komplementu (complement-dependent lysis). Tento produkt byl nedávno povolen a je v současnosti používán v klinické léčbě „lowgrade B-cell non Hodgkin's lymphoma (pomalu rostoucího lymfoblastického lymfomu).

[8.] Ve vývoji je řada dalších humanizovaných a chimérických protilátek, nebo jsou používány v klinických zkouškách. Kromě toho, humanizovaný Ig, který specificky reaguje s antigenem CD33 exprimovaným na normálních myeloidních buňkách, stejně jako na většině typů myeloidních leukemických buněk, byl konjugován s protinádorovým léčivem calicheamicinem, CMA-676 (Sievers et al., Blood Supplement, 308, 504a (1997)). Tento konjugát, známý jako léčivo MYLOTARG®, získal nedávno schválení FDA (Caron et al., Cancer Supplement, 73, 10491056 (1994)). Vzhledem ke své cytolytické aktivitě byla další protilátka proti CD33 (HumMl95), která je v současnosti v klinických zkouškách, konjugována s několika cytotoxickými látkami, včetně geloninového toxinu (McGraw et al., Cancer Immunol.Immunother., 39, 367 374 (1994)), a radioizotopy ¹³¹I (Caron et al, Blood 83, 1760-1768 (1994)), ⁹⁰Y (Jurcic et al., Blood Supplement,

92, 613a (1998)) a ²¹³Bi (Humm et al., Blood Supplement, 38:231P (1997) ) .

[9.] Chimérická protilátka proti leukocytárnímu antigenu CD-45 (cHuLym3) je v preklinické fázi pro léčbu lidské leukemie a lymfomů (Sun et al., Cancer Immunol.

« ·

Immunother., 48, 595-602 (2000)) jako kondiciující pro transplantaci kostní dřeně. Ve zkouškách in vitro, byla pozorována specifická lyže buněk v testu ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) (Henkart, Immuníty,

1, 343-346 (1994); Squier and Cohen, Current Opin.Immunol., 6, 447-452 (1994)).

[12.] Na rozdíl od humanizace myších monoklonálních protilátek a konstrukce chimérických protilátek, umožňuje použití metody fágového displeje izolaci scFv's zahrnujících plně lidské sekvence. Nedávno byla vyvinuta zcela lidská protilátka proti lidskému receptoru TGFb2, založená na klonu scFv odvozeném pomocí metody fágového displeje. Tento scFv, převedený do plně lidského IgG4, který je schopen kompetice o vazbu s TGFb2 (Thompson et al., J. Immunol. Methods, 227, 17-29 (1999), má silnou antiproliferativní aktivitu. Tato technologie, známá odborníkům v oboru, je detailněji popsaná v následujících publikacích: Smith, Science, 228, 1315 (1985); Scott et al., Science, 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS, 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249, 404-406 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 13(14), 3245-3260 (1994); Bass et al., Proteins, 8, 309-314 (1990);

McCafferty et al., Nátuře, 348, 552-554 (1990); Nissim et al., EMBO J. , 13, 692-698 (1994); US Patenty č. 5 427 908,

432 018, 5 223 409 a 5 403 484, lib.

Ligand pro izolované protilátkové molekuly scFv [11.] Destičky, fibrinogen, GPIb, selektiny a PSGL-1 mají významnou úlohu v řadě patogenních stavů nebo stavů nemoci, jako jsou abnormální nebo patogenní zánět, abnormální nebo patogenní imunitní reakce, autoimunitní • ·

• · ··· · · reakce, metastázy, abnormální nebo patogenní adheze, trombóza a/nebo restenóza a abnormální nebo patogenní agregace. Z tohoto důvodu protilátky, které křížově reagují s destičkami a s těmito molekulami, mohou být užitečné pro diagnostiku a léčbu nemocí a poruch zahrnujících tyto a jiné patogenní stavy.

Destičky [12.] Destičky jsou dobře charakterizované složky krevního systému a hrají řadu významných úloh v hemostázi, trombóze a/nebo restenóze a restenóze. Poškození krevních cév uvádí do pohybu proces známý jako hemostáze (zástava krvácení), který je charakterizován řadou následujících pochodů. První reakcí na poraněných krevních cév je adheze destiček k zasažené oblasti na vnitřním povrchu cév. Dalším krokem je agregace mnoha vrstev destiček na dříve adherované destičky za tvorby hemostatického koláče. Tento koláč z destiček uzavírá stěny cévy. Hemostatický koláč je zesílen ukládáním polymerů fibrinu. Sraženina je rozpuštěna pouze tehdy, jestliže je poranění zahojeno.

Význam destiček v metastáze [13.] Nádorová metastáza je možná nejvýznamnějším faktorem limitujícím přežití pacientů s rakovinou. Souhrnné údaje demonstrují, že schopnost nádorových buněk vzájemně působit na destičky hostitele znamená jednu z nepostradatelných determinant metastázy. Leslie

Oleksowicz, Z.M.:Characterization Of Tumor-Induced

Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb And GPIIb/IIIa Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells, Thrombosis Research 79: 261-274 (1995).

• « [14.] Bylo prokázáno, že schopnost nádorových buněk agregovat destičky koreluje s metastázovým potenciálem nádorových buněk, a u hlodavčích modelů bylo prokázáno, že inhibice nádory indukované agregace destiček koreluje se supresí metastázy. Bylo prokázáno, že interakce nádorových buněk s destičkami zahrnuje molekuly adherované na membráně a sekreci agonistů. Byla identifikována exprese imunologicky příbuzných glykoproteinů na liniích nádorových buněk. Bylo prokázáno, že destičkové imunologicky příbuzné glykoproteiny, GPIb, GPIIb/IIIa, GPIb/IX a podjednotka a integrinu jsou exprimované na povrchu linií buněk z nádorů prsů. Oleksowicz, Z.M.: Characterization Of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb And GPIIb/IIIa Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells, Thrombosis Research 79: 261-274 (1995); Kamiyama, M. et al., „Inhibition of platelet GPIIb/IIIa binding to fibrinogen by sérum factors: studies of circulating immune complexes and platelet antibodies in patients with hemophilia, immune thrombocytopenic purpura, human immunodeficiency virus-related immune thrombocytopenic purpura, and systemic lupus erythematosus, J. Lab. Clin. Med. 117 (3) : 209-17 (1991) .

[15.] Gasic (J.T.B.Gasic et al., Proč. Nati. Acad. Sel. USA 61:46-52 (1968) a spolupracovníci prokázali, že protilátkou indukovaná trombocytopenie významně redukovala počet- a objem metastází produkovaných střevním adenokarcinomem CT26, Lewisovým plicním karcinomem a melanomem B16. Karpatkin, S. et al. „Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo, J. Clin.Invest. 81(4): 1012-9 (1988); Clezardin, P. et al., „Role of platelet membrane • · • · glycoproteins Ib/IX and Ilb/IIIa, and of platelet alphagranule proteins in platelet aggregation induced by human osteosarcoma cells, Cancer Res. 53(19): 4695-700 (1993). Kromě toho bylo zjištěno, že na povrchové membráně buněk HELL je exprimován jedinečný polypeptidový řetězec (60kd), který je úzce příbuzný ke GPIb a odpovídá nekompletní nebo abnormální O-glykosylované a podjednotce GPIb. Kieffer, N. et al., „Expression of platelet glycoprotein Ib alpha in HEL cells, J.Biol. Chem. 261(34): 15854-62 (1986).

Komplex GPIb [16.] Každý krok v procesu hemostáze vyžaduje přítomnost receptorů na povrchu destiček. Jedním z receptorů, který je v hemostázi významný, je glykoproteinový komplex Ib-IX (rovněž známý jako CD42). Tento receptor zprostředkovává adhezi (počáteční přichycení) destiček v místě poškození cévní stěny vazbou na von Willebrandův faktor (vWF) v subendotelu. Má rovněž rozhodující úlohu ve dvou dalších funkcích destiček významných v hemostase (a)v agregaci destiček indukované vysokým silovým namáháním v oblastech arteriální stenózy (cévního zúžení) a (b) v aktivaci destiček indukované nízkou koncentrací trombinu.

[17.]. Komplex GPIb-IX je jednou z hlavních komponent vnějšího povrchu destičkové plasmatické membrány. Komplex GPIb-IX obsahuje tři membránově vázané polypeptidy - 130 kDa α-podjednotku a 25 kDa β-podjednotku řetězce GPIb spojené disulfidovým můstkem a nekovalentně připojený GPIX (22 kDa). Všechny čtyři jednotky jsou přítomny v ekvimolárním množství na membráně destiček pro účinnou expresi na buněčném povrchu a funkci komplexu CD42, což • · • ····· · · · ··»»» • ···· ···

10.............

naznačuje, že správné skládání třech podjednotek do komplexu je nutné pro plnou expresi na plasmatické membráně. Řetězec a GPIb sestává ze tří odlišných strukturálních domén: (1) globulární N-koncové domény, obsahující na leucin bohaté opakující se sekvence a lemující sekvence s vazbami na Cys; (2) vysoce glykosylované mucinu podobné (mucine-like) makroglykopeptidové domény; a (3) s membránou asociovaná Ckoncová oblast, která obsahuje disulfidový můstek k GPIbP a transmembránové a cytoplasmatické sekvence.

[18.]. Řada důkazů naznačuje, že vWF a vazebná doména GPIb-IX komplexu pro trombin jsou umístěny v globulární oblasti, která zahrnuje přibližně 300 aminokyselin na aminokonci GPIba. Lidský destičkový komplex GPIb-IX je klíčovým membránovým receptorem zprostředkujícím jak funkci destiček, tak jejich reaktivitu. Rozpoznání vWF vázaného v subendotelu pomocí GPIb umožňuje destičkám adherovat na poškozené stěny cév. Kromě toho vazba vWF k GPIba rovněž indukuje aktivaci destiček, která může zahrnovat interakci cytoplasmatické domény GPIb-IX s cytoskeletem nebo fosfolipázou A2. Mimo to obsahuje GPIba vazebné místo s vysokou afinitou pro α-trombin, které usnadňuje aktivaci destiček způsobem, jehož mechanismus až dosud nebyl úspěšně stanoven.

[19.]. N-koncová globulární doména GPIba obsahuje seskupení (cluster) negativně nabitých aminokyselin. Řada důkazů naznačuje, že v transfektovaných buňkách CHO, exprimující komplex GPIb-IX, a v destičkovém GPIba jsou tři zbytky tyrosinu obsažené v této doméně (Tyr-276, Tyr278 a Tyr-279) podléhají sulfataci.

• · • ·

Sulfatace proteinů [20.]. Sulfatace proteinů je široce rozšířenou posttranslační modifikací, která zahrnuje enzymatické kovalentní připojení síranu, buďto k bočnímu řetězci cukru, nebo k páteři polypeptidu. Uvedená modifikace vzniká v trans-Golgiho kompartmentů, a proto působí pouze na protein, který prochází napříč tímto kompartmentem. Takové proteiny zahrnují sekreční proteiny, proteiny vylučované v granulích a extracelulární oblasti plasmatických membránových proteinů. Dosud je známo, že aminokyselinovým zbytkem, který podléhá sulfataci je tyrosin. J.W.Kehoe et al., Chemistry and Biol., Ί, R57-R61 (2000). Jiné aminokyseliny, například threonin, mohou rovněž podléhat sulfataci, konkrétně v nemocných buňkách.

[21.]. Byla nalezena celá řada proteinů, které mají sulfatovaný tyrosin, avšak přítomnost tří nebo více sulfatovaných tyrosinů v jediném peptidu tak, jak to bylo zjištěno u GPIb, není běžná. GPIba (CD42), který je exprimován destičkami a megakaryocyty, zprostředkovává přichycení destiček a jejich rolování po subendotelu pomocí vazby s vWF, rovněž obsahuje řadu negativních nábojů na své N-koncové doméně. Takové vysoce kyselé a hydrofilní prostředí je považováno za předpoklad pro sulfataci, neboť tyrosylprotein sulfotransferáza specificky rozpoznává a sulfatuje tyrosiny bezprostředně sousedící se zbytky kyselých aminokyselin. J.R.Bundgaard et al., JBC 272:2170021705 (1997). Plná sulfatace kyselé oblasti GPIba poskytuje oblast s mimořádnou hustotou negativního náboje 13 negativních nábojů uvnitř úseku 19 aminokyselin, která je vhodným kandidátským místem pro elektrostatické interakce s jinými proteiny.

» · • · • · • · · • · · [22.]. Selektiny P-, E- a L- jsou rodinou adhezních molekul, které mimo jiné funkce zprostředkovávají rolování leukocytů po cévním endotelu. P-Selektin je uložen v destičkách v granulích a je po aktivaci trombinem, histaminem, esterem forbolu a jinými stimulačními molekulami transportován k povrchu. P-Selektin je rovněž exprimován na aktivovaných endoteliálních buňkách. ESelektin je exprimován na endoteliálních buňkách a LSelektin je exprimován na neutrofilech, monocytech, Tbuňkách a B-buňkách.

[23.]. Glykoproteinový ligand-1 P-Selektinu (PSGL-1, rovněž nazývaný CD 162) je mucinový glykoproteinový ligand P-Selektinu, E-Selektinu a L-Selektinu. PSGL-1 je homodimer spojený disulfidovým můstkem, který má štěpné místo PÁCE (Paired Basic Amino Acid Converting Enzymes). Rovněž má PSGL-1 tři potenciální tyrosinová místa pro sulfataci, následovaná přibližně 15 dekamerovými opakujícími se sekvencemi, které jsou bohaté na prolin, serin a threonin. Extracelulární část PSGL-1 obsahuje tři N-vázaná glykosylační místa a má řadu sialylovaných, fukosylovaných O-vázaných oligosacharidových postranních řetězců.

K.L.Moore et al., JBC 118:445-456 (1992). Většina Nglykanových míst a mnohé z O-glykanových míst jsou obsazeny. Podskupinou těchto O-glykanů jsou „core-2, sialylované a fukosylované struktury, které jsou vyžadovány pro vazbu selektinů. Sulfatace tyrosinu aminoterminální části PSGL-1 je rovněž nezbytná pro vazbu P-Selektinu a LSelektinu. Kromě toho existuje N-koncový propeptid, který je pravděpodobně posttranslačně odštěpován.

• ·· ·’ · ·« · • · · · ·>·· « · · • · · · · ♦ · · · · • ··>·· · · ·· »···· • ♦ · · · ···

13..........

[24.]. PSGL-1 má v buňkách HL60 361 aminokyselinových zbytků, 267 zbytků v extracelulární oblasti, 25 zbytků v transmembránové oblasti a 69 zbytků v intracelulární oblasti. Sekvencí kódující PSGL-1 je jediný exon, takže alternativní sestřih (alternativě splicing) není možný. Nicméně, PSGL-1 v buňkách HL60 a ve většině buněčných linií má 15 následujících, opakujících se, konsensus sekvencí z 10 aminokyselinových zbytků přítomných v extracelulární oblasti, ale také existuje 14 a 16 opakování této sekvence v polymorfonukleárních leukocytech, monocytech a řadě jiných buněčných linií, včetně většiny nativních leukocytů PSGL-1 tvoří homodimer spojený disulfidovými můstky na buněčném povrchu. V.Afshar-Kharghan et al., Blood 97:33063312 (2001).

[25]. PSGL-1 je exprimován na neutrofilech jako dimer se zjevnou molekulovou hmotností 250 kDa a 160 kDa, zatímco na HL60 je dimerní forma 220 kDa. Jestliže je analyzována za redukčních podmínek, je.každá podjednotka redukována z poloviny. Rozdíly v molekulové hmotnosti mohou být způsobeny polymorfismem v molekule, díky přítomnosti odlišného počtu opakujících se dekamerních sekvencí. Leukocyte Typing VI. Edited by T.Kishimoto et al. (1997).

[26.]. PSGL-1 je exprimován na většině krevních leukocytů, jako jsou neutrofily, monocyty, leukocyty, podtřída B buněk a všechny T-buňky, a zprostředkovává rolování (rolling) neutrofilů na P-Selektin. Leukocyte Typing VI. Edited by T.Kishimoto et al. (1997). PSGL-1 může také zprostředkovávat interakci neutrofil-neutrofi1 prostřednictvím vazby s L-Selektinem, a tím zprostředkovávat zánět. Snapp, et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998) .

·· ·*·

[27.]. PSGL-1 zprostředkovává rolování leukocytů na aktivovaném endotelu, na aktivovaných destičkách a na jiných leukocytech a místech zánětu.

[28.]. Byly připraveny komerčně dostupné protilátky proti lidskému PGSL-1 a KPL1 ; bylo prokázáno, že inhibují interakci mezi PGSL-1 a P-Selektinem a mezi PGSL-1 a LSelektinem. Epitop KPLl byl mapován až k tyrosinovému sulfatačnímu konsensus motivu z PGSL-1 (YEYLDYD) (Snapp et al., Blood, 91(1):154-164 (1998). KPLl rozpoznává pouze tento zvláštní epitop a nereaguje křížově se sulfatovanými epitopy přítomnými na jiných buňkách, jako jsou buňky BCLL, buňky AML, metastatické buňky, buňky mnohočetného myelomu a podobně.

[29.]. Při zánětu je významné rolování leukocytů a interakce mezi P-Selektinem (exprimovaným aktivovaným endotelem a na destičkách, které mohou být imobilizovány v místě poškození) a PSGL-1 napomáhá připojení a rolování leukocytů na stěny cév. Ramachadran et al., PNAS, 98(18):10166-71 (2001); Afshar-Kharghan, et al., Blood, 97(10):3306-7 (2001).

[30.]. Rolování buněk je rovněž významné v metastáze, předpokládá se, že P- a E-Selektin na endotelových buňkách váže metastatické buňky, čímž umožňuje jejich extravazaci z proudu krve do obklopujících tkání.

[31.]. Destičky jsou rovněž zúčastněny v procesu metastáze; jestliže metastatické buňky vstoupí do krevního řečiště, vytvářejí se mnohobuněčné komplexy složené z destiček a leukocytů obalujících nádorové buňky. Tyto komplexy, které mohou být nazývány jako mikroembolie, pomáhají nádorovým buňkám uniknout pozornosti imunitního systému. Obalení nádorových buněk destičkami vyžaduje expresi R-Selektinu destičkami.

[32.]. Působení heparinu, inhibitoru P- a L-Selektinu, inhibuje interakci mezi nádorovou buňkou a destičkou.

Rovněž zpracování nádorových buněk předem O-sialoproteázou, která odstraňuje sialylované, fukosylované mucinové ligandy, inhibuje tvoru komplexů nádorová buňka-destička. Pokusy in vivo dokládají, že oba tyto způsoby ošetření vedou k větší asociaci monocytů s cirkulujícími nádorovými buňkami, což naznačuje, že snížení vazby destiček zvyšuje přístup imunitních buněk k cirkulujícím nádorovým buňkám. Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6):711-7 (2001).

[33.]. PSGL-1 a GPIb sdílejí strukturální podobnost a mají mucinu podobné, silně glykosylované vazebné oblasti pro ligand. Afshar-Kharghan, et al., Blood 97 (10): 3306-7 (2001).

[34.]. PSGL-1 byl nalezen na všech leukocytech: neutrofilech, monocytech, lymfocytech, aktivovaných periferních T-buňkách, granulocytech, eosinofilech, destičkách a na některých CD34 pozitivních kmenových buňkách a určité podskupině B-buněk. P-Selektin je selektivně exprimován na aktivovaných destičkách a na endotelových buňkách. Interakce mezi P-Selektinem a PSGL-1 podporuje rolování leukocytů na cévní stěny a abnormální akumulace leukocytů na vaskulárních místech vede k různým patologickým zánětům. Stereospecifické příspěvky jednotlivých tyrosinových sulfátů na PSGL-1 jsou významné pro vazbu P-Selektinu k PSGL-1. Náboj je rovněž významný pro vazbu: snížení NaCl (ze 150 na 50 mM) zvyšovalo vazbu • · (Kd ~75 nM). Sulfatace tyrosinu na PSGL-1 zvyšuje, avšak není nezbytně vyžadována pro adhezi PSGL-1 na P-Selektin. PSGL-1 tyrosinová sulfatace podporuje pomalejší adhezi rolování při všech intenzitách silového namáhání a podporuje adhezi rolování při mnohem vyšších intenzitách silového namáhání (Rodgers S.D., et al., Biophys J. , 81:2001-9 (2001)).

Fibrinogen [35.]. Existují dvě formy normálního lidského fibrinogenu: fibrinogen major a fibrinogen (primární varianta minor), z nichž každá je nalézána u normálních jedinců. Normální fibrinogen, který je hojnější formou (tvořící ~ 90 % fibrinogenu nalézaného v těle) je složen ze dvou identických 55 kDa alfa (a) řetězců, dvou identických 95 kDa beta (β) řetězců a dvou identických 49,5 kDa gamma (γ) řetězců. Normální variantní fibrinogen, který je méně hojnou formou (tvořící ~ 10 % fibrinogenu nalézaného v těle)je složen ze dvou identických 55 kDa alfa (a) řetězců, dvou identických 95 kDa beta (β) řetězců a jednoho 50,5 kDa gamma prime(γ') řetězce. Oba řetězce, tj. řetězec gamma a řetězec gamma prime jsou kódovány stejným genem s alternativním sestřihem vyskytujícím se na 3' konci. Normální řetězec gamma sestává z 1-411 aminokyselin. Normální řetězec gamma prime sestává ze 427 aminokyselin: aminokyseliny 1-407 jsou shodné, jako v normálním gamma řetězci, a aminokyselinami 408-427 jsou

VRPEHPAETEYDSLYPEDDL. Normálně je tato oblast obsazena trombinovými molekulami.

[36.]. Fibrinogen je přeměněn na fibrin působením trombinu v přítomností iontů vápníku, což vede ke koagulaci • · · · krve. Fibrin je rovněž složkou trombů a exudátů akutních zánětů.

[37.]. Destičky a molekuly (jako fibrinogen, GPIb, selektiny a PSGL-1), které hrají významnou roli v interakcích buňka-buňka, interakcích buňka-matrix, interakcích destička-destička, interakcích destička-buňka, interakcích destička-matrix, buněčném rolování a adhezi a hemostáze mají rovněž významnou úlohu v patogenních stavech nebo stavech onemocnění, jako je abnormální nebo patogenní zánět, abnormální nebo patogenní imunitní reakce, autoimunitní reakce, metastáza, abnormální nebo patogenní adheze, trombóza a/restenóza, abnormální nebo patogenní agregace. Z tohoto důvodu protilátky, které křížově reagují s destičkami a s těmito molekulami, mohou být užitečné v diagnostice a léčbě nemocí a poruch zahrnujících tyto a jiné patogenní stavy. Existuje proto potřeba identifikovat obecné epitopy uvnitř nebo mezi těmito molekulami a potřeba identifikovat protilátky schopné s nimi křížově reagovat.

[38.]. Protilátky mohou být poskytnuty v mnoha formách, jako jsou fragmenty, komplexy a multimery. Příklady takových protilátkových fragmentů zahrnují jednořetězcové Fv (scFv) fragmenty a fragmenty Fab.

[39.] Bylo prokázáno, že scFv penetrují tkáněmi a jsou odstraněny z krve rychleji než protilátka o úplné velikosti, protože mají menší velikost. Adams, G.P., et al.f Br.J.Cancer ΊΊ, 1405-1412 (1988); Hudson, P.J., Curr. Opin. Immunol. 11(5), 548-557 (1999); Wu, A.M., et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999). Z tohoto důvodu jsou scFv často použity v diagnostice zahrnující radioaktivní značky, jako je zobrazení nádorů, což umožňuje mnohem rychlejší • · • ·

odstranění radioaktivního značení z těla. Celá řada scFV multimerů cílených proti nádorům je v současné době v preklinickém hodnocení stability in vivo a účinnosti. Adams, G.P., et al., Br.J. Cancer 77, 1405-1412 (1988); Wu, A.M. et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999).

[40.] Jednořetězcové fragmenty Fv (scFv) jsou obsaženy ve variabilních doménách těžkých (V_H) a lehkých (V_L) řetězců protilátky, spojených dohromady polypeptidovým linkerem. Linker je dostatečně dlouhý, aby umožnil (V_H) a (V_L) doménám poskládání do funkční domény Fv, která umožňuje scFv rozpoznávat a vázat svůj cíl s podobnou nebo zvýšenou afinitou základní (parent) protilátky [41.] Monomery scFv jsou typicky navrhovány s C-koncem V_H domény připojeným polypeptidovým linkerem k N-terminálnímu zbytku V_L. Případně je zavedena inverzní orientace: C-terminální konec V_L domény je spojen s N-terminálním koncem V_H pomocí polypeptidového linkeru. Power, B., et al., J. Immun. Meth. 242, 193-204 (2000). Polypeptidový linker je typicky o délce přibližně dvanácti aminokyselinových zbytků. Jestliže je linker redukován na přibližně tři až sedm aminokyselin, nemohou se scFv poskládat do funkční domény Fv a místo tohoto asociují s druhým scFv za tvorby diabody (dimeru). Další snížení délky linkeru na méně než tři aminokyseliny podporuje asociaci scFv do trimerů nebo tetramerů v závislosti na délce linkeru, složení a doménové orientaci Fv. B.E.Powers, P.J.Hudson, J.Immuno. Meth. 242 (2000) 193-194.

[42.] Nedávno bylo prokázáno, že multivalentní protilátkové fragmenty, jako jsou dimery, trimery a tetramery, často poskytují vyšší afinitu k cíli ve srovnání s vazbou základní protilátky. Vyšší afinita nabízí mnoho výhod včetně ideální farmakologické kinetiky při cílených aplikacích na nádory. Kromě toho při studiu P-selektinu a jeho ligandu PSGL-1, které se účastní spojování a rolováníu leukocytů, odborníci došli k závěru, že buňky exprimující dimerní formy PSGL-1 nastolují stabilnější adhezi rolováníu, na základě vyšší vazebné afinity. Tyto adheze jsou odolnější k silovému namáhání a vykazují menší kolísání v rychlosti rolování. Ramachandran, et al. , PNAS, vol. 98 (18) : 10166-71 (2001).

[43.] Vyšší vazebná afinita těchto multivalentních forem je žádoucí v diagnostických a terapeutických režimech. Tak například, scFv může být použit jako blokující agens vazby cílového receptoru, a tím blokuje vázání „přirozeného ligandu. V takových případech je žádoucí mít vyšší afinitní asociaci mezi scFv a receptorem tak, aby byla snížena možnost oddělení, která může umožnit nežádoucí vazbu přirozeného ligandu na cíl. Kromě toho, tato vysoká afinita je významná zejména tehdy, jestliže cílové receptory jsou zúčastněny v adhezi a rolování (rolling), nebo, jestliže jsou cílové receptory na buňkách, které jsou přítomny v místech vysokého silového namáhání (high sheer flow), jakými jsou krevní destičky.

[44.] Cíl em vynálezu je poskytnout izolované epitopy, které jsou přítomny na různých molekulách a které napomáhají v takových procesech, jako je buněčné rolování, adheze, trombóza a/nebo restenóza a agregace, a které jsou přítomny na nemocných buňkách, jako jsou buňky AML, buňky B-CLL, buňky mnohočetného myelomu a metastatické buňky.

[45.] Jiným předmětem vynálezu je poskytnutí metod používajících takové izolované epitopy k přípravě protilátek, které rozpoznávají a křížově reagují s epitopy, jež jsou přítomny na molekulách, které napomáhají v takových procesech, jako je buněčné rolování, zánět, imunitní reakce, infekce, autoimunitní reakce, metastáza, adheze, trombóza a/nebo restenóza a agregace, a které jsou také přítomny na nemocných buňkách, jako jsou buňky AML, buňky B-CLL, buňky mnohočetného myelomu a metastatické buňky.

[46.] Další předměty podle vynálezu zahrnují použití takových protilátek ve vývoji a poskytnutí léčiv pro inhibici buněčného rolování, zánětu, imunitní reakce, infekce, autoimunitních reakcí, metastáz, adheze, trombózy a/nebo restenózy a agregace, a pro léčbu nemocí, jako je AML, B-CLL, mnohočetný myelom, metastázy, kardiovaskulární nemoci, jako je infarkt myokardu, retinopatická onemocnění, nemoci způsobené interakcemi sulfatovaný tyrosindependentní protein - protein, nebo jiné nemoci, ve kterých takové buněčné funkce nebo účinky hrají signifikantní úlohu.

[47.] Předmětem vynálezu je využití epitopů a protilátek v metodách diagnostiky různých individuálních stavů onemocnění, jako jsou například nemoci AML, B-CLL, mnohočetný myelom, metastázy, nebo jiné nemoci, ve kterých takové buněčné funkce nebo účinky, jakými jsou buněčné rolování, zánět, imunitní reakce, infekce, autoimunitní reakce, metastázy, adheze, trombóza a/nebo restenózy a agregace, hrají signifikantní úlohu.

[48.] Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí multivalentních forem protilátek, fragmentů a komplexů. Konkrétněji, předmětem vynálezu je poskytnutí dimerů, trimerů a tetramerů, někdy zde nazývaných jako diabodies, triabodies a tetrabodies v uvedeném pořadí.

[49.] Tyto a další předměty vynálezu jsou dále popsány.

PODSTATA VYNÁLEZU [50.] Předkládaný vynález poskytuje epitopy, které jsou nalézány na ligandech a receptorech, jež mají významné úlohy v tak odlišných procesech, jako je zánět, imunitní reakce, metastáza, adheze, trombóza, restenóza a agregace. Epitopy podle předkládaného vynálezu jsou rovněž nalézány na leukemických a nádorových buňkách, konkrétně leukemického a myeloidního původu. Proto jsou tyto epitopy užitečnými cíli pro terapeutické zprostředkování těchto procesů. Protilátky namířené proti takovým epitopům jsou vhodné jako terapeutická agens proti nádorům (jak jako protinádorové agens, tak jako antimetastatické agens), leukémiím, autoimunitním onemocněním, zánětlivým onemocněním, kardiovaskulárním chorobám, jako je infarkt myokardu, retinopatické nemoci a jiné nemoci zprostředkované abnormální funkcí destiček, a nemoci způsobené interakcemi sulfatovaný tyrosin-dependentní protein - protein. Předkládaný vynález poskytuje takové protilátky, kompozice obsahující protilátky a terapeutické a diagnostické metody s použitím protilátek.

[51.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop podle vzorce I (S)_r

I [(W)_z-P-(Y)_t-P]_{q (I)}, ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A)_m(A)_n(X)uz nebo (X) _u(A) _n(A)_m, nebo (A) _n (X) _u (A) _m, nebo (A) _n (A) _m(X)u, nebo (X) _u (A) _m(A)„, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou asparátu, glutamátu, nebo tyrosinu

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin q je 1 až 6 z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až.2 n je Ο až 3 m je O až 3, kde, jestliže n = O, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, jestliže q je 1, r je 1 a jestliže q je > 1, alespoň jeden z Y je sulfatován; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán s protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejím komplexem, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[52.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop podle vzorce I, kde sulfatovanou sloučeninou je peptidonebo glyko- nebo lipo-konjugát, nebo jejich kombinace.

[53.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje izolovaný epitop vzorce I, ve kterém W je glycin, Y je peptidokonjugát tyrosinu nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu; A je glutamát, γ karboxy glutamát nebo aspartát; a q je 1, 2 nebo 3. V konkrétním provedení je Y peptido-konjugát tyrosinu; q je 3; a r je 1.

[54.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje izolovaný epitop podle vzorce II

(II) ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a • · · ·· *··· glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A) _m (A) _n (X) _u, nebo (X)_u(A)_n(A)_m, nebo (A)_n(X)_u(A)_m, nebo (A) _n (A) _m (X) _u, nebo (X)_u(A)_m(A)_n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou asparátu, glutamátu, nebo tyrosinu

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin z je 0, 1 nebo 2 r j e 0 nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m j e 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, alespoň jeden z Y je sulfatován; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejich komplexy,

které obsahují protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[55.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop podle vzorce II, kde sulfatovanou sloučeninou je peptidonebo glyko- nebo lipo-konjugát, nebo jejich kombinace.

[56.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje izolovaný epitop vzorce II, ve kterém W je glycin, Y je peptidokonjugát tyrosinu nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu; A je glutamát, γ karboxy g.lutamát nebo aspartát, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin' nebo glycin. V konkrétním provedení je Y peptido-konjugát tyrosinu; q je 3; a r je 1.

[57.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop podle vzorce III (S)r. (S)_r (S)_r

I I I (III), (G)_z(X)_u(E)_n(D)_m(Y)_t(X)_u(E)_n(D)_m(Y)_t(X)_u(E)_n(D)_n,(Y)_t(D)_ni(E)_n(X)_u ve kterém:

G je glycin

E je glutamát

D je aspartát

Y je tyrosin

S je sulfát nebo sulfatovaná sloučenina

X	je jakákoliv	aminokyselina s výjimkou	výše uvedených
z	je 0, 1 nebo	2
t	je 1, 2 nebo	3
r	je 0 nebo 1
u	je 0 až 2
n	je 0 až 3
m	je 0 až 3
= o,	kde, alespoň jeden z Y je sulfatován; pak m > 0/ kde, jestliže m = 0, pak n	kde, jestliže n >.0;; a dále,

kde izolovaný epitop je schopen být vázán protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejich komplexy, které obsahují protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[58.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop vzorce III, ve kterém r je 1.

[59.] V jakémkoliv z výše uvedených provedení může Y znamenat lipidovou, karbohydrátovou, peptidovou, glykolipidovou, glykoproteinovou, lipoproteinovou a/nebo lipopolysacharidovou molekulu.

[60.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje deriváty, homology, mimetika a varianty výše popsaných epitopů a

poskytuje epitopy, jak jsou výše popsány a mající kromě sulfatace alespoň jednu posttranslační modifikaci.

[61.] Předkládaný vynález poskytuje kompozice obsahující jeden nebo více z výše popsaných epitopů. Rovněž jsou poskytnuty izolované polynukleotidy kódující alespoň část z výše popsaných epitopů.

[62.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje protilátky, jejich fragment vázající antigen, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopné vazby nebo křížové reakce s alespoň jedním z výše popsaných epitopů.

[63.] Stejně tak je poskytnut způsob přípravy protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejich komplexů, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopných vazby nebo křížové reakce s alespoň jedním z výše popsaných epitopů. Způsob zahrnuje tyto kroky: (a) poskytnutí fágové expresní knihovny (phage display library); (b) poskytnutí jednoho z výše popsaných epitopů; (c) panning fágové expresní knihovny pro získání fágových partikul! exprimujících oligopeptid nebo polypeptid schopný vazby k izolovanému epitopů; (d) produkci protilátky, jejího vazebného fragmentu, nebo jejich komplexů, které obsahují protilátku nebo její vazebný fragment, obsahujících peptid nebo polypeptid schopný vazby k izolovanému epitopů.

[64.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje protilátky, jejich vazebné fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které mají vazebnou schopnost protilátkového fragmentu scFv se sekvencí SEQ ID NO: 25 (Yl-scFv) a /nebo se sekvencí SEQ ID NO: 203 (Y17-scFv).

[65.] Rovněž jsou poskytnuty protilátky, jejich vazebné fragmenty, nebo jejich komplexy, které mají vazebnou schopnost peptidu nebo polypeptidu, kde peptid nebo polypeptid má první hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 8 (Y1 CDR3) nebo SEQ ID NO: 20 (Y17 CDR3). V těchto konkrétních provedeních má peptid nebo polypeptid druhou hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 115 a/nebo třetí hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 114.

[66.] Jsou poskytnuty protilátky, protilátkové fragmenty a protilátkové komplexy, které jsou schopny vazby k peptidovému nebo polypeptidovému epitopu, který má délku přibližně 3 až 126 aminokyselinových zbytků a obsahuje alespoň jeden sulfatovaný zbytek tyrosinu a alespoň dvě kyselé aminokyseliny. V konkrétních provedeních epitop dále zahrnuje alespoň jeden leucinový, isoleucinový, prolinový, fenylalaninový, serinový nebo glycinový zbytek. V dalším konkrétním provedení jedna nebo více z alespoň dvou kyselých aminokyselinových zbytků jsou zaměněny leucinovým, isoleucinovým, prolinovým, fenylalaninovým, serinovým nebo glycinovým zbytkem. V dalších konkrétních provedeních obsahuje epitop DYD nebo ΕΥΕ. V konkrétních provedeních je epitop DYD nebo ΕΥΕ. V ještě dalším provedení obsahuje epitop DYE nebo EYD.

[67.] V konkrétních provedeních podle vynálezu jsou protilátky, fragmenty protilátek a protilátkové komplexy poskytnuté podle předkládaného vynálezu schopné vazby na epitop na molekule lipidu, karbohydrátu, peptidu, glykolipidu, glykoproteínu, lipoproteinu a/nebo ···*· · · ·· ····· • · · · · · · • · · · · · · · · · lipopolysacharidu. Výhodně protilátky, jejich fragmenty vázající antigen, nebo jejich komplexy obsahující alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle předkládaného vynálezu jsou schopné vazby k lipidovým, karbohydrátovým, peptidovým epitopům, glykolipidovým epitopům, glykoproteinovým epitopům, lipoproteinovým epitopům a/nebo lipolysacharidovým epitopům. V řadě provedení molekula lipidu, karbohydrátu, peptidu, glykolipidu, glykoproteinu, lipoproteinu a/nebo lipopolysacharidu obsahuje alespoň jednu sulfatovanou sloučeninu.

[68.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo vazebný fragment, jež jsou schopny vazby k alespoň dvěma molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu (prime), GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (complement compound 4, CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu, i když nikoliv nezbytně současně. Rovněž tak protilátky, fragmenty protilátek nebo komplexy podle předkládaného vynálezu se vážou k jakémukoliv analogu těchto proteinů, pokud je receptorový epitop intaktní.

[69.] V konkrétních výhodných provedeních jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny vazby k alespoň dvěma molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu (prime), GPIba, lumicanu, komplementové sloučeniny 4, inhibitoru, protrombinu a heparinu a jsou schopny vázat se k nemocným buňkám, jako jsou buňky B-CLL, buňky AML, buňky • · · · · · mnohočetného myelomu a metastatické buňky. V konkrétních provedeních jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny vazby ke každé z molekul vybrané ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu', GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4, inter-alfa inhibitoru a protrombinu. V dalších konkrétních provedeních jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny vazby ke každé z molekul vybrané ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu', GPIba a heparinu; a v dalších konkrétních provedeních jsou tyto protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment schopny rovněž vazby k nemocným buňkám, jako jsou buňky B-CLL, buňky AML, buňky mnohočetného myelomu a metastatické buňky.

[70.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny vazby k alespoň dvěma molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu (prime), heparinu, GPIba, lumicanu, komplementové sloučeniny 4, inter-alfa inhibitoru a protrombinu a dále jsou schopny vazby k epitopu na karbohydrátové a/nebo lipidové molekule, obsahující alespoň jednu sulfatovanou sloučeninu.

[71.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které • ·

obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s jedním nebo více epitopy, přičemž každý epitop obsahuje jeden nebo více sulfatovaných zbytků tyrosinu uvnitř shluku kyselých aminokyselin. Konkrétními provedeními jsou protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s alespoň jedním buněčným typem vybraným ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk. V dalším konkrétním provedení jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s PSGL-1. Přednostně se protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s PSGL-1, vážou k epitopu QATEYEYLDYDFLPETE, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován.

[72.] V dalším konkrétním provedení jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s GPlba. Přednostně se protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s GPlb-α., vážou k epitopu DEGDTDLYDYYPEEDTEGD, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován, k epitopu TDLYDYYPEEDTE, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován, k epitopu GDEGDTDLYDYYP, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován,

• ·· »4 · ·	44 •	4	4 4 4	44	4
4	4
					«	« 4
• 4 4 4	4 4	4	4	4 ·	4	4 4 4 4
• ·	4	•	4	•	4	4
• ·« 4 4	4 4		444		4 ·	4

k epitopu YDYYPEE, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován a/nebo k epitopu TDLYDYYP, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován, [73.] Ještě dalšími z těchto provedení jsou protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s fibrinogenem γ prime. Přednostně se.protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s fibrinogenem γ prime, vážou k epitopu EPHAETEYDSLYPED, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován.

[74.] V ještě dalším provedení jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s heparinem.

[75.] V ještě dalším provedení jsou poskytnuty protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s komplementovou sloučeninou 4 (complement compound 4,

CC4). Přednostně se protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s CC4, vážou k epitopu

MEANEDYEDYEYDELPAK, kde alespoň jeden tyrosinový zbytek je sulfatován.

• · [76.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny vazby k fragmentům, analogům, variantám a mimetikům výše uvedených proteinů potud, pokud epitop je v podstatě intaktní.

[77.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny křížově reagovat s alespoň jedním buněčným typem vybraným ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

[78.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jež jsou schopny inhibovat buněčné rolování; inhibovat zánět; inhibovat autoimunitní nemoci; inhibovat trombózu; inhibovat restenózu; inhibovat metastázu; inhibovat růst a/nebo replikaci nádorových buněk; zvyšovat mortalitu nádorových buněk; inhibovat růst a/nebo replikaci leukemických buněk; zvyšovat rychlost mortality leukemických buněk; zvyšovat citlivost nádorových buněk k poškozování protirakovinnými agens; zvyšovat citlivost leukemických buněk k poškozování antileukemickými látkami; inhibovat nárůst počtu nádorových buněk u pacienta majícího nádor; snižovat počet nádorových buněk u pacienta majícího nádor; inhibovat nárůst počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii; inhibovat tvorbu komplexů buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička; inhibovat adhezi buňka-buňka, buňka-matrix, • · · · ·

destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička; agregaci.

[79.] Jsou poskytnuty farmaceutické kompozice obsahující protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle předkládaného vynálezu v množstvích účinných k inhibici, léčbě, zlepšení jejich účinků, nebo v prevenci nemocí a/nebo stavů, které jsou předmětem zájmu.

[80.] Předkládaný vynález poskytuje použití protilátek, jejich antigen vázajících fragmentů, nebo jejich komplexů podle předkládaného vynálezu ve způsobu přípravy léčiva k inhibici, léčbě, zlepšení jejich účinků, nebo v prevenci nemocí a/nebo stavů, které jsou předmětem zájmu.

[81.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy pro použití jako léčiva k inhibici, léčbě, zlepšení jejich účinků, nebo v prevenci nemocí a/nebo stavů, které jsou předmětem zájmu.

[82.] Předkládaný vynález poskytuje způsob inhibování, léčby, zlepšení účinků, nebo prevence nemocí a/nebo stavů, které jsou předmětem zájmu, jež zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, farmaceutické kompozice obsahující účinné množství protilátky, jejího antigen vázajícího fragmentu, nebo jejich komplexů, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle předkládaného vynálezu.

• · [83.] Protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle předkládaného vynálezu, mohou být komplexovány nebo vázány s různými agens.

[84.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, vázané s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

[85.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, vázané nebo komplexované s jedním nebo více toxiny, radioizotopy a farmaceutickými agens.

[86.] Předkládaný vynález poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou. Příklady takových vehikul a nosičů zahrnují dextran, lipofilní polymery, hydrofilní polymery, HPMA a liposomy.

[87.] Předkládaný vynález také poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, vázané nebo komplexované s radioaktivním izotopem nebo jiným zobrazovacím agens. Rovněž je poskytnut diagnostický kit obsahující protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle předkládaného vynálezu.

[88.] Předkládaný vynález poskytuje izolovaný epitop obsahující aminokyselinovou sekvenci GPIba - Tyr 276 až Glu 282, ve které alespoň jedna z aminokyselin 276, 278 a 279 je sulfatována. Ve výhodném provedení dále epitop obsahuje aminokyseliny GPIba - 283 až 285.

[89.] Předkládaný vynález také poskytuje protilátky, jejich antigen vázající fragmenty, nebo jejich komplexy, které obsahují alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vázat se k epitopu obsahujícím aminokyselinovou sekvenci GPIba Tyr 276 až Glu 282, ve které alespoň jedna z aminokyselin 276, 278 a 279 je sulfatována, přičemž intenzita vazby zvýšena, jestliže epitop dále obsahuje aminokyseliny GPIba - 283-285.

[90.] Rovněž je poskytnut izolovaný N-koncový peptid GPIba, který má zjevnou molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa, přičemž uvedený peptid obsahuje epitop mající sekvenci YDYYPEE, kde alespoň jeden z tyrosinových zbytků v epitopu je sulfatován, a izolovaný peptid GPIba sestávající z aminokyselin 1 až 282, ve kterém alespoň jedna z aminokyselin 276, 278 a 279 je sulfatována.

[91.] Předkládaný vynález rovněž poskytuje polyklonální protilátky, protilátkové fragmenty nebo protilátkové • Λ · komplexy, které křížově reagují s variabilním lehkým řetězcem lidské monoklonální protilátky scFv Yl.

V konkrétních provedeních polyklonální protilátky, protilátkové fragmenty nebo protilátkové komplexy křížově reagují s peptidem kódovaným restrikčním fragmentem NdelEcoRl variabilního lehkého řetězce lidské monoklonální protilátky Y-l. Rovněž jsou poskytnuty diagnostické kity obsahující takové polyklonální protilátky.

Definice:

[92.] Protilátky (antibodies, Ab's), nebo ímunoglobuliny (immunoglobulins, Ig's)jsou proteinové molekuly, které se vážou k antigenu. Jsou složeny z jednotek čtyř polypeptidových řetězců (2 lehké a 2 těžké), vzájemně propojených disulfidovými můstky. Každý z řetězců má konstatní a variabilní oblast. Mohou být rozděleny do pěti tříd, IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, na základě jejich těžkého řetězce. Třída IgG obsahuje několik podtříd zahrnujících, bez omezení, IgGi, IgG₂, IgG₃ a IgG₄. ímunoglobuliny jsou produkovány in vivo B lymfocyty a rozpoznávají konkrétní cizorodé antigenní determinanty a usnadňují odstranění (clearing) antigenu.

[93.] Protilátky mohou být produkovány a používány v mnoha formách, včetně protilátkových komplexů. Zde používaný výraz „protilátkový komplex nebo „protilátkové komplexy znamená komplex jedné nebo více protilátek s jinou protilátkou, nebo s fragmentem či fragmenty protilátek, nebo komplex dvou či více fragmentů protilátek. Příklady fragmentů protilátek zahrnují fragmenty Fv,

F(ab')2, F(ab'), Fc, a Fd.

• · [94.] Termín Fv tak, jak je popise a nárocích používán, znamená molekulu, která je tvořena z variabilní oblasti těžkého řetězce lidské protilátky a z variabilní oblasti lehkého řetězce lidské protilátky, která může být shodná nebo odlišná, a ve kterém je variabilní oblast těžkého řetězce spojena, svázána, fúzována nebo kovalentně připojena, asociována variabilní oblastí lehkého řetězce.

Fv může být jednořetězcový Fv (scFv), nebo disulfidovým můstkem stabilizovaný Fv (dsFv). ScFv tvoří část variabilních domén každého z těžkých a lehkých řetězců protilátky a jsou propojeny flexibilním aminokyselinovým spacerem nebo linkerem. Linker může být větvený nebo nevětvený. Výhodně představuje linker 0 až 15 aminokyselinových zbytků, nej výhodněji pak je linkerem (Gly4Ser)3.

[95.] Fv molekula sama o sobě sestává z prvního řetězce a ze druhého řetězce, přičemž každý z řetězců obsahuje první, druhou a třetí hypervariabilní oblast. Hypervariabilní smyčky uvnitř variabilní oblasti (domény) lehkých a těžkých řetězců jsou nazývány komplementaritu určující oblasti (Complementary Determining Regions, CDR) .

V každém těžkém a lehkém řetězci existují oblasti CDRl,

CDR2 a CDR3. Tyto oblasti tvoří vazebné místo pro antigen a mohou být specificky modifikovány pro dosažení zvýšené vazebné aktivity. Přirozeně nejvariabilnější z těchto oblastí je oblast CDR3 těžkého řetězce. Oblast CDR3 je považována za nejexponovanější oblast molekuly Ig a jak bylo zde ukázáno a prokázáno, je místem primárně zodpovědným za pozorované selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky.

• * [96.] Fragment molekuly Fv je definován jako jakákoliv molekula menší než původní Fv, která si stále uchovává selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky původního Fv. Příklady takových fragmentů zahrnují bez omezení (1) minibody, jež obsahuje fragment těžkého řetězce pouze z Fv, (2) microbody, jež obsahuje malou frakcionační jednotku z variabilní oblasti těžkého řetězce (PCT přihláška č. PCT/IL99/00581), (3) podobné protilátky obsahující fragment lehkého řetězce a (4) podobné protilátky obsahující funkční jednotku z variabilní oblasti lehkého řetězce.

[97.] Zde používaný termín „Fab fragment je monovalentní fragment odvozený od imunoglobulinu vázající antigen. Fab fragment sestává z lehkého řetězce a části těžkého řetězce.

[98.] Fragmentem F(ab')2 je bivalentní fragment imunoglobulinu vázající antigen, získaný štěpením pepsinem. Obsahuje oba lehké řetězce a část obou těžkých řetězců.

[99.] Fragmentem Fc je část imunoglobulinu, která neváže antigen. Obsahuje karboxy-koncovou část těžkých řetězců a vazebná místa pro receptor Fc.

[100.] Fragmentem Fd je variabilní oblast a první konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu.

[101.] Polyklonální protilátky jsou produktem imunitní odpovědi jsou tvořeny řadou odlišných B-lymfocytů. Monoklonální protilátky jsou odvozeny od jedné buňky.

• · ·

[102.] Podle předkládaného vynálezu je kazetou, užitou pro polypeptidy, míněna určitá sekvence po sobě následujících aminokyselin, která slouží jako čtecí rámec, je považována za jednu jednotku a je s ní jako s takovou zacházeno. Na jednom nebo obou koncích, mohou být aminokyseliny zaměněny, inzerovány, odstraněny, nebo připojeny. Podobně mohou být aminokyselinové úseky (stretches) zaměněny, inzerovány, odstraněny nebo připojeny na jednom nebo obou koncích.

[103.] Zde použitý výraz „epitop znamená antigenní determinantu nebo antigenní místo, které interaguje s protilátkou, fragmentem protilátky nebo komplexem protilátky, nebo s komplexem obsahujícím její vazebný fragment nebo T.buněčný receptor. Výraz epitop je používán zaměnitelně s výrazy ligand, doména a vazebná oblast.

[104.] Selektivita je zde definována jako schopnost cílící molekuly vybrat a vázaT-buňku jednoho typu nebo buněčného stadia ze směsi buněčných typů nebo buněčných stadií, všech buněčných typů nebo buněčných stadií, které mohou být specifické k cílící molekule.

[105.] Výraz „afinita je zde použit jako míra vazebné síly (asociační konstanta) mezi receptorem (tj. jedním vazebným místem na protilátce) a ligandem (tj. antigenní determinantou). Síla součtu všech nekovalentních interakcí mezi jedním vazebným místem pro antigen na protilátce a jedním epitopem je afinitou protilátky pro tento epitop. Protilátky s nízkou afinitou vážou antigen slabě a mají tendenci snadno disociovat, zatímco protilátky s vysokou afinitou vážou antigen pevněji a zůstávají ve vazbě déle.

Výraz „avidita se od afinity liší, neboť vyjadřuje valenci interakce antigen-protilátka.

[106.] Specifičnost interakce antigen-protilátka: Ačkoliv reakce antigen-protilátka je specifická, v některých případech protilátka vyvolaná jedním antigenem může křížově reagovat s jiným nesouvisejícím antigenem. Takovéto křížové reakce se objevují, jestliže dva odlišné antigeny nesou homologní nebo podobné epitopy, nebo jejich kotevní oblast (anchor region), nebo jestliže protilátky specifické pro jeden epitop se vážou k nepříbuznému epitopů majícímu podobné chemické vlastnosti.

[107.] Destičky jsou cytoplasmatickými fragmenty megakaryocytů, podobné disku, které vznikají v sinu kostní dřeně a následně cirkulují v periferní krvi. Destičky mají několik funkcí včetně hlavní role při srážení krve.

Destička obsahuje v centrální části granule a periferně čistou protoplasmu, avšak žádné zřetelné jádro [108.] Výraz aglutinace zde znamená proces, ve kterém suspendované baktérie, buňky, disky a jiné částice podobné velikosti adherují a tvoří shluky. Proces je podobný precipitaci, avšak částice jsou větší a jsou spíše v suspenzi než v roztoku.

[109.] Výraz agregace znamená shlukování destiček indukované in vitro, a trombinu a kolagenu, jako součástí postupného mechanismu vedoucího k tvorbě sraženin nebo hemostatických krevních koláčů.

[110.] Konzervativní aminokyselinová substituce je zde definována jako záměna jedné nebo dvou aminokyselin • ·

v aminokyselinovém složení peptidu, polypeptidu nebo proteinu, nebo jeho fragmentu. Substituce se týká aminokyselin, které mají obecně podobné vlastnosti (jako je kyselost, bazicita, aromatičnost, velikost, pozitivní nebo negativní náboj, polarita, nepolarita), takovým způsobem, že substituce podstatným způsobem nemění charakteristiku peptidu, polypeptidu nebo proteinu (tj. náboj, izoelektrický bod, afinitu, aviditu, konformaci, rozpustnost) nebo aktivitu. Typické substituce, které mohou být prováděny pro takové konzervativní záměny aminokyselin, mohou být v rámci následujících skupin aminokyselin:

(i) glycin (G), alanin (A), valin (V), leucin (L) a isoleucin (I) (ii) kyselina asparagová (D) a kyselina glutamová (E) (iii) alanin (A), serin (S) a threonin (T) (iv) histidin (H), lysin (K) a arginin (R) (v) asparagin (N) a glutamin (Q) (vi) fenylalanin (F), tyrosin (Y) a tryptofan (W).

[111.] Konzervativní aminokyselinové substituce mohou být prováděny v oblastech lemujících hypervariabilní oblasti primárně zodpovědných za selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky v molekule, stejně jako v jiných částech molekuly, jako je kazeta variabilní části těžkého řetězce. Kromě toho nebo alternativně mohou být modifikace doprovázeny rekonstrukcí molekul pro tvorbu protilátek o úplné délce, diabodies (dimerů), triabodies (trimerů) a/nebo tetrabodies (tetramerů), nebo minibodies či microbodies.

[112.] Fágemid je definován jako částice fága, která nese plasmidovou DNA. Fágemidy jsou plasmidové vektory navržené tak, aby obsahovaly počátek replikace z vláknitého • · fága, jako je fág M13, nebo fd. Vzhledem k tomu, že nese plasmidovou DNA, nemá fágemidová částice dostatečný prostor pro obsažení úplného komplementu fágového genomu.

Komponentou, která chybí ve fágovém genomu, je podstatná informace pro sbalení (packaging) fágové partikule. Aby mohl být fág propagován, je nutné kultivovat požadované fágové partikule s kmenem pomocného fága (helper phage strain), který doplňuje chybějící informaci pro sbalení.

[113.] Promotor je oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a zahajuje transkripci.

[114.] Fágová expresní knihovna (phage display library, rovněž nazývaná phage peptide/antibody library, phage library nebo peptide/antibody library) obsahuje velkou populaci fága (obecně 10⁸ - 10⁹) , ve které každá fágová částice exprimuje odlišnou peptidovou nebo polypeptidovou sekvenci. Peptidové nebo polypeptidové fragmenty mohou být konstruovány o variabilní délce. Tyto displej ováné peptidy nebo polypeptidy mohou být odvozeny, avšak bez omezení, od lehkých nebo těžkých řetězců lidských protilátek.

[115.] Farmaceutická kompozice se týká přípravku, který obsahuje peptid nebo polypeptid podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, excipient nebo ředidlo.

[116.] Farmaceutické agens se týká látky, která je užitečná v profylaktickém ošetření nebo diagnostice savců, zahrnujících, bez omezení, člověka, hovězí dobytek, koně, vepře, myši, psy, kočky, nebo jakákoliv jiná teplokrevná zvířata. Farmaceutické agens je vybráno ze skupiny zahrnující radioizotop, toxin, oligonukleotid, • ·

rekombinantní protein, fragment protilátky a protinádorové agens. Příklady takových farmaceutických látek zahrnují, bez omezení, antivirální agens včetně acycloviru, gancicloviru, zidovudinu; látky s účinností proti trombóze/restenóze zahrnující cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirin; protizánětlivá činidla zahrnující zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtolmetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib a nimesulfid; látky proti autoimunitě zahrnující leflunomid, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotid a cyklofosfamid; a antiadhezivní/antiagregační látky zahrnující limaprost, clorcromen a kyselinu hyaluronovou.

[117.] Antileukemické agens je látka s antileukemickou aktivitou. Tak například, antileukemická agens zahrnují takové látky, které inhibují nebo zastavují růst leukemických nebo nezralých preleukemických buněk, látky, které zabíjejí leukemické nebo preleukemické buňky, látky, které zvyšují citlivost leukemických nebo preleukemických buněk k jiným antileukemickým látkám, a látky, které inhibují metastázu leukemických buněk. Podle předkládaného vynálezu může být antileukemickým agens též látka s antiangiogenní aktivitou, která brání, inhibuje, retarduje nebo zastavuje vaskularizaci tumorů.

[118.] Vzorek exprese (expression pattern) genu může být studován analýzou množství genového produktu produkovaného za různých podmínek, v určitých časech, v různých tkáních a podobně. Za gen se zvýšenou expresí (over-expressed) je považován ten, jehož množství genového • · produktu je vyšší, než množství produktu nalézané u normální kontroly, tj. zdravé kontroly.

[119.] Daná buňka může na svém povrchu exprimovat protein mající vazebné místo (nebo epitop) pro určitou protilátku, avšak toto vazebné místo může existovat ve skryté (kryptické) formě (tj. může být sféricky bráněno nebo blokováno, nebo může postrádat znaky nutné pro vazbu s protilátkou) v buňce ve stadiu, které může být nazváno prvním stadiem (stadium I). Stadiem I může být například normální, zdravý, nikoliv nemocný status. Jestliže epitop existuje v kryptické formě, není určitou protilátkou rozpoznáván, tj. nenastává vazba protilátky s tímto epitopem nebo s danou buňkou ve stadiu I. Nicméně, epitop může být odhalen například tím, že prodělá vlastní modifikaci, nebo může být odblokován modifikací sousedících nebo asociovaných molekul, nebo tím, že jeho oblast prodělá konformační změnu. Příklady modifikací zahrnují změny v poskládání, změny v posttranslačních modifikacích, změny ve fosfolipidizaci, změny v sulfataci, změny v glykosylaci a podobně. Takové modifikace se mohou objevit, jestliže buňka vstupuje do odlišného stadia, které lze nazvat druhým stadiem (stadium II). Příklady druhého stadia zahrnují aktivaci, proliferaci, transformaci nebo maligní status. Po modifikaci může být epitop exponován a protilátka se může navázat.

[120.] Peptidová mimetika jsou malé molekuly, peptidy, polypeptidy, lipidy, polysacharidy nebo jejich konjugáty, které mají stejný funkční účinek nebo aktivitu, jako jiné entity, jako jsou protilátky.

• · ·« ·· • · · · φ

Stručný popis obrázků [121.] Obr.l znázorňuje štěpící místa endoproteázy na a řetězci GPIb.

[122.] Obr. 2 znázorňuje Western blotting zobrazující vazbu Yl a Y17 k destičkám za redukovaných a neredukovaných podmínek.

[123.] Obr. 3 znázorňuje přehled reaktivity Yl s různými preparáty destiček GC a membránové frakce buněk

KG-1.

[124.] Obr. 4 znázorňuje Western blotting demonstrující, že štěpení destičkového GPIb 0sialoglykoproteinovou endoproteázou narušuje vazbu jak Yl, tak Y17.

[125.] Obr. 5 znázorňuje Western blotting demonstrující, že Yl a Y17 podobně vážou fragmenty glycocalicinu po štěpení O-sialoglykoproteinovou endoproteázou.

[126.] Obr. 6 znázorňuje výsledky analýzy FACS demonstrující, že specifická proteolýza GPIb ruší vazbu Yl k destičkám.

[127.] Obr. 7 znázorňuje Western blotting demonstrující, že Yl se váže k N-koncovému (His-1 až Glu-282) fragmentu destičkového GPIba po štěpení mocarhaginem.

[128.] Obr. 8 znázorňuje Western blotting znázorňující vazbu Yl a Ϋ17 ke glycocalicinu po štěpení mocarhaginem.

[129.] Obr. 9 znázorňuje Western blotting zobrazující vazbu Yl a Y17 k destičkám.

[130.] Obr. 10 znázorňuje Western blotting demonstrující, že Yl a Y17 vážou podobně glycocalicin po štěpení Ficinem.

[131.] Obr. 11 znázorňuje Western blotting demonstrující, že Yl reaguje s větším fragmentem, vzniklým štěpením GPIbaa cathepsinem G.

[132.] Obr. 12 znázorňuje Western blotting demonstrující, že Yl a Y17 reagují s větším fragmentem, vzniklým štěpením GPIbaa cathepsinem G.

[133.] Obr. 13 znázorňuje a Western blotting demonstrující, že štěpení glycocalicinu mocarhaginem a cathepsinem G ruší vazbu Yl.

[134.] Obr. 14 znázorňuje Western blotting demonstrující vazbu Yl and Y17 k lyzátu promytých destiček štěpených mocarhaginem a cathepsinem G.

[135.] Obr. 15 je graf ilustrující inhibici aglutinace promytých destiček pomocí Yl-scFv.

[136.] Obr. 16 je graf ilustrující inhibici agregace destiček v plasmě bohaté na destičky pomocí Yl-scFv.

• « [137 promytých ] Obr. 17 je graf ilustrující indukci destiček pomocí Yl-IgG.

aglutinace [138. destiček v

Obr. 18 je graf ilustrující indukci agregace plasmě bohaté na destičky pomocí Yl-IgG.

[139.] Obr. 19 poskytuje výsledky zkoušky ELISA.

[140.] Obr. 20 znázorňuje Western blotting ilustrující specifičnost vazby Yl and oc-CD42(Nl-19) k jejich ligandům.

[141.] Obr. 21 znázorňuje Western blotovou reaktivitu Yl s Yl-ligandem na purifikované membráně KG-1 buňky s použitím imunoprecipitace a RP-HPLC.

[142.] Obr. 22 znázorňuje Western blotting uvádějící účinek O-sialoglykoproteinového endopeptidázového štěpení na vazbu Yl.

[143.] Obr. 23 znázorňuje Western blotting uvádějící účinek aryl-sulfatázového štěpení na vazbu Yl k lyzátu buněk KG-1, purifikovaných RP-HPLC, a k heparinu-BSA.

[144.] Obr. 24 znázorňuje imunoprecipitační schéma použité v analýze specifičnosti vazby Yl.

[145.] Obr. 25 znázorňuje Western blotting porovnávající vazbu Yl a protilátky anti-CD-162 k buňkám získaným od pacientů s AML a z normální krve.

[146.] Obr. 26 znázorňuje výsledky analýzy FACS, které uvádí schopnost protilátek KPL1, PLl, a PL2 soutěžit s Yl o vazbu.

9 [147.] Obr. 27 znázorňuje výsledky analýzy FACS, které demonstrují specifičnost vazby Yl.

[148.] Obr. 28 rovněž uvádí výsledky analýzy FACS, které demonstrují specifičnost vazby Yl.

[149.] Obr. 29 je graf ilustrující % inhibice vazby Yl v přítomnosti různých peptidů.

	[150.]	Obr. 30 je	graf	uváděj ící	hmotnost	: jater	myší z
různě	léčených skupin.
	[151.]	Obr. 31 je	graf	uváděj ící	% buněk	MOLT v	kostní
dřeni	myší	z různě léčených	skupin.
	[152.]	Obr. 32 je	graf	uváděj ící	% buněk	MOLT v	krvi

myší z různě léčených skupin.

[153.] Obr. 33 uvádí Western blotting, znázorňující účinek aryl-sulfatázy a štěpení mocarhaginem na vazbu Yl.

[154.] Obr. 34 je graf uvádějící hmotnost jater (průměr+/-SEM (směrodatná odchylka průměru rozdílů)) u myší ve 35.dnu.

[155.] Obr. 35 je graf ilustrující účinek léčby na přežívání.

[156.] Obr. 36 je graf uvádějící % výskytu leukemie v různě léčených skupinách.

% buněk KG-1 buněk KG-1 [157.] Obr. 37 je graf znázorňující v krvi u různě léčených skupin.

[158.] Obr.38 je graf ilustrující % v kostní dřeni pokusných zvířat.

[159.] Obr. 39 je graf ilustrující farmakokinetiku TCA-precipitovatelné radioaktivity v plasmě myši po intravenózní injekci ¹²⁵I-CONY1. Sekvence CONY1 je uvedena v SEQ ID NO: 204.

[160.] Obr. 40 je graf ilustrující specifickou radioaktivitu různých orgánů/tkání myši po intravenózní injekci ¹²⁵I-CONY1.

[161.] Obr. 41 je graf ilustrující distribuci radioaktivity v různých orgánech/tkáních myši po intravenózní injekci ¹²⁵I-CONYl.

[162.] Obr. 42 je graf znázorňující profil Superdex 75 pro Yl-cys-kak.

[163.] Obr. 43 se týká velikosti dimerů ve srovnání s monomerem za redukčních a neredukčních podmínek.

[164.] Obr.44 uvádí analýzu FACS znázorňující hladinu vazby IgG-Yl molekuly ve srovnání s vazbou scFv-Yl.

[165.] Obr. 45 uvádí Western blottingy znázorňující vazbu Yl a jiných protilátek k přirozenému od lidských destiček odvozenému glycocalicinu a k rekombinantnímu glycocalicinu produkovaném v E. coli.

• · • · · * · · · · · ··· ·· · · · · · • ····· · · ·· · · · · · • · · · · · t « ····· ·· · · · ·· · [166.] Obr. 46 znázorňuje srovnání vazby mezi dimerem Yl, Yl-scFv (CONY1) a Yl-IgG.

[167.] Obr. 47 znázorňuje srovnání vazby mezi dimerem Yl se sulfidovým můstkem a Yl-scFv (CONY1).

[168.] Obr. 48 poskytuje aminokyselinové a nukleotidové sekvence těžkých a lehkých řetězců Yl-IgG.

Jsou uvedeny otevřený čtecí rámec (open reading frame, ORF) nukleotidové sekvence Yl-HC (SEQ ID NO: 205), aminokyselinová sekvence Yl-HC (SEQ ID NO: 206), ORF nukleotidové sekvence Yl-LC (SEQ ID NO: 207), a aminokyselinová sekvence Yl-LC (SEQ ID NO : 208).

[169.] Obr. 49 poskytuje aminokyselinovou sekvenci TMI (SEQ ID NO: 209).

[170.] Obr. 50 poskytuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci Y16 scFv (SEQ ID NO : 210).

[171.] Obr. 51 poskytuje aminokyselinovou sekvenci Yl Biotag (SEQ ID NO: 211).

[172.] Obr. 52 poskytuje aminokyselinovou sekvenci Ylcys-KAK scFv (SEQ ID NO: 212).

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU [173.] V předkládaném vynálezu byly použity celé buňky pro selekci specifických protilátek, které rozpoznávají povrchové determinanty leukemických buněk, jejichž specifický receptor nebyl dosud znám nebo charakterizován. Kromě toho byl použit vícestupňový postup biopanníngu, ve kterém byl fág selektován panningem na více než jednom buněčném typu. Tento postup je významným zlepšením oproti metodám z dosavadního stavu techniky, v nichž selekce antigen-specifických fágových protilátek závisí do značné míry na biopanningu proti imobilizovanému jedinému antigenu, a tak se při použití celých buněk jako cíle uskutečňuje omezená selekce.

[174.] Určité epitopy, které byly identifikovány tímto vícestupňovým postupem, jsou charakteristické přítomností sulfatovaných sloučenin, jako je sulfatovaný zbytek tyrosinu nebo sulfatovaný karbohydrát či lipidová sloučenina, výhodně v rámci shluku dvou nebo více kyselých aminokyselin, jsou nalézány na ligandech a receptorech, které hrají významnou úlohu v tak odlišných procesech, jako jsou zánět, imunitní reakce, infekce, autoimunitní reakce, metastáza, adheze, trombóza a/nebo restenóza, buněčné rolování a agregace. Takové epitopy jsou rovněž nalézány na nemocných buňkách, jakými jsou buňky B-CLL, buňky AML, buňky mnohočetného myelomu a metastatické buňky. Zvěděné epitopy jsou vhodnými cíly pro terapeutické urovnání těchto procesů a pro diagnostické účely.

[175.] Ačkoliv tyto epitopy mají variabilní primární aminokyselinové sekvence, protilátky proti takovým sulfatovaným epitopům jsou často schopné vazby nebo křížové reakce s více než jedním takovým epitopem na více než jedné molekule, třebaže se nejedná nezbytně o vazbu simultánní. Takové protilátky jsou vhodné jako terapeutická agens proti nádorům (jak jako protinádorová agens, tak jako antimetastatická agens), leukémiím, autoimunitním chorobám, virovým onemocněním, nemocím, které zahrnují abnormální agregaci, nemocím, které zahrnují abnormální adhezi, infarktům, kardiovaskulárním onemocněním, a zánětlivým onemocněním.

[176.] Lidská protilátka scFv Yl byla izolována z lidské protilátkové fágové expresní knihovny, která byla použita ke screeningu fixovaných lidských destiček za účelem identifikace protilátek, jež se vážou s destičkami. Byla izolována a charakterizována řada klonů (odlišných protilátek scFv). Bylo zjištěno, že se jeden z těchto klonů, označený jako Yl, neočekávaně váže s leukemickými buňkami získanými od pacientů s AML a od pacientů, kteří mají určité jiné typy leukémií. Panningem prováděným na fixovaných destičkách byl izolován další klon, Y17, u něhož bylo zjištěno, že se váže k lidské krvi.

[177.] Proteiny extrahované z lidských destiček byly analyzovány Western blottingem na SDS-PAGE s použitím protilátky Yl scFv a protilátky Y17-scFv tak, aby byly identifikovány epitopy, ke kterým se protilátky na povrchu destiček vážou. S použitím této metody bylo stanoveno, že epitopem na destičkách pro Yl scFv a Y17-scFv je glycocalicin, jedna z podjednotek komplexu CD42.

[178.] Glycocalicinový extracelulární fragment získaný z lidských destiček byl purifikován z aktivovaných destiček. Byl štěpen různými proteázami, takovými, jako je ficin, mocarhagin, cathepsin G, tak, aby byl přesně lokalizován epitop pro vazbu s Yl na molekule glycocalicinu. Byla provedena analýza metodou Western blotting s použitím protilátky Yl, jako detekčního prostředku. Kromě toho, pro stanovení Yl vazebného epitopu na glycocalicinu byly použity komerčně dostupné protilátky proti glycocalicinu (protilátky, o kterých je známo, že se • ·· ·· · ·· · • · · · · · · · · ·· • · · ·· · ···· • ····· · · · · * ···· ··· ·· · · · · · · · · vážou k různým epitopům glycocalicinu) v kompetiční vazebné zkoušce s protilátkou Yl.

[179.] Na základě výsledků je usuzováno, že aminokyseliny glycocalicinu 272 až 285 hrají významnou úlohu ve vazbě Yl ke glycocalicinu. Kromě toho, protože nebyl rekombinantní N-koncový polypeptid glycocalicinu (aminokyseliny 1 až 340 a 1 až 480) protilátkou Yl detekovatelný, je usuzováno, že vazba Yl ke svému epitopu je závislá na post-translačních modifikacích, jako jsou glykosylace či sulfatace, které jsou modifikacemi, o nichž není známo, že se vyskytují v E. coli.

[180.] Pro ověření této hypotézy bylo na purifikovaný glycocalicin působeno enzymy (glykosidázami), které odstraňují N- a O-vázanou sloučeninu cukru z proteinů, a enzymy (sulfatázami), které odstraňují sulfátové sloučeniny z proteinů. Vazba protilátky Yl ke glycocalicinu nebo k fragmentům odvozeným z glycocalicinu, nebyla glykozidázami dotčena. Uvedený výsledek naznačuje, že sulfatované skupiny jsou základního významu pro vazbu Yl ke glycocalicinu.

[181.] Pro další ověření těchto výsledků byly připraveny sulfatované a nesulfatované syntetické peptidy na základě identifikovaného epitopu (aminokyseliny 272 až 285 glycocalicinu) a byly použity ke stanovení vazebné specifičnosti protilátky Yl ke glycocalicinu v jejich přítomnosti (zkouškou ELISA). Sulfatované peptidy inhibovaly vazbu protilátky Yl ke glycocalicinu několikanásobně více, než odpovídající nesulfatované peptidy, což naznačuje, že sulfatace je pro vazbu podstatná.

[182.] Z výše uvedených experimentálních výsledků lze usuzovat, že epitop pro protilátku Yl je v glycocalicinu umístěn mezi aminokyselinami 272 až 285, kde se nalézá shluk negativně nabitých aminokyselin.

[183.] Paralelně byla studována vazba protilátky Yl k buňkám KG-1 (lidská buněčná linie získaná od pacienta s AML), k různým lidským proteinům získaným z plasmy a ke krevním vzorkům pacientů s primární leukémií.

[184.] Bylo zjištěno, že protilátka Yl se váže s relativně nízkou afinitou ke dvěma proteinům získaným z lidské plasmy, k jednomu o molekulové hmotnosti ~ 50 kD, který byl identifikován jako fibrinogen-gama prime, a ke druhému proteinu o molekulové hmotnosti ~ 80 kD, který byl identifikován jako složka 4 komplementu (CC4) a lidský lumican. Uvedené proteiny obsahují sulfatované zbytky tyrosinu v kombinaci s úsekem negativně nabitých aminokyselin.

[185.] Jako ligand Yl na buňkách KG-1 byl identifikován PSGL-1, který je receptorem pro E, L- a Pselektiny, a to na základě kompetičních testů (ve kterých vazba protilátky Yl k buňkám KG-1 probíhala za přítomnosti různých komerčně dostupných protilátek proti PSGL-1) a po řadě pokusů s použitím sulfatovaných a nesulfatovaných syntetických peptidů odvozených z N-koncového místa PSGL-1 N-koncové místo PSGL-1 obsahuje zbytky sulfatovaných tyrosinů doprovázené úsekem negativně nabitých aminokyselin.

« « · · · ···· ····· « · · · ····· [186.] Ačkoliv se protilátka Yl váže.k několika molekulám, jako je molekula glycocalicinu na destičkách, fibrinogen-gama prime, složka komplementu 4 z lidské plasmy a molekula PSGL-1 na buňkách KG-1, její afinita k primárním leukemickým buňkám získaným buďto od pacientů s AML nebo s mnohočetným myelomem (MM) je mnohonásobně vyšší ve srovnání s dříve popsanými epitopy. Kromě toho, skutečnost, že komerčně dostupná protilátka proti PSGL-1 (KPL1) nerozpozná všechny (7 ze 12) nemocných primárních leukemických buněk ve vzorcích krve získaných od pacientů, zatímco protilátka Yl je specificky a selektivně rozpoznává, naznačuje, že na primárních leukemických buňkách existují další epitopy pro protilátku Yl, které' se liší od epitopů na buňkách KG-1.

[187.]-Příklady sulfatovaných epitopů podle předkládaného vynálezu zahrnují ty, které jsou znázorněny vzorci I, II, a III, stejně jako jejich deriváty, homology, mimetíka a varianty.

Vzorec (I) :

(S)r [(W)_z-P-COt-P]q

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A) _m (A) _n (X) _u, nebo (X) _u (A) _n (A) _m, nebo (A) _n(X)_u(A)_m, nebo (A) _n(A) _m(X)_u, nebo (X) _u(A)_m(A)_n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinů

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin q je 1 až 6 z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m j e 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, jestliže q je 1, r je 1 a jestliže q je >

1, alespoň jeden z Y je sulfatován; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán s protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejím komplexem, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[188]. Výhodným epitopem je epitop vzorce I, ve kterém W je glycin, Y je peptidový konjugát tyrosinu nebo giykokonjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu; A je glutamát, γ karboxy-glutamát nebo aspartát; a q je 1, 2, nebo 3. V konkrétních provedeních je Y peptidový konjugát tyrosinu; q je 3; a r je 1.

Vzorec II:

(S)r (S)_r (S)_r I I I (W)_z-P-C0r-P-(Y)_t-P-(Y)t-P (II), ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A)_m(A)_n(X)_u, nebo (X) _u(A)_n(A)_m, nebo (A) _n(X)_u(A)_m, nebo (A) _n (A) _m (X) _u, nebo (X) _u (A) _m (A) _n, nebo (A) _m (X) _u (A) _n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinu

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 je 1, 2 nebo 3 je 0 až 2 je 0 až 3 je 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde alespoň jeden z Y je sulfatován; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán s protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejím komplexem, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[189.] Výhodným epitopem je epitop vzorce II, ve kterém W je glycin, Y je peptidový konjugát tyrosinu nebo glykokonjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu; A je glutamát, γ karboxy-glutamát nebo aspartát, leucin, isoleucin, fenylalanin, serin nebo glycin. V konkrétních provedeních je Y peptidový konjugát tyrosinu; q je 3; a r je 1.

·· ·· · · · «

4 ···· ··· • · « » · ·«·· ··««· « · · · * · · · ·

Vzorec III :

(S)_r (S)_r (S)_r

III (G)_z(X)u(E)_n(D)ró(Y)t (X)u(E)n(P)inOOtGOu(E)n(D)_m(Y)t(D)_m(E)_n(X)u (III) , ve kterém

G je glycin

E je glutamát

D je aspartát

Y je tyrosin

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou výše uvedených z je 0, 1 nebo 2 t je 1, 2 nebo 3 r je 0 nebo 1 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3, kde alespoň jeden z Y je sulfatován; kde, jestliže n 0, pak m > 0 ; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán s protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejím komplexem, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

[190.] Výhodným epitopem je epitop vzorce III, ve kterém r je 1.

[191.] Sulfatovanou sloučeninou ve kterémkoliv ze vzorců může rovněž být peptido-, glyko- nebo lipokonjugát. Y může zahrnovat lipidovou a/nebo karbohydrátovou molekulu. Epitopy mohou kromě sulfatace mít alespoň jednu další posttranslační modifikaci.

[192.] Takovéto epitopy jsou nalézaný na tak odlišných molekulách, jakými jsou GPIb a PSGL-1, a jsou nalézány na určitých nemocných buňkách, jako jsou buňky B-CLL, buňky AML, buňky mnohočetného myelomu a metastatické buňky. Sulfatace tyrosinu a/nebo jiných sloučenin je zejména významná pro vazbu k těmto epitopům. Lidské proteiny, o nichž je známo, že obsahují sulfatovaný tyrosin, zahrnují následující proteiny:

Peptid

Trombomodulin (408-426)

Lidský GPIba (269-287)

Lidský kofaktor heparinu 11(56-75)

Lidský fibrinogen γ' (408-427) a-2-Antiplasmin

Sekvence

ECPEGY1LDDGFICTDIDE

DEGDTDLYDYYPEEDTEGD

GEEDDDYLDLEEDDDY1DIVD

VRPEHPAETEYDSLYPEDOL

PPMEEDYPQFGSP • · • ·

Cholecystokinin (CCK) α,-2-Choriogonadotropin

Komplement C4

PSGL-1

Faktor VIII (716-731)

Lumican

Produkce a selekce Yl

RISDRDYMGWMDF

CHCSTCYYHKS-COOH

MEANEDYEDYEYDELPAK

QATEYEYLDYDFLPET

GDYYEDSYEDISAYLL

GYYDYDFPL [193.] Jedním příkladem protilátky podle předkládaného vynálezu, která se váže k epitopům vzorce I až III je zcela lidská protilátka Yl. Selekce, produkce a počáteční charakteristika Yl jsou detailně popsány v U S Patentových přihláškách č. 09/751 181 a č. 60/258 948. Stručně řečeno, fágová displejová knihovna exprimující fragmenty protilátky scFv byla použita pro získání a produkci cílících molekul, a průtoková cytometrie, zejména fluorescenční třídění aktivovaných buněk (FACS), bylo použito pro identifikaci a izolaci specifických fágových klonů, jejichž peptid nebo polypeptid rozpoznává cílové buňky. Použitá fágová expresní knihovna byla zkonstruována z lymfocytů periferní krve neimunizovaných lidských donorů.

[194.] Fágové klony byly selektovány a identifikovány mnohostupňovým postupem, známých jako biopanning.

Biopanning byl prováděn inkubací fágů exprimujících ligandové varianty (fágové expresní (displejová) knihovna)s cíli, s odstraněním nenavázaných fágů promývací technikou, a specifickou elucí navázaných fágů. Eluované fágy byly případně amplifikovány před vzetím do dalších vazebných cyklů a případná amplifikace obohatily pool specifických

sekvencí ve prospěch fágových klonů nesoucích protilátkové fragmenty, které vykazovaly nejlepší vazbu k cíli. Po několika cyklech byly jednotlivé fágové klony charakterizovány a byly stanoveny sekvence peptidů exprimovaných klony sekvenováním odpovídající DNA fágového virionu.

[195.] Podle předkládaného vynálezu byl v počátečních stupních biopanningu prováděn screening destiček proti neidentifikovaným epitopům, s následnou selekcí klonů prováděnou s požadovanou cílovou buňkou (např. buňkami BCLL, buňkami AML, buňkami mnohočetného myelomu a metastatickými buňkami), jejichž cílové buněčné povrchové markéry jsou známy.

[196.] Maligní a nemocné krevní buňky (např. leukemie a lymfomu) jsou charakterizovány jako nezralé buňky, které exprimují buněčné povrchové proteiny normálně nalézané na částečně diferencovaných hematopoetických progenitorech.

Z tohoto důvodu nejsou destičky zajímavým zdrojem pro identifikaci povrchových markérů nezralých buněk, jež jsou exprimovány na nemocných nebo maligních krevních buňkách.

[197.] Byl selektován klon scFv, produkující Yl, který se váže k destičkám a myelogenním leukemickým buňkám, zejména k buňkám AML. Yl scFv má sekvenci SEQ ID NO: 25. Vazebné charakteristiky Yl lze primárně přičíst na vrub CDR3 oblasti , která má sekvenci SEQ ID NO: 8. Rovněž byly připraveny úplné protilátky Yl-IgG.

[198.] Byl rovněž selektován druhý klon scFv, Y17, který se váže k destičkám a buněčným liniím získaným z lidských myelogenních leukemických buněk, zejména buněk

AML. Y17-scFv má sekvenci SEQ ID NO: 203. Vazebné charakteristiky Y17 lze primárně přičíst na vrub CDR3 oblasti těžkého řetězce, která má sekvenci SEQ ID NO: 20.

Příprava protilátek [199.] Oblasti CDR podle předkládaného vynálezu mohou být rovněž inzerovány do kazet pro produkci protilátek. Podle předkládaného vynálezu je kazetou, užitou pro polypeptidy, míněna určitá sekvence po sobě následujících aminokyselin, která slouží jako čtecí rámec, je považována za jednu jednotku a je s ní jako s takovou zacházeno. Aminokyseliny mohou být zaměněny, inzerovány, odstraněny, nebo připojeny na jednom nebo obou koncích. Podobně mohou být aminokyselinové úseky (stretches) zaměněny, inzerovány, odstraněny nebo připojeny na jednom nebo obou koncích.

[200.] Aminokyselinová sekvence kazety může být zdánlivě neměnná, zatímco zaměněné, inzerované nebo připojené sekvence mohou být vysoce variabilní. Kazeta může být složena z řady domén, z nichž každá obsahuje kritickou funkci pro konečný konstrukt.

[201.] Hypervariabilní oblasti protilátek podle vynálezu tvoří vazebné místo pro antigen u protilátek podle předkládaného vynálezu. Vazebné místo pro antigen je komplementární ke struktuře epitopů, ke kterým se protilátky vážou, a proto je nazýváno jako komplementaritu určující oblasti (complementarity-determining regions,

CDRs). Existují tři CDRs na každém lehkém a těžkém řetězci protilátky, každá umístěná na smyčkách, které spojují β řětězce domén V_H a V_L.

• · · · · [202.] Kazeta podle zvláštního provedení podle předkládaného vynálezu obsahuje od N-konce, čtecí rámec oblasti 1 (FRl), CDRl, čtecí rámec oblasti 2 (FR2), CDR2 a čtecí rámec oblasti 3 (FR3).

[203.] V provedení podle vynálezu je možné zaměnit odlišné oblasti uvnitř kazety. Tak například, v kazetě mohou být hypervariabilní oblasti CDR2 a CDRl zaměněny nebo modifikovány nekonzervativními nebo výhodně konzervativními substitucemi aminokyselin. Konkrétněji, oblasti kazety CDR2 a CDRl, sestávající ze sekvence po sobě následujících aminokyselin, vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-113 nebo jejich fragment, mohou být zaměněny sekvencí SEQ ID NO:115 a 114 v uvedeném pořadí. Nejkonkrétněji, oblasti kazety CDR2 a CDRl, sestávající ze sekvence po sobě následujících aminokyselin, vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30-32, 35, 37-39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59-68, 70, 71, 76-85, 87, 89-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 a 113 nebo jejich fragment, mohou být zaměněny sekvencí SEQ ID NO: 115 a 114 v uvedeném pořadí.

[204.] Ve výhodném provedení podle vynálezu obsahuje peptid nebo polypeptid těžký a lehký řetězec, přičemž každý řetězec obsahuje první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, kterými jsou CDR3, CDR2 a CDRl oblasti, v uvedeném pořadí. Vazebná selektivita a specifičnost jsou determinovány zejména CDR3 oblastí řetězce, pravděpodobně CDR3 oblastí lehkého řetězce a výhodně CDR3 oblastí těžkého řetězce, a druhotně oblastmi CDR2 a CDRl lehkého řetězce, výhodně pak těžkého řetězce. Vazebná selektivita a specifičnost mohou být druhotně ovlivněny oblastmi lemujícími proti a po směru první, druhé a/nebo třetí hypervariabilní oblasti.

[205.] Ve výhodném provedení oblast CDR3 peptidu nebo polypeptidu má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24.

[206 Ve výhodnějším provedení má oblast CDR3 těžkého řetězce aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, CDR2 má aminokyselinovou sekvenci identickou se SEQ ID NO:115, a oblast CDR1 má aminokyselinovou sekvenci identickou se SEQ ID NO:114 [207.] V nejvýhodnějším provedení podle vynálezu má oblast CDR3 aminokyselinovou sekvenci identickou se SEQ ID NO: 8 .

[208.] Výhodným provedením podle vynálezu je scFv se sekvencí CDR3 identickou se SEQ ID NO:8 a s úplnou sekvencí scFv identickou se SEQ ID NO:25.

[209.] V nejvýhodnějším provedení vynálezu, mají oblasti CDR3, CDR2 a CDRl aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 8, 115. a 114, v uvedeném pořadí.

[210.] V dalším provedení podle vynálezu obsahuje peptid Fv oblast CDRl a CDR2 variabilního těžkého řetězce, který sám o sobě obsahuje kazetu s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 30113; oblast CDR3, výhodně variabilního těžkého řetězce, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; oblast proti směru, lemující CDR3 oblast, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117; oblast po směru, lemující CDR3 oblast, která má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 116; spacer z 0-20

..... ........

aminokyselinových zbytků o sekvenci SEQ ID NO: 123 nebo 124; variabilní oblast lehkého řetězce se sekvencí, kterou je SEQ ID NO: 7.

[211.] Podobně, v dalším provedení oblast lemující CDR2 oblast proti směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119; oblast lemující CDR2 oblast po směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, oblast lemující CDR1 oblast proti směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 121 a oblast lemující oblast CDR1 po směru, má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:120.

[212.] Ve výhodném provedení podle vynálezu je poskytnut peptid nebo polypeptid, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR2 a CDRl hypervariabilní oblast, v uvedeném pořadí, a ve kterém aminokyselinovou sekvencí pro CDR3 je SEQ ID NO:8, aminokyselinovou sekvencí pro CDR2 je SEQ ID NO: 115, aminokyselinovou sekvencí pro CDRl je SEQ ID NO:114, a ve kterém oblast lemující oblast CDR3 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:117, oblast lemující oblast CDR3 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:116, oblast lemující oblast CDR2 proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 119, oblast lemující oblast CDR2 po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 118, oblast lemující oblast CDRl proti směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:121 a oblast lemující oblast CDRl po směru má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:120.

[213.]. Jiné provedení podle vynálezu poskytuje molekulu Fv, která obsahuje první řetězec, mající první, druhou a třetí hypervariabilní oblast, a druhý řetězec, maj'ící první druhou a třetí hypervariabilní oblast, ve které jedna z hypervariabilních oblastí prvního řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 824, a ve které jedna z hypervariabilních oblastí druhého řetězce má sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202, a ve které první, druhou a třetí hypervariabilní oblastí jsou CDR3, CDR2 a CDR1 oblast v uvedeném pořadí, přičemž Fv je scFv nebo dsFv, mající jednu nebo více identifikátorových sekvencí.

[214.] Jiné provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid (i) ve kterém každý z prvního a druhého řetězce obsahuje první hypervariabilní oblast vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24; nebo (ii) ve kterém první hypervariabilní oblasti prvních a druhých řetězců jsou identické a jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24, nebo (iii) ve kterém první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 8-24 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202; nebo ve kterém první hypervariabilní oblast prvního řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1-6 a 125-202 a první hypervariabilní oblast druhého řetězce je vybrána ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 824 .

Další provedení podle vynálezu poskytuje peptid nebo polypeptid, ve kterém druhou a třetí hypervariabilní oblastí prvního řetězce jsou SEQ ID NO: 114 a 115 v uvedeném pořadí [215.] Pokud se jedná o všechny aminokyselinové sekvence z 25 aminokyselinových zbytků zde popsaných a podrobně uvedených (např. CDR oblasti, CDR lemující • ·«·* ··· • · · · ·»·· • · · · · ·· ····« oblasti), je třeba chápat a jako další provedení podle vynálezu vzít v úvahu, že tyto aminokyselinové sekvence zahrnují ve svém rozsahu i sekvence s jednou nebo dvěmi aminokyselinovými substitucemi, a že substitucemi jsou výhodně konzervativní aminokyselinové záměny. Pokud se jedná o všechny aminokyselinové sekvence z > 25 aminokyselinových zbytků zde popsaných a podrobně uvedených, je třeba chápat a jako další provedení podle vynálezu vzít v úvahu, že tyto aminokyselinové sekvence zahrnují ve svém rozsahu i sekvence s 90% sekvenční podobností s původní sekvencí (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)). Podobné nebo homologní aminokyseliny jsou definovány jako neidentické aminokyseliny, které vykazují podobné vlastnosti, např. kyselost, zásaditost, aromatičnost, velikost, pozitivní nebo negativní náboj, polaritu a nepolaritu.

[216.] Procento aminokyselinové podobnosti nebo homologie nebo sekvenční podobnosti je stanovováno srovnáním aminokyselinových sekvencí dvou odlišných peptidů nebo polypeptidů. Dvě sekvence jsou seřazeny vedle sebe (alignment), obvykle s použitím jednoho z řady počítačových programů navržených pro tento účel, a jsou porovnávány aminokyselinové zbytky v každé pozici. Takto je stanovena aminokyselinová identita nebo homologie. Poté je použit algoritmus pro stanovení procenta aminokyselinové podobnosti. Obecně je upřednostňováno porovnávat aminokyselinové sekvence, a to vzhledem ke značně zvýšené citlivosti detekce nepatrných souvztažností mezi molekulami peptidů, polypeptidů nebo proteinů. Proteinové porovnání může vzít v úvahu přítomnost konzervativních aminokyselinových substitucí, zatímco chybné párování (mismatch) může poskytnout pozitivní skóre, jestliže neidentické aminokyseliny mají podobné fyzikální a/nebo chemické vlastnosti (Altschul et al., Nucleíc ňcids Res., 25, 3389-3402 (1997).

[217.] V provedení podle vynálezu mohou tři hypervariabilní oblasti každého z lehkých a těžkých řetězců být 'vzájemně zaměněny mezi dvěmi řetězci a mezi třemi hypervariabilními místy uvnitř a/nebo mezi řetězci.

Polyklonální protilátky proti V_L (odvozeném z Yl) [218.] Fragment DNA kódujici doménu V_L (variabilního lehkého řetězce) lidské protilátky byl klonován PCR z klonu Yl (identický fragment může být získán z jakéhokoliv klonu knihovny Nissim I (Nissim et al.,Antibody fragments from a „single pot phage display library as immunochemical reagents, EMBO J. 13 (3): 692-698 (1994)), nebo dokonce z lidského genomu s použitím shodné metodologie) s následujícími syntetickými oligonukleotidovými primery: oligo 5'-WdeI (TTTCATATGGAGCTGACTCAGGACCCTGCT) a oligo 3'EcoRl (TTTGAATTCCTATTTTGCTTTTGCGGC). Po amplifikaci polymerázovou řetězcovou reakcí (podmínky PCR: 94° 1', 56° ',72° 2'x 30, pak 65° 5') byl získaný fragment DNA štěpen restrikčními enzymy Ndel a FcoRI a klonován do míst restrikčních enzymů Ndel a FcoRI předem štěpeného plasmidu, kterým je IPTG indukovatelný expresní vektor používaný pro prokaryontní expresi rekombinantních proteinů v E.coli. Buňky E. coli byly transformovány s ligační směsí a pozitivní klony byly selektovány amplifikaci PCR s použitím výše uvedených oligonukleotidových primerů. Buňky nesoucí tento plasmid byly pěstovány a indukovány k expresi pomocí IPTG. Po indukci IPTG byly bakteriální buňky sklizeny centrifugací z jednolitrové kultury, inkluzní tělíska byla • 4· ·· ·· · Q · · · ♦ « · · · • · · · · · · • · ··· ·· >

··· ·· ·· *·· ·· · izolována a solubilizována v guanidin-HCl + DTT, refolding byl proveden ředěním v pufru obsahujícím Tris-Arginin-EDTA. Po refoldingu při 5-10° po dobu 48 hodin byl roztok obsahující protein dialyzován a koncentrován proti 20mM glycinu, pH 9. Dialyzovaný roztok obsahující proteiny byl opakovaně purífikován s použitím ionto-výměnného sloupce HiTrapQ a eluován gradientem NaCl. Hlavní pík byl analyzován SDS PAGE a gelovou filtrací. Z původního 1 litru kultury bylo získáno alespoň 10 mg purifikovaného V_L.

[219.] Králíci byli imunizováni V_L (400 mg) v přítomnosti CFA (kompletní Freundovo adjuvans), poté V_L (200 mg) v přítomnosti IFA (nekompletní Freundovo adjuvans) ve 2 až 4 týdenních intervalech. Získané titry byly nízké (1:50 - 1:100) pravděpodobně díky vysoké homologii mezi lidskými a králičími řetězci V_L.

Polyklonální protilátky proti protilátkám scFv [220.] Dva jednotlivé klony scFv (Yl a N14), získané z protilátkové fágové expresní knihovny Nissim I (Nissim et al.,Antibody fragments from a 'single poťphage display library as immunochemical reagents, EMBO J. 13 (3): 692698 (1994)), byly odděleně kultivovány. Po indukci IPTG byly kultury pěstovány při 22°C po dobu 16 hodin.

Protilátkové fragmenty scFv byly sklizeny z periplasmy bakteriálních buněk a byly purifikovány na sloupci Protein A-Sepharose. Všechny postupy kultivace při bakteriálním klonování, postup indukce, sklizně fragmentu protilátky scFv a purifikace protilátkového fragmentu byly prováděny v souladu s : Harrison J. L., Williams S. C., Winter G, and Nissim A. Methods Enzymol. 267: 83-109 (1996). V podstatě mohou být selektovány jakékoli dva nebo více jednotlivé »· · · · klony z protilátkové fágové expresní knihovny Níssím I tak, aby bylo možné připravit králičí polyklonální protilátky, které rozpoznávají jakoukoliv jednotlivou protilátku scFv, která je přítomna v knihovně Nissim, nebo jako jakýkoliv IgG nebo jeho fragment, za předpokladu, že obsahuje stejný řetězec V_L nebo jeho fragment.

[221.] Králíci byli imunizováni 400 mg v poměru 1:1 směsi purifikovaných protilátkových fragmentů scFv v přítomnosti kompletního Freundova adjuvans a poté 200 mg této směsi v přítomnosti nekompletního Freundova adjuvans ve 2 až 4týdenních intervalech.

[222.] Pro detekci protilátek scFv vázajících se k buňkám průtokovou cytometrií (FACS) nebo k různým proteinovým frakcím na SDS-PAGE (Western blotting analýzou) byly polyklonální protilátky proti scFv použity přímo ze séra imunizovaných králíků nebo po purifikaci na sloupci. Protein A-Sepharose.

Charakteristika vazebných míst na destičkách pro Yl [223.] Cirkulující destičky jsou cytoplasmatické partikule uvolňované z periferní části megakaryocytů. Destičky mohou hrát významnou roli v hemostázi. Po vaskulárním poškození adherují destičky k povrchu poškozené tkáně a vzájemně se spojují (koheze). Tento sled procesů vzniká rychle za tvorby bezstrukturní hmoty (obecně nazývané destičková zátka nebo trombus) v místě vaskulárního poškození. Fenomén koheze, rovněž známý jako agregace, může být iniciován in vitro řadou látek, nebo agonistů, jako je: kolagen, adenosin-difosfát (ADP) epinefrin, serotonin a ristocetin. Agregace je jedním « · ··· · · ♦ · · · · ··· · · · · · • ····· · · · · · • · · · · · · ₇₃ .........

z řady testů in vitro, používaných pro měření funkce destiček.

[224.] Řada důkazů v dosavadním stavu techniky naznačuje, že shluk negativně nabitých aminokyselin mezi Asp269 a Asp287 v GPIba má význam pro vazbu von

Willebrandova faktoru (vWF) k destičkám, který naopak zprostředkovává adhezi destiček k poškozeným krevním cévám, agregaci destiček způsobenou vysokým silovým namáháním v oblastech arteriální stenózy a aktivaci destiček indukovanou nízkými koncentracemi trombinu Ward, C. M., et al., Biochemistry 35 (15): 4929-39 (1996). Interakce vWF s GPIb je závislá na aktivaci nebo konformační změně ve struktuře vWF, jestliže je vázán k matrix nebo je exponován silovému namáhání. Tento proces je napodoben in vitro specifickými modulátory, které se vážou k vWF, jakými jsou ristocetin a botrocetin.

Reaktivita Yl k buněčnému extraktu z destiček [225.] Byl použity imunoblotting a štěpení endoproteázou pro identifikaci epitopu pro Yl na povrchové membráně destiček. Endoproteázová štěpící místa na molekule GPIba jsou znázorněna na Obr. 1.

Analýza Western blotting [226.] Yl-scFv byl selektován z fágové protilátkové knihovny bíopanningem na lidské destičky a bylo zjištěno, že se váže k fixovaným a promytým lidským destičkám. Charakterizace Yl byla prováděna zkouškou ELISA a analýzou

FACS.

• · [227.] Pro charakterizaci epitopu na membráně destiček, ke kterému se váže Yl, byly odděleny povrchové proteiny destiček pomocí SDS-PAGE (jak za redukčních, tak za neredukčních podmínek) a byl proveden imunoblotting s biotinem značeným Yl. Výsledky tohoto pokusu prokazují, že Yl reaguje s proteinem o molekulové hmotnosti 135 kDa za redukčních podmínek a s proteinem o molekulové hmotnosti 160 kDa za neredukčních podmínek. Tyto molekulové hmotnosti odpovídají destičkovému GPIba, který má molekulovou hmotnost 135 kDa za redukčních podmínek. Za neredukčních podmínek má řetězec GPIba, vázaný disulfidovým můstkem k GPIbP, molekulovou hmotnost 160 kDa. (Obr. 2).

[228.] Řetězec GPIba je vázán disulfidovým můstkem k GPIbp řetězci za tvorby destičkového membránového proteinu GPIb. Je známo, že se monoklonální protilátky, MCA466S (Serotec) a S.C.7071 (Santa Cruz) vážou v uvedeném pořadí ke C-koncovému fragmentu GPIba a k N-konci GPIba, a rovněž bylo zjištěno, že reagují se stejnými fragmenty, s nimiž za redukčních a neredukčních podmínek reaguje Yl (S.C. byla použita pouze za redukčních podmínek). Tyto výsledky dále potvrzují, že Yl se váže k destičkovému povrchovému proteinu GPIba.

[229.] Další analýza semipurifikovaného fragmentu GPIb (glycocalicinu) Western analýzou potvrdila, že se Yl skutečně váže k alfa podjednotce komplexu GPIb.

[230.] Western analýza rekombinantního GPIb exprimovaného v E. coli prokázala, že GPIb exprimovaný v E. coli nereaguje s Yl. Z tohoto důvodu se jeví, že posttranslační modifikace, které v E.coli neprobíhají, jsou pro vazbu Yl nezbytné. Ani N- nebo O-glykanázy nepůsobí na «

být aryl_{Π Γ} · · · · ·

5 vazbu Yl k buňkám KG-1. Nicméně, vazba Yl může inaktivována (eliminována) působením ligandů s sulfatázami nebo proteázami.(Obr. 3).

Lokalizace místa epitopu pro Y1 na fragmentu GPIba glycocalicinu (GC) [231.] Pro další lokalizaci vazebného místa pro Yl byly ke štěpení GPIb použity specifické endoproteázy se známými štěpícími místy a fragmenty byly testovány na vazbu Yl.

Účinek O-sialoglykoprotein endoproteázy na vazbu Yl k destičkovému GPIba [232.] Enzym O-sialoglykoprotein endoproteáza z Pasteurella haemolytica (Cedarlan CLE 100) selektivně štěpí lidský destičkový GPIb a specificky štěpí pouze proteiny obsahující sialylované, O-vázané glykany. 0sialoglykoprotein endoproteáza neštěpí N-vázané glykoproteiny nebo neglykosylované proteiny. Uvádí se, že tento enzym štěpí GPIb, které je silně O-glykosylován, avšak nikoliv GPIIb-IIIa nebo jiné receptory na destičkách. GPIba byl O-sialoglykoprotein endoproteázou štěpen tak, aby byla dále stanovena vazba Yl k molekule.

[233.] Imunobloty (Obr. 4 a 5) a analýza FACS (Obr. 6) znázorňují, že inkubace promytých destiček s 0sialoglykoprotein endoproteázou ruší vazbu Yl, stejně jako vazbu monoklonální protilátky MCA466S (Serotec), která je namířena proti GPIba. Endoproteáza nepozměňovala vazbu monoklonální protilátky (anti-CD61) namířené proti • · · · ·

• · · ····· • · · · • · · · · ·

GPIIb/IIIa (Obr. 4). Tyto výsledky poskytují další důkaz, že receptorem pro Yl na destičkových membránách je GPIba.

Štěpení GPIb mocarhaginem - mapování epitopu pro Yl [234.] Mocarhagin (Sigma L4515a) je metaloproteináza z jedu kobry, která štěpí destičkový GPIba specificky v jednom místě mezi zbytky Glu-282 a Asp-283, za vzniku dvou stabilních produktů: ~45 kDa N-koncového fragmentu (His-1 až Glu-282), který je uvolňován do supernatantu, a na membránu vázaného ~95 kDa C-koncového fragmentu.

[235.] Na promyté destičky bylo působeno mocarhaginem a lyzáty destiček byly po elektroforéze na SDSpolyakrylamidových gelech přeneseny na nitrocelulózu. Analýza Western blotting lyzátů promytých destiček, na které bylo působeno mocarhaginem, s Yl prokazuje ztrátu pruhu, odpovídajícího GPIba (135 kDa), a vazbu Yl k Nkoncovému ~45 kDa fragmentu. Monoklonální protilátka (MCA466S) namířená proti C-koncovému fragmentu GPIba reagovala s ~95 kDa C-koncovým fragmentem a monoklonální protilátka (S.C.7071) namířená proti N-koncovému fragmentu GPIba reagovala se shodným ~45 kDa fragmentem, jenž byl rozpoznáván Yl (Obr. 7).

[236.] Působení mocarhaginu na glycocalicin (rozpustný, extracelulární fragment GPIba) poskytlo výsledky podobné těm, které byly zjištěny u promytých destiček a prokazují vazbu Yl a monoklonální protilátky S.C.7071 k ~45 kDa N-koncovému fragmentu, jako produktu štěpení GPIba (Obr. 8). Tyto výsledky dokazují, že epitop pro Yl je obsažen uvnitř sekvence His-1 až Glu-282.

• ·

Charakterizace klonu Y17 - vazba k GPIb [237.] Y17, druhý lidský protilátkový fragment scFv podle vynálezu, který byl selektován stejným způsobem jako Yl, byl charakterizován s využitím metod použitých pro charakterizaci Yl. [viz Příklad 17]. Stručně řečeno, Y17 byl selektován z fágové protilátkové knihovny biopanningem na lidské destičky. Charakterizace Y17 byla prováděna s použitím zkoušky ELISA a analýzy FACS. Bylo zjištěno, že Y17 se váže jak k fixovaným, tak k promytým lidským destičkám. Pro další charakterizaci receptoru na destičkových membránách, který váže Y17, byly destičkové proteiny odděleny pomocí SDS-PAGE a imunoblotovány s biotinem značeným Y17 za redukčních a neredukčních podmínek. Výsledky prokázaly, že Y17 reaguje s proteinem, majícím zjevnou molekulovou hmotnost 135 kDa za redukčních podmínek, a s proteinem, majícím zjevnou molekulovou hmotnost ~160 kDa za neredukčních podmínek. Získané výsledky odpovídají destičkovému GPIba, který za redukčních podmínek má molekulovou hmotnost 135 kDa a za neredukčních podmínek má molekulovou hmotnost 160 kDa, a sestává z řetězce GPIba propojeným disulfidovým můstkem s GPIba. Monoklonální protilátka MCA466S (Serotec), namířená proti C-koncovému fragmentu GPIba, a monoklonální protilátka S.C.7071 (Santa Cruz), která rozpoznává N-konec GPIba, reagují za redukčních a neredukčních podmínek se stejnými pruhy jako Y17 (Obr. 2).

[238.] Western blotty naznačují, že Yl a Y17 se podobně vážou k destičkovým lyzátům (Obr. 9).

• ·

[239.] Yl a Y17 se také podobně vážou ke glycocalicinu po štěpení glycocalicinu O-sialoglykoprotein endoproteázou nebo ficinem (Obr. 5 a 10).

[240.] Analýza FACS prokázala, že Yl a Y17 mají podobné vazebné profily k destičkám a k buňkám KG-1. Kromě toho, oba se nevážou s buňkami Ráji a T2. Naopak, TMI (SEQ ID NO:209), Y16 (SEQ ID NO:210) a Y45 se nevážou k žádné z výše uvedených lidských buněčných linií.

[241.] Uvedené výsledky prokazují, že Yl a Y17, dva monoklonální protilátkové fragmenty podle předkládaného vynálezu, rozpoznávají epitop na různých buňkách, a že tento epitop není rozpoznáván jakoukoliv jinou z testovaných monoklonálních protilátek.

Štěpení GPIb cathepsinem G - mapování epitopů pro Yl [2421.] Cathepsin G (Sigma C4428), serinová proteáza neutrofilů, štěpí glycocalicin v prvém štěpícím místě mezi zbytky Leu-275 a Tyr-276 a ve druhém štěpícím místě mezi zbytky Val-296 a Lys-297. Působení cathepsinu G na glycocalicin poskytuje dva N-koncové fragmenty: malý Nkoncový fragment o 42 kDa (Hís-1 až Leu-275) a velký Nkoncový fragment o 45 kDa (His-1 až Val-296), a odpovídající ~95 kDa C-koncové fragmenty. (Obr. 1).

[243.] Glycocalicin a fragmenty glycocalicinu, generované štěpením cathepsinem G, byly podrobeny elektroforéze na SDS-polyakrylamidových gelech a přeneseny na nitrocelulózu pro Western analýzu. V imunoblotech se Yl vázal k většímu N-koncovému fragmentu (His-1 až Val-296), avšak nikoliv k menšímu N-koncovému fragmentu(Hís-1 až Leu• ····· · · ·· · • · · · · · · ·*· ·· ·· ··· ··

275), ani k C-koncovému fragmentu. Podobně, komerčně dostupná monoklonální protilátka SZ2 (Immunotech 0719), o níž je známo, že rozpoznává epitop na GPIba mezi zbytky Tyr-276 a Glu-282, rovněž reaguje pouze s větším N-koncovým fragmentem (Obrázky 11 and 12).

[244.] Kromě toho se monoklonální protilátka S.C.7071, o které je známo, že rozpoznává epitop mezi His-1 a Leu275, vázala k oběma N-koncovým fragmentům. Yl se neváže k fragmentu His-1 až Leu-275, který je vázán S.C.7071. Tyto výsledky prokazují, že epitop pro Yl je lokalizován mezi prvním a druhým místem štěpení cathepsinem G, které je uvnitř sekvence Tyr-276 až Val-296, nebo pravděpodobněji mezi aminokyselinami ~276 až 282.

Účinek parciálních syntetických GPIba peptidů na vazbu Yl k purifikovanému glycocalicinu a k promytým destičkám (washed platelets, WP) [245.] Byla provedena zkouška ELISA pro stanovení účinku syntetických peptidů odvozených z GPIb na vazbu Yl k purifikovanému glycocalicinu. Kromě toho byla provedena analýza FACS s použitím promytých destiček.Kompetitivní vazebná analýza FACS byla použita pro stanovení významu sulfatovaného tyrosinů uvnitř vazebného místa GPIb pro Yl. Yl-scFv v koncentraci 1 μρ byl předem inkubován s odlišnými peptidy o koncentracích 2,5 a 200 μΜ. Po této preinkubaci po dobu 30 minut pří teplotě místnosti byla směs přidána do zkumavky obsahující ~10⁷ promytých destiček a byla stanovována vazba Yl k promytým destičkám s použitím polyklonální králičí anti-scFv-PE protilátky. Byl stanoven inhibiční účinek peptidů ve srovnání s vazbou kontroly (samotný Yl) měřením zbytkové vazby Yl k promytým destičkám. Peptidy a výsledky jsou popsány v Tabulkách 1 a 3, v uvedeném pořadí, a jsou podobné výsledkům, které byly zjištěny s použitím shodných peptidů ve zkoušce ELISA (Tabulka 2). V obou zkouškách byla stanovována kontrolní úroveň vazby Yl následovně. Polystyrénová mikrotitrační destička MaxiSorp™ byla potažena (a) purifikovaným glycocalicinem nebo (b) promytými destičkami. Po intenzivním promývání byl přidán Yl v množství 0,5 μg/jamka. Destička pak byla inkubována s králičí anti-scFv s následným přidáním anti králičí-HRP (horše radish peroxidase, křenová peroxidáza)) a substrátu pro HRP. Byla měřena úroveň vazby anti králičí-HRP intenzitou produkovaného zbarvení, přičemž úroveň vazby anti králičíHRP koreluje s úrovní vazby anti Yl-scFv a úrovní vazby Yl. Byla měřena optická denzita při A₄o5- Každý vzorek byl testován duplicitně a byl vypočten průměr.

[246.] Účinek syntetických GPIba peptidů na vazbu Yl k purifikovanému glycocalicin byl stanoven smísením různých koncentrací peptidů s konstatním množstvím Yl. Po preinkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti byla směs přidána do polystyrénové mikrotitrační destičky Maxisorp potažené purifikovaným glycocalicinem tak, jak je popsáno u stanovení vazby Yl v nepřítomnosti peptidů. Inhibiční účinek peptidů byl stanovován měřením zbytkové vazby Yl ke glycocalicinu s použitím králičích anti Yl-scFv a anti králičích-HRP protilátek, jak je popsáno pro stanovení vazby Yl v nepřítomnosti peptidů. Pokus byl prováděn se čtyřmi peptidy, které reprezentovaly různé podskupiny ze sekvence 268 až 285, a kontrolním peptidem. Každý peptid byl testován v odlišných koncentracích 200 μΜ, 2 5 μΜ, 2,5 μΜ a 0,5 μΜ .

[247.] Pět peptidů uvádí následující Tabulka 1:

Tabulka 1

Název peptidu	Charakterizace	Sekvence
EGR	negativní kontrolní peptid	REEGRQHFFLLEGRSSYS
P-l	zbytky 268-285 GPIba	GDEGDTDLYDYYPEEDTE
P-l-S	zbytky 268-285 GPIba	GDEGDTDLY*DY*Y*PEEDTE
P-2-S	zbytky 273-285 GPIba	TDLY*DY*Y*PEEDTE
P-3-S	zbytky 268-280 GPIba	GDEGDTDLY*DY*Y*P

Y* je identický s Y, tj. tyrosin, který je však sulfatovaný.

[248.] Výsledky získané v těchto zkouškách jsou uvedeny v Tabulkách 2 a 3 níže.

Tabulka 2

Účinek syntetických GPIba peptidů na vazbu Yl ke glycocalicinu, 0,25 pg/jamka Yl

	Zbytková vazba Yl (% základu)
Koncentrace peptidů	200 μΜ	2 5 μΜ	2,5 μΜ	0,5 μΜ

EGR	85	89	100	121
P-l	61	71	94	CO co
P-l-S	0	25	62	89
P-2-S		15	52	78
P-3-S		21	67	80

[249.] Tyto výsledky jasně ukazují, že inhibiční účinek peptidů obsahujících sulfatovaný tyrosin je signifikantně vyšší, než účinek pozorovaný u nesulfatovaných peptidů. Účinek je závislý na dávce a peptidy obsahující delší (v protisměru) lemující sekvence mají vyšší inhibiční účinek, než peptidy s prodloužením C'(po směru) lemujícími sekvencemi. Výsledky zřetelně podporují závěr, že sulfatovaný tyrosin je vyžadován pro vazbu Yl ke GPIba, a že sekvence proti směru a po směru od sulfatované oblasti zvyšují vazbu Yl ke GPIba.

Tabulka 3

Účinek syntetických GPIba peptidů na vazbu Yl k promytým destičkám, jak byl zjištěn komparativní analýzou FACS.

	Zbytková vazba Yl (% základu) (geometrický průměr)
Koncentrace peptidů	200 μΜ	2,5 μΜ
EGR	119	96
P-l	87	106
P-l-S	5	41
P-2-S	7	61
P-3-S	26	82
Kontrola-žádný peptid	114

• · ··· ·· · ···· * · · · · · · · · · ···· • · · · · · · » g β ····· ·« · »· · · · [250.] Tyto výsledky dále podporují hypotézu, že sulfatované zbytky tyrosinu uvnitř specifické oblasti jsou významné pro rozpoznání Yl na GPIb. Shrnuto, analýza Nkoncových peptidových fragmentů proteolýzy mocarhaginem a cathepsinem G naznačuje, že aminokyselinová sekvence Tyr276 až Glu-282 v GPIba je nebo obsahuje významný epitop pro vazbu Yl (Obr.3 ). Další charakterizace naznačuje, že kromě zbytků 276-282 (sulfatovaná aniontová sekvence) glycocalicinu, jsou aminokyseliny v protisměru od poloh 283-285 zúčastněny v rozpoznávacím místě pro Yl.

Biologická aktivita Yl-scFv, Y17-scFv a IgG Yl na funkci destiček [251.] Pokusy ke stanovení lokalizace naznačují, že vazebné místo pro Yl je umístěno ve vazebných místech pro alfa-trombin a vWF, které jsou významné pro agregaci destiček. Z tohoto důvodu byly studovány vazba Yl-scFv, Y17-scFv, a Yl-IgG k promytým destičkám a k plasmě bohaté na destičky ke stanovení účinků vazby na agregaci destiček.

Účinek Yl-scFv and Y17-scFv na aglutinaci promytých destiček (washed platelets, W.P.) [252.] Agregace je stanovována v PRP díky přítomnosti trombotických agens, zatímco aglutinace je stanovována u promytých destiček. Účinek Yl (scFv) na aglutinaci promytých destiček byl testován za různých koncentrací Yl. Destičky byly předem inkubovány s Yl-scFv, Y17-scFv, Y16scFv, nebo s kontrolním TM-1 scFv po dobu 4 min při 37° C před expozicí k ristocetinu, který je induktorem aglutinace a agregace destiček.

• · • · · · · ·»· · ·· • · · ·· · ···· • «· · · · · · · · ····· [253.] Výsledky těchto studií jsou uvedeny v Tabulce 4 a na Obr. 15. Preinkubace destiček s 25 μς/ιηΐ Yl-scFv inhibovala aglutinaci promytých destiček indukovanou ristocetinem. Při koncentraci Yl 12,5 μg/ml, byla pozorována pouze částečná aglutinace destiček. Při koncentraci Yl 4 μρ/ml nebyla pozorována žádná aglutinace destiček. Uvedené výsledky naznačují, že inhibiční aktivita Yl na aglutinaci promytých destiček je závislá na dávce. Inkubace promytých destiček s scFv TMI, jako negativní kontrolou, neměla žádný vliv na aglutinaci destiček indukovanou ristocetinem. Ani Y17, ani Y16, které jsou jinými klony scFv selektovanými ze stejné fágové expresní knihovny s použitím shodného mnohastupňového postupu použitého pro selekci Yl, významně neinhibovaly aglutinaci promytých destiček.

Tabulka 4

Koncentrace scFv	% inhibice	% aglutinace
TM-1 scFv 25 gg/ml	10	90
Yl-scFv 25 μg/ml	77	23
Yl-scFv 12,5 pg/ml	33	67
Yl-scFv 4 gg/ml	8	92
Yl7-scFv 25 μρ/ιηΐ	15	85
Y16-scFv 38 μρ/πιΐ	14	86

★ 100 % aglutinace je kalibrováno na základě působení ristocetinu

Účinek Yl-scFv a Yl7-scFv na agregaci plasmy bohaté na destičky (Platelet-Rich-Plasma, PRP) [254.] Účinek Yl (scFv) na agregaci plasmy bohaté na destičky (platelet-rich-plasma, PRP) byl testován při

různých koncentracích Yl. PRP byla předem inkubována s YlscFv, Yl7-scFv, nebo s kontrolním TM-1 scFv po dobu 4 minut při 37° C před expozicí k ristocetinu, který je induktorem aglutinace a agregace. Byl pozorován reverzibilní inhibiční účinek, jestliže byl scFv přidán k PRP před přídavkem ristocetinu, a to v závislosti na dávce.

[255.] Výsledky těchto studií jsou uvedeny v Tabulce 5 a na Obr. 16. Yl v konečné koncentraci 50 μρ/πιΐ inhiboval ~80 % agregace destiček indukované ristocetinem v plasmě bohaté na destičky, a tato agregace byla zaznamenána v prvních 4 minutách. Při koncentraci Yl 25 μρ/πιΐ nebyla pozorována žádná signifikantní inhibice agregace destiček. Y17 neinhiboval agregaci destiček. Inkubace promytých destiček s 50 pg/ml negativní kontroly TMl-scFv neměla žádný účinek na agregaci destiček indukovanou ristocetinem (Tabulka 5).

[256.] Srovnání mezi promytými destičkami a PRP naznačuje, že (1) scFv-ΥΙ má inhibiční účinek na agregaci a aglutinaci destiček indukovanou ristocetinem; (2) účinek je závislý na dávce; (3) vyšší inhibiční účinek je pozorován u promytých destiček ve srovnání s PRP; (4) reverzibilní inhibiční účinek byl detekován u PRP; (5) ani TMI, ani fragment protilátky Y16-scFv nevykazovaly účinek; a (6) Y17 je negativní kontrolou v této zkoušce.

Tabulka 5

Koncentrace scFv	% inhibice	% agregace
TMl-scFv 50 pg/ml	0	100
Yl-scFv 50 pg/ml	80	20
Yl-scFv 25 pg/ml	13	87

• ·

Y17-scFv 38 pg/ml

100 * 100 % aglutinace je kalibrováno na základě působení ristocetinu

Účinek Yl-IgG na aglutinaci promytých destiček (Washed

Platelets, W.P.) [257.] Díky své přirozené struktuře má úplný IgG Yl dvě vazebná místa pro GPIba a jedno vazebné místo pro receptor Fc. Je pravděpodobné, že jestliže se úplný IgG Yl váže ke dvěma molekulám GPIba, aktivuje destičky a indukuje aglutinaci destiček. Kromě toho, vzhledem k tomu, že destičky mají receptor pro Fc, může Yl IgG indukovat aglutinaci destiček vazbou ke GPIba a k receptoru Fc, čímž vzniká aglutinace destiček vazbou každého IgG Yl ke třem destičkám. Proto byl testován účinek IgG Yl na agregaci promytých destiček, a to v různých koncentracích Yl IgG v přítomnosti nebo v nepřítomnosti ristocetinu. Indukce agregace destiček pomocí Yl IgG byla monitorována po dobu 4 minut při 37° C, s následným přidáním ristocetinu.

[258.] Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 6 a na Obr. 17 bez agonistů. Samotný Yl-IgG v konečné koncentraci 50 gg/ml indukoval aglutinaci destiček ~ 39% ve srovnání s normální aglutinaci promytých destiček. Indukce aglutinace destiček pomocí Yl-IgG byla testována po dobu 4 minut při 37° C, s následným přidáním ristocetinu. Žádný další účinek na aglutinaci destiček nebyl po přidání ristocetinu pozorován: byla zjištěna normální aglutinace destiček. Nicméně, nebyla zjištěna žádná aglutinace, jestliže byly destičky inkubovány s 1 pg/ml Yl.

• · • · · · · · ··· · · ··· · ·· ··· · · · ···· • ····· · · ·· ····· • ···· ··· • · · · · ·· · · · ·· · [259.] Jestliže byla shodným výše uvedeným způsobem použita komerční monoklonální protilátka proti GPIba (CD42)(Pharmigen), která inhibuje aglutinaci destiček, nebo kontrolní lidský IgG-Lambda (Sigma), nebyla zjištěna žádná redukce aglutinace

Tabulka 6

	Q. O inhibice		O, o aglutinace
Koncentrace	Bez	S	Bez	S
protilátky IgG	ristocetinu	ristocetinem	ristocetinu	ristocetinem
Yl-IgG 50 gg/ml	61	5	39	95
Yl-IgG 25 μg/ml	65	5	35	95
Yl-IgG 12,5 μg/ml	62	5	38	95
Yl-IgG 3,5 μg/ml	66	14	34	86
Yl-IgG 1 μg/ml	92	7	8	93
Myší anti-lidský CD42 IgG 20 μg/ml	99,5	100	0,5	75
Kontrolní lidský IgG 20 μg/ml	99, 5	25	0,5	75
Kontrola aktivace ristocetinem		0		100

• · • · · · · ··· · · · • · · · · · ···>· • ····· · · ·· ····· • ···· · · · ····· ·· · ·· ·· ·

Účinek Yl-IgG na agregaci plasmy bohaté destičkami (Platelet-Rich-Plasma, PRP) [260.] Účinek Yl-IgG na agregaci plasmy bohaté destičkami byl testován při různých koncentracích Yl-IgG v přítomnosti nebo v nepřítomnosti ristocetinu. Indukce agregace destiček s Yl-IgG byla testována po dobu 4 minut při 37° C, s následným přidáním ristocetinu.

[261.] Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 7 a na Obr. 18. Nebyl pozorován žádný účinek na agregaci destiček po přidání ristocetinu: byla pozorována normální agregace destiček. Yl-IgG v konečné koncentraci 50 μg/ml indukoval agregaci destiček v plasmě bohaté destičkami před přidáním ristocetinu. Yl-IgG v koncentraci 25 μρ/πιΐ pouze částečně indukoval agregaci destiček před přidáním ristocetinu.

Žádná inhibice agregace destiček nebyla pozorována při koncentracích Yl-IgG 10 μg/ml, 4 μg/ml, nebo 1 μg/ml. Komerčně dostupné monoklonální protilátky proti GPIba (Pharmigen), které inhibují agregaci destiček v koncentracích 20 μς/πιΐ, neindukovaly agregaci destiček. Kontrolní lidský IgG-Lambda (Sigma) ve stejné koncentraci jako Yl-IgG rovněž neindukoval agregaci destiček.

Tabulka 7

	O. o inhibice		o, 0 aglutinace
Koncentrace	Bez	S	Bez	S
IgG	ristocetinu	ristocetinem	ristocetinu	ristocetinem
Yl-IgG	64	0	36	100

• · · ·· · ··· ·«· · · · · ♦ · · · «·· · · · · · · ····· ··· ·· ·« ··· ··

50 μρ/ιηΐ
Yl-IgG 2 5 μρ/ιηΐ	75	8	25	92
Yl-IgG 10 μρ/ιηΐ	93	10	7	90
Yl-IgG 4 μg/ml	98	5	2	95
Yl-IgG 1 μg/ml	95,5	0,5	0,5	99, 5
Lidský IgG anti-CD42 20 μg/ml	99,5	0,5	0,5	99, 5
Kontrola aktivace ristocetinem		0		100

Identifikace plasmatických rozpustných ligandů Yl a buněčných linií [262.] Protilátky proti GPIba (CD42b) rozpoznávají lyzát destiček a glycocalicin, avšak nikoliv lyzát buněk KG-1 (myeloidní linie pozitivně vázající Yl) nebo lyzát buněk RÁJI (linie B buněk, která je negativní pro vazbu Yl o koncentracích, ve nichž jsou buňky KG-1 na vazbu s Yl pozitivní). Naopak, Yl rozpoznává jak glycocalicin, lyzát destiček, tak buňky KG-1, avšak nikoliv extrakt z buněk RÁJI. Negativní kontrola scFv-181 nerozpoznávala žádný z relevantních proteinů (Obr. 20).

[262.] Jedinečnost křížové reaktivity Yl byla dále prokázána ve srovnávací studii mezi Yl a SZ2 (Mab proti sulfatované oblasti GPIb). Na rozdíl od SZ2, váže se Yl

nejen k GPIb, ale rovněž k plasmatickým proteinům a k extraktům z buněk odvozených z myeloidu tak, jak je popsáno níže.

Ligandy Yl v lidské plasmě.

[264.] Imunoreakci s Yl vykazovaly dva proteiny jak v normální plasmě, tak v plasmě pacientů s leukémií. První z nich byl označen jako H P-ligand 1, který má molekulovou hmotnost za redukčních podmínek ~50 kDa a > 300 kDa za neredukčních podmínek a který zcela ze séra vymizí po koagulaci; a (2) H P-ligand 2, který má molekulovou hmotnost jak ze redukčních, tak za neredukčních podmínek ~80 kDa a který po koagulaci zůstává v séru. Po purifikaci s použitím gelové elektroforézy 2D s reverzní fází se sloupcem Q-Sepharosy (RP-HPLC) a mapování peptidů, byl identifikován ~50kDa ligand jako normální varianta gama' řetězce lidského fibrinogenu. Sekvence VRPEHPAETEYDSLYPEDDL je přítomna pouze ve fibrinogenu gama', avšak nikoliv v abundantní formě fibrinogenu gama, je podobná aniontové oblasti GPIb obsahující sulfatovaný tyrosin.

Nejpravděpodobněji se jedná o vazebné místo pro Yl. Protein o ~80 kDa byl identifikován jako komplementová sloučenina 4 (complement compound 4, CC4) a lumican. Jak je uvedeno výše, obsahuje zbytky sulfatovaného tyrosinu doprovázené úsekem negativně nabitých aminokyselin.

Vazba Yl k buňkám primární leukemie [265.] Analýza FACS naznačuje, že se Yl selektivně váže k leukemickým buňkám, avšak nikoliv k normálním krevním buňkám, jak ve vzorcích normální krve, tak k normálním buňkám v leukemických vzorcích krve. Souhrn • · · · · · · · · ·· ··· ·· · ···· • · · · » · · · · · ····· • ···· ··· ····· *· ··· ·· · výsledků této analýzy u pacientů je uveden v následujících tabulkách.

Tabulka 8: Výsledky u pacientů s Yl

Onemocnění	Počet pozitivních	% pozitivních
mnohočetný myelom	16/16	100 %
AML	60/78	80 %
B-leukemie	29/43	67 %

Tabulka 9: B-Leukemie

Typ	Zdroj	Počet pozitivních	% pozitivních	% negativních
Pre-B- -ALL	BM	3/3	100	0
B-ALL	MB	3/9	33	67
B-CLL	PB	17/23	74	26
B-lymfom	PB	5/8	62	38

BM = kostní dřen (Bone Marrow)

PB = periferní krev (Peripheral Blood)

Charakteristika epitopu pro Yl na myeloidních buňkách (KG-1) [266.] Přibližně 25 miliard buněk KG-1 bylo připraveno pro purifikaci epitopu pro Yl z membrán buněk KG-1. Bylo zjištěno, že preparáty membrán KG-1 obsahují alespoň 2 podjednotky, které se vážou s Yl: -HOkDa podjednotku a ~120 kDa podjednotku. Yl se rovněž váže k podjednotce o ~220 kD, která může být dimerem podjednotky o -110 kDa. Purifikace epitopu pro Yl byla prováděna imunoprecipitací • · · s Yl a HPLC s reverzní fází (RP-HPLC). 2:1 frakce (pool) bylo použito pro Western blotting s scFv Yl a 40:1 bylo použito pro barvení stříbrem (Obr. 21).

[267.] Ligand Yl byl dále charakterizován s použitím enzymatického působení proteáz, glykanáz a sulfatáz; Western blottingu s Yl, anti-CD42 protilátek, anti-CD162 protilátek a 181, imunoprecipitace používající Yl a antiCD162 protilátky; analýzy FACS s použitím Yl a anti-CD162 protilátek; a sekvenování.

[268.] Níže uvedená tabulka sumarizuje biochemické pokusy, které byly prováděny pro charakterizaci a lokalizaci vazebného místa pro Yl na buňkách KG-1.

Analýza Western blotting s Yl na SDS-PAGE redukčních gelech.

Tabulka 10

Substrát	Působení	Podmínky	Reaktivita s Yl	Zobrazeno na Obrázku
RP-HPLC KG-1	0-	30'při	Reaktivita	Obr.	22
membránová	sialoglykoprotein	37° C	pouze
frakce	endopeptidáza		s formou
			120 kDa
RP-HPLC KG-1	0-	4 hod.	Žádná	Obr.	22
membránová	sialoglykoprotein	při 37°C	reaktivita
frakce	endopeptidáza
RP-HPLC KG-1	aryl-sulfatáza	18 hod.	Žádná	Obr.	23
membránová		při 22°C	reaktivita
frakce

RP-HPLC KG-1 membránová frakce	mocarhagin	7 ' při 37°C	Žádná reaktivita	Obr.	33
Glycocalicin (GC)	0- sialoglykoprotein endopeptidáza	30'při 37°C	Zvýšená vazba	Obr.	22
Heparin-BSA	aryl-sulfatáza	18 hod. při 22°C	Váže se k Yl jako bez působení	Obr.	23

[269.] Lze shrnout, že po působení endopeptidáz je signál pro Yl odštěpen a nemůže být detekován (Obr. 22). Pravděpodobněji se fragment obsahující se vazebné místo pro Yl nalézá na N-konci a je příliš malý, aby mohl být stanoven za podmínek, které byly použity ve výše uvedených pokusech. Podobně, po působení mocarhaginem byl signál pro Yl rozštěpen a nemohl být detekován (Obr. 33), což dokládá, že epitop pro Yl se nalézá na N'-konci ligandu. Kromě toho výsledky získané s aryl-sulfatázou, která odstraňuje sulfátové sloučeniny z proteinů (v extraktu buněk KG-1), avšak nikoliv sloučeniny cukrů (v heparinu), dále podporují naši hypotézu, že sulfát je pro rozpoznání Yl vyžadován (Obr. 23). O-sialoglykoprotein endopeptidáza překvapivě zvýšila signál pro Yl v produktu štěpení GC (glycocalicinem). Předpokládá se, že po takovémto působení na vazebné místo pro Yl, je toto místo nyní umístěno na Ckonci a je lépe exponováno pro vazbu s Yl.

Korelace mezi Yl a protilátkou KPL1 proti PSGL-1:analýza

Western blotting [270.] Byla stanovována vazba protilátky scFv Yl a komerčně dostupné anti-PSGL-1 monoklonální protilátky (KPLl) k membránovým proteinů imunoprecipitovaným (IP)

KPL1, odvozeným z buněk KG-1. Buněčný lyzát buněk Ráji byl použit jako negativní kontrola k Yl a KPLl.

[271.] Membránové frakce z buněk KG-1 byly imunoprecipitovány s KPLl. Imunoprecipitovaná (IP) frakce byla dále imunoprecipitována buďto s protilátkou scFv Yl, nebo s KPLl. Neprecipitované (eluované) frakce byly analyzovány Western blottingem, s použitím buďto protilátky scFv Yl, nebo protilátky KPLl.

[272.] Jak schémata imunoprecipitace, tak výsledky jsou uvedeny na Obrázku 24. KPLl nerozpoznává glycocalicin. Nicméně, jak protilátka scFv Yl, tak protilátka KPLl rozpoznává membránové proteiny na buňkách KG-1.

[273.] Lyzáty z buněčných linií a primárních krevních buněk bílé řady byly imunoprecipitovány s protilátkami anti-CD162 a centrifugovány pro získání supernatantu a eluátu. Analýza Western blotting proteinů přítomných v eluátu a supernatantu byla prováděna $ použitím protilátky scFv Yl a protilátky anti-CD162. Preparáty membrán z buněk KG-1 obsahují dvě podjednotky (-110 kDa a -120 kDa), ke kterým se váže protilátka anti-CDl62 (PSGL1). Naopak, membránové preparáty z normálních krevních buněk bílé řady mají pouze menší pddjednotku. Preparáty membrán od pacientů s AML mají pouze větší podjednotku.

ScFv Yl se váže ke odlišnému druhu, který se nalézá v supernatantu po imunoprecipitaci a ke kterém se protilátky anti-CD 162 nevážou (Obr. 25).

• · · · · ··· • · ···· ♦··

Analýza FACS [274.] Byla stanovována vazba protilátky Yl (jak forem scFv, tak forem IgG) k buňkám KG-1 v přítomnosti protilátek anti-PSGL-1 (anti-CD162)(KPLl) v kompetitivní vazebné zkoušce s použitím analýzy FACS.K tomuto účelu byly použity různé komerčně dostupné protilátky anti-PSGL-1, KPLl (protilátka, která identifikuje sulfatovaný tyrosin Nkoncové domény PSGLl), PL1 (protilátka, která identifikuje nesulfatovanou N-koncovou doménu PSGL-1) a PL2 (protilátka, která identifikuje nesulfatovanoú vnitřní doménu receptoru PSGL-1). Pouze KPLl kompletně inhibuje vazbu Yl k buňkám KG-1, zatímco PLl vazbu inhibuje částečně. Nebyla zjištěna inhibice vazby v přítomnosti protilátky PL2 (Obr. 26).

Buňky Ráji se s protilátkami KPLl nevázaly. Podobně kompletní IgG Yl v různých koncentracích inhibuje vazbu protilátky KPLl k buňkám KG-1 v závislosti na dávce (Obr.

27) . Podobně protilátka KPLl inhibuje vazbu protilátky IgG Yl o úplné délce k buňkám KG-1 v závislosti na dávce (Obr.

28) .

Korelace mezi Yl a KPLl ve vazbě k primární leukemichým buňkám [275.] Analýza vazby protilátek scFv Yl a protilátek anti-CD162 k nemocným buňkám dále ilustruje, že scFv má vazebné charakteristiky odlišné od charakteristik protilátek anti-CD162. Konkrétně analýza FACS vazby Yl a protilátky anti-CD162 k buňkám pre-B-ALL, HCL, AML, B-ALL, B-CLL, neklasifikované leukemie, B-PLL, mnohočetného myelomu od lidských pacientů prokázala, že tyto dvě protilátky mají odlišné vazebné profily (Tabulka 11). Yl se váže k leukemickým buňkám u 10 ze 12 vzorků. Naopak, • · protilátka anti-CD162 se vázala pouze u 5 z 12 vzorků. Proto je možné uzavřít, že u leukemických buněk se scFv Yl váže k ligandu, který je jiný než ligand rozpoznávaný protilátkou anti-CD162.

Tabulka 11: Vzorky leukémií - analýza protilátka anti-CD162 oproti Yl

		Reakce s leukemickými buňkami
Pacient #	Onemocnění	ScFV Yl	Anti-CD162
42291	Pre-B-ALL	+	-
42299	HCL	-	-
42311	AML	+	+
42321	B-ALL	-	-
42323	B-CLL	+	-
42325	neklasifikované	+	-
42332	B-CLL	+	-
42352	B-PLL	+	+ /-
42330	AML		+
42334	MM	+	-
42366	AML	+	+
42370	AML/ALL	+	+ /-

[276.] Lze shrnout, že, vazebnými doménami pro Yl obsahujícími sulfatovaný tyrosin v GPIba, fibronectinu (' a PSGL-1 jsou DEGDTDLYDYYPEEDTEGD (aminokyseliny 269-287), EHPAETEYDSLYPED (aminokyseliny 411-427) a QATEYELDYDFLPETE (aminokyseliny 1-17) v uvedeném pořadí. Další vazebné místo s vyšší afinitou k Yl je pravděpodobněji exprimováno na primárních leukemických buňkách. Je zajímavé, že krevní vzorky, které jsou pozitivní jak s scFv Yl, tak s protilátkou anti-CD162, byly získány od pacientů s AML, zatímco B-buňky byly s anti-CD162 negativní.

»♦ · · ·

Analýza vazby sulfatovaných peptidů k Yl [277.] Byla použita zkouška ELISA kompetitivni vazby pro stanovení významu přítomnosti a pozice sulfatovaných tyrosinů pro vazbu peptidů k Yl.

[278.] Glycocalicin byl imobilizován na destičce Maxisorb.

ScFv Yl byl předem inkubován s testovaným peptidem po dobu 10 minut ve třech odlišných koncentracích (1, 10 a 100 μΜ) tak, aby bylo prováděno pozorování závislosti na dávce (Tabulka 12). Po preinkubaci byla směs (Yl + peptid) přidána na destičku a vazba scFv Yl byla stanovena s použitím polyklonální králičí anti-V_L protilátky, která rozpoznává V_L řetězec scFv Yl, přičemž byl pozorován pokles vazby scFv Yl ke glycocalicinu ve srovnání vazbou kontroly. Ve směsích, ve kterých se peptid s scFv Yl nevázal, nebyla pozorována žádná změna ve vazbě scFv Yl s glycocalicinem ve srovnání s vazbou kontroly.

[279.] Pokus byl prováděn dvakrát a výsledky jsou uvedeny v grafu ELISA (Obrázek 29). Peptidy odvozené z fibrinogenu nevykazovaly inhibici vazby Yl, bez ohledu na sulfataci. Nesulfatované peptidy z PSGL-1 neinhibovaly vazbu Yl ke glycocalicinu. Všechny sulfatované peptidy odvozené z PSGL1 inhibovaly vazbu Yl ke glycocalicinu. Peptidy P-YYY* a PYY*Y* byly nejlepšími inhibitory, následované z hlediska účinnosti peptidem P-Y*YY*, pak P-Y Y*Y, pak P-Y*Y*Y a PY*YY. Nesulfatované peptidy odvozené od glycocalicinu neinhibovaly vazbu Yl ke glycocalicinu, avšak peptid odvozený od glycocalicinu mající shodnou sekvenci sulfatovanou na třech sulfátech (G-Y*Y*Y*) neinhiboval vazbu, s účinností podobnou účinnosti P-Y Y*Y.

• · · · · · · · é « · • · · · · · · « · « * ····· · · · · »···· ··· · · · · ··· ·· [280.] Proto je zřejmé, že ne každý sulfatovaný peptid se váže s scFv Yl ve stejném rozsahu. Tyto výsledky rovněž signifikantně prokazují, že pouze jeden sulfatovaný tyrosin je nezbytný pro vazbu, jak může být pozorováno u peptidů PY*YY a P-YY Y*. Kromě toho je možné pozorovat, že aminokyselinový kontext sulfatovaných tyrosinů má vliv na vazbu Yl. Tak například, P- Y*YY (obsahující jeden sulfatovaný tyrosin v sekvenci EY*E) inhibuje vazebnou účinnost pouze v koncentraci 100 μΜ. Naopak, P-YYY* (obsahující jeden sulfatovaný tyrosin v sekvenci DY*D) účinně inhibuje vazbu v koncentraci 1 μΜ.

Tabulka 12

Sulfatované peptidy

Název	Zdroj peptidu	Sekvence	#aa	MW (moleku- lová hmotnost)	Sulfatace
F-YY	fibrinogen (řetězec Ί')	VRPEHPAETEYESLYPEDDL	20	2389
F- y*y*	fibrinogen (řetězec γ')	VRPEHPAETEY*ESLY*PEDDL	20	2549	sulfato- vaný
p-yyy	PSGL-1 N-konec	QATEYEYLDYDFLPETE	17	2126	-
P- y*yy	PSGL-1 N-konec	QATEY*EYLDYDFLPETE	17	2206	sulfato- vaný
P- Y*Y*Y	PSGL-1 N-konec	QATEY*EY*LDYDFLPETE	17	2286	sulfato- vaný

• · · « • · · · * · · • · · • · · ·

P- * * Y YY	PSGL-1 N-konec	QATEY*EYLDY*DFLPETE	17	2286	sulfato- vaný
P-	PSGL-1	QATEYEY*LDYDFLPETE	17	2286	sulfato-
YY*Y	N-konec				váný
P-	PSGL-1	QATEYEY*LDY*DFLPETE	17	2286	sulfato-
YY*Y*	N-konec				váný
P-	PSGL-1	QATEYEYLDY*DFLPETE	17	2286	sulfato-
YYY*	N-konec				váný
G-YYY	GPIba	GDEGDTDLYDYYPEEDTE	18	2126	-
G-	GPIba	GDEGDTDLY*DY*Y*PEEDTE	18	2366	sulfato-
Y*Y*Y*					váný

Y* = sulfatovaný tyrosin

Hypotéza/závěry [281.] (1) Yl je podobný L-selektinu, který rozpoznává jak sulfatovaný protein, tak sloučeniny cukrů, a je odlišný od P-selektinu, který rozpoznává pouze sulfatované proteiny. Z tohoto důvodu může soutěžit o vazbu s oběma proteiny.

[282.] (2) Variace v sulfataci během diferenciace a růstu buněk může působit na vazbu Yl. Z tohoto důvodu může Yl soutěžit jak s P-, tak s L-selektiny o vazbu k jejich sulfatovaným ligandům.

In vivo modely pro stanovení účinnosti protilátek specifických proti leukémii [283.] Byly vyvinuty dva lidské modely leukemie u imunodeficientní myši, stejně jako systémy zkoušek.

• ·

100 [284.] Použitými lidskými buněčnými liniemi byly buňky MOLT4, získané od pacienta s leukémií T buněk, a buňky KG1, získané od pacienta s AML. Pro identifikaci a kvantifikaci maligního buněčného přihojení (engraftment) byly použity protilátky specifické pro odpovídající lidské antigeny na každé z buněčných linií.

Model T-ALL (MOLT4) [285.] In vivo myší model pro T-ALL používá myš (Jackson Laboratories), které byly indikovány buňky MOLT4, získané od pacienta s leukémií T buněk.

[286.] V jednom pokusu byly myši předem ošetřeny s 100 mg/kg Cytoxenu (CTX, injekční cyklofosfamid, Mead Johnson) a 5 dnů po ošetření cyklofosfamidem jim bylo intravenózně injekčně aplikováno 2xl0⁷ buněk MOLT-4/myš. Od 5. dne po injekci buněk MOLT-4 bylo myším postupně třikrát týdně i. v. injikováno protirakovinné agens nebo PBS (jako negativní kontrola). Ve 35. týdnu byla zvířatům odebrána krev a zvířata byla usmrcena, a jejich játra byla vyříznuta a zvážena. Játra zvířat, která nebyla ošetřena, tj. zvířat, kterým byl podán PBS a buňky MOLT-4, vykazovala velice masivní tumorový růst, a jejich velikost byla zvýšena 23krát ve srovnání s kontrolními PBS neinfikovanými zvířaty. V tomto pokusu bylo pět skupin:

Tabulka 13

1. Skupina, které nebyly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená PBS

2. Kontrolní skupina, injikovaná buňkami MOLT-4, ošetřená PBS • · · · • · · · • · · · • · · · · ·

101 ·

3. Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená Yl scFv (CONY 1), 75 gg/myš

4. Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená CONY 1 scFv-Doxorubicin, 75 μg/myš

5. Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená Doxorubicinem, 0,1 mg/kg.

Počet myší	Inokulace	Ošetření
5	Pouze PBS	-
9	MOLT-4	-
9	MOLT-4	CONY-Dox (2,5 mg/kg)
9	MOLT-4	CONY-Dox (2,5 mg/kg)
8	MOLT-4	Samostatný Dox (0,1 mg/kg)

[287.] Myši začaly hynout 32 dnů po inokulaci buněk a myši, které přežily, byly v tomto čase usmrceny. Buňky kostní dřeně byly analyzovány průtokovou cytometrií s použitím protilátek anti-lidský CD44-FITC a YlBiotin/SAV-PE. Vzorky krve od několika zvířat byly monitorovány na počet destiček a bílých krvinek. Játra byla zvážena a vyšetřena na výskyt tumoru. Rovněž další orgány byly vyšetřeny na výskyt tumoru.

[288.] Výsledky jsou uvedeny (Obrázky 30, 31 a 32). Masivní růst tumorů (bílé uzlíky) byly pozorovány v játrech všech myší injikovaných buňkami MOLT-4.

[289.] Procento buněk MOLT-4 nalezené v kostní dřeni bylo velice nízké (Obr. 31).

[290.] Lze shrnout, že tyto výsledky prokazují vhodnost použití modelu MOLT-4 jako modelu pro jaterní metastázy leukemických buněk.

102 * [291.] Paralelně byly odebrány části jater na histologické vyšetření a byly odebrány buňky pro analýzu FACS. Přežívání skupiny ošetřených zvířat bylo porovnáno s kontrolní skupinou neošetřených myší.

[292.] Ve 35. dnu byla játra zvážena, hmotnosti jsou uvedeny (Obr. 30). Jak je znázorněno, velikost jater je u myší infikovaných tumorem, jako negativní kontrolou ošetřenou PBS, téměř ztrojnásobena ve srovnání s kontrolou PBS a myšmi, kterým nebyly injikovány buňky MOLT-4. Hmotnosti jater myší, které byly ošetřeny nízkou dávkou Doxorubicinu, byly podobné hmotnostem jater myší, které byly infikovány nádorem a ošetřeny PBS. Na druhé straně ošetření CONYl-scFv a CONYl-scFv-Doxorubicin konjugátem významně inhibovalo růst tumorů v játrech (mnohem nižší hmotnosti jater).

[293.] SCID/MOLT-4

1.

2.

3.

.

5.

6.

Ve druhém pokusu byl použit identický protokol na 6 skupinách zvířat:

Skupina, které nebyly injikovány buňky MOLT-4, PBS kontrola

Skupina, injíkovaná MOLT-4, ošetřená PBS Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená CONY 1 scFv, 75 μg/myš

Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená nespecifickou protilátkou scFv získanou z knihovny Nissim I, 75 μρ/πτ/έ Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená Yl-IgG, 5 pg/myš

Skupina, které byly injikovány buňky MOLT-4, ošetřená nespecifickým lidským IgG, 5pg/myš.

103

[294.] Jsou uvedeny výsledky (Obr. 34), které dokládají, že ošetření buďto s CONYl-scFv nebo s Yl IgG inhibovalo růst tumoru (na základě hmotností jater), zatímco u zvířat ošetřených molekulami nespecifických protilátek byl pozorován malý nebo žádný účinek.

[295.] Přežívání bylo stanoveno u myší ze tří skupin, které byly kontinuálně ošetřovány, a výsledky jsou uvedeny (Obr. 35). Jak je znázorněno, bylo prodlouženo přežívání pouze myší ošetřených CONYl-scFv.

Model AML KG-1 [296.] In vivo myší model pro lidský AML používá myš SCID/NOD (Jackson Laboratories), inokulovanou buňkami KG-1, získanými z lidské buněčné linie AML.

[297.] V prvním pokusu byly myši NOD/SCID předem ošetřeny 100 mg/kg CYTOXANu®. Čtyři dny po injekci CYTOXANu® byly buňky KG-1 intravenózně injikovány do ocasní žíly šesti skupinám myší (Tabulka 14, Skupiny 2 a 5-9). Jedna skupina myší (Tabulka 14, skupina 1) byly injikována samotným PBS (kontrola). Počínaje 14. dnem po injekci buněk KG-1 byly myši ošetřeny s: CONY 1, Doxorubicinem, konjugátem CONY 1-Doxorubicin, nebo MYLOTARG®em. MYLOTARG® je monoklonální protilátka (anti-CD33) chemicky konjugovaná s calcheamicinem (nedávno povolený FDA pro léčbu AML u pacientů ve věku nad 60 let nebo po první recidivě AML). Myši byly ošetřovány jednou nebo třikrát týdně po dobu tří týdnů. Jedna skupina (skupina 2) myší, kterým byly injikovány buňky KG-1, byla ponechána bez ošetření (Tabulka 14). Dvě další skupiny myší (skupiny 3 a 4) byly injikovány buňkami KG-1, které byly předem inkubovány s CONY 1 nebo

104

181-scFv (negativní, nespecifickou kontrolní protilátkou) v bezsérovém RPIM obsahujícím 1 % BSA (hovězí sérový albumin) při 4° C. Protilátky byly použity v koncentracích 0,25 mg scFv/10⁸ buněk (75μg/myš). Před vlastní injekcí myši byly preinkubované buňky KG-1 promyty a resuspendovány v RPMI. Buňky KG-1 v RPMI byly myším inokulovány v koncentraci 75 pg scFv/0,2 ml RPMI na myš. Skupina myší 3 byla inokulována KG-1 + CONY1, a skupina myší 4 byla inokulována KG-1 + 181-scFv. (Tabulka 14). Toto ošetření (skupina 3 a 4) bylo prováděno jeden den po inokulaci skupin 1-2 a 5-9, tj. 5 dnů po injekci CYTOXANu®.

Tabulka 14

# myší	Skupina #	Inokulace	Ošetření
9	1	PBS	-
11	2	KG-1	-
9	3	KG-1 + Yl	-
9	4	KG-1 + 181	-
8	5	KG-1	75 μρ/myš (2,5 mg/kg) CONY 1, 3krát týdně
9	6	KG-1	0,1 mg/kg Doxorubicinu, 3krát týdně
10	7	KG-1	5 mg/kg Doxorubicinu, lkrát týdně
11	8	KG-1	75 μg/myš (2,5 mg/kg) CONY 1- Doxorubicin, 3krát týdně
9	9	KG-1	0,2 mg/kg MYLOTARG®, lkrát týdně

[298.] Myši byly usmrceny od 60. do 65. dne po injekci buněk. Kostní dřeň a vzorky krve byly analyzovány průtokovou cytometrií s použitím myší protilátky anti-human

105

CD34-FITC (IQP 144F) (nebo anti-CD44-FITC (MCA89F,

Serotec)) a Yl-Biotin/SAV-PE. Jako izotypová kontrola byl použit myší IgGl-FITC (IQP191-F) a jako negativní kontrola byl použit myší IgG2a-FITC (MCA929F, Serotec). Průtoková cytometrie byly prováděna s použitím systému FACS Calibur a softwaru CellQwest, Becton Dickinson.

[299.] Jsou znázorněny výsledky (Obr. 36 a 37). Devět z deseti myší, kterým byly injikovány buňky KG-1 a byly ošetřeny pouze Doxorubicinem v dávce 5 mg/kg (Skupina 7), uhynulo během tří týdnů po zahájení léčby.

[300.] Kostní dřeň myší, kterým byly injikovány buňky KG-1 a které nebyly léčeny (Skupina 2), obsahovala v průměru 30 % buněk KG-1 v populaci buněk kostní dřeně. U všech myší v této skupině se rozvinula leukemie.

[301.] Lze shrnout, že téměř u všech myší, injikovaných buňkami KG-1 se rozvinula leukemie při průměru 30 % buněk KG-1 v kostní dřeni (jak byl podíl stanoven analýzou FACS). Obecně bylo přihojení buněk KG-1 lokalizováno do kostní dřeně. Méně než 10 % buněk KG-1 bylo nalezeno v krvi. V jednom případě byl pozorován nádor ve stěně peritonea.

[302.] Myši, které byly injikovány buňkami KG-1 a byly léčeny samotným Doxorubicinem v dávce 0,1 mg/kg (Skupina 6), měly ve srovnání se Skupinou 2 statisticky významně (p < 0,05) nižší procentuální obsah buněk KG-1 v kostní dřeni.

[303.] Myši, které byly injikovány buňkami KG-1 a byly léčeny konjugátem CONYl-Doxorubicin (Skupina 5), měly ve srovnání se Skupinou 2 nižší procentuální obsah buněk KG-1

106 v kostní dřeni (16,3 % oproti 30,4 %, v uvedeném pořadí). Nicméně, tento rozdíl nebyl shledán jako statisticky významný. Během pokusu bylo zjištěno, že CONYl-Doxorubicin byl kontaminován lipopolysacharidy (LPS). Z tohoto důvodu nebylo možné použít optimální koncentrace CONYlDoxorubicinu a léčba byla ukončena před koncem pokusu.

[304.] Myši, kterým byly injikovány buňky KG-1 preinkubované in vitro s CONY1 nebo 181-scFv (Skupiny 3 a 4, v uvedeném pořadí) měly ve své kostní dřeni signifikantně nižší procentuální podíl buněk KG-1.

[305.] Kostní dřeň jak myší, které byly injikovány pouze PBS (negativní kontrola), tak myší, kterým byly injikovány buňky KG-1 a byly léčeny MYLOTARGem® (Skupina 9), byla prostá buněk KG-1. Tyto výsledky prokazují, že tento in vivo model je vhodný jako model pro AML.

[306.] Celkové procento buněk KG-1, nalezených v krevním řečišti u různých skupin, bylo celkově velmi nízké s vysokou variabilitou uvnitř jednotlivých skupin. Je třeba poznamenat, že jedna myš léčená MYLOTARGem® vykazovala vysoké procentuální zastoupení buněk KG-1 v krvi, avšak nikoliv v kostní dřeni.

[307.] Identifikace lidských leukemických buněk (původem z buněk KG-1) v kostní dřeni a v krevním řečišti myši byla prováděna analýzou FACS s použitím komerčně dostupných protilátek anti-human CD34 nebo CD44, paralelně s protilátkami Yl scFv.

[308.] V prvním dnu analýzy byl signifikantní rozdíl u myší, kterým byly injikovány pouze buňky KG-1 (Skupina 2), • · ·· · · · · * · ··· · ·« • ·· · ··»· • «···· · * · · ····· která měla vysoký procentuální podíl buněk KG-1 v kostní dřeni ve srovnání se skupinou myší, které byly ošetřeny CONYl-Doxorubicinem (Skupina 8). Ve třetím dnu analýzy byla situace obrácená: myši ze Skupiny 8 měly vyšší procentuální podíl buněk KG-1 ve své kostní dřeni ve srovnání se skupinou myší 2. Tato situace mohla být důsledkem následující příčin: A) výběr myší ve špatné fyzické kondici v prvním dnu pokusu, B) proliferace buněk KG-1 u myší ze Skupiny 8 během dnů po ukončení léčby, a C) počet myší v každé skupině byl příliš malý pro to, aby byly získány statisticky významné výsledky.

Farmakokinetika CONYl u myší [309.] CONY 1 scFv byl značen ¹²⁵I-Bolton Hunter reagencií (k lysinu). Značící reakce byla prováděna při 4°

C v borátovém pufru (pH 9,2) s ¹²⁵I-Bolton Hunter reagencií, poté byl ¹²⁵I-CONY1 purifikován na chromatografickém sloupci PD-10. Radioaktivní protein byl pak přimíšen k neznačenému CONYl k získání roztoku CONYl 75 μρ/πιΐ, obsahujícího 2,5 x 10 ⁶ CPM/ml ve fyziologickém roztoku.

[310.] Samečci myší Balb-C byli předem ošetřeni intraperitoneální injekcí 0,5 ml/myš 0,9% Nal. Po dvou hodinách bylo myším intravenózně injikováno 0,2 ml značeného roztoku s CONY-1, tak, že výsledná dávka ¹²⁵ICONY1 byla 15 μρ (5 x 10⁵ CPM) na myš.

[311.] V různých časech po injekci byla krev sbírána do EDTA, myši byly usmrceny a tkáně byly vyříznuty. Vzorky a tkáně byly odebírány v 5., 15., a 30. minutě a v 1., 2., 4., 8., 24. hodině po injekci. V každém časovém intervalu byly použity 2 až 4 myši. Plasma byl oddělena a buďto v ní

108 byl odečítána radioaktivita gama záření, nebo byla podrobena precipitaci kyselinou trichloroctovou (trichloroacetic acid, TCA). Po centrifugaci byly TCA precipitáty podrobeny stanovení gama radioaktivity. Vzorky jater, plic, ledvin, sleziny a kostní dřeně byly zváženy a byla v nich stanovena gama radioaktivita. Plasmatická radioaktivita precipitovaná TCA byla vynášena proti času a byl uplatněn dvourozměrný kinetický model. Byla stanovena celková hodnota radioaktivity pro orgán/tkáň a hodnota specifické radioaktivity. Výsledky jsou uvedeny (Obr. 39, a 41).

[312.] Porovnání hodnot radioaktivity krve a plasmy naznačuje, že prakticky veškerý CONY-1 byl umístěn v plasmě a neadheroval k erytrocytům. Hodnoty radioaktivity v plasmě byly podobné hodnotám TCA precipitátů, což naznačuje, že byly spojeny s nedegradovaným proteinem. Obr. 39 znázorňuje hladiny CONY-1 v plasmě v různých časových bodech po podání. Hodnoty byly statisticky vyhodnoceny dvourozměrným modelem a získané hodnoty poločasů odstraňování z krve (blood clearance) byly 35 a 190 minut, v uvedeném pořadí.

[313.] Distribuce radioaktivity v různých tkáních v určitých časových bodech po podání jsou uvedeny jako specifická a celková radioaktivita, v uvedeném pořadí (Obr. 40 a 41). Ve většině tkání nebyla specifická akumulace radioaktivity, jak je zřejmé z porovnání jejich specifické aktivity k aktivitě krve. Mírně nižší aktivity byly pozorovány v ledvinách ve 4. hodině a v kostní dřeni ve 4. a 8. hodině; toto je nejpravděpodobněji spojeno s exkrecí degradačních produktů.

109

[314.] Výsledky naznačují, že u myši je CONY-1 vylučován s poločasem 35 minut. Rychlost druhotného vylučování má menší význam a může být výsledkem přítomnosti nějakých polymerních forem injikovaného materiálu. Ve tkáních neexistuje majoritní specifický příjem CONY-1, pouze s výjimkou mírného zvýšení v kostní dřeni.

Produkce protilátek a fragmentů [315.] Protilátky, jejich fragmenty, jejich konstrukty, peptidy, polypeptidy, proteiny a jejich fragmenty a konstrukty mohou být produkovány buďto v prokaryontních, nebo v eukaryontních expresních systémech. Metody produkce protilátek a jejich fragmentů v prokaryontních a eukaryontních systémech jsou v oboru velmi dobře známy.

[316.] Eukaryontní buněčný systém, tak jak je v zde předkládaném vynálezu definován a diskutován, se týká expresního systému pro produkci peptidů nebo polypeptidů metodami genového inženýrství, v nichž hostitelskou buňkou je eukaryot. Eukaryontním expresním systémem může být savčí systém a peptid nebo polypeptid produkovaný v savčím expresním systému je po purifikaci v podstatě prostý od savčích kontaminant. Jiné příklady vhodných eukaryotních expresních systémů zahrnují kvasinkové expresní systémy.

[317.] Výhodný prokaryontní systém pro produkci peptidu nebo polypeptidů podle vynálezu používá jako hostitele pro expresní vektor E. coli. Peptid nebo polypeptid produkovaný v E. coli je po purifikaci v podstatě prostý od kontaminujících proteinů z E. coli. Použití prokaryontních expresních systémů může vést • ·

110

k přidání methioninového zbytku k N-konci některé nebo všech sekvencí poskytnutých podle předkládaného vynálezu. Odstranění N-koncového zbytku methioninu po produkci peptidu nebo polypeptidu tak, aby byla umožněna exprese úplného peptidu nebo polypeptidu, může být provedeno způsobem známým v oboru, přičemž jedním z příkladů těchto postupů je použití aminopeptidázy z Aeromonas za vhodných podmínek (U.S. Patent č. 5 763 215).

Typy protilátkových fragmentů a konstruktů.

[318.] Předkládaný vynález poskytuje peptid nebo polypeptid zahrnující protilátku nebo její fragment vázající antigen, její konstrukt, nebo konstrukt z fragmentu. Protilátky podle předkládaného vynálezu zahrnují protilátky IgG, IgA, IgD, IgE, nebo IgM. Třída IgG představuje několik podtříd zahrnujících IgG_lz IgG₂, IgG3 a IgGí [319.] Fragmenty protilátek podle předkládaného vynálezu zahrnují molekuly Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab₂ a Fd. Menší protilátkové fragmenty, jako jsou fragmenty z Fv, jsou rovněž v termínu fragmenty zahrnuty potud, pokud si zachovávají vazebné charakteristiky původní protilátky nebo většího fragmentu. Příklady takových fragmentů mohou být (1) minibody, jež obsahuje fragment těžkého řetězce pouze z Fv, (2)microbody, jež obsahuje malou frakcionační jednotku z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky (PCT přihláška č. PCT/IL99/00581), (3) podobné protilátky obsahující fragment lehkého řetězce a (4) podobné protilátky obsahující funkční jednotku z variabilní oblasti lehkého řetězce. Konstrukty zahrnují například multimery, jako jsou diabodies, triabodies a tetrabodies. Vyjádření • ·

111 „protilátka, její vazebný fragment nebo komplex zahrnující protilátku nebo její vazebný fragment,, je míněno tak, že zahrnuje všechny tyto molekuly, stejně jako jejich deriváty a homology, mimetika a jejich varianty potud, pokud nejsou specifikovány jinak, nebo nejsou definovány jiným způsobem na základě kontextu a/nebo na základě znalostí v oboru.

[320.] Jestliže jednou byly protilátka, fragment, nebo konstrukt mající požadované vazebné schopnosti selektovány a/nebo zkonstruovány, je snadné se znalostmi odborníka v oboru a s využitím zde poskytnutého popisu připravit konstrukty a fragmenty, které si uchovávají charakteristiky původní protilátky. Tak například, mohou být připraveny celé molekuly protilátek, fragmenty Fv, fragmenty Fab, fragmenty Fab2, dimery, trimery, a jiné konstrukty, které si uchovávají požadované charakteristiky původní selektované a zkonstruované protilátky, jejího fragmentu nebo konstruktu.

[321.] Jestliže je žádoucí substituce aminokyselin při současném zachování charakteristik protilátky nebo fragmentu, je v rámci běžných znalostí v oboru možné provádět konzervativní aminokyselinové substituce. Rovněž mohou být prováděny modifikace, jako je konjugace protilátek nebo jejich fragmentů s farmaceutickými nebo diagnostickými agens, aniž by byly pozměňovány jejich vazebné charakteristiky. Mohou být prováděny i jiné modifikace, jako jsou ty, které vedou k produkci stabilnějších protilátek nebo fragmentů, aniž by byla pozměněna jejích specifičnost. Tak například, mohou být provedeny peptoidní modifikace, semipeptoidní modifikace, modifikace cyklického peptidu, modifikace N-konce, modifikace C-konce, modifikace peptidové vazby, modifikace

112 páteře a modifikace reziduí. Je snadné se schopnostmi odborníka v oboru a s využitím zde poskytnutého popisu testovat modifikované protilátky nebo jejich fragmenty a stanovovat, zda byly jejich vazebné charakteristiky pozměněny.

[322.] Podobně, je v možnostech a v rámci znalostí odborníka v oboru s využitím zde poskytnutého popisu měnit vazebné charakteristiky protilátky, fragmentu nebo jejího konstruktu tak, aby byla získána molekula s více požadovanými charakteristikami. Tak například, jestliže je jednou protilátka mající požadované vlastnosti identifikována, může být použita náhodná nebo řízená mutageneze pro vytváření variant protilátky a tyto varianty mohou být screenovány na požadované charakteristiky.

[323.] Protilátky a fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou mít identifikátorovou sekvenci (tag), která může být do nich inzerována nebo k nim připojena za účelem jejich přípravy a identifikace a k diagnostice.

Identifikátorová sekvence může být z molekuly později odstraněna. Příklady vhodných identifikátorových sekvencí zahrnují: AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G (Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-618 (1998).

Upřednostňovanou identifikátorovou sekvencí je c-myc nebo KAK.

Multimerní protilátky [324.] Předkládaný vynález poskytuje peptid nebo polypeptid Yl a Y17 obsahující molekulu scFv. Zde použitý scFv je definován jako molekula, která je vytvořena • · · · · · ·

113 z variabilní oblasti těžkého řetězce lidské protilátky a z variabilní oblasti lehkého řetězce lidské protilátky, které mohou být shodné nebo odlišné, a ve které je variabilní oblast těžkého řetězce spojena, svázána, fúzována nebo kovalentně připojena, nebo asociována s variabilní oblastí lehkého řetězce.

[325.] Konstruktem Yl a X17 scFv může být multimer (např. dimer, trimer, tetramer a podobně) molekul scFv, které zahrnují jednu nebo více hypervariabilních domén protilátky Yl nebo Y17. Všechny od scFv odvozené konstrukty a fragmenty si uchovávají zvýšené vazebné charakteristiky tak, že se selektivně a/nebo specificky vážou k cílové buňce ve prospěch jiných buněk. Vazebná selektivita a/nebo specifičnost je primárně determinována hypervariabilními oblastmi.

[326.] Hypervariabilní smyčky uvnitř variabilních domén lehkých a těžkých řetězců jsou nazývány komplementaritu určující oblasti (hypervariabilní úseky, Complementary Determining Regions, CDR). V každém z těžkých a lehkých řetězců existují oblasti CDR1, CDR2 a CDR3.

Nejvariabilnější z těchto oblastí je oblast CDR3 těžkého, řetězce. Oblast CDR3 je považována za nejexponovanější oblast molekuly Ig a jak zde bylo prokázáno, je místem primárně zodpovědným za pozorované selektivní a/nebo specifické vazebné charakteristiky.

[327.] Peptid Yl a Y17 podle předmětného vynálezu může být kostruován tak, aby byl složen do multivalentních forem Fv. Multimerní formy Yl a Y17 byly zkonstruovány pro zlepšení vazebné afinity a specifičnosti a ke zvýšení jejich biologického poločasu v krvi.

114

[328.] Multivalentní formy scFv byly produkovány i jinými odborníky. Jeden z přístupů spojuje dva scFv pomocí linkerů. Jiný přístup pro spojení zahrnuje použití disulfidových vazeb mezi dvěmi scFv. Nejjednodušší přístup pro přípravu dimerních nebo trimerních Fv zveřejnil Hollinger et al., PNAS, 90, 6444-6448 (1993) a A. Kortt, et al., Protein Eng., 10, 423-433 (1977). Jedna z metod byla navržena tak, že dimery scFv jsou připravovány přidáním sekvence FOS a JUN proteinové oblasti za vzniku leucinového zipperu mezi nimi na C-konci scFv. Kostelny S.A. et al., J.Immunol. 1992, Mar 1; 148 (5) :1547-53; De Kruif J. et al., J. Biol. Chem. 1996 Mar 29; 271(13):7630-4. Jiná metoda byla navržena pro přípravu tetramerů přidáním sekvence kódující streptavidin na C-konec scFv. Streptavidin je složen ze čtyř podjednotek, a jestliže je scFv-streptavidin poskládán, přizpůsobují se 4 podjednotky tak, že tvoří tetramer. Kipriyanov SM et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 1995; 6(3):93-101. V dalším způsobu přípravy dimerů, trimerů a tetramerů je do proteinu, který je předmětem zájmu, zaveden volný cystein. Pro křížové spojení volných cysteinů požadovaného proteinu byl použit křížový linker na bázi peptidu s variabilním počtem (2 až 4) maleinimidových skupin. Cochran J.R. et al., Immunity, 2000 Mar; 12(3)24150.

[329.] V tomto systému byla fágová knihovna (jak byla popsána výše) navržena k expresi scFv, které se mohou skládat do monovalentní formy oblasti Fv protilátky. Kromě toho, jak bylo diskutováno výše, je konstrukt vhodný pro bakteriální expresi. Fragmenty scFv připravené metodami genetického inženýrství obsahují variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce připojené ke kontinuálně kódovanému

115

flexibilnímu peptidovému spaceru o 15 aminokyselinách. Výhodným spacerem je (Gly4Ser)3. Celková délka tohoto spaceru s aminokyselinovými složkami poskytuje neobjemný spacer, který dovoluje oblastem V_H a V_L poskládat se do funkční domény Fv, která poskytuje účinnou vazbu k cíli.

[330.] Předkládaný vynález je zaměřen na multimery Yl a X17, které byly připraveny způsoby známými v oboru. Výhodný způsob přípravy multimerů, zejména dimerů, zahrnuje použití cysteinových zbytků pro tvorbu disulfidových můstků mezi monomery. V tomto provedení jsou dimery vytvářeny přidáním cysteinu na karboxylový konec scFv (označeno jako Yl-cys scFv nebo Yl dimer), tak, aby byla usnadněna tvorba dimeru. Poté, co byl připraven konstrukt DNA (viz Příklad 2D a 6D) a použit pro transfekci, byly Yl dimery exprimovány v produkčním vektoru a znovu poskládány in vitro. Protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE, HPLC a FACS. Žádný z těchto prvních pokusů nenaznačoval tvorbu dimerů.

Z tohoto důvodu byl postup opakován a tentokrát byly provozovány dvoulitrové fermentační dávky protilátek. Po expresi Yl-cys v kmeni E.coli BL21 bylo provedeno opětovné poskládání proteinu (refolding) v argininu. Po refoldingu byl protein dialyzován a purifikován Q-Sepharosou a gelovou filtrací (Sephadex 75). SDS-PAGE (neredukovanou) a gelovou filtrací byly detekovány dva píky. Produkty odpovídající pikům byly jednotlivě odebrány a analyzovány FACS. Vazba monomeru a dimeru k buňkám Jurkat byla kontrolována pomocí FACS. Vazba dimerů vyžadovala pouze 1/100 množství monomerní protilátky pro stejnou úroveň barvení, které naznačuje, že dimer má vyšší aviditu. Byly stanoveny podmínky pro refolding dimeru a po následujících stupních dialýzy, chromatografie a gelové filtrace byl získán materiál obsahující > 90 % dimerů (mg množství).

116

Purifikovaný dimer byl charakterizován gelovou filtrací a analýzou SDS-PAGE za oxidačních podmínek. Vazebná kapacita dimerů byla potvrzena radíoreceptorovou zkouškou, ELISA analýzou a FACS analýzou.

[331.] Pro porovnání vazebnosti monomeru scFv (rovněž označovaném jako CONYl) a dimeru Yl byly provedeny pokusy vazebné kompetice in vitro na buňkách KG-1. Kromě toho tyto pokusy rovněž porovnávaly vazbu Yl IgG o úplné délce s monomery scFv Yl. K uskutečnění studie byl Yl IgG značen biotinem. Studie odhalila kompetici mezi Yl IgG a IgG YlBiotin. Kompetice nebyla zjištěna mezi nerelevantním lidským IgG a značeným Yl IgG. Částečná kompetice byla pozorována mezi Yl scFv (5 μρ a 10 μρ) a Yl IgG-Biotin (50 ng). Studie rovněž prokázaly, že 1 ng IgGYl-FITC se vázal na buňky KG-1 (bez séra) ve stejném rozsahu, jako 1 μg scFv-FITC, avšak v přítomnosti séra byla většina vazeb Yl IgG „blokována. Studie rovněž ukázaly, že vazebnost dimeru Yl je alespoň 20krát vyšší, než vazebnost scFv monomeru, jak bylo zjištěno analýzou pomocí radioreceptorové zkoušky, analýzy ELISA nebo analýzy FACS.

[332.] V dalším provedení podle vynálezu byl kromě cysteinu přidán na karboxylový konec lysin-alanin-lysin (zde označováno jako Yl-cys-KAK scFv). Aminokyselinová sekvence tohoto scFv konstruktu je uvedena níže a je rovněž sekvencí SEQ ID NO: 212.

MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ

APGKGLEWVS GINWNGGSTG 60

61YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM

RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 120

117 to * to to · · · · · to · to » to toto to to · · to to « · · · · · · ·· «···· • ···» ··« ··· ·· ·· ··· ·· ·

121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY

YASWYQQKPG QAPVLVIYGK 180

181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR

DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG 240

241 GGCKAK [333.] Yl-cys-KAK byl připraven v baktériích pomocí vektoru λ-pL. Exprese v λ-pL vektoru byla indukována zvýšením teploty na 42° C. Inkluzní protilátky byly získány z indukovaných kultur a byly semipurifikovány vodnými roztoky tak, aby byly odstraněny nežádoucí rozpustné proteiny. Inkluzní protilátky byly solubilizovány v guanidinu, redukovány DTT a in vitro ponechány v roztoku na bázi argininu/oxidovaného glutathionu pro refolding. Po refoldingu byl protein dialyzován a koncentrován tangenciální průtokovou filtrací vůči pufru obsahujícím močovino/fosfátový pufr. Protein byl opětovně purifikován a koncentrován iontovou chromatografií na SP-sloupci.

HPLC byla prováděna k získání profilu dimeru po refoldingu a purifikaci z gelového filtračního sloupce Superdex 75. Na Obrázku 42 je první pík pro Yl-cys-KAK (dimer) vlevo(~ 10,8 minut) a následující pík je pro monomer (~ 12 minut). Podle proteinových velikostních markérů putujících na stejném sloupci má dimer přibližně 52 kDa a monomer 26 kDa. Rovnováha mezi dimerem a monomerem může být změněna úpravou podmínek refoldingu (koncentrace oxidovaného činidla a koncentrace proteinu v pufru pro refolding). Dimer a monomer byly odděleny chromatografií na sloupci Superdex 75.

* ·«« · c r · · « «···· • ···· «·»

118 ......... ·· * [334.] Byla provedena zkouška ELISA pro zjištění vazebných rozdílů mezi monomerem (CONY1 scFv rovněž označený jako Yl-ΚΑΚ) a dimerem ΥΙ-cys KAK (cysteinový dimer) k antigenu GPIb (glycocalicin), odvozeném od destiček. Polyklonální anti-jednořetězcová protilátka a/nebo nová polyklonální anti-V_L (odvozená od králíků) a anti-králičí HRP protilátky byly použity pro detekci vazby k GPIb. Dimer byl přibližně lOOkrát aktivnější než monomer. Tak například, pro dosažení 0,8 jednotek O.D. bylo použito 12,8 μς/πιΐ monomeru ve srovnání s pouhým 0,1 μρ/ιηΐ dimeru. Viz Obrázek 19.

[335.] Kromě toho vazebná analýza FACS k buňkám KG-1 prokázala, že dimer je senzitivnější než monomer, jestliže byla prováděna dvou- nebo třístupňová vazebná zkouška. Dimery přímo značené FITC vykazovaly mírnou převahu (použito lOx méně materiálu) oproti monomeru. Radioreceptorová zkouška na buňkách KG-1, ve které byly dimery použity jako kompetitory, prokázala, že dimer je 30x účinnější než monomer.

[336.] Pozměňování délky spacerů je další výhodnou metodou tvorby dimerů, trimerů a tetramerů (často v oboru označovaných jako diabodies, triabodies a tetrabodies, v uvedeném pořadí). Dimery se tvoří za podmínek, kdy spacer spojující dva variabilní řetězce scFv je obecně zkrácen. Tento zkrácený spacer zabraňuje variabilním řetězcům téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Místo toho jsou domény nuceny párovat se s komplementárními doménami jiných molekul za vzniku dvou vazebných domén. Ve výhodném způsobu byl použit spacer pouze o 5 aminokyselinách (Gly₄Ser)pro konstrukci diabody. Tento dimer může být vytvořen ze dvou identických scFv, nebo ze dvou odlišných populací scFv a • · · · · · ··· · · · · · • · · · · · • ····· · · ·

119 ··· ·· ·· · · · může si uchovávat selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základních (parent) scFv(s), a/nebo vykazovat zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[337.] Podobným způsobem jsou vytvářeny triabodies za podmínek, kdy spacer spojující dva variabilní řetězce scFv je obecně zkrácený na méně než 5 aminokyselinových zbytků, což zabraňuje variabilním řetězcům téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Místo toho tři oddělené molekuly scFv asociují za vzniku trimeru. Ve výhodném provedení jsou triabodies získány úplným odstraněním flexibilního spaceru. Triabody může být vytvořena ze tří identických scFv nebo ze dvou nebo tří odlišných populací scFv a uchovává si selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základního (parent) scFv(s) a/nebo vykazuje zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[338.] Tetrabodies jsou podobně vytvářeny za podmínek, kdy spacerové spojení dvou variabilních řetězců scFv je obecně zkráceno na méně než 5 aminokyselinových zbytků, což zabraňuje dvěma variabilním řetězcům z téže molekuly poskládat se do funkční domény Fv. Místo toho čtyři oddělené molekuly scFv asociují za vzniku tetramerů. Tetrabodies mohou být vytvořeny ze čtyř identických scFv nebo 1-4 jednotlivých jednotek z odlišných populací scFv a měly by si uchovávat selektivní a/nebo specifickou zvýšenou vazebnou aktivitu základního (parent) scFv(s) a/nebo vykazovat zvýšenou vazebnou sílu nebo afinitu.

[339.] To, zda se v případě, kde spacer je obecně kratší než 5 aminokyselinových zbytků, budou vytvářet triabodies nebo tetrabodies, závisí na aminokyselinové

120 sekvenci konkrétních scFv(s) ve směsi a na reakčních podmínkách.

[340.] Ve výhodném provedení jsou tetramery vytvářeny prostřednictvím asociace biotin/streptavidin. Byl vytvořen nový fermentační konstrukt, který je schopen být enzymaticky značen biotinem (zde označován jako Yl-biotag nebo Yl-B). Sekvence, která je substrátem pro enzym BirA, byla přidána k C-konci Yl. Enzym BirA připojuje biotin k lysinovému zbytku uvnitř sekvence. Yl—biotag byl klonován a exprimován v E.coli. Inkluzní materiál protilátky byl izolován a refoldován. Čistota poskládaného proteinu byla > 95% a > 100 mg bylo získáno z kultury o objemu 1 litr (malé měřítko, neoptimalizované podmínky). Pomocí HPLC, SDS-PAGE a hmotové spektroskopie bylo zjištěno, že molekulová hmotnost této formy je podobná scFv. Bylo zjištěno, že Yl-biotag je nejkonzistentnější reagens pro analýzu FACS. Avšak, když byla studována vazba Yl-biotag a buněk KG-1 v přítomnosti séra, byly vyžadovány vysoké koncentrace (lOx více) oproti srovnatelné vazbě v nepřítomnosti séra. Nicméně, tento konstrukt nabídl výhodu specifické biotinylace, kde vazebné místo molekuly zůstává intaktní. Kromě toho je každá molekula značena pouze jedním biotinem, tj. každá molekula dostává jeden biotin na karboxylový konec.

[341.] Limitované značení jedním biotinem na molekulu v požadované poloze umožnilo produkci tetramerů se streptavidinem. Tetramery se vytvářely inkubací Yl-B se streptavidin-PE.

[342.] Analýza FACS naznačila, že tetramery vytvářené z Yl-biotag a Streptavidin-PE byly v nepřítomnosti séra 100

121 až lOOOkrát citlivější než monomery Yl scFv., Tetramery Ylbiotag se streptavidin-PE se specificky vážou k jedné buněčné linii (KG-1), které je Yl-reaktivní. Odlišnost této reakce od vazby pozadí byla velmi vysoká a poskytla vysokou citlivost pro detekci malých množství receptoru.

Vyhodnocení FACS úplné normální krve s tetramery Y1BSAV naznačilo, že není přítomna žádná vysoce reaktivní populace. Monocyty a granulocy byly pozitivní v malém rozsahu. U buněčných linií, u nichž byly získány pozitivní výsledky, jako s KG-1 buňkami, byly tetramery alespoň lOOkrát reaktivnější.

[343.] Poté byly tetramery inkubovány s buněčnými vzorky. Nízká dávka tetramerů Yl (5 ng) se dobře váže s buněčnou linií (KG-1) a poskytuje 10 až 20krát vyšší odpověď, než byla dosud pozorována s jinými protilátkovými formami Yl. Minoritní reakce byla zjištěna, jestliže byly testovány negativní buněčné linie s různými dávkami tetramerů.

Konjugáty pro diagnostické a farmaceutické účely [344.] Protilátky a jejich vazebné fragmenty podle předmětného vynálezu mohou být asociovány, kombinovány, fúzovány nebo vázány s různými farmaceutickými agens, jako jsou léčiva, toxiny a radioaktivní izotopy, případně s farmaceuticky účinným nosičem, za tvorby kompozic obsahujících léčivo-peptid (drug-peptide compositions), fúzní složky nebo konjugáty, které mají účinnost proti onemocnění nebo proti rakovině. Takové konjugáty a fúzní složky mohou být rovněž použity pro diagnostické účely.

122 [345.] Příklady vhodných nosičů vhodných k použití podle vynálezu zahrnují dextran, HPMA (lipofilní polymer) nebo jakýkoliv jiný polymer. V jiném provedení mohou být použity upravené liposomy, jako jsou liposomy nesoucí molekuly scFv Yl, například Doxil, který je komerčně dostupným preparátem obsahujícím liposomy obsahující velká množství Doxorubicinu. Takové liposomy mohou být připraveny tak, aby obsahovaly jedno nebo více požadovaných farmaceutických agens a mohou být smíchány s protilátkami podle předkládaného vynálezu za poskytnutí vysokého poměru léčiva k protilátce.

[346.] V dalším provedení může být vazbou mezi protilátkou nebo jejím fragmentem a farmaceutickým agens vazba přímá. Přímá vazba mezi dvěmi nebo více sousedícími molekulami může vznikat prostřednictvím chemické vazby mezi prvky nebo skupinami prvků v molekulách. Chemickou vazbou může být například iontová vazba, kovalentní vazba, hydrofobní vazba, hydrofilní vazba, elektrostatická vazba nebo vodíková vazba. Vazby mohou být prostřednictvím skupiny, například skupiny amino, karboxy, amido, hydroxy, a peptidová a disulfidová vazba. Přímou vazbou může výhodně být vazba rezistentní k proteázám.

[347.] Vazba mezi peptidem a farmaceutickým agens, nebo mezi peptidem a nosičem, nebo mezi nosičem a farmaceutickým agens může být prostřednictvím linkerové sloučeniny. Tak, jak je zde v popise a v nárocích používáno, je linkerová sloučenina definována jako sloučenina, která spojuje dvě nebo více sloučenin dohromady. Linker může mít přímý nebo rozvětvený řetězec. Linker s rozvětveným řetězcem může být složen ze dvouvětevných, třívětevných nebo čtyřvětevných sloučenin.

··· · · ··« · · · • ····· · · · * ·····

123 ····· ·· ··· ·· ·

Linkerové sloučeniny vhodné podle vynálezu zahrnují sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z díkarboxylových kyselin, maleimido hydrazidů, PDPH, hydrazidů karboxylové kyseliny a malých peptidů.

[348.] Konkrétnější příklady linkerových sloučenin vhodných podle předkládaného vynálezu zahrnují:

a. dikarboxylové sloučeniny, jako je kyselina jantarová, kyselina glutarová a kyselina adipová;

b. maleimido hydrazidy, jako jsou hydrazid N-[εmaleimidokapronové kyseliny], 4-[Nmaleimidomethyl]cyklohexan-l-karboxylhydrazid, a hydrazid N-[K-maleimidoundekanové kyseliny];

c. PDPH linkery, jako je (3—[2 — pyridyldithio]propionyl hydrazid) konjugovaný se sulfhydrylovým reaktivním proteinem; a

d. hydrazidy karboxylových kyselin vybraných z kyselin o 2-5 atomech uhlíku [349.] Rovněž jsou vhodné přímé vazby využívající malých peptidových linkerů. Tak například, s použitím malých peptidů mohou být vytvořeny přímé vazby mezi volným cukrem, například protirakovinné látky Doxorubicinu, a scFv. Příklady malých peptidů zahrnují AU1, AU5, Btag, cmyc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3,

Protein C, S-TAG®, T7, V5, VSV-G.

[350.] Protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být připojeny, konjugovány, komplexovány s nebo jinak asociovány se zobrazovacími agens (rovněž nazývanými indikativní markéry), jako jsou radioizotopy, a tyto konjugáty mohou být užitečné pro • · • · · · · · · • · · · · « ····** ·

124 ··· » · ·· ··· diagnostiku a zobrazovací účely. Jsou poskytnuty kity obsahující takové konjugáty radioizotop-protilátka (nebo fragmenty protilátky).

[351.] Příklady radioizotopů vhodných pro diagnostiku zahrnují ⁿⁱindium, ¹¹³indium, ^99mrhenium, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³ jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium. Výhodnými radioaktivním izotopy jsou izotopy opakní v paprscích X (rentgenovém záření) nebo paramagnetických iontů.

[352.] Indikativní markerovou molekulou může rovněž být fluorescenční markerová molekula. Příklady fluorescenčních markerových molekul zahrnují fluorescein, phycoerythrin, nebo rhodamin, nebo jejich modifikace či konjugáty.

[353.] Protilátky nebo jejich fragmenty konjugované k indikativním markérům mohou být použity pro diagnostiku nebo monitorování stavů onemocnění. Takový monitoring může být prováděn in vivo, in vitro, nebo ex vivo. Jestliže je monitoring prováděn in vivo nebo ex vivo, je zobrazovací agens výhodně fyziologicky přijatelné, tj.takové, že nepoškozuje pacienta v nepřijatelném rozsahu. Přijatelné úrovně poškození mohou být stanoveny klinickými lékaři s použitím takových kriterií, jako je vážnost onemocnění a dostupnost jiných alternativ.

··· · · ··· · ··

125 ··· ·· ·· · · · [354.] Předkládaný vynález poskytuje diagnostický kit pro in vitro analýzu účinnosti léčby před, během a po ošetření, který obsahuje zobrazovací agens sestávající z peptidu podle vynálezu spojeného s indikativní markerovou molekulou. Vynález dále poskytuje způsob použití zobrazovacího agens pro diagnostickou lokalizaci a zobrazení nádoru, konkrétně tumoru, který zahrnuje následující kroky:

a) kontaktování buněk s kompozicí,

b) měření radioaktivity vázané na buňky, a

c) vizualizaci tumoru.

[355.] Příklady vhodných zobrazovacích agens zahrnují fluorescenční barviva, jako je FITC, PE a podobně, fluorescenční proteiny, jako jsou zelené fluorescenční proteiny. Jiné příklady zahrnují radioaktivní molekuly a enzymy, které reagují se substrátem za vzniku rozpoznatelné změny, jako je změna zbarvení.

[357.] Podle jednoho příkladu je zobrazovacím agens v kitu fluorescenční barvivo, jako například FITC, a kit umožňuje analýzu účinnosti léčby nádorů, konkrétněji rakoviny krve, tj. leukemie, lymfomu a myelomu. Je používána analýza FACS pro stanovení procenta buněk obarvených fluorescenčním agens a intenzity barvení v každém stupni onemocnění, tj. po diagnóze, během léčby, během remise a během relapsu.

[358.] Protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být vázány, konjugovány s nebo jinak asociovány s protirakovinnými agens, antileukemickými

126

agens, antimetastatickými agens, protizánětlivými agens, antitrombotickými agens, antirestenotickými agens, antiagregačními agens, antiautoimunitními agens, antiadhezními agens, agens proti kardiovaskulárním onemocněním, nebo s jinými agens proti onemocněním a farmaceutickým agens. Farmaceutické agens se týká agens, které je vhodné k profylaktickému ošetření nebo k diagnostice u savců zahrnujících , avšak bez omezení, člověka, hovězí dobytek, koně, vepře, myši, psy, kočky, nebo jakákoliv jiná teplokrevná zvířata.

[358.] Příklady takových farmaceutických látek zahrnují, avšak bez omezení, antivirální agens včetně acycloviru, gancicloviru, zidovudinu; látky s účinností proti trombóze/restenóze zahrnující cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirin; protizánětlivá činidla zahrnující zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtolmetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib a nimesulfid; látky proti autoimunitě zahrnující leflunomid, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotid a cyklofosfamid; a antiadhezivní/antiagregační látky zahrnující limaprost, clorcromen a kyselinu hyaluronovou.

[359.] Další příkladná farmaceutická agens zahrnují Doxorubicin (adriamycin), morfolinodoxorubicin, methoxymorfolinyldoxorubicin, cis-platinu, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabin (Ara-C), cyklofosfamid, prednison, daunorubicin, morfolinodaunorubicin, methoxymorfolinyldaunorubicin, idarubicin, fludarabin, chlorambucil, interferon alfa,

127 hydroxymočovinu, temozolomid, thalidomid a bleomycin a jejich deriváty a kombinace.

[360. ] Protirakovinné agens je látka s protirakovinnou aktivitou. Tak například, protirakovinná agens zahrnují takové látky, které inhibují nebo zastavují růst rakovinných nebo nezralých prekancerózních buněk, látky, které zabíjejí rakovinné nebo prekancerózní buňky, látky, které zvyšují citlivost rakovinných nebo prekancerózních buněk k jiným protirakovinným látkám, a látky, které inhibují metastázu rakovinných buněk. Podle předkládaného vynálezu může být protirakovinným agens též látka s antiangiogenní aktivitou, která brání, inhibuje, retarduje nebo zastavuje vaskularizaci tumorů.

[361.] Inhibice růstu rakovinné buňky zahrnuje například (i) prevenci rakovinného nebo metastatického růstu, (ii) snížení rakovinného nebo metastatického růstu, (iii) úplné zabránění procesu růstu rakovinné buňky nebo metastatického procesu, s tím, že buňka zůstává intaktní a živá, nebo (iv) zabití rakovinné buňky.

[362.] Antileukemické agens je látka s antileukemickou aktivitou. Tak například, antileukemické agens zahrnují takové látky, které inhibují nebo zastavují růst leukemických nebo nezralých preleukemických buněk, látky, které zabíjejí leukemické nebo preleukemické buňky, látky, které zvyšují citlivost leukemických nebo preleukemických buněk k jiným antileukemickým látkám, a látky, které inhibují metastázu leukemických buněk. Podle předkládaného vynálezu může být antileukemickým agens též látka s antiangiogenní aktivitou, která brání, inhibuje, retarduje nebo zastavuje vaskularizaci tumorů.

128 [363.] Inhibice růstu leukemických buněk zahrnuje například i) prevenci leukemického nebo metastatického růstu, (ii) snížení leukemického nebo metastatického růstu, (iii) úplné zabránění procesu růstu leukemické buňky nebo metastatického procesu, s tím, že buňka zůstává intaktní a živá, nebo (iv) zabití leukemické buňky.

[364.] Příklady agens proti onemocněním, proti rakovině a proti leukémii, ke kterým mohou být protilátky a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu vhodně vázány, zahrnují toxiny, radioizotopy a farmaceutické látky.

[365.] Příklady toxinů zahrnují gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, diftérický toxin, ricin nebo jejich modifikace nebo deriváty.

[366.] Příklady radioizotopů zahrnují radioizotopy gama-zářiče, positron-zářiče a zářiče rentgenového záření, které mohou být použity pro lokalizaci a/nebo terapii, a beta-zářiče a alfa-zářiče, které mohou být použity pro léčení.

[367.] Konkrétnější příklady terapeutických radioizotopů zahrnují ^1:L1indium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechnecium, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

129 [368.] Nelimitující příklady protirakovinných a antileukemických agens zahrnují Doxorubicin (adriamycin), morfolinodoxorubicin, methoxymorfolinyldoxorubicin, cisplatinu, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabin (AraC) , cyklofosfamid, prednison, daunorubicin, morfolinodaunorubicin, methoxymorfolinyldaunorubicin, idarubicin, fludarabin, chlorambucil, interferon alfa, hydroxymočovinu, temozolomid, thalidomid a bleomycin a jejich deriváty a kombinace.

Farmaceutické kompozice [369.] Protilátky, konstrukty, konjugáty a fragmenty podle předmětného vynálezu mohou být podány pacientovi, který to potřebuje prostřednictvím vhodné metody. Příkladné metody zahrnují intravenózní, intramuskulární, subkutánní, topický, intratracheální, intrathekální, intraperitoneální, intralymfatický, nasální, sublinguální, orální, rektální, vaginální, respirační, bukální, intradermální, transdermální nebo intrapleurální způsob podání.

[370.] Pro intravenózní podání je prostředek výhodně připraven tak, aby množství podané pacientovi bylo účinným množstvím od přibližně 0,1 mg do přibližně 1000 mg v požadované kompozici. Výhodněji, podané množství bude v rozmezí od přibližně 1 mg do přibližně 500 mg v požadované kompozici. Kompozice podle vynálezu jsou účinné v širokém dávkovacím rozsahu a závisejí na takových faktorech, jako je specifikum ošetřované nemoci, biologický poločas peptidové nebo polypeptidové farmaceutické kompozice v těle pacienta, fyzikální a chemické charakteristiky farmaceutického agens a farmaceutické kompozice, způsob podání farmaceutické kompozice, • · • * · · · ··· · ·· • · · ·· · ···· • ····· · · ·· · ·*· • · · · · ··· ····· ·· ··· · · ·

130 zvláštnosti pacienta, který je ošetřován nebo diagnostifikován, stejně jako jiné parametry, o kterých se ošetřující lékař domnívá, že jsou důležité.

[371.] Kompozice pro orální podání může být v jakékoliv vhodné formě. Příklady zahrnují tablety, tekutiny, emulze, suspenze, sirupy, pilulky, tobolky nebo kapsule. Způsoby přípravy farmaceutických kompozic jsou v oboru velmi dobře známy. Viz například Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.)Lippincott, Williams & Wilkins (pub).

[372.] Farmaceutická kompozice může být také formulována tak, aby usnadňovala časované, udržovací, pulsované nebo kontinuální uvolňování. Farmaceutická kompozice může být podána také jako zařízení, jako je zařízení s časovaným, postupným, pulsovaným nebo kontinuálním uvolňováním.

[373.] Farmaceutická kompozice pro topické podání může být v jakékoliv vhodné formě, jako jsou krémy, masti, tekuté přípravky (lotio) , náplasti, roztoky, suspenze a gely.

[374.] Kompozice obsahující protilátkové fragmenty připravené podle vynálezu může obsahovat běžná farmaceuticky přijatelná ředidla, excipienty, nosiče a podobně. Tablety, pilulky, tobolky a kapsule mohou obsahovat běžné excipienty, jako jsou laktóza, škrob a stearát hořečnatý. Čípky mohou obsahovat excipienty, jako jsou vosky a glycerol. Injekční roztoky obsahují sterilní apyrogenní média, jako je fyziologický roztok, a mohou obsahovat pufrovací činidla, stabilizační činidla nebo • · ·«· · · ··· · ·· • · · ·· · ··*· • ····· · · · · ····· • ···· ··· ····· ·· ··· · · ·

131 konzervační látky. Rovněž mohou být použity běžné enterické potahovací látky.

[375.] Následující příklady provedení jsou předkládány pro pochopení‘vynálezu, ale nejsou zamýšleny a neměly by být vykládány způsobem omezujícím rozsah vynálezu. Ačkoliv jsou popsány specifické reagencie a reakční podmínky, mohou být prováděny modifikace, které jsou míněny tak, že spadají do rozsahu vynálezu. Následující příklady jsou proto poskytnuty pro další ilustraci vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ

Příklad 1 :Příprava destiček

1.1 Příprava promytých destiček [376.] Koncentrát destiček v kyselina-citrát-dextróze (acid-citrate-dextrose, ACD)) byl získán z krevní banky, destičky byly izolovány, jednou promyty v pufru obsahujícím ACD a fyziologický roztok v poměru 1:7. Po každém promytí byly destičky centrifugovány při 800 x g po dobu 10 minut a byly resuspendovány v roztoku Tyrodes (2 mM MgCl₂ , 137 mM NaCl, 2,68 mM KC1, 3 mM NaH₂PO₄, 0,1 % glukóza, 5 mM Hepes a 0,35 % albumin, pH 7,35) a byl stanoven počet buněk.

1.2 Příprava plasmy bohaté na destičky [377.] Krev byla shromážděna do zkumavky obsahující 3,8% citrát sodný. Plasma bohatá na destičky byla připravena centrifugací při 250 x g po dobu 10 minut.

Příklad 2: Agregace destiček • ·» ·· * ·· · •· « · · · · · · ·· • · · · · · · · * » • ·*··· · « · · ·>··*

132 #·«·· ·· · ·· · · » [378.] Pro studium agregace destiček byly plasma bohatá na destičky (platelet rich plasma, (PRP)) a promyté destičky míchány při 500 otáčkách za minutu a 37° C v lumiagregometru pro úplnou krev (Lumiaggregometer Chronolog, Havertown, PA). Rozdíl ve světelné transmisi při průchodu suspenzí destiček a suspendujícím médiem byl vzat jako 100% agregace. Účinek Yl na agregaci destiček byly vyhodnocován přidáním různých koncentrací Yl před přidáním agonisty a účinek byl zaznamenáván po dobu čtyř minut.

Příklad 3: Působení endoproteázami na destičky

3.1 Štěpení destiček Mocarhaginem [379.] Pro digesci Mocarhaginem bylo na 10⁸ promytých destiček v pufru TS (0,01 M Tris, 0,15 M chlorid sodný, pH 7,4), obsahujícím 1 mM chloridu vápenatého, působeno 12 μg/ml mocarhaginu (konečná koncentrace) po dobu 1 hodiny při 22° C a štěpení bylo zastaveno přidáním EDTA na koncentraci 0,01 M.

3.2 Štěpení glycocalicinu Cathepsinem G [380.] 10⁸ promytých destiček v pufru TS obsahujícím 1 mM chloridu vápenatého bylo inkubováno s 1,8 μρ/ιηΐ cathepsinu G (konečná koncentrace) po dobu 4 hodin při 22°

C a štěpení bylo zastaveno přidáním PMSF na koncentraci 1 mM.

[381.] 10⁶destiček v 0,1 M pufru Tris o pH 7,4, obsahujícím 0,2 % albuminu a proteázové inhibitory (10 μΜ leupeptinu, 0,24 mM PMSF) bylo inkubováno s 0,14 mg/ml • ·

9 9

133

O-sialoglykoprotein endoproteázy (konečná koncentrace) po dobu 45 minut při 37° C a štěpení bylo zastaveno přidáním vzorku pufru a varem. Použitý vzorek pufru obsahoval 3 % SDS, 12 % glycerolu, 50 mM Tris.HCl, 2 % βmerkaptoethanolu, a 0,03 % bromfenolové modře.

Příklad 4: Štěpení glycocalicinu endoproteázami

Štěpení glycocalicinu Mocarhaginem [382.] Pro štěpení mocarhaginem byl glycocalicin v pufru TS, obsahujícím 1 mM chloridu vápenatého, inkubován s 10 pg/ml mocarhaginu (konečná koncentrace) pod dobu 1 hodiny při 22° C a štěpení bylo ukončeno přidáním EDTA na koncentraci 0,01 M.

Štěpení glycocalicinu Cathepsinem G [383.] Pro štěpení cathepsinem G byl glycocalicin v pufru TS, obsahujícím 1 mM chloridu vápenatého inkubován s 3,4 gg/ml cathepsinu G (konečná koncentrace) po dobu 4 hodin při 22° C a štěpení bylo ukončeno přidáním PMSF ke koncentraci 1 mM.

Štěpení glycocalicinu O-sialoglykoprotein endoproteázou [384.] Glycocalicin v 0,05 M Tris pufru o pH 7,4 byl inkubován s 1,2 mg/ml O-sialoglykoprotein endoproteázy (konečná koncentrace) po dobu 15 min při 37° C a digesce byla ukončená přidáním vzorkového pufru (tak, jak je popsán v Příkladu 3(YH) a varem.

•· ·· · ··· • ·· · · · * · ····· · · ·· ·····

134 ··· · · ·· ··· · ·

Příklad 5: Konstrukce Yl IgG o úplné délce [385.] Úplné molekuly IgG mají několik předností oproti formám Fv, včetně delšího poločasu in vivo a potenciálu pro indukci buněčných odpovědí in vivo, jako jsou odpovědi zprostředkované ADCC nebo CDC (complement dependent cytotoxicity; Tomlinson, Current Opinions of Immunology, 5, 83-89 (1993)). Postupem molekulárního klonování, který je popsán níže, byly konvertovány oblasti Yl Fv do molekul IgGl o úplné délce. Konstrukce Yl-IgGl byla provedena vzájemným spojením cDNA v následujícím pořadí: Sekvence lehkých a těžkých řetězců ΥΙ-IgG jsou uvedeny na Obr. 48. Jsou uvedeny otevřený čtecí rámec (open reading frame, (ORF)) nukleotidové sekvence Yl-HC (SEQ ID NO: 205), aminokyselinová sekvence Yl-HC (SEQ ID NO: 206), ORF nukleotidové sekvence Yl-LC (SEQ ID NO: 207), a aminokyselinová sekvence Yl-LC (SEQ ID NO: 208).

[386.] Vedoucí sekvence kompatibilní se savčím expresním systémem: Byl vyvinut zaměnitelný systém umožňující vhodnou inzerci elementů vyžadovaných pro molekulu IgG o úplné délce. Byly syntetizovány následující komplementární dvouřetězcové oligonukleotidy kódující domnělou vedoucí sekvenci, tyto byly anelovány a ligovány do místa Xhol savčího expresního vektoru pBJ-2 (pod řízení promotoru SRcc5) .

5'-TCGACCTCATCACCATGGCCTGGGCTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCA

GGACACAGGGTCCTGGGCCGAT a

5'-GATCGATTGCACCAGCTGGATATCGGCCCAGGACCCTGTGTCCTGAGTGAG

GAGGGTGAGGAGCAGCAGAGCCCAGGCCATGGTGATGAGG. Proti směru od iniciačního kodonu ATG byly včleněny dva elementy Kozákové.

135

Kromě toho bylo zavedeno vnitřní místo FcoRV mezi domnělé místo štěpení vedoucí sekvence a místo Xhol tak, aby bylo umožněno subklonování variabilních oblastí. Tento modifikovaný vektor byl označen jako pBJ-3.

[387.] Sekvence kódující V_L, odvozená ze sekvence cDNA sekvence pro Yl-scFv, byla inzerována mezi sekvenci kódující vedoucí sekvenci a sekvencí kódující konstantní oblast lehkého řetězce. Podobně byla sekvence kódující V_H, odvozená ze sekvence cDNA sekvence pro Yl-scFv inzerována mezi sekvenci kódující vedoucí sekvenci a sekvenci kódující konstantní oblast těžkého řetězce. Toto bylo provedeno PCR amplifikací vektoru pHEN-Yl, kódujícího původní Yl tak, aby byly získány jednotlivě oblasti V_L a V_H.

Oligonukleotidy [388.] Oligonukleotidy 5'-TTTGATATCCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA (sense) a

5'-GCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGT (anti-sense) byly použity pro PCR reakci pro amplifikací V_L Produkt cDNA o očekávané velikosti ~ 350 bp byl purifikován, sekvenován a štěpen pomocí restrikčních enzymů EcoRV a AvrlI. Stejný postup byl proveden pro amplifikací a purifikaci cDNA pro oblast V_H s použitím sense a anti-sense oligonukleotidů:

[389.]

5'-GGGATATCCAGCTG(C/G)(A/T)GGAGTCGGGC a

5'-GGACTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTG,v uvedeném pořadí.

··· ·· ·· ···

136 [390.] Konstantní oblasti: Konstantní oblast λ3 (CLÍŠ) a konstantní oblasti těžkých řetězců CH1-CH3, odvozené pro cDNA IgGl, byly jednotlivě syntetizovány následujícím způsobem:

[391.] Pro konstantní oblast CL-13 byla provedena RTPCR na mRNA extrahované z poolu normálních periferních B buněk (buňky CD19+) v kombinaci se sense oligonukleotidem 5'-CCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGC a anti-sense oligonukleotidem 5'-TTTGCGGCCGCTCATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGT. Produkt PCR o očekávané velikosti (~ 400 ) byl purifikován, sekvenován a štěpen restrikčními enzymy AvrlI a Notl.

[392.] Pro konstantní oblast IgGl (γ řetězec) byl klon lidských B buněk (klon CMV - klon # 40), imortalizovaný BTG, selektován pro PCR amplifikaci. Bylo zjištěno, že tento klon sekretuje IgGl proti lidskému CMV a rovněž bylo zjištěno, že indukuje odpověď ADCC ve zkouškách in vitro. Pro cDNA oblasti CH1-CH3 byly syntetizovány oligonukleotidy

5'-ACCGCTCGAGTGC(T/C)TCCACCAAGGGCCCATC(G/C)GTCTTC (sense) a

5'-TTTGCGGCCGCTCATTTACCC(A/G)GAGACAGGGAGAGGCT (anti-sense) a byly použity pro PCR amplifikaci. Tak, jak bylo popsáno pro cDNA sekvenci kódující CL, byl produkt PCR o očekávané velikosti (~ 1500 bp) purifikován, sekvenován a štěpen restrikčními enzymy AvrlI a Notl.

[393.] Pro konečný expresní vektor byl proveden postup trojnásobné ligace s použitím vektoru pBJ-3 předem štěpeného EcoRV-Notl, cDNA pro variabilní oblasti, štěpené

137

EcoRV-AvrlI, a cDNA pro konstantní oblasti, štěpené AvrlINotl. Konečný vektor pro expresí těžkého a lehkého řetězce byl pojmenován jako pBJ-Yl-HC a pBJ-Yl-LC,v uvedeném pořadí.

[394.] Další vektor, pBJ-Yl-LP, byl zkonstruován na základě pBJ-Yl-LC tak, aby umožnil dvojitou selekci na základě genu pro rezistenci k puromycinu (puromycin resistant gene, PAC). V tomto vektoru byl gen pro rezistenci k neomycinu plasmidu pBJ-Yl-LC zaměněn fragmentem o ~ 1600 bp kódujícím gen PAC (z vektoru pMCCZP) .

[395.] Otevřený čtecí rámec (ORF) jak pro Yl-HC, tak pro Yl-LC a jimi kódované aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v sekvencích SEQ ID NO: 205 až 208.

[396.] Vedoucí sekvence je podtržena. Každá z kódovaných oblastí V_H a V_L je podtržena, následuje buďto sekvence konstantní oblasti IgGl (pro těžký řetězec), nebo sekvence konstantní oblasti λ3 (pro lehký řetězec).

[397.] Exprese těžkého a lehkého řetězce Yl v buňkách

CHO.

Vektory pBJ-Yl-HC a pBJ-Yl-LC byly individuálně použity pro transfekci a selekci stabilních buněk, které exprimují těžké a lehké řetězce. Po selekci na G418 a růstu buněk byl sekretovaný protein v supernatantu analyzován na expresi IgGl s použitím sendvičové (capture) EIA zkoušky a analýzy Western blotting, jak je popsáno níže.

138 [398.] Sendvičová EIA zkouška: Na jamky 96-jamkové destičky byl předem navázán myší protilidský IgGl Fc (Sigma). Supernatant z výše uvedeného postupu byl přidán do jamek a přítomnost těžkého řetězce IgGl byla detekována biotinylovanou kozí anti-γ chain specifickou protilátkou (Sigma), streptavidin-HRP a substrátem. ELISA plate reader zaznamenal vznik zabarvení při A405 · [399.] Analýza Western blotting: Supernatant z výše uvedených buněk byl nanesen na 12,5% SDS-PAGE. Exprese každého z řetězců byla detekována s (a) kozí anti-human IgG-HPR protilátkou(H+L; Sigma Cat #A8667) pro detekci těžkého řetězce a (b) biotinylovanou kozí anti-human λ3 chain protilátkou (Southern Biotechnology Association, Cat #2070-08) pro detekci lehkého řetězce.

[400.] Exprese obou řetězců byly potvrzena výše uvedenými zkouškami a pak byla provedena kotransfekce tak, aby byl získán ΥΙ-IgGl o úplné délce.

Exprese a purifikace IgG-Yl [401.] Buněčná kultura a transfekce: Buňky CHO byly kultivovány v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem a 40 pg/ml gentamicinu při 37° C v 5% atmosféře CO2 Jeden den před transfekcí bylo 0,8-lxl0⁶ buněk vyseto na 90mm plotny. Kultury byly kotransfektovány s 10 pg DNA lehkých a těžkých řetězců transfekční reagenční technikou FUGene (Roche). Po dvou dnech růstu v neselektivním médiu byly buňky kultivovány po dobu 10-12 dnů v médiu F-12, obsahujícím 550 pg/ml neomycinu a 3 μg/ml puromycinu. Buňky byly trypsinizovány a klonovány limitujícím ředěním 0,5 buněk/jamka v jamkových destičkách Costar. Jednotlivé

139 kolonie byly sklizeny, pěstovány v miskách o šesti jamkách a přeneseny do lahví.

[402.] Stanovení sekrece těžkých a lehkých řetězců: Bylo použito sandvičové zkoušky ELISA ke stanovení protilátky sekretované do supernatantu transfektovaných buněk CHO. Ke stanovení koncentrace protilátky byly použity následující reagencie: monoklonální anti-human IgGl (Fc)(Sigma) jako navázaná protilátka, biotinový konjugát s kozí anti-human IgG protilátkou (specifickou pro γ-řetězec) jako detektor (Sigma) a čistý lidský IgGl, lambda (Sigma) jako standard. Ve zkoušce ELISA se rychlost produkce pohybovala v rozmezí 3-4 μρ/πιΐ.

[403.] Produkce a purifikace Mab z buněk: Buňky byly pěstovány v rotujících láhvích ke konečné koncentraci 12xl0⁸ buněk na láhev v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem, doplněným neomycinem a puromycinem. Pro produkci byly buňky kultivovány ve stejném médiu, avšak s 2% fetálním telecím sérem po další po dva dny.

[404.] Sekretovaná protilátka byla purifikována na sloupci G-Sepharose (Pharmacia). Vazba probíhala v 20 mM sodném fosfátovém pufru, pH 7,0; eluce byla prováděna v 0,lM glycinovém pufru, pH 2,5-3,0. Množství purifikované protilátky bylo stanoveno UV absorbancí, čistota byla analyzována pomocí SDS-PAGE. Za nedenaturujících podmínek měla úplná protilátka IgG očekávanou molekulovou hmotnost 160 kD. V denaturovaných gelech měly jak těžký, tak lehký řetězec očekávanou molekulovou hmotnost 55 a 28 kD, v uvedeném pořadí.

140 [405.] Vazba úplné molekuly IgG-Yl: Byly prováděny vazebné pokusy za účelem stanovení úrovně vázání molekuly IgG-Yl ve srovnání s úrovní vazby molekuly scFv-ΥΙ. Bylo použito metody dvojího barvení, ve které 5 ng IgG-Yl reagovalo jak s buňkami RÁJI (negativní kontrola, Obrázky 44-47a, tak s buňkami Jurkat (Yl pozitivní buňky, Obrázky 44-47b a 44-47c). K detekci byl použit kozí PE-značený anti-human IgG (Obrázky 44-47c). Podobně, 1 μς scFv-ΥΙ reagoval s buňkami Jurkat (Obrázky 44-47b) a králičí PEznačený anti-scFv byl použit pro detekci. Výsledky naznačují, že jak IgG-Yl, tak scFv-ΥΙ vážou buňky Jurkat s tím, že pro detekci podobné úrovně je třeba přibližně 10^{3 * *}krát více molekul scFv-ΥΙ, než molekul IgG-Yl.

Příklad 6: Příprava fragmentů Fab a F(ab')₂ odvozených z úplné protilátky IgG Yl

Buněčná kultura a transientní transfekce [406.] Buňky CHO byly kultivovány v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem a 40 pg/ml gentamicinu při 37° C v 5% atmosféře CO₂. Jeden den před transfekcí bylo 1l,5xl0⁶ buněk vyseto na 90mm plotny. Kultury byly kotransfektovány s 10 pg DNA kódující variabilní lehké a variabilní těžké řetězce protilátky Yl, pro každý řetězec odděleně v eukaryontním expresním systému. Transfekce byly prováděny transfekční reagenční technikou FUGene (Roche).

[407.] Po dvou dnech růstu v neselektivním médiu byly buňky kultivovány po dobu 10-12 dnů v médiu F-12, obsahujícím 550 pg/ml neomycinu a 3 pg/ml puromycinu. Buňky byly trypsinizovány a klonovány limitujícím ředěním 0,5 buněk/jamka v jamkových plastových destičkách Costar-96.

141

Jednotlivé kolonie byly sklizeny, pěstovány v miskách o šesti jamkách a přeneseny do lahví pro další selekci (ke stanovení hladiny exprese a sekrece protilátky do růstového média).

Buněčná kultura a dlouhodobá transfekce:

[408. Buňky CHO byly kultivovány v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem a 40 pg/ml gentamicinu při 37° C v 5% atmosféře C0₂. Jeden den před transfekcí bylo 0,8-lx 10⁶ buněk vyseto na 90mm plotny. Kultury byly transfektovány s 10 pg DNA kódující variabilní lehké a variabilní těžké řetězce protilátky Yl, klonované pod CMV (cytomegalovirový) promotor, a gen dhfr pod promotorem sv40. Transfekce byla provedena s použitím transfekční reagenční techniky FUGene (Roche). Po dvou dnech růstu v neselektivním médiu byly buňky kultivovány v médiu obsahujícím 100 nM - 5 μΜ methotrexatu (MTX)a dialyzované fetální telecí sérum tak, aby byly selektovány klony (po limitujícím zředění), které exprimují zvýšené hladiny úplné protilátky Yl.

Stanovení sekrece těžkých a lehkých řetězců:

[409.] Bylo použito sandvičové zkoušky ELISA ke stanovení koncentrace protilátky sekretované do supernatantu transfektovaných buněk CHO. Ke kvantifikaci koncentrace protilátky byly použity následující reagencíe: monoklonální protilátka anti-human IgGl (Fc)(Sigma) jako navázaná protilátka, biotinový konjugát s kozí anti-human IgG protilátkou (specifickou pro γ-řetězec) jako detektor (Sigma) a čistý lidský IgGl, lambda (Sigma) jako standard.

142

Produkce a purifikace Mab z buněk:

[410.] Buňky byly pěstovány v rotujících láhvích ke konečné koncentraci l-2x!0⁸ buněk na láhev v médiu F-12 s 10% fetálním telecím sérem, doplněným neomycinem a puromycinem (tak, jak je uvedeno výše) . Pro produkci protilátek byly buňky kultivovány ve stejném médiu, avšak s 2% fetálním telecím sérem, po další po dva dny.

[411.] Sekretovaná protilátka byla purifikována na sloupci G-Sepharose (Pharmacia) a iontovýměnném sloupci QSepharose (Pharmacia). Vazba probíhala v 20 mM sodném fosfátovém pufru, pH 7,0, zatímco eluce byla prováděna v O,1M glycinovém pufru, pH 2,5-3,0. Množství purifikované protilátky bylo stanoveno UV absorbancí a zkouškou ELISA, zatímco čistota byla analyzována pomocí SDS-PAGE a HPLC. Za nedenaturujících podmínek měla úplná protilátka IgG očekávanou molekulovou hmotnost 160 kD. V denaturovaných gelech měly jak těžký, tak lehký řetězec očekávanou molekulovou hmotnost 55 a 28 kD, v uvedeném pořadí.

Fragmentace Yl IgG na Fab a F(ab')2 :

[412.] Molekula IgG je složena ze dvou identických lehkých řetězců a dvou identických těžkých řetězců. Tyto řetězce jsou vzájemně spojeny do záhybů (domén) kombinací nekovalentních interakcí a kovalentních vazeb (disulfidovými můstky). Lehký řetězec sestává z jedná variabilní domény a jedné konstantní domény. Těžký řetězec sestává z variabilní domény (V_H) a tří oddělených konstantních domén (CHl, 2 a 3). Pantová oblast (hinge region) mezi první konstantní doménou těžkého řetězce (CHl) a druhou konstantní doménou těžkého řetězce (CH2) je snadno

143 přístupná pro proteolytický atak enzymů. Rozštěpení v tomto bodě produkuje fragmenty Fab a (Fab')2 a část Fc. Část molekuly označovaná Fc si uchovává schopnost molekuly vázat antigen, avšak má nízké nespecifické vázání. Podíl Fab je nejvhodnější pro situace, kdy je požadována schopnost vázat antigen bez efektorových funkcí.

[413.] Fragmenty Fab a F(ab')₂ jsou in vivo používány jako diagnostická a terapeutická činidla. Pro přípravu chemoterapeutických protirakovinných agens, specifických proti nádoru namísto poškozování všech buněk, může agens být vázáno na protilátky, které se vážou k buněčným povrchovým antigenům nádorů. Použití Fab nebo F(ab')₂ místo intaktniho IgG nabízí řadu výhod:

[414.] (1) Fragmenty mohou snadněji prostupovat kapilárami a difundovat ke tkáňovým povrchům.

[415.] (2) Fragmenty, které nejsou vázány v konjugátu, budou odstraňovány mnohem rychleji, než intaktní nevázaný IgG; z tohoto důvodu větší podíl agens fragmenť terapeutické činidlo dosáhne cílové oblasti.

Podrobný postup přípravy fragmentů Fab:

[416.] 1 mg purifikované protilátky Yl byl nanesen na 2ml sloupec imobilizovaného Ficinu ve štěpícím pufru s koncentrací cysteinu HC1 2 mg/ml (pro přípravu fragmentů F(ab')₂ ) a 20 mg/ml (pro přípravu fragmentů Fab), při 37° C po dobu 5 hodin (pro Fab) a 20 hodin (F(ab')₂. Reakce byla ukončena elucí produktů štěpení se 4 ml pufru „Immunopure Binding buffer. Oddělení fragmentů Fab nebo F(ab')₂ od nerozštěpeného IgG a fragmentů Fc bylo provedeno s použitím sloupce s navázaným Proteinem A a vazebného pufru.

Fragmenty Fab nebo F(ab')₂ byly obsaženy v protékajícím proudu. Na základě odečtu absorbance při 280 nm byly shromažďovány frakce odpovídající pikům a obsahující fragmenty. Fragmenty byly koncentrovány a dialyzovány proti PBS s použitím mikrokoncentrátoru s přerušení při molekulové hmotnosti 10 000 Dalton. Znovuvytváření proteinu, čistota a charakteristika byly stanovovány s použitím absorbance při 280 nm, gelové elektroforézy a HPLC.

Příprava buněčného extraktu (Lyzátu) [417.] 2xl0⁶ buněk bylo sklizeno a centrifugováno v mikrocentrifúze (1300 otáček za minutu, 4° C, 5 minut) .

K promytí byl k peletu přidán 0,5-1 ml PBS+pi a vzorek byl jemně promícháván. Směs byla centrifugována shodně, jako je uvedeno výše. Promytí s 0,5-1 ml PBS+pi bylo opakováno a směs byla centrifugována shodně, jako je uvedeno výše.

Buňky peletu byly resuspendovány v lyžujícím pufru (200 μ1/20χ10⁶ buněk peletu). Použitým lyžujícím pufrem byl 50mM Tris o pH 7,4, 1 mm PMSF 1 % NP-40, a 1 mM EDTA, ačkoliv mohou být použity i jiné vhodné lyžující pufry. Suspenze byly inkubovány po přibližně 60 minut na ledu, poté centrifugovány (3000 otáček za minutu, 4° C, 5 min) . Supernatant byl shromážděn a rozdělen na alikvotní množství.

Příprava surové frakce membrán a extrakce membránových proteinů.

[418.] Dvacet objemů homogenizačního pufru bylo přidáno k jednomu objemu zahuštěných buněk. Použitým

145 ····· · · ·· ····· • · · · · · · • · ·« ··· · · · homogenizačním pufrem byl 2% (w/v) Tween 20, 1 mM MgS0₄, 2 mM CaCl₂ , 150 mM NaCl, a 25 mM Tris-HCl, pH 7,4. Rovněž byly přidány následující proteázové inhibitory:1 mM PMSF, 5 pg/ml leupeptinu a 5 pg/ml aprotoninu. Buňky byly homogenizovány s použitím tří až pěti zásahů v homogenizátoru Plotter-Elvehjem s rotujícím teflonovým pístem (Ultra-Torex). Vzorek byl uchováván během homogenizace v chladu, poté byl po dobu 1 hodiny míchán na ledové lázni. Pak byl vzorek opět podroben několika dodatečným impulsům homogenizátoru, poté byl centrifugován při 3000 g po dobu 30 minut při 4° C. Supernatant byl shromážděn a centrifugován při 45 000 g (19 000 otáček za minutu, rotor ss-34) po dobu 1 hodiny při 4°C. Supernatant z centrifugace při 45 000 g byl odstraněn. Roztok 50 mM Tris, 7,4, lmM EDTA, 1% NP-40 a proteázových inhibitorů byl přidán k peletu a poté byl rozpuštěný pelet uložen na led po dobu jedné hodiny.

Frakcionační purifikace membrán na sloupci HPLC [419.7.] Pro frakcionační purifikaci membrán byl použit sloupec RPC (Pharmacia Typ PLRP-S 300 A). Použitými pufry byly: (A) 20mM Tris ,8,0 a (B) 60% propanol v DDW. Rychlost průtoku byla 1 ml/minuta, s výjimkou promývacího kroku, během kterého rychlost promývání byly 2 ml/min. Celý postup byl prováděn při teplotě prostředí.

[420.] Eluční vzorek po imunoprecipitací (immunoprecipitation, IP) frakcí membrán z buněk Jurkat nebo KG-1, byl přidán k vzorkovému pufru (62 mM Tris, pH 6,8, 10 % glycerolu, 3 % SDS, 720 mM merkaptoethanolu) zředěnému pufrem A v poměru 1:4.

146 [421.] Vzorek byl nanesen na sloupec a byla shromažďována protékající kapalina. Sloupec byl promyt pufrem A, dokud optická hustota protékající kapaliny nepoklesla na nulu.

[422.] Proteiny byly ze sloupce eluovány podle následujícího postupu: 5 minut s 80% A, pak 40 minut gradient 80-0 % pufru A a 20-100 % pufru B. Druhý gradient byl aplikován pro převedení složení promývací kapaliny na 80% A a toto složení bylo použito k promývání sloupce po 5 dalších minut. Eluovaná kapalina byla sbírána ve frakcionačním sběrači do frakcí o velikosti 1 ml.

[423.] Vzorky byly odpařeny na malé objemy v odparce Speed-Vac a poté analyzovány s použitím SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného) a Western blottingu.

Purifikace normální lidské plasmy na sloupcích Q Sepharosy [424.] 5 ml normální lidské čerstvě zmražené plasmy bylo naředěno v poměru 1:10 startovacím pufrem a filtrováno přes filtr (0,45 μπι syringe filter, Sartorius, cat #

16555). Startovací pufrem byl 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 obsahující proteázové inhibitory (5 gg/ml leupeptinu, 5 gg/ml aprotininu a 1 mM PMSF).

[425.] Sloupec 5 ml HiTrap Q Sepharose (Amersham Pharmacia, cat # 17-1154-01) byl napojen na P-l peristaltickou pumpu (Amersham Pharmacia). Sloupec byl podle doporučení výrobce promýván rychlostí průtoku přibližně 4 ml/minuta. Naředěná zfiltrovaná plasma byla nanesena na sloupec a byla odebírána protékající kapalina.

• · · · ·

147

Sloupec byl promyt 20 objemy roztoku 0,3M NaCl ve startovacím pufru. Proteiny byly eluovány při koncentracích NaCl ve startovacím pufru 0,6 M, 0,8 M, a 1,0 M. Eluční objemy byly 50, 20 a 20 ml, v uvedeném pořadí. Celý postup byl prováděn při teplotě 4° C.

[426.] Eluované frakce byly podrobeny analýze SDS-PAGE v duplicitních gelech s následnou analýzou Western blotting, ve které byly použity biotinylovaná protilátka Yl a protilátka 181 jako negativní kontrola. Fibrinogen γ' byl nalezen v eluční frakci obsahující 0,6 M NaCl. Eluční frakce l,0M NaCl obsahovala komplementovou sloučeninu 4 (CC4), lumican, protrombin, a inter-alfa inhibitor.

Purifikace normální lidské plasmy na sloupci HPLC [427.] Normální lidská plasma purifikovaná na Q-Sepharose byly smíchána s močovinou (na konečnou koncentraci alespoň 8 M), DTT (na konečnou koncentraci 30 mM) a TFA (na konečnou koncentraci 0,1 %).

[428 ] Roztok purifikované plasmy byl nanesen na 3ml sloupec RPC (Amersham Pharmacia) a byla odebírána protékající kapalina. Sloupec byl promýván pufrem A, dokud optická hustota proudu nepoklesla na nulu. Proteiny byly ze sloupce eluovány podle následujícího postupu: 5 minut s 90% pufrem A, poté 40 minut gradientem 90 až 0% pufr A a 10 až 100% pufr B. Druhý gradient byl pak použit pro přenesení protékající kompozice do 90% pufru A a tato kompozice byla použita k pokračujícímu promývání sloupce po dalších 5 minut. Použitými pufry byly (A) 0,1 % TFA v DDW a (B) 80% CAN a 0,1 % TFA v DDW. Rychlost průtoku byla 1 ml/minuta, • · · · · • · · « ·

148 ··* ** ........

s výjimkou promývacího stupně, během kterého byla rychlost průtoku 2 ml/minuta.

[429.] Eluovaná kapalina byla shromažďována ve sběrači frakcí do frakcí o velikosti 1 ml. Celý postup byl prováděna při teplotě prostředí.

[430.] Vzorky byly odpařeny na malé objemy v odparce Speed-Vac a poté byly analyzovány s použitím SDS-PAGE a Western blottingu.

Western blotting analýza sestřihu receptoru Yl na filtru po blotování [431.] Nitrocelulózová membrána byla blokována s použitím 5% odstředěného mléka po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Pak byla membrána 3krát promývána po dobu 5 minut pokaždé s 0,05% Tweenem 20 v PBS při teplotě místnosti. Membrána byla inkubována s 5 μρ/πιΐ Yl-biotin (nebo 181-biotin) ve 2% odstředěném mléce v PBS po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak byla membrána promývána 3krát po dobu 5 minut, pokaždé s chladným 0,05% Tweenem 20 v PBS v chladné místnosti (o teplotě přibližně 4 až přibližně 10° C) . Pak byla membrána inkubována v chladné místnosti se SAV-HRP (streptavidin-HRP) ve 2% odstředěném mléce, naředěným v poměru 1:1000 0,05% Tweenem (na konečnou koncentraci 1 g/ml). Ředění bylo prováděno při teplotě místnosti (přibližně při 25° C), poté byl naředěný SAV-HRP před použitím ochlazován na ledu po dobu 10-15 minut. Inkubace byla prováděna po dobu 1 hodiny za jemného promíchávání. Po inkubaci se SAV-HRP byla membrána promyta tak, jak je uvedeno výše. Pak byla membrána inkubována se „Super Signa! mixture (Pierce) po dobu 5 minut podle

149 doporučení výrobce a poté byl nadbytečný roztok vysušen. Membrána byla použita pro expozici na X-ray film (Fuji) a film byl vyvolán.

Příklad 7: Prokaryontní exprese rekombinantního glycocalicinu (GC) [432.] Fragment DNA kódující glycocalicin (GC, aminokyselina 1 až aminokyselina 493 z GPIba) byl klonován do prokaryontní vektorové kazety, indukovatelné IPTG. Buňky E. coli (BL21 DE3) nesoucí nově zkonstruovaný plasmid byly pěstovány při 37°C na optickou hustotu O.D. 0,7-0,8, poté byly kultivovány při 37° C po dobu 3 hodin v přítomnosti IPTG pro indukci.

[433.] Byl analyzován SDS-polyakrylamidový gel s naneseným buďto částečně purifikovaným glycocalicinem, získaným z lidských destiček (GC) nebo s nanesenými buněčnými lyzáty E. coli (total), získanými z indukovaných a neindukovaných buněk. Byla prováděna analýza Western blotting s biotinylovaným Yl-scFv, s polyklonální králičí protilátkou anti-human glycocalicin, s komerčně dostupnou myší monoklonální protilátkou anti-human CD42 (SZ2 Immunotech, PM640 Serotec, HIP1 Pharmigen, AN51 DAKO) a s polyklonální protilátkou proti N-konci GPIba (Sc-7071, Santa Cruz).

[434.] Polyklonální protilátky rozpoznávaly jak rekombinantní glycocalicin získaný z bakterií, tak přirozený glycocalicin získaný z lidských destiček. Yl-scFv a komerčně dostupné protilátky rozpoznávaly přirozený glycocalicin získaný z lidských destiček, avšak

150 « ·· ·· 4 ·

nerozpoznávaly bakteriemi produkovaný rekombinantni glycocalicin získaný z destiček. Obr. 45.

[435.] Prokaryontní systém (například E. coli) postrádá mechanismy posttranslačních modifikací, jako jsou mechanismy glykosylace a sulfatace. Z tohoto důvodu skutečnost, že ΥΙ-scFv nerozpoznává bakteriemi produkovaný rekombinantni glycocalicin získaný z destiček, podporuje závěr, že posttranslační modifikace, jako je glykosylace a sulfatace, je pro vazbu ΥΙ-scFv ke glycocalicinu nezbytná.

Protokol FACS pro vzorky krev/kostnx dřeň [436.] Vzorky poskytly nemocnice. Vzorky pacientů o velikosti 30 μΐ/zkumavka. Přidá se 5 μΐ/zkumavka CD33-APC (pro AML), nebo CD19-APC (pro B-CLL), nebo CD38-APC (pro mnohočetný myelom). Přidá se 5 μΐ/zkumavka CD45-PerCp a 5 μΐ scFv-ΥΙ, nebo kontrolního scFv-N31, nebo CD162-PE (KPL1). Zkumavky se inkubují po dobu 30 minut při teplotě 4° C za pomalého míchání. Promývá se přidáním 2 ml PBS a odstřeďuje se po dobu 5 minut při 1200 otáčkách za minutu. Odstraní se supernatant.

[437.] Pro jednostupňovou zkoušku se pokračuje krokem lyže:

[438.] Přidá se 500 μΐ roztoku BD Lysin naředěného v poměru 1:10 ddH₂O (300 μΐ na vzorek pacienta). Vortexuje se při vysoké rychlosti a inkubuje se po dobu 12 minut při 4°C. Promyje se tak, jak je uvedeno výše. Odstraní se supernatant. Dále se přidá 500 μΐ PBS. Vzorky jsou odečítány FACS s použitím získaného nastavení pro krevní vzorky podle mezinárodních standardů.

• ·

151

[439.] Pro dvě nebo více zkoušek je pracovním pufrem PBS + 1% BSA + 0,05% azid sodný. Inkubace a promytí tak, jak je uvedeno výše.

[440.] Lyže buněk červených krvinek je konečným krokem zkoušky, následovaná resuspendováním s 500 μΐ PBS.

Příklad 8: Konstrukce triabodies [441. ] Vektor pHEN-Yl, kódující původní Yl, byl amplifikován s použitím PCR jednotlivě jak pro oblasti V_L, tak pro oblasti V_H Pro PCR reakci amplifikující V_L.byly použity sense oligonukleotid 5'AACTCGAGTGAGCTGACACAGGACCCT a anti-sense oligonukleotid 5'TTTGTCGACTCATTTCTTTTTTGCGGCCGCACC Produkt cDNA o očekávané velikosti ~350 bp byl purifikován, sekvenován a štěpen restrikčními enzymy Xhol a Notl.

[442.] Stejný postup byl použit pro amplifikaci oblasti V_H (s použitím sense oligonukleotidu 5'ATGAAATACCTATTGCCTACGG a anti-sense oligonukleotidu 5'AACTCGAGACGGTGACCAGGGTACC). Produkt PCR pro V_H byl štěpen s restrikčními enzymy Ncol a Xhol. Byla provedena trojnásobná ligace do vektoru pHEN, předem rozštěpeného Ncol-Notl. Konečný vektor byl označen jako pTria-Yl.

[443.] Po transformaci E. coli byla odebrána řada klonů pro další analýzu, která zahrnovala sekvenování DNA, expresi proteinu a extrakci z periplasmatického prostoru bakterií. Pro potvrzení velikosti triabodies Yl byly provedeny SDS-PAGE za redukčních podmínek a analýza Western blotting.

152

Příklad 9: Konstrukce diabodies [444.] Výše uvedený vektor pTria-Yl byl linearizován restrikčním enzymem Xhol a syntetické komplementární dvouřetězcové oligonukleotidy (5'-TCGAGAGGTGGAGGCGGT a 5'TCGAACCGCCTCCACCTC) byly předem anelovány a ligovány do místa Xhol, mezi Yl-těžké a Yl-lehké řetězce. Tento nový vektor byl označen jako pDia-Yl. Tak, jak bylo popsáno pro triabodies, byly provedeny stanovení sekvence DNA a exprese proteinu.

Příklad 10: Exprese a purifikace diabodies a triabodies.

[445.] Exprese v E. coli byla v podstatě taková, jako je popsána pro scFv-ΥΙ. Nicméně purifikace diabodies a triabodies protilátky Yl z periplasmy transformovaných buněk E. coli byla odlišná. Monomerní forma scFv Yl může být purifikována na afinitním sloupci Sepharosy s navázaným Proteinem A. Avšak multimerní formy Yl jsou tímto postupem purifikovány neúčinně. Z tohoto důvodu byly periplasmatické proteiny extrahované z bakterií precipitovány přes noc se 60% síranem amonným, resuspendovány v H₂0 a naneseny na sloupec gelové chromatografie (size exclusion) Sephacryl200 (Pharmacia), předem ekvilibrovaný s 0,lxPBS. Frakce byly shromážděny a analyzovány pomocí HPLC a jednotlivé frakce obsahující buďto dimerní nebo trimerní formy byly soustředěny pro značení FITC a analýzu FACS.

Příklad 11: Vazba Yl diabodies a triabodies k buňkám [446.] Byla provedena analýza FACS na buňkách Jurkat s použitím troj stupňového barvícího postupu („three step • ·

153 ........

staining proceduře). Nejprve jsou barveny surové extrakty nebo purifikované neznačené scFv, pak myší anti-myc protilátky a nakonec FITC- nebo PE- konjugované anti-myší protilátky. FACS analýza vyžaduje 5-8xl0⁵ buněk, resuspendovaných v PBS+1%BSA. Vázání bylo prováděno po dobu 1 hodiny při 4 °C. Po každém kroku byly buňky promyty a resuspendovány v PBS+1%BSA. Po konečném barvícím stupni byly buňky fixovány pomocí resuspendování v PBS, 1% BSA, 2% formaldehydu a poté odečteny pomocí FACS (BectonDickinson).

[447.] Vazba Yl-scFv byla porovnána s vazbou diabodies a triabodies. V této analýze byl vazebný profil všech tří forem velmi podobný, což naznačuje, že výše uvedené modifikace v molekule nepozměňují, nezakrývají nebo neruší zřejmou vazebnou afinitu Yl ke svému ligandu.

Příklad 12: Studium afinity S-S Yl-dimeru ve srovnání s CONYl a Yl-IgG s použitím radioreceptorové vazebné zkoušky (Radioreceptor Binding Assay, RRA) na buňkách KG-1.

[448.] Systém zkoušky zahrnoval použití radioaktivních ligandů, které byly připraveny jodizací s ¹²⁵I s použitím chloraminu T na konstrukt Yl-IgG nebo Bolton-Hunter (CONYl) reagens. Testovací zkumavky obsahovaly 5xl0⁶ buněk KG-1 na 0,2 ml a značený izotopový indikátor s různým množstvím neznačeného kompetitoru v PBS + 0,1 % BSA, pH 7,4. Po jedné hodině inkubace za třepání při 4° C byly buňky důkladně promyty ledovým pufrem a použity pro vyhodnocení radioaktivity.

[449.] V radioreceptorové vazebné zkoušce RRA, byly použity 2 ng/zkumavka ¹²⁵I-Yl-IgG a kompetice byla prováděna • 9 • ·

154 ..........

s každou ze tří molekul. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 46. Výsledky zobrazené na tomto obrázku ukazují, že afinita S-S dimeru Yl byla dvakrát nižší, než afinita úplné protilátky Yl a 30krát vyšší, než afinita CONYl. Přibližný odhad afinity Y—IgG v tomto pokuse je 2xl0^-8 M.

Odpovídající afinita dimeru je proto 4xl0’⁸ M.

[450.] Ve druhé zkoušce RRA, používající značený CONYl, bylo použito 100 ng/zkumavka ¹²⁵I-Yl-IgG a kompetice byla prováděna s každou ze tří molekul. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 47. Výsledky zobrazené na tomto obrázku ukazují, že afinita S-S dimeru Yl byla 20krát vyšší, než afinita CONYl. Přibližný odhad afinity CONYl v tomto pokuse je 10⁶ M. Odpovídající afinita dimeru je proto 5xl0^-8 M.

Příklad 13: Produkce Yl-cys-KAK (cysteinového dimeru) [451.] Jeden litr bakteriální kultury λρΙι-yl-cys-KAK byl indukován při 42° C po 2-3 hodiny. Kultura byla centrifugována při 5000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Pelet byl resuspendován ve 180 ml TE (50mM Tris-HCl pH 7,4, 20mM EDTA). Bylo přidáno 8 ml lysozymu (ze zásobního roztoku 5 mg/ml) a inkubováno 1 hodinu. Dále bylo přidáno 20 ml 5M NaCl a 25 ml 25% Tritonu a inkubováno po další hodinu. Směs byla centrifugována při 13 000 otáčkách za minutu po 60 minut při 4° C. Supernatant byl odstraněn. Pelet byl resuspendován v TE pomocí tkáňového homogenizátoru. Tento postup byl opakován 3-4krát až do světle šedého zabarvení inkluzních tělísek (peletu). Inkluzní tělíska byla solubilizována v 6M guanidin-HCl,

0,1M Tris, pH 7,4, 2mM EDTA (1,5 gramů inkluzních tělísek v 10 ml solubilizačního pufru poskytlo ~ 10 mg/ml • ·

rozpustného proteinu). Takový vzorek byl nejprve inkubován po alespoň 4 hodiny. Koncentrace proteinu byla změřena a upravena na koncentraci 10 mg/ml. Byl přidán DTT na konečnou koncentraci 65 mM a při teplotě místnosti probíhala inkubace přes noc. Opětovné svinutí (refolding) bylo iniciován zředěním (kapku po kapce) 10 ml proteinu na roztok obsahující 0,5 M argininu, 0,1 M Tris, pH 8, 2 mM EDTA, 0,9 mM GSSG. Roztok pro refolding byl inkubován při ~ 10° C po 48 hodin. Roztok pro refolding s obsahem proteinu byl dialyzován proti pufru obsahujícím 25mM fosfátový pufr, pH 6, 100 mM močoviny a zakoncentrován na 500 ml. Koncentrovaný/dialyzovaný roztok byl navázán na sloupec SP-Sepharose a protein byl eluován gradientem NaCl (až k 1M).

Příklad 14: ELISA ke GC (glycocalicinu) [452.] 100 μΐ purifikovaného glycocalicinu bylo inkubováno přes noc při 4° C v plochých plotnách Maxisorp o 96 jamkách. Plotna byla promyta PBTS (PBS + 0,05% Tween) 3krát, pak 200 ml PBTS-milk (PBTS + 2% odtučněné mléko) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Plotna byla promyta PBTS a byl přidán monomer nebo dimer (100 ml) v PBTS-milk v různých koncentracích po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak byla plotna promyta a byla přidána anti-V_L polyklonální protilátka (získaná z králíků imunizovaných V_L odvozeným z Yl) (ředěno 1:100 v PBTS-milk) po dobu jedné hodiny. Plotna byla promyta a anti-králičí HPR byla přidána po další jednu hodinu. Plotna byla promyta 5krát a 100 μΐ substrátu TMB bylo přidáno přibližně na dobu 15 minut, pak bylo přidáno 100 μΐ 0,5 H2SO4 pro zastavení reakce. Optická hustota byla měřena při 450 nm na ELISA readeru.

« · [453.] Posttranslační modifikace, jako je glykosylace a sulfatace, je nezbytná pro vazbu scFv a komerčně dostupných protilátek ke GC. Prokaryontní (£. coli) systém postrádá mechanismy posttranslačních modifikací, jako je glykosylace a sulfatace.

Příklad 15: Příprava tetramerů z Yl [454.] Byl navržen konstrukt, ve kterém následující sekvence LNDIFEAQKIEWHE byla přidána k C-konci Yl pomocí PCR a klonování do expresní kazety, indukovatelné IPTG.

Klon byl pojmenován Yl-biotag. Tato sekvence je substrátem pro enzym BirA, enzym, který v přítomnosti volného biotinu je schopen kovalentně připojit biotin ke zbytku lysinu (K) (Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 1996 Oct 4; 274 (5284):94-6, Altman JD et al). Konstrukt byl produkován jako inkluzní tělíska v bakteriálních buňkách BL21. Refolding byl proveden tak, jak bylo popsáno výše. Inkluzní tělíska byla solubilizována guanidin-DTT. Refolding byl proveden ředěním v pufru obsahujícím arginin-Tris-EDTA. Byla provedena dialýza a zakoncentrování s následnou HiTrapQ iontovýměnnou purifikací.

[455.] Purifikovaný Yl-biotag scFv byl inkubován s enzymem BirA (poskytnutým Avidity) a biotinem podle doporučení výrobce. Biotinylovaný Yl-biotag byl analyzován testem HABA (který stanovuje množství biotinu na molekulu) a bylo prokázáno, že obsahoval přibližně >0,8 zbytků biotinu/molekula.

[456.] Biotinylovaný Yl-biotag byl inkubován se Streptavidin-PE (Phycoerytrin) za vzniku komplexů a byl • · · · ·

157 použit v FACS pokusech s použitím buněk KG-1 (pozitivních pro Yl). Citlivost vazby byla zvýšena alespoň lOOkrát díky zvýšení avidity. Streptavidin může vázat až 4 biotinylované Yl-biotag molekuly.

[457.] Sekvence Yl-biotag je následující a je SEQ ID NO: 211:

MEVQLVESGGGWRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ

APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL

YLQMNSLRAE DTAVYYCARMRAPVIWGQGT LVTVSRGGGG

121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY

161 YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA

201 SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNWFG GGTKLTVLGG

241 GGLNDIFEAQ KIEWHE

Příklad 16: Charakteristika aktivity Y17 [458.] Enzym O-sialoglykoprotein endoproteáza z Pastora! haemolytica, který selektivně štěpí GPIb z lidských destiček, byl použit ke stanovení specifičnosti vazby Y17 ke GPIba. O-sialoglykoprotein endoproteáza specificky štěpila pouze proteiny obsahující sialylované, O-vázané glykany, a neštěpila N-vázané glykoproteiny a neglykosylované proteiny. O tomto enzymu je známo, že štěpí GPIb, který je silně O-glykosylován, avšak neštěpí GPIIbIlla nebo jiné receptory na destičkách. Inkubace promytých destiček s O-sialoglykoprotein endoproteázou, která štěpí GPIb, ruší vazbu ke GPIb u Y17, stejně jako tuto vazbu u monoklonální protilátky (MCA466S-serotec) namířené proti GPIba, jak bylo prokázáno imunobloty a analýzou FACS. Endoproteáza nepozměňovala vazbu monoklonální protilátky (anti CD61), namířené proti GPIIb/IIIa (Obr. 4).

Příklad 17: Identifikace epitopů pro Y17 na destičkovém

GPIb [459.] Zajímavým přístupem identifikace epitopů pro Yl na destičkovém GPIb, je použití enzymu endoproteázy, jejíž štěpící místa na destičkovém GPTb jsou plně charakterizovány.

17.1: Účinek mocarhaginu na mapování epitopů pro Yl [460.] Mocarhagin, metaloproteináza z hadího jedu kobry, štěpí destičkový GPIba specificky v jednom místě mezi zbytky Glu-282 a Asp-283, vytváří dva stabilní produkty, 45kDa N-koncový fragment (His-1 až Glu-282), který je nalézán v supernatantu, a na membránu vázaný lOOkDa C-koncový fragment.

[461.] Na promyté destičky bylo působeno mocarhaginem a destičkový lyzát byl oddělen na SDS-polyakrylamidových gelech a přenesen na nitrocelulózu. Analýza promytých, mocarhaginem opracovaných destiček ve zkoušce Western blotting s Yl vede ke ztrátě pruhu odpovídajícímu GPIb (135 kDa) a vazby Y17 k N-koncovému 45kDa produktu štěpení. Monoklonální protilátka MCA466S, namířená proti C-koncovému fragmentu GPIba, reagovala se lOOkDa C-koncovým fragmentem, zatímco monoklonální protilátka S.C.7071, která rozpoznává N-konec GPIba, reagovala se stejným 45kDa Nkoncovým fragmentem, který byl rozpoznáván Y17 (FIG. 14).

[462.] Působení mocarhaginu na glycocalicin poskytlo výsledky podobné těm, které byly zjištěny u promytých destiček, a prokazovaly vazbu Yl a monoklonální protilátky S.C.7071 ke 45kDa N-koncovému produktu štěpení GPIba, • «

159 ..........

(Obr. 8). Na základě těchto výsledků lze usuzovat, že epitop pro Yl je obsažen uvnitř sekvence His-1 až Glu-282.

17.2: Účinek cathepsinu G na mapování epitopu pro Y17 .

[463.] Cathepsin G, serinová proteáza z neutrofilů, štěpil glycocalicin mezi zbytky Leu-275 a Tyr-276 a ve druhém místě štěpení mezi zbytky Val-296 a Lys-297. Glycocalicinu, na který bylo působeno cathepsinem G, poskytuje dva N-koncové fragmenty, malý 42kDa fragment (His-1 až Leu-275) a velký 45kDa N-koncový fragment(His-1 až Val-296), kromě ~95kDa C-koncového fragmentu. Glycocalicin a fragmenty glycocalicinu, generované jeho štěpením cathepsinem G, byly odděleny na SDSpolyakrylamidových gelech a byly přeneseny na nitrocelulózu. Y17 se vázal na větší fragment (His-1 až Val-296), avšak nikoliv k menšímu fragmentu(His-1 až Leu-275). Kromě toho monoklonální protilátka S.C.7071, která rozpoznává epitop uvnitř His-1 až Leu-275, blotovala oba fragmenty (Obr. 12). Analýza N-koncových peptidových fragmentů z proteolýzy mocarhaginem a cathepsinem G potvrdila, že aminokyselinová sekvence GBPIba Tyr-276 až Glu-282 je významným rozpoznávacím motivem pro vazbu Y17.

Příklad 18: Účinek Y17-scFv na vWF-dependentní aglutinaci [464.] Účinek Y17-scFv na vWF-dependentní aglutinaci destiček byl testován při různých koncentracích Y17. Na rozdíl od Yl, Y17 v konečné koncentraci 10, 25 nebo 50 μg/ml nevykazoval vWF-dependentní aglutinaci promytých destiček, indukovanou ristocetinem. Analýza N-koncových peptidových fragmentů z proteolýzy mocarhaginem a cathepsinem G potvrdila, že aminokyselinová sekvence • · • · · • · · · «

160 • ·

• · · • · · · ♦ · ·

GBPIba Tyr-276 až Glu-282 je významným rozpoznávacím motivem pro vazbu Y17 a Yl. Protože Y17 neinhibuje agregaci destiček, zdá se, že Yl a Y17 se nevážou ke stejným sekvencím, ale k přesahujícím sekvencím.

Claims (322)

1. Izolovaný epitop podle vzorce I (S)_r

I [fWX-P-CY)_t-P]_q ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována je (A)_m(A)_n(X)u, nebo (X) _u (A) _n (A) _m, nebo (A) _n (X) _u (A) _m, nebo (A) _n (A) _m(X)_u, nebo (X) _u (A) _m (A) _n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinů

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin q je 1 až 6 z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 • *

162

t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3, kde, jestliže n = 0, > 0; kde, jestliže q alespoň jeden z Y je pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n je 1, r je 1 a jestliže q je > 1, sulfatován; a dále, kde izolovaný

epitop je schopen být vázán s protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejím komplexem, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

2. Izolovaný epitop podle nároku 1, ve kterém sulfatovanou sloučeninou je peptido-, glyko- nebo lipokonjugát .

3. Izolovaný epitop vzorce I, ve kterém

W je glycin,

Y je peptido-konjugát tyrosinu nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu;

A je glutamát, γ karboxy glutamát nebo aspartát;

a q je 1, 2 nebo 3.

4. Izolovaný epitop podle nároku 3, ve kterém • *

Y je peptido-konjugát tyrosinu;

q je 3;

a r je 1.

5. Izolovaný epitop podle vzorce II (^S)r (S)_r (S)_r I I I (ww-íYVP-cn-p-cYw ,_TT.

ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A)_m(A)_n(X)_u, nebo (X) _u(A) _n(A)_m, nebo (A) _n(X)_u(A)_m, nebo (A) _n(A)_m(X)_u, nebo (X)_u(A)_m(A)_n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinu

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin., isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin z je 0, 1 nebo 2

164 • ♦ · · « · ’ ····» ·· ··♦ ·· r je O nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, alespoň jeden z Y je sulfatován; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejich komplexy, které obsahují protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

6. Izolovaný epitop podle nároku 5, ve kterém sulfatovanou sloučeninou je peptido-, glyko- nebo lipokonj ugát.

7. Izolovaný epitop podle nároku 5, ve kterém

W je glycin

Y je peptido-konjugát tyrosinu nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu

A je glutamát, γ karboxy glutamát nebo aspartát, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin nebo glycin.

165 ··· ·· · · · · · • · · · · « » · ·· ···· • ···· ··· ····· ·· ··· ·· ·

8. Izolovaný epitop podle nároku 7, ve kterém

Y je peptido-konjugát tyrosinu;

q je 3;

a r j e 1.

9. Izolovaný epitop podle vzorce III (S)r (S)r (S)_r (G)_z(X)_u(E)_n(D)_m(Y)_t (X)u(E)n(D)_mCY)t(X)_u(E)_n(D)_mCY)_t(D)_n,(E)_n(X)_u (¹11) v ve kterém:

G je glycin

E je glutamát

D je aspartát

Y je tyrosin

S je sulfát nebo sulfatovaná sloučenina

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou výše uvedených z je 0, 1 nebo 2 t je 1, 2 nebo 3 r je 0 nebo 1 u je 0 až 2

166 n je Ο až 3 m je O až 3 kde, alespoň jeden z Y je sulfatován; kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; a dále, kde izolovaný epitop je schopen být vázán protilátkou, jejím fragmentem vázajícím antigen, nebo jejich komplexy, které obsahují protilátku nebo její vazebný fragment, obsahující první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

10. Izolovaný epitop podle nároku 9, ve kterém r je 1.

11. Izolovaný epitop podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, ve kterém přirozeně se vyskytující sloučenina Y, která je schopna být sulfatována, zahrnuje lipidovou, karbohydrátovou, peptidovou, glykolipidovou, glykoproteinovou, lipoproteinovou a/nebo lipopolysacharidovou molekulu.

12. Homolog nebo mimetikum izolovaného epitopu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

13. Izolovaný epitop podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde izolovaný epitop obsahuje kromě sulfatace alespoň jednu posttranslační modifikaci.

14. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný epitop podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

• · ·· · ·· ·

167 ·· ·· · ·«·· ····· · · · · ···· ··· · · «· ··· ··

15. Kompozice podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje po směru nebo proti směru oblast schopnou zvyšovat vazebnou kapacitu epitopů.

16. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že oblast po směru nebo proti směru je poblíž epitopů.

17. Izolovaný polynukleotid kódující alespoň část izolovaného epitopů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

18. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopné vazby nebo křížové reakce s izolovaným epitopem podle nároku 1.

19. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopné vazby nebo křížové reakce s izolovaným epitopem podle nároku 5.

20. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopné vazby nebo křížové reakce s izolovaným epitopem podle nároku 9.

21. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopné vazby nebo křížové reakce s izolovaným epitopem podle nároku kteréhokoliv z nároků 2 až 4, 6 až 8, nebo 10 až 13.

22. Způsob přípravy protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje

168 alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, schopných vazby nebo křížové reakce s izolovaným epitopem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:

(a) poskytnutí fágové expresní knihovny;

(b) poskytnutí izolovaného epitopu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13;

(c) panning fágové expresní knihovny pro získání fágových partikulí exprimujících oligopeptid nebo polypeptid schopný vazby k izolovanému epitopu;

(d) produkci protilátky, jejího vazebného fragmentu, nebo jejího komplexu, který obsahuje protilátku nebo její vazebný fragment, obsahujících peptid nebo polypeptid schopný vazby k izolovanému epitopu.

23. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment mající vazebné schopnosti fragmentu protilátky scFv o SEQ ID NO: 25 nebo SEQ ID NO: 203.

24. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment mající vazebné peptidu nebo polypeptidu, kde peptid nebo polypeptid obsahuje první hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 20.

25. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment podle některého z nároků 23 až 24, kde peptid nebo polypeptid má dále druhou hypervariabilní • · · · · ·

169 • · « ·· · ·«·« • ·«··· · · ·· ····· ····· ·· · · · · · · oblast obsahující SEQ ID NO: 115 a/nebo třetí hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 114.

26. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vazby k peptidovému nebo polypeptidovému epitopu, který má délku přibližně 3 až 126 aminokyselinových zbytků a obsahuje alespoň dvě kyselé aminokyseliny a alespoň jeden sulfatovaný zbytek tyrosinu.

27. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 26, kde epitop dále obsahuje prolinový, leucinový, isoleucinový, serinový, glycinový, nebo fenylalaninový zbytek.

28. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, kde protilátka nebo její fragment vázající antigen je dále schopna vazby s epitopem na molekule lipidu, karbohydrátu, peptidů, glykolipidu, glykoproteinu, lipoproteinu a/nebo lipopolysacharidu.

29. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 28, kde epitop na molekule lipidu, karbohydrátu, peptidů, glykolipidu, glykoproteinu, lipoproteinu a/nebo lipopolysacharidu obsahuje alespoň jednu sulfatovanou sloučeninu.

• · ·

30. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vazby k alespoň dvěma odlišným molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu.

31. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vazby k alespoň dvěma odlišným molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu, a jsou schopny vazby s alespoň jedním typem buněk vybraným ze skupiny sestávající z buněk

B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

32. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 31, které jsou schopny vazby ke každé molekule vybrané z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba a heparinu.

33. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 32, schopné vazby ke každé molekule vybrané z PSGL-1, fibrinogenu y', GPIba a heparinu, a schopné vazby s alespoň jedním typem buněk vybraným ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

• · · · · ·

171

34. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vazby k alespoň dvěma odlišným molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu, a dále jsou schopny vazby k molekule lipidu, karbohydrátu, peptidu, glykolipidu, glykoproteinu, lipoproteinu a/nebo lipopolysacharidu.

35. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 34, kde epitop na molekule lipidu, karbohydrátu, peptidu, glykolipidu, glykoproteinu, lipoproteinu a/nebo lipopolysacharidu obsahuje alespoň jednu sulfatovanou sloučeninu.

36. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny křížové reakce s jedním nebo více epitopy, přičemž každý epitop obsahuje jeden nebo více zbytků sulfatovaného tyrosinu a alespoň jeden shluk dvou nebo více kyselých aminokyselin.

37. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36 , které jsou schopny křížové reakce s PSGL-1.

38. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 37, které se vážou c · «

172 k QATEYEYLDYDFLPETE, kde alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

39. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36 , které jsou schopny křížové reakce s GPIba.

40. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36, které se vážou k DEGDTDLYDYYPEEDTEGD, kde alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

41. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 39, které se vážou TDLYDYYPEEDTE, kde alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

42. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 39, které se vážou k DEGDTDLYDYYP, kde alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

43. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 39, které se vážou k YDYYPEE, kde alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

44. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo • ·

173 její vazebný fragment, podle nároku 39, které se vážou k TDLYDYYP, kde alespoň jeden zbytek tyrosinu je sulfatován.

45. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36, které jsou schopny křížové reakce s fibrinogenem γ' .

46. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 45, které se vážou k EPHAETEYDSLYPED, kde alespoň jeden zbytek tyrosinu je sulfatován.

47. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36, které jsou schopny křížové reakce s heparinem.

48. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36, které jsou schopny křížové reakce s komplementovou sloučeninou 4 (CC4).

49. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 48, které se vážou k MEANEDYEDYEYDELPAK, kde alespoň jeden zbytek tyrosinu je sulfatován.

50. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 36, které jsou schopny

174 křížové reakce s alespoň jedním typem buněk vybraným ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

51. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat buněčné rolování.

52. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat zánět.

53. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat autoimunitní onemocnění.

54. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat trombózu.

55. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat restenózu.

56. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo

175 • · · ·· · · · • · · · · · · její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat metastázu.

57. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat růst a/nebo replikaci nádorových buněk.

58. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny zvyšovat mortalitu nádorových buněk.

59. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat růst a/nebo replikaci leukemických buněk.

60. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny zvyšovat rychlost mortality leukemických buněk.

61. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny zvyšovat citlivost nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

176 • ·

62. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny zvyšovat citlivost nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami

63. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny zvyšovat citlivost leukemických buněk k poškození látkami proti leukémii.

6.4. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat zvýšení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

65. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny snižovat počet nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

66. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat zvýšení počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

67. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až

177

20, 23 až 25, které jsou schopny snižovat počet leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

68. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její buňka-buňka vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat tvorbu komplexu buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

69. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat adhezi buňkabuňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

70. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, které jsou schopny inhibovat agregaci buňkabuňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

71. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, vázané nebo komplexované s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických,

178 antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

72. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je antivirální agens vybrané ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

73. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je antitrombotické/antirestenotické agens vybrané ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

74. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je protizánětlivá látka, vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

75. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je antiautoimunitni látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

• ·

179 • · ·· · · · · ’ ····· · · ·· ····· • · · · · · · • · · · · · · · · ·

76. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

77. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 71, kde agens je látka vybraná ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

78. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 77, kde toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, diftérického toxinu, ricinu a jejich modifikací a derivátů.

79. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 77, kde radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positronzářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfazářičů.

80. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 77, kde radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ⁿⁱindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechnecium, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium,

180 ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

81. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 78, kde farmaceutická látka je vybrána ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

82. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

83. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, kde vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

181 » ·« · · · »* · ·· · · · 9 ·· «·· • « · · · 9 · · » · • ····· 9 · · * ···· »···· í* · «·» · 9 ·

84. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, vázané nebo komplexované s radioaktivním izotopem nebo jiným zobrazovacím agens.

85. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 84.

86. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství'účinném pro inhibici buněčného rolování.

87. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici zánětu.

88. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici autoimunitních onemocnění.

89. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo

182 její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici trombózy.

90. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici restenózy.

91. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici metastázy.

92. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici růstu a/nebo replikace nádorových buněk.

93. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro zvýšení mortality nádorových buněk.

94. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo

183 • ·· »· · ··· ··· · · · ·· · ·· ··· · · · · · * · • ····· · · · · ····· • · · · · · · · ····· ·· ··· · · · její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném pro inhibici růstu a/nebo replikace leukemických buněk.

95. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke zvýšení rychlosti mortality leukemických buněk.

96. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke zvýšení citlivosti nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

97. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke zvýšení citlivostí nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami.

98. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke zvýšení citlivosti leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami

184

99. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném k inhibici zvýšení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

100. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke snížení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

101. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném k inhibici zvýšení počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

102. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném ke snížení počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

103. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném k inhibici agregace buňka185 ··· ·· ·· ··· buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

104. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném k inhibici tvorby komplexu buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destičkadestička a/nebo buňka-destička.

105. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, v množství účinném k inhibici adheze buňkabuňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

106. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, vázané nebo komplexované s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

107. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo

186 její vazebný fragment, podle nároku 106, kde agens je antivirální látka vybraná ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

108. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 106, kde agens je antitrombotická/antirestenotická látka vybraná ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

109. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 106, kde agens je protizánětlivá látka vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

110. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 106, kde agens je antiimunitní látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho, SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

111. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo

187 její vazebný fragment, podle nároku 106, kde agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

112. Farmaceutická kompozice podle nároku 106, vyznačující se tím, že agens je vybráno ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

113. Farmaceutická kompozice podle nároku 106, vyznačující se tím, že toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, ricinu a jejich modifikací a derivátů.

114. Farmaceutická kompozice podle nároku 106, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positron-zářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfa-zářičů.

115. Farmaceutická kompozice podle nároku 106, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ¹¹¹indium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, “technecium, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125ratellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ⁸¹ⁱⁿkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

116. Farmaceutická kompozice podle nároku 106, vyznačující se tím, že farmaceutická látka je vybrána ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cisplatiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabínu

188 (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

117. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

118. Farmaceutická kompozice podle nároku 117, kde vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

119. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat buněčné rolování.

120. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat zánět.

189

121. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat autoimunitní onemocnění.

122. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat restenózu.

123. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat trombózu.

124. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat metastázu.

125. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat růst a/nebo replikaci nádorových buněk.

126. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z • Μ

190 nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno zvyšovat rychlost mortality nádorových buněk.

127. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat růst a/nebo replikaci leukemických buněk.

128. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno zvyšovat rychlost mortality leukemických buněk.

129. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno zvyšovat citlivost nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

130. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno zvyšovat citlivost nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami.

131. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je

191 schopno zvyšovat citlivost leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami.

132. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat zvyšování počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

133. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno snižovat počet nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

134. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat zvyšování počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

135. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno snižovat počet leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

136. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu

192 protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat tvorbu komplexu buňka-buňka, buňkamatrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňkadestíčka.

137. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat agregaci buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

138. Použití protilátky, jejího fragmentu vázajícího antigen, nebo jejího komplexu, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro přípravu léčiva, které je schopno inhibovat adhezi buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

139. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 119 až 138, vyznačující se tím, že protilátka nebo její vazebný fragment, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jsou vázané nebo komplexované s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

193

140. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že agens je antivirální látka vybraná ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

141. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že antitrombotické/antirestenotické agens je vybrané ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

142. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že agens je protizánětlivá látka, vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

143. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že agens je antiautoimunitní látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

144. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

145. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že agens je látka vybraná ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

146. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu,

194

Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, diftérického toxinu, ricinu a jejich modifikaci a derivátů.

147. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positron-zářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfa-zářičů.

148. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ^luindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechneciurn, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton,

33,

95, xenon, ⁹⁰yttrium, ^zlJbismut, brom, ¹⁰fluor, ^S3ruthenium, ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, gallium a ⁶⁸gallium.

149. Způsob podle nároku 139, vyznačující se tím, že farmaceutická látka je vybrána ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

150. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 119 až 138, vyznačující se tím, že protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25 jsou vázané nebo komplexované

195 • · ·· · ·«·· ····· · · · · ····· s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

151. Způsob podle nároku 150, vyznačující se tím, že vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

152. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat buněčné rolování.

153. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat zánět.

154. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat autoimunitní onemocnění.

155. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat restenózu.

196 ··· · · · ···· • ····· · · ·· · · ··

156. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat trombózu.

157. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat metastázu.

158. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat růst a/nebo replikaci nádorových buněk.

159. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno zvyšovat rychlost mortality nádorových buněk.

160. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat růst a/nebo replikaci leukemických buněk.

161. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až

197 • · ·· · ··· • · ···· ··· • · ·· · ···· • ·· · · · · · · ···· • · ··« ·· ·

20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno zvyšovat rychlost mortality leukemických buněk.

162. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno zvyšovat citlivost nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

163. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno zvyšovat citlivost nemocných buněk k poškození protirakovinnými látkami.

164. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno zvyšovat citlivost leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami.

165. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat zvýšení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

166. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo • · · · * ·· ·

198

4 · · · · ♦ · · · ····· · 9 · · · ·· · ····« · · · · ♦ ·· · její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno snižovat počet nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

167. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat zvýšení počtu leukemických buněk u pacienta majícího rakovinu.

168. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno snižovat počet leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

169. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat tvorbu komplexu buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

170. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat agregaci buňka-buňka, buňka-matrix, destičkamatrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

199 * · · « · · · · c «· « · · · · · « · » · • ··· · · · · · · » ♦·· • · · » 4 «·· ··· ·· ··» ·» ·

171. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, 23 až 25, pro použití jako léčivo, které je schopno inhibovat adhezi buňka-buňka, buňka-matrix, destičkamatrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

172. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 152 až 171, kde protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jsou vázány nebo komplexovány s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

173. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je antivirální agens vybrané ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

174. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je antitrombotické/antirestenotické agens vybrané ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

200

175. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je protizánětlivá látka, vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

176. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je antiautoimunitní látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

177. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

178. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde agens je látka vybraná ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

179. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas • · • · • « · ·· · ···· • ····· · · ·· ····· • ···· ···

201.............

exotoxinu (PE) , PE40, PE38, diftérického toxinu, ricinu a jejich modifikací a derivátů.

180. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positronzářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfazářičů.

181. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ¹¹¹indium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechnecium, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium. ¹⁸²

182. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 172, kde farmaceutická látka je vybrána ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubi.cinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, ternozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

202 *

183. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 152 až 171, kde protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment jsou vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

184. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, podle nároku 183 , kde vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

185. Izolovaný epitop obsahující aminokyselinovou sekvenci z GPIba od Tyr-276 do Glu-282, ve které alespoň jedna z aminokyselin 276, 278 a 279 je sulfatována.

186. Izolovaný epitop podle nároku 185 , který dále obsahuje aminokyseliny z GPIba 283 až 285.

187. Protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, které jsou schopny vázat epitop podle 185, přičemž vázání je zvýšeno, jestliže epitop podle nároku 185 dále obsahuje aminokyseliny z GPIba 283 až 285.

188. Izolovaný N-koncový peptid z GPIba mající zjevnou molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa, která obsahuje • · • · ··· ·· · · · · · • ····· · · ·· ····· • · · · · ··· ····· ·· ··· ·· ·

203 epitop mající sekvenci YDYYPEE, ve které alespoň jeden tyrosinový zbytek v epitopu je sulfatován.

189. Izolovaný peptid GPIba sestávající z aminokyselin 1 až 282, ve kterém alespoň jedna z aminokyselin 276, 278 a 279 je sulfatována.

190. Protilátkový multimer obsahující alespoň první a druhý fragment vázající antigen, ve které alespoň první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba jsou schopné křížové reakce s epitopem vzorce I:

(S)_r

I [(W)z - P - (Y)_t - P]q _(I), ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A)_m(A)„(X)_u, nebo (X) _u (A) _n(A)_m, nebo (A) _n (X) _u (A) _m, nebo(A)_n(A)_m(X)_u, nebo (X) _u (A)_m(A) _n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinu

204

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin q je 1 až 6 z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, jestliže q je 1, r je 1 a jestliže q je >

1, alespoň jeden z Y je sulfatován.

191. Protilátkový multimer podle nároku 190, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba se vážou křížovou reakcí epitopem, v němž

W je glycin,

Y je peptido-konjugát tyrosinů nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu;

A je glutamát, γ karboxy glutamát nebo aspartát;

205 • · q je 1, 2 nebo 3.

192. Protilátkový multimer,podle nároku 190, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba se vážou křížovou reakcí s epitopem, v němž

Y je peptido-konjugát tyrosinu;

q je 3;

r je 1.

193. Protilátkový multimer obsahující alespoň první a druhý fragment vázající antigen, ve které alespoň první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba jsou schopné křížové reakce s epitopem vzorce II:

(SX (S)_r (SX ™ I I I (W)z-P-(YX-P-(YX-P-(YX-P _(II)r ve kterém

W je jakákoliv aminokyselina jiná než aspartát a glutamát

Y je jakákoliv přirozeně se vyskytující sloučenina, která může být sulfatována

P je (A) _m (A) _n (X) _u, nebo (X) _u(A) _n(A)_m, nebo (A) _n(X)_u(A)_m, nebo (A) _n (A) _m (X) _u, nebo (X) _u (A) _m(A) _n, nebo (A)_m(X)_u(A)_n

S je sulfát nebo sulfatovaná molekula • ·

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou aspartátu, glutamátu, nebo tyrosinu

A je jakákoliv negativně nabitá aminokyselina nebo leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, serin, nebo glycin z je 0, 1 nebo 2 r je 0 nebo 1 t je 1, 2 nebo 3 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3, kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0; kde, alespoň jeden z Y je sulfatován.

194. Protilátkový multimer podle nároku 193, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba se vážou křížovou reakcí s epitopem, v němž

W je glycin,

Y je peptido-konjugát tyrosinu nebo glyko-konjugát asparaginu, šeřinu nebo threoninu;

A je glutamát, γ karboxy glutamát nebo aspartát, leucin, isoleucin,. prolin, fenylalanin, serin nebo glycin.

207

195. Protilátkový multimer podle nároku 193, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba se vážou křížovou reakcí s epitopem, v němž:

Y je peptido-konjugát tyrosinu;

q je 3;

a r j e 1.

196. Protilátkový multimer obsahující alespoň první a druhý fragment vázající antigen, ve které alespoň první' nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba jsou schopné křížové reakce s epitopem vzorce III:

(S)r (S)r (S)_r (GWCEjnO^COt (X)_u(E)_n(D)_m(Y)_t(X)_u(E)_n(D)_m(Y)_t(P)_m(E)_n(X)_u ^(111J <

ve kterém:

G je glycin

E je glutamát

D je aspartát

Y je tyrosin

S je sulfát nebo sulfatovaná sloučenina

X je jakákoliv aminokyselina s výjimkou výše uvedených

208 z je 0, 1 nebo 2 t je 1, 2 nebo 3 r je 0 nebo 1 u je 0 až 2 n je 0 až 3 m je 0 až 3 kde, alespoň jeden z Y je sulfatován; kde, jestliže n = 0, pak m > 0; kde, jestliže m = 0, pak n > 0.

197. Protilátkový multimer podle nároku 196, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba se vážou křížovou reakcí s epitopem, v němž r je 1.

198. Protilátkový multimer podle nároku 190, 193 nebo 196, kde multimerem je dimer, trimer nebo tetramer.

199. Protilátkový multimer podle nároku 198 , kde multimerem je dimer.

200. Dimer podle nároku 199, ve kterém alespoň jeden z fragmentů vázajících antigen je vybrán z fragmentů scFv z Yl a Y17.

201. Dimer podle nároku 199, ve kterém první a druhé fragmenty vázající antigen jsou spojeny disulfidovým můstkem.

209

202. Dimer podle nároku 201, ve kterém prvními a druhými fragmenty jsou Yl-CysKAK.

203. Dimer podle nároku 199, ve kterém první a druhé fragmenty vázající antigen jsou spojeny polypeptidovým linkerem z 5 až 20 aminokyselin.

204. Dimer podle nároku 203, ve kterém polypeptidový linker obsahuje 5 aminokyselin.

205. Dimer podle nároku 204, ve kterém polypeptidovým linkerem je Gly4Ser.

206. Protilátkový multimer podle nároku 198, kde multimerem je trimer.

207. Trimer podle nároku 206, obsahující tři fragmenty vázající antigen, ve kterém alespoň jedním z fragmentů vázajících antigen je fragment ΥΙ-scFv nebo Y17-scFv.

208. Trimer podle nároku 207, ve kterém fragmenty vázající antigen jsou spojeny polypeptidovým linkerem.

209. Trimer podle nároku 208, ve kterém polypeptidový linker obsahuje 1 až 5 aminokyselin.

210. Protilátkový multimer podle nároku 198, ve kterém multimerem je tetramer.

211. Tetramer podle nároku 210, obsahující čtyři fragmenty vázající antigen, kde alespoň jedním z fragmentů vázajících antigen je fragment Yl scFv nebo fragment Y17 scFv.

210 •to ··· toto *

212. Tetramer podle nároku 2Í1, ve kterém fragmenty vázající antigen jsou spojeny polypeptidovým linkerem.

213. Tetramer podle nároku 212, ve kterém polypeptidový linker obsahuje 1 až 5 aminokyselin.

214. Tetramer podle nároku 210, ve kterém čtyři fragmenty vázající antigen tvoří komplex prostřednictvím asociace se streptavidin-biotinem.

215. Protilátkový multimer podle nároku 198, obsahující identické fragmenty vázající antigen.

216. Protilátkový multimer podle nároku 198, ve kterém alespoň první a druhý fragment vázající antigen obsahuje první hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 8.

217. Protilátkový multimer podle nároku 198, ve kterém alespoň první a druhý fragment vázající antigen, nebo oba, obsahuje první hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 20.

218. Protilátkový multimer podle nároku 216 nebo 217, ve kterém alespoň první a druhý fragment vázající antigen, nebo oba, má druhou hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 115 a/nebo třetí hypervariabilní oblast obsahující SEQ ID NO: 114.

219. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196, 216 a 217, kde multimer je schopen vazby k alespoň ke dvěma odlišným molekulám, vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba, heparinu, »· · · · ·

211 lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu.

220. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196, 216 a 217, kde multimer je schopen vazby k alespoň dvěma odlišným molekulám vybraným ze skupiny sestávající z PSGL-1, fibrinogenu γ', GPIba, heparinu, lumicanu, komplementové sloučeniny 4 (CC4), inter-alfa inhibitoru a protrombinu a je schopen vazby s alespoň jedním typem buněk, vybraným ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

221. Protilátkový dimer obsahující první a druhý fragment vázající antigen, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba obsahují hypervariabilní oblast zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8 [Yl CDR3].

222. Protilátkový dimer obsahující první a druhý fragment vázající antigen, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba obsahují hypervariabilní oblast zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 20 [Y17 CDR3].

223. Protilátkový dimer podle nároku 221 nebo 222, ve kterém první nebo druhý fragment vázající antigen, nebo oba dále obsahují druhou hypervariabilní oblast zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 115 a/nebo třetí hypervariabilní oblast zahrnující SEQ ID NO: 114.

224. Protilátkový multimer obsahující první nebo druhý fragment vázající antigen, ve kterém první nebo druhý

212 • «« ·· « ·* · *· · « · · ·· · · · • · · « · · · · · · ♦ ··· ··· · ♦ · · · · · · · fragment vázající antigen je schopen křížové reakce se dvěma nebo více epitopy, obsahujícími jeden nebo více sulfatovaných tyrosinových zbytků a alespoň jeden shluk dvou nebo více kyselých aminokyselin.

225. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s PSGL-1.

226. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci QATEYEYLDYDFLPETE, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

227. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s GPIba.

228. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci DEGDTDLYDYYPEEDTEGD, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

229. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci TDLYDYYPEEDTE, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

230. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci DEGDTDLYDYYP, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

231. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci YDYYPEE, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinů je sulfatován.

213 ·· ·· * · · · e · · · • ·» · · ·

9 · « e · · · · • ·* • r ·

Λ « · • » » « • · · · · · · * · · «· «

232. Protilátkový multimer podle nároku 224, který se váže k sekvenci TDLYDYYP, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinu je sulfatován.

233. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s fibrinogenem γ' .

234. Protilátkový multimer podle nároku 233, který se váže k sekvenci EPHAETEYDSLYPED, ve které alespoň jeden zbytek tyrosinu je sulfatován.

235. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s heparinem.

236. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s komplementovou sloučeninou 4 (CC4).

237. Protilátkový multimer podle nároku 224, který je schopen křížové reakce s alespoň jednou buňkou vybranou ze skupiny sestávající z buněk B-CLL, buněk AML, buněk mnohočetného myelomu a metastatických buněk.

238. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 ,7 ,27 a 28.

239. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném ke zvýšení mortality nádorových buněk, nebo ke zvýšení citlivosti nádorových buněk k poškození protirakovinnou látkou.

214 • · · · · · · ·· ···· ·· • · · · · · · ····· · · ·· · • · · · · · ·· ·· · · · · ·

240. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici růstu a/nebo replikace leukemických buněk.

241. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici abnormální adheze buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo destička-buňka.

242. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném ke zvýšení citlivosti nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

243. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném ke zvýšení mortality leukemických buněk, nebo ke zvýšení citlivosti leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami.

244. Farmaceutická kompozice obsahující protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196, 216 a 217, vyznačující se tím, že multimer je vázaný nebo komplexovaný s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

215

245. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je vybráno ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

246. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je antivirální agens vybrané ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

247. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je antitrombotická/antirestenotická látka vybraná ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

248. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je protizánětlivá látka, vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

249. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens antiautoimunitní látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

250. Farmaceutická kompozice podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

• · · · · «.· · ··

... .· · ....

• ····· · · ·· ···· • ...» ...

216 .............

251. Farmaceutická kompozice podle nároku 245, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positron-zářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfa-zářičů.

252. Farmaceutická kompozice podle nároku 251, vyznačující se tím, že radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ^11:Lindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechnecium, ^121mtellur, ^122mtellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

253. Farmaceutická kompozice podle nároku 245, vyznačující se tím, že agens je farmaceutická látka vybraná ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cisplatiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubičinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

254. Farmaceutické agens podle nároku 244, vyznačující se tím, že agens je vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

255. Farmaceutická kompozice podle nároku 254, vyznačující se tím, že vehikulum nebo nosič je vybrán ze • ·

217 skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

256. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici buněčného rolování.

257. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici zánětu.

258. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici autoimunitních onemocnění.

259. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici trombózy.

260. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici restenózy.

261. Farmaceutická kompozice podle nároku 238 v množství účinném k inhibici metastázy.

262. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici růstu a/nebo replikace nádorových buněk, ke zvýšení mortality nádorových buněk, nebo ke zvýšení citlivosti nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami.

• ·

218 .......

263. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici růstu a/nebo replikace leukemických buněk, ke zvýšení rychlosti mortality leukemických buněk, nebo ke zvýšení citlivosti leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami.

264. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném ke zvýšení citlivosti nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

265. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkový multimer v množství účinném k inhibici agregace buňka-buňka, buňkamatrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňkadestička, adheze nebo tvorby komplexu.

266. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že je vázaná nebo komplexovaná s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

267. Farmaceutická kompozice podle nároku 266, vyznačující se tím, že agens je antivirální agens vybrané ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

268. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že protilátkový multimer je vázán nebo • ·

219 ............

komplexován s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

269. Farmaceutická kompozice podle nároku 238, vyznačující se tím, že vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

270. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 1, 4, 7, 27 a 28 pro přípravu léčiva, které inhibuje buněčné rolování.

271. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje zánět.

272. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 1, 4, 7, 27 a 28 pro přípravu léčiva, které inhibuje autoimunitní onemocnění.

273. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje restenózu.

274. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje trombózu.

275. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje metastázu.

• · * ·

220

276. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje růst a/nebo replikaci nádorových buněk.

277. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které zvyšuje rychlost mortality nádorových buněk.

278. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje růst a/nebo replikaci leukemických buněk.

279. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které zvyšuje rychlost mortality leukemických buněk.

280. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které zvyšuje citlivost nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

281. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které zvyšuje citlivost nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami.

282. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro • · · · ·

221 přípravu léčiva, které zvyšuje citlivost leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami

283. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje zvýšení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

284. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které snižuje počet nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

285. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje zvýšení počtu leukemických buněk u pacienta majícího leukémii.

286. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které snižuje počet leukemických buněk u pacienta majícího leukémii

287. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje tvorbu komplexu buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

288. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje agregaci buňka-buňka, • · buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňka-destička.

289. Použití protilátkového multimeru podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro přípravu léčiva, které inhibuje adhezi buňka-buňka, buňka-matrix, destička-matrix, destička-destička a/nebo buňkadestička .

290. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 270 až 289, ve kterém protilátkový multimer je vázán nebo komplexován s agens vybraným ze skupiny sestávající z protirakovinných, antimetastatických, antileukemických látek, látek proti nemocím, antiadhezních, antitrombotických, antirestenotických, antiautoimunitních, antiagregačních, antibakteriálních, antivirálních a protizánětlivých látek.

291. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je antivirální agens vybrané ze skupiny sestávající z acycloviru, gancicloviru a zidovudinu.

292. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je antitrombotické/antirestenotické agens vybrané ze skupiny sestávající z cilostazolu, dalteparin sodium, reviparin sodium a aspirinu.

293. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je protizánětlivá látka, vybraná ze skupiny sestávající ze zaltoprofenu, pranoprofenu, droxicamu, acetyl salicylic 17, diclofenacu, ibuprofenu, dexibuprofenu, sulindacu, naproxenu, amtolmetinu, celecoxibu, indomethacinu, rofecoxibu a nimesulidu.

223

294. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je antiautoimunitní látka vybraná ze skupiny sestávající z leflunomidu, denileukin diftitoxu, subrea, WinRho SDF, defibrotidu a cyklofosfamidu.

295. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je antiadhezní/antiagregační látka vybraná ze skupiny sestávající z limaprostu, clorcromenu a kyseliny hyaluronové.

296. Způsob podle nároku 290, ve kterém agens je látka vybraná ze skupiny sestávající z toxinů, radioizotopů a farmaceutických látek.

297. Způsob podle nároku 290, ve kterém toxin je vybrán ze skupiny sestávající z geloninu, Pseudomonas exotoxinu (PE), PE40, PE38, diftérického toxinu, ricinu a jejich modifikací a derivátů.

298. Způsob podle nároku 290, ve kterém radioizotop je vybrán ze skupiny sestávající z gama-zářičů, positronzářičů, zářičů rentgenového záření, beta-zářičů a alfazářičů. ²⁹⁹

299. Způsob podle nároku 290, ve kterém radioizotop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ⁱⁿindium, ¹¹³indium, ^99mrheniurn, ¹⁰⁵rhenium, ¹⁰¹rhenium, ^99mtechnecium, ^121mtellur, ^122ratellur, ^125mtellur, ¹⁶⁵thulium, ¹⁶⁷thulium, ¹⁶⁸thulium, ¹²³jod, ¹²⁶jod, ¹³¹jod, ¹³³jod, ^81mkrypton, ³³xenon, ⁹⁰yttrium, ²¹³bismut, ⁷⁷brom, ¹⁸fluor, ⁹⁵ruthenium, ⁹⁷ruthenium, ¹⁰³ruthenium, ¹⁰⁵ruthenium, ¹⁰⁷rtuť, ²⁰³rtuť, ⁶⁷gallium a ⁶⁸gallium.

224

300. Způsob podle nároku 290, ve kterém farmaceutická látka je vybrána ze skupiny sestávající z Doxorubicinu (adriamycin), morfolinodoxorubicinu, methoxymorfolinyldoxorubicinu, cis-platiny, taxolu, calicheamicinu, vincristinu, cytarabinu (Ara-C), cyklofosfamidu, prednisonu, daunorubicinu, morfolinodaunorubicinu, methoxymorfolinyldaunorubicinu, idarubicinu, fludarabinu, chlorambucilu, interferonu alfa, hydroxymočoviny, temozolomidu, thalidomidu a bleomycinu a jejich derivátů a kombinací.

301. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 270 až 289, ve kterém protilátka, její fragment vázající antigen, nebo její komplex, který obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její vazebný fragment, jsou vázané nebo komplexované s vehikulem nebo nosičem, který je schopen být připojen nebo komplexován s více než jednou látkou.

302. Způsob podle nároku 301, ve kterém vehikulum nebo nosič je vybrán ze skupiny sestávající z dextranu, lipofilních polymerů, hydrofilních polymerů, HPMA a liposomů.

303. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování buněčného rolování.

304. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování zánětu.

225 • ·· ·· · ·· · · · · ·· ·

305. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování autoimunitních onemocnění.

306. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování restenózy.

307. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování trombózy.

308. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování metastázy.

309. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování růstu a/nebo replikace nádorových buněk.

310. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke zvýšení rychlosti mortality nádorových buněk.

311. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibování růstu a/nebo replikace leukemických buněk.

312. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke zvýšení rychlosti mortality leukemických buněk

226

313. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke zvýšení citlivosti nemocných buněk k poškození látkami proti onemocnění.

314. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke zvýšení citlivosti nádorových buněk k poškození protirakovinnými látkami.

315. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke zvýšení citlivosti leukemických buněk k poškození antileukemickými látkami.

316. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo k inhibici zvýšení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

317. Protilátkový multimer podle kteréhokoliv z nároků 190, 193, 196 a 216 až 218 pro použití jako léčivo ke snížení počtu nádorových buněk u pacienta majícího rakovinu.

318. Polyklonální protilátka, protilátkový fragment nebo komplex, který křížově reagují s variabilním lehkým řetězcem lidské monoklonální protilátky scFv Yl.

319. Polyklonální protilátka, protilátkový fragment nebo komplex podle nároku 318, který křížově reaguje s restrikčním fragmentem Ndel-EcoRl variabilního lehkého řetězce lidské monoklonální protilátky Y-l.

227

320. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, protilátkový fragment nebo komplex podle kteréhokoliv z nároků 318 až 319.

321. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, protilátkový fragment nebo komplex podle kteréhokoliv z nároků 318 až 319 konjugovaný s Doxorubičinem.

322. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, protilátkový fragment nebo komplex podle kteréhokoliv z nároků 318 až 319 a farmaceuticky přijatelný nosič vybraný ze skupiny sestávající z dextranu, HPMA, hydrofilních polymerů, lipofilních polymerů a liposomů.

323. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, protilátkový fragment nebo komplex podle kteréhokoliv z nároků 318 až 319 smíchaný s liposomy nesoucími Doxorubicin.