CZ20032054A3

CZ20032054A3 - Podjednotkové vakcíny s A2 supermotivy

Info

Publication number: CZ20032054A3
Application number: CZ20032054A
Authority: CZ
Inventors: John Sidney; Alessandro Sette; Howard M. Grey; Scott Southwood
Original assignee: Epimmune Inc.
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2003-12-17
Also published as: EP1368659A2; SK9512003A3; IL156660A0; MXPA03006581A; JP2005512016A; NZ526860A; KR20040052475A; WO2002061435A2; RU2003126447A; US20040096445A1; WO2002061435A3; CA2432995A1; CN1653337A; CA2432995C; AU2002243730B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká vývoje vakcín, které budou účinné u velké části populace, zejména u těch jedinců v populaci, kteří mají alelu A2 supertypu. Podjednotkové vakcíny, které obsahují A2 supermotiv, mohou být navrženy tak, aby pokryly takovou populaci.

Dosavadní stav techniky

Genetická výbava daného savce kóduje struktury asociované s imunitním systémem daného druhu. Ačkoliv existuje v lidské populaci značná genetická diversita, a ještě větší diversita existuje při srovnání lidí a jiných druhů, existují společné rysy a efekty. U savců jsou některé molekuly asociované s imunitními funkcemi označované jako hlavní histokompatibilní komplex.

MHC molekuly jsou klasifikovány jako molekuly třídy I nebo třídy II. Molekuly MHC třídy II jsou exprimovány primárně na buňkách podílejících se na iniciaci a tlumení imunitních reakcí, jako jsou T lymfocyty, B lymfocyty, makrofágy, atd. Molekuly MHC třídy II jsou rozpoznávány pomocnými T lymfocyty a indukují proliferaci pomocných T lymfocytů a amplifikaci imunitní reakce na konkrétní imunogenní peptid, který je prezentován. MHC molekuly třídy I jsou exprimovány téměř na všech jaderných buňkách a jsou rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty (CTL), které potom ničí buňky nesoucí antigen. CTL jsou zejména významné při rejekci nádorů a v boji proti virovým infekcím.

4 «4 4 «4 «44» 4·

CTL rozpoznávají antigen ve formě peptidového fragmentu navázaného na MHC molekuly třídy I a nikoliv intaktní cizorodý antigen samotný. Antigen musí být normálně endogenně syntetizován buňkou a část proteinového antigenu se degraduje na malé peptidové fragmenty v cytoplasmě. Některé z těchto malých peptidů se transportují do pre-Golgiho kompartmentů a interagují s těžkými řetězci třídy I pro usnadnění správného složení a asociaci s podjednotkou β2 mikroglobulinu. Komplex peptid-MHC třída I se potom přesouvá na povrch buňky pro expresi a potenciální rozpoznání specifickými CTL.

Zkoumání krystalické struktury lidské MHC molekuly třídy I, HLA-A2.1, ukázalo, že vazebný zářez pro peptid je tvořen složením al a a2 domén těžkého řetězce třídy I (Bjorkman, et al., Nátuře 329:506 (1987)). V těchto pokusech však nebyla identita peptidů vázaných do zářezu určena.

Buus, et al., Science 242:1065 (1988), poprvé popsali způsob pro eluci navázaných peptidů z MHC molekul za použití kyseliny. Potom Rammensee a spol. (Falk, et al., Nátuře 351:290 (1991)) vyvinuli způsob pro charakterizaci přirozeně zpraďovaných peptidů navázaných na molekuly třídy I.^-Další výzkumníci dosáhli přímého sekvenování aminokyselin u častých peptidů v různých HPLC frakcích za použití automatizovaného sekvenování peptidů eluovaných z molekul třídy IB typu (Jardetzky, et al., Nátuře 353:326 (1991)) a A2.1 typu, za použití hmotnostní spektrometrie (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992)). Přehled charakterizace přirozeně zpracovávaných peptidů v MHC třídy I byl prezentován Rotzschkem & Falkem (Rótzschke & Falk, Immunol. Today 12:447(1991)). PCT přihláška WO 97/34621, která je zde uvedena jako odkaz, popisuje peptidy, které mají vazebný motiv pro A2.1 alely.

« · • · ···· ··

Sette, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:3296 (1989), ukázali, že motivy specifické pro MHC alelu mohou být použity pro předpovězení MHC vazebné kapacity. Schaeffer, et al.,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:4649 (1989), ukázali, že vazba MHC souvisí s jeho imunogenicitou. Další (De Bruijn, et al., Eur. J. Immunol.,· 21:2963-2970(1991); Pamer, et al., 991 Nátuře 353:852-955 (1991)) podali předběžný důkaz, že vazebné motivy třídy I mohou být aplikovány na identifikaci potenciálně imunogenních peptidů ve zvířecích modelech. Motivy třídy I specifické pro mnoho lidských alel daného izotypu třídy I byly již popsány. Je žádoucí, aby kombinované frekvence těchto různých alel byly dosti vysoké pro to, aby pokryly velkou část - a snad celou - lidskou populaci.

I přes pokroky v oboru neexistují v oboru použitelné lidské peptidové vakcíny nebo terapeutická činidla na bázi předkládaného vynálezu

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje parametry pro vývoj vakcín, u kterých se předpokládá, Že budou účinné u velké části populace. Podle návodu, který je zde uveden, se při přípravě vakcín proti konkrétním infekčním organismům nebo virům nebo nádorům relevantní antigen hodnotí pro určení lokalizace epitopů, které s nejvyšší pravděpodobností způsobují cytotoxickou T-lymfocytární reakci na infekci nebo nádor. Analyzováním aminokyselinové sekvence antigenu způsobem, který je zde uveden, může být identifikována vhodná sada epitopů. Peptidy, které se skládají z těchto epitopů, mohou být snadno testovány na svou schopnost vazby na jednu nebo více HLA alel charakteristických pro A2 supertyp. Obecně, peptidy, které se • · váží s afinitou reprezentovanou IC50 500 nM nebo méně, mají vyšší pravděpodobnost vyvolání cytotoxické T lymfocytární (CTL) reakce. Schopnost těchto peptidů provádět tuto' funkci může být také snadno verifikována. Podle takto identifikovaných imunogenních peptidů mohou být potom navrženy vakcíny. Vakcíny se mohou skládat z peptidů samotných, prekursorů, ze kterých budou vznikat peptidy in vivo, nebo z nukleových kyselin kódujících tyto peptidy pro produkci in vivo.

V jednom aspektu se tedy vynález týká způsobu pro identifikaci epitopu v antigenu charakteristickém pro patogen nebo nádor. Epitop identifikovaný tímto způsobem s vyšší pravděpodobností zesiluje imunitní reakci u jedince majícího alelu A2 supertypu než náhodně vybraný peptid. Způsob zahrnuje analyzování aminokyselinové sekvence antigenu pro segmenty délky 8-11 aminokyselin, kde aminokyselina v pozici 2 je malý nebo alifatický hydrofobní zbytek (L, I, V, M, A, T nebo Q) a aminokyselina na C-konci segmentu je také malý nebo alifatický hydrofobní zbytek (L, I, V, M, A nebo T). Ve výhodných provedeních je zbytek v pozici 2 L nebo Μ. V jiných výhodných provedeních obsahuje segment 9-10 aminokyselin. V jiném výhodném provedení segment obsahuje Q nebo N v pozici 1 a/nebo R, H nebo K v pozici 8, a neobsahuje D, E a G v pozici 3, když je segmentem 10-mer. Též výhodný je V v pozici 2 a na C-konci.

Vynález také popisuje přípravky obsahující imunogenní peptidy mající vazebný motiv subsekvencí pro HLA-A2.1 molekuly. Imunogenní epitopy v peptidech, které se váží na vhodnou MHC alelu, mají výhodně délku 8-11 zbytků a lépe 9 až 10 zbytků a obsahují konzervované zbytky v některých pozicích, jako jsou pozice 2 a C-konec. Kromě toho peptidy neobsahují negativní vazebné zbytky, jak jsou zde definovány, v jiných «♦ · ·· ·· pozicích, jako jsou pozice 1, 3, 6 a/nebo 7 v případě peptidů délky 9 aminokyselin a pozice 1, 3, 4, 5, 7, 8 a/nebo 9 v případě peptidů délky 10 aminokyselin. Předkládaný vynález definuje pozice v motivu umožňující selekci peptidů, které se účinně váží na HLA A2.1.

Za použití motivů sekvencí, jak jsou zde popsány, mohou být identifikovány epitopy na mnoha imunogenních cílových proteinech. Příklady vhodných antigenů zahrnují prostatický specifický antigen (PSA), jaderné a povrchové antigeny viru hepatitidy B (HBVc, HBVs), antigeny viru hepatitidy C, antigeny viru Epstein-Barrové, viru lidské imunodeficience typu I (HIV1), herpes viru Kaposiho sarkomu (KSHV), lidského papilloma viru (HPV), Lassa viru, mycobacterium tuberculosis (MT), p53, CEA, trypanosomový povrchový antigen (TSA) a Her2/neu. Peptidy a nukleové kyseliny kódující tyto peptidy jsou použitelné ve farmaceutických přípravcích pro in vivo a ex vivo terapeutické a diagnostické aplikace.

Definice

Termín peptid je zaměnitelný s termínem oligopeptid a v předkládaném vynálezu označuje sérii zbytků, obvykle Laminokyselin, vázaných na sebe obvykle peptidovými vazbami mezi α-amino a karbonylovými skupinami sousedních aminokyselin. Oligopeptidy jsou obvykle kratší než 250 aminokyselin a mohou mít délku menší než 150, 100, 75, 50, 25, nebo 15 aminokyselin. Dále, oligopeptid podle předkládaného vynálezu může být takový oligopeptid, který neobsahuje více než 15 sousedních aminokyselin přirozeného antigenů.

Nomenklaturou použitou pro popis peptidových sloučenin je běžná nomenklatura, ve které je amino skupina přítomna vlevo

444· 44 (na N-konci) a karboxylová skupina vpravo (na C-konci) každého aminokyselinového zbytku. Ve vzorci reprezentujícím specifická provedení předkládaného vynálezu jsou amino- a karboxylterminální skupiny, ačkoliv nejsou konkrétně uvedeny, ve formě, která předpokládá fyziologické pH, pokud není uvedeno jinak. Ve strukturálním vzorci aminokyselin je každý zbytek obecně reprezentován standardním trojpísmenným nebo jednopísmenným kódem. L-forma aminokyselinového zbytku je reprezentována jedním velkým písmenem nebo velkým prvním písmenem trojpísmenného kódu, a D-forma - pro aminokyseliny mající D-formu - je reprezentována jedním malým písmenem nebo třípísmeným kódem malými písmeny. Glycin neobsahuje asymetrický uhlíkový atom a je proto označován jednoduše jako Gly nebo G.

Imunogenní peptid nebo epitop je peptid nebo aminokyselinová sekvence, která obsahuje motiv specifický pro alelu, jako je peptidová sekvence, která se váže na MHC molekulu a indukuje CTL reakci. Imunogenní peptidy podle předkládaného vynálezu jsou schopné vazby na vhodnou HLA-A2 molekulu a indukce a cytotoxické T-lymfocytární reakce proti antigenu, ze kterého je imunogenní peptid odvozen. Imunogenní peptidy podle předkládaného vynálezu jsou kratší než přibližně 15 zbytků, často kratší než 12 zbytků a obvykle mají délku mezi přibližně 8 a přibližně 11 zbytky, výhodně 9 nebo 10 zbytky.

Imunogenní peptidy jsou výhodně identifikovány za použití algoritmů podle předkládaného vynálezu. Algoritmy jsou matematické postupy, které produkují skóre, které umožňuje selekci imunogenních peptidů. Obvykle se používá algoritmické skóre s prahem vazby, které umožňuje selekci peptidů, které mají vysokou pravděpodobnost vazby při určité afinitě a proto * t · ·· «··· ·· ·· 9 jsou imunogenní. Algoritmus je založen buď na efektu MHC vazby konkrétní aminokyseliny v konkrétní pozici peptidů, nebo na efektech konkrétní substituce v peptidů obsahujícím motiv na vazbu.

Výsledky vazby jsou často vyjádřeny jako IC₅₀. IC50 je koncentrace peptidů ve vazebném testu, při které je pozorována 50% inhibice vazby referenčního peptidů. Při podmínkách, při kterých jsou testy, jak jsou zde popsány, prováděny (tj. limitující HLA proteiny a koncentrace značeného peptidů), se tyto hodnoty blíží hodnotám K_D. Testy pro stanovení vazby jsou podrobně popsány v PCT přihláškách WO 94/20127 a WO 94/03205. Je třeba uvést, že hodnoty IC50 se mohou měnit, často velmi výrazně, se změnami testovacích podmínek a že závisejí na konkrétních použitých činidlech (například na HLA přípravku atd.). Například .nadměrné koncentrace HLA molekuly budou zvyšovat změřenou hodnotu IC₅₀ pro daný ligand a proto nebudou odrážet skutečnou hodnotu K_D.

Vazba je často vyjádřena jako relativní poměr ve vztahu k referenčnímu peptidů. Podle toho, jestli je test více či méně sensitivní, se hodnoty IC50 pro testované peptidy mohou o něco lišit. Nicméně, vazba ve srovnání s referenčním peptidem by se neměla významně měnit. Například, v testu prováděném za podmínek, při kterých se IC₅₀ referenčního peptidů zvýší 10krát, se hodnota IC₅₀ testovaného peptidů také zvýší přibližně 10-krát. Proto se - aby se eliminovaly nejasnosti - hodnocení toho, zda je peptid dobrým, středně dobrým, slabým nebo negativním vazebným činidlem obvykle provádí za použití jeho hodnoty IC₅o, ve vztahu k IC50 standardního peptidů. Vazba může být vyjádřena jako poměr nebo může být poměr použit pro normalizaci hodnoty IC50, jak je popsáno v příkladu 1.

• · • φ

Φ φφφφ •Φ φ*

Vysoká afinita pro HLA molekuly třídy I je zde definována jako vazba s hodnotou IC50 nebo Kd menší než 50 nM. Střední afinita je vazba s IC50 (nebo KD) mezi přibližně 50 a přibližně 500 nM.

Konzervovaný zbytek je aminokyselina, která se vyskytuje s významně vyšší frekvencí, než by se předpokládalo z náhodné distribuce, v určité pozici v peptidů. Obvykle je konzervovaný zbytek takový zbytek, kde může být MHC struktura kontaktována s imunogenním peptidem. Jeden ze tří, výhodně dvou, konzervovaných zbytků v peptidů definované délky, definuje motiv- pro imunogenní peptid. Tyto zbytky jsou obvykle v těsném kontaktu se zářezem pro vazbu peptidů, se svými vedlejšími řetězci zanořenými do specifických kapes zářezu samotného. Obvykle imunogenní peptid obsahuje až tři konzervované zbytky, častěji dva konzervované zbytky.

Termín negativní vazebné zbytky označuje aminokyseliny, které - když jsou přítomné v určitých pozicích (například, pozicích 1, 3 a/nebo 7 9-meru) - způsobují, že se peptid neváže nebo slabě váže a nakonec tedy není imunogenní, tj. neindukuje CTL reakci.

Termín motiv označuje posloupnost zbytků v peptidů definované délky, obvykle přibližně 8 až přibližně 11 aminokyselin, kterou rozpoznávají konkrétní MHC alely. Peptidové motivy jsou obvykle různé pro každou lidskou MHC alelu a liší se v obsahu vysoce konzervovaných zbytků a negativních zbytků.

Vazebný motiv pro alelu může být definován za použití zvyšujícího se stupněm přesnosti. V jednom případě jsou konzervované zbytky přítomny ve správných pozicích v peptidů a •·· ··· ···· ···* ·· ♦· · ·· ·· nejsou přítomny negativní zbytky v pozicích 1, 3 a/nebo 7.

Supermotiv je vazebná specificita pro peptid společná HLA molekulám kódovaným dvěma nebo více HLA alelami. Epitop nesoucí supermotiv je výhodně rozpoznáván s vysokou nebo střední afinitou (jak je zde definována) dvěma nebo více HLA antigeny.

HLA supertyp nebo rodina je sada HLA molekuly zařazených do jedné skupiny podle společné vazebné specificity pro peptid. HLA molekuly třídy I, které mají podobné vazebné afinity pro peptidy obsahující některé aminokyselinové motivy, jsou sdruženy do HLA supertypů. Termíny HLA superrodina, HLA supertypová rodina a HLA xx-like supertypové molekuly (kde xx označuje konkrétní HLA typ), jsou synonyma.

Výraz izolovaný nebo biologicky čistý označuje materiál, který ve významnější míře neobsahuje nebo vůbec neobsahuje složky, se kterými se obvykle vyskytuje v normálním stavu. Peptidy podle předkládaného vynálezu tedy neobsahují materiál, se kterým jsou obvykle asociovány in sítu, tj. například MHC I molekuly na buňkách prezentujících antigen. I když byl protein 'izolován do homogenního nebo dominantního proužku, jsou přítomny stopové nečistoty v rozsahu 5-10% přirozeného proteinu, který se přečistil současně s požadovaným proteinem. Izolované peptidy podle předkládaného vynálezu neobsahují takové endogenní současně přečištěné proteiny.

Termín zbytek označuje aminokyselinu nebo mimetikum aminokyseliny obsaženou v oligopeptidu prostřednictvím amidové vazby nebo vazby napodobující amidovou vazbu.

• «

0000 ··

0 0 00

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1. Pozice 2 a C-konec upřesňují specificitu HLA-A*0201. Preference pro specifické zbytky v pozici 2(a) nebo na C-konci (b) je uvedena jako funkce procenta peptidů nesoucích specifický zbytek, které se váží na A*0201 s IC50 500 nM nebo lépe. ARB hodnoty peptidů nesoucích specifické zbytky v pozici 2(a) nebo na C-konci (b) se vypočítaly způsobem popsaným dále a indexovaly se ve vztahu ke zbytku s nejvyšší vazebnou kapacitou. Průměr (geometrický) vazebné kapacity peptidů s L v pozici 2 byl 1991 nM. Průměr (geometrický) vazebné kapacity peptidů s V na C-konci byl 2133 nM. Peptidy zahrnuté do analýzy měly alespoň jeden tolerovaný kotevní zbytek, jak je popsáno v textu, buď v pozici 2 nebo v C-konci.

Obr. 2. Mapa A*0201 motiv. Souhrnná mapa A*0201 motivu pro 8merové (b), 10-merové (c) a 11-merové (d) peptidy.

V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky ukázané jako výhodné (nebo škodlivé) asociované s průměrnou vazebnou kapacitou 3-krát vyšší (nebo 3-krát nižší) než peptidy stejné velikosti obsahující ve stejné pozici jiné zbytky.

V primárních kotevních pozicích jsou výhodnými zbytky ty, které jsou asociovány s průměrnou vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku ve stejné pozici. Tolerované primární kotevní zbytky jsou ty, které jsou asociované s průměrnou vazebnou kapacitou mezi 10- a 100- násobkem optimálního zbytku ve stejné pozici.

Obr. 3. Pozice 2 upřesňuje specificitu HLA-A2-supertypové molekuly. ARB hodnoty peptidů obsahujících specifické zbytky v pozici 2 se vypočetly pro každou molekulu A2-supertypu způsobem popsaným v textu a indexovaly se vůči zbytků s nejvyšší hodnotou ARB pro každou specifickou molekulu.

• · • * ·«·« ·· ·« · ♦ 4 ·

Průměr (geometrický) vazebné kapacity peptidů obsahujících zbytek s nejvyšší ARB byl 55, 59, 89 a 41 mM pro A*0202,

A*0206 a A*6802, v příslušném pořadí.

Obr. 4. C-konec upřesňuje specificitu HLA-A2-supertypových molekul. ARB hodnoty peptidů majících specifické zbytky na Ckonci se vypočetly pro každou molekulu A2-supertypu způsobem popsaným v textu a indexovaly se vzhledem ke zbytku s nejvyšší ARB pro každou specifickou molekulu. Průměr (geometrický) vazebné kapacity peptidů obsahujících zbytek s nejvyšší ARB byl 291, 48, 250, a 553 nM pro A*0202, A*0203, A*0206, a A*6802, v příslušném pořadí.

Obr. 5. Mapa A*0202 motivu. Souhrnná mapa A*0202 motivu pro9merový (a) a 10-merový (b) peptid. V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky uvedené jako preferované (nebo škodlivé) asociované s průměrnou vazebnou kapacitou 3-krát vyšší (nebo 3-krát nižší) než peptidy stejné velikosti obsahující ve stejné pozici jiné zbytky. V primárních kotevních pozicích jsou výhodnými zbytky ty, které jsou asociovány s průměrnou vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku ve stejně pozici. Tolerované primární kotevní zbytky jsou ty, které jsou asociované s průměrnou vazebnou kapacitou mezi 10a 100- násobkem optimálního zbytku ve stejné pozici.

Obr. 6. Mapa A*0203 motivu. Souhrnné mapy A*0203 motivu pro 9merový (a) a 10-merový (b) peptid. V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky uvedené jako preferované (nebo škodlivé) asociované s průměrnou vazebnou kapacitou 3-krát vyšší (nebo 3-krát nižší) než peptidy stejné velikosti obsahující ve stejné pozici jiné zbytky. V primárních kotevních pozicích jsou výhodnými zbytky ty, které jsou asociovány s průměrnou vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku ve • · ♦ *·· · · · • t * a ·« aa * ·* *· stejné pozici. Tolerované primární kotevní zbytky jsou ty, které jsou asociované s průměrnou vazebnou kapacitou mezi 10a 100- násobkem optimálního zbytku ve stejné pozici.

Obr. 7. Mapa A*0206 motivu. Souhrnné mapy A*0206 motivu pro 9merový (a) a 10-merový (b) peptid. V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky uvedené jako preferované (nebo škodlivé) asociované s průměrnou vazebnou kapacitou 3-krát vyšší (nebo 3-krát nižší) než peptidy stejné velikosti obsahující ve stejné pozici jiné zbytky. V primárních kotevních pozicích jsou výhodnými zbytky ty, které jsou asociovány s průměrnou vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku ve stejné pozici. Tolerované primární kotevní zbytky jsou ty, které jsou asociované s průměrnou vazebnou kapacitou mezi 10a 100- násobkem optimálního zbytku ve stejné pozici.

Obr. 8. Mapa A*6802 motivu. Souhrnné mapy A*6802 motivu pro 9merový (a) a 10-merový (b) peptid. V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky uvedené jako preferované (nebo škodlivé) asociované s průměrnou vazebnou kapacitou 3-krát vyšší (nebo 3-krát nižší) než peptidy stejné velikosti obsahující ve stejné pozici jiné zbytky. V primárních kotevních pozicích jsou výhodnými zbytky ty, které jsou asociovány s průměrnou vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku ve stejné pozici. Tolerované primární kotevní zbytky jsou ty, které jsou asociované s průměrnou vazebnou kapacitou mezi 10a 100- násobkem optimálního zbytku ve stejné pozici.

Obr. 9. Konvenční sekvence A2 supermotivu sekundární a primární kotevní sekvence ovlivňuje vazebnou kapacitu A2supertypu 9-(a) a 10-merových (b) peptidů. Uvedené zbytky významně ovlivňují vazbu na 3 nebo více molekul A2-supertypu. Počet ovlivněných molekul je uveden v závorkách.

. · · • Φ Φ

Φ Φ • «· • Λ • ·

Φ4«Φ «4 *

• Φ Φ

ΦΦΦ » • · ♦ Φ «Φ ·#

V sekundárních kotevních pozicích jsou zbytky považovány za výhodné pouze tehdy, když nemají škodlivý vliv na molekulu. Výhodné zbytky, které jsou pro molekulu škodlivé, jsou uvedeny malým písmem a kurzívou. Hodnocení primárních kotevních pozic jsou provedena za použití analýzy jednotlivých substitucí a peptidové knihovny, jak je popsáno v textu.

Popis výhodných provedení

Předkládaný vynález se částečně týká způsobu vývoje vakcin na bázi epitopu. Tento způsob je založen na dobře známé skutečnosti, že mechanismus pro indukci CTL imunitní reakce zahrnuje krok prezentace epitopu ve formě peptidu velikosti přibližně 8-11 aminokyselin navázaného na HLA molekulu přítomnou na buňkách prezentujících antigen uvedeným CTL. HLA molekula je produkt třídy I MHC, který je exprimován na většině jaderných buněk.

Produkty alel MHC třídy I jsou genericky charakterizovány jako A, B a C HLA molekuly. V každé z těchto kategorií existuje v populaci mnoho alelických variant; předpokládá se, že existuje více než 500 alel třídy I a třídy II. Jelikož reakce cytotoxických T-lymfocytů nemůže být vyvolána, pokud není .epitop prezentován molekulami HLA třídy I obsaženými na povrchu buněk jedince, který je imunizován, je důležité, aby byl epitopem takový epitop, který je schopen vazby na HLA jedince.

Výchozím bodem pro vývoj vakcíny je proto zajištění toho, aby vakcína generovala velké množství epitopů, které mohou být úspěšně prezentovány. Může být možné podat peptidy reprezentující epitopy jako takové. Takové podání je závislé na prezentaci prázdných HLA molekul na buňkách jedince.

V jednom přístupu využívajícím imunogenní peptidy samotné mohou být tyto peptidy inkubovány s buňkami prezentujícími antigen od jedince, které jsou tak zpracovány ex vivo a potom navráceny jedinci.

Alternativně může být peptid velikosti 8-11 aminokyselin generován in šitu podáním nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou Sekvenci, která ho kóduje. Prostředky pro získání takové molekuly nukleové kyseliny jsou popsány v WO 99/58658, která je zde uvedena jako odkaz. Dále mohou být imunogenní peptidy podány jako součást větší peptidové molekuly, která může být rozštěpena za uvolnění požadovaného peptidů. Větší peptid může obsahovat irelevantní aminokyseliny, obecně čím méně, tím lépe. Proto mají peptidy, které obsahují takové aminokyseliny, obvykle délku 25 aminokyselin nebo méně, častěji 20 aminokyselin nebo méně, a nej častěji 15 aminokyselin nebo méně. Prekursorem může být také heteropolymer nebo homopolymer obsahující více různých nebo stejných CTL epitopů. Samozřejmě mohou být také použity směsi peptidů a nukleových kyselin, které generují různé imunogenní peptidy. Vývoj peptidových vakcín, molekul nukleové kyseliny nebo hetero- nebo homo-polymery je závislý na obsažení požadovaného epitopu. Předkládaný vynález poskytuje návod pro identifikaci relevantního epitopu, který je účinný pro značnou část populace jedinců, kteří jsou charakterizováni A2 supertypem. Následující stránky popisují metody a výsledky pokusů pro identifikaci A2 supermotivu.

Je výhodné, aby peptidy obsahovaly alelu, která se váže na alelu HLA-A2 supertypu. Tyto motivy mohou být použity pro definování T-lymfocytárních epitopů pro jakýkoliv požadovaný antigen, zejména pro ty antigeny, které jsou asociovány s lidskými virovými nemocemi, nádory nebo autoimunitními • · · ·*· ·« * · · ·

...... ·· * ·· ** nemocemi, a kde aminokyselinová sekvence potenciálního antigenu nebo autoantigenu je známá.

Epitopy na mnoha potenciálních cílových proteinech mohou být identifikovány podle HLA vazebných motivů. Příklady vhodných antigenu zahrnují prostatický specifický antigen (PSA), jaderné a povrchové antigeny viru hepatitidy B (HBVc,

HBVs), antigeny viru hepatitidy C, antigeny viru EpsteinBarrové, melanomové antigeny (např. MAGE-1), viru lidské imunodeficience typu I (HIV1), antigeny lidského papilloma viru (HPV), p53, CEA, trypanosomový povrchový antigen (TSA) a Her2/neu.

Peptidy obsahující epitopy z těchto antigenu mohou být syntetizovány a potom testovány na svou schopnost vázat se na vhodné MHC molekuly v testech využívajících, například, přečištěné molekuly třídy I a radioaktivním jodem značené peptidy a/nebo buňky využívající prázdné molekuly třídy I, a za použití například., imunofluorescenčního barvení a průtokové mikrofluormetrie, testů na peptid-dependentní skládáni třídy I, a inhibice CTL rozpoznávání kompetici s peptidem. Ty peptidy, které se váží na molekulu třídy I, mohou být dále hodnoceny na svou schopnost sloužit jako cíle pro CTL od infikovaných nebo imunizovaných jedinců, stejně jako na svou kapacitu indukovat primární in vitro nebo in vivo CTL reakce, které mohou indukovat vznik CTL populací schopných reagovat s cílovými buňkami infikovanými virem nebo s nádorovými buňkami jako potenciální terapeutická činidla.

Antigeny MHC třídy I jsou kódované HLA-A, B, a C lokusy.

HLA-A a B antigeny jsou exprimovány na povrchu buněk v přibližně stejných densitách, zatímco exprese HLA-C je významně nižší (snad až 10-krát nižší). Každý z těchto lokusů • 99

9

má mnoho alel.. Peptid vazebné motivy podle předkládaného vynálezu jsou relativně specifické pro každý podtyp alely.

Pro peptidové vakcíny peptidy výhodně obsahují motiv rozpoznávaný MHC I molekulou mající rozsáhlou distribuci v lidské populaci, nebo motiv rozpoznávaný geneticky diversifikovanou populací. Jelikož se MHC alely vyskytují v různých etnických skupinách a rasách s různou frekvencí, může volba cílové MHC alely záviset na cílové populaci.

Tabulka 1 ukazuje frekvenci produktů různých alel v HLA-A lokusu u různých ras. Například většina kavkazské populace může být pokryta peptidy, které se váží na čtyři podtypy HLA-A alel, konkrétně HLA-A2.1, Al, A3.2, a A24.1. Obdobně většina asiatské populace je zahrnuta přidáním peptidů, které se váží na pátou alelu HLA-A1 1.2.

···· *·

Tabulka 1

Alela/Podtyp	14(691*	AÍ54)	CT502)
Al	10,1(7)	1,8(1)	27,4(138)
A2.1	11,5(8)	37,0(20)	39,8(199)
A2.2	10,1(7)	0	33(17)
A2.3	1,4(1)	5,5(3)	0,8(4)
A2.4	-	-	-
A2.5	•'		-
A3.1	1,4(1)	0	0,2(0)
A3.2	5,7(4)	5,5(3)	21^(108)
All.t	0	5,5(3)	0
A11.2	5,7(4)	31,4(17)	8,7(44)
A11.3	0	3,7(2)	0
A23	43(3)	-	3,9(20)
A24	2,9(2)	27,7(15)	153(77)
A24.2	-	w	-
A24.3	-	-	-
A25	1,4(1)	- -	63(35)
A26.1	W)	9,2(5)	5,9(30)
A26.2	73(5)	-	1,0(5)
A26V	-	3,7(2)	«
A28.1	10,1(7)	-	1,6(8)
A28.2	1,4(1)	»	7,5(38)
A29.1	1,4(1)	-	W)
A29.2	10,1(7)	1,8(1)	5,3(27)
A30.1	8,6(6)	-	43(25)
A302	1,4(1)	-	03(1)
A303	7,2(5)	*	33(20)
A31	4,3(3)	7,4(4)	«#35)
A32	2,8(2)		7,1(36)
Aw33.1	8,6(6)	-	23(13)
Aw33.2	2,8(2)	16,6(9)	13(6)
Aw34.1	1,4(1)	-	-
Aw34.2	14,5(10)	*	0,8(4)
Aw36	5,9(4)		-

Tabulka je sestavena z B. DuPont, Immunobiology of HLA, Vol. I, Histocompatibility Testing 1987, Springer-Verlag, New York 1989.

N “ Negroidní; A = Asiatská; C = Kavkazská. Čísla v závorkách představují počet jedinců zahrnutých v analýze.

Může se vyskytovat zkřížená vazba peptidů nesoucích HLA• «4

4

4444 » 4 4 I

44

A2.1 motiv s jinými molekulami specifickými pro HLA-A2 alelu. Tyto molekuly specifické pro alelu sdílející vazebné specificity s HLA-A2.1 jsou považovány za HLA-A2.1 supertyp. B-oblast HLA molekuly A2 supertypu je charakterizována společným motivem obsahujícím zbytky (tato nomenklatura využívá jednopísmenných aminokyselinových kódů, kde dolní index označuje pozici v peptidů) F/Yg, A₂₄, M₄g, E/Ng3, K/Nge,

V₆₇, H/Q™ a Y/C99. Obdobně, F kapsa A2-supertypu je charakterizována společným motivem obsahujícím zbytky ϋγτ, Tsoz Lei _a Y116 (155) . Přibližně 66% peptidů vážících A*0201 bude zkříženě reagovat se třemi nebo více alelami A2-supertypu.

A2 supertyp, jak je zde definován, je v souladu s daty o zkřížené reaktivitě, (Fruci, D. et al., Hum. Immunol. 38:187, 1993), z vazebných testů na živých buňkách (del Guercio, M.F. et al., J. Immunol. 154:685, 1995) a s daty získanými sekvenováním přirozeně zpracovaných peptidů (Sudo, T., et al.,

J. Jmmunol. 155:4749, 1995) navázaných na molekuly specifické pro HLA-A2 alelu. Proto se rodina HLA molekul (tj. HLA-A2 supertyp, který se váže na tyto peptidy) skládá z alespoň devíti HLA-A proteinů: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 a A*6901.

Jak je zde popsáno, zahrnuje HLA-A2 supermotiv peptidové ligandy s L, I, V, Μ, A, T, nebo Q jako primárními kotevními zbytky v pozici 2 a L, I, V, M, A, nebo T jako primárními kotevními zbytky v C-koncové pozici epitopu. HLA-A2 motivy, které jsou nejvíce relevantní z hlediska předkládaného vynálezu, jsou V, A, T, nebo Q v pozici dvě a L, I, V, M, A, nebo T v C-koncové kotevní pozici. Peptidový epitop obsahující HLA-A2 supermotiv se může vázat na jeden nebo více molekul HLA-A2 supertypu.

• ·· • * · * ···· ·· ·· · ·· ··

Postup, který může být použit pro identifikaci peptidů podle předkládaného vynálezu, je popsán v Falk, et al., Nátuře 351:290(1991), která je zde uvedena jako odkaz. Stručně, způsob zahrnuje velkoobjemovou izolaci MHC molekuly třídy I, obvykle imunoprecipitací nebo afinitní chromatografií, z vhodné buňky nebo buněčné linie. Příklady jiných metod pro izolaci požadované MHC molekuly, které jsou také dobře známé odborníkům v oboru, jsou iontoměničová chromatografie, lektinová chromatografie, vylučování podle velikosti, vysoce výkonná ligandová chromatografie a kombinace všech výše uvedených technik.

V typickém případě je pro izolaci požadované alely použita imunoprecipitace. Může být použito mnoho protokolů, v závislosti na specificity použitých protilátek. Například, alelově-specifické mAb mohou být použity pro afinitní přečištění HLA-A, HLA-B, a HLA-C molekul. Existuje několik mAb činidel pro izolaci HLA-A molekuly. Monoklonální BB7.2 je vhodná pro izolování HLA-A2 molekuly. Afinitní kolony připravené za použití těchto mAb za použití standardních technik jsou úspěšně použity pro přečištění produktů příslušné HLA-A alely.

Kromě mAb specifických pro alelu mohou být široce reaktivní anti-HLA-A, B, C mAb, jako jsou W6/32 B9.12.1 a Bl.23.2, použity v alternativních protokolech pro afinitní přečištění, jak jsou popsány v příkladech provedení vynálezu.

Peptidy navázané na vazebný zářez pro peptid izolovaných MHC molekul jsou eluovány obvykle pomocí zpracování kyselinou. Peptidy mohou být také disociovány z molekul třídy I pomocí různých standardních denaturačních prostředků, jako je teplo, pH, detergenty, soli, chaotropní činidla nebo jejich

444 *4 kombinace.

Peptidové frakce se dále separovaly od MHC molekul vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází (HPLC) a sekvenovaly se. Peptidy mohou být separovány různými standardními technikami známými v oboru, včetně filtrace, ultrafiltrace, elektroforesy, chromatografie s vylučováním podle velikosti, srážení specifickými protilátkami, iontoměničové chromatografie , isoelektrofokusování a podobně.

Sekvenování izolovaných peptidů může být provedeno za použití standardních technik, jako je Edmanova degradace (Hunkapiller, M.W., et al., Methods Enzymol. 91, 399 [1983]). Mezi další metody vhodné pro sekvenování patří sekvenování jednotlivých peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie, jak bylo popsáno dříve (Hunt, et al., Science 225:126 1 (1992), zde uvedeno jako odkaz). Aminokyselinové sekvenování velkých heterogenních peptidů (například, kombinovaných HPLC frakcí) z různých molekul třídy I obvykle zjistí charakteristickou sekvenci (motiv) pro každou alelu třídy I.

Definování motivů specifických pro různé alely třídy I umožňuje identifikaci potenciálních peptidových epitopů z antigenního proteinu, jehož aminokyselinová sekvence je známá. Obvykle se identifikace potenciálních peptidových epitopů nejprve provede za použití počítače pro prohlédnutí aminokyselinové sekvence požadovaného antigenu na přítomnost motivů.

Po identifikaci epitopů nesoucích motiv se syntetizují epitopové sekvence. Kapacita vazby na molekuly MHC třídy I se měří různými způsoby. Jedním způsobem je vazebný test s molekulou třídy I, jak je popsán v souvisejících « 00 • 0 • · « · 0 0 · · 0·0· ·0 00 ·

0 < • 0 00 přihláškách, které jsou uvedeny dále. Mezi další alternativy popsané v literatuře patří inhibice prezentace antigenu (Sette, et al., J. Immunol. 141:3893 (1991), in vitro testy sestavování (Townsend, et al., Cell 62:285 (1990), a testy na bázi FACS využívající mutovaných buněk, jako jsou RMA.S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963 (1991)).

Jak je zde uvedeno, vyšší vazebná afinita pro HLA' koreluje s vyšší imunogenicitou. Vyšší imunogenicita může být manifestována několika různými způsoby. Imunogenicita může odpovídat tomu, jestli je imunitní reakce vůbec vyvolána, a síle takové reakce, stejně jako velikostí populace, u které je reakce vyvolána. Například může peptid vyvolat imunitní reakci v rozličných skupinách populace, ale v žádném případě nevyvolá silnou reakci. Podle zde popsaných principů bylo zjištěno, že téměř 90% peptidů s vysokou vazbou jsou peptidy imunogenní, oproti pouze přibližně 50% peptidů, které se váží se střední afinitou. Dále, peptidy s vyšší vaezbnou afinitou vedly k silnější reakci. Proto je méně peptidu nutno pro vyvolání stejného biologické efektu při použití peptidu s vysoce afinitní vazbou. Ve výhodných provedeních podle předkládaného vynálezu jsou tedy epitopy s vysoce afinitní vazbou zejména výhodné. Nicméně, významného zlepšení oproti předchozímu stavu v oboru lze dosáhnout i při použití peptidů se střední nebo vysokou vazebnou afinitou.

Vztahy mezi vazebnou afinitou pro HLA molekuly třídy I a imunogenicitou jednotlivých epitopů peptidu byly poprvé určeny předkladateli tohoto vynálezu. U těchto pokusů, ve kterých jsou tyto jednotlivé peptidy popisovány, je třeba uvést, že buněčné zpracování peptidů in vivo vede k vzniku takových peptidů i tehdy, když se použijí delší fragmenty. Proto delší peptidy skládající se z jednoho nebo více epitopů spadají do • ·Β φ φ * φ • · · ΦΦΦ · φ φ φ

......... ·· ” rozsahu předkládaného vynálezu. Korelace mezi vazebnou afinitou a imunogenicitou byla analyzována ve dvou různých experimentálních postupech (Sette, et al., J. Jmmunol,

153:5586-5592, 1994). V prvním způsobu se imunogenicita potenciálních epitopů v rozmezí vazebné afinity k HLA větším než 10000-násobném analyzovala u HLA-A*0201 transgenních myší.

Ve druhém způsobu se antigenicita přibližně 100 různých epitopů odvozených od viru hepatitidy B (HBV), které všechny obsahovaly A*0201 vazebné motivy, testovala za použití PBL (lymfocytů periferní krve) od pacientů s akutní hepatitidou.

Na základě těchto testů se určilo, že práh afinity přibližně 500 nM (výhodně 50 nM nebo nižší) koreluje s kapacitou peptidového epitopu vyvolat CTL reakci. Tato data platí pro vazebnou afinitu třídy I k přirozeně zpracovávaným peptidům a pro syntetizované T-lymfocytární epitopy. Tato data také ukazují významnou úlohu výběru determinant pro charakter Tlymfocytárních reakci (viz například Schaeffer, et al.,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:4649-4653, 1989).

Proto jsou CTL-indukujícími peptidy výhodně ty peptidy, které mají IC₅o pro třídu I HLA molekul 500 nM nebo nižší.

V případě peptidových epitopů obsahujících motiv z antigenů asociovaných s nádory bylo prokázáno, že práh vazebné afinity 200 nM je asociován se zabíjením nádorových buněk vzniklými populacemi CTL.

Ve výhodném provedení se po hodnocení vazebné aktivity pro molekulu specifickou pro HLA-A2 alelu peptidy vykazující vysokou nebo střední afinitu analyzují dále. Vybrané peptidy mohou být testovány na jiných členech supertypové rodiny. Ve výhodných provedení jsou peptidy, které vykazují zkříženou vazbu, potom použijí ve vakcínách nebo buněčných skríningových testech.

• toto • to • to ♦ •••to ·· • toto ·· to • · · to to· ··

Například se peptidy, které jsou pozitivní v HLA-A2 vazebném testu, tj., mají hodnoty vazebné afinity 500 nM nebo nižší, testují na schopnost peptidu indukovat specifické CTL reakce in vitro. Například mohou být buňky prezentující antigen, které byly inkubovány s peptidem, testovány na schopnost indukovat CTL reakce v cílových buněčných populacích. Buňkami prezentujícími antigen mohou být normální buňky,jako jsou mononukleární buňky periferní krve, nebo dendritické buňky (Inaba, et al., J. Exp. Med. 166:182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18:219 [1988]).

Alternativně mohou být použity mutované savčí buněčné linie, které ztratily schopnost pohlcovat molekuly třídy I se zpracovanými peptidy, jako je myší buněčné linie RMA-S (Kárre, et al., Nátuře, 319:675 (1986); Ljunggren, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970(1991)), a lidský somatický Tlymfocytární hybrid, T-2 (Cerundolo, et al., Nátuře 345:449452 (1990)), a které byly transfektovány vhodnými geny kódujícími lidské molekuly třídy I, a peptidy mohou být exogenně přidány k takovým buňkám za účelem testování kapacity peptidu indukovat primární CTL reakce in vitro. Mezi další eukaryotické buněčné linie, které mohou být použity, patří různé hmyzí buněčné linie, jako jsou buněčné linie z moskytích larev (ATCC buněčné linie CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585,

6586), buněčné linie z housenek bource morušového (ATTC CRL 8851), buněčné linie z vojnice (ATCC CRL 1711), buněčné linie z molů (ATCC CCL 80) a drosophilové buněčné linie, jako je buněčná linie Schneider (viz Schneider J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-365 [1927]).

Lymfocyty periferní krve jsou výhodně izolovány po prosté venepunkci nebo leukoforesou od normálních dárců nebo od

4

99 4 4 • · 4 · « 4 4

4 4 4 4 • 449 94 ·· · pacientů a jsou použity jako zdroje buněk reagujících na CTL prekursory. V jednom provedení jsou vhodné buňky prezentující antigen inkubovány s 10-100 μΜ peptidu v bezsérovém mediu po dobu 4 hodin za vhodných kultivačních podmínek. Buňky prezentující antigen obsahující peptid se potom inkubují s populací reagujících buněk in vitro po dobu 7 až 10 dnů za optimálních kultivačních podmínek. Pozitivní CTL aktivace může být stanovena testováním kultur na přítomnost CTL, které usmrcují radioaktivně značené cílové buňky, jak specifickým peptidem pulsované cílové buňky, tak cílové buňky exprimující endogenně zpracovanou formu relevantního viru nebo nádorového antigenu, ze kterého byla peptidová sekvence odvozena.

Specificita a MHC restrikce CTL se určí testováním proti různými cílovým buňkám obsahujícím peptid exprimujícím vhodné nebo nevhodné lidské MHC molekuly třídy I. Peptidy, které jsou pozitivní v MHC vazebném testu a které vyvolávají specifické CTL reakce, jsou zde označeny jako imunogenní peptidy.

Kast, et al. (J. Immunol. 152:3904-3912, 1994) ukázali, že peptidy obsahující motiv odpovídají za 90 % epitopů, které se váží na alelově-specifické HLA molekuly třídy I. V tomto pokusu se všechny možné peptidy délky 9 aminokyselin a překrývající se v 8 aminokyselinách (240 peptidů), které pokrývaly celou sekvenci E6 a E7 protein lidského papillomaviru typu 16, hodnotily na vazbu na HLA molekuly specifické pro pět alel, které jsou exprimovány s vysokou frekvencí v různých etnických skupinách. Tato nezkreslená sada peptidů umožnila hodnocení prediktivní hodnoty HLA motivů třídy I. Ze sady 240 peptidů bylo identifikováno 22 peptidů, které se vázaly na HLA molekuly specifické pro alelu s vysokou nebo střední afinitou. Z těchto 22 peptidů obsahovalo 20, * «« • · · « • Φ ·· {t.j. 91%) motiv. Tak tento pokus demonstroval význam motivů pro identifikaci peptidových epitopů pro použití ve vakcínách: použití identifikačních technik na bázi motivu eliminuje skríning 90% potenciálních epitopů. Kvantita dostupných peptidů, a jejich komplexnost pro Skríning, dělá z úplného vyčerpávajícího hodnoceni antigenu záležitost značně obtížnou, jestli ne nemožnou, bez použití motivů.

Imunogenní peptidový epitop podle předkládaného vynálezu může být obsažen v polyepitopovém vakcinačním prostředku obsahujícím další peptidové epitopy stejného antigenu, antigeny ze stejného zdroje a/nebo antigeny z jiného zdroje. Dále, epitopy třídy II mohou být obsaženy společně s epitopy třídy I. Peptidové epitopy ze stejného antigenu mohou být sousední epitopy .se sousedící sekvencí, nebo mohou být získány z jiných regionů proteinu.

Jak bude podrobněji uvedeno dále, mohou být imunogenní peptidy připraveny synteticky, jako například chemickou syntézou, nebo rekombinantní DNA technologií, nebo mohou být izolovány z přirozených zdrojů, jako jsou viry nebo nádory. Ačkoliv výhodně je peptid v podstatě neobsahující jiné přirozené proteiny hostitelské buňky a jejich fragmenty, může být v některých provedeních peptid synteticky konjugován na přirozené fragmenty nebo částice.

Polypeptidy. nebo peptidy mohou mít různé délky, mohou být ve svých neutrálních (nenabitých) formách nebo ve formách solí, a mohou být bez modifikací, jako je glykosylace, oxidace vedlejšího řetězce nebo fosforylace, nebo mohou obsahovat tyto modifikace, kde podmínkou je, aby taková modifikace nenarušovala biologickou aktivitu polypeptidů, jak je zde popsána.

• ·· «*<

··*♦»·· 4 4« ·

Φ · · 4 4 4 · · · 4

4444 44 44 4 ·4 44

Je žádoucí, aby byl peptid tak malý, jak jen je možné, a zároveň aby si zachoval v podstatě všechny biologické aktivity velkého peptidu. Pokud je to možné, tak je žádoucí optimalizovat peptidové epitopy podle předkládaného vynálezu na délku 9 nebo 10 aminokyselinových zbytků, což je , srovnatelné s velikostí endogenně zpracovávaných virových peptidů nebo peptidů nádorových buněk, které se váží na MHC molekuly třídy I na povrchu buněk.

Peptidy mající požadovanou aktivitu mohou být modifikovány podle potřeby, aby byly zajištěny určité jejich vlastnosti, například lepší farmakologické charakteristiky, za zlepšení nebo alespoň zachováni v podstatě veškeré biologické aktivity nemodifikovaného peptidu ve vazbě na požadovanou MHC molekulu a v aktivaci vhodných T-lymfocytů. Například mohou být v peptidech provedeny různé změny, jako jsou substituce, buď konzervativní nebo nekonzervativní, kde takové změny mohou poskytovat určité výhody v použití, jako je lepší vazba na MHC. Konzervativní substitucí se míní nahrazení aminokyselinového zbytku jiným zbytkem, který je biologicky a/nebo chemicky podobný, například je jeden hydrofobní zbytek nahrazen jiným, nebo jeden polární zbytek jiným. Substituce zahrnují kombinace jako jsou Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met;

Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; a Phe, Tyr. Vliv substituce jednotlivých aminokyselin může být také zkoumán za použití D-aminokýselin. Takové modifikace mohou být provedeny za použití dobře známých postupů peptidové syntézy, které jsou popsány například v Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany a Merrifield, The Peptides, Gross and Meienbofer, eds. (N.Y., Academie Press), str. 1-284 (1979); a Stewart and Young, Solid Phase Peptid Synthesis, (Rockford, 111., Pierce), 2. vydání (1984).

···· 4·

Peptidy mohou být také modifikovány prodloužením nebo zkrácením aminokyselinové sekvence sloučeniny, například, přidáním nebo odebráním aminokyselin. Peptidy nebo analogy podle předkládaného vynálezu mohou být také pozměněny alterováním pořadí nebo složení některých zbytků; je jasné, že některé aminokyselinové zbytky zásadní pro biologickou aktivitu, například zbytky v kritických kontaktních místech nebo konzervované zbytky, nemohou být obvykle pozměněny bez nežádoucího účinku na biologickou aktivitu. Non-kritické aminokyseliny nemusí být omezeny na aminokyseliny přirozeně se vyskytující v proteinech, jako jsou L-a-aminokyseliny, ale mohou zahrnovat též artificiální aminokyseliny, jako jsou β-γδ-aminokyseliny, stejně jako mnohé deriváty L-a-aminokyselin, jako jsou D-isomery přirozených aminokyselin.

Obvykle se série peptidů se substitucí jednotlivých aminokyselin použije pro určení vlivu elektrostatického náboje, hydrofobnosti atd. na vazbu. Například se v celé délce řetězce provede série substitucí positivně nabitými (například Lys nebo Arg) nebo negativně nabitými (například Glu) aminokyselinami a sleduje se různá sensitivita k různými MHC molekulám a T-lymfocytárním receptorům. Dále mohou být použity vícečetné substituce za použití malých, relativně neutrálních skupin, jako je Ala, Gly, Pro, nebo podobné zbytky. Substituce mohou produkovat multi-epitopové peptidy, které jsou homo-oligomery nebo heterooligomery. Počet a typ zbytků, které jsou substituovány nebo přidány, závisí prostoru, který je nutný mezi zásadními kontaktními body a některými funkčními atributy, které jsou požadovány (například hydrofobnost versus hydrofilnost). Zvýšená vazebná afinita pro MHC molekulu nebo T-lymfocytární receptor může být také dosažena takovými substitucemi, ve srovnání s afinitou φφφ φφφ « • · φ φ

ΦΦ ΦΦ • I» · * · ♦ · φφφ φ · • · · φφφ

ΦΦΦΦ ·· φ původního peptidu. Ve všech případech takové substituce využívají aminokyselinových zbytků nebo jiných molekulárních fragmentů vybraných tak, aby se eliminovala, například sterická nebo elektrická interference, která by mohla narušit vazbu.

Aminokyselinové substituce jsou obvykle substituce jednoho zbytku. Substituce, delece, inserce nebo jakékoliv jejich kombinace mohou být proto kombinovány za zisku finálního peptidu. Substituční varianty jsou takové varianty, ve kterých byl alespoň jeden zbytek peptidu odstraněn a jiný zbytek byl vložen na jeho místo. Takové substituce jsou při jemném modulování charakteristik peptidu obvykle provedeny podle následující tabulky 2.

Tabulka 2
Původní zbytek	Příklad substituce
Ala	Ser
Arg	Lys,His
Asn	Gin
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Lys; Arg
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; His
Met	Leu; Ile
Phe	Tyr,Tip
Ser	Thr
Thr	Ser
Tip	Tyr, Phe
Tyr	Tip; Phe
Val	Ile; Leu

4 4 ·

4444 ·4 4*4 *· ··

Významné změny funkce (například afinity pro MHC molekuly nebo T-lymfocytární receptory) se provedou pomocí takových substitucí, které jsou méně konzervativní než změny uvedené v tabulce 2, t.j. výběrem zbytků, které se více liší ve svém vlivu na udržování (a) struktury peptidového skeletu v místě substituce, například na helikální nebo listovou konformaci (b) náboje nebo hydrofobnosti molekuly v cílovém místě, nebo (c) velikosti vedlejšího řetězce. Substituce, u kterých se předpokládá, že budou produkovat největší změny ve vlastnostech peptidů, budou ty, ve kterých se (a) hydrofilní zbytek, například seryl, substituuje za hydrofobní zbytek, například leucyl, isoleucyl, fenylalanyl, valyl nebo alanyl;

(b) zbytek mající elektropozitivní vedlejší řetězec, například, lysyl, arginyl, nebo histidyl, substituuje za elektronegativní zbytek, například glutamyl nebo aspartyl; nebo (c) zbytek mající velký vedlejší řetězec, například fenylalanin, substituuje za zbytek nemající vedlejší řetězec, například glycin.

Peptidy mohou také obsahovat isosterní formy dvou nebo více zbytků v imunogenním peptidů. Isosterní forma, jak je zde definována, je sekvence dvou nebo více zbytků, která může být substituována za jinou sekvenci, protože sterická konformace první sekvence odpovídá vazebnému místu specifickému pro druhou sekvenci. Termín specificky zahrnuje modifikace peptidového skeletu známé odborníkům v oboru. Mezi takové modifikace patří amidový dusík, α-uhlík, aminový karbonyl, kompletní odstranění amidové vazby, extenze, delece nebo zesítění skeletu. Obecně viz Spatola, Chemistry and

Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins. Vol. VII (Weinstein ed., 1983).

Modifikace peptidů různými mimetiky aminokyselin nebo • ·» **««·» · ······ ·· · ·· »· artificiálními aminokyselinami jsou zejména vhodné pro zvýšení stability peptidu in vivo. Stabilita může být testována mnoha způsoby. Například mohou být pro testování stability použity peptidasy a různá biologická media, jako jsou lidská plasma a sérum. Viz, například, Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11:291-302(1986). Poločas peptidů podle předkládaného vynálezu se výhodně určí za použití testu s 25% lidským sérem (obj./obj.). Obecně je postup následující. Kombinované lidské sérum (typ AB, neinaktivované teplem) se delipiduje před použitím odstředěním. Sérum se potom naředí na 25% pomocí RPMI tkáňového kultivačního media a použije se pro testování stability peptidu. V předem stanovených časových intervalech se odebere malé množství reakčního roztoku a toto množství se přidá buď do 6% kyseliny trichloroctové, nebo do ethanolu. Zkalený reakční vzorek se ochladí (4 °C) na dobu 15 minut a potom se odstředí za zisku pelety vysrážených sérových proteinů. Přítomnost peptidů se potom určí HPLC s reverzní fází za použití chromatografických podmínek specifických pro stabilitu.

Peptidy podle předkládaného vynálezu nebo jejich analogy, které mají CTL stimulační aktivitu, mohou být modifikovány tak, aby získaly i jiné požadované vlastnosti než lepší sérový poločas. Například může být zvýšena schopnost peptidů indukovat CTL aktivitu pomocí vazby na sekvenci, která obsahuje alespoň jeden epitop, který může indukovat reakci pomocných T-lymfocytů.

V některých provedeních je peptidem pro pomocné T-lymfocyty takový peptid, který je rozpoznáván pomocnými T-lymfocyty u většiny populace. Tohoto může být dosaženo výběrem aminokyselinových sekvencí, které se váží na většinu, nebo všechny, MHC molekuly třídy II. Tyto jsou známé jako špatně • 4 • 4 « 4

4

4 4

4 44

MHC-restringované sekvence pro pomocné T-lymfocyty. Příklady aminokyselinových sekvencí, které jsou špatně MHC restringované, jsou sekvence z antigenu jako je tetanický toxin v pozicích 830-843 (QYLKANSKFIGITE), circumsporozoitový (CS) protein Plasmodium falciparum v pozicích 378-398 (DIEKKIAKMEKASSVFNWNS), a Streptokokový 18 kD protein v pozicích 1-16 (YGAVDSILGGVATYGAA).

Alternativně je možné připravit syntetické peptidy schopné stimulovat T pomocné lymfocyty, špatně MHC-restringovaným způsobem, za použití aminokyselinové sekvence, které se přirozeně nevyskytuje. Tyto syntetické sloučeniny, označované jako Pan-DR-vazebné epitopy nebo PADRE™ molekuly (Epimmune,

San Diego, CA), jsou navržen podle své vazebné aktivity k většině HLA-DR (lidské MHC třídy II) molekul (viz například U.S. Patent č. 5736142).

Zejména výhodné konjugáty imunogenní peptid/epitop pro pomocné T-lymfocyty, jsou odděleny spojovací molekulou. Spojovací molekula je obvykle relativně malá, neutrální molekula, jako jsou aminokyseliny nebo mimetika aminokyselin, které jsou za fyziologických podmínek v podstatě bez náboje. Tyto oddělovací molekuly jsou obvykle vybrány například z Ala, Gly, nebo jiných neutrálních oddělovacích skupin tvořených nepolárními aminokyselinami nebo neutrálními polárními aminokyselinami. Je třeba si uvědomit, že volitelně přítomná oddělovací skupina nemusí být složena ze stejných zbytků a proto se může jednat o hetero- nebo homooligomer. Když je přítomna, je obvykle oddělovací skupina tvořena alespoň jedním nebo dvěma zbytky, častěji třemi až šesti zbytky. Alternativně může být CTL peptid navázán na peptid pro pomocné T-lymfocyty bez oddělovací skupiny.

• · •999 ·«

Imunogenní peptid může být navázán na peptid pro pomocné Tlymfocyty buď přímo, nebo prostřednictvím oddělovací skupiny, na amino nebo karboxy konci CTL peptidů. Amino konec imunogenního peptidů nebo peptidů pro pomocné T-lymfocyty může být acylovaný. Příkladem peptidů pro pomocné T-lymfocyty jsou tetanický toxoid 830-843, chřipkový protein 307-319, proteiny malarického cirkumsporozoita 382-398 a 378-389.

V některých provedeních může být výhodné použít ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu alespoň jednu složku, která aktivuje CTL. Lipidy byly identifikovány jako činidla schopná indukovat CTL in vivo proti virovým antigenům. Například zbytky kyseliny palmitové mohou být navázány na alfa a epsilon amino skupiny Lys zbytku a potom mohou být navázány, například prostřednictvím jednoho nebo více spojovacích zbytků, jako jsou Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser a podobně, na imunogenní peptid. Lipidovaný peptid může být potom injikován přímo v micelární formě, inkorporovaný do liposomu nebo emulgovaný v adjuvans, například v nekompletním Freundově adjuvans. Ve výhodném provedení obsahuje účinný imunogen kyselinu palmitovou navázanou na alfa a epsilon-aminoskupiny Lys, který je navázán vazbou, například Ser-Ser, na aminokonec imunogenního peptidů.

Jiným příkladem lipidové indukce CTL reakcí, která může být použita, jsou lipoproteiny E. coli, jako jsou tripalmitoyl-Sglycerylcysteinlyseryl-serin (P₃CSS), který může být použit pro indukci virus-specifických CTL, když je kovalentně navázán na vhodný peptid. Viz, Dereš, et al., Nátuře 342:561-564 (1989). Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být navázány na P3CSS, například, a lipopeptid může být podán jedinci pro specifickou indukci CTL reakce na cílový antigen. Dále, protože indukce neutralizačních protilátek může být též indukována P3CSS konjugovaným na peptid, který má vhodný epitop, mohou být tyto dva prostředky kombinovány pro účinnější indukci humorální a buněčné imunitní reakci vůči infekci.

Dále mohou být přidány na konce peptidu další aminokyseliny pro usnadnění vazby peptidů jeden na druhý, pro vazbu na nosič nebo na větší peptid, pro modifikaci fyzikálních nebo chemických vlastností peptidu nebo oligopeptidu a podobně. Aminokyseliny jako je tyrosin, cystein, lysin, kyselina glutamová nebo asparagová, a podobně, mohou být vloženy na Cnebo N-konec peptidu nebo oligopeptidu. Modifikace na C-konci může v některých případech měnit vazebné charakteristiky peptidu. Dále, peptidová nebo oligopeptidová sekvence se může lišit od přirozené sekvence tím, že se modifikuje terminálníNH₂ acylací, například alkanoylovou {C1-C20) nebo thioglykolylovou acetylací, amidací na terminálním karboxylu, například amoniakem, methylaminem, atd. V některých případech mhou tyto modifikace poskytnout místa pro vazbu na nosič nebo jinou molekulu.

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny různými způsoby. Vzhledem k tomu, že mají relativně malou velikost, mohou být peptidy (diskrétní epitopy nebo polyepitopové peptidy) syntetizovány v roztoku nebo na pevných nosičích za použití běžných technik. Komerčně jsou dostupné různé automatizované syntezátory, které mohou být použity známými způsoby. Viz například Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis. 2. vydání, Pierce Chemical Co. (1984), výše.

Alternativně může příprava peptidů podle předkládaného vynálezu zahrnovat použití rekombinantní DNA technologie, ve ··«· které je nukleotidová sekvence, která kóduje požadovaný imunogenní peptid, insertována do expresního vektoru, transformována nebo transfektována do vhodné hostitelské buňky a kultivována za podmínek vhodných pro expresi. Tyto postupy jsou obecně známé v oboru a jsou popsány v Sambrook, et al., Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), která je zde uvedena jako odkaz. Tak mohou být připraveny fúzní proteiny, které obsahují jeden nebo více proteinů podle předkládaného vynálezu, a tyto proteiny mohou být použity pro prezentaci vhodného T-lymfocytárního epitopů.

Protože kódující sekvence pro peptidy uvažované délky mohou být syntetizovány chemicky, například fosfotriesterovou metodou dle Matteucci, et al., J. Tůn. Chem. Soc. 103:3185 (1981), mohou být modifikace provedeny prostou substitucí vhodné baze za bázi kódující přirozenou peptidovou sekvenci. Kódující sekvence může být potom připravena s vhodnými spojovacími sekvencemi a může být ligována do expresních vektorů běžně dostupných v oboru, a vektor může být použit pro transformaci vhodných hostitelských buněk pro produkci požadovaného fúzního proteinu. Existuje mnoho takových vektorů a vhodných hostitelských systémů. Pro expresi fúzních proteinů může být kódující sekvence opatřena operativně navázanými start a stop kodony, promotorem a terminátorem a obvykle replikačním systémem, aby byl získán expresní vektor vhodný pro expresi v požadované hostitelské buňce. Promotorové sekvence kompatibilní s bakteriálními hostiteli se například dodávají v plasmidech obsahujících vhodná restrikční místa pro inserci požadované kódující sekvence. Získané expresní vektory se transformují do vhodných bakteriálních hostitelských buněk. Mohou být ovšem použity také kvasinkové nebo savčí hostitelské buňky, pokud jsou použity vhodné vektory a kontrolní sekvence.

* » · * φ φφ φ φφ • ΦΦΦ φ ·

Peptidy podle předkládaného vynálezu a farmaceutické a vakcinační prostředky obsahující tyto peptidy jsou vhodné pro podání savcům, konkrétně lidem, pro terapeutickou léčbu a/nebo prevenci infekcí a nádorů. Příklady onemocnění, které mohou být léčeny za použití imunogenních peptidů podle předkládaného vynálezu, jsou karcinom prostaty, hepatitida B, hepatitida C, ADS, karcinom ledvin, karcinom čípku děložního, lymfom, infekce CMV a condylomata acuminata.

Pro farmaceutické prostředky jsou imunogenní peptidy podle předkládaného vynálezu často podány jedinci již trpícímu nádory nebo infikovanému daným virem. Jedinci v inkubační fázi nebo s akutní fází infekce mohou být léčeni imunogenními peptidy samotnými nebo společně s jinou léčbou podle potřeby.

V terapeutických aplikacích jsou prostředky podány pacientovi v dávce dostatečné pro vyvolání účinné CTL reakce na infekční agens nebo nádorový antigen a pro vyléčení nebo alespoň stabilizaci příznaků a/nebo komplikací. Dávka adekvátní pro dosažení tohoto cíle se označuje jako terapeuticky účinná dávka či dávková jednotka. Toto množství závisí například na složení peptidového prostředku, způsobu podání, stadiu a závažnosti léčeného onemocnění, hmotnosti a celkovém zdravotním stavu pacienta a na posouzení předepisujícího lékaře. Obvykle je pro člověka pro počáteční imunizaci (to znamená pro terapeutické nebo profylaktické podání) od přibližně 1,0 gg do přibližně 20000 gg peptidu pro 70 kg pacienta, výhodně 100 gg, 150 gg, 200 gg, 250 gg, 300 gg, 400 gg nebo 500 gg-20000 gg, a potom se podají dosycovací dávky ve stejném rozsahu podle dosycovacího režimu během několika týdnů až měsíců, podle reakce pacienta a aktivitě specifických CTL v krvi pacienta. V provedeních, kde se použije podání rekombinantní nukleové kyseliny nukleové kyseliny, se podaný «··· *4 materiál titruje pro dosažení požadované terapeutické odpovědi. Je třeba si uvědomit, že peptidy a přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být použity u vážných onemocnění, tj. v život ohrožujících nebo potenciálně život ohrožujících situacích. V takových případech, při minimalizaci cizorodých substancí v prostředku podle předkládaného vynálezu a například při relativně netoxickém charakteru peptidů, je možné a může být žádoucí podat významně vyšších dávek těchto přípravků.

Pro terapeutické použití by mělo být podávání zahájeno při prvních příznacích infekce nebo při detekci nebo chirurgickém odstranění nádoru, nebo krátce po diagnose v případě akutní infekce. Potom se podávají dosycovací dávky do té doby, než dojde alespoň ke zlepšení příznaků a po určitou dobu poté. U chronických infekcí mohou být nutné iniciální dávky a dosycovací dávky.

Léčba infikovaných jedinců prostředky podle předkládaného vynálezu může vést k vymizení infekce u akutně infikovaných jedinců. Pro jedince citlivé (nebo predisponované) ke vzniku chronické infekce jsou prostředky zejména výhodné ve způsobech určených pro zabránění vzniku chronické infekce z akutní infekce. Když jsou citliví jedinci identifikováni před nebo během infekce, mohou být tyto prostředky podávány těmto jedincům za minimalizace potřeby podávání prostředků větší populaci.

Peptidové prostředky mohou být také použity pro léčbu chronických infekcí a pro stimulaci imunitního systému například k buňkám infikovaným virem u nosičů. Je významné podat takovou dávku imuno-potenciačního peptidu a zvolit takový způsob podání, aby bylo dosaženo efektivní stimulace toto·· ···· «· ·· reakce cytotoxických T-lymfocytů. Pro léčbu chronické infekce tedy mohou být nutné imunizačni dávky následované dosycovacimi dávkami v daných intervalech, například od jednoho do čtyř týdnů, někdy i dlouhodobě, aby bylo dosaženo účilhé imunizace jedince. V případě chronických infekcí by aplikace měly pokračovat alespoň do té doby, než klinické příznaky nebo laboratorní testy ukáží, že byla infekce eliminována nebo alespoň významně zlepšena a po určitou dobu potom.

Farmaceutické prostředky pro terapeutickou léčbu jsou určené pro parenterální, lokální nebo orální podání. Peptidy podle· předkládaného vynálezu mohou být podány ve formě nukleové kyseliny, která kóduje peptidy. Výhodně jsou farmaceutické prostředky podány parenterálně, například intravenosně, podkožně, intradermálně nebo intramuskulárně.

Tak předkládaný vynález poskytuje prostředky pro parenterální podání, které obsahují roztok imunogenních peptidů rozpuštěných nebo suspendovaných v přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou být použity různé nosiče, například voda, pufrovaná voda, 0,8% salinický roztok, 0,3% glycin, kyselina hyaluronová a podobně. Tyto prostředky mohou být sterilizované běžnými, dobře známými sterilizačními technikami, nebo mohou být sterilně přefiltrovány. Získané vodné roztoky mohou být baleny pro použití jako takové, nebo mohou- být lyofilizovány, kde lyofilizované prostředky jsou smíseny se sterilním roztokem před použitím. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance, například pro úpravu na fyziologické podmínky, jako jsou činidla upravující pH a pufrovací činidla, činidla upravující tonicitu, smáčivá činidla a podobně, například octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorbitan-monolaurát, triethanolamin-oleát, atd.

• ··

Koncentrace CTL stimulačních peptidů podle předkládaného vynálezu ve farmaceutických prostředcích může být různá, tj. od nižší než přibližně 0,1%, obvykle alespoň přibližně 2%, až do 20% až 50% nebo více (hmotnostní %), a bude určena primárně objemem kapalin, viskozitou, atd., podle vybraného způsobu podání. Dávková jednotka peptidového prostředku pro člověka je obvykle obsažena ve farmaceutickém prostředku, který obsahuje dávkovou jednotku pro člověka a přijatelný nosič, výhodně vodný nosič, a je podána v objemu kapaliny, který se obvykle používá pro podání takových prostředků člověku.

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také podány v liposomech, které slouží pro přenos peptidů do požadovaných tkání, jako je lymfatická tkáň, nebo pro cílené dopravení peptidů do infikovaných buněk, stejně jako pro zvýšení poločasu peptidového prostředku. Liposomy mohou být ve formě emulzí, pěn, micel, nerozpustných monovrstev, kapalných krystalů, fosfolipidové disperze, lamelárních vrstev a podobně. V těchto prostředcích je peptid, který má být podán, inkorporován do liposomu, samostatně nebo společně s molekulou, která se váže - například - na receptor převažující na lymfoidních buňkách, jako jsou například monoklonální protilátky, které se váží na CD45 antigen, nebo s jinou terapeutickou nebo imunogenní kompozicí. Tak mohou být liposomy, buď obsahující uvnitř nebo na povrchu požadovaný peptid podle předkládaného vynálezu, směrovány k lymfoidním buňkám, kam liposomy tak přenáší vybrané terapeutické/ imunogenní peptidové prostředky. Liposomy pro použití v předkládaném vynálezu jsou tvořeny ze standardních lipidů vytvářejících vesíkuly, které jsou obvykle tvořeny neutrálními a negativně nabitými fosfolipidy a steroly, jako je cholesterol. Výběr lipidů se obvykle řídí například velikostí liposomu, labilitou vůči kyselinám a stability • ·· · ·« «« • · · φ · « • t < «· liposomů v krevním řečišti. Existují různé způsoby pro přípravu liposomů, a jsou popsány, například v Szoka, et al.,

Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), U.S. patenty č.

4235871, 4501728, 4837028, a 5019369.

Pro směrování k buňkám imunitního systému může být ligandem, který je inkorporován do liposomů, například protilátka nebo její fragmenty specifické pro buněčné povrchové determinanty požadované buňky imunitního systému. Suspenze liposomů obsahující peptid může být podána intravenosne, lokálně atd., v dávce, která závisí mimo jiné na způsobu podání, podávaném peptidu a stadiu léčeného onemocnění.

Pro pevné prostředky mohou být použity běžné netoxické pevné nosiče, jako je například manitol, laktosa, škrob, magnesiumstearát, sacharin sodný, talek, celulosa, glukosa, sacharosa, uhličitan hořečnatý a podobně, vše farmaceutické čistoty. Pro orální podání se farmaceuticky přijatelný netoxický prostředek připraví smísením obvykle používaných přísad, jako jsou výše uvedené nosiče, a 10 až 95 % aktivní složky, tj. jednoho nebo více peptidů podle předkládaného vynálezu, výhodněji v koncentraci 25 % až 75 %.

Pro aerosolové podání jsou imunogenní peptidy výhodně podány v jemně dělené formě, společně se surfaktantem a hnacím plynem. Obvyklé procento peptidů je 0,01 až 20 % hmot., výhodně 1 až 10 %. Surfaktant musí být samozřejmě netoxický a výhodně je rozpustný v hnacím plynu. Příklady takových činidel jsou estery nebo částečné estery mastných kyselin obsahujících od 6 do 22 atomů uhlíku, jako jsou kyseliny kapronová, oktanová, laurová, palmitová, stearová, linolová, linolenová, olesterová a olejová s alifatickým polyhydrickým alkoholem • * * • · nebo jeho cyklickým anhydridem. Směsné estery, jako jsou směsné nebo přirozené glyceridy, mohou být také použity. Surfaktant může tvořit 0,l%-20% hmotnostních prostředku, výhodně 0,25-5%. Zbytek kompozice tvoři hnací plyn. Může být použit také nosič, pokud je to žádoucí, například lecitin, který je vhodný při intranasáiním podání.

V souladu s tím je jeden aspekt předkládaného vynálezu zaměřen na vakcíny, které obsahují jako aktivní složku ímunogenně účinné množství imunogenního peptidů podle předkládaného vynálezu. Peptidy mohou být také podány ve formě nukleových kyselin kódujících peptid podle předkládaného vynálezu po expresi u příjemce. Peptid může být vložen do hostitele, včetně člověka, navázaný na svůj vlastní nosič nebo jako homopolymer nebo heteropolymer aktivních peptidových jednotek. Takový polymer má výhodu vyšší imunologické reakce a - když jsou pro přípravu polymeru použity různé peptidy další schopnosti indukovat protilátky a/nebo CTL, které reagují s různými antigenními determinantami viru nebo nádorových buněk. Mezi použitelné nosiče, dobře známé v oboru, patří například thyroglobulin, albuminy jako jsou lidský sérový albumin, tetanický toxoid, polyaminokyseliny, jako je póly(lysin:kyselina glutamová), influenza, jaderný protein viru hepatitidy B, rekombinantní vakcíny proti hepatitidě B a podobně. Vakcíny mohou také obsahovat fyziologicky tolerovatelná ředidla, jako je voda, fosfátem pufrovaný salinický roztok nebo salinický roztok, a dále typicky obsahují adjuvans. Materiály, jako je inkompletní Freundovo adjuvans, fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, nebo kamenec jsou materiály známými v oboru jako adjuvans. A jak bylo uvedeno výše, mohou být CTL reakce indukovány konjugováním peptidů podle předkládaného vynálezu na lipidy, jako je P3CSS. Po imunizací peptidovým prostředkem podle předkládaného * ·· v 4 * 4 • * · »44 »·4· 4« 4« *

4 ·

4« ·· vynálezu, například injekcí, aerosolem, orálně, transdermálně nebo jinak, produkuje imunitní systém hostitele velká množství CTL specifických pro výše uvedený požadovaný antigen, a jedinec se stává alespoň částečně imunním vůči pozdější infekci, nebo resistentní ke vzniku chronické infekce.

V některých případech může být žádoucí kombinovat peptidové vakcíny podle předkládaného vynálezu s vakcínami, které indukují tvorbu neutralizačních protilátek k danému viru, zejména k antigenům obalu viru.

Pro terapeutické nebo imunizační účely mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu podávány ve formě nukleové kyseliny kódující jeden nebo více peptidů podle předkládaného vynálezu. Nukleové kyseliny mohou kódovat peptid podle předkládaného vynálezu a volitelně jednu nebo více dalších molekul. Pro podání nukleových kyselin pacientům se používá mnoho metod. Například může být nukleová kyselina podána přímo, ve formě holé DNA. Tento postup je popsán například ve Wolff, et al·., Science 247: 1465-1468 (1990), a v U.S. patentech č. 5580859 a 5589466. Nukleové kyseliny mohou být také podány pomocí balistického podání, jak je popsáno například v U.S. Patentu č. 5204253. Mohou být podány částice skládající se pouze z DNA. Alternativně může být DNA adherována na částice, jako jsou částice zlata.

Nukleové kyseliny mohou být také podány v komplexu s kationtovými sloučeninami, jako jsou kationtové lipidy. Způsoby podání genů pomocí lipidů jsou popsány například ve WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); Rose U.S. Pat č. 5279833; WO 91/06309; a Felgner, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:

7413-7414 (1987).

•44 · · * · 4 4

4 4 »44 4444

4444 44 44 4 »4 44

Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také exprimovány atenuovanými virovými hostiteli, jako jsou virus vaccinia nebo kravských neštovic. Tento způsob zahrnuje použití viru vakcinie jako vektoru pro expresi nukleotidových sekvencí kódujících peptidy podle předkládaného vynálezu. Po vložení do akutně nebo chronicky infikovaných hostitelských buněk nebo do neinfikovaného hostitele exprimuje rekombinantní virus vakcinie imunogenní peptid a tím indukuje CTL reakci u jedince. Vakciniové vektory a způsoby jejich použití v imunizačních protokolech jsou popsány například v U.S. patentu č. 4722848. Jiným vektorem je BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG vektory jsou popsány například v Stover, et al. {Nátuře 351:456-460(1991)). Odborníkům v oboru budou známé další vektory vhodné pro terapeutické podání nebo imunizaci peptidy podle předkládaného vynálezu, například vektory Salmonella typhi a podobně.

Výhodným prostředkem pro podání nukleové kyseliny kódující peptidy podle předkládaného vynálezu jsou minigenové konstrukty kódující více epitopů podle předkládaného vynálezu, případně s dalšími molekulami. Pro vytvoření DNA sekvence kódující vybrané CTL epitopy (minigenu) pro expresi v lidských buňkách se aminokyselinové sekvence epitopů mohou například reversně translatovat. Pro výběr kodonu pro každou aminokyselinu je použita tabulka používaných lidských kodonů. Tyto epitop-kódující DNA sekvence jsou přímo spojeny, čímž se získá molekula, která kóduje souvislou polypeptidovou sekvenci. Volitelně mohou být do minigenu zapracovány další elementy, za účelem optimalizace exprese a/nebo imunogenicity. Příklady aminokyselinových sekvencí, které mohou být reverzně translatovány a obsaženy v minigenové sekvenci, jsou: epitopy pro pomocné T lymfocyty, vedoucí (signální) sekvence a

I « « *

I ' l « « λ « « ti 4 «· · * retenční signál pro endoplasmatické retikulum. Dále může být MHC prezentace CTL epitopů zlepšena obsažením syntetických (například poly-alaninových) nebo přirozených sekvencí sousedících s CTL epitopy.

Minigenová sekvence se konvertuje na DNA sestavením oligonukleotidů, které kódují plus a minus řetězce minigenu. Překrývající se oligonukleotidy (délky 30-100 baží) se syntetizují, fosforylují se, přečistí se a tepelně se zpracují za vhodných podmínek za použití dobře známých technik. Konce oligonukleotidů se spojí za použití T4 DNA ligasy. Tento syntetický minigen, kódující polypeptid složený z CTL epitopů, se může klonovat do požadovaného expresního vektoru.

Vektor obvykle obsahuje standardní regulační sekvence známé odborníkům v oboru, pro zajištění exprese v cílových buňkách.

Je nutné použít několik vektorových elementů: promotor s následným klonovacím místem pro inserci minigenu;

polyadenylační signál pro účinné ukončení transkripce; E. coli sekvenci rozpoznávající počátek replikace; a E. coli selektovatelný markér (například gen pro resistenci na ampicilin nebo kanamycin). Pro tento účel mohou být použity různé promotory, například lidský cytomegalovirový (hCMV) promotor. Viz U.S. patenty č. 5580859 a 5589466, které uvádějí další vhodné promotorové sekvence.

Pro optimalizaci exprese minigenu a imunogenicity mohou být žádoucí další modifikace vektoru. V některých případech jsou pro účinnou expresi genu nutné introny a do transkribovaného regionu minigenu může být vložen jeden nebo více syntetických nebo přirozeně se vyskytujících intronů. Lze také zvážit použití mRNA stabilizačních sekvencí pro zvýšení exprese minigenu. Nedávno bylo zjištěno, že imunostimulační sekvence * »· · * * • · · ·«»· « • ♦ · · »· ·« (ISS nebo CpG) mají význam pro imunogenicitu DNA vakcín. Tyto sekvence mohou být obsaženy ve vektoru, mimo kódující sekvenci minigenu, pokud se zjistí, že zvyšují imunogenicitu.

V některých provedeních může být použit bicistronický expresní vektor, který umožňuje produkci epitopů kódovaných minigenem, a druhý protein pro zvýšení nebo snížení imunogenicity. Příklady proteinů nebo polypeptidů, které mohou zesilovat imunitní reakci, když jsou exprimovány současně, jsou cytokiny (například IL2, IL12, GM-CSF), molekuly indukující cytokiny (například LelF) nebo kostimulační molekuly. Dále, když jsou použity epitopy pro pomocné T lymfocyty (HTL), mohou být HTL epitopy navázány na intracelulární cílící signály a exprimovány separátně od CTL epitopů. Toto umožňuje nasměrování HTL epitopů do jiného kompartmentů než CTL epitopy. Toto může usnadnit vstup HTL epitopů do dráhy MHC třídy II, což usnadní a zlepší indukci CTL. Oproti indukci CTL může být v některých případech výhodné specifické snížení imunitní reakce současnou expresí imunosupresivních molekul (například TGF-β).

Po výběru expresního vektoru se minigen klonuje do polylinkerového regionu za promotorem. Plasmid se potom transformuje do vhodného kmene E. coli a DNA se připraví za použití standardních technik. Orientace a DNA sekvence minigenu, stejně jako jiných elementů obsažených ve vektoru, se potvrdí za použití restrikčního mapování a analýzy DNA sekvence. Bakteriální buňky nesoucí správný plasmid se mohou uložit do vzorové buněčné banky a do pracovní buněčné banky.

Terapeutická množství plasmidové DNA se produkují, například fermentací E. coli, po které následuje přečištění. Alikvoty z buněčné banky se použijí pro naočkování

4441 94

4 44 44 fermentačního media (jako je Terrific Broth), a provede se kultivace do nasycení v baňce za třepání nebo v bioreaktoru, za použití dobře známých technik. Plasmidová DNA může být přečištěna za použití standardních bioseparačních technik, jako například za použití pevné aniontové iontoměničové pryskyřice od Quiagen. Pokud je to žádoucí, může být superšroubovice DNA izolována z otevřených cirkulárních a lineárních forem za použití gelové elektroforesy nebo jiných metod.

Přečištěná plasmidová DNA může být připravena pro injekce za použití různých prostředků. Nej jednodušším způsobem je rekonstituce lyofilizované DNA ve sterilním fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS). Byly popsány různé metody a brzy budou dostupné nové techniky. Jak bylo uvedeno výše, jsou nukleové kyseliny výhodně připraveny s kationtovými lipidy. Dále mohou být také komplexovány na přečištěnou plasmidovou DNA glykolipidy, fusogenní liposomy, peptidy a sloučeniny označované dohromady jako protektivní, interaktivní, nekondenzující (PLNC), za účelem ovlivnění proměnných jako je stabilita, intramuskulární dispergování nebo transport do specifických orgánů nebo buněk.

Senzibilizace cílové buňky může být použita jako funkční test na expresi prezentace minigenem kódovaných CTL epitopů MHC molekulami třídy I. Plasmidová DNA může být vložena do savčí buněčné linie, která je vhodná jako cíl pro standardní test uvolňování chrómu CTL. Použitý způsob transfekce závisí na konečném přípravku. Elektroporace může být použita pro holou DNA, zatímco kationtové lipidy umožňují přímou transfekci in vitro. Ko-transfektován může být plasmid exprimující zelený fluorescentní protein (GFP), což umožní třídění buněk aktivované fluorescencí (FACS). Tyto buňky se • β pak značí chromém 51 a použijí jako cílové buňky pro CTL linie specifické pro epitop. Cytolýza, detekovaná uvolňováním 51Cr, ukazuje na MHC prezentaci CTL epitopů kódovaných minigenem.

a ·« a · ♦ * • · · • a • a a * • a

Imunogenicita in vivo je druhým způsobem funkčního testování minigenových DNA přípravků. DNA produktem mohou být imunizovány transgenní myši exprimující vhodné lidské MHC molekuly. Dávka a způsob podání závisí na přípravku (například IM pro DNA v ΡΒΞ, IP pro komplexy lipid-DNA). 21 dnů po imunizaci se odeberou splenocyty a restimulují se po dobu 1 týdne za přítomnosti peptidů kódujících každý testovaný epitop. Tyto efektorové buňky (CTL) se testují na cytolýzu cílových buněk obsahujících peptid značených chromém 51 za použití standardních technik. Lýza cílových buněk senzibilizovaných MHC s peptidy odpovídajícími epitopům kódovaným minigenem demonstruje funkci DNA vakcíny v in vivo indukci CTL.

Transgenní zvířata vhodných haplotypů mohou být dalším užitečným nástrojem pro optimalizaci imunogenicity minigenové DNA in vivo. Dále mohou být použita zvířata, jako jsou opice, mající konzervované HLA molekuly se zkříženou reaktivitou k CTL epitopům rozpoznávaným lidskými MHC molekulami, pro stanovení imunogenicity CTL epitopů člověka (Bertoni, et al.,

J. Immunol. 161:4447-4455 (1998)).

Takové pokusy in vivo jsou nutné pro vyřešení různých proměnných zásadních pro vývoj vakcíny, které nejsou snadno hodnotitelné v testech in vitro, jako je způsob podání, formulování vakcíny, tkáňová biodistribuce, a zahrnutí primárních a sekundárních lymfatických orgánů. Vzhledem k jednoduchosti a flexibilitě jsou HLA transgenní myši atraktivní alternativou, alespoň pro prvotní testy vývoje • · • t ···· ·· vakcíny, k obtížným a nákladným testům na vyšších zvířatech, jako jsou primáti.

Antigenní peptidy mohou být použity také pro indukci CTL ex vivo. Získané CTL mohou být použity pro léčbu chronických infekcí (například virových nebo bakteriálních) nebo nádorů u pacientů, kteří nereagují na běžnou terapii, nebo nereagují na terapii peptidovou vakcínou. Ex vivo CTL reakce na určitý patogen (infekční agens nebo nádorový antigen) jsou indukovány inkubací prekursorových buněk CTL (CTLp) od pacienta ve tkáňové kultuře společně se zdrojem buněk prezentujících antigen (APC) a vhodným imunogenním peptidem. Po vhodné inkubaČní době (obvykle 1-4 týdny), během které se CTLP aktivují a dozrají a expandují do efektorových CTL, se buňky infusí podají zpět pacientovi, kde budou ničit svůj specifický cíl (infikované buňky nebo nádorové buňky).

Peptidy mohou být také použity jako diagnostická činidla. Například mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro určení citlivosti konkrétního jedince na léčebný režim, který využívá peptid nebo příbuzné peptidy, a tak může být použitelný pro modifikaci existujících terapeutických protokolů nebo v určení prognosy pro postiženého jedince.

Například může být peptid podle předkládaného vynálezu použit v tetramerovém barvícím testu pro hodnocení mononukleárních buněk periferní krve na přítomnost CTL specifických pro antigen po kontaktu s patogenem nebo imunogenem. Komplex HLA-tetramer se použije přímo pro vizualizaci CTL specifických pro antigen (viz například Ogg, et al. Science 279:2103-2106, 1998; a Altman, et al. Science 174:94-96, 1996) a pro určení frekvence antigen-specifických CTL ve vzorku mononukleárních buněk periferní krve.

• * « »· « « * »· 99

Tetramerové činidlo múze být za použití peptidů podle předkládaného vynálezu připraveno následujícím způsobem: peptid, který se váže na HLA molekul nebo supertyp molekuly specifickou pro antigen se skládá za přítomnosti příslušných HLA těžkých řetězců a p2-mikroglobulinu za vzniku trimolekulárního komplexu. Komplex se biotinyluje na karboxykonci těžkého řetězce v místě, které bylo dříve zapracováno do proteinu. Tvorba tetrameru se potom indukuje přidáním streptavidinu. Díky fluorescentně značenému streptavidinu se tetramer může použít pro barvení buněk specifických pro antigen. Buňky mohou být identifikovány například průtokovou cytometrií. Taková analýza může být použita pro diagnostické nebo terapeutické účely.

Dále mohou být peptidy také použity pro stanovení toho, kteří jedinci mají vyšší riziko vzniku chronické infekce.

Předkládaný vynález se vztahuje k U.S. přihlášce č. 08/589,108, podané 23.1.1996 a nyní opuštěné, a U.S. přihlášce č. 08/205,713 podané 3.4.1994, která je pokračováním U.S. přihlášky č. 08/159,184, podané 29.11.1993 a nyní opuštěné, která je částečným pokračováním U.S. přihlášky č. 08/073,205 podané 4.6.1993 a nyní opuštěné, která je částečným pokračováním U.S. přihlášky č. 08/027,146 podané 5.3.1993 a nyní opuštěné. Přihláška také se také vztahuje k U.S. přihlášce č. 60/013,980 podané 21.3.1996 a nyní opuštěné, U.S. přihlášce č. 08/454,033 podané 26.5.1995, U.S. přihlášce č. 08/349,177 podané 2.12.1994, a U.S. přihlášce č. 08/753,622 podané 27.1.1996 a nyní opuštěné. Každá z výše uvedených přihlášek je zde uvedena jako odkaz.

9« · 9 949 • · 9 9 9 4 9 9 9 9 · • « · 9·· 9 9 · 9 «9*99« ·· 9 9« 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Peptidy

Použité peptidy se syntetizovaly způsobem popsaným v Ruppert, J. et al., Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2.1 Molecules, Cell 74:929-937 (1993), nebo byly zakoupen jako surový materiál od Chiron Mimotopes (Chiron Corp., Australia). Syntetizované peptidy byly obvykle přečištěny na >95% homogenitu HPLC s reverzní fází. Čistota syntetizovaných peptidů byla stanovena za použití analytické HPLC s reverzní fází a aminokyselinové analýzy, sekvenování a/nebo hmotnostní spektrometrie. Lyofilizované peptidy se resuspendovaly v koncentraci 4-20 mg/ml v 100% DMSO a potom se naředily na požadované koncentrace v PBS+0,05% (obj./obj.) NP40 (Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland).

Příklad 2: Přečištění MHC

EBV transformované buněčné linie JY (A*0201), M7B (A*0202), FUN (A*0203), DAH (A*0205), CLA (A*0206), KNE (A*0207), AP (A*0207) a AMAI (A*6802) se použily jako primární zdroj MHC molekul. Jednou MHC alelou transfektované 721.221 linie se také použily jako zdroje A*0202 a A*0207. Buňky se kultivovaly in vitro v RPMI 1640 mediu (Flow Laboratories, McLean, VA), doplněném 2 mM L-glutaminem (GIBCO, Grand Island, NY), 100 U (100 pg/ml) roztoku penicilin-streptomycin (GIBCO) a 10% teplem-inaktivovaným FCS (Hazelton Biologics). Velkoobjemové kultury se kultivovaly ve válcových baňkách. HLA molekuly se přečistily z buněčných lyzátů (Sidney, J., et al., The Measurement of MHC/Peptide Interactions by Gel Infiltration, • » · * » · • ·· · · • 9 · · · 4 • ♦ · ♦ « ·»·» «» 94 • · · · * * · 4 • ♦ « · « • * · · · • ·· ··

Curr Prot Immunol 18.3.1-18.3.19 (1998)). Stručně, buňky se lyžovaly při koncentraci 10 buněk/ml v 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, obsahujícím 1% (obj./obj.) NP-40, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA a 2 mM PMSF. Lyzáty se potom nechaly projít přes 0,45 pM filtry, očistily se od jader a drtě odstředěním při 10000 x g na 20 minut a MHC molekuly se přečistily afinitní chromatografií na bázi monoklonální protilátky.

Pro afinitní přečištění se kolony inaktivované Sepharose CL4B a Protein A Sepharose použily jako před-kolony. Molekuly třídy I se zachycovaly opakovaným průchodem přes Protein A Sepharosové korálky konjugované s anti-HLA (A, B, C) protilátkou W6/32 (Sidney, J., et al., supra). HLA-A molekuly se dále přečistily od HLA-B a -C molekul průchodem přes Bl.23.2 kolonu. Po 2 až 4 kolech se W6/32 kolona promyla 10 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 s 1% (obj./obj.) NP-40, 2 objemy kolony PBS, a 2 objemy kolony PBS obsahujícím 0,4% (hmot./obj.) n-oktylglukosidu. Molekuly třídy I se eluovaly 50 mM dimethylaminem v 0,15 M NaCl obsahujícím 0,4% (hmot./obj.) n-oktylglukosidu, pH 11,5. 1/26 objemu 2,0 M Tris, pH 6,8, se přidala k eluátu pro redukci pH na ~8,0. Eluát se potom zahustil odstředěním na Centriprep 30 odstředivkách při 2000 rpm (Amicon, Beverly, MA). čistota proteinu, koncentrace a účinnost deplečních kroků se sledovaly SDS-PAGE a BCA testy.

Příklad 3: Vazebné testy pro peptid

Kvantitativní testy pro měření vazby peptidů na solubilní molekuly třídy I jsou založeny na inhibici vazby radioaktivně značeného standardního peptidů. Tyto testy jsou prováděny způsobem popsaným dříve (Sidney, J., et al., výše). Stručně, 1-10 nM radioaktivně značeného peptidů se inkubuje současně s 1 pM až 1 nM přečištěného MHC za přítomnosti lidského β₂ • ’··* · · ·' · · ♦’ * ! · ··· ···· »··· ·» ·· · ·· ·· mikroglobulinu (Scripps Laboratories, San Diego, CA) a směsy inhibitorů proteas. Po dvoudenní inkubaci se procento radioaktivity navázané na MHC určilo gelovou filtrační chromatografií s vylučováním podle velikosti za použití TSK 2000 kolony. Alternativně se procento radioaktivity navázané na MHC určilo zachycením komplexů MHC/peptid na plotnách potažených W6/32 protilátkou, a stanovením cpm vazby za použiti TopCount mikroscintilační kamery (Packard Instrument Co., Meriden, CT) (Southwood, et al., Epimmune Technical Report Epi 063-99).

Radioaktivně značený standardní peptid použitý pro testování A+0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*02G6 a A*0207 byl F₆ > Y analog HBV jaderného 18-27 epitopu (sekvence

FLPSDYFPSV). Průměrná IC₅₀ tohoto peptidu pro každou molekulu byla 5,0, 4,3, 10, 4,3, 3,7 a 23 nM, v příslušném pořadí. C₄ >

A analog HBV pol 646 (sekvence FTQAGYPAL), nebo MÁGE 1 282 (sekvence YVIKVSARV), se požily jako značené sloučeniny pro A*6802 test. Jejich IC₅₀ pro A*68O2 byly 40 a 8 nM, v příslušném pořadí.

V případě kompetitivních testů se vypočetla koncentrace peptidu způsobující 50% inhibici vazby radioaktivně značeného peptidu. Peptidy se nejprve testovaly v jedné nebo dvou vysokých dávkách. ICs₀ peptidů vedoucí k pozitivní inhibici se potom určily v dalších pokusech, ve kterých s testovalo dvě až šest dalších ředění. Za použitých podmínek, kde [značená sloučenina]< (MHC] a IC₅₀ > [MHC] jsou změřené hodnoty IC₅o odpovídajícím přiblížením skutečným hodnotám Kd. Každý kompetitorový peptid byl testován ve dvou až čtyřech pokusech. Jako pozitivní kontrola se v každém pokusu také testovala neznačená verze radioaktivně značené substance.

• 4

444· ·* •4 4 4· *4

Příklad 4: Alternativa vazebného testu

Virem Epstein-Barrové (EBV)-transformovaní homozygotní buněčné linie, fibroblasty, CIR, nebo 721.22 transfektanty, se použily jako zdroje HLA molekul třídy I. Tyto buňky se kultivovaly in vitro v RPMI 1640 mediu doplněném 2mM Lglutaminu (GLBCO, Grand Island, NY), 50 μΜ 2-ME, 100 μg/ml streptomycinu, 100 U/ml penicilinu (Irvine Scientific) a 10% teplem-inaktivovaným FCS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Buňky se kultivovaly ve tkáňových kultivačních baňkách o objemu 225-cm² nebo pro velkoobjemové kultury se kultivovaly ve válcových baňkách. Buňky se odebraly odstředěním při 1500 RPM za použití IEC-CRU5000 odstředivky s 259 rotorem a promyly se třikrát fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS)(0,01 M P0₄, 0,154 M NaCl, pH 7,2) .

Buňky se peletovaly a uskladnily se při -70°C nebo se zpracovaly detergentním lyzačním roztokem pro přípravu lyzátů. Buněčné lyzáty se připravily přidáním zásobního detergentního roztoku (1% NP-40 (Sigma) nebo Renex 30 (Accurate Chem. Sci. Corp., Westbury, NY 11590), 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0] k buněčným peletám (dříve spočítaným) v poměru 50-100 x 10⁶buněk na ml detergentního roztoku. Směs inhibitorů proteas se přidala k předem odměřenému objemu zásobního detergentního roztoku bezprostředně před přidáním buněčné pelety. Přidání inhibiční směsi produkovalo následující konečné koncentrace: fenylmethylsulfonylfluoríd (PMSF), 2 mM; aprotinin, 5 μg/ml; leupeptin, 10 μ9/ιη1; pepstatin, 10 μg/ml; jodacetamid, 100 μΜ; a EDTA, 3 ng/ml. Buněčné lyzáty se 1 hodinu mísily při teplotě 4°C. Obvykle se 5-10xl0⁹ buněk lyžovalo v 50-100 ml detergentního roztoku. Lyzát se pročistil odstředěním při 15000 x g po dobu 30 minut při 4°C a potom se supernatantová φ ·· • · φ φ · φ

ΦΦΦ φ φφ φφ · frakce nechala projít přes 0,2 μ filtrační jednotku (Nalgene).

Přečištění HLA-A antigenů se provedlo za použití afínitních kolon připravených s mAb-konjugovanými Sepharosovými korálky. Pro produkci protilátek se buňky kultivovaly v RPMI s 10% FBS ve velkých tkáňových kultivačních baňkách (Corning 25 160225), Protilátky se přečistily z předpřečištěného tkáňového kultivačního media za použití frakcionace síranem amonným, po které následovala afinitní chromatografie na protein-ASepharose (Sigma)'. Stručně, nasycený síran amonný se pomalu přidával za míšení do supernatantu tkáňové kultury do koncentrace 45% (obj./obj.) přes noc při 4°C pro vysrážení imunoglobulinů. Vysrážené proteiny se odebraly odstředěním při 10000 x g po dobu 30 minut. Sraženina se potom rozpustila v minimálním objemu ΡΒΞ a přenesla se do dialyzačních trubiček (SpectrofPor 2, Mol. Hranice molekulové hmot. = 12000-14000, Spectum Medical Ind.). Dialýza se provedla proti PBS (> 20násobek objemu roztoku proteinu) s 4-6 výměnami dialyzačního pufru během 24-48 hodinové periody při 4°C. Dialyzovaný proteinový roztok se pročistil odstředěním (10000 x g po dobu 30 minut) a pH roztoku se upravilo na pH 8,0 pomocí IN NaOH. Protein-A-Sepharosa (Sigma) se hydratovala podle návodu výrobce a připravila se protein-A-Sepharosová kolona. Kolona s objemem lože 10 ml obvykle váže 50-100 mg myšího IgG.

Vzorek proteinu se vnesl do protein-A-Sepharosové kolony za použití peristaltické pumpy pro vnesení velkých objemů nebo spádu pro menší objemy (<100 ml). Kolona se promyla několika objemy PBS a eluát se sledoval při A280 ve spektrofotometru do té doby, než bylo dosaženo základní hladiny. Navázaná protilátka se eluovala za použití 0,1 M kyseliny citrónové při vhodném pH (upravené pomocí IN NaOH). Pro myší IgG-1 se použilo pH 6,5, pro IgG2a pH 4,5 a pro IgG2b a IgG3 pH 3,0. 2 ·«· · ·4

Μ Tris baze se použily pro neutralizaci eluátu. Frakce obsahující protilátku (sledované A280) se smísily, dialyzovaly se proti PBS a dále se zahustily za použití Amicon Stirred

Cell systému (Amicon Model 8050 s YM30 membránou). Anti-A2 mAb, BB7.2, se použila pro afinitní přečištění.

HLA-A antigen se přečistil za použití afinitních kolon připravených s mAb-konjugovanými Sepharosovými korálky.

Afinitní kolony se připravily inkubací protein-A-Sepharosových korálků (Sigma) s afinitne přečištěnými mAb, jak bylo popsáno výše. 5 až 10 mg mAb na ml korálků je výhodný poměr. Korálky s navázanou mAb se promyly boritanovým pufrem (boritanový pufr: 100 mM tetraborítanu sodného, 154 mM NaCl, pH 8,2) tak, aby výplach vykazoval při základním křivce A280. Dimethylpimelímidát (20 mM) v 200 mM triethanolaminu se přidal pro kovalentní zesítění navázaných mAb na protein-A-Sepharosu (Schneider, et al., J. Biol. Chem. 257:10766 (1982). Po inkubaci po dobu 45 minut při teplotě místnosti na rotačce se nadbytek zesíťovacího činidla odstranil promytím korálků dvakrát 10-20 ml 20 mM ethanolaminu, pH 8,2. Mezi tím se každá kaše umístila na rotačku na dobu 5 minut při teplotě místnosti. Korálky se promyly boritanovým pufrem a PBS plus 0,02% azidem sodným.

Buněčný lyzát (5-10 x 10⁹ buněčných ekvivalentů) se potom pomalu nechal projít přes 5-10 ml afinitní kolonu (průtok 0,ΙΟ, 25 ml za minutu) pro umožnění vazby antigenu na imobilizovanou protilátku. Poté, co se lyzát nechal projít skrz kolonu se kolona promyla postupně 20 objemy kolony detergentního zásobního roztoku plus 0,1% dodecyl-síranu sodného, 20 objemy kolony 0,5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, a 10 objemy kolony 20 mM Tris, pH 8,0. HLA-A antigen navázaný na mAb se eluoval bazickým pufrovacím roztokem (50 mM • ·· dimethylamin ve vodě). Alternativně mohou být roztoky kyselin, jako je 0,15-0,25 M kyselina octová, také použity pro eluci navázaného antigenu. Podíl eluátu (1/50) se odebral pro kvantifikaci proteinu za použití buď kolorimetrického testu (BCA test, Píerce) nebo SDS-PAGE, nebo obou. SDS-PAGE analýza se provedla způsobem popsaným v Laemmli (Laemmli, U.K., Nátuře 227:680 (1970)) za použití známých množství hovězího sérového albuminu (Sigma) jako proteinového standardu. Protilátky specifické pro alelu se použily pro přečištění specifické MHC molekuly. V případě HLA-A2 se použila mAb BB7.2.

Podrobný popis protokolu pro měření vazby peptidů na HLA molekuly třídy I byl již publikován (Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813, 1994; Sidney, et al., v Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., John Wiley & Sons, New York,

Section 18.3, 1998). Stručně, přečištěné MHC molekuly (5 až 500 nM) se inkubovaly s různými neznačenými peptidovými inhibitory a 1-10 nM ¹²⁵I-radioaktivně značenými sondovacími po dobu 48 hodin v PBS obsahujícím 0,05% Nonidet P-40 (NP40) (nebo 20% hmot./obj. digitoninu pro H2-IA testy) za přítomnosti směsi inhibitorů proteas. Konečné koncentrace inhibitorů proteas (od CalBioChem, La Jolla, CA) byly 1 mM PMSF, 1,3 nM 1.10 fenanthrolinu, 73 μΜ pepstatinu A, 8 mM EDTA, 6 mM N-ethylmaleimidu a 200 pM N alfa-p-tosyl-L-lysinchlormethyl-ketonu (TLCK). Všechny testy se provedly při pH 7,0.

Po inkubaci se komplexy MHC-peptid separovaly od volného peptidů gelovou filtrací na 7,8 mm x 15 cm ΤΞΚ200 kolonách (TosoHaas 16215, Montgomeryville, PA), eluovaly se při průtoku 1,2 ml/min PBS, pH 6,5, obsahujícím 0,5% NP40 a 0,1% NaNg. Eluát z TSK kolon se nechal projít skrz Beckman 170 radioizotopový detektor a radioaktivita se zanesla do grafu a • to «••to ·* integrovala se za použití Hewlett-Packard 3396A integrátoru, a určila se frakce navázaného peptidu.

Radioaktivně značené peptidy se jodovaly za použití chloramin-T metody. Specifický radioaktivně značený sondovací peptid se použil v každém testu. Obvykle se v předběžných pokusech každý MHC přípravek titroval za přítomnosti daných množství radioaktivně značených peptidů pro stanovení koncentrace HLA molekul nutné k k vazbě 10-20% celkové radioaktivity. Všechny další testy inhibice a přímé vazby se prováděly za použití těchto HLA koncentrací.

Protože za těchto podmínek [značená substance]< [HLA] a IC50 > [HLA], zjištěné IC₅₀ hodnoty se blíží skutečným KD hodnotám. Peptidové inhibitory se obvykle testovaly v koncentracích od 120 gg/ml do 1,2 ng/ml, a testovaly se ve dvou nebo čtyřech nezávislých pokusech. Pro umožnění srovnání dat získaných v různých pokusech se relativní vazba vypočítala pro každý peptid vydělením IC50pozitivní kontroly pro inhibici, tj. referenčního peptidu, který je použit v každém vazebném testu, IC50 pro každý testovaný peptid (obvykle neznačenou verzi radioaktivně značeného sondovacího peptidu). Pro účely databáze a srovnání mezi pokusy se shrnuly hodnoty relativní vazby. Tyto mohou být potom konvertovány na normalizované hodnoty IC₅₀ v nM vydělením standardních historických IC50 referenčního peptidu relativní vazbou daného peptidu. Tato metoda kompilace dat se ukázala jako nejpřesnější a nej vhodnější pro srovnání peptidů, které byly testovány v různé dny nebo s různými šaržemi přečištěných MHC.

Například, standardní referenční peptid (nebo pozitivní kontrola ) pro HLA-A2.1 vazebný test, který je zde popsán, je peptid mající sekvenci FLPSDYFPSV, který má průměrnou historickou hodnotu IC50 = 5 nM ve více opakovaných vazebných • · • « «4 ·· testech. Tato standardní hodnota se použila pro normalizaci udávané IC₅₀ hodnoty pro HLA-A2.1 vazbu, jak je zde popsána.

Tak může být hodnota relativní vazby testovaného peptidů obsahujícího HLA-A2.1 motiv konvertována na normalizovanou hodnotu IC₅₀ vydělením standardní referenční hodnoty IC50, t.j.

nM, hodnotou relativní vazby testovaného peptidů obsahujícího HLA-A2.1 motiv.

Příklad 5: Analýza sekvence a vazby

Za použití testu popsaného v příkladu 3 se hodnoty relativní vazby vypočetly pro každý peptid vydělením IC50 pozitivní kontroly pro inhibici hodnotou IC₅o pro každý testovaný peptid. Tyto hodnoty mohou být potom konvertovány na hodnoty IC₅₀ nM vydělením IC50 (nM) pozitivních kontrol pro inhibici relativní vazbou požadovaného peptidů. Tato metoda kompilace dat se ukázala jako nejpřesnější a nejvhodnější pro srovnání peptidů, které byly testovány v různé dny nebo s různými šaržemi přečištěných MHC. Standardizované hodnoty relativní vazby také umožňují výpočet geometrického průměru, nebo hodnoty průměrné relativní vazby (ARB) pro všechny peptidy s určitými charakteristikami (Ruppert, J., et al., Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2.1 Molecules, Cell 74:929-937 (1993);

Sidney, J., et al., Definition of an HLA-A3-Like Supermotif Demonstrates the Overlapping Peptide Binding Repertoires of Common HLA Molecules, Hum Immunol. 45:79-93 (1996); Sidney,

J., et al., Specificity and Degeneracy in Peptide Binding to HLA-B7-Like Class I Molecules, J. Immunol. 157:3480-3490 (1996); Kondo, A., et al., Prominent Roles of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A24 Human Class I Molecules, J. Immunol. 155:43074312 (1995); Kondo, A., et al., Two Distinct HLA-A*0101-Specific Submotifs Illustrate * ·«

Alternativě Peptide Binding Modes, Immunogenetics 45:249-258 (1997); Gulukota, K., et al., Twq Complementary Methods for Predictíng Peptides Binding Major Histocompatibility Complex Molecules, J. Mol. Biol. 267:1258-1267 (1997); Southwood, S., et al., Several Common HLA-DR Types Share Largely Overlapping Peptide Binding Repertoires, J. Immunol. 160:3363-3373 (1998)) .

Mapy sekundárních interakcí ovlivňujících vazbu peptidu na molekuly HLA-A2 supertypu na bázi ARB byly připraveny způsobem popsaným dříve (Ruppert, J. et al., Prominent Role of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A2.1 Molecules, Cell 74:929-937 (1993); Sidney, J., et al., Definition of an HLA-A3-Like Supermotif Demonstrates the Overlapping Peptide Binding Repertoires of Common HLA Molecules, Hum Immunol. 45:79-93 (1996); Sidney, J., et al, Specificity and Degeneracy in Peptide Binding to HLA-B7-Like Class I Molecules, J. Immunol. 157:3480-3490 (1996); Kondo, A., et al., Prominent Roles of Secondary Anchor Residues in Peptide Binding to HLA-A24 Human Class I Molecules, J. Immunol. 155:4307-4312 (1995); Kondo, A., et al., Two Distinct HLA-A*0101-Specific Submotifs Illustrate Alternativě Peptide Binding Modes, Immunogenetics 45:249-258 (1997); Gulukota, K., et al., Two Complementary Methods for

Predictíng Peptides Binding Major Histocompatibility Complex Molecules, J. Mol. Biol. 267:1258-1267 (1997)). V podstatě všechny peptidy dané velikosti (8, 9, 10 nebo 11 aminokyselin) a s alespoň jedním tolerovaným hlavním kotevním zbytkem se vybraly pro analýzu. Vazebné kapacity peptidů v každé velikostní skupině se analyzovaly stanovením hodnot ARB pro peptidy, které obsahují specifické aminokyselinové zbytky ve specifických pozicích. Pro určení specificity na hlavních kotevních pozicích se ARB hodnoty standardizovaly na ARB peptidů nesoucích zbytky asociované s nej lepší vazbou. Pro *

444 4 4 stanovení sekundárního ukotvení se hodnoty ARB standardizovaly k ARB pro celou uvažovanou sadu peptidů. To znamená, že hodnota ARB se určila například pro všechny 9-merové peptidy, které obsahují A v pozici 1, nebo F v pozici 7, atd. Vzhledem ke vzácnému výskytu některých aminokyselin se některé analyzované zbytky seskupovaly podle chemické podobnosti, jak je popsáno v literatuře (Ruppert, J. et al., výše; Sidney, J., et al., výše; Sidney, J., et al., výše; Kondo, A., et al., výše; Kondo, A., et al., výše; Gulukota, K., et al., výše; Southwood, S., et al., výše).

Frekvence molekul HLA-A2-Supertypu

Pro selekci panelu molekul A2-supertypu reprezentativních pro alelické formy nejčastější v hlavních etnických skupinách se použila nepublikovaná data typizování populace od D. Mann a M. Fernandez-Vina. Tato data byla v souladu s publikovanými daty (Sudo, T., et al., DNA Typing for HLA Class I Alelles:

I. Subsets of HLA-A2 and of -A28, Hum. Immunol. 33:163-173 (1992); Ellis, J.M., et al., Frequencies of HLA-A2 Alelles in Five US Population Groups, Hum. Immunol. 61:334-340(2000); Krausa, P., et al., Genetic Polymorphism Within

HLA-A*02: Significant Allelic Variation Revealed in Different Populations, Tissue Antigens 45:233-231 (1995) a Imanishi,

T., et al., Alelles and Haplotype Frequencies for HLA and Complement Loci in Various Ethnic Groups Tsuji, K., et al., (eds): HLA 1991, Proceedings of the Eleventh International Histo-Compatibility Workshop and Conference, Vol. 1., Oxford University Press, Oxford, str. 1065-1220(1992)), a jsou uvedena v tabulce 3. Pro čtyři hlavní uvažované etnické skupiny je zjevné, že sedm HLA alel reprezentuje hlavní většinu alel A2 supertypu. Do této skupiny patří A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, A*0207 a A*6802. Každá « ··

V • · ··«· #· ·· · ke * ·· ·· z těchto alel je přítomna u 2% nebo více procent celkové populace a také se vyskytují s frekvencí vyšší než 5% u alespoň jedné hlavní etnické skupiny. Další alely jsou přítomny s frekvencí 1,3% nebo nižší, v jakékoliv hlavní etnické skupině. Dále, žádná z minoritních alel není přítomna s frekvencí vyšší než 1% v celkové populaci. Podle těchto zjištění se A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, A*Q207 a A*680-2 vybraly pro testy pro definování vazebné specificity pro peptidy a zkřížené reaktivity u A2-supertypu.

Hlavní kotevní pozice molekul A2 Supertypu

Předchozí pokusy naznačily značně se překrývající vazebnou specificitu pro peptid pro sadu molekul třídy I označenou jako A2-supertyp. V tomto příkladu jsme hlavní vazebnou specificitu pro peptid pro molekuly A2 supertypu zkoumaly podrobněji. Některé z těchto výsledků byly publikovány dříve a jsou zde uvedeny pouze jako odkazy (Ruppert, J., et a!, výše a Sidney, J., et al., The HLA~A*0207 Peptide Binding Repertoire is Limited to a Subset of the A*0201 Repetoire, Hum. Immunol., 58:12-20(1997)).

V první sérii pokusů se nekonzervativní lysinové (K) substituce vložily do každé pozice dvou peptidů, u kterých bylo dříve uvedeno, že se váží na molekuly A2-supertypu: 1)

HCV NS3 590 9-merového peptidu (sekvence YLVAYQATV), a 2) Fg >

Y 10-merového analogu jaderného peptidu 18 HBV (sekvence FLPSDYFPSV). Tyto peptidy byly testovány na svou kapacitu vazby na A*0201, A*0202, A*0203, A*0205, A*0206, A*0207 a A*6802. V tabulkách 4a a 4b jsou vazebné kapacity vyjádřeny jako poměry relativní k původnímu peptidu. Peptidy, jejichž vazebné kapacity jsou 10-krát nebo více lepší, jsou považovány za výhodné; ty, jejichž vazebné kapacity jsou 10-100-krát • 4 • ·4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 • 4 * 4 4 4

4444 44 44 4

4 4 4

44 horší, jsou považovány za tolerované. Pomlčka označuje relativní vazbu nižší než 0,01. V případě HCV NS3 590 peptidů (Tabulka 4a) vedly K substituce v pozici 2 a na C-konci k vyšší než 100-násobné redukci vazby na každou HLA molekulu. Vyšší než 100-násobné snížení vazby bylo také zaznamenáno pro A*6802, když byl 'K substituován v pozicích 1 a 5. Redukce vazebné kapacity v řádu 10-100-násobném byly zjištěny v několika dalších pozicích, konkrétně v pozicích 3 a 7. Když se testoval 10-merový HBV jaderný 18 Fg>Y ligand (Tabulka 4b), tak byla opět pozorována více než 100-násobná redukce vazebné kapacity, když byl peptid substituován v pozici 2 a na Ckonci. Významné redukce vazby byly také pozorovány po substituci' v pozici 7.

Dohromady tato data naznačují, že molekuly A2-supertypu váží jak 9-, tak 10-merové peptidové ligandy prostřednictvím kotevních zbytků v pozici 2 a na C-konci. Přítomnost dalších primárních nebo sekundárních kotevních zbytků směrem ke středu peptidů je demonstrována skutečností, že vazba 9- a 10merových peptidů byla obvykle redukována substitucemi v pozici 7.

• · • « • Φ ·· ·« «ΦΦ* ··

Tabulka 3: Fenotypové frekvence alel A2-supertypu u čtyř hlavních etnických skupin

Fenotypová frekvence

Aiela	negroidní	Kavkazská¹	Orietální	Hispánská	Průměr
A*0201	22J	45,6	18,1	37,1	30,8
A*6802	12,7		0,0	W	4,7
A*0206	0,0	0,4		6,3	4,0
A*0207	0,0	0,0	11,0	0,0	2,7
A*0205	A²	1,8	O»³	3,0	2,5
A*0203	0,0	0,0	8,8	0,0	2,2
A*0202	6,4	0,0	0,5	1,3	2,0
A*6901	0,0	0,7	0,3	1/3	0,6
A*0211	0,0	0,0	0,0	IP	0,3
A*0212 .	0,0		0,3	0,8	0,3
A*0213	0,0	0,0	0,0	0,4	o,i
A*0214	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Celkem	43,1	48,2	45,0	51,9	47,1

Tabulka 4a HCV NS3 590

Relativní vazebná kapacita

1 2 3 4 5 6 7 8 9	A*020l	A«0202	ΑΌ203	A*O205	A*0206	A*6802
YLVAYQATV	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1»* o
K	0,40.	0,050	.0,31	0,19	0,29	*
K	»		-	-	«ř	*
K	0,53	0,093	0,60	0,63	0,064	0,022
K	0,36	0,19	0,44	1,0	0,41	0,17
K	0,17	0,026	0,30	0,23	0,16	-
K	0,54	0,033	0,27	0,24	0,10	0,060
K	0,054	0,016	0,32	0,14	0,065	0,043
K	0,24	0,13	0,37	0,79	0,14	0,13
K	-	-	-	*	-	-

*· • 4

4 · ·««« 9« • ♦ 9 4

99 *4

Tabulka 4b

HBV jaderný 18 F₆>Y

Sekvence Relativní vazebná kapacita

1 1 3 4 S 6 7 í 9 10	ΑΌ201	A*0202	A*0203	A*0205	A*0206	A*O207	AW2
FLPSDYFPSV	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1/	1,0
K	0/3	0,75	0,72	0,36	V	0,24	-
K		-	-	-	-	-	-
K	0,44	0,39	13	0/7	0,17	•	0/2
K	0,95	0,82	M	0,61	13	1,3	0,43
K	0,60	0,75	12	0,60	0,76	0,85	0,77
K	0,58	0,70	6,8	0,40	0/9	1,8	1.6
K	-	-	0,079	-	-	0,027	-
K	0,25	0/2	63	0,076	0/9	0/5	0,092
K	0,14	0,18	0/1	0,18	0,25	0,14	'0,42
K	-	-	-	-	-	-	-

Specificita kotevních zbytků v pozici 2 a na C-konci

Podle těchto výsledků se specificita molekul A2-supertypu pro ligand v pozici 2 a na C-konci analyzovala za použití dalších HCV NS3 590 a HBV jaderný 18 F$>Y analogů s jednou substitucí, a také za použití poly-alaninových peptidových analogů s jednou substitucí (peptid 953.01; sekvence ALAKAAAAV). Pro tyto analýzy se výhodné aminokyseliny pro kotevní zbytky definovaly jako ty aminokyseliny, které jsou asociované s vazebnou kapacitou v mezích 10-násobku optimálního zbytku. Aminokyseliny, jejichž relativní vazebná kapacita byla mezi 0,01 a 0,1 byly definovány jako tolerované a aminokyseliny, které byly asociované s vazebnou kapacitou nižší než 0,01 byly považovány za netolerované. V tabulkách označuje pomlčka relativní vazbu nižší než 0,01.

, »·· ·

0« 0 · 0 · · 0

0* ζ · 0 0 · 0000 >•0000 ·0 · ·· ··

Vazebné kapacity jsou vyjádřeny jako poměry vzhledem k analogu s nejvyšší vazebnou afinitou pro každou jednotlivou molekulu.

Bylo zjištěno, že v pozici 2 jsou malé alifatické a hydrofobní zbytky obecně tolerovány, zatímco jiné zbytky,včetně velkých polárních, aromatických a nabitých zbytků, nejsou obvykle tolerovány (Tabulky 5a, 5b a 5c). L, I,

V a M byly výhodné jako kotevní zbytky ve většině (>80%) případů (Tabulka 5d). Kombinace alela/peptid v tabulce 5d označují počet případů, ve kterých byl daný zbytek asociován s relativní vazbou v rozmezí 1-0,1 (výhodné) nebo 0,1-0,01 (tolerované). A, T, Q a S byly méně často výhodné jako kotevní zbytky, ale byly buď preferované, nebo tolerované ve >80% testovaných případů. Žádná z dalších testovaných aminokyselin nebyla preferována v jakémkoliv případě nebo byla tolerována pouze vzácně.

Tabulka 5a HCV NS3 590

Relativní vazebná kapacita

Zbytek e	A*0201	A*0202	A*0203	A*0205	A*0206	A*6802
v	0,28	0/8	0/3	0/6	0/3	0/9
T	0/8	0/4	0,11	0,34	0,74	1,0
L	1,0		1,0	0,19	l,e	0,029
I	0,49	0/4	0/4	0,24	0,81	0,045
Q	0,91	0/5	.0,46	1,0	0/7	-
P	-	-	-	-	-	-
K	-	-	-		-	-
F	0/516	•	0,012	-	-	•
D	-	-	-	-	-

• · ···« ·♦ * * e ·· ·

Tabulka 5b

HBV jaderný 18 F₆>Y

Relativní vazebná kapacita

Zbytek ie	A*0201	A*0202	A*0203	A*0205	A*0206	A*0207	A*6802
I	0,18	0,66	0,41	0,82	V»	opi	0p3
L	M	0,46	M	0,79	0p6	1,0	0,088
V	o,oó5		0,10	1,0	0,60	0,10	opi
T	0,013	<ps	0,025	0,25	0,11	•	1,0
Q	0,26	0,049	0,49	0,074	0,15	0,053	-
F	- '	-	0,015	-	-		0,046
D	-	-		-	-	-	-
K	-	*	-	-	-	-	-
P	-	-	-	-	-	-	•

Tabulka 5c

Poly-alaninový peptid ALAKAAAAV

Relativní vazebná kapacita

Zbytek e	A*0201	A*0202	A*0203	A*0205	A*02O6	A*6802
L	M	0,92	0,22	0,77	0,49	0,011
M	0,43	o,*	0,70	0,43	opi	opio
V	0,051	ip	0,40	i,®	!,0	0,68
1	0,063	0,56	M	0,16	0,44	0,073
T	0,025	0,75	0,091	0,20	0,35	1,0
A	0^013	<^26	0,070	0,089	0,075	opi
S	•	0,12	0,023	0,011	0,025	0,057
G	-	0,031	fyOll	-	0,017	-
P	-	-	-	-	-	0,016
c	-	-	-	-	-	-
D	-	-	-	-	-	-
F	-	-	-	-	-	-
K.	-	-	-	-	-	-
N	-	-	-	-	-	-

Φ ··

- » - » » w « φ φ φφφ φφφ φφφ φφφφ φφφφ «Φ Μ « ·Φ ΦΦ

Tabulka 5d Souhrn

Kombinace alela/peptid

Zbytek	Testovanýj	‘referovaný T	olerovaný %f	ireferovaných	% tolerovanýc íebo preferova	h mých
V	19	17	2	89,5	100/1
L	19	16	3	84,2	100,0
I	19	16	3	84,2	100,0
M	6	S	1	83,3	ιοο,ο
T	19	14	4	73,7	94,7
A	6	2	4	33,3	100,0
Q	13	8	3	61,5	84,6
S	6	1	4	16,7	83,3
G	6 ·	0	3	0,0	50,0
F	19	0	4	0,0	21,1
P	19	0	1	0,0	V
C	6	0	0	0,0	0,0
K	19	0	0	0,0	0,0
N	6	0	0	0,0	0,0
0 19	0	0	0,0	0,0

Na C-konci bylo zjištěno, že V je optimální zbytek v kontextu všech tří původních peptidů pro A*0201, A*0206 a A*6802, a u 2 ze 3 případů pro A*0203 a A*0205 (tabulky 6a, 6b a 6c). Celkově byly V nebo L optimálními C-terminálními zbytky pro každou molekulu, bez ohledu na testovaný peptid. Kombinace alela/peptid v tabulce 6d označují počet případů, ve kterých byl daný zbytek asociován s relativní vazbou v rozmezí 1-0,1 (výhodné) nebo 0,1-0,01 (tolerované). Alifatické/hydrofobní a aa a a a >

····· · a · a

Q/ aaaa aa » · aa ·· aminokyseliny V, L a I byly výhodné jako kotevní zbytky u více než 66,7% MHC-peptidů. M, A a T byly tolerované přibližně v 50% případů. Další testované zbytky nebyly akceptovány nebo byly .tolerovány pouze vzácně.

Opakované hodnocení vazebné specificity A*0201 pro peptid

Přesná specificita vazby A*0201 se hodnotila podrobněji za použití databáze více než 4000 peptidů velikosti mezi 8- a 11zbytky. Bylo zjištěno, že více než 30% peptidů obsahujících L nebo M v pozici 2 se váže na A*02.01 s afinitou 500 nM nebo lepší (Obr. Ia). Mezi 5 a 15% peptidů obsahujících alifatické zbytky I, V, A, T a Q se vázalo s IC₅o 500 nM nebo lepší. Žádný další zbytek, včetně aromatických (F, W, a Y), nabitých (R, H,

K, D, a E), polárních (S a N) a malých (C, G a P) zbytků, nebyl asociován s IC50 500 nM nebo lepší.

V souladu s analýzou za použití jednotlivých substitucí se zjistilo, že V je optimální A*0201 C-terminální kotevní zbytek (Obr. lb) . Celkem 31.9% peptidů s V na C-konci se vázalo na A*0201. I, L, S, C, Μ, T a A byly také tolerovány, a 7,1 až 28,6% peptidů se vázalo.s IC50 500 nM nebo lepší.

Potom se analyzovala korelace mezi délkou peptidu (mezi 8 a 11 zbytky) a vazebnou kapacitou. Bylo zjištěno, že 27,6% 9merových peptidů se váže s IC50 500 nM nebo menší, což odpovídá předchozím hodnocením (Ruppert, J., et al., výše) (Tabulka 7a). ARB hodnoty se standardizovaly na sadu peptidů optimální velikosti a jsou uvedeny pro referenční účely.

Delší peptidy byly také schopné vazby, ačkoliv o něco nižší; 17,8% 10-merových a 14,5% 11-merových peptidů mělo afinity 500 nM nebo lepší. Nakonec bylo zjištěno, že 8-merové

Afi *♦···# vo ··«· ·· ·· · peptidy se váží na A*0201 pouze vzácně, kdy 3,5% peptidů má vazebné kapacity lepší než 500 mM.

Databáze peptidů vážících se na A*0201 se dále analyzovala pro hodnocení přísnosti A*0201 motivu. Jak se předpokládalo, peptidy s výhodnými zbytky v každé kotevní pozici se vázaly nejcastěji (48,7%) a s vyšší průměrnou relativní vazebnou kapacitou než jiné peptidy v knihovně (tabulka 7b). Peptidy s jedním výhodným zbytkem a jedním tolerovaným zbytkem se také vázaly relativně často, v rozmezí 17,6 až 28,4%. Konečně, peptidy s alespoň jedním netolerovaným zbytkem, nebo s tolerovanými zbytky v obou hlavních kotevních pozicích, se vázaly pouze vzácně, pokud vůbec, s frekvencemi vazby v rozmezí 0-7,1%. Žádné významné odlišnosti nebyly pozorovány v preferencích primárních kotevních zbytků v závislosti na velikosti ligandu.

Tabulka 6a

HCV NS3 590

Relativní vazebná kapacita

Zbytek	A*0201	A*0202	A*0203	A*Q205	A*0206	A*6802
v	V	0>83	M	o^si	M	1,°
1	0,22	0,14	0,60	030	0,17	0,075
L	0,95	M	0,72	M	038	0,062
T	0,16	0,012	0,11	0,017	(^034
F	0,066	-	0,044	-	-
D	-	-	-	-
K	-	-	-	-	*
P	-	-	-	-		—
Q	-	-	-	- 1 ·

« • 44

4* • 4 *4 *

4 • 44 · · • 4 4 • «44 ·

4· 44

Tabulka 6b

HBV jaderný 18 F₆>Y

Relativní vazebná kapacita

Zbytek e	A*0201	A*0202	A*0203	A*02O5	A*0206	A*02O7	A*6802
I	0^1	0,70	0,15	0,19	0,26	VS	0,39
v		M	M	M		M	1,0
L	0,18	0,43	0,23	0,26	<yŽ77	ς23	0,087
T	0,033	0,045	0,027	0,022	0,10	^027	-
P	^023	•	-	-	0/)12	opto	-
D	-	-	-	-	- -	-	•
F	-	-	-	-	- ..	-	-
K	-	-	-	-	•	-	-
Q	-	-	-		-	-	•

Tabulka 6c

Poly-alaninový peptid ALAKAAAAV

Relativní vazebná kapacita

Zbytek	A*0201	A*0202	A*0203	A*02O5	A*0206	A*6802
I	0,18	0,29	0,37	0,11	t^io
v	M	0,73	(po	M	U
L	0,040	M	1,0	0,36	0,085	0,26
M	0,025	0,18	0,031	0,049	0,034	-
A	0,072	-	0,077	-	-	0,025
S	-	- ,	<M>n	-	-	-
T	-	*	0,043	*	-	-
C	-	•	-	•	-	-
F	-	-	-	-	-	-
G	•	-	-	•	-	•
N	-	-	-		-	-
P	*	-	-	-	-	-
R	-	-	-	-	-	-
Y	-	-	-	-	-	-

«'*'4

Tabulka 6d Souhrn

Kombinace peptid/alela

Zbytek	Testovaný	Preferovaný	Tolerovaný V	«preferovanýci	’ % tolerován; nebo preferox	ch raných
V	19	19	0	ιοορ	I0<^0
I	19	18	1	93,3	100,0
L	19	14	5	6^7	1<XV>
M	6	1	4	20,0	«V
T	19	3	9	20,0	63,2
A	6	0	3	0,0	50,0
S	6	0	1		16,7
P	19	0	3	0,0	15,8
F	19	0	2	0,0	10,5
C	6	0	0	0,0	0,0
G	6	0	0	0,0	<io
N	6	0	0	qo	0,0
R	6	0	0	0,0	0,0
K	13	0	0	<y>	V
Y	6	0	0	0,0	0,0
D	13	0	0	0,0	0,0
Q	13	0	0	¢0	0,0

Tabulka 7a

Vazba v závislosti na velikosti peptidu

Délka peptidu	Cn)	“/«vážících se peptidů	ARB
8	171	3,5	0,072
9	2066	27,6	bo
10	1451	17,8	0,27
11	179	14,5	0,20
Total	3867	22,2

Tabulka 7b

Vazba v závislosti na hlavních kotevních motivech

Motiv	(n)	% vážících se peptidů	ARB
Pozice 2	C-konec
Výhodný	Výhodný	526	48,7	1,0
Výhodný	Tolerovaný	1446	28,4	0,31
Tolerovaný	Výhodný	558	17,6	0,098
Netolerovaný	Výhodný	27	0,0	0,031
Výhodný	Netolerovaný	66	6,1	0,026
Tolerovaný	Tolerovaný	1337	7,1	0,026
Netolerovaný	Tolerovaný	46	0,0	0,015
Netolerovaný	Netolerovaný	71	0,0	0,014
Tolerovaný	Netolerovaný	105	0,0	0,013
Celkem	4182	20,7

Pro identifikaci vlivu sekundárních kotevních zbytků se vazebná kapacita A*0201 pro peptidy v každé velikostní skupině dále analyzovala stanovením hodnoty ARB pro peptidy, které obsahují určitý aminokyselinový zbytek ve specifické, ale na velikosti závislé, pozici. Výsledné ARB hodnoty, podle párů příslušný zbytek/pózice, pro 8-11-merové sekvence, jsou uvedeny v tabulkách 8a-8d. Všechny peptidy v tabulkách 8a-8d mají alespoň 1 výhodný a 1 tolerovaný zbytek v hlavních kotevních pozicích. V sekundárních kotevních pozicích jsou hodnoty odpovídající 3-násobnému nebo vyššímu zvýšení vazebné kapacity uvedeny výše a tučným písmem. Negativní efekty, asociované s trojnásobným snížením vazebné afinity, jsou identifikovány podtržením a kurzívou. Také zbytky určené jako výhodhé nebo tolerované kotevní zbytky jsou uvedeny tučně. Hodnoty ARB v kotevních pozicích se získaly z analýzy popsané na obr, 1. Pro použití hodnot uvedených v této tabulce jako koeficientů pro prediktivní algoritmy se hodnoty pro ··· ··· ··· «·»· Μ ·· · ·» ·« netolerované zbytky nastavily na 0,001, což je ekvivalentní 1000-násobné redukci vazebné kapacity, pro odfiltrování peptidů neobsahujících motiv.

V tabulkách 8a, 8b, 8c a 8d jsou výsledky analýzy panelu 93 8-merových peptidů, 1389 9-merových peptidů, 953 10-merových peptidů, a 95 11-merových peptidů, v příslušném pořadí, založeny na přirozených sekvencích různého virového, bakteriálního nebo patogenního původu. Hodnoty ARB se vypočetly, například, způsobem popsaným v Sidney et al., Human Immunology 62:1200 (2001) a Sidney et al., J. Immunology 157: 3480(1996). Pro 9-merové a 10-merové peptidy se ARB hodnoty určené pro každý zbytek braly individuálně. Pro 8-merové a 11merové peptidy (tabulky 8a a 8d, v příslušném pořadí,) se hodnoty ARB získaly sdružením chemicky podobných zbytků, jak je popsáno v Ruppert et al., Cell 74: 929 (1993). Průměrná geometrická vazebná kapacita panelu 8-merových, 9-merových, 10-merových a 11-merových peptidů byla 14420 nM, 1581 nM, 3155 nM a 3793 nM, v příslušném pořadí.

Souhrnné mapy jsou uvedeny na Obr. 2a-2d. Ve většině pozic může být detekován sekundární vliv. Většina negativních vlivů (55%) vyžadovala přítomnost acidických (D a E) nebo basických (R, H a K) zbytků. Prolin (P) a velké polární zbytky (Q a N) měly také často negativní účinky. Ačkoliv byla každá konkrétní velikost asociována s jedinečnými preferencemi, ve většině případů (79%) byly výhodné zbytky aromatické (F, W nebo Y) nebo hydrofobní (L, I, V nebo M). Většina délek peptidů vykazovala preference pro F, Y a M v pozici 3. Obdobně, peptidy všech velikostí měly společnou preferenci pro aromatické nebo hydrofobní zbytky v pozici C-2.

Tabulka 8a 8-měrové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek	1	2	3	4	5	6	7	8
A	0,47	0,052	2,0	0,57	1,8		0,83	0,28
C	V	0,0010	0,70	1,3	0,59	2,3	1,1	0,0010
I)	0,23	<p»10	0,42	0,43	0,34	0,43	0,50	0,0010
E	0_f23	0,0010	0,42	0,43	0,34	0,43	0,50	0,0010
F		0,0010	M	1,3	0,27	3,4	1,2	0,0010
G	v	C^OOIO	17	I,»	V	0,38	4,8	0,0010
Π	0,95	0,00(0	$30	0,54	0,61	0,40	0,55	0,0010
I		0,17	1/4	2,0	9,9	1,5	1,0	ops
K	0,95	0,0010	0_r30	0,54	0,61	0,40	0,55	0,0010
L		1,0	Μ	^0	9/>	1,5	1,0	0,34
M		0,73	1,4	2,0	9,9	1,5	1,0	0,13
N	0,90	(^0010	1,0	0,51	0,38	0,38	0,66	0,0010
P	0,33	<V»to	0,38	0,40	0,75	0,50	V	0,0010
Q	0,90	0,076	1,0	0,51	0,38	0,38	0,66	0,0010
R	0,95	0^0010	0,30	0,54	0,61	0,40	0,55	0,0010
S	V3	0,0010	0,70	1,3	0,59	33	1,1	0,0010
T	1.3	0,075	0,70	1,3	0,59	33	1,1	0,11
v	¥	0,084	1,4	2,0	9,9	1,5	1,0	1,0
w	2,5	0,0010	Μ	1,3	0,27	Μ	1,2	0,0010
Y	2,5	0,0010	Μ	1,3	0,27	3,4	1,2	0,0010

·· · · · ·

Tabulka 8b 9-merové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek	1	2	3	4	5	6	7	8	9
A	1,8	0,052	1/2	2,3	1/9	0,45	2,3	0,80	0,28
C	0,70	0,0010	0,57	v	¥	2,1	0,86	1/2	0/W10
D	0,065	0,0010	1/2	v	0,84	0,52	0,21	0,34	ο,οαιο
£	0,065	0,0010	0,14	1,5		0,58	0,32	¥	0/)010
F	9,1	<^0010	M	1/1	w	2,6	6,8		0,0010
G	0,84	0,0010	0,58	¥	0/69	0,43	0,28	0,79	0,00)0
H	0,68	0,0010	0,79	0,83	3,8	0^6	V	1/3	0,0010
I	1/3	<V17	1,8	0,56	¥	2,0	1.5	0,45	0,35
K	1/5	tyOOlO	0,14	0,56	0,57	0_fJ7	0,19	0,46	0^0010
L	v>	1,0	V	0,70	V3	2,6	2,9	2/1	0,34
M	13	0,73	4,6	o	0,97	1/5	1,0	0,30	0,13
N	1,1	0,0010	0,78	0,52	0,32	0,90	0,47	0,47	cpoio
P	0,074	0,0010	<^64	0,62	0,47	0,89	1,6	1,6	0,0010
Q		0,076	1/2	0,74	V°	0,83	0,62	0,78	(^0010
R	1,6	0,0010	0,13	0,47	0,47	0,17	0,17	0,49	C^OOIO
S	0,99	0,0010	<\65	1/2	0,45	0,97	0,51	2/0	0,0010
T	0,60	0,075	0,53	2,1	0,59	1/9	0,98	V	0,11
V	0,93	0,084	1/2	0,56	1/7	V	0,75	0,30	Μ
w	0,58	0,0010	25	54	V	1»3	7,6	1,9	0,0010
Y	10	cyooio	V»	ty52	3,2	1.0	¥	i?	0/)010

• 9 • 9 · 9 · «9 · ·9

Tabulka 8c

10-merové peptidy

Pozice (ARB)

999« ··

Zbytek ; [

A		0,052	1,7	1,6
C	q.63	0,0010	IP	IP
D	o_ti2	0,0010	0,85	M
£	O_tll	0,0010	0_;17	V
F	4,4	0,0010	4,1	1/4
G	v	0,0010	0,44
H	0,54	<$ooio	0,90	0,76
I	1,4	0,17	v	0,67
K	1,8	0,0010	0,73	0,44
L	V>	i_zo	3,6	v
M	1,4	0,73	9,8	1/1
N	0,58	0,0010	0,56	1/4
P	0_tll	0,0010	0,53	0,66
Q	0^0	0,076	0,97	0,30
R	1,1	0,0010	0,79	0,35
S	v	0,0010	C$38	0,60
T	0,83	0,075	0,44	Vi
v	1,2	0,084	($.96	0,54
w	0,71	($0010	1/8	4p
Y	9,0	0,0010	7,4	0,74

5	6	7	8	9	10
Μ	1/1	0,62	1/2	1,0	0,28
1,8	0,51	1/3	2,6	1,2	0,0010
v	l/l	0,39.	0,22	0,38	0,0010
	0,75	0,43	0,40	0,92	0,0010
V	2,3	3,0	5,0	5,3	0,0010
0,91	0,91	0,81	0,67	Ví	0,0010
1/2	0,42	0,74	1/6	0,52	0,0010
V4	1/6	2,7	1/5	0,57	435
^26	0,39	0,48	0,22	0,47	(J.0010
1/3	1/3	4/5		IP	0,34
0,58	1/7	2,2	4/6	0,38	0,13
0,39,	1/1	0,43	0/3	0,79	(ynio
0,40	0,92	0,86	V	0,85	0,0010
V?	0,48	0,41	0,32	0,70	0,0010
0,33	0,77	0,27	0,77	0,38	($0010
0,43	0,58	0,49	0,87	1/1	0,0010
1/6	0,89	1,0	0,49	V²	0.11
VO	2,2	1/1	¥	1/4	v
3,5	1/1	2,6	4/8	V⁵	0,0010
0,67	0,52	2,0	V?	V°	($0010

• ·· • · · · ··· «· *· ♦ · ··

Tabulka 8d

11-měrové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek ’ 2 ³ 4 5 6 7 8 9 10 ji

A 0,34 0,052 1,8 2,7

C 2^ o/»io 0^7 p_t2j

D 0,21 ty»i0 0/10 12

E 0,21 V»íq o,40

F 1,2 0,0010 o,4O

G 3,3 θ?⁰¹⁰ 0,13 1,0

H 12 0,0010 q.42 q.58

I 4,4 0,17 9,2 1,4

K 12 OjOOio o,42 0,58

L 4,4 1,0 9,2 1,4 ,M 4,4 0,73 9,2 1,4

N 0,12 o/»w 0.QP2 1,7

P 0,056 <yx>iG ιμ 0,38

Q 0^2 0,076 0,092 1,7

R 12 0/ΧΗΟ 0/42 0,58

S 2,2 <V»io <p7 ρ_;27

T 2,2 0,075 0,17 0,21

V 4,4 0,084 9,2 1,4

W 1,2 <y»IO 6_Z1 0,40

Y 1,2 0,0010 _6/1 0,40

V

0j98

0,94

2,6

0^0

0,12 ¥

2,4

Q.57 b4

0,57

0,12

0,98

2,4

2,6

2,2

1,4

0,30

0,11

0,088

V 0,088

W

V

V³

0,13 l,³

0,088

M b4

3,2

0,11

1,0

1,9

0_t21

0,21 ¥

1,4

0,87

Μ

0,87

0,19 <p5

0,79

Μ

1?

¥

0,87

Μ

1,4

0,23

0,63 $25

0,25

8,8

5Λ

0,51 ¥

0,51

V

2,1 ¥

1?

¥

0,51

0,63

2,1 ¥*

8,8

0,074

0,79

0,28

V

0,76

0,16

5,5

0,16

5,5

1,1

0,088

1,1

0,16

0,79

5,5

V 6,1

1.3

1.4

1.5

1,5 0,17 9,0 0,33 0,83 0,33 0,83 0,83 0,21 o^i

0,33

1/

1,4

0,83

0,17

0,28

0,0010

0,0010 o/»io

0,0010

0,35

0,0010

0^4

0,13

0,0010

0,00)0

0,0010

0.11

1,0

0,0010

QJOOIO

Pro peptidy dané velikosti bylo také pozorováno několik odlišných preferencí. Například, 8-merové peptidy nemají žádnou preferenci v pozice 1 ani pozice 3 pro hydrofobní nebo aromatické zbytky výhodné pro 9-, 10- a 11-merové peptidy. 11• ·· • * • · · · 4

4 · 4 ··· · · · měrové peptidy byly jedinečné v preferenci G v mnoha pozicích v středu peptidů.

Hlavní kotevní specificity pro další molekuly A2-supertypu

V dalších pokusech se hodnotily hlavní kotevní specificity A*O202, A*0203, A*0206 a A*6802, čtyř nejčastějších alel A2supertypu po A*0201. Peptidy ve vazebné databázi A2-supertypu často odráží chybnou selekci za použití strategií na bázi A*020.1, jako je selekce pouze A*0201 vazebných peptidů nebo selekce peptidů, které mají vysoké skóre v A*0201 algoritmech. V důsledku toho jsou ve většině dat týkajících se vazby peptidů dostupná data pro non-A*0201 molekuly pouze pro výhodné a tolerované zbytky pro supertyp. Přes tato omezení byla pro testy k dispozici databáze přibližně 400 peptidů. Nebyla k dispozici databáze dostatečná pro analyzování A*0205 a A*0207, ačkoliv analýza specificity A*0207 byla publikována již dříve (Sidney, J., et. al., výše).

Analýzy specificity pozice 2 jsou shrnuty na Obr. 3a-d. Obecně, V, T, A, I a M jsou tolerované v každé molekule. Alelově specifické preference byly také zjištěny. V případě A*0202 je Q nejvýhodnější zbytek. Další zbytky (L, J, V, A, T a M) byly tolerované a byly přibližně ekvivalentní, s ARB v rozmezí 0,08-0,30. Naopak, A*0203 měl preference pro L, M a Q. Zbytky V, A, I a T byly asociované s celkově nižšími vazebnými afinitami. Třetí typ byl zjištěn pro A*0206, kde byly Q, V, I, A a T všechny tolerované s ARB hodnotami mezi 0,47 a 1,0, zatímco L a M byly méně dobře tolerované. Nakonec, pro A*6802 byly V a T optimálními zbytky, s ARB >0,45. A byl také výhodný, ale s nižší ARB (0,13). Významné snížení vazby bylo pozorováno pro I a M, které měly ARB mezi 0,050 a 0,020.

L a Q nebyly tolerovány, s ARB <0,010. Na C-konci byly I, V, *

• 4 *4 44

4·«» ♦*

L, A, M a T tolerovány všemi testovanými molekulami A2supertypu, s ARB >0,060 (Obr. 4a-d). I a V byly zbytky nejvýhodnější pro každou alelu; V byl optimální zbytek pro A*0203, A*0206 a A*6802. L byl obvykle další nejvýhodnější zbytek. T, A a M byly obvykle asociované s nižšími hodnotami ARB.

Závěrem, kotevní zbytky v pozici 2 a na C-konci preferované nebo tolerované A*0201 byly také tolerované dalšími molekulami A2-supertypu. Ačkoliv měla každá alela v něčem jedinečný charakter preferencí v pozici 2, byl charakter preferencí každé alely na C-konci velmi podobný.

Sekundární vlivy ovlivňující vazbu peptidů na molekuly A2supertypu

Stejná knihovna peptidových ligandů se analyzovala pro stanovení preferencí velikosti ligandu pro ?.*0202, A*G203, A*0206 a A*68Q2. pro každou alelu se hodnoty ARB standardizovaly na sadu peptidů optimální velikosti. Zjistili jsme, Že pro každou molekulu byly 9-11 měrové peptidy dobře tolerované, s ARB >0,36 (Tabulka 9 a-d). Pro A*0203, A*0206 a A*6802 byly 9-merové peptidy optimální, ale 10-mery byly optimální v případě A*Q202. Pro všechny alely byly 8-merové peptidy mnohem méně tolerovány, s ARB v každém případě < 0,11.

Tabulka 9a - A*0202

Délka peptidů	(n)	ARB
8	6	0,050
9	268	0,79
10	120
11	16	0,90
Celkem	410

Tabulka 9b - A*0203	79	* ·· · · * • · · · · ; : . · · · · · ··«· ·· ·· ·
. Délka peptidut	(n)	ARB
8	6	0,11
9	272	i.ó
10	122	0,75
11	16	0,36
Celkem	416

Tabulka 9c - A*0206
Délka peptidu:	(n)	ARB
8	6	0,066
9	268	1,0
10	120	0,38
11	16	0,66
Celkem¹	410

Tabulka 9d - A*6802.

Délka peptidu)	(n)	ARB
8	6	0,071
9	268	¥
10	120	0,60
11	16	0,47
Celkem <	410

< 4 4

Vliv sekundárních kotevních zbytků na kapacitu vazby peptidu na A*0202, A*0203, A*0206 a A*6802 se analyzoval poté. Počet dostupných peptidů umožňoval analýzu pouze 9- a 10merových ligandů. ARB hodnoty pro 9-merové a 10-merové peptidy jako funkce přítomnosti konkrétního zbytku v konkrétní pozici jsou uvedeny v tabulkách 10-13, a souhrnných mapách na obr. 58. Ja-k bylo uvedeno výše, pozitivní a negativní efekty jsou definovány jako efekty asociované s 3-násobným zvýšením nebo snížením vazby, v příslušném pořadí.

V tabulkách 10a a 10b se testoval panel 268 9-merových peptidů a panel 120 10-merových peptidů, v příslušném pořadí, na vazbu na A*0202 alelu. V tabulkách 11a a 11b se testoval panel 272 9-merových peptidů a panel 122 10-merových peptidů, v příslušném pořadí, na vazbu na A*0203 alelu. V tabulkách 12a a 12b se testoval panel 268 9-merových peptidů a panel 120 10merových peptidů, v příslušném pořadí, na vazbu na A*0206 alelu. V tabulkách 13a a 13b se testoval panel 268 9-merových peptidů a panel 120 10-merových peptidů, v příslušném pořadí, na vazbu na A*68Q2 alelu. Všechny peptidy byly odvozeny od přirozených sekvencí z různých virů, bakterií nebo patogenů a měly alespoň 1 výhodný a 1 tolerovaný zbytek v hlavní kotevní pozici. ARB hodnoty jsou odvozeny od skupin chemicky podobných zbytků, jak je popsáno v Ruppert et al., Cell 74: 929 (1993).

V sekundárních kotevních pozicích jsou hodnoty odpovídající 3násobnému nebo vyššímu zvýšení vazebné kapacity uvedeny výše a tučným písmem. Negativní efekty, asociované s trojnásobným snížením vazebné afinity, jsou identifikovány podtržením a kurzívou. Také zbytky určené jako výhodné nebo tolerované kotevní zbytky jsou uvedeny tučně. Pro použití hodnot uvedených v této tabulce jako koeficientů pro prediktivní algoritmy se hodnoty pro netolerované zbytky nastavily na 0,001., což je ekvivalentní 1000-násobné redukci vazebné ···· ·· • « · » ·« · ·· kapacity, pro odfiltrování peptidů neobsahujících motiv. Geometrický průměr vazebné kapacity každého panelu v tabulkách 10a, 10b, 11a, 11b, 12a, 12b, 13a a 13b byl 401 nM, 342 nM, 85 nM, 95 nM, 387 nM, 643 nM, 838 nM a 1055 nM, v příslušném pořadí.

Obecně, efekty škodlivé pro vazbu byly často (35%) spojeny s nabitými zbytky (D, E, R, H nebo K). Dalších 35% efektů škodlivých pro vazbu může být přisouzeno G nebo P. Za pozitivní vlivy byly relativně náhodně odpovědné bazické (R,

Η, K), kyselé (D, E), hydrofobní (F, W, Y, L, I, V, M) nebo malé (A, P) zbytky.

Ačkoliv měla každá molekula odlišný charakter preferencí a averzí, bylo možné u 10-merových peptidů vysledovat některé obecné trendy. Například, pro všechny molekuly byly Q a N výhodné v v pozici 1, a R, H a K byly výhodné v pozici 8. D, E a G byly jednotně škodlivé pro 10-merové peptidy v pozici 3. Společné preference nebo averze nebyly pozorovány pro 9-merové peptidy.

• · • « · ·* ·« *··· ··

Tabulka 10a 9-merové peptidy

Pozice

Zbytek	1	2	3
A	v	0,16	v
C	0j30	0,0010	0,71
D	0,083	0,0010	0,097
E	0,083	ψ»10	0,097
F	2,0	ψ»1Ο	2,1
G	0,46	0,0010	0,66
Π	¥	ψ»ιο	0,34
1	1/1	0^17	1,1
K	¥	0,0010	0,34
L	1,1	0,081	V
M	1,1	0,14	¥
N	0,37	0,0010	0,35
P	0,42	0,0010	v
Q	0,37	1,0	0,35
R	1,6	0,0010	0,34
S	0,30	tyXHO	0,71
T	0j30	0,18	0,71
V	1,1	0,29	1/1
w	¥	<yxno	2/1
¥	2,0	0,0010	2/1

(ARB)

V

1/2

0,59

1/9

0,74 ¥

0,74

0,24

0,43

0,24

0,74

1/2

1,2

1/4

0,59

0,59 ^86^- ²/l

0,78

1/9

0,23

0,58

0,79

0,58

0,79

0,79 ¥

0,55 ¥

0,58

2,1

0,79

1?

1/9

6	7	8	9
0,23	2,4	1/1	0,43
2,1	0,95	0,95	0,0010
0,71	0_f23	0,95	0,0010
0,71	0,23	0,95	<poio
0,51	0,77	¥	0,0010
0,36	0,71	0,64	<£0010
0,43	1,8	1/1	0,0010
¥	0,75	0,41	¥
0,43	¥	¥	0,0010
2,2	0,75	(^41	0,76
¥	0,75	0,41	0,17
0,87	¥	¥	0,0010
0,26	0,75	¥	<y>oio
0,87	¥	¥	0,0010
0,43	1,8	1/1	^0010
2,1	0,95	0,95	(yooio
¥	0,95	0,95	0,15
$2	0,75	0,41	0,92
0,51	0,77	3j0	t^ooio
0,51	0,77	3,0	0,0010

Tabulka 10b

10-merové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek i 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A	1/2	0,16	v	0,81	1,4	3,1	0,56		2/	0,43
c .	0,27	0/J010	0,44	3,0	13	0,95	0,43	1,6	1/5	0,0010
D	OJ 6	0,0010		2,2	9,1	3,6	v-	0,0077	1,8	0,0010
E	0J6	(^0010	$28	2,2	9,1	3,6	v-	0,0077	1,8	0,0010
F		0,0010	W	13	0,83		V	1/5	1.1	<y»io
G	0,32	0,0010	0_f098	0,88	1,0	0,44	0,32	1,0	0,59	0,0010
H	2,1	ψ»ιο	2,0	0,52	0,89	0,27	0,74	9,9	0,22	0,0010
I	0,76	0,17	0,85	0,65	0,67	0,60	V	0,40	0,60	1,0
K	V	0/)010	2,0	0,52	0,89	0,27	0,74	’/>	0,22	0,0010
L	0,76	0,081	0,85	0,65	0,67	0,60	6,7	0,40	0,60	0,76
M	0,76	0,14	0,85	0,65	0,67	0,60	ς?	0,40	0,60	0^7
N	4,2	tyXHO	0,38	V⁴	0,66	0,36	0,26	0,79	0,91	0,0010
P	0,46	O/XHO	v	$091	v	2,5	0J4	1/2	3,8	<\|0010
Q	9	1,0	0,38	1,4	0,66	0,36	0_t26	0,79	0,91	<iooio
R	2,»	0,0010	2,0	0,52	0,89	^27	0,74	9,9	0,22	tyooio
S	0,27	0,0010	0,44	3,0	1?	0,95	0,43		1/5	0,0010
T	0,27	0,18	0,44	3,0	V	0,95	0,43	1,«	13	0,15
V	0,76	0,29	0,85	0,65	0,67	0,60	6>7	0,40	0,60	0^2
W	3,9	0^0010	M	1,3	0,83	2,8	1\|3	1/5	VI	tyOOIO
Y	V	0,0010	5,8	1,3	0,83	^8	V3	1/5	1.1	0,0010

* * « « ··

9 9 «·« « · · · ···· ·· · 9 99 99

Tabulka 11a

9-merové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek	1	2	3	4	5	6	7	s	9
A	0,95	0,077	4,4	2,3	1,2	0,36	4,3	1,4	0,17
C	0,41	0,0010	0,83	1,4	0,91	0,86	1,8	1J	<ςοοιο
D	0,42	0,0010	0,059	0,73	0,28	0,36	0,56	0,64	0,0010
E	0,42	o/xno	0.059	0^3	£2$	0,36	0,56	0,64	0,0010
F	3,3	0,0010	0,71	0,55	1,5	0,28	0,075	1/3	0,0010
G	i?	0,0010	1,8	1,5	0,86	I/³	V	1,2	0,0010
H	0,63	0,0010	4,2	0,91	IA	0,71	0,95	0,30	cyooio
I	1/1	0,070	0,77	0,85	0,63	1/?	1/2	0,56	0,56
K	0,63	ψΧΗΟ	4,2	0,91	V	0,71	0,95	0,30	0,0010
L	1,1	1,0	0,77	0,85	0,63	IA	1,2	0,56	0,14
M	1?	0,63	0,77	0,85	0,63	1,9	1,2-	0,56	0,17
N	0,36	0,0010	1,3	0,59	2,1	1/3	0,97	*,3	t^ooio
P	0.015	0,0010	V»	0,55	1,2	1/8	1,0	4,4	C^OOIO
Q	0,36	0,51	1,3	0,59	2,1	1/3	0,97	1/3	ϋ,ΟΟϊΰ
R	0,63	0,0010	4?	0,91	V	0,71	0,95	Q^O	0,0010
s	0^1	0,0010	0,83	M	0,91	0,86	l,⁸	1,7	0,0010
T	0,41	0,045	<\83	I,⁴	0,91	0,86	1,8	1,7	0,26
V	i?	0,10	0,77	0,85	0,63	1/9	1/2	0,56	1,0
w	V	<yx>io	0,71	0,55	1,5	0,28	0,075	1,3	0,0010
Y	3^	0,0010	0,71	0,55	1,5	0,28	0,075	1,3	0,0010

• * · I • 4 4·

Tabulka 11b 10-merové peptidy

Zbytek

Pozice ~3 (ARB)

A

C

D

E

F

G

H

I

K

L

M

N

P

Q

R

S w

Y v

0,68

0/2

432

8p

V>

0,75

0,29

0,75

0,29

6,0 o_;o;p

6,0

0,077

0,0010

0,0010 ^OOIO

0,0010

0,070

90010

1,0

0,63

1,5

0,33

0,074

6,4

0,32

Q.83

0,83

0,43

0/0

1,1

1,0

3,7

0,66

0/9

M

0,60

Μ

3,8	1,3	0,56	1,7	3,0
0/2	0,69	0,69	2,2	1,1
V	Μ	0,60	16	2,8
1,1	2,4	0,60	16	2,8
1,0	v	V⁷	0,23	1,3
0,63	v°	0,33	3,8	2,6
0,62	^55	0,77	V	0,085
Vi	0/7	3,3	0,65	0/2
0,62	0/5	0,77	V	0,085
Μ	0,57	33	0,65	0,52
1,1	<VS7	3/	0,65	0/2
0,75	1?	0,17	0,89	0,91
1J	4/	3.6	1.4	7 c
			»-	*r-
0,75	1,3	ftZZ	0,89	0,91
0,62	0,55	0,77	V	0,085

Cp7

9<X>IO

9.OOIO

0,0010 oyioio

9.0010

90010

0,56

0,0010

0/4

0/7

90010 n tom

7'“'

• · · 4 *4 4«

4 · · 4 4

44«· ** ·4 »

Tabulka 12a

9-merové peptidy

Pozice (ARB)

Zbytek	1 1	2	3	4	5	6 .	7	s	9
A	0,95	0,52	0,91	1/	0/4	0/3	V	0,53	0,16
C	0/5	0,0010	0,47	V	1,4	0/5	0,72	V	0,0010
D	0,81	0,0010	0,51	1,4	2/	v		0,64	0,0010
E	0,81	0,0010	0,51	M	2,2	v	0,23	0,64	0,0010
F	V	0,0010	V	0,85	v	1,6	2,0	¥	0,0010
G	0,67	0,0010	0,33	2,4	0,24	0/4	0/1	0/2	0,0010
H	V	0,0010	0,13	0,47	0,62	0/1	0/5	0,83	(j.0010
I	0,77	0,49	4,1	0,82	0/6	ty	0,74	0,46	0,54
K	V	0,0010	0,33	0,47	0,62	0/1	0/5	t^83	0,0010
L	0,77	0,061	V	0/2	0,86	2/	0,74	0,46	0,23
M	0,77	0,18	v	0/2	0,86	^4	0/4	Q46	<}071
N	0.48 <	qooio	0,39	0/9	£0	nqx Wj>-X	1 O	1 Λ x,u	í*0010
P	0,33	0,0010	0,47	0^2	0/7	0,39	v	¥	0,0010
Q	0,48	lfi	0/9	0£9	2,0	0,94	1/	V>	0,0010
R	v	0,0010	0,33		0/2	0/1	0,85	0,83	0/W10
S	0/5	0,0010	0,47	V	v	0,75	0/2	1,6	(yooio
T	0,35	0,47	0,47	V	M	0,75	0,72	λ6	0,11
v	0,77	0,53	4,1	0,82	0/6	2,4	0,74	0,46	1,0
w	2,5 .	0,0010	M	0,85	V	1/	2,0	3,3	0,0010
Y	2/	0,0010		0,85	v	1/	2,0	3/	0,0010

4

Tabulka 12b 10-měrové peptidy

Zbytek ~1 2^-

A	¥	0,52
C	£61	t^ooio
D	0,063	0,0010
E	0,068	0,0)10
F	3,0	0,0010
G	0,71	0,0010
H	¥	0,0010
I	0,42	0,49
K	¥	0,0010
L	0,42	£061
M	0,42	0,18
N	¥	o/xno
P	0,17	0,0010
Q	9	1,0
R	¥	0,0010
S	0,61	0,0010
T	opi	0,47
V	0,42	0,53
w	3,0	tyOOlO
Y	3,0	0,0010

Pozice (ARB)

4 s Γ“ ζ62 V ξΐ 0£5 £23 0,71 1,4 0,80

W V 11 3,2 £099 27 ll

V 0,80 1,2 2,6 £072 0,81 Opi 0,48 £1Z 0^6 0,66 0,86

3,8 0,67 0,76 0,90 £2Z 0,56 0,66 Q,86

3,8 0,67 0,76 0,90

Qf28 1.8 047 089

-ř , _f —

0,84 17 0,57 0,83 £28 1,8 0,47 0,82 £IZ 0,56 0,66 0^6 £23 0,71 1,4 0,80 £23 0,71 1,4 0,80

3,8 0,67 0,76 0,90

4,1 OpO 1,2 2,6

4,1 0,80 1,2 2,6

8 9 10 £2Z £53 p oiš^-

0,56 3,2 0,78 0,0010

0p8 4,0 0,0010

1,2 0,38 4,0 θ,οοιο

1.8 2,1 0,45 0,0010

ΟΤΙ 0,73 0,41 0,0010

0,96 5,0 0,25 0,0010

4.9 0,79 1,0 0,54

0,96 5,0 0,25 ο,οοιο

4,9 0,79 1,0 0,23 ¥ 0,79 1,0 0,071 fi 14 Π 9Π* nax nnnin

Hfízs. 7-— £26 ip 3,6 ψχηο £14 ομο 0,34 ^0010

0,96 5,0 0,25 ςοοιο

0,56 1,2 078 tyooio

0,56 V 0,78 0,11

0,79 1,0 l_;0

V £1 0,45 0,0010

IP 2,1 0.45 cípoio • ··

Tabulka 13a

9-měrové peptidy '

Pozice (ARB)

Zbytek

	I	2	3	4	s	6	7	&	9
A	0/6	0,13	6,8	0/8	0,71	0J4	3,4	0,71	0,15
C	1,0	C^OOIO	0,42	0,92	0,95	1,7	Q.60	ty75	90010
D	352	0,0010	0_f30	0,70	0,28	0,70	0,36	0,45	0,0010
E	352	0,0010	0_;30	0,70		0,70	0,36	0,45	0,0010
F	7,6	o/xiio	2J	1,4	1,8	v	1,5		0,0010
G	0^54	9OOIO	0,24	2,5	0,48	0/3	0,85	¥	0,0010
H	OJ 6	0,0010	0,27	0/5	0,68	3,2	V	13	0,0010
I	2,2	0,052	0,88	IP	1/1	0,80	0,65	0,57	0,80
K	OJ 6	0,0010	0,27	0,55	0,68	V	3/	1,5	0,0010
L	2J	0,0078	0,88	1?	v	0,80	0,65	0,57	0/2
M	2J	0,023	0,88	v	¥	0,80	0,65	0/7	0/93
N	0,83	0/3010	1,6	0/5	0/6	0,71	0,46	¥	0,0010
P	0,49	0,0010	2,8	0,43	24	2,3	0,71 *	1,7	o/xno
Q	0,83	0,0010	¥	0,45	0,36	0,71	0,46	¥	0,0010
R	0J6	9.0010	0,27	0,55	0,68	v	3,2	1,5	90010
S	1,0	0,0010	0,42	0,92	0,95	1,7	0,60	0,75	0/3010
T	1,0	0,45	0,42	0,92	0,95	1,7	0,60	0,75	0/62
V	2/	1,0	0,88	1,3	V	0,80	0,65	0/7
w	7,6	0,0010	2,7	M	1,8	2/	1,5	2,1	0,0010
Y	7,6	0,0010	2,7	M	1,8	V	1,5	2/	90010

· • ·· * · ♦ · · · · · · • · ♦ · · · ···· ·· ·· *

Tabulka 13b

10-merové peptidy

Pozice (ARB) Zbytek ---j--

A	0,50	0,13	5,6	3,5
C	2,1	(^0010	1,4	1,4
D	V	0,0010	0,042	4,8
E	3/2	C^OOIO	$042	4,8
F	V	<^0010	V
G	0,086	^0010	0,16	0,38
II	0,73	OjOOlO	$16	0,15
I	V	0,052	V	V
K	0,73	0,0010	$16	0,15

L 1,2 0,0078 1,2 1,2

M 1,2 0,023 λ 1,2

Ν 16 ο,οοιο ^22 1,5

P 115 °/»¹⁰ 0,17 0,045

Q 16 0,0010 0,22 1,5

R 0,73 0,/d 0,15

S 2,1 0,0010 i_f4 1,4

T 2,1 0,45 1,4 1,4

V 1,2 1,0 1,2 1,2

W 1,1 <M»io 2,7 1,4

Y 1,1 0,0010 2,7 1,4

5	6	7	s	9	10
2,7	0,69	0,71	1/3	1/	0,15
0,20	0,72	0,26	V	0,55	oyooto
v	0,68	0,28	0,10	1/2	ο,ροιο
4,3	0,68	0,28	0_f10	1?	0,0010
v	1/5	V	0,98	v	tyOOlO
2/1	0,54	1/5	1/5	0,66	0,0010
0,70	0,18	3,8	3/1	0,88	0,0010
V	v	1,7	0^6	0,74	0,80
0,70	0,18	3,8	V	0^8	0,0010
2,8	1,8	V	0^6	0,74	0,32
2,8	1/	1/7	0,96	0,74	0,093
0,20	¥	V	0,31	1,6	0,0010

0,090 0,60 0,12 0,96 1,8 «,οοιο

0,20 8,4 3,2 0,3/ 1,6 0,0010

0,70 0,18 3,8 3,1 0,88 P/xno

0,20 0,72 OJ6 1,1 0,55 °,0010

0,20 0,72 0,26 1,1 0,55 0,062

2,8 1,8 1,7 0^6 0,74 1,0

1,3 1,5 4,9 0,98 2,2 Ψ*>^ί0

1,3 1,5 4,9 0,98 2,2 ο,οοιο

Dohromady data v tomto oddíle podrobně popisují motivy pro 9- a 10-merové peptidy vážící se na A*0202, A*0203, A*0206 a A*6802. Každý motiv je charakterizován specifickými vlastnostmi asociovanými s dobrou nebo Špatnou vazbou peptidů.

Společný A2-supermotiv

Motivy popsané výše pro molekuly A2 supertypu jsou velmi podobné a značně se překrývají. Proto může být identifikován společný motiv, který obsahuje rysy sdílené motivy specifickými pro molekuly (obr. 9). Společný motiv je charakterizován přítomnosti hydrofobních a alifatických zbytků v pozici 2 peptidových ligandů. V této pozici jsou V, L a M výhodné, zatímco T, Q, A a I jsou tolerované. Podle rozmezí preferencí pro každý zbytek pro každou molekulu A2-supertypu je V nejvýhodnější zbytek. Na C-konci je společný motiv charakterizován přítomností hydrofobních a alifatických zbytků L, I, V, M, A a T. V je nejčastější optimální zbytek, zatímco L a I jsou také považovány za výhodné a obvykle jsou dalšími nejvíce optimálními zbytky. M, A, a T jsou považované za tolerované zbytky.

Mapy sekundárních kotevních zbytků pro A*0201, A*0202, A*0203, A*0206 a A*6802 byly použity pro získání společného kotevního motivu pro supertyp pro 9- a 10-merové peptidy (Obr. 9). Zbytky považované za výhodné pro 3 nebo více molekul A2supertypu, bez škodlivých efektů pro další molekuly, byly povazovány za výhodné pro společný motiv pro supertyp. Naopak, zbytky identifikované jako škodlivé pro 3 nebo více molekul byly označeny jako škodlivé pro společný motiv. Společný motiv se významně překrývá s uvedeným A*0201 motivem a preferuje aromatické zbytky v pozici 1 a/nebo 3, a má též averzi k nabitým zbytkům v pozici 3.

• « • ·

.........

Korelace mezi vazebnou afinitou k A*0201 a zkříženou reaktivitou A2-supertypu

Z důvodu dominance A*0201 ve čtyřech hlavních etnických skupinách ve srovnání s ostatními alelami A2 supertypu {viz, například, Tabulka 3) bylo zajímavé zjistit, jak dobře se peptidy vážící se na A*0201 váží též na jiné molekuly A2supertypu. Bylo zjištěno, že peptidy, které se váží na A*0201 s dobrou afinitou (IC50 <500 nM) se často váží též na další molekuly A2-supertypu (Tabulka 14a). 36,1 až 73,6% peptidů vážících se na A*0201 se váže také na další molekuly A2supertypu. Analýza degenerace A2-supertypu v závislosti na afinitě k A*0201 měla také zajímavé výsledky. 72,8% peptidů, které se váží na A*0201 s ICso <500 nM se váže na 3 nebo více molekul A2-supertyp (Tabulka 14b). Obecným pravidlem je, že vyšší vazebná afinita peptidu pro A*0201 je spojena s vyšší pravděpodobností, že se peptid bude vázat také na 3 nebo více molekul supertypu. Více než 96% peptidů, které se váží na A*0201 s afinitami 20 nM nebo lepšími se také váže na 3 nebo více molekul A2-supertypu. Naopak, peptidy s A2-supermotivem, které se neváží na A*0201 s afinitami lepšími než 500 nM, se pouze vzácně (10%) váží na 3 nebo více molekul A2 superrodiny, a nikdy se neváží na 4 nebo více molekul.

Tato analýza zkřížené vazby peptidů na A*0201 a další molekuly A2-supertypu potvrdila, že tato rodina HLA molekul rozpoznává podobné strukturální rysy v peptidových ligandech. Bylo -též prokázáno, že vazebná afinita k A*0201 koreluje s pravděpodobností vazby na více alel A2-supertypu.

• *

Tabulka 14a

Zkřížená reaktivita mezi molekulami A2-supertypu % ligandu zkříženě reagujících s

Aiela	A*0201	A*0202	A*0203	A*0206	A*6802	Average
A*0201		54^9	73,6	50,2	3 týl	53,7
A*0202	54,9		50,2	38,7	26,2	42,5
A*0203	73,6	50,2		42,7	30,0	49_zl
A*0206	50,2	38,7	42,7		24,3	39,0
A*6802	36,1	26,2	30,0	24,3		29,2

Tabulka 14b

Degenerace ligandu A*0201

A*0201		vazba na alely A2-supertypu (% peptidů)
Afinita	0	1	2	3	4	5	>=3
<=20	0,0	0,0	V	17,5	36,8	42,1	96,5
<-100	A A VfV		i i,2	21,4	34,7	29,1	85,2
<=500	0,0	v	20,1	25,1 ..	28,3	19,3	72,8
>500	40,0	33,3	16,7	10,0	0,0	0,0	10,0

Analýza

Výsledky této analýzy umožnily podrobné definování vlastností peptidů, které se váží na HLA-A*0201 a jiné molekuly A2-supertypu. Molekuly A2-supertypu mají společnou nejen značně se překrývající vazebnou specificitu pro peptidy, ale též významně se překrývající vazebný repertoár pro peptidy. Identifikovaly se specifické charakteristiky peptidových ligandů asociované s vazebnou kapacitou pro degenerovaný A2-supertyp, které poskytují logické vysvětlení •

0·

00*0 00 * 0 • ·

00 pro vztahy v rámci supertypu.

V předchozím testu se analyzovala vazebná specificita A*0201 pro peptid, a konstruoval se podrobný motiv, včetně identifikace sekundárních kotevních zbytků. V předkládané analýze, která se provedla na 10-krát větší databázi, jsme potvrdili data a rozšířili jsme analýzu tak, aby zahrnovala 8a 11-merové peptidy. Celkově byla specificita A*0201 pro 8- a

11-merové peptidy podobná specificite pro 9- a 10-merové peptidy. Například, bez ohledu na velikost peptidu, byla většina negativních vlivů na vazebnou kapacitu spojena s přítomností nabitých zbytků v sekundárních kotevních pozicích, zatímco většina pozitivních vlivů byla asociována s přítomností hydrofobních zbytků. Definování podrobných motivů pro 8- a 11-merové peptidy by mělo umožnit kompletnější identifikaci epitopů. Identifikace ligandů A*0201 byla značně usnadněna použitím algoritmů na bázi ARB hodnot. V naší analýze byla použita významně větší databáze, než byla dostupná dříve, což umožnilo úpravo koeficientů algoritmu. Vzhledem k tomu, že jsou nové koeficienty získány z významně větší sady dat, jsou statisticky přesnější a měly by být účinnější v přesné predikci epitopů. Kromě toho nová analýza ukázala, že revidovaný A*0201 9-merový polynomiální algoritmus na bázi větší sady dat je přesnější než starší algoritmus na bázi menší sady dat a predikční metody na bázi neuronové sítě. Kromě přesnější predikce epitopů (Ruppert, J., et al., výše; Sidney, J., et al., výše; Kondo, A., et al., výše; Gulukota,

K., et al., výše; Parker, K.C., et al., Sequence Motifs Important for Peptide Binding to the Human MHC Class I Molecules, HLA-A2, J. Immunol. 149:3580-3587 (1992) a Milik,

M., et al., Application of an Artificial Neural Network to Predict Specific Class I MHC Binding Peptide Sequences, Nátuře (Biotech) 16:753-756 (1998)), umožňují podrobné • 4 peptidové vazebné motivy definování jak primárních, tak sekundárních kotevních pozic pro racionální vývoj optimalizovaných ligandů. Například mohou být identifikovány přirozené sekvence mající suboptimální zbytky v primárních a/nebo sekundárních pozicích. Suboptimální zbytky mohou být potom nahrazeny optimálními zbytky, za 2isku epitopů s vyšší vazebnou afinitou (Sidney, J., et al., výše; Pogue, R.R., et al, Amino-Terminal Alteration of the HLA-A*0201-Restricted Human Immunodeficiency Virus Pol Peptide Increases Complex Stability and in Vitro Immunogenicity, Proč. Nati. Acad.

Sci., USA, 92:8166-8170 (1995) a Bakker, A.B., et al., Analogues of CTL epitopes With Improved MHC Class-I Binding Capacity Elicit Anti-Melanoma CTL Recognizing the Wide-Type Epitope, Int. J. Cancer, 70:302-309(1997)). Po této modifikaci mohou být přirozené peptidy, které nebyly schopné vyvolat reakci, nebo byly špatně imunogenní, vysoce imunogenními (Pogue, R.R., et al., výše; Bakker, A.B., et al., výše; Parkhurst, M.R., Improved Induction of MelanomaReactive CTL With Peptidy From the Melanoma Antigen gplOO Modified at HLA-A*0201-Bínding Peptides,J. Immunol. 157:25392548 (1996); Rosenberg, S.A., et al., Immunologic and Therapeutic Evaluation of a Synthetic Peptide Vaccine for the Treatment of Patients With Metastatic Melanoma, Nátuře (Med) 4:321-327 (1998); Sarobe, P., et al., Enhanced in vitro Potency and in vivo Immunogenicity of a CTL Epitope From Hepatitis C Virus Core Protein Following Amino Acids Replacement at Secondary HLA-A2.1 binding Positions, J. Clin. Invest. 102:1239-1248 (1998) a Ahlers, J.D., et al., Enhanced Immunogenicity of HIV-1 Vaccine Construct by Modification of the Native Peptide Sequences, Proč, Nati. Acad. Sci., USA, 94:10856-10861 (1997)). CTI indukované takovými peptidovými analogy byly schopné, ve většině případů, rozpoznávat cílové buňky exprimující přirozené sekvence antigenu. Tento fenomén ·

• 4 « fc » » fc *· • fc · • · · ’ fc··# fc* ·· ·» ·· pravděpodobně odráží méně přísné požadavky na epitop pro rozpoznávání cílových buněk ve srovnání s požadavky nutnými pro stimulaci naivních T-lymfocytů k indukci diferenciace na efektory (Cho, B.K., et al., Functional Differences Between Memory and Naivě CD8 T Cells, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96:2976-2981 (1999); Sykulev, Y., et al., Evidence That A Single Peptide - MHC Complex On A Target Cell Can Elicit Acytolytic T Cell Response, Immunity 4:565-571 (1996)). Tak mohou podrobné motivy popsané v předkládaném vynálezu usnadnit nejen identifikaci přirozených CTL epitopů, ale také vývoj epitopů s vyšší vazebnou kapacitou a/nebo imunogenními charakteristikami.

Vazebná specificita pro peptid jiných molekul A2-supertypu byla také zkoumána za použití peptidových analogů s jednou substitucí a peptidových knihoven. V souladu s dřívějšími pracemi (del Guercio, M-F, et al., Binding of a Peptide Antigen to Multiple HLA Alelles Allows Definition of an A2Like Supertype, J. Immunol. 154:685-693 (1995) a (Sidney, J., et al., Practical, Biochemical and Evolutionary Implications of the Discovery of HLA Class I Supermotifs, Immunol. Today 17:261-266(1996)); viz též zprávy podané pro NIH-NIAID kontrakt NG1-AI-45241), jsme zjistili, že primární vazebné motivy molekul A2-supertypu jsou značně podobné. Použití peptidových knihoven umožnilo podrobnou charakterizaci sekundárních kotevních preferencí a averzí pro každou molekulu. Bylo prokázáno, že ačkoliv má každá molekula A2supertypu jedinečnou specificitu, může být identifikován společný supermotiv. Jelikož supermotiv popisuje vlastnosti peptidových ligandů, které jsou společné pro molekuly A2supertypu, tak se předpokládá, že umožní účinnou identifikaci vysoce zkříženě reaktivních peptidů, a ukáže vhodné strategie pro fixování vazebných míst, což umožní modulování degenerace supertypu peptidových ligandů. Dalším výsledkem této analýzy bylo odvození koeficientů, které mohou být použity v algoritmech pro predikci vazby peptidu na A*0202, A*0203, A*0206 a A*6802.

Protože je HLA A*0201 nejvíce prevalentní alelou A2supertypu, jak v obecné populaci, tak v hlavních etnických skupinách, tak se peptidová skríningová strategie použila nejprve se zaměřením na identifikaci peptidů vážících se na A*0201. Bylo zjištěno, že více než 70% peptidů, které se váží na A*0201, se váže také na 2 další molekuly A2-supertypu, a ře pravděpodobnost vazby na další alely A2-supertypu koreluje s vazebnou afinitou k A*0201.

Závěrem, zde uvedená data představují formální demonstrování společné vazebné specificity skupiny HLA-A molekul označovaných jako A2-supertyp pro peptid. Nejen že tyto molekuly rozpoznávají podobné charakteristiky v primárních a sekundárních vazebných pozicích jejich peptidových ligandů, ale též mají značně se překrývající vazebný repertoár pro peptidy. Důkaz toho, že tyto molekuly mají značně rozsáhlý překrývající se repertoár má významný vliv pro vývoj potenciálních vakcinačních konstruktů. Kromě toho, koncept, že zkřížená reaktivita A2-supertypu na úrovni vazby peptidů může mít imunologický význam, byl prokázán v mnoha studiích, jak u infekčních onemocnění (Khanna R., et al., Identification of Cytotoxic T-Cell Epitopes Within Epstein-Barr Virus (EBV) Oncogene Latent Membrane Protein 1 (LMP1): Evidence for HLA A2 Supertype-Restricted Immune Recognition of EBV-Infected Cells by LMPl-Specific Cytotoxic T lymphocytes, Eur J Immunol, 28:451-458 (1998); Bertoletti,

A., et al., Molecular Features of the Hepatitis B Virus Nucleocapsid T-Cell Epitope 18-27: Interaction With HLA An T97

Cell Receptor, Hepatology 26:1027-1034 (1997); Livingston, B.D., et al., Immunization With the HBV Core 18-27 Epitope Elicits CTL Responses in Humans Expressing Different HLA-A2 Supertype Molecules, Hum Immunol 60:1013-1017, (1999);

Bertoni, R., et al., Human Histocompatibility Leukocyte Antigen-Binding Supermotifs Predict Broadly Cross-Reactive Cytotoxic T Lymphocyte Responses in Patients With Acute Hepatitis, J Clin Invest 100:503-513 (1997); a Doolan, D.L., et al., Degenerate Cytotoxic T-Cell Epitopes from P. falciparum Restricted by Multiple HLA-A and HLA-B Supertype Alelles, Immunity 7:97-112(1997)), tak u nádorů (Fleischhauer, K., et al., Multiple HLA-A Alelles Can Present an Immunodominant Peptide of the Human Melanoma Antigen MelanA/MART-1 To A Peptid-Specific HLA-A*0201+ Cytotoxic Cell Line, J Immunol, 157: 787-797 (1996); Rivoltini, L., et al., Binding and Presentation of Peptides Derived From Melanoma Antigens MART-1 and Glycoprotein-100 by HLA-A2 Subtypes: Implications for Peptide-Based Immunotherapy, J Immunol 156:3882-3891 (1996); Kawashima, I., The Multi-Epitope Approach for Immunotherapy for Cancer Identification of Several CTL Epitopes from Various Tumor-Associated Antigens Expressed on Solid Epithelial Tumors, Hum Immunol 59:114 (1998)).

Příklad 6: Peptidové přípravky pro profylaktické použití

Vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu se používají pro prevenci infekcí nebo pro léčbu nádorů u jedinců. Například polyepitopický peptidový epitopový přípravek obsahující více CTL a HTL epitopů se podá jedincům rizikovým z hlediska HIV infekce. Přípravek je ve formě jednoho lipidovaného polypeptidu, který obsahuje různé epitopy. Vakcína se podá ve vodném nosiči obsahujícím φ φφ

ΦΦΦ

Φ Φ ΦΦΦΦ ··

Freundovo nekompletní adjuvans. Dávka peptidu pro počáteční imunizaci je od přibližně 1 do přibližně 50000 μς pro 70 kg pacienta v objemu vhodném pro aplikaci člověku. Po první aplikaci vakcíny následují dosycovací dávky ve 4 týdnu, po kterých se provede hodnocení velikosti imunitní reakce u pacienta, za použití technik, které určují přítomnost epitopově-specifických CTL populací ve vzorku PBMC. Další dosycovací dávky se podávají podle potřeby. Bylo zjištěno, že přípravek je jak bezpečný, tak účinný v profylaxi HIV infekce.

Alternativně může být polyepitopický peptidový přípravek podán ve formě nukleové kyseliny, za použití způsobů známých v oboru.

Výše uvedený popis je určen pro ilustraci předkládaného vynálezu, ale nijak neomezuje jeho rozsah. Odborníkům v oboru budou jasné další varianty předkládaného vynálezu, které spadají do rozsahu připojených patentových nároků. Všechny citované publikace, patenty a patentové přihlášky jsou zde uvedeny jako odkazy.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace epitopu sestávajícího z 9 aminokyselin, který se váže na alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, vyznačující se tím, že (a) se poskytne aminokyselinová sekvence příslušného antigenů, (b) pomocí této sekvence se identifikuje aminokyselinová subsekvence tvořená 9 aminokyselinovými zbytky, která má ve své poloze 2 první aminokyselinovou kotvu vybranou ze skupiny tvořené L, Μ, V, T, Q, A a I a na svém C-konci druhou aminokyselinovou kotvu vybranou ze skupiny tvořené L, V, I, A, T a M, kde

(i) poloha 1 této subsekvence není P a (ii) poloha 3 této subsekvence není D, E, R nebo K a (ííí: ) poloha 5 této subsekvence není E a (iv) poloha 6 této subsekvence není A a (V) poloha 7 této subsekvence není D nebo E, a tato subsekvence ze stupně (b) se identifikuje jako

epitop, který váže alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedené subsekvence je Y nebo F nebo (ii) poloha 3 uvedené subsekvence je A.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedené subsekvence je Y nebo F a (ii) poloha 3 uvedené subsekvence je A.
4. Způsob identifikace epitopu sestávajícího z 10 aminokyselin, který se váže na alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, vyznačující se tím, že • ·· » · • · · ··«· ·· « · ·

II · ··

100 (a) se poskytne aminokyselinová sekvence příslušného antigenů, (b) pomocí této sekvence se identifikuje aminokyselinová subsekvence tvořená 10 aminokyselinovými zbytky, která má ve své poloze 2 první aminokyselinovou kotvu vybranou ze skupiny tvořené L, Μ, V, T, Q, A a I a na svém C-konci druhou aminokyselinovou kotvu vybranou ze

skupiny tvořené L , v, I, A, T a M, kde (i) poloha 1 této subsekvence není D, E nebo P a (ii) poloha 3 této subsekvence není D, E, R, K ; nebo G 3 (iii) poloha 4 této subsekvence není P a (iv) poloha 7 této subsekvence není Q, N nebo P a (V) poloha 8 této subsekvence není D, Q nebo N a (Vi) poloha 9 této subsekvence nebí R, K nebo H, a

(c) tato subsekvence se identifikuje jako epitop, který váže alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedené subsekvence je F nebo Y nebo (ii) poloha 3 uvedené subsekvence je F, Y nebo W nebo (iii) poloha 5 uvedené subsekvence je D nebo E nebo (iv) poloha 7 uvedené subsekvence je L, V, I nebo M nebo (v) poloha 8 uvedené subsekvence je H, R nebo K.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že

(i) poloha 1 uvedené subsekvence je F nebo Y a (ii) poloha 3 uvedené subsekvence je F, Y nebo W a (iii) poloha 5 uvedené subsekvence je D nebo E a (iv) poloha 7 uvedené subsekvence je L, V, I nebo M a (v) poloha 8 uvedené subsekvence je H, R nebo K.

• Φ

0 V

0 0

0 0

101

0 *0

0 0 0

0 0 · «000 00

0· 0·
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále navrhne peptid zahrnující subsekvenci identifikovanou ve stupni (c), kde tento peptid neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, čímž se navrhne peptid zahrnující epitop vázající alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, který je účinný při vyvolání imunitní odpovědi v populaci charakterizované přítomností alely A2 supertypu.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopů je Y nebo F nebo (ii) poloha 3 uvedeného epitopů je A.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopů je Y nebo F a (ii) poloha 3 uvedeného epitopů je A.
10. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se dále navrhne peptid zahrnující subsekvenci identifikovanou ve stupni (c), kde tento peptid neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, čímž se navrhne peptid zahrnující epitop vázající alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, který je účinný při vyvolání imunitní odpovědi v populaci charakterizované přítomností alely A2 supertypu.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopů je F nebo Y nebo (ii) poloha 3 uvedeného epitopů je F, Y nebo W nebo (iii) poloha 5 uvedeného epitopů je D nebo E nebo (iv) poloha 7 uvedeného epitopů je L, V, I nebo M nebo (v) poloha 8 uvedeného epitopů je H, R nebo K.

♦ ·

102 fcfcfcfc ·· • fc fcfc • fc • fc
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopu je F nebo Y a (ii) poloha 3 uvedeného epitopu je F, Y nebo W a (iii) poloha 5 uvedeného epitopu je D nebo E a (iv) poloha 7 uvedeného epitopu je L, V, I nebo M a (v) poloha 8 uvedeného epitopu je H, R nebo K.
13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále připraví peptid obsahující subsekvenci identifikovanou ve stupni (c), kde tento peptid neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, čímž se vyrobí peptid zahrnující epitop vázající alespoň tři HLA molekuly superrodiny HLA-A2.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopu je Y nebo F nebo (ii) poloha 3 uvedeného epitopu je A.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že (i) poloha 1 uvedeného epitopu je Y nebo F a (ii) poloha 3 uvedeného epitopu je A.
16. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se dále připraví peptid obsahující subsekvenci identifikovanou ve stupni (c), kde tento peptid neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, čímž se vyrobí peptid zahrnující epitop vázající alespoň tři HLA molekuly superrodiny HLA-A2.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že

9 9

9 9

103

9999 • 9

9 9 9

9 9

99 9 (i) poloha 1 uvedeného epitopů je F nebo Y nebo (ii) poloha 3 uvedeného epitopů je F, Y nebo W nebo (iii) poloha 5 uvedeného epitopů je D nebo E nebo (iv) poloha Ί uvedeného epitopů je L, V, I nebo M nebo (v) poloha 8 uvedeného epitopů je H, R nebo K.
18. Způsob podle nároku 17 (i) poloha 1 uvedeného epitopů je F nebo Y a (ii) poloha 3 uvedeného epitopů je F, Y nebo W a (iii) poloha 5 uvedeného epitopů je D nebo E a (iv) poloha 7 uvedeného epitopů je L, V, I nebo M a (v) poloha 8 uvedeného epitopů je H, R nebo K.
19. Způsob podle nároku 13 nebo 16, vyznačující se tím, že uvedený peptid má méně než 250 aminokyselin.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený peptid má méně než 50 aminokyselin.
21. Způsob podle nároku 13 nebo 16, vyznačující se tím, že se dále hodnotí schopnost uvedené subsekvence nebo uvedeného peptidu vázat molekulu HLA-A2.1 s hodnotou IC50 menší než 500 nM.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se dále hodnotí schopnost uvedené subsekvence nebo uvedeného peptidu vázat molekulu HLA-A2.1 s hodnotou IC50 menší než 100 nM.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se dále hodnotí schopnost uvedené subsekvence nebo uvedeného peptidu vázat molekulu HLA-A2.1 s hodnotou IC50 menší než 20 nM.

• ·

104
24. Způsob podle nároku 13 nebo 16, vyznačující se tím, že se dále testuje schopnost uvedené subsekvence nebo uvedeného peptidu být rozpoznáván HLA-A2 cytotoxickýmí T buňkami nebo stimulovat cytotoxickou T buněčnou odpověď.
25. Způsob navrhování peptidu účinného pro vyvolání imunitní odpovědi v populaci charakterizované přítomností alely A2 supertypu, přičemž tento peptid zahrnuje epitop tvořený 9 až 10 aminokyselinami, kterýžto epitop váže alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, vyznačující se tím, že (a) se poskytne aminokyselinová sekvence příslušného antigenů, (b) pomocí této sekvence se jako epitop identifikuje subsekvence tvořená 9 až 10 aminokyselinovými zbytky, která má ve své poloze 2 první aminokyselinovou kotvu vybranou ze skupiny tvořené L, Μ, V, T, Q, A a I a na svém C-konci druhou aminokyselinovou kotvu vybranou ze skupiny tvořené L, V, I, A, T a M, (c) identifikuje se fragment uvedeného antigenů, který obsahuje epitop identifikovaný ve stupni (b), kde tento fragment neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenů, (d) uvedený fragment se připraví a testuje na vazbu HLAA2.1 molekuly s hodnotou IC₅o menší než 500 nM a (e) stanoví-li se ve stupni (d), že uvedený fragment váže HLA-A2.1 molekulu s hodnotou IC50 menší než 500 nM, navrhne se peptid, který zahrnuje uvedený fragment, čímž se navrhne peptid zahrnující epitop, který váže alespoň tři HLA molekuly HLA-2 supertypu.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že se stanoví, že se uvedený fragment váže na HLA-A2.1 molekulu • ·

105 • · s hodnotou IC50 menší než 100 nM.
27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se stanoví, že se uvedený fragment váže na HLA-A2.1 molekulu s hodnotou IC50 menší než 20 nM.
28. Způsob navrhování peptidů účinného pro vyvolání imunitní odpovědi v populaci charakterizované přítomností alely A2 supertypu, přičemž tento peptid zahrnuje epitop tvořený 9 až 10 aminokyselinami, kterýžto epitop váže alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu, vyznačující se tím, že (a) se poskytne aminokyselinová sekvence příslušného antigenu, (b) pomocí této sekvence se identifikuje epitop, kterým je subsekvence tvořená 9 až 10 aminokyselinovými zbytky, která má ve své poloze 2 první aminokyselinovou kotvu, kterou je V, L nebo M, a na svém C-konci druhou aminokyselinovou kotvu, kterou je V, L nebo I, (c) identifikuje se fragment uvedeného antigenu, který obsahuje epitop identifikovaný ve stupni (b), kde tento fragment neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, a (d) navrhne se peptid, který zahrnuje uvedený fragment, kde tento peptid neobsahuje více než 15 souvislých aminokyselin uvedeného antigenu, čímž se navrhne peptid zahrnující epitop, který váže alespoň tři HLA molekuly HLA-A2 supertypu,
29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že první a/nebo druhou aminokyselinovou kotvou je V.