CZ20032081A3 - Kombinace inhibitoru interakce CD2/LFA-3 a UVB záření pro použití při léčení kožních onemocnění - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká CD2-vazebného agens, např. inhibitoru interakce CD2/LFA-3 (jako je např. LFA-3/IgG fúzní polypeptid), v kombinaci s pomocným agens, např. UVB zářením, pro použití při léčení nemoci, např. psoriázy nebo jiného epidermálního nebo dermálního onemocnění charakterizovaného aberantní aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že kožní choroby, jako je například psoriáza, ekzém, mycosis fungoídes, aktinokeratóza a lichen planus, postihují jedno až dvě procenta populace Spojených Států, přičemž každoročně se objeví 150 000 až 260 000 nových případů (Research Needs in 11 Major Areas in Dermatology, I. Psoriasis., J. Invest. Dermatol., 73: 402-13, 1979). Celá řada těchto kožních onemocnění je charakterizována zvýšenou aktivací T lymfocytů a abnormální prezentací antigenů v dermis a pokožce (Cooper, Immunoregulation in the Skin, v Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl. Dermatol., vyd. van Vloten et al., 19, s. 69-80 na s. 73, 74, 76, 1990). Například u kontaktní alergické dermatitidy je pozorována aktivace intrakutánních T lymfocytů. Je známo, že kůže pacientů s projevy atopické dermatitidy obsahuje zvýšený počet Langerhansových buněk (Cooper, Immunoregulation in the Skin, v Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl. Dermatol., vyd. van Vloten et al., 19, na s. 74, 1990) . V psoriatické kůži se vyskytuje zvýšený počet buněk prezentujících antigen, složených jak z Langerhansových buněk tak z buněk jiných než Langerhansových, buněk prezentujících antigen nesoucích MHC II. Třídy (Cooper, Immunoregulation in the Skin, v Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl. Dermatol., vyd. van Vloten et al., 19, na s. 75, 1990).

Kožní lymfom pocházející z řady T je charakterizovaný expanzí maligní klonální populace T lymfocytů v dermis a epidermis. Poškozené epidermální buňky obsahují zvýšený počet buněk prezentujících CD1⁺DR⁺ antigen (Cooper, Immunoregulation in the Skin v Cutaneous Lymphoma, Curr. Probl. Dermatol., vyd. van Vloten et al., 19, na s. 76-77, 1990).

V současnosti známá léčba výše uvedených kožních nemocí je omezena. Steroidy nebo cyklosporin A jsou obecně používány v léčbě psoriázy, lichen planus (lišej), urtikárie, atopické dermatitidy, UV poškození, pyoderma gangrenosum (pyodermie, hnisavé onemocnění kůže), vitiliga, oční jizevnatý pemfigoid, alopecia areata (alopecie, holohlavost), alergické a iritační kontaktní dermatitidy a kožního T lymfocytárního lymfomu. Kromě toho u části těchto kožních onemocnění různé terapie zahrnují retinoidy, PUVA, dusíkatý yperit, interferon, chemoterapii, metotrexát, terapii světlem (např. UV světlo a PUVA), antibiotika a antihistaminika. (Viz obecně např. Fitzpatrick, Dermatology in General Medicine, 3. vyd., McGraw Hill, 1987). Terapie UV světlem, obě terapie UVA a UVB, vystavují kůži UV záření mezi 320 až 400 nm (UVA záření) nebo 290 až 320 nm (záření UVB). PUVA terapie je forma fotochemoterapie, která zahrnuje opakovanou topickou aplikaci psoralenu nebo sloučeniny založené na psoralenu na postižený úsek kůže, a pak následuje expozice tohoto úseku UVA záření. Dalším způsobem použitým k léčbě proliferativních kožních nemocí, konkrétně psoriázy a mycosis fungoides (fungoidní mykóza) je fotodynamická terapie (PDT).

Vedlejší účinky těchto terapií jsou známy. Nejběžněji se projevující nevýhody cyklosporinu A zahrnují toxicitu způsobenou imunosupresí, a také renální a nervovou toxicitu. Steroidy mají dobře známé vedlejší účinky včetně indukce Cushingova syndromu. Vedlejší účinky některých dalších výše uvedených terapií zahrnují karcinomy kůže, toxické působení na kostní dřeň a tělesnou soustavu, kalcifikace ligament, fibrózu jater a další chorobné stavy. Co se týče terapie světlem, prodloužená léčba kožních nemocí s použitím těchto typů terapie může mít za následek významné akutní a chronické nepříznivé účinky včetně erytému, pruritu, karcinomů kůže a chronického poškození kůže indukovaného světlem (Stern et al., Ν. E. J. Med., 300: 809-812,1979).

V souladu s tím existuje potřeba zlepšených terapeutických způsobů prevence a léčení kožních onemocnění s projevy zvýšené aktivace T lymfocytů a abnormální prezentace antigenu.

• ·· ·

Podstata vynálezu

Vynález je částečně založen na objevu, že kombinace CD2-vazebného agens, např. LFA-3/IgG fúzního polypeptidů, a pomocného agens, např. UVB záření, je vysoce účinná v léčení psoriatických lézí. Pomocné agens je agens mající jednu nebo více následujících vlastností: (i) redukuje produkci a/nebo hladiny interferonu-γ (IFN-γ) , (ii) redukuje počet T lymfocytů v postižené tkáni, konkrétně CD69+ T lymfocytů, (iii) snižuje expresi CD40 ligandu (CD40L, tj . CD154) nebo (iv) zvyšuje odumírání T lymfocytů, např. apoptózou. Bez vazby na jakékoliv konkrétní teorie, má se za to, že léčba působí redukcí počtu a aktivity buněk typu Thl v psoriatických lézích. V souladu s tím se vynález týká způsobů a přípravků vhodných pro léčení nebo prevenci epidermálních nebo dermálních onemocnění charakterizovaných aberantní aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů.

Všeobecně se vynález týká léčení nebo prevence kožních onemocnění pacienta, např. epidermálního nebo dermálního onemocnění charakterizovaného aberantní (např. zvýšenou) aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů, např. lymfocytů typu Thl.

Kombinace podle vynálezu pro požití při léčení nebo prevenci výše zmíněných kožních onemocnění zahrnuje: Podávání CD2-vazebného agens, LFA3-vazebného agens nebo inhibitoru interakce CD2/LFA-3, např. CD2-vazebného agens, pacientovi, v kombinaci s pomocným agens, např. agens mající jednu nebo více následujících vlastností: (i) redukuje produkci a/nebo hladiny interferonu-γ (IFN-γ) , (ii) redukuje počet T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) v postižené tkáni,

- 5 4 4 4 44 4 konkrétně CD69+ T lymfocytů, (iii) snižuje expresi CD40 ligandu (CD40L) nebo (iv) zvyšuje odumírání T lymfocytů, např.

apoptózou, a takto se léčí nebo zabrání kožnímu chorobnému stavu.

Ve výhodném provedení je kožní chorobný stav charakterizovaný jedním nebo více následujícím: (i) zvýšené hladiny IFN, např. zvýšená produkce IFN-γ T lymfocyty, (ii) zvýšené hladiny populací T lymfocytů, např. CD3-, CD4-, CD8, CD45-a/nebo CD69-pozitivních T lymfocytů, (iii) zvýšená exprese CD40 ligandu nebo (iii) hyperproliferace keratinocytů.

Ve výhodném provedení je kožní chorobný stav chronický zánětlivý chorobný stav, např. psoriáza.

Ve výhodném provedení je kožní chorobný stav autoimunní choroba, např. chronická autoimunní choroba, např. psoriáza.

Ve výhodném provedení je kožní chorobný stav vybrán z jednoho nebo více onemocnění, jako je: psoriáza, atopická dermatitida, kožní lymfom pocházející z řady T, jako je například mycosis fungoides, alergická a iritační kontaktní dermatitida, lichen planus, alopecie, např. alopecia areata, pyoderma gangrenosum, vitiligo, oční jizevnatý pemfigoid nebo urticaria. Výhodně je kožní chorobný stav psoriáza, atopická dermatitida, alergická dermatitida nebo alopecia areata. Nejvýhodněji chorobný stav je psoriáza.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. homolog protilátky anti-CD2, rozpustný CD2-vazebný fragment LFA-3, CD2-vazebný fragment LFA-3 kondenzovaný, např. fúzovaný, k další skupině, např. celému plazmatického proteinu nebo jeho části, jako je například celý imunoglobulin nebo jeho část (např. IgG (např. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (např. IgAl, IgA2) , IgD

- 6 99 9 a IgE, ale výhodně IgG) nebo jeho fragment (např. imunoglobulinový konstantní úsek), sérový albumin (např. humánní sérový albumin) nebo syntetický hydrofilní polymer, jako například pegylací (např. PEG), CD2-vazebná malá molekula nebo peptidomimetikum, CD2-vazebný polypeptidový fragment identifikovaný např. vystavováním na fágu nebo s použitím peptidové kombinační knihovny.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je CD2-vazebný fragment LFA-3 fúzovaný k celému nebo části imunoglobulinového kloubového („hinge) úseku a konstantního úseku těžkého řetězce nebo jejích částem (např. LFA-3/IgG fúzní polypeptid, např. LFA-3/IgG fúzní polypeptid mající nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 7 a 8 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu). Ještě další výhodný LFA-3/IgG fúzní protein má aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obrázku 1 a je kódován nukleotidovou sekvencí ukázanou na stejném obrázku.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je rozpustný LFA-3 polypeptid, např. polypeptidy vybrané z aminokyselin 1 až 92, 1 až 80, 50 až 65, 20 až 80 LFA-3 sekvence ukázané v sekv. id. č. 3 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je homolog protilátky anti-CD2, např. monoklonální protilátky anti-CD2 (např. rekombinantní (např. chimérické nebo humanizované protilátky anti-CD2) nebo jejího fragmentu vázajícího antigen (např. Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 fragment, F(v) fragment nebo intaktní imunoglobulinový těžký řetězec homologu protilátky anti-CD2).

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens obsahuje první skupinu, která váže CD2 a druhou skupinu, která „rekrutuje »

efektorovou buňku. První skupina může být CD2-vazebný fragment LFA-3, např. fragment popsaný v tomto textu, nebo homolog protilátky, která váže CD2, např. homolog protilátky popsané v tomto textu. Druhá skupina může být polypeptid schopný rekrutovat efektorové buňky, jako jsou například zabíječské buňky („natural killer - NK) . Výhodně druhá skupina obsahuje: fragment imunoglobulinového konstantního úseku, např. imunoglobulinový fragment popsaný v tomto textu nebo F.c receptor (např. FcyRI nebo FcyRII) homologu vazebné protilátky.

V obzvláště výhodném provedení CD2-vazebné agens je chimérický, např. fúzní, polypeptid, který obsahuje CD2-vazebný fragment LFA-3 a polypeptid schopný rekrutovat efektorové buňky. Ve výhodném provedení chimérický nebo fúzní polypeptid obsahuje CD2-vazebný fragment LFA-3, např. fragment popsaný v tomto textu, nebo homolog protilátky, která váže CD2, např. homolog protilátky popsané v tomto textu a fragment imunoglobulinového konstantního úseku, např. imunoglobulinový fragment popsaný v tomto textu nebo Fc receptor homologu vazebné protilátky.

Ve výhodném provedení inhibitor interakce CD2/LFA-3 je LFA3-vazebné agens, např. homolog protilátky anti-LFA-3, rozpustný LFA3-vazebný fragment CD2, LFA3-vazebný fragment CD2 fúzovaný k další skupině, např. plazmatickému proteinu, jako je například imunoglobulin (např. IgG (např. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (např. IgAl, IgA2), IgD a IgE, výhodně IgG) nebo jeho fragment (např. imunoglobulinový konstantní úsek), sérový albumin (např. humánní sérový albumin) nebo pegylovaný protein, LFA3-vazebná malá molekula nebo peptidomimetikum, LFA-3-vazebný polypeptidový fragment identifikovaný, např. vystavováním na fágu nebo s použitím peptidové kombinační knihovny.

- 8 • to « · · · · ·· ··to ·

Ve výhodném provedení LFA3-vazebné agens je homolog protilátky anti-LFA-3, např. monoklonální protilátky anti-LFA-3 (např. rekombinantní (např. chimérické nebo humanizované protilátky anti-LFA-3) nebo jejího fragmentu vázajícího antigen (např. Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')₂ fragment, F(v) fragment nebo intaktní imunoglobulinový těžký řetězec homologu protilátky anti-LFA-3).

Ve výhodném provedení pomocné agens je agens, které přímo nebo nepřímo způsobí jedno nebo více: (i) redukci produkce a/nebo hladin interferonu-γ (IFN-γ), (ii) redukci počtu T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů), v postižené tkáni, konkrétně CD69+ T lymfocytů, (iii) pokles exprese CD40 ligandu (CD40L) nebo (iv) zvýšené odumírání T lymfocytů, např. apoptózou. Takové účinky mohou být následkem jednoho nebo více: redukce počtu nebo aktivity T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů), redukce počtu nebo aktivity imunitních buněk produkujících IFN-γ (např. T lymfocytů), sekvestrace nebo jiná inaktivace IFN-γ, interference se syntézou a/nebo sekrecí IFN-γ imunitní buňkou, indukce buňkami (např. efektorovými buňkami) zprostředkovaného usmrcování T lymfocyty (např. imunitními buňkami produkujícími IFN-γ). Příklady pomocných agens zahrnují: terapii světlem (např. UVA, UVB nebo PUVA), metotrexát, retínoidy, cyklosporin, etretinát, inhibitor cytokinů, např. makrolaktam (např. pimekrolimus), IFN-y-vazebné agens, např. protilátka anti-IFN-γ, nebo její fragment vázající antigen, antagonista

IFN-γ, nebo IFN^-receptoru, fragment vázající antigen, např. protilátka který inhibuje nebo její interakce

4 « · * 4 4 444444

4 4· 4 4 4 4 · * 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 · · · 444444 · 4

4 4 · * 4 · · 4 4 • 4 444 44 44 *· ·♦

IFN-y-receptoru, malá molekula nebo inhibitor typu peptidomimetika.

Ve výhodném provedení pomocné agens je vybráno ze skupiny, kterou tvoří: ultrafialové záření, např. záření UVA nebo UVB, záření PUVA, metotrexát, retinoidy, cyklosporin, etretinát, makrolid, makrolaktam (např. takrolimus (FK506) nebo askomycin makrolaktam (např. pimekrolimus) nebo jejich kterákoliv kombinace. Výhodné agens je záření UVB.

Ve výhodném provedení léčení dále zahrnuje monitorování pacienta, např. na výskyt symptomů nebo na změny v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo změny populace imunitních buněk (např. T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů), T lymfocytů produkujících IFN-γ) . Pacient může být monitorován před začátkem léčby, během léčby nebo poté, co byl podáván jeden nebo více prvků léčby. Monitorování může být použito pro hodnocení potřeby další léčby stejnými přípravky nebo další léčby jinými přípravky. Všeobecně pokles hladiny cytokinů, např. IFN-γ, nebo vybrané populace imunitních buněk (např. T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ) je ukazatel zlepšení chorobného stavu pacienta.

Léčba může zahrnovat kombinaci s ještě jinými agens. Ve výhodném provedení tedy způsob dále zahrnuje: pacientovi se podává agens, které inhibuje kostimulační signál receptoru T lymfocytů, např. inhibitor interakce B7-CD28, ICAM-LFA-1 nebo CD40-CD40L nebo kterékoliv jejich kombinace. Agens může být kterákoliv interagující molekula (např. protilátka nebo její fragment, rozpustný polypeptid, malá molekula nebo peptidomímetikum, které interferuje s ligandem (např. B7,

ICAM, CD40), vazebný protějšek ligandu (např. CD28, LFA-1, CD40L). Výhodně agens je homolog protilátky proti LFA-1 nebo CD40L, např. humanizovaná protilátka anti-LFA-1.

Ve výhodném provedení způsob dále zahrnuje: pacientovi se podává topicky aplikované agens, např. jeden nebo více členů ze skupiny, kterou tvoří steroid, vitamín (např. vitamín D) , dehet, anthralin, makrolid nebo makrolaktam, např. takrolimus (FK506) nebo askomycin makrolaktam (např. pimekrolimus).

Ve výhodném provedení pacient je savec, např. primát, výhodně vyšší primát, např. člověk. V jednom provedení pacient je pacient mající epidermální nebo dermální chorobu (např. pacient trpící mírnou, průměrnou nebo závažnou formou psoriázy).

Ve výhodném provedení kožní onemocnění postihuje epidermální, dermální nebo hypodermální tkáň. Výhodně kožní chorobný stav postihuje epidermální tkáň.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens a pomocné agens jsou podávána současně. V dalších provedeních CD2-vazebné agens a pomocné agens jsou podávána postupně, např. nejdříve podávání CD2-vazebného agens následované pomocným agens nebo naopak. CD2-vazebné agens a pomocné agens mohou být podávány v kombinaci s topickou terapií (např. steroid, vitamín (např. vitamín D) nebo dehet, anthralin nebo makrolaktam, např. takrolimus (FK506) nebo askomycin makrolaktam (např. pimekrolimus).

V jiném provedení CD2-vazebné agens a pomocné agens jsou podávána střídavě. Například podávání CD2-vazebného agens může být následováno střídavým schématem topických terapií, např. kúra steroidní terapie, následovaná vitamínovou kúrou (např. léčba vitamínem D3) , pak následovaná anthralinem. Může být použita kterákoliv kombinace a sekvence topických přípravků.

«4 ····

- 11 Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens a pomocné agens jsou podávána v dostatečně těsné blízkosti, např. prostorově nebo časově, tak, že žádaný účinek, např. snížení hladin IFN-γ, nebo redukce symptomů, je větší než účinek, který by byl pozorován, kdyby bylo pomocné agens podáváno bez CD2-vazebného agens nebo CD2-vazebné agens podáváno bez pomocného agens.

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je podáváno během kdy hladiny IFN-γ jsou redukovány IFN-γ redukčním Například CD2-vazebné agens může pacientovi, který má mírnou formu psoriázy, nebo po topické terapii jedním nebo více členy ze skupiny, kterou tvoří steroid, vitamín (např. vitamín D) , dehet, anthraliny, makrolidy nebo makrolaktamy, např. takrolimus (FK506) nebo askomycin makrolaktam (např. pimekrolimus) nebo kterákoliv jejich kombinace. Některým pacientům, např.

pacientům majícím mírnou až závažnou období, agens.

být podáváno současně, před formu psoriázy,

CD2-vazebné agens může být podáváno současně, před nebo po terapii světlem (např. léčbě UVB a/nebo PUVA). V dalších provedeních CD2-vazebné agens může být podáváno současně, před nebo po terapii světlem v kombinaci s jedním nebo více členy ze skupiny, kterou tvoří retinoidy, metotrexát nebo cyklosporin. V jednom provedení pacient s mírnou až závažnou psoriázou je léčen CD2-vazebným agens ve kterékoliv období během schématu obsahujícím: terapii světlem a retinoidy, následované metotrexátem, následované cyklosporinem.

V některých provedeních CD2-vazebné agens je podáváno systémově (např. intravenózně, intramuskulárně, infúzním zařízením nebo subkutánně). V jiném provedení CD2-vazebné agens je podáváno lokálně (např. topicky) na postiženou oblast, např. psoriatické leze.

♦ · fc fcfc fcfc·· fcfc • fcfc fcfc • · · · fc · • fcfc fcfc • 4 · · «fcfcfc • fcfcfc · fcfc fcfcfc • fcfcfcfc · · • fcfcfcfc

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens je LFA-3/IgG fúzní polypeptid a je podáván systémově. V jednom provedení LFA-3/IgG fúzní polypeptid je podáván pacientovi jednou týdně během terapeutického léčebného období dvanácti týdnů.

Ve výhodném provedení pomocné agens je podáváno lokálně, např. světelnou expozicí, např. záření UVA, UVB nebo PUVA. V dalších provedeních je systémově podáváno pomocné agens (např. metotrexát, perorální retinoidy, cyklosporin, makrolaktam (např. takrolimus nebo pimekrolimus).

Ve výhodném provedení pomocné agens je UVB, např. ultrafialové záření (světlo) v rozsahu 290 až 320 nm, výhodněji ve formě úzkého pásma UVB kolem 311 nm.

Kterákoliv kombinace zahrnující podávání CD2-vazebného agens a pomocného agens spadá také do rozsahu vynálezu.

CD2-vazebné agens a pomocné agens mohou být podávána během období aktivní nemoci nebo během období remise nebo méně aktivní nemoci. CD2-vazebné agens a pomocné agens mohou být podávána před léčbou, souběžně s léčbou, po léčení nebo během remise onemocnění.

V dalším aspektu se vynález týká kombinace pro použití při léčení nebo prevence psoriázy u pacienta. Kombinace zahrnuje:

Pacientovi se podává fúzní polypeptid, který obsahuje CD2-vazebný fragment LFA-3 fúzovaný k fragmentu konstantního úseku IgG, v kombinaci s množstvím UVB dostatečným pro snížení hladiny interferonu-γ v epidermis pacienta, a takto se léčí nebo zabrání psoriáze. Výhodně předkládaný kombinační léčebný způsob může mít za následek významně zesílený stupeň remise nemoci (včetně clearance) a/nebo významně prodloužené období remise nemoci nebo clearance, relativně k období, které by bylo dosaženo každým agens samotným.

9999 • · · » 0 0 0 0 0 0 0

0 0000 00 0

0 0 · 0 000000 0 0

0 00 0 0000

000 00 00 00 00

- 13 Ve výhodném provedení fragment LFA-3 je fúzován k celému nebo části imunoglobulinového kloubového („hinge) úseku a konstantnímu úseku těžkého řetězce, např. LFA-3/IgG fúzni polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou mající nukleotidovou sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 7 a mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 8, patentu Spojených Států č.

162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu). Ještě další výhodný LFA-3/IgG fúzni protein má aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obrázku 1 a je kódován nukleotidovou sekvencí ukázanou na stejném obrázku.

Ve výhodném provedení CD2-vazebný LFA-3 polypeptid

obsahuj e	aminokyseliny 1	až	92, 1	až 80	, 50 až	65, 20 až 80
z LFA-3	sekvence ukázané	v	sekv.	id. č.	3 patentu Spojených
Států č.	6 162 432, který	je	tímto	zahrnut formou	odkazu.
Ve	výhodném provedení	způsob	dále	zahrnuj e	monitorování

pacienta, např. na výskyt symptomů nebo na změny v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo změny populace imunitních buněk (např. např. T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ) . Pacient může být monitorován před začátkem léčby nebo poté, co byl podáván jeden nebo více prvků léčby. Monitorování může být použito pro hodnocení potřeby další léčby stejnými přípravky nebo další léčby jinými přípravky. Všeobecně pokles hladiny cytokinů, např. IFN-γ, nebo vybrané populace imunitních buněk (např. T lymfocytů, např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ) je ukazatel zlepšeného chorobného stavu pacienta.

Léčba může zahrnovat kombinaci s ještě jinými agens. Ve výhodném provedení tedy léčení dále zahrnuje: pacientovi se • · · « · · · • 4 · • · · • · · ·« ··« ** ·♦ ·· ···· • · · · · · · • · · 4 · · · • »44444 · « ♦♦ ·« ·♦ podává agens, které inhibuje kostimulační signál receptoru T lymfocytů, např. inhibitor B7/CD28, ICAM-LFA-1 nebo CD40-CD40L (tj . CD154) nebo kterékoliv jejich kombinace. Agens může být kterákoliv interagující molekula (např. protilátka nebo její fragment, rozpustný polypeptid, malá molekula nebo peptidomimetikum, které interferuje s ligandem (např. B7, ICAM, CD40), vazebný protějšek ligandu (např. CD28, LFA-1, CD40L). Výhodně agens je homolog protilátky proti LFA-1, např. humanizovaná protilátka anti-LFA-1.

Ve výhodném provedení způsob dále zahrnuje: pacientovi se podává topicky aplikované agens, např. jeden nebo více členů ze skupiny, kterou tvoří steroid, vitamín (např. vitamín D) , dehet nebo anthralin.

Ve výhodném provedení pacient je savec, např. primát, výhodně vyšší primát, např. člověk, např. pacient mající epidermální nebo dermální chorobu (např. pacient trpící mírnou, průměrnou nebo závažnou formou psoriázy).

Ve výhodném provedení fúzní polypeptid a UVB jsou podávány současně. V dalších provedeních CD2-vazebné agens a pomocné agens jsou podávána postupně, např. nejdříve podávání fúzního proteinu následované UVB léčbou nebo naopak. Jestliže je nejdříve podáváno UVB, fúzní protein by měl být podáván dokud ještě trvají UVB terapeutické účinky, např. snížení hladiny IFN-γ. Jestliže je nejdříve podáván fúzní protein, UVB by mělo být podáváno dokud ještě trvá terapeutický účinek fúzního proteinu, např. snížení hladiny IFN-γ.

Fúzní polypeptid a UVB mohou být podávány v kombinaci vitamín D) takrolimus s topickou terapií (např. steroid, vitamín (např. nebo dehet, anthraliny nebo makrolaktamy, např.

(FK506) nebo askomycin makrolaktam (např. pimekrolimus). V dalších provedeních fúzní polypeptid a UVB jsou podávány

střídavě. V jednom provedení podávání CD2-vazebného agens může být následováno střídavým schématem topických terapií, např. kúra steroidní terapie, následovaná vitamínovou kúrou (např. léčba vitamínem D3), pak následovaná anthralinem.

Může být použita kterákoliv kombinace a sekvence topických a/nebo systémových přípravků.

Ve výhodném provedení fúzní polypeptid a UVB jsou podávány v dostatečně těsné blízkosti, např. prostorově nebo časově, tak, že účinek, např. snížení hladin IFN-γ, nebo redukce symptomů, je větší než účinek, který by byl pozorován, kdyby bylo UVB podáváno bez fúzního polypeptidů nebo kdyby fúzní polypeptid byl podáván bez UVB.

V některých provedeních fúzní polypeptid je podáván systémově (např. intravenózně, intramuskulárně, infúzí (např. infúzním zařízením) nebo subkutánně). V jednom provedení fúzní polypeptid je podáván pacientovi jednou v terapeutickém léčebném období dvanácti týdnů.

Ve výhodném provedení pomocné agens je UVB, např. ultrafialové světlo v rozsahu 290 až 320 nm, výhodněji ve formě úzkého pásma UVB kolem 311 nm.

Ve výhodném provedení UVB je podáváno lokálně, např. světelnou expozicí, např. UVB zářením.

Fúzní polypeptid a/nebo UVB mohou být podávány během období aktivní nemoci nebo během období remise nebo méně aktivní nemoci.

V dalším aspektu se vynález týká léčení nebo prevence chorobného stavu pacienta, např. zánětlivého chorobného stavu. Zánětlivý chorobný stav může být chronický zánětlivý chorobný stav, např. chronický zánětlivý chorobný stav, charakterizovaný aberantní (např. zvýšenou) aktivitou nebo

• ·	•	99	99	9999
•	•	• ·	9	9	9	9	9	9 1
•	9	«	9	9	•	9	9	• ·
•	*	•	9 9	9	* ·	9	9 9	• ·
• ·		99 9	99		99		99	• 9

proliferaci T lymfocytů, např. lymfocytů typu Thl. Kombinace zahrnuje:

Pacientovi se podává inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. inhibitor, jak byl popsán v tomto textu, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, a takto se léčí nebo zabrání chronickému zánětlivému chorobnému stavu.

Ve výhodném provedení způsob dále zahrnuje monitorování změn v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo v populaci imunitních buněk (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ), kde pokles v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo v populaci imunitních buněk je ukazatel zlepšeného chorobného stavu pacienta.

Ve výhodném provedení chronický zánětlivý chorobný stav je psoriáza.

V dalším aspektu se vynález týká léčení nebo prevence autoimunní choroby pacienta. Autoimunní choroba může být chronická autoimunní choroba, charakterizovaná aberantní (např. zvýšenou) aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů, např. lymfocytů typu Thl. Kombinace zahrnuje:

Pacientovi se podává inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. inhibitor, jak byl popsán v tomto textu, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, a takto se léčí nebo zabrání autoimunní chorobě.

Ve výhodném provedení způsob dále zahrnuje monitorování změn v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo v populaci imunitních buněk (např. CD8/CD45 R0+ lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ), kde pokles v hladině cytokinů, např. IFN-γ, nebo v populaci ·

• · · • · • · • 9 • 9 9 ·· ·· 9« »1·· • · · · · a · • * a · · · a aa «··«·· · « • 9 9 · a 9 a

99 99 99 imunitních buněk je ukazatel zlepšeného chorobného stavu pacienta.

Ve výhodném provedení autoimunní choroba je psoriáza, diabetes mellitus, artritida (včetně revmatoidní artritidy, juvenilní revmatoidní artritidy, osteoartritidy, psoriatické artritidy) , sclerosis multiplex, encefalomyelitida, myasthenia gravis, systémový lupus erythematosus, autoimunní thyreoiditida, dermatitida (včetně atopické dermatitidy a ekzematózní dermatitidy)).

Ve výhodném provedení autoimunní choroba postihuje buňku, tkáň nebo orgán na tělesném povrchu nebo v jeho blízkosti, např. epidermální, dermální, oční, bukální, a/nebo nazofaryngeální sliznice. V dalších provedeních autoimunní choroba postihuje buňku, tkáň nebo orgán, který může být zpřístupněn s použitím aplikačního zařízení, např. endoskopu nebo jehly.

Ve výhodném provedení autoimunní choroba je vybrána z psoriázy nebo dermatitidy (včetně atopické dermatitidy a ekzematózní dermatitidy).

V dalším aspektu se vynález týká léčení nebo prevence pacienta s psoriázou. Kombinace zahrnuje to, že se pacientovi podává inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. CD2-vazebné agens, v kombinaci s agens vybraným ze skupiny, kterou tvoří záření (např. UVB nebo PUVA záření), metotrexát, retinoid (např. perorální retinoid) a cyklosporin, a takto se léčí nebo zabrání psoriáze.

Ve výhodném provedení agens je záření, např. UVB záření.

V ještě dalším aspektu se vynález týká modulace (např. snížení) aktivity nebo proliferace T lymfocytů (např. paměťových efektorových T lymfocytů (např. CD8/CD45 R0+

·· • ·	• ·· 9^	•	♦ ··
• ·	•	• · · «
• ·	•	• ·	• ··· · ·	•
• ·	•	«	• · ·	•	A
·«	··*		·· Λ·	··	··

lymfocytů nebo CD4/CD45 R0+ lymfocytů) nebo T lymfocytů produkujících IFN-γ) . Kombinace zahrnuje:

Kontakt T lymfocytů s inhibitorem interakce CD2/LFA-3, např. CD2-vazebné agens, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, v množství dostatečném k modulování, např. snížení, aktivity nebo proliferace T lymfocytů.

Výše popsaný způsob může být použit v bezbuněčných podmínkách (např. rekonstitutovaný systém), na buňkách v kultuře, např. in vitro nebo ex vivo (např. kultury obsahující T lymfocyty). Například buňky mohou být pěstovány in vitro v kultivačním médiu a inhibitor a/nebo agens, jak byly popsány v tomto textu, mohou být zavedeny do kultivačního média. V dalších provedeních jsou T lymfocyty odebrány pacientovi před krokem kontaktu. Ošetřené buňky pak mohou být vráceny pacientovi. Alternativně může být způsob prováděn na buňkách přítomných v pacientovi např. jako část in vivo (např. terapeutického nebo profylaktického) terapeutického protokolu.

V dalším aspektu se vynález týká přípravku (např. farmaceutického přípravku), který obsahuje inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. inhibitor interakce CD2/LFA-3, jak byl popsán v tomto textu, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu se vynález týká soupravy, která obsahuje inhibitor interakce CD2/LFA-3, např. inhibitor interakce CD2/LFA-3, jak byl popsán v tomto textu, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, nebo instrukce na použití kombinace takových přípravků.

Ve výhodném provedení inhibitor interakce CD2/LFA-3 je LFA3/Ig fúzní polypeptid. Výhodně LFA-3/Ig fúzní polypeptid je lyofilizován.

Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou více zjevné z následujícího podrobného popisu, obrázků a připojených patentových nároků.

Podrobný popis vynálezu

Aby mohlo být předkládanému vynálezu snadněji porozuměno, jsou nejdříve definovány určité termíny. Další definice jsou uvedeny dále v popisu.

Jak se v tomto textu používá, termín CD2 znamená CD2 polypeptid, který interaguje s (např. se váže k) přirozeně se vyskytujícímu LFA-3 polypeptidů a který má nebo je homologní (např. alespoň přibližně 85% homologíe) s aminokyselinovou sekvencí, jak je ukázaná v sekv. id. č. 5 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu, nebo který je kódován (a) přirozeně se vyskytující savčí CD2 sekvencí nukleové kyseliny (např. sekv. id. č. 5 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu), (b) sekvencí nukleové kyseliny degenerovanou na přirozeně se vyskytující CD2 sekvencí nukleové kyseliny, (c) sekvencí nukleové kyseliny alespoň z 85 % homologní s přirozeně se vyskytující savčí CD2 sekvencí nukleové kyseliny (např. sekv. id. č. 5 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu) nebo (d) sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje s jednou z předcházejících sekvencí nukleové kyseliny v podmínkách totožných přibližně s 20 °C až 27 °C pod Tm a 1M chloridem

sodným, např. se sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje s jednou z předcházejících sekvencí nukleové kyseliny ve stringentních podmínkách, např. vysoce stringentních podmínkách.

Jak se v tomto textu používá, termín LFA-3 znamená LFA-3 polypeptid, který se váže k přirozeně se vyskytujícímu CD2 polypeptidu a který má nebo je homologní (např. alespoň přibližně 85% homologie) s aminokyselinovou sekvencí, jak ukázaná v sekv. id. č. 1 nebo 3 patentu Spojených Států č. 6 162 432 nebo který je kódován (a) přirozeně se vyskytující savčí LFA-3 sekvencí nukleové kyseliny (např. sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 3 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu), (b) sekvencí nukleové kyseliny degenerovanou na přirozeně se vyskytující LFA-3 sekvenci nukleové kyseliny, (c) sekvencí nukleové kyseliny alespoň z 85 % homologní s přirozeně se vyskytující savčí LFA-3 sekvencí nukleové kyseliny (např. sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 3 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu) nebo (d) sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje s jednou z předcházejících sekvencí nukleové kyseliny v podmínkách totožných přibližně s 20 °C až 27 °C pod Tm a 1M chloridem sodným, např. se sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje s jednou z předcházejících sekvencí nukleové kyseliny ve stringentních podmínkách, např. vysoce stringentních podmínkách.

CD2-vazebné agens je agens, které interaguje s (např. se váže k) CD2 a výhodně moduluje (výhodně snižuje) CD2/LFA-3 interakci a/nebo moduluje CD2 signalizaci. Příklady CD2-vazebných agens zahrnují: rozpustné LFA-3-vazebné fragmenty přirozeně se vyskytujícího CD2 ligandů, rozpustné

fúze jejich LFA-3 nebo CD2-vazebných fragmentů s dalším proteinem nebo polypeptidem, např. imunoglobulinem nebo jeho fragmentem, LFA-3/CD2 fúzní polypeptid, protilátky, které vážou CD2, např. rekombinantní, monoklonální, chimérická, CDR-roubovaná, humanizovaná, humánní nebo hlodavci protilátka a malé molekuly nebo peptidomimetika.

LFA3-vazebné agens je agens, které interaguje s (např. se váže k) LFA-3 a výhodně moduluje (výhodně snižuje) CD2/LFA-3 interakci a/nebo moduluje LFA-3 signalizaci. Příklady LFA3- vazebných agens zahrnují: rozpustné CD2-vazebné fragmenty přirozeně se vyskytujícího LFA-3 ligandu, rozpustné fúze jejich CD2 nebo LFA-3-vazebných fragmentů s dalším proteinem nebo polypeptidem, např. imunoglobulinem nebo jeho fragmentem, LFA-3/CD2 fúzní polypeptid, protilátky, které vážou LFA-3, např. rekombinantní, monoklonální, chimérická, CDR-roubovaná, humanizovaná, humánní nebo hlodavci protilátka a malé molekuly nebo peptidomimetika.

LFA-3/IgG fúzní polypeptid je fúzní polypeptid, který obsahuje LFA-3 sekvenci, která váže CD2 a celou nebo část imunoglobulinové sekvence, např. část ímunoglobulinové sekvence, která interaguje s Fc receptorem. LFA-3 sekvence může být kompletní LFA-3 nebo její CD2-vazebný fragment. Ve výhodném provedení LFA-3 sekvence je humánní LFA-3 a výhodně sekvence, která je totožná s jednou nebo oběma alelami pacienta. Další provedení mohou zahrnovat modifikovanou LFA-3 sekvenci, např. tu, která se liší od humánní LFA-3 sekvence alespoň o 1, ale méně než o 3, 4, 5 nebo 6 zbytků. (Kompletní aminokyselinová sekvence humánní LFA-3 je uvedena v sekv. id. č. 1 nebo 3 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu). Obzvláště výhodný LFA-3/IgG fúzní protein je kódovaný nukleovou kyselinou mající

nukleotidovou sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 7 a mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 8 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu. Ještě další výhodný LFA-3/IgG fúzní protein (také nazýván v tomto textu jak velký sestřihový produkt) má aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obrázku 1 a je kódován nukleotidovou sekvencí ukázanou na stejném obrázku. Signální peptid odpovídá aminokyselinám 1 až 28 obrázku 1, zralý LFA-3 úsek odpovídá aminokyselinám 29 až 120 obrázku 1 a IgGl úsek odpovídá aminokyselinám 121 až 351 obrázku 1.

Jak se v tomto textu používá, rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid je LFA-3 nebo CD2 polypeptid neschopný zachytit se (ukotvit se) sám v biologické membráně. Takové rozpustné polypeptidy zahrnují například CD2 a LFA-3 polypeptidy, které postrádají podstatnou část své membránové domény pro zakotvení polypeptidů nebo jsou modifikovány tak, že membránová doména je nefunkční. Jak se v tomto textu používá, rozpustné LFA-3 polypeptidy zahrnují kompletní nebo zkrácený (např. s vnitřními delecemi) PI-navázaný LFA-3.

Jak se v tomto textu používá, homolog protilátky je protein obsahující jeden nebo více polypeptidů vybraných z imunoglobulinových lehkých řetězců, imunoglobulinových těžkých řetězců a jejich fragmentů vázajících antigen, které jsou schopné vazby k jednomu nebo více antigenům. Jednotlivé polypeptidy homologu protilátky složeného z více než jednoho polypeptidů mohou volitelně být vázány disulfidovými můstky nebo jinak kovalentně zesítěný. V souladu s tím homology protilátek zahrnují intaktní imunoglobuliny typů IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (a také jejich podtypy), kde lehké řetězce imunoglobulinu mohou být typů kappa nebo lambda. Homology protilátek také zahrnují části intaktních imunoglobulinů, které si podrží antigen-vazebnou specifitu, například Fab fragmenty, Fab' fragmenty, F(ab')₂ fragmenty, F(v) fragmenty, monomery nebo dimery těžkého řetězce, monomery nebo dimery lehkého řetězce, dimery, které tvoří jeden těžký a jeden lehký řetězec apod.

Jak se v tomto textu používá, humanizovaný rekombinantní homolog protilátky je homolog protilátky, vytvořený rekombinantní DNA technologií, ve kterém některé nebo všechny aminokyseliny humánního imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězec, které jsou vyžadovány pro vazbu antigenu, byly substituovány odpovídajícími aminokyselinami imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce savce jiného původu než lidského.

Jak se v tomto textu používá, chimérický rekombinantní homolog protilátky je homolog protilátky, vytvořený rekombinantní DNA technologií, ve kterém celý nebo část kloubového („hinge) úseku a konstantních úseků imunoglobulinového lehkého řetězce, těžkého řetězce nebo obou byly substituovány odpovídajícími úseky dalšího imunoglobulinového lehkého řetězce nebo těžkého řetězce.

vysoce stringentních s komplementárním vláknem

Sekvence podobné nebo homologní (např. alespoň přibližně 85% sekvenční identita) se sekvencí popsanou v tomto textu jsou také součástí této přihlášky. V některých provedení sekvenční identita může být přibližně 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší. Alternativně, podstatná identita existuje, když segmenty nukleové kyseliny budou hybridizovat v selektivních hybridizačních podmínkách (např.

hybridizačních podmínkách)

Nukleové kyseliny mohou být přítomny v celých buňkách, v buněčném lyzátu nebo v částečně purifikované nebo v podstatě čisté formě.

- 24 • ·· ·

Výpočty homologie nebo sekvenční identity mezi dvěma sekvencemi (termíny jsou v tomto textu používané zaměnitelně) jsou prováděny takto. Sekvence jsou porovnány pro účely optimálního srovnání (např. mezery mohou být zavedeny do jedné nebo obou z první a druhé aminokyselinové sekvence nebo sekvence nukleové kyseliny pro optimální porovnání a nehomologní sekvence mohou být přehlíženy pro účely srovnání). Ve výhodném provedení délka referenční sekvence porovnávané pro účely srovnání je alespoň 30 %, výhodně alespoň 40 %, výhodněji alespoň 50 %, dokonce výhodněji alespoň 60 % a dokonce výhodněji alespoň 70 %, 80 %, 90 %, 100 % délky referenční sekvence. Aminokyselinové zbytky nebo nukleotidy v odpovídajících aminokyselinových polohách nebo nukleotidových polohách jsou pak srovnávány. Když poloha v první sekvenci je zabrána stejným aminokyselinovým zbytkem nebo nukleotidem jako v odpovídající poloze ve druhé sekvenci, pak molekuly jsou totožné v této poloze (jak se v tomto textu používá, termín identita aminokyselin nebo nukleových kyselin je totožný s termínem homologie aminokyselin nebo nukleových kyselin). Procento identity mezi dvěma sekvencemi je funkce počtu identických poloh sdílených sekvencemi, přičemž se bere v úvahu počet mezer a délka každé mezery, které je zapotřebí zavést pro optimální porovnání dvou sekvencí.

Srovnání sekvence a stanovení procenta identity mezi dvěma sekvencemi může být uskutečněno s použitím matematického algoritmu. Ve výhodném provedení procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi je určováno s použitím algoritmu autorů Needleman a Wunsch (1970, J. Mol. Biol., 48: 444-453), který byl zaveden do programu GAP v softwaru GCG (dostupné na adrese http://www.gcg.com), s použitím buď matice Blossum 62 nebo matice PAM250 a váha pro mezeru („gap weight) 16, 14,

12, 10, 8, 6 nebo 4 a váha délky („length weight) 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6. V ještě dalším výhodném provedení procento identity mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi je určováno s programu GAP v softwaru GCG (dostupné na adrese http://www.gcg.com), s použitím NWSgapdna. Matice CMP a gap weight 40, 50, 60, 70 nebo 80 a length weight 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6. Obzvláště výhodný soubor parametrů (a jediný, který by měl být použit, jestliže si je odborník nejistý, jaké parametry by měly být použity pro určení, zda molekula je v sekvenční identitě nebo homologii podle mezí vynálezu) je Blossum 62 skórující matice s penaltou pro mezeru („gap penalty) 12, penaltou pro prodlouženou mezeru („gap extend penalty) 4 a penaltou pro mezeru měnící čtecí rámec („frameshift gap penalty) 5.

Jak se v tomto textu používá, termín homologní je synonymum s termínem podoba a znamená, že požadovaná sekvence se liší od referenční sekvence přítomností jedné nebo více substitucí aminokyselin (ačkoli mírné inzerce nebo delece aminokyselin) mohou také být přítomny. V současnosti výhodné prostředky pro výpočet stupně homologie nebo podobnosti s referenční sekvencí jsou prostřednictvím použití algoritmů v daném pořadí, prostřednictvím v http://blast.wustl.edu a http://pfam.wust!. Edu, v každém případě, s použitím výchozích hodnot algoritmu nebo doporučených parametrů pro určování významnosti vypočtené příbuznosti sekvencí. Procento identity mezi dvěma aminokyselinami nebo nukleotidovými sekvencemi může také být určeno s použitím algoritmu autorů E. Meyers a W. Miller (1989, CABIOS, 4: 11-17), který byl zaveden do programu ALIGN (verzi 2.0), s použitím PAM120 tabulky reziduálních vah („weight residue table), gap length penalty 12 a gap penalty 4.

BLAST a Pfam dostupných, Washington University

I

- 26 • · fcfc fc···

• fcfcfc · · · • fcfcfcfc

Jak se v tomto textu používá, termín hybridizuje ve stringentních podmínkách popisuje podmínky pro hybridizaci a promývání. Stringentní podmínky jsou odborníkům známy a mohou být zjištěny v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ν. Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. V této práci jsou popsány vodné a nevodné metody a každá může být použita. Výhodným příkladem stringentních hybridizačních podmínek je hybridizace v 6x chlorid sodný/citrát sodný (SSC) v přibližně 45 °C, následovaná jedním nebo více promytími v 0,2x SSC, 0,1% SDS v 50 °C. Dalším příkladem stringentních hybridizačních podmínek je hybridizace v 6x SSC v přibližně 45 °C, následovaná jedním nebo více promytími v 0,2x SSC, 0,1% SDS v 55 °C. Dalším příkladem stringentních hybridizačních podmínek je hybridizace v 6x SSC v přibližně 45 °C, následovaná jedním nebo více promytími v 0,2x SSC, 0,1% SDS v 60 °C. Výhodné stringentní hybridizační podmínky jsou hybridizace v 6x SSC v přibližně 45 °C, následovaná jedním nebo více promytími v 0,2x SSC, 0,1% SDS v 65 °C. Obzvláště výhodné vysoce stringentní podmínky (a podmínky, které by měl být použity jestliže odborník si je nejistý, které podmínky by měly být použity, aby se určilo, zda molekula je v hybridizačním limitu podle vynálezu) jsou 0,5M fosfát sodný, 7% SDS v 65 °C, následované jedním nebo více promytími v 0,2x SSC, 1% SDS v 65 °C.

Rozumí se, že polypeptidy podle vynálezu mohou mít další substituce konzervativních nebo neesenciálních aminokyselin, které nemají podstatný účinek na funkce polypeptidů. Zda konkrétní substituce bude nebo nebude tolerována, tj. zda nepříznivě neovlivní požadované biologické vlastnosti, jako je například vazebná aktivita, může být určeno tak, jak bylo popsáno v práci Bowie, JU et al., 1990, Science, 247: 13061310.

4 4 4 4 4 4 444444

4 4 4 · 4 · · 44 ·

4 4 44 *44444 4 4

4 4· 4 44*4

444 44 44 4· 44

Konzervativní substituce aminokyseliny je ta, při které je aminokyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem majícím podobný postranní řetězec. V oboru byly definovány rodiny aminokyselinových zbytků mající podobné postranní řetězce. Tyto rodiny zahrnují aminokyseliny s bazickými postranními řetězci (např. lysin, arginin, histidin), kyselými postranními řetězci (např. asparagová kyselina, glutamová kyselina), polárními postranními řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), nepolárními postranními řetězci (např. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), β-rozvětvenými postranními řetězci (např. threonin, valin, izoleucin) a aromatickými postranními řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin).

Neesenciální aminokyselinový zbytek je zbytek, který může být změněn oproti sekvenci divokého typu hybridní protilátky, bez zrušení nebo výhodněji bez podstatné změny

biologické aktivity, zbytek má za následek	zatímco esenciální	aminokyselinový
takovou	změnu.
Kožní onemocnění
Kombinace podle	tohoto	vynálezu	j sou	použitelné pro
prevenci nebo léčbu	kožních	onemocnění	savců	, např. primátů

nebo člověka, charakterizovaných zvýšenou aktivací T lymfocytů a abnormální prezentací antigenu v dermis a epidermis, podáváním inhibitorů interakce CD2/LFA-3. Tyto chorobné stavy jsou psoriáza, UV poškození, atopická dermatitída, kožní lymfom pocházející z řady T, jako je například mycosis fungoides, alergická a iritační kontaktní dermatitída, lichen planus, alopecie, např. alopecia areata, pyoderma gangrenosum, vitiligo, oční jizevnatý pemfigoid a urtikárie. Rozumí se, že

9 9 ·· 9 9 ······ ···· 9 9 · 9 9 9 9 · 9 · · 9 999 9 9 · ·

9 99 9 9999 způsoby léčení a profylaxe kožních onemocnění, jako je například pyoderma gangrenosum a urtikárie, jsou zahrnuty v rozsahu předkládaného vynálezu. Tyto dále uvedené kožní chorobné stavy jsou také dermatózy citlivé na cyklosporin A a proto zahrnují aktivaci T lymfocytů. Výhodně způsoby podle vynálezu jsou použity v profylaxe nebo léčbě psoriázy, atopické dermatitidy, alergické dermatitidy nebo alopecia areata a výhodněji, psoriázy.

Kombinace podle vynálezu mohou být aplikovány na kteréhokoliv pacienta, např. savce, výhodně na lidi. Jak se v tomto textu používá, termín pacient zahrnuje člověka a také zvířata jiného než lidského původu. Výhodně je pacient lidský pacient, který má kožní choroby charakterizované zvýšenou aktivací T lymfocytů a abnormální prezentací antigenu v dermis a epidermis. Termín zvířata jiného než lidského původu podle vynálezu zahrnuje všechny obratlovce, např. savce, jako jsou například primáti jiného než lidského původu (konkrétně vyšší primáty), ovce, pes, hlodavci (např. myši nebo laboratorní potkani), morče, koza, prase, kočka, králíci, krávy a zvířata, která nejsou savci, jako jsou například kuřata, obojživelníci, plazi, apod.

Inhibitory interakce CD2/LFA-3

Kterýkoliv inhibitor interakce CD2/LFA-3 je použitelný ve způsobech podle tohoto vynálezu. Takové inhibitory zahrnují např. homolog protilátky anti-LFA-3, homolog protilátky anti-CD2, rozpustné LFA-3 polypeptidy, rozpustné CD2 polypeptidy, malé molekuly (např. chemické agens mající molekulovou hmotnost menší než 2500 D, výhodně menší než 1500 D, chemická, např. malá organická molekula, např. produkt kombinační knihovny), LFA-3 a CD2 mimetika a jejich deriváty.

Výhodné inhibitory jsou rozpustné LFA-3 polypeptidy a homology protilátky anti-LFA-3.

·· · ·· ·· ·· ·«·· ···· ···· ·· to •to · · · · ··· · · to · ··· ·· · · · · ·

Použitelnost specifických rozpustných CD2 polypeptidu, rozpustných LFA-3 polypeptidu, homologů protilátky anti-LFA-3, homologů protilátky anti-CD2 nebo CD2 a LFA-3 mimetik může snadno být určena testováním jejich schopnosti inhibovat interakci LFA-3/CD2. Tato schopnost může být testována například s použitím jednoduchého vazebného buněčného testu, který umožňuje vizuální (se zvětšením) vyhodnocení schopnosti předpokládaného inhibitoru inhibovat interakci mezi LFA-3 a CD2 na buňkách nesoucích tyto molekuly. Jako CD2+ substrát jsou výhodné Jurkat buňky a jako LFA-3+ jsou výhodné ovčí červené krvinky nebo humánní JY buňky. Vazebné charakteristické vlastnosti rozpustných polypeptidů, homologů protilátky a mimetik použitelných v tomto vynálezu mohou být testovány několika známými způsoby, jako například radioaktivním značením homologu protilátky, polypeptidu nebo agens (např.

35_c nebo

125

I),a pak kontaktem značeného polypeptidu, mimetika agens nebo homologu protilátky s CD2+ buněk LFA-3+, dle vhodnosti. Vazebné charakteristické vlastnosti mohou také být testovány s použitím vhodné enzymaticky značené sekundární protilátky. Mohou také být použity rozetové kompetitivní testy, jako jsou například testy popsané autory Seed et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, s. 3365-69, 1987).

Homology protilátek anti-LFA-3 a anti-CD2

Mnoho typů homologů protilátek anti-LFA-3 nebo anti-CD2 je použitelných ve způsobech podle tohoto vynálezu. Zahrnují monoklonální protilátky, rekombinantní protilátky, chimérické rekombinantní protilátky, humanizované rekombinantní * *· 00 00 0000 00 00 0000 00 0

0 0 00 0 ··0 0 0 0 0 protilátky, a také části vázající antigen předcházejících protilátek.

Z homologů protilátky anti-LFA-3 je výhodné použít monoklonální protilátky anti-LFA-3. Je výhodnější použít monoklonální protilátku anti-LFA-3 vytvářenou hybridomem vybraným ze skupiny hybridomů, která mají přístupová čísla ATCC HB 10693 (1E6), ATCC HB 10694 (HC-1B11) , ATCC HB 10695 (7A6) a ATCC HB 10696 (8B8) nebo monoklonální protilátku známou jako TS2/9 (Sanchez-Madrid et al., Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte-Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 and LFA-3, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, s. 7489-93, 1982). Nejvýhodněji je monoklonální protilátka anti-LFA-3 vytvářená hybridomem vybraným ze skupiny hybridomů, která mají přístupová čísla ATCC HB 10695 (7A6) a ATCC HB 10693 (1E6).

Z homologů protilátky anti-CD2 je výhodné použít monoklonální protilátky anti-CD2, jako jsou například anti-CD2 monoklonální protilátky známé jako epitop Τ11χ protilátek, včetně TS2/18 (Sanchez-Madrid et al., Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte-Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 and LFA-3, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, s. 7489-93, 1982) .

Technologie produkce monoklonálních protilátek je dobře známa. Ve stručnosti, imortalizovaná buněčná linie (typicky myelomové buňky) je fúzovaná k lymfocytům (typicky splenocytům) savce imunizovaného přípravkem obsahujícím daný antigen a na tkáňových supernatantech buněk výsledného hybridomů je prováděn screening na protilátky proti antigenu. (Viz obecně, Kohler et al., Nátuře, Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, 256, s. 495-97, 1975). Použitelný imunogeny pro účel podle tohoto vynálezu zahrnují buňky, které nesou CD2 nebo LFA-3, a také bezbuněčné preparáty obsahující LFA-3, CD2 nebo jejich vazebné fragmenty, které vážou opačný receptor (např. CD2 fragmenty, které vážou LFA-3 nebo LFA-3 fragmenty, které vážou

CD2) .

·· * 44 44 ·*4 4 «4·· · · · · · 4 · • 4 4 · · 444444 · ·

4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 444 44 ·4 44 44

Imunizace může být uskutečněna s použitím standardních postupů. Jednotková dávka a režim imunizace závisí na druhu imunizovaného savce, jeho stavu imunity, tělesné hmotnosti savce, apod. Typicky je imunizovanému savci odebrána krev a sérum z každého vzorku krve je testováno na konkrétní protilátky s použitím vhodných screeningových testů. Například použitelné anti-LFA-3 nebo anti-CD2 protilátky mohou být identifikovány testováním schopnosti imunního séra blokovat tvorbu rozet Jurkat buněk ovčími červenými krvinkami, což je důsledek přítomnosti LFA-3 a CD2 na odpovídajícím povrchu těchto buněk. Lymfocyty použité pro produkci hybridomových buněk jsou typicky izolovány z imunizovaných savců, jejichž séra už byla testována jako pozitivní požadovaných protilátek s použitím těchto testů.

na přítomnost screeningových

Typicky imortalizovaná buněčná linie (např. myelomová buněčná linie) pochází od stejného savčího druhu, jako lymfocyty. Výhodné imortalizované buněčné linie jsou myší myelomové buněčné linie, které jsou citlivé na kultivační médium obsahující hypoxanthin, amínopterin a thymidin (HAT médium ).

Typicky jsou HAT-senzitivní myší myelomové buňky fúzovány k myším splenocytům s použitím polyethylenglykolu (PEG) 3350. Hybridomové buňky, které jsou výsledkem fúze, jsou pak vybírány s použitím HAT média, které usmrtí nefúzované a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty φφ φ *φ φ φφ • φ φφ φφφφ φφφφ φφ φ φφφ φφφφφφφ φ φ φφφ» φφφ φφφ φ φφφ φφ φ φφφφ φφ φφφ φφ φφ φφ φφ

- 32 jsou usmrceny po několika dnech, protože nejsou transformovány). Hybridomy produkující požadovanou protilátku jsou detekovány screeningem hybridomových tkáňových supernatantu, například na schopnost vázat jejich příslušný counter-receptor nebo na svou schopnost blokovat adhezi buněk Jurkat k ovčím červeným krvinkám. Typicky je prováděno subklonování hybridomových kultur limitním ředěním, aby se zajistila monoklonalita.

Aby produkovaly anti-LFA-3 nebo anti-CD2 monoklonální protilátky, jsou hybridomové buňky, které byly testovány pozitivní v takových screeningových testech, pěstovány v živném médiu za podmínek a po dostatečnou dobu, aby se umožnila sekrece monoklonálních protilátek do kultivačního média hybridomovými buňkami. Jsou dobře známy techniky tkáňových kultur a kultivační média vhodná pro hybridomové buňky. Kondicionovaný tkáňový supernatant hybridomů může být sbírán a požadované protilátky volitelně dále purifikovány známými metodami.

Alternativně může požadovaná protilátka vytvořena injekcí hybridomových buněk do břišní dutiny myší, předem injikovaných přistáném. Hybridomové buňky proliferují v břišní dutině, sekretují protilátku, která se hromadí jako ascites. Protilátka může být sklízena odběrem ascitu z břišní dutiny stříkačkou.

Homology protilátek anti-CD2 a anti-LFA-3 použitelné v předkládaném vynálezu mohou také být rekombinantní protilátky produkované hostitelskými buňkami transformovanými DNA kódující imunoglobulinové lehké a těžký řetězce požadované protilátky. Rekombinantní protilátky mohou být vytvářeny známými technikami genetického inženýrství. (Viz např. patent

499« • ·

94 • 9 9

9 4

999

9 9

44 • 9

- 33 49 • 9 • 9 • 9

9

9 9

9 9 4 «9 9

94

Spojených Států č. 4 816 397, který je zahrnut formou odkazu v tomto textu).

Například rekombinantní protilátky mohou být vytvářeny klonováním cDNA nebo genomové DNA kódující imunoglobulinové lehké a těžké řetězce požadované protilátky z hybridomové buňky, která vytváří homolog protilátky použitelný v tomto vynálezu. cDNA nebo genomová DNA kódující tyto polypeptidy je pak vložena do expresních vektorů tak, že oba geny jsou operativně spojeny se svými vlastními transkripčními a translačními expresními kontrolními sekvencemi. Expresní vektor a expresní kontrolní sekvence jsou vybrány tak, aby byly kompatibilní s použitou expresní hostitelskou buňkou. Typicky jsou oba geny vloženy do stejného expresního vektoru.

Mohou být použity prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky. Exprese v eukaryotických hostitelských buňkách je výhodná, protože u takových buněk je pravděpodobnější než u prokaryotických buněk, že sestaví a sekretují správně svinuté a imunologicky účinné protilátky. Nicméně kterákoliv vytvořená protilátka, která je inaktivní kvůli nevhodnému svinutí, může být renaturována podle dobře známých metod (Kim a Baldwin, Specific Intermediates in the Folding Reactions of Smáli Proteins and the Mechanism of Protein Folding, Ann. Rev. Biochem., 51, s. 459-89, 1982). Je možné, že hostitelské buňky budou produkovat části intaktních protilátek, jako například dimery lehkého řetězce nebo dimery těžkého řetězce, které jsou také homology protilátek podle předkládaného vynálezu.

Rozumí se, že v předkládaném vynálezu jsou použitelné variace výše uvedeného postupu. Například může být žádoucí transformovat hostitelskou buňku DNA kódující buď lehký řetězec nebo těžký řetězec (ale ne oba) homologu protilátky.

Technologie rekombinantní DNA může také být použita pro odstranění některé části nebo celé DNA kódující každý nebo oba lehký a těžký řetězec, která není nutná pro vazbu CD2 nebo LFA-3 counter-receptoru. Molekuly exprimované takovými zkrácenými DNA molekulami jsou použitelná ve způsobech podle tohoto vynálezu. Kromě toho mohou být vytvářeny bifunkční protilátky, ve kterých jeden těžký a jeden lehký řetězec jsou homology protilátky anti-CD2 nebo anti-LFA-3 a další těžký a lehký řetězec je specifický pro antigen jiný než CD2 nebo LFA-3 nebo další epitop CD2 nebo LFA-3.

Chimérické rekombinantní homology protilátek anti-LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být vytvářeny transformací hostitelské buňky vhodným expresním vektorem obsahující DNA kódující požadovaný imunoglobulinový lehký a těžký řetězec, ve které veškerá DNA nebo část DNA kódující kloubové a konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce byla substituována DNA odpovídajícího úseku imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce odlišného živočišného druhu. Když původní rekombinantní protilátka není humánního původu a inhibitor má být podáván člověku, je výhodná substituce odpovídajících humánních sekvencí. Příkladná chimérická rekombinantní protilátka má myší variabilní úseky a humánní kloubový a konstantní úsek. (Viz obecně patent Spojených Států č. 4 816 397, Morrison et al., Chimeric Human Antibody Molecules: Mouše Antigen-Binding Domains With Human Constant Region Domains, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, s. 6851-55, 1984, Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/US86/02269, Akira, et al., Evropská patentová přihláška 184 187, Taniguchi, Μ., Evropská patentová přihláška 171, 496, Neuberger et al., Mezinárodní patentová přihláška WO 86/01533, Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043, Liu et al., 1987, PNAS, 84: 3439-3443, Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521- 35 • · • · · · · ·

3526, Sun et al., 1987, PNAS, 84: 214-218, Nishimura et al.,

1987, Canc. Res., 47: 999-1005, Wood et al., 1985, Nátuře, 314: 446-449, a Shaw et al., 1988, J. Nati. Cancer Inst., 80: 1553-1559).

Humanizované rekombinantní protilátky anti-LFA-3 nebo anti-CD2 mohou být tvořeny nahrazením sekvencí Fv variabilního úseku, které nejsou přímo zapojeny do vazby antigenu ekvivalentními sekvencemi humánních Fv variabilních úseků. (Obecné metody tvorby humanizovaných protilátek jsou poskytnuty autory Morrison, S. 1., 1985, Science, 229: 12021207, Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214, a Queen et al., patent Spojených Států č. 5 585 089, patent Spojených Států č. 5 693 761 a patent Spojených Států č. 5 693 762, obsah každého z nich je tímto zahrnut formou odkazu). Tyto metody zahrnují izolaci, manipulaci a expresi sekvencí nukleových kyselin, které kódují všechny nebo části imunoglobulinových Fv variabilních úseků z alespoň jednoho těžkého nebo lehkého řetězce. Zdroje takových nukleových kyselin jsou odborníkům známy a například mohou být získány z hybridomu produkujícího protilátku anti-LFA-3 nebo anti-CD2. Nukleové kyseliny kódující humanizovanou protilátku nebo její fragment pak mohou být klonovány do vhodného expresního vektoru.

Humanizované nebo CDR-roubované protilátkové molekuly nebo imunoglobuliny mohou být vytvářeny CDR-roubováním nebo CDR substitucí, kde jeden, dva nebo všechny CDR imunoglobulinového řetězce mohou být nahrazeny. (Viz např. patent Spojených Států č. 5 225 539, Jones et al., 1986, Nátuře, 321: 552-525, Verhoeyan et al., 1988, Science, 239: 1534, Beidler et al.,

1988, J. Immunol., 141: 4053-4060, Winter, patent Spojených Států č. 5 225 539, obsah každého z nich je tímto výslovně zahrnut formou odkazu). Winter popisuje způsob CDR-roubování,

·· »· který může být použit pro přípravu humanizovaných protilátek podle předkládaného vynálezu (patentová přihláška Velké Británie GB 2188638A, podaná na 26. března, 1987, Winter, patent Spojených Států č. 5 225 539, jejich obsah je výslovně zahrnut formou odkazu). Všechny CDR konkrétní humánní protilátky mohou být nahrazeny alespoň částí CDR jiného než lidského původu nebo pouze několik CDR může být nahrazeno CDR jiného než lidského původu. Je pouze nutné nahradit počet CDR vyžadovaných pro vazbu humanizované protilátky k předurčenému antigenu, např. LFA-3 nebo CD2.

V rozsahu vynálezu jsou také humanizované protilátky, včetně imunoglobulinů, ve kterých specifické aminokyseliny byly substituovány, odstraněny nebo přidány. Konkrétně výhodné humanizované protilátky mají substituce aminokyselin v úseku čtecího rámce, jako například pro zlepšení vazby k antigenu. Například vybraný malý počet zbytků čtecího rámce humanizovaného imunoglobulinového řetězce příjemce může být nahrazen odpovídájícími aminokyselinami dárce. Výhodné lokalizace substitucí zahrnují aminokyselinové zbytky přilehlé k CDR nebo které jsou schopné interakce s CDR (viz např. patent Spojených Států č. 5 585 089). Kritéria pro selekci aminokyselin dárce jsou popsána v patentu Spojených Států č. 5 585 089, např. sloupce 12-16 patentu Spojených Států č. 5 585 089, jehož obsah je tímto zahrnut formou odkazu. Jiné techniky pro humanizaci imunoglobulinových řetězců, včetně protilátek, jsou popsány v práci autorů Padlan et al., EP 519596 Al, publikované 23. prosince, 1992.

Humánní monoklonální protilátky (mAbs) namířené proti humánnímu LFA-3 nebo CD2 mohou být tvořeny s použitím transgenních myší nesoucích kompletní humánní imunní systém spise než nesoucí myší systém. Splenocyty z těchto ·· »···

transgenních myší imunizovaných požadovaným antigenem jsou použity ke vzniku hybridomů, které sekretují humánní mAb se specifickými afinitami pro epitopy humánního proteinu (viz např. Wood et al., International Application WO 91/00906, Kucherlapatí et al., PCT publication WO 91/10741, Lonberg et al., International Application WO 92/03918, Kay et al., International Application 92/03917, Lonberg, N. et al., 1994, Nátuře, 368: 856-859, Green, L. L. et al., 1994, Nátuře Genet., 7: 13-21, Morrison, S. L. et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855, Bruggeman et al., 1993, Year Immunol, 7: 33-40, Tuaillon et al., 1993, PNAS, 90: 3720-3724, Bruggeman et al., 1991, Eur J Immunol, 21: 1323-1326).

Monoklonální protilátky mohou také být tvořeny dalšími metodami známými odborníkům v oboru rekombinantní DNA technologie. Alternativní způsob, nazývaný způsob displeje kombinačních protilátek („combinatorial antibody display), byl vyvinut pro identifikaci a izolaci protilátkových fragmentů majících specifitu pro konkrétní antigen a může být použit pro produkci monoklonálních protilátek (pro popis displeje kombinačních protilátek viz např. Sastry et al., 1989;, PNAS, 86:5728, Huse et al., 1989, Science, 246: 1275, a Orlandi et al., 1989, PNAS, 86:3833). Po imunizaci zvířete imunogenem, jak bylo popsáno výše, je protilátkový repertoár výsledného poolu B lymfocytů klonován. Jsou obecně známy metody získání DNA populace imunoglobulinových oligomerových primerů a sekvence variabilních úseků různorodé molekul s použitím směsi PCR. Například smíchané oligonukleotidové primery odpovídající 5' vedoucím (signální peptid) sekvencím a/nebo sekvencím čtecího rámce 1 (FR1), a také primer ke konzervativnímu 3' konstantnímu úseku primeru může být použít pro PCR amplifikaci variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce z celé řady myších protilátek (Larrick et • 0

- 38 • fc

I · · 4 « · · « al., 1991, Biotechniques, 11:152-156). Podobná strategie může také byl použita pro amplifikaci variabilních úseků humánního těžkého a lehkého řetězce humánních protilátek (Larrick et al., 1991, Methods: Companion Methods in Enzymology, 2:106110) .

V ilustrativním provedení RNA byla izolována z B lymfocytů, například periferních krvinek, kostní dřeně nebo preparátů ze sleziny, s použitím standardních protokolů (např. patent Spojených Států č. 4 683 202, Orlandi, et al. PNAS, 1989, 86: 3833-3837, Sastry et al., PNAS, 1989, 86: 5728-5732, a Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281.) první vlákno cDNA je syntetizováno s použitím primerů specifických pro konstantní úsek těžkého řetězce (řetězců) a každý kappa a lambda lehký řetězec, a také primerů pro signální sekvence. S použitím PCR primerů pro variabilní úsek, variabilní úseky obou těžkých a lehkých řetězců jsou amplifikovány, každý sám nebo v kombinaci a ligovány do vhodných vektorů pro další manipulaci při tvorbě displejových knihoven. Oligonukleotidové primery použitelné v amplifikačních protokolech mohou být unikátní nebo degenerované nebo mohou inkorporovat inozin do degenerovaných poloh. Do primerů mohou také být inkorporovány rozpoznávací sekvence pro restrikční endonukleázy, aby se umožnilo klonování amplifikovaného fragmentu do vektoru v předurčeném čtecím rámci pro expresi.

V-genová knihovna klonovaná z protilátkového repertoáru pocházejícího z imunizací může být exprimována populací displejových knihoven, výhodně pocházejících z filamentózního fága, za vzniku protilátkové displejové knihovny. Ideálně displejová knihovna obsahuje systém, který umožňuje sběr vzorků z velmi velkých různorodých protilátkových displejových knihoven, rychlé třídění po každém kole afinitní separace • ·

- 39 a snadnou izolaci protilátkového genu z purifikovaných displejových knihoven. Kromě komerčně dostupných souprav pro tvorbu fágových displejových knihoven (např. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalogové č. 27-9400-01, a soupravy Stratagene SurfZAP™ pro fágový displej, katalogové č. 240612), příklady způsobů a reagencií konkrétně přizpůsobených pro použití při tvorbě různorodé protilátkové displejové knihovny mohou být nalezeny například v publikacích autorů Ladner et al., patent Spojených Států č. 5 223 409,

Kang et al., Mezinárodní patentová přihláška WO 92/18619, Dower et al., WO 91/17271, Winter et al., WO 92/20791, Markland et al., WO 92/15679, Breitling et al., WO 93/01288, McCafferty et al.,. WO 92/01047, Gamed et al., WO 92/09690, Ladner et al., WO 90/02809, Fuchs et al., 1991, Bio/Technology, 9: 1370-1372, Hay et al., 1992, Hum Antibod

Hybridomas, 3:81-85, Huse et al., 1989, Science, 246:12751281, Griffths et al., 1993, EMBO J, 12:725-734, Hawkins et al., 1992, J Mol Biol, 226:889-896, Clackson et al., 1991, Nátuře, 352:624-628, Gram et al. , 1992, PNAS, 8 9:357 6-358 0,

Garrad et al., 1991, Bio/Technology, 9:1373-1377, Hoogenboom et al., 1991, Nuc Acid Res, 19:4133-4137, a Barbas et al., 1991, PNAS, 88:7978-7982.

V určitých provedeních domény V úseku těžkého a lehkého řetězce mohou být exprimovány na stejném polypeptidu, spojeném ohebným linkerem za vzniku jednořetězcového Fv fragmentu a scFV gen následně klonován do požadovaného expresního vektoru nebo fágového genomu. Jak bylo obecně popsáno v práci autorů McCafferty et al., Nátuře, 1990, 348:552-554, kompletní VH a

VL domény protilátky, spojené ohebným (Gly₄-Ser)3 linkerem mohou být použity za vzniku jednořetězcové protilátky, která může poskytnout displejovou knihovnu separovatelnou na základě afinity k antigenu. Izolované scFV protilátky imunoreaktívní • · · · » · · · · · ·· • » · φ · · · · ·· • · φ 9 · φ · ·· · • · φ · · ΦΦΦΦΦ· · « · · ·· φ · · · «· ··· φφ ·· ·· *· povrchu displejové je na protilátkové s antigenem mohou pak být formulovány do farmaceutického přípravku pro použití v předmětném způsobu.

Jakmile je jednou exponována na knihovny (např. na filamentózním fágu), knihovně prováděn screening s antigenem nebo jeho peptidovým fragmentem pro identifikaci a izolaci knihoven, které exprimují protilátku mající specifitu k antigenů. Nukleová kyselina kódující vybranou protilátku může být získána z displejové knihovny (např. z fágového genomu) a subklonována do jiných expresních vektorů standardními technikami rekombinantní DNA.

Specifické protilátky s vysokými afinitami k povrchovému proteinu mohou být tvořeny podle metod odborníkům v oboru známých, např. metod zahrnujících screening knihoven (Ladner, R.C., et al., patent Spojených Států č. 5 233 409, Ladner, R.C., et al., patent Spojených Států č. 5 403 484). Dále, metody těchto knihoven mohou být použity pro screening, aby se získaly vazebné determinanty, které jsou mimetika strukturálních determinant protilátek.

Konkrétně Fv vazebný povrch konkrétní protilátkové molekuly interaguje s jejím cílovým ligandem podle principů interakcí protein-protein, proto sekvenční data pro VH a VL (které mohou být řetězce typu kappa nebo lambda) jsou základem technik proteinového inženýrství odborníkům v oboru známým. Detaily o proteinovém povrchu, který obsahuje vazebné determinanty, mohou být získány z informací o protilátkové sekvenci, modelováním s použitím dříve určených trojrozměrných struktur jiných protilátek získaných z NMR studií nebo krystalografických dat. (Viz například Bajorath, J. a S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Fund., and Genet., 24 (2),152-157, Webster, D.M. a A. R. Rees, 1995, Molecular ·

- 41 modeling of antibody-combining sites, in S. Paul, vyd., Methods in Molecular Biol., 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NI, s. 17-49, a Johnson, G., Wu, T.T. a E.A. Kabat, 1995, Seqhunt: A program screen aligned nucleotide and amino acid sequences, v Methods in Molecular Biol., 51, op. cit., s. 1-15).

Úsek vázající antigen může také být získán screeningem různých typů kombinačních knihoven s požadovanou vazebnou aktivitou a identifikací aktivních živočišných druhů metodami, které byly popsány.

V jednom provedení rozmanitá peptidová knihovna je vyjádřena populací displejových knihoven za vzniku peptidové displejové knihovny. Ideálně displejová knihovna obsahuje systém, který umožňuje sběr vzorků z velmi velkých různorodých peptidových displejových knihoven, rychlé třídění po každém kole afinitní separace a snadnou izolaci genu kódujícího peptid z purifikovaných displejových knihoven. Peptidové displejové knihovny mohou být např. v prokaryotických organismech a virech, které mohou být rychle amplifikovány, mají relativně snadnou manipulaci a které umožňují vytvoření velkého počtu klonů. Výhodné displejové knihovny zahrnují například vegetativní bakteriální buňky, bakteriální spory a nejvýhodněji bakteriální viry (obzvláště DNA viry). Nicméně, předkládaný vynález také zvažuje použití eukaryotických buněk včetně kvasinek a jejich spor jako potenciální displejové knihovny. Fágové displejové knihovny jsou popsány výše.

Další techniky zahrnují afinitní chromatografii s vhodným receptorem pro izolaci vazebných agens, následovanou identifikací izolované vazebného agens nebo ligandů obvyklými technikami (např. hmotová spektrometrie a NMR). Výhodně rozpustný receptor je konjugován se značkou (např. fluorofory, • ·

- 42 kolorimetrické enzymy, radioizotopy nebo luminiscenční sloučeniny) , která může být detekována pro indikaci vazby ligandu. Alternativně, imobilizované sloučeniny mohou být selektivně uvolňovány a ponechány difundovat přes membránu, aby interagovaly s receptorem.

Kombinační knihovny sloučenin mohou také být syntetizovány s přívěsky či „značkami („tag) , aby se kódovala identita každého člena knihovny (viz např. W.C. Still et al., WO 94/08051/). Obecně tento způsob uvádí použití inertních, ale snadno detekovatelných přívěsků, které jsou připojeny k pevnému nosiči nebo ke sloučeninám. Když je detekována aktivní sloučenina, totožnost sloučeniny je určena identifikací unikátního průvodního přívěsku. Tento způsob značení umožňuje syntézu rozsáhlých knihoven sloučenin, které mohou být identifikovány ve velmi nízkých hladinách v celkovém souboru všech sloučenin v knihovně.

Homology protilátek anti-CD2 a anti-LFA-3, které nejsou intaktní protilátky, jsou také použitelné v tomto vynálezu. Takový homology mohou být derivovány z kterýchkoliv homologů protilátek popsaných výše. Například fragmenty vázající antigen, a také kompletní monomerní, dimerní nebo trimerní polypeptidy pocházející z výše popsaných protilátek jsou samy o sobě použitelné. Použitelné homology protilátek tohoto typu zahrnují (i) Fab fragment, jednomocný fragment skládající se z VL, VH, CL a CHI domén, (ii) F(ab')₂ fragment, dvojmocný fragment obsahující dva Fab fragmenty spojené disulfidovým můstkem v kloubovém úseku, (iii) Fd fragment skládající se z VH a CHl domén, (iv) Fv fragment skládající se z VL a VH domén jednoho ramena protilátky, (v) dAb fragment (Ward et al., 1989, Nátuře, 341:544-546), skládající se z VH domény a (vi) izolovaný komplementaritu určující úsek (CDR). Kromě * · · • ··· • · ·· ·· ··

- 43 toho, ačkoli dvě domény Fv fragmentu, VL a VH, jsou kódovány oddělenými geny, mohou být spojeny, s použitím rekombinantních metod, syntetickým linkerem, který umožní, že jsou tvořeny jako jeden proteinový řetězec, ve kterém se VL a VH úseky párují za vzniku jednomocných molekul (známých jako jednořetězcový Fv (scFv), viz např. Bird et al., 1988, Science, 242:423-426, a Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad Sci. USA, 85:5879-5883). Takové jednořetězcové protilátky jsou také zamýšleny být zahrnovány do termínu fragment vázající antigen protilátky. Tyto protilátkové fragmenty jsou získány s použitím obvyklých technik známých odborníkům v oboru a s fragmenty je prováděn screening na použitelnost stejným způsobem jako s intaktními protilátkami. Anti-LFA-3 těžké řetězce jsou výhodné anti-LFA-3 protilátkové fragmenty.

Protilátkové fragmenty mohou také být vytvářeny chemickými metodami, např. štěpením intaktní protilátky proteázou, jako je například pepsin štěpeného produktu použitelné fragmenty činidlem, jako nebo papain a volitelně ošetřením redukčním činidlem. Alternativně, mohou být vytvářeny s použitím hostitelských buněk transformovaných zkrácenými geny pro těžké a/nebo lehké řetězce. Monomery těžkých a lehkých řetězců mohou být vytvářeny ošetřením intaktní protilátky redukčním je například dithiothreitol, následovaným se oddělily řetězce. Monomery těžkých a purifikaci, aby lehkých řetězců mohou také být vytvářeny hostitelskými buňkami transformovanými DNA kódující buď požadovaný těžký řetězec nebo lehký řetězec, ale ne oba. (Viz např. Ward et al., Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli, Nátuře, 341, s. 544-46, 1989, Sastry et al., Cloning of the Immunological

Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable • · ··

Region-Specific cDNA Library, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, s. 5728-32, 1989) .

vynálezu.

derivovány

Rozpustné CD2 a LFA-3 polypeptidy

Rozpustné LFA-3 polypeptidy nebo rozpustné CD2 polypeptidy, které inhibují interakci LFA-3 a CD2 jsou použitelné ve způsobech podle předkládaného

Rozpustné LFA-3 polypeptidy jsou výhodné.

Rozpustné LFA-3 polypeptidy mohou být z transmembránové formy LFA-3, konkrétně extracelulární domény (např. AAi-AA₁₈₇ ze sekv. id. č. 2 patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu). Takové polypeptidy jsou popsány v patentu Spojených Států č. 4 956

281 a společně projednávané patentové přihlášce

Států, pořadové č. 07/667 971 (která má

Spoj ených shodného přihlašovatele jako předkládaná přihláška), které jsou v tomto textu zahrnuty formou odkazu. Výhodné rozpustné LFA-3 polypeptidy zahrnují polypeptidy, které se skládají z AAi~AA₉₂ ze sekv. id. č., AAi-AAqo ze sekv. id. č. 2, AA₅₀-AA₆5 ze sekv. id. č. 2 a AA₂o-AA₈o ze sekv. id. č. 2, přičemž sekv. id. č. 2 je ukázána v patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu. Vektor obsahující DNA sekvenci kódující sekv. id. č. 2 (tj. sekv. id. č. 1) je deponován v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přístupovým č. 75107, přičemž sekv. id. č. 1 a 2 jsou ukázány v patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu.

Nejvýhodnější fúzní proteiny tohoto typu obsahují aminokoncových 92 aminokyselin zralého LFA-3, C-koncových 10 aminokyselin humánního IgGI kloubového úseku obsahujícího dva cysteinové zbytky, o kterých se předpokládá, že se účastní

- 45 fc · · fc • fcfc · • fc · fcfcfc

LFA3TIP. je uložen meziřetězcové disulfidové vazby a CH2 a CH3 úseky konstantní domény humánního IgGi těžkého řetězce (např. sekv. id. č. 8) .

Tento fúzní protein je v tomto textu nazýván plazmid, pSABl52, kódující ukázkový LFA3TIP v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod přístupovým č. ATCC 68720. DNA sekvence pSAB152 inzertu je sekv. id. č. 7. Sekv. id. č. 7 a 8 jsou ukázány v patentu Spojených Států č. 6 162 432, který je tímto zahrnut formou odkazu.

Aminokyselinová varianty LFA-3TIP, a nukleotidová sekvence delší sestřihové než ta, která je ukázána v patentu Spojených Států č. 6 162 432, je ukázána na obrázku 1. Signální peptid delší LFA-3TIP varianty odpovídá aminokyselinám 1 až 28 na obrázku 1, zralý LFA-3 úsek odpovídá aminokyselinám 29 až 120 na obrázku 1 a IgGi úsek odpovídá aminokyselinám 121 až 351 na obrázku 1. Delší sestřihová variantu LFA-3TIP se liší od kratší varianty tím, že má přidáno šest aminokyselin k C-koncové části.

Jeden způsob produkce LFA3TIP pro použití podle tohoto vynález je popsán ve společně projednávané patentové přihlášce Spojených Států poř. č. 07/770 967. Obecně, kondicionované kultivační médium z buněk COS7 nebo CHO transfekovaných pSAB152 bylo koncentrováno s použitím spirální cartridge AMICON S1Y30 (AMICON, Danvers, Massachusetts) a podroben chromatografií na koloně Protein A-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, Missouri). Navázané proteiny byly eluovány a podrobeny chromatografické gelové filtraci na koloně Superose-12 (Pharmacia/LKB, Piscataway, New Jersey).

Frakce ze Superose-12 obsahující LFA3TIP s nejmenším množstvím kontaminujících proteinů, jak určeno na gelech z SDS-PAGE a analýzou Western bloty, (viz např. Towbin et al.,

9 • · ·· « ·» ·· • « ·· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 « · · · · 9 999

9 9 9 9 9

Proč: Nati. Acad. Sci. USA, 74, s. 4350-54, 1979, Antibodies: A Laboratory Manual, s. 474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), byly sloučeny a koncentrovány v YM30 Centricon (AMICON). LFA3TIP byl detekován na Western blotech s použitím králičího anti-LFA-3 polyklonálního antiséra, následovaného detekovatelně značeným kozím anti-králičím IgG. Purifikovaný LFA3TIP z buněk COS7 nebo CHO byl dimer ze dvou monomerních LFA-3-Ig fúzních proteinů, spojených disulfidovými vazbami.

Další výhodný fúzní protein se skládá z první a druhé LFA-3 domény fúzované ke kloubovým úsekům CH2 a CH3 humánního IgGl, v tomto textu nazývaný LLFA3-Ig.

Rozpustné LFA-3 polypeptidy mohou také pocházet z PI-navázané formy LFA-3, jako jsou například ty popsané v PCT patentové přihlášce poř. č. WO 90/02181. Vektor obsahující DNA sekvenci kódující PI-navázaný LFA-3 (tj . sekv. id. č. 3) je uložen v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přístupovým č. 68788. Rozumí se, že PI-navázaná forma LFA-3 a transmembránová forma LFA-3 mají totožné aminokyselinové sekvence v průběhu celé extracelulární domény. V souladu s tím výhodné PI-navázané LFA-3 polypeptidy jsou stejné jako transmembránová forma LFA-3.

Rozpustné CD2 polypeptidy mohou pocházet z kompletního CD2, obzvláště extracelulární domény (např. AAi-AAiss ze sekv. id. č. 6). Takové polypeptidy mohou zahrnovat celou nebo část extracelulární domény CD2. Příklady rozpustných CD2 polypeptidů jsou popsány v PCT WO 90/08187, který je v tomto textu zahrnut formou odkazu.

Produkce rozpustných polypeptidů použitelných v tomto vynálezu může být dosaženo celou řadou metod v oboru známých. Například polypeptidy mohou pocházet z intaktní *444 ·

4

4 4« ··

4444 4 444 4 • 4 4 4 · · · *

4 4 4 4 4 444 4 4 transmembránové LFA3 nebo CD2 molekuly nebo intaktní PInavázané LFA-3 molekuly proteolýzou s použitím specifických endopeptidáz v kombinaci s exopeptidázami, Edmanovy degradace nebo obou metod. Intaktní LFA-3 molekula nebo intaktní CD2 molekula může být dále purifikována ze svého přírodního zdroje s použitím obvyklých metod. Alternativně, intaktní LFA-3 nebo CD2 mohou být vytvářeny známými technikami rekombinantní DNA s použitím cDNA (viz např. patent Spojených Států č. 4 956 281, Wallner et al., Aruffo a Seed, Proč. Nati. Acad Sci, 84, s. 2941-45, 1987, Sayre et al., Proč. Nati. Acad Sci. USA, 84, s. 2941-45, 1987).

Výhodně jsou rozpustné polypeptidy použitelné v předkládaném vynálezu vytvářeny přímo, což eliminuje potřebu celé LFA-3 molekuly nebo celé CD2 molekuly jako výchozí látky. To může být dosaženo obvyklými technikami chemické syntézy nebo známými technikami rekombinantní DNA, kde pouze ty DNA sekvence, které kódují požadované peptidy jsou exprimovány v transformovaných hostitelích. Například gen, který kóduje požadovaný rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid může být syntetizován chemickými prostředky s použitím syntezátoru oligonukleotidů. Takové oligonukleotidy jsou navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadovaného rozpustného LFA-3 polypeptidu nebo rozpustného CD2 polypeptidu. Specifické DNA sekvence kódující požadovaný peptid mohou také pocházet z kompletní DNA sekvence izolací specifických fragmentů získaných pomoci restrikční endonukleázy nebo PCR syntézou specifikovaného úseku.

Standardní metody mohou být použity pro syntézu genu kódujícího rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid, který je použitelný v tomto vynálezu. Například kompletní aminokyselinová sekvence může být použita ke *4 ···· • 4 • ·

· ·

4 ·

4 4

4 4 4

44 konstrukci „zpětně translatovaného („back-translated) genu. DNA oligomer obsahující nukleotidovou sekvenci kódující rozpustný LFA-3 polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid použitelný v tomto vynálezu může být syntetizován v jednom menších oligonukleotidů polypeptidu může být Výhodně rozpustný LFA-3 kroku. Alternativně, několik kódujících části požadovaného syntetizováno a pak ligováno.

polypeptid nebo rozpustný CD2 polypeptid použitelný v tomto vynálezu bude syntetizován jako několik oddělených oligonukleotidů, které jsou následovně spojeny dohromady. Jednotlivé oligonukleotidy typicky obsahují 5' nebo 3' přesahy pro komplementární sestrojení.

Jakmile jsou jednou sestrojeny, výhodné geny jsou charakterizovány sekvencemi, které jsou rozpoznávány restrikčními endonukleázami (včetně unikátních restrikčních míst pro přímé sestrojení do klonovacího nebo expresního vektoru), výhodné kodony berou ohled na použitý hostitelský expresní systém a sekvence, které, když jsou transkribovány, vytváří stabilní účinně translatovanou mRNA. řádné sestrojení může být potvrzeno nukleotidovým sekvencováním, restrikčním mapováním a expresí biologicky účinného polypeptidu ve vhodném hostiteli.

odborníci v oboru ocení, že díky degeneraci genetického kódu DNA molekuly obsahující mnoho dalších nukleotidových sekvencí budou také schopné kódování rozpustných LFA-3 a CD2 polypeptidů kódovaných specifickými DNA sekvencemi popsanými výše. Tyto degenerované sekvence také kódují polypeptidy, které jsou použitelné v tomto vynálezu.

DNA sekvence mohou být exprimovány v jednobuněčných hostitelích. Jak je v oboru známo, aby se dosáhlo vysoké hladiny exprese transfekovaného genu v hostiteli, gen musí být

4» 444» « 4« ·4 • 4 44 4··· 4 4 4

44« *>* 4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 4 444 4 4 4 4

4 «4 4 4444

4« 444 44 44 ·4 49

- 49 operativně spojen s transkripčními a translačními expresními kontrolními sekvencemi, které jsou funkční ve zvoleném expresním hostiteli. Výhodně jsou expresní kontrolní sekvence a požadovaný gen obsaženy v expresním vektoru, který dále obsahuje markér bakteriální selekce a replikační počátek. Jestliže expresní hostitel je eukaryotická buňka, expresní vektor by měl dále zahrnovat další expresní markér použitelný v expresním hostiteli.

DNA sekvence kódující požadované rozpustné polypeptidy mohou nebo nemusí kódovat signální sekvenci. Jestliže expresní hostitel je prokaryotický, obecně je výhodné, že DNA sekvence nekóduje signální sekvenci. Jestliže expresní hostitel je eukaryotický, obecně je výhodné, že je signální sekvence kódována.

Amino-koncový methionin může nebo nemusí být přítomen v exprimovaném produktu. Jestliže koncový methionin není štěpen expresním hostitelem, může být, je-li žádoucí, chemicky odstraněn standardními technikami.

Může být použita celá řada kombinací expresní hostitel/vektor. Použitelné expresní vektory pro eukaryotické hostitele zahrnují například vektory obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40, bovinního papiloma viru, adenoviru a cytomegaloviru. Použitelné expresní vektory pro bakteriální hostitele zahrnují známé bakteriální plazmidy, jako jsou například plazmidy z E. coli, včetně col El, pCRl, pBR322, pMB9 a jejich derivátů, plazmidy se širším rozsahem hostitelů, jako je například RP4, DNA fágy, např. četné deriváty fágu lambda, např. NM989 a další DNA fágy, jako je například M13 a filamentózní jednovláknové DNA fágy. Použitelné expresní vektory pro kvasinky zahrnují 2μ plazmid a jeho deriváty. Použitelné vektory pro hmyzí buňky zahrnují pVL 941.

·· 4444 *4 · ·

4« 44

Kromě toho v těchto vektorech může být použita kterákoliv z celé řady expresních kontrolních sekvencí. Takové použitelné expresní kontrolní sekvence zahrnují expresní kontrolní sekvence asociované se strukturními geny předcházejících expresních vektorů. Příklady použitelných expresních kontrolních sekvencí zahrnují například časné a pozdní promotory SV40 nebo adenoviru, lac systém, trp systém, TAC nebo TRC systém, hlavní operátorové a promotorové úseky fágu lambda, kontrolní úseky fd obalového proteinu, promotor pro

3-fosfoglycerátkinázu nebo jiné glykolytické enzymy, promotory kyselé fosfatázy, např. Pho5, promotory kvasinkového apárovacího systému a další sekvence, o kterých je známo, že řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů a jejich různé kombinace.

Je použitelná celá řada jednobuněčných hostitelských buněk. Tito hostitelé mohou zahrnovat dobře známé eukaryotické a prokaryotické hostitele, jako jsou například kmeny E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, houby, kvasinky, hmyzí buňky, jako například Spodoptera frugiperda (SF9), zvířecí buňky, jako například buňky CHO a myší buňky, buňky opice, jako jsou například COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 a BMT 10 a humánní buňky, a také rostlinné buňky v tkáňové kultuře. Co se týče exprese zvířecích buněk, původci preferují CHO buňky a COS 7 buňky.

Ovšem rozumí se, že ne všechny vektory a expresní kontrolní sekvence fungují stejně dobře pro expresi DNA sekvencí popsaných v tomto textu. Ani všichni hostitelé nefungují stejně dobře se stejným expresním systémem. Nicméně odborník v oboru může provádět selekci těchto vektorů, expresních kontrolních sekvencí a hostitelů bez nadměrných experimentů. Například při selekci vektoru musí být uvažován hostitel, protože vektor se v něm musí replikovat. Musí také být vzat do úvahy počet kopií vektoru, schopnost řídit tento počet kopií a exprese všech dalších proteinů kódovaných vektorem, jako například antibiotikových markérů.

99 • 9 9 β » * · • · ·

9# ♦ · ·· 999

9 9# · ·

9 9 9 9 9 · • 9 « 999 · · ·

9 9 9 9 9

99 99 99

Při selekci expresní kontrolní sekvence by také měla být vzata do úvahy celá řada faktorů. Ty zahrnují například relativní pevnost sekvence, její kontrolovatelnost a její kompatibilitu s DNA sekvencemi diskutovanými v tomto textu, konkrétně co se týče potenciálních sekundárních struktur. Jednobuněční hostitelé by měli být vybráni po úvaze o jejich slučitelnosti se zvoleným vektorem, toxicitou produktu kódovaného DNA sekvencemi, jejich sekrečními charakteristickými vlastnostmi, jejich schopností svinout správně rozpustné polypeptidy, jejich fermentačními nebo kultivačními požadavky a snadností purifikace produktů kódovaných DNA sekvencemi.

V mezích těchto parametrů odborník v oboru může vybrat různé kombinace vektor/expresní kontrolní sekvence/hostitel, které budou exprimovat požadované DNA sekvence při fermentaci nebo ve zvířecí tkáňové kultuře ve velkém měřítku, například s buňkami CHO nebo buňkami COS 7.

Rozpustné LFA-3 a CD2 polypeptidy mohou být izolovány z fermentační nebo tkáňové kultury a purifikovány s použitím kterékoliv z celé řady obvyklých metod. Odborník v oboru může vybrat nejvhodnější techniky izolace a purifikace.

Zatímco techniky rekombinantni DNA jsou výhodným způsobem produkce použitelných rozpustných CD2 polypeptidů nebo rozpustných LFA-3 polypeptidů majících sekvenci o více než 20 aminokyselinách, kratší CD2 nebo LFA-3 polypeptidy mající méně než přibližně 20 aminokyselin jsou výhodně produkovány obvyklými technikami chemické syntézy. Synteticky vytvářené

• · • * 0 • · * • · · · polypeptidy použitelné v tomto vynálezu mohou výhodně být vytvářeny s extrémně vysokými výtěžky a mohou být snadno purifikovány.

Výhodně jsou takové rozpustné CD2 polypeptidy nebo rozpustné LFA-3 polypeptidy syntetizovány syntézou ve fázi roztoku nebo syntézou polypeptidů na pevné fázi a volitelně štěpeny karboxypeptidázou (pro odstranění C-koncových aminokyselin) nebo degradovány manuální Edmanovou degradací (pro odstranění N-koncových aminokyselin). Řádného svinutí polypeptidů může být dosaženo v oxidačních podmínkách, které podporují tvorbu disulfidových můstků, jak bylo popsáno autory Kent, Chemical Synthesis of Polypeptides and Proteins, Ann. Rev. Biochem., 57, s. 957-89, 1988. Polypeptidy vytvářené mohou být purifikovány separačními známými, výhodně s použitím HPLC s převráceným poměrem fází. Použití syntézy ve fázi roztoku výhodně umožňuje přímé přidání určitých derivatizovaných aminokyselin k rostoucímu polypeptidovému řetězci, jako například O-sulfátester tyrosinu. To odstraní potřebu následného kroku derivatizace pro modifikaci kteréhokoliv zbytku polypeptidů použitelných v tomto vynálezu.

tímto způsobem pak technikami v oboru

LFA-3 a CD2 mimetikum nebo činidlo typu malé molekuly

Podle předkládaného vynálezu jsou také použitelná LFA-3 a CD2 mimetika. Tato agens, která mohou být peptidy, semipeptidové sloučeniny nebo nepeptidové sloučeniny (např. malé organické molekuly), jsou inhibitory interakce CD2/LFA-3. Výhodná CD2 a LFA-3 mimetika inhibují CD2/LFA-3 interakci alespoň tak dobře, jako anti-LFA-3 monoklonální protilátka 7A6 nebo anti-CD2 monoklonální protilátka TS2/18 (popsáno výše).

·· ·· · · ··

Ve výhodném provedení testované agens je člen kombinační knihovny, např. peptidové nebo organické kombinační knihovny nebo knihovny přírodních produktů. Ve výhodném provedení velké množství testovaných sloučenin, např. členů knihovny, obsahuje alespoň 10, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ nebo 10⁸ sloučenin. Ve výhodném provedení velké množství testovaných sloučenin, např. členů knihovny, sdílí strukturální nebo funkční charakteristiky.

V jednom provedení vynález poskytuje knihovny LFA-3 a/nebo CD2 inhibitorů. Syntéza kombinačních knihoven je v oboru dobře známa a byla uvedena v přehledech (viz např. E.M. Gordon et al., J. Med. Chem., 1994, 37: 1385-1401, DeWitt, S. H.,

Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res., 1996, 29: 114, Armstrong, R. W. , Combs, A. P., Tempest, P. A., Brown, S. D. , Keating, T.

A., Acc. Chem. Res., 1996, 29: 123, Ellman, J. A., Acc. Chem.

Res., 1996, 29: 132, Gordon, E. M., Gallop, M. A., Patel, D. V., Acc. Chem. Res., 1996, 29: 144, Lowe, G, Chem. Soc. Rev.,

1995, 309, Blondelle et al., Trends Anal. Chem., 1995, 14:83, Chen et al. J. Am. Chem. Soc., 1994, 116: 2661, patenty Spojených Států č. 5 359 115, 5 362 899 a 5 288 514, PCT publikace č. W092/10092, WO93/09668, WO91/07087, WO93/20242,

W094/08051).

Knihovny sloučenin podle vynálezu mohou být připraveny podle celé řady metod, některé z nich jsou v oboru známy. Například strategie split-pool může být realizována takto: perličky funkcionalizovaného polymerního nosiče jsou umístěny ve velkém množství reakčních nádob, je známa celá řada polymerních nosičů vhodných pro syntézu peptidů na pevné fázi a některé jsou komerčně dostupné (například viz M. Bodansky Principles of Peptide Synthesis, 2. vyd., Springer-Verlag, Berlin, 1993) . Ke každému alikvotu perliček je přidán roztok

- 54 • · · · · · * · · · · · • · ····· · odlišné aktivované aminokyseliny a reakce jsou ponechány pokračovat za vzniku velkého množství imobilizovaných aminokyselin, jedné v každé reakční nádobě. Alikvoty derivatizovaných perliček jsou pak promyty, sloučeny („pooled) neboli rekombinovány a pool perliček je znovu rozdělen, přičemž každý alikvot je umístěn do oddělené reakční nádoby. Další aktivovaná aminokyselina je pak přidána ke každému alikvotu perliček. Cyklus syntézy je opakován až do dosažení požadované délky peptidů. Aminokyselinové zbytky přidané v každém cyklu syntézy mohou být náhodně vybrány, alternativně, aminokyseliny mohou být vybrány tak, aby poskytly predeterminovanou („biased) knihovnu, t j. takovou knihovnu, ve které určité části inhibitoru jsou vybrány nenáhodně, např. za vzniku inhibitoru, který má známou strukturální podobu nebo homologii se známým peptidem schopným interagovat s protilátkou, např. s místem vázajícím antigen anti-idiotypové protilátky. Je nutné ocenit, že celá řada peptidových sloučenin, peptidomimetik nebo nepeptidových sloučenin může být snadno tvořena tímto způsobem.

Split-pool stratege má za následek knihovnu peptidů, být použity pro podle vynálezu.

např. inhibitorů, které mohou knihovny testovaných sloučenin ilustrativní syntéze, diversomerní knihovna je vytvořena pripravu

V další metodou autorů Hobbs DeWitt er al. (Proč. Nati. Acad Sci. USA., 90: 6909, 1993). Další metody syntézy, včetně teabag techniky podle Houghtena (viz např. Houghten et al., Nátuře, 354: 84-86, 1991) mohou také být použity pro syntézu knihoven sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Na knihovnách sloučenin může být prováděn screening, aby se určilo, zda nějaký člen knihovny má požadovanou aktivitu, a jestliže má, identifikovat aktivní sloučeninu (třídu

sloučenin). Byly popsány metody screeningu kombinačních knihoven (viz např. Gordon et al., J Med. Chem., výše). Na knihovnách rozpustných sloučenin může být prováděn screening afinitní chromatografii s receptorem vhodným pro izolaci ligandů receptoru, následovanou identifikací izolovaných ligandů obvyklými technikami (např. hmotová spektrometrie, NMR, apod.). Na imobilizovaných sloučeninách může být prováděn kontaktem sloučeniny s rozpustným receptorem, rozpustný receptor konjugován se značkou (např.

fluorofory, kolorimetrické enzymy, radioizotopy, luminiscenční sloučeniny, apod.), která může být detekována pro indikaci vazby ligandu. Alternativně, imobilizované sloučeniny mohou a ponechány s receptorem.

screening výhodně je být selektivně uvolňovány membránu, aby interagovaly použitelných pro screening popsány níže.

difundovat

Příklady pres testů knihoven podle vynálezu jsou

V jednom provedení může být na sloučeninách podle vynálezu prováděn screening na schopnost interagovat s CD2 nebo LFA-3 polypeptidem testováním aktivity každé sloučenina vázat se přímo k polypeptidů nebo inhibovat CD2/LFA-3 interakci, např. inkubací testované sloučeniny s CD2 nebo LFA-3 polypeptidem a lyzátem, např. buněčným lyzátem T lymfocytů nebo APC, např.

jamce mnohajamkové destičky, jako je například jamková mikrotitrační destička. V tomto být určena aktivita v jedné standardní provedení sloučeniny může které každé individuální neobsahují žádnou

Jamka nebo jamky, testovanou sloučeninu, mohou být použity jako kontrolní. Po inkubaci může být aktivita každé testované sloučeniny určena testováním každé jamky. Aktivita velkého množství testovaných sloučenin může být určována souběžně.

V ještě dalším provedení velké množství testovaných sloučenin může být současně testováno na vazebnou aktivitu. Například testované sloučeniny mohou být syntetizovány na perličkách z pevné pryskyřice v syntéze jedna perlička-jedna sloučenina, sloučeniny mohou být imobilizovány na pryskyřičném nosiči prostřednictvím fotolabilního linkeru. Velké množství perliček (např. až 100 000 perliček nebo více) může pak být spojeno s kvasinkami a rozprášeno do velkého množství nano-kapiček, kde každá kapička obsahuje jednu perličku (a tudíž jednu testovanou sloučeninu). Expozice „nano-kapiček UV světlu pak má za následek odštěpení sloučenin od perliček. Je uznáváno, že tento formát testu umožňuje rychlý screening rozsáhlých knihoven testovaných sloučenin.

Kombinační knihovny sloučenin mohou také být syntetizovány s „přívěsky („tag), aby se kódovala identita každého člena knihovny (viz např. W.C. Still et al., patent Spojených Států č. 5 565 324 a PCT publikace č. WO 94/08051 a WO 95/28640) . Obecně tento způsob uvádí použití inertních, ale snadno detekovatelných přívěsků, které jsou připojeny k pevnému nosiči nebo ke sloučeninám. Když je detekována aktivní sloučenina (např. jednou z technik popsaných výše), totožnost sloučeniny je určena identifikací unikátního průvodního přívěsku. Tento způsob značení umožňuje syntézu rozsáhlých knihoven sloučenin, které mohou být identifikovány ve velmi nízkých hladinách. Takové schéma značení může být použitelné, např. v nano-kapičkovém screeningovém testu popsaném výše pro identifikaci sloučenin uvolňovaných z perliček.

Ve výhodném provedení knihovny sloučenin podle vynálezu obsahují alespoň 30 sloučenin, výhodněji alespoň 100 sloučenin a ještě výhodněji alespoň 500 sloučenin. Ve výhodném provedení

knihovny sloučenin podle vynálezu obsahují méně než 10⁹ sloučenin, výhodněji méně než 10⁸ sloučenin a ještě výhodněji méně než 10⁷ sloučenin.

Derivatizované inhibitory

Ve způsobech podle tohoto vynálezu jsou také použitelné derivatizované inhibitory interakce CD2/LFA-3, ve kterých například kterýkoliv homolog protilátky, rozpustné CD2 a LFA-3 polypeptidy nebo CD2 a LFA-3 mimetika popsaná v tomto textu jsou funkčně spojeny (chemickou kondenzací, genetickou fúzí nebo jinak) k jednomu nebo více členům samostatně vybraným ze skupiny, kterou tvoří homology protilátek anti-LFA-3 a antiCD2, rozpustné LFA-3 a CD2 polypeptidy, CD2 a LFA-3 mimetika, cytotoxická agens a farmaceutické přípravky.

Jeden typ derivatizovaného inhibitoru je vytvářen zesítěním („crosslinking) dvou nebo více inhibitorů (stejného typu nebo různých typů). Vhodná zesíťovadala zahrnují ta, která jsou heterobifunkční, tj. která mají reaktivní skupiny oddělené vhodným spacerem m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidu) nebo (např. disukcinimidylsuberát). Takové linkery jsou k dispozici od firmy Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

dvě odlišně (např. ester homobifunkční

Další možnost zesítění využívá Pl vazebnou signální sekvenci v PI-navázaném LPA-3 nebo jeho fragmentech. Specificky, DNA kódující PI-vazebnou signální sekvenci (např. AAi62“ AA212 ze sekv. id. č. 4) je ligována po směru od DNA kódující požadovaný polypeptid, výhodně rozpustný LFA-3 polypeptid. Jestliže tento konstrukt je exprimován ve vhodné eukaryotické buňce, buňka bude rozpoznávat Pl vazebnou signální sekvenci a bude kovalentně spojovat Pl k polypeptidu.

Hydrofobní vlastnost PI může pak být využívána za vzniku micelárních agregátů polypeptidů.

Jsou také použitelné inhibitory spojené s jedním nebo více cytotoxickými nebo farmaceutickými přípravky. Použitelné farmaceutické přípravky zahrnují biologicky účinné peptidy, polypeptidy a proteiny, jako jsou například homology protilátek specifické pro humánní polypeptid jiný než CD2 nebo LFA-3, nebo jejich části. Použitelné farmaceutické přípravky a cytotoxické přípravky také zahrnují cyklosporin A, prednison, FK506, metotrexát, steroidy, retinoidy, interferon a dusíkatý yperit.

Výhodný inhibitory derivatizované s farmaceutickým přípravkem zahrnují rekombinantně vytvářené polypeptidy, ve kterých rozpustný LFA-3 polypeptid, rozpustný CD2 polypeptid nebo peptidyl CD2 nebo peptidyl LFA-3 mimetikům je fúzováno k celému nebo části imunoglobulinového kloubového úseku těžkého řetězce a celému nebo části konstantního úseku těžkého řetězce. Výhodné polypeptidy pro přípravu takových fúzních proteinů jsou rozpustné LFA-3 polypeptidy. Nejvýhodnější jsou fúzní proteiny obsahující AAi-AA₉₂ z LFA-3 (např. sekv. id. č. 2) fúzované k části humánního IgGl kloubového úseku (včetně C-koncových deseti aminokyselin kloubového úseku obsahujících dva cysteinové zbytky, o kterých se předpokládá, že se účastní meziřetězcové disulfidové vazby) a CH2 a CH3 úseků IgGl konstantní domény těžkého řetězce. Předpokládá se, že takové fúzní proteiny projevují prodloužený poločas v séru a umožní dimerizaci inhibitoru.

Kombinace pro použití při léčení

Vazebná agens, např. CD2 nebo LFA-3 vazebná agens, mohou být používána pro léčení v kombinaci s jinými činidly nebo

terapiemi, jako je například terapie světlem (např. UVA, UVB nebo PUVA), chemoterapie (např. metotrexát, retinoid, cyklosporin, etretinát) nebo topická terapie (např. steroid, vitamín (např. vitamín D) , dehet, anthralin, makrolid nebo makrolaktam (např. takrolimus nebo pimekrolimus). Taková kombinační léčba může výhodně využívat nižší dávky terapeutických nebo profylaktických přípravků.

provedeních každého kombinačnímu podávání

Podávání „kombinace nebo v kombinaci, jak se používá v tomto textu, znamená, že dvě (nebo více) různé léčby jsou podávány pacientovi v průběhu období, kdy je pacient postižen chorobným stavem, např. dvě nebo více léčebných kůr je aplikováno poté, co u pacienta byl diagnostikován chorobný stav a předtím, než byl chorobný stav vyléčen nebo odstraněn. V některých provedeních aplikace jedné léčby ještě probíhá, když začne druhá aplikace, takže existuje překrývání léčeb. To je v tomto textu někdy nazýváno jako současná nebo souběžná aplikace. V dalších provedeních aplikace jedné léčby skončí předtím, než začne aplikace jiné léčby. V některých případu je léčba účinnější díky Například druhá léčba je účinnější, např. rovnocenný účinek je pozorován s menším množstvím druhé léčby nebo druhá léčba redukuje symptomy do větší míry, než by bylo pozorováno, kdyby druhá léčba byla podávána bez výskytu první léčby nebo analogická situace je pozorována s první léčbou. V některých provedeních aplikace je taková, že redukce symptomu nebo jiného parametru se vztahem k chorobnému stavu, např. snížení hladiny nebo produkce IFN-γ, indukce apoptózy T lymfocytů nebo poklesu exprese CD40L, je větší, než kdyby byla pozorována při jedné léčbě aplikované bez přítomnosti druhé. Účinek těchto dvou léčeb může být částečně aditivní, zcela aditivní nebo větší než aditivní účinek první aplikované taková, že

Aplikace může být léčby je ještě • ·· ·

» · ·· detekovatelný, když je aplikována druhá, např. když UVB je aplikováno jako první, snížení IFN-γ je ještě detekovatelné, když je podávána LFA-3/Ig fúze.

Ve výhodném provedení aplikace první léčby a aplikace druhé léčby nastává 1, 2, 5, 10, 15 nebo 30 dnů po sobě.

Vazebná agens, jak byla popsána v tomto textu, mohou být použita jako doplněk obvyklé léčby kožních onemocnění, jako je například psoriáza. Například vazebná agens mohou být aplikována před terapií psoriázy, souběžně s ní nebo po postupné terapii psoriázy (přehled v práci autorů Koo, J. , 1999, J Am Acad Dermatol., 41(3 Pt 2): S25-8). Termín postupná terapie se týká léčebné strategie zahrnující použití specifických terapeutických přípravků v záměrném sledu pro optimalizaci terapeutického výsledku. Odůvodnění této strategii u psoriázy je, že chronická choroba vyžaduje dlouhodobou udržovací terapii, a také rychlou úlevu od symptomů a že některé dostupné terapie psoriázy jsou vhodnější pro rychlou clearance, zatímco jiné jsou vhodnější pro dlouhodobou udržovací léčbu. Postupná terapie obsahuje 3 hlavní kroky: (1) fáze clearance nebo quick-fix fáze, (2) přechodná fáze a (3) udržovací fáze.

metotrexátu. s postupným

Jeden příklad postupné systémové terapie zahrnuje použití rychle působícího pomocného agens, např. cyklosporinu v maximální dermatologické dávce (5 mg/kg denně) nebo Přibližně po 1 měsíci je započata přechodná fáze zavedením CD2-vazebného agens a/nebo dalšího pomocného agens, např. acitretinu, jako udržovacího agens. Jakmile je stanovena maximální tolerovaná dávka CD2-vazebného agens a/nebo dalšího pomocného agens, např. acitretinu, dávka rychle působícího pomocného agens, např. cyklosporinu, je postupně zmenšována a podávání CD2-vazebného agens a/nebo

·* ·» • · · · 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 * · · 999 999 9 • · 9 9 9 9 9

9« 99 99 ·· 9 9 9 9 dalšího pomocného agens, např. acitretinu, pokračuje pro dlouhodobé udržování. Pro zlepšenou kontrolu může být přidána kombinace s fototerapií (UVB nebo PUVA), je-li nutné.

V jiném příkladném provedení CD2-vazebné agens může být podáváno po prodloužené časové období (např. terapeutické léčebné období dvanácti týdnů). Během období remise nebo méně aktivní nemoci CD2-vazebné agens může být podáváno samotné nebo v kombinaci s topickým agens (např. steroid, vitamín (např. vitamín D), dehet, anthralin, makrolid nebo makrolaktam (např. takrolimus (FK506) nebo pimekrolimus)) a/nebo fototerapií (např. UVA, UVB nebo PUVA, ale výhodně UVB). Během období aktivní nemoci může být podáváno krátké léčebné období rychle působící, ale toxické pomocné agens, jako je například metotrexát a/nebo cyklosporin.

Deriváty askomycin makrolaktamu, jako je například pimekrolimus (ASM 981 krém 1%), jsou selektivní inhibitory zánětlivých cytokinů, které jsou v současnosti používány v léčení zánětlivých kožních onemocnění, jako je například atopická dermatitida, alergická kontaktní dermatitida, iritační kontaktní dermatitida a psoriáza (Stuetz, A. et al., 2001, Semin. Curan. Med. Surg. 20(4):233-41, Bornhovd, E. et al., 2001, J. Am. Dermatol., 45(5):736-43).

Ve výhodném provedení CD2-vazebné agens (např. LFA-3/Ig fúze) nebo farmaceutický přípravek je obsahující je podáván systémově (např. intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, do kloubů, intrathekálně, periostálně, do tumoru, do lézí, do okolí lézí, prostřednictvím infúze (např. s použitím infúzního zařízení), perorálně, topicky nebo inhalací). Výhodně CD2-vazebné agens je podáváno intramuskulárně nebo intravenózně. V dalších provedeních CD2-vazebné agens je • · • · · ·

podáváno lokálně (např. topicky) do postižené oblasti, např. psoriatické léze.

Terapie světlem

V jednom provedení vazebné agens, jak je popsané v tomto textu, např. CD2-vazebné agens popsané v tomto textu, je podáváno v kombinaci s fototerapií (v tomto textu také nazývanou terapie světlem) absorpce ultrafialového (UV) rychle rostoucí buňky a

Fototerapie záření kůží, zastavila používá optické aby se usmrtily se proliferace.

V současnosti jsou obě terapie, jak záření UVA tak UVB, které exponují kůži UV záření mezi 320 až 400 nm (UVA záření) nebo 290 až 320 nm (záření UVB), účinně a široce používány k léčbě kožních onemocnění. Ve výhodném provedení je použito záření UVB v rozsahu 290 až 320 nm a výhodněji ve formě úzkého pásma UVB ve 311 nm. V dalších provedeních může také být použita PUVA terapie, což je forma fotochemoterapie, která zahrnuje opakovanou topickou aplikaci psoralenu nebo sloučeniny založené na psoralenu na úsek postižené kůže, následovanou expozicí tohoto úseku UVA záření. V ještě dalších provedeních fotodynamická terapie (PDT) může být použita k léčbě kožních onemocnění, konkrétně psoriázy a mycosis fungoides. V této metodě je pacientovi podáváno fotosenzibilizující agens, což je lék selektivně zachycovaný v karcinomových buňkách. Po absorpci světla (typicky mezi 320 až 700 nm, v závislosti na léku) fotosenzibilizující agens podstupuje fotochemickou reakci, která má za následek produkci cytotoxického singletového kyslíku, který nakonec vede k destrukci nádorových cév v kůži (Anderson, et al., 1992, Arch. Dermatol., 728:1631-1636).

• · · · · ·

V mnoha případech bude opakována aplikace jednoho nebo obou, CD2-vazebného agens, např. LFA-3/Ig fúze, a terapie světlem, např. UVB. CD2-vazebné agens může být aplikováno ve stejných nebo nestejných časových intervalech. Například CD2vazebné agens může být aplikováno každé 3 až 12 dnů, např. jednou týdně. Aplikace může být opakována až 3, 6, 12, 15, 24-krát nebo vícekrát. Jeden nebo více běhů druhé léčby, např. aplikace terapie světlem, např. UVB, může předcházet kúře aplikace fúzního proteinu, následovat po ní nebo být současně podáváno s kúrou aplikace fúzního proteinu.

Farmaceutické přípravky

Tento vynález se týká prevence nebo léčení výše uvedených kožních onemocnění u pacienta podáváním jednoho nebo více CD2vazebných agens, např. inhibitorů interakce CD2/LFA-3 nebo jejích derivatizované formy (forem), v kombinaci s pomocným agens, savci.

Výhodně je podáváno účinné množství CD2-vazebného agens nebo jeho derivatizované formy. Účinné množství znamená množství schopné snížit šíření nebo závažnost kožních onemocnění popsaných v tomto textu.

Odborníkům v oboru je zjevné, že účinné množství inhibitoru závisí, inter alia, na plánu podávání, podávané lékové jednotce, zda inhibitor je podáván v kombinaci s jinými terapeutickými přípravky, imunitním stavu a zdraví pacienta, terapeutické nebo profylaktické aktivitě konkrétního podávaného inhibitoru a poločasu v séru.

Výhodně CD2-vazebné agens je podáváno v dávce mezi přibližně 0,001 a přibližně 50 mg inhibitoru na kg tělesné hmotnosti, výhodněji mezi přibližně 0,01 a přibližně 10 mg

inhibitoru na kg tělesné hmotnosti, nejvýhodněji mezi přibližně 0,1 a přibližně 4 mg inhibitoru na kg tělesné hmotnosti.

Lékové jednotky by měl být podávány dokud není pozorován účinek. Účinek může být měřen celou řadou metod, včetně in vitro testů aktivity T lymfocytů a clearence postižených oblastí kůže. Výhodně léková jednotka je podávána přibližně jednou až třikrát za týden nebo jednou až třikrát denně. Výhodněji, je podávána přibližně jednou až třikrát denně po dobu přibližně mezi 3 a 7 dny nebo přibližně jednou až třikrát denně po dobu přibližně mezi 3 a 7 dny měsíčně. Nicméně se uznává, že mohou být použity nižší nebo vyšší dávky a jiné plány podávání.

CD2-vazebné agens nebo jeho derivatizovaná forma (formy) jsou také výhodně podávány v přípravku zahrnujícím farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceuticky přijatelný nosič znamená nosič, který nezpůsobuje alergické reakce nebo jiný neobvyklý účinek u pacientů, kterým je podáván.

Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují například jeden nebo více členů skupiny, kterou tvoří voda, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosfáty, dextróza, glycerol, ethanol apod., a také jejich kombinace. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou dále zahrnovat menší množství pomocných látek, jako jsou například smáčedla nebo emulgátory, konzervační činidla nebo pufry, které prodlužují skladovatelnost nebo účinnost inhibitoru.

Jak bylo popsáno výše, farmaceutický přípravek nebo CD2vazebné agens může být podáváno ve spojení s jinými pomocnými terapeutickými nebo profylaktickými činidly. Ty zahrnují například cyklosporin A, steroidy, retinoidy, dusíkatý yperit, interferon, metotrexát, antibiotika a antihistaminika.

Tato pomocná agens mohou být podávána v jedné lékové formě s inhibitorem (tj. jako část stejného farmaceutického přípravku), mnohonásobné lékové formě odděleně od inhibitoru, ale souběžně, nebo mnohonásobné lékové formě, kde dvě složky jsou podávány odděleně, ale postupně. Alternativně, CD2-vazebné agens a jiné účinné agens mohou být ve formě jedné konjugované molekuly. Konjugace dvou složek může být dosaženo standardními zesíťovacími technikami v oboru dobře známými. Jedna molekula může také mít formu rekombinantního fúzního proteinu. Kromě toho inhibitory nebo farmaceutické přípravky, použitelné v předkládaném vynálezu, mohou být použity v kombinaci s jinými terapiemi, jako je například PUVA, chemoterapie a UV světlo. Takové kombinační terapie mohou výhodně využívat nižší dávky terapeutických nebo profylaktických agens.

CD2-vazebné agens nebo farmaceutický přípravek může být v celé řadě forem. Ty zahrnují například pevné, polotuhé a kapalné lékové formy, jako jsou například tablety, pilulky, prášky, kapalné roztoky, disperze nebo suspenze, lipozomy, čípky, přípravky pro injekci, pro infúzi a topické přípravky. Výhodná forma závisí na zamýšleném způsobu podáváni a terapeutickém použití. Výhodné formy jsou roztoky pro injekci nebo roztoky pro infúzi.

Vynález obsahuje formulace vhodné pro použití jako topicky aplikované opalovací krémy nebo UV-protektory. Výhodná provedení zahrnují LFA3TIP přípravky. Účinná složka může být formulována v lipozomu. Produkt může být použit před UV expozicí, během ní nebo po UV expozici nebo před zčervenáním, během něho nebo po zčervenání kůže.

Soupravy

V dalším aspektu se vynález týká souprav, které obsahují CD2-vazebné agens, jak bylo popsáno v tomto textu, v kombinaci s pomocným agens, např. agens, jak bylo popsáno v tomto textu, nebo instrukce, jak používat takové agens.

Ve výhodném provedení inhibitor interakce CD2/LFA-3 je LFA3/Ig fúzní polypeptid. Výhodně LFA-3/Ig fúzní polypeptid je lyofilizován.

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které by neměly být vykládány jako omezující. Obsah všechny odkazů, projednávaných patentových přihlášek a publikovaných patentů, citovaných v textu této přihlášky, je tímto výslovně zahrnut v předkládané přihlášce formou odkazu.

Popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci LFA-3/IgG fúzního proteinu. Signální peptid odpovídá aminokyselinám 1 až 28 obrázku 1, zralý LFA-3 úsek odpovídá aminokyselinám 29 až 120 obrázku 1 a IgGl úsek odpovídá aminokyselinám 121 až 351 obrázku 1.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

In vitro inhibice IFN-γ a pokles hladin CD25 po kokultivaci LFA3TIP

In vitro vyšetření LFA3TIP s použitím mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) od dobrovolníků bez psoriázy a s psoriázou prokázalo významnou inhibici IFN-γ, a také pokles hladin CD25 po kokultivaci LFA3TIP. Pokles hladin IFN-γ byl také vyjádřen v in vivo vyšetření T lymfocytů od pacientů léčených LFA3TIP. Při daném významném účinku LFA3TIP na PBMC in vitro si původci přáli určit, zda in vivo podávání LFA3TIP mělo nebo nemělo účinek na PBMC léčených dobrovolníků. Aby se toto vyšetřilo, odebraný vzorek periferní krve byl přidán do protokolu, který byl časován s každým keratomovým vzorkem, aby se umožnilo vyšetření hladin IFN-γ a CD25 v PBMC populace léčené LFA3TIP. PBMC preparáty byly získávány s pomocí Ficollu a stimulovány podle PBMC protokolů v oboru známých. PBMC získané od in vivo LFA3TIP ošetřených pacientů byly použity v dalších experimentech s průtokovou cytometrií. Experimenty s periferní krví přidaly dalších 15 experimentálních bodů každému pacientovi pro každý časový bod. Skládaly se ze značení na CD3, CD69, CD25, CD2, IFN γ, CD40L a Apo2.7. Dále byla na PBMC in vivo léčených pacientů také vyšetřována CD40L exprese.

• φ · · * ♦ · · ·· » +

- 68 ··<

··

Příklad 2

Humánní LFA-3/IgGl fúzní protein inhibuje produkci IFN-γ normálními a psoriatickými T lymfocyty periferní krve a zesiluje účinek UVB

Psoriáza je částečně zprostředkovaná produkcí interferonu γ (IFN-γ) aktivovanými T lymfocyt. Alefacept (humánní LFA3/IgGl fúzní protein, LFA3TIP, v současnosti vyvinutý firmou Biogen, lne., pod obchodní značkou Amevive™) vykazuje inhibiční účinky na T lymfocyty in vitro a in vivo. Fáze 3 klinických zkoušek alefaceptu u psoriázy pokračuje. UVB záření zůstává jednou z nejúčinnějších léčeb psoriázy a původci dříve publikovali, že jedna in vivo UVB expozice může selektivně snížit produkci IFN-γ T lymfocyty.

Aby se vyšetřily účinky alefaceptu na produkci IFN-γ T lymfocyty, PBMC normálních jednotlivců (n=7) nebo psoriatických pacientů (n=7) byly aktivovány a produkce IFN-γ byla měřena průtokovou cytometrií. Co se týče nepsoriatických PBMC ošetřených alefaceptem v koncentraci 8 gg/ml, počet IFN-y+ T lymfocytů klesal v 5/7 případech (20-90% redukce), zvýšil se v 1/7 nebo zůstal nezměněn v 1/7 případech. U psoriatických PBMC léčba alefaceptem v koncentraci 8 μρ/πνΐ způsobila pokles produkce IFN-γ u 6/7 testovaných pacientů, s průměrem 56+0,12% redukce, (p<0,005). Populace PBMC mohla být rozdělena do dvou skupin na základě produkce IFN-γ, vysoká (>10%) nebo nízká (<10%) IFN-y^+CD3+. Když byly hodnoceny odděleně, obě populace s vysokou produkcí, jak nepsoriatická tak psoriatická, byly účinně inhibovány alefaceptem v koncentraci 8 μρ/ml, φφ • Φ φφφφ • · · · * φφφφφφ « · • φ · · · ΦΦΦΦ· ·· φφφ φφ φφ φφ «·

- 69 s průměrnou redukcí 56% a 65%, v daném pořadí. Na rozdíl od toho, populace s nízkou produkcí vykazovali malou inhibici. Předběžné ošetření anti-Fcy RI a RIII mAb zrušilo redukci IFN-y alefaceptem. Když PBMC populace byly předem ošetřeny UVB zářením (0-20 ml/cm²) , alefacept zesílil apoptózu indukovanou UVB a dále snižoval IFN-γ o 32,2 % (p= 0,009, n=3).

Tyto výsledky ukazují, že alefacept inhibuje produkci IFN-γ T lymfocyty, že je žádoucí interakce s buňkami nesoucími FcyR a že jeho kombinace s UVB se může ukázat jako účinná při redukci počtu a aktivity lymfocytů typu Thl v psoriatické lézi.

Příklad 3

Léčba psoriázy humánním LFA-3/IgGl fúzním proteinem redukuje počet infiltrujících T lymfocytů produkujících IFN-γ v kožních lézích

Psoriáza je chronické zánětlivé kožní onemocnění zprostředkované částečně produkcí IFN-γ aktivovaným T lymfocyty (Thl typ) v lézi. Alefacept (humánní LFA-3/IgGl fúzní protein, LFA3TIP, v současnosti vyvinut pod obchodní značkou AMEVIVE™) je nový rekombinantní protein, který vede k reverzibilnímu snížení CD3+CD45RO+ T lymfocytů v krvi.

Aby se studovaly účinky na kožní T lymfocyty, klinická studie se známým označením fáze III s alefaceptem byla prováděna na 6 pacientech, kterým byl podáván alefacept jednou týdně v množství 7,5 mg i.v., po dobu 12 po sobě jdoucích

4444 · 4 4 4 4 · · 4 4 4 • 44 * 4 4 4 4 4 4 • * · 4 4 4 444 44« 4 • 4 4 44 4 4444

4 444 44 44 44 44

- 70 týdnů. Procento CD3⁺ T lymfocytů a CD3⁺ populace produkující IFN-γ v celkovém počtu epidermálních nebo dermálních buněk bylo analyzováno průtokovou cytometrií a byla vypočítána denzita lymfocytů CD3⁺ nebo IFNy⁺CD3⁺ jako počet buněk/mm².

U 5/6 pacientů, kteří vykazovali známky klinického zlepšení stavu ve 13. týdnu, byla denzita epidermálních T lymfocytů produkujících IFN-γ (IFNy⁺CD3⁺) redukována na 0,2 6 ±

0,3 % bazální hodnoty. Průměrná denzita IFNy⁺CD3⁺ lymfocytů pro všech 6 pacientů v bazálních hodnotách byla 182±91/mm² oproti 77±45/mm² ve 12 týdnech léčby alefaceptem (p=0,05). Co se týkalo všech 6 pacientů, PAŠI zlepšení korelovalo s % změny v IFNy⁺CD3⁺ epidermálních lymfocytech v r =0,80, p=0,06. Je zajímavé, že v počáteční fázi léčby, několik pacientů vykazovalo přechodné zvýšení IFNy⁺CD3⁺ T lymfocytů v lézích ve 3. týdnu, ve spojení s přechodným zvýšením tloušťky epidermis, jak IFNy⁺CD3⁺ T lymfocyty, tak tloušťka epidermis pak klesala v následujících týdnech.

Výsledky výše popsaných zkoušek svědčí pro to, že alefacept může významně redukovat počet infiltrujících IFNy⁺CD3⁺ T lymfocytů typu Thl, ve spojení s klinickým zlepšením. Protože se má za to, že IFN-γ je klíčový faktor v patogeneze psoriázy, redukce Thl lymfocytů v kůži může představovat rozhodující krok pro klinické zlepšení psoriázy.

9999 • *

- 71 99 ··· • * 9

9 9

4 4 ·

4 4 ·

4· 44

Uložení biologického materiálu

Myší hybridomové buňky a anti-LFA-3 protilátky použité v předkládaném vynálezu byly jakožto příklady kultur uloženy v souladu s Budapešťskou smlouvou v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, ATCC), Rockville, Maryland, U.S.A., 5. března 1991, a jsou identifikovány následovně:

Označení Přístupové č. ATCC

1E6	HB	10693
HC-1B11	HB	10694
7A6	HB	10695
8B8	HB	10696

Bakteriofág nesoucí plazmid kódující transmembránový LFA-3 byl uložen podle Budapešťské smlouvy ve sbírce In Vitro International, lne., Linthicum, Maryland, U.S.A., 28. května 1987, pod přístupovým č. IVI-10133. Tento depozit byl přenesen do ATCC (American Type Culture Collection) 20. června 1991, a identifikován takto:

Označení Přístupové č. ATCC lambdaHT16[lambdagt10/LFA-3] 75107

E. coli transformované plazmidem kódujícím PI-navázaný LFA-3 byly uloženy podle Budapešťské smlouvy ve sbírce In Vitro International, lne., 22. července 1988, pod přístupovým č. IVI-10180. Tento depozit byl přenesen do ATCC (American • · * · • · ·»

- 72 ·* *· ·♦ • ♦ · · • · · · • · ··· β · · ·· ···«

Type Culture Collection) 20. června 1991, a identifikován takto:

Označení Přístupové č. ATCC

68788

Sekvence

Následuje shrnutí sekvencí popsaných v patentu Spojených Států č. 6 162 432, na které se odkazuje v textu této přihlášky:

sekv. id. č. 1	DNA sekvence transmembránového LFA-3
sekv. id. č. 2	Aminokyselinová sekvence transmembránového LFA-3
sekv. id. č. 3	DNA sekvence PI-navázaného LFA-3
sekv. id. č. 4	Aminokyselinová sekvence PI-navázaného LFA-3
sekv. id. č. 5	DNA sekvence CD2
sekv. id. č. 6	Aminokyselinová sekvence CD2
sekv. id. č. 7	DNA sekvence LFA3TIP
sekv. id. č. 8	Aminokyselinová sekvence LFA3TIP

Analogie

Odborníkovi je zřejmé, že pomocí rutinních experimentů je možné realizovat mnoho analogií specifických provedení vynálezu popsaných v tomto textu. Takové analogie jsou zahrnuty v rozsahu vynálezu, který je definován následujícími patentovými nároky.

- 73 ·· • · • · • * ·» ·» • · • · ·«< · ·· ·· * · · • · · • · e • · · · *· ·· ···«

SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> 1. ..750 <221> signální peptid <222> 1...84 <221> zralý peptid <222> 85...750 <400> 1

atg gtt gct ggg agc Met Val Ala Gly Ser

gac gcg

ggg <=gg

gcc ctg ggg gtc ctc agc gtg

48

Asp

Ala

Gly

Arg -20

Ala Leu Gly

Val Leu -15

Ser Val

-25

gtc

tgc

ctg

ctg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

atc

agc

tgt

ttt

tcc

caa

caa

96

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Xle

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Gin

-10

-5

1

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

agc

aat

144

Ile

Tyr

Gly

val

Val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

5

10

15

20

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

eta

tgg

aaa

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

25

30

35

gaa

ctg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

gct

ttc

tca

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

40

45

50

gtt

tat

tta

gac

act

gtg

tca

ggt

agc

ctc

act

atc

tac

aac

tta

aca

288

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

55

60

65

tca

tca

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

tcg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

Thr

Asp

70

75

80

- 74 * · φ φφ φφ ΦΦΦΦΦ· • ΦΦΦ φφφφ φφ φ ♦ · φ φφφφ ΦΦΦ

85

90

95

100

Leu

Thr

Cys

Ala

Leu 105

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile 110

Glu

Val

Gin

Cys

Met 115

Ile

Pro

Glu

His

Tyr 120

Asn

Ser

His

Arg

Gly 125

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser 130

Trp

Asp

Cys

Pro

Met 135

Glu

Gin

Cys

Lys

Arg 140

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile 145

Tyr

Phe

Lys

Met

Glu 150

Asn

Asp

Leu

Pro

Gin 155

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr 160

Leu

Ser

Asn

Pro

Leu 165

Phe

Asn

Thr

Thr

Ser 170

Ser

Ile

Ile

Leu

Thr 175

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser 180

Ser

Gly

His

Ser

Arg 185

His

Arg

Tyr

Ala

Leu 190

Ile

Pro

Ile

Pro

Leu 195

Ala

val

Ile

Thr

Thr 200

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr 205

Met

Asn

Gly

Met

Tyr 210

Ala

Phe

<210> 5 <211> 1056 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> 1. ..1053 <221> signální peptid <222> 1...72 <221> zralý peptid <222> 73...1053

<400> 5 atg agc ttt cca tgt aaa

ttt gta gcc agc ttc ctt ctg att

ttc aat Phe Asn -10

48

Met Ser

Phe

Pro

Cys -20

Lys

Phe

Val Ala Ser -15

Phe

Leu

Leu - Zle

gtt

tet

tcc

aaa

ggt

gca

gtc

tcc

aaa

gag

att

acg

aat

gcc

ttg

gaa

96

Val

Ser

Ser

Lys

Gly

Ala

Val

Ser

Lys

Glu

Zle

Thr

Asn

Ala

Leu

Glu

-5

1

5

acc

tgg

ggt

gcc

ttg

ggt

cag

gac

atc

aac

ttg

gac

att

cct

agt

ttt

144

Thr

Trp

Gly

Ala

Leu

Gly

Gin

Asp

Zle

Asn

Leu

Asp

Zle

Pro

Ser

Phe

10

15

20

caa

atg

agt

gat

gat

att

gac

gat

ata

aaa

tgg

gaa

aaa

act

tea

gac

192

Gin

Met

Ser

Asp

Asp

Zle

Asp

Asp

Zle

Lys

Trp

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp

25

30

35

40

aag

aaa

aag

áfct.

gca

caa

ttc

aga

aaa

gag

aaa

gag

act

ttc

aag

gaa

240

Lys

Lys

Lys

Zle

Ala

Gin

Phe

Arg

Lys

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Lys

Glu

45

50

55

aaa

gat

aca

tat

aag

cta

ttt

aaa

aat

gga

act

ctg

aaa

att

aag

cat

288

Lys

Asp

Thr

Tyr

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Gly

Thr

Leu

Lys

Zlé

Lys

His

60

65

70

ctg

aag

acc

gat

gat

cag

gat

atc

tac

aag

gta

tea

ata

tat

gat

aca

336

Leu

Lys

Thr

Asp

Asp

Gin

Asp

zle

Tyr

Lys

Val

Ser

Zle

Tyr

Asp

Thr

75

80

85

aaa

gga

aaa

aat

gtg

ttg

gaa

aaa

ata

ttt

gat

ttg

aag

att

caa

gag

384

• · · · · · · • · ······ · ·

Lys

Gly 90

Lys

Asn

Val

Leu

Glu 95

Lys

Ile

Phe

Asp

Leu 100

Lys

Ile

Gin

Glu

agg

gtc

tca

aaa

cca

aag

atc

tcc

tgg

act

tgt

atc

aac

aca

acc

ctg

432

Arg 105

Val

Ser

Lys

Pro

Lys 110

Ile

Ser

Trp

Thr

Cys 115

Ile

Asn

Thr

Thr

Leu 120

acč

tgt

gag

gta

atg

aat

gga

act

gac

ccc

gaa

tta

aac

ctg

tat

caa

480

Thr

Cys

Glu

Val

Met 125

Asn

Gly

Thr

Asp

Pro 130

Glu

Leu

Asn

Leu

Tyr 135

Gin

gat

393

aaa

cat

cta

aaa

ctt

tet

cag

agg

gtc

atc

aca

cac

aag

tgg

528

Asp

Gly

Lys

His 140

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin 145

Arg

Val

Ile

Thr

His 150

Lys

Trp

acc

acc

agc

ctg

agt

gca

aaa

ttc

aag

tgc

aca

gca

ggg

aac

aaa

gtc

576

Thr

Thr

Ser 155

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe 160

Lys

Cys

Thr

Ala

Gly 165

Asn

Lys

val

agc

aag

gaa

tcc

agt

gtc

gag

cct

gtc

agc

tgt

cca

gag

aaa

ggt

ctg

624

Ser

Lys 170

Glu

Ser

Ser

Val

Glu 175

Pro

val

Ser

Cys

Pro 180

Glu

Lys

Gly

Leu

gac

atc

tat

ctc

atc

att

ggc

ata

tgt

gga

gga

ggc

agc

ctc

ttg

atg

672

Asp 185

ile

Tyr

Leu

Ile

Ile 190

Gly

Ile

Cys

Gly Gly Gly 195

Ser

Leu

Leu

Met 200

gtc

ttt

gtg

gca

ctg

ctc

gtt

ttc

tat

atc

acc

aaa

agg

aaa

aaa

cag

720

Val

Phe

Val

Ala

Leu 205

Leu

Val

Phe

Tyr

Ile 210

Thr

Lys

Arg

Lys

Lys 215

Gin

agg

agt

cgg

aga

aat

gat

gag

gag

ctg

gag

aca

aga

gcc

cac

aga

gta

768

Arg

Ser

Arg

Arg 220

Asn

Asp

Glu

Glu

Leu 225

Glu

Thr

Arg

Ala

His 230

Arg

Val

gct

act

gaa

gaa

agg

ggc

cgg

aag

ccc

cac

caa

att

cca

gct

tca

acc

816

Ala

Thr

Glu 235

Glu

Arg

Gly Arg

Lys 240

Pro

His

Gin

Ile

Pro 245

Ala

Ser

Thr

cct

cag

aat

cca

gca

act

tcc

caa

cat

cct

cct

cca

cca

cct

ggt

cat

864

Pro

Gin 250

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser 255

Gin

His

Pro

Pro

Pro 260

Pro

Pro

Gly

His

cgt

tcc

cag

gca·

pct

agt

cat

cgt

ccc

ccg

cct

cct

gga

cac

cgt

gtt

912

Arg 265

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser 270

His

Arg

Pro

Pro

Pro 275

Pro

Gly

His

Arg

Val 280

cag

cac

cag

cct

cag

aag

agg

cct

cct

gct

ccg

tcg

ggc

aca

caa

gtt

960

Gin

His

Gin

Pro

Gin 285

Lys

Arg

Pro

Pro

Ala 290

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin 295

Val

cac

cag

cag

aaa

ggc

ccg

ccc

ctc

ccc

aga

cct

ega

gtt

cag

cca

aaa

1008

His

Gin

Gin

Lys 300

Gly

Pro

Pro

Leu

Pro 305

Arg

Pro

Arg

Val

Gin 310

Pro

Lys

cct Pro

ccc Pro

cat His 315

333 Gly

gca Ala

gca Ala

gaa Glu

aac Asn 320

tca Ser

ttg Leu

tcc Ser

cct Pro

tcc Ser 325

tet Ser

aat Asn

1053

taa

1056 • ·

<210>	6
<211>	351
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<220>
<221>	signální
<222>	1. . .	24

<400> 6

Met

Ser

Phe

Pro

cys -20

Lys

Phe

Val

Ala

Ser -15

Phe

Leu

Leu

Ile

Phe -10

Asn

val

Ser

Ser

Lys -5

Gly

Ala

Val

Ser

Lys 1

Glu

Ile

Thr

Asn 5

Ala

Leu

Glu

Thr

Trp 10

Gly

Ala

Leu

Gly

Gin 15

Asp

Ile

Asn

Leu

Asp 20

Ile

Pro

Ser

Phe

Gin 25

Met

Ser

Asp

Asp

Ile 30

Asp Asp

Ile

Lys

Trp 35

Glu

Lys

Thr

Ser

Asp 40

Lys

Lys

Lys

Ile

Ala 45

Gin

Phe

Arg

Lys

Glu 50

Lys

Glu

Thr

Phe

Lys 55

Glu

lys

ASp

Thr

Tyr 60

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn 65

Gly

Thr

Leu

Lys

Ile 70

Lys

His

Leu

Lys

Thr 75

Asp

Asp

Gin

Asp

Ile 80

Tyr

Lys

Val

Ser

Ile 85

Tyr

Asp

Thr

Lys

Gly 90

Lys

Asn

val

Leu

Glu 95

Lys

Ile

Phe

Asp

Leu 100

Lys

Ile

Gin

Glu

Arg 105

Val

Ser

Lys

Pro

Lys 110

Ile

Ser

Trp

Thr

Cys 115

Ile

Asn

Thr

Thr

Leu 120

Thr

Cys

Glu

Val

Met 125

Asn

Gly

Thr

Asp

Pro 130

Glu

Leu

Asn

Leu

Tyr 135

Gin

Asp Gly Lys

His 140

Leu

Lys

Leu

Ser

Gin 145

Arg

Val

Ile

Thr

His ISO

Lys

Trp

Thr

Thr

Ser 155

Leu

Ser

Ala

Lys

Phe 160

Lys

Cys

Thr

Ala

Gly 165

Asn

Lys

Val

Ser

Lys 170

Glu

Ser

Ser

Val

Glu 175

Pro

val

Ser

Cys

Pro 180

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp 185

Ile

Tyr

Leu

Ile

Ile 190

Gly

Ile

Cys

Gly Gly Gly 195

Ser

Leu

Leu

Met 200

Val

Phe

Val

Ala

Leu 205

Leu

Val

Phe

Tyr

ile 210

Thr

Lys

Arg

Lys

Lys 215

Gin

Arg

Ser

Arg

Arg 220

Asn

Asp

Glu

Glu

Leu 225

Glu

Thr

Arg

Ala

His 230

Arg

Val

Ala

Thr

Glu 235

Glu

Arg

Gly Arg

Lys 240

Pro

His

Gin

Ile

Pro 245

Ala

Ser

Thr

Pro

Gin 250

Asn

Pro

Ala

Thr

Ser 255

Gin

His

Pro

Pro

Pro 260

pro

Pro

Gly

His

Arg 265

Ser

Gin

Ala

Pro

Ser 270

His

Arg

Pro

Pro

Pro 275

Pro

Gly

His

Arg

Val 280

Gin

His

Gin

Pr.o

Gin '285

Lys

Arg

Pro

Pro

Ala 290

Pro

Ser

Gly

Thr

Gin 295

Val

His

Gin

Gin.

Lys 300

Gly

Pro

Pro

Leu

Pro 305

Arg

Pro

Arg

val

Gin 310

Pro

Lys

Pro

Pro

His 315

Gly

Ala

Ala

Glu

Asn 320

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser 325

Ser

Asn

<210> 7 <211> 1050 <212> DNA <213> Homo sapiens • 0 0 0··· · 0 • · · ·· ······ · <220>

<221> CDS <222> 1...1041 <221> signální peptid <222> 1... 84 <221> zralý peptid <222> 85...1041 <4OO> 7

atg

gtt

gct

ggg

agc

gac

gcg

ggg

cgg

gcc

ctg

ggg

gtc

ctc

agc

gtg

48

Met

Val

Ala

Gly -25

ser

Asp

Ala

Gly

Arg -20

Ala

Leu

Gly

val

Leu -15

Ser

val

gtc

tgc

ctg

ctg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

atc

agc

tgt

ttt

tcc

caa

caa

96

Val

Cys

Leu -10

Leu

His

Cys

Phe

Gly -5

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe 1

Ser

Gin

Gin

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

agc

aat

144

Ile S

Tyr

Gly

val

Val

Tyr 10

Gly

Asn

Val

Thr

Phe 15

His

Val

Pro

Ser

Asn 20

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

cta

tgg

aaa

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu 25

Val

Leu

Trp

Lys

Lys 30

Gin

Lys

Asp t·

Lys

Val 35

Ala

gaa

ctg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

gct

ttc

tca

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn 40

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala 45

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys 50

Asn

Arg

gtt

tat

tta

gac

act

gtg

tca

ggt

agc

ctc

act

atc

tac

aac

tta

aca

288

val

Tyr

Leu 55

Asp

Thr

Val

Ser

Gly 60

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr 65

Asn

Leu

Thr

tca

tca

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

tcg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Ser 70

Asp

Glu

Asp

Olu

Tyr 75

Glu

Met

Glu

Ser

Pro 80

Asn

Ile

Thr

Asp

acc

atg

aag

ttc

ttt

ctt

tat

gtc

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

384

Thr 85

Met

Lys

Phe

Phe

Leu 90

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr 95

His

Thr

Cys

Pro

Pro 100

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

432

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu 10S

Leu

Leu

Gly Gly

Pro 110

Ser

Val

Phe

Leu

Phe 115

Pro

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

480

Pro

Lys

Pro

Lys 'm

Asp

Thr

Leu

Met

Ile 125

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu 130

val

Thr

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

528

cys

Val

Val 135

Val

Asp

Val

Ser

His 140

Glu

Asp

Pro

Glu

Val 145

Lys

Phe

Asn

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

576

Trp

Tyr ISO

Val

Asp

Gly

Val

Glu 155

val

His

Asn

Ala

Lys 160

Thr

Lys

Pro

Arg

gag

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgg

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

624

Glu 165

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser 170

Thr

Tyr Arg

Val

Val 175

Ser

Val

Leu

Thr

Val 180

- 78 • · · ······* • · · · · · ··· · · · · • · · · · · · · · «

ctg Leu

cac cag gac tgg etg aat ggc

aag gag tac aag tgc aag gtc tcc

672

His Gin Asp Trp Leu 185

Asn Gly

Lys

Glu 190

Tyr Lys

Cys

Lys

Val Ser 195

aac

aaa

gec

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

720

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Xle

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

200

205

210

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

gat

768

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

215

220

225

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

816

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

230

235

240

tat

ccc

ago

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

gag

864

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

245

250

255

260

aac

aac

tac

aag

acc

acg

ect

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

912

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

265

270

275

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

cag

ggg

960

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

280

285

290

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

ctg

cac

aac

cac

tac

1008

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

295

300

305

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tet

ccg

ggt

aaa

tgagtgcgg

1050

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly Lys

310 315

<210>	8
<211>	347
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	signální
<222>	1...28

<400> 8

Met

Val

Ala

Gly -25'

Ser

Asp

Ala

Gly Arg -20

Ala

Leu

Gly

Val

Leu -15

Ser

Val

Val

Cys

Leu -10

Leu

His

Cys

Phe

Gly -5

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe 1

Ser

Gin

Gin

Xle 5

Tyr

Gly

Val

Val

Tyr 10

Gly

Asn

Val

Thr

Phe 15

His

val

Pro

Ser

Asn 20

Val

Pro

Leu

Lys

Glu 25

Val

Leu

Trp

Lys

Lys 30

Gin

Lys

Asp

Lys

Val 35

Ala

Glu

Leu

Glu

Asn 40

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala 45

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys 50

Asn

Arg

Val

Tyr

Leu 55

Asp

Thr

Val

Ser

Gly 60

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr 65

Asn

Leu

Thr

Ser

Ser 70

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr 75

Glu

Met

Glu

Ser

Pro 80

Asn

Ile

Thr

Asp

Thr 85

Met

Lys

phe

Phe

Leu 90

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr 95

His

Thr

Cys

Pro

Pro 100

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu 105

Leu

Leu

Gly Gly

Pro 110

Ser

Val

Phe

Leu

Phe 115

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys 120

Asp

Thr

Leu

Met

Ile 125

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu 130

Val

Thr

Cys

Val

Val 135

Val

ASP

Val

Ser

His 140

Glu

ASp

Pro

Glu

Val 145

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr 150

Val

Asp

Gly

Val

Glu 155

Val

His

Asn

Ala

Lys 160

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu 165

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser 170

Thr

Tyr

Arg

Val

Val 175

Ser

Val

Leu

Thr

Val 180

Leu

His

Gin

Asp

Trp 185

Leu

Asn

Gly Lys

Glu 190

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val 195

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu 200

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu 205

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys 210

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro 215

Arg

Glu

Pro

Gin

Val 220

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro 225

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu 230

Thr

Lys

Asn

Gin

Val 235

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu 240

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr 245

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala 250

Val

Glu

Trp

Glu

Ser 255

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu 260

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr 265

Thr

Pro

Pro

Val

Leu 270

Asp

Ser

Asp Gly

Ser 275

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser 280

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 285

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin 290

Gin

Gly

Asn Thr

Val Gin 310

Phe 295 Lys

Ser Ser

Cys Leu

Ser Ser

Val Leu 315

Met 300 Ser

His Pro

Glu Ala Gly Lys

Leu

His 305

Asn

His

Tyr

- 80 • · · ·« ·« «99999 • · · · · · · · · · 9

<210>	9
<211>	1056
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	1. . .1053
<400>	9

atg Met 1

gtt gct ggg

agc Ser 5

gac gcg ggg cgg gcc ctg ggg gtc ctc agc gtg

48

Val Ala

Gly

Asp

Ala

Gly

Arg Ala Leu Gly Val Leu ser Val

10

15

gtc

tgc

ctg

ctg

cac

tgc

ttt

ggt

ttc

atc

agc

tgt

ttt

tcc

caa

caa

96

Val

Cys

Leu

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Gin

'20.

25

30

ata

tat

ggt

gtt

gtg

tat

ggg

aat

gta

act

ttc

cat

gta

cca

agc

aat

144

Ile

Tyr

Gly

Val

val

Tyr

Gly

Asn

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

35

40

45

gtg

cct

tta

aaa

gag

gtc

cta

tgg

aaa

aaa

caa

aag

gat

aaa

gtt

gca

192

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

50

55

60

gaa

ctg

gaa

aat

tet

gaa

ttc

aga

gct

ttc

tea

tet

ttt

aaa

aat

agg

240

Glu

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

70 75 80 • · • · · ·

gtt

tat

tta

gac

act

gtg

tca

ggt

agc

ctc

act

atc

tac.

aac

tta

aca

288

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr 85

Val

Ser

Gly

Ser

Leu 90

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu 95

Thr

tca

tca

gat

gaa

gat

gag

tat

gaa

atg

gaa

tcg

cca

aat

att

act

gat

336

Ser

Ser

Asp

Glu 100

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met 105

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile 110

Thr

Asp

aec

atg

aag

ttc

ttt

ctt

tat

gtc

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

384

Thr

Met

Lys 115

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val 120

Asp

Lys

Thr

His

Thr 125

Cys

Pro

Pro

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

432

Cys

Pro 130

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu 135

Gly

Gly

Pro

Ser

Val 140

Phe

Leu

Phe

Pro

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tec

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

480

Pro 145

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 150

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 155

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 160

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

528

Cys

Val

Val

Val

Asp 165

Val

Ser

His

Glu

Asp 170

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 175

Asn

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

576

Trp

Tyr

Val

Asp 180

Gly

Val

Glu

Val

His 185

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 190

Pro

Arg

gag

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

624

Glu

Glu

Gin 195

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 200

Arg

Val

Val

Ser

val 205

Leu

Thr

val

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

672

Leu

His 210

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 215

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 220

Cys

Lys

val

Ser

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

720

Asn 225

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 230

Pro

Zle

Glu

Lys

Thr 235

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 240

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

gat

768

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 245

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 250

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg 255

Asp

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

816

Glu

Leu

Thr

Lys 260

Asn

Gin

val

Ser

Leu 265

Thr

Cys

Leu

val

Lys 270

Gly

Phe

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

gag

864

Tyr

Pro

Ser 275

Asp

Zle

Ala

Val

Glu 280

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 285

Gin

Pro

Glu

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ttg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

912

Asn

Asn 290

Tyr

Lys

Thr

Thr

pro 295

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 300

Asp

Gly

Ser

Phe

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

cag

ggg

960

Phe 305

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 310

Thr

val

Asp

Lys

Ser 315

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly 320

·· 4 ·« · » ······ • · · · ··+· · · · • 99 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 999 9

aac Asn

gtc ttc tca tgc tcc

gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac

1008

Val Phe Ser

Cys Ser 325

val Met

His

Glu Ala 330

Leu His

Asn His 335

Tyr...

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tet

ccg

gat

tcc

aac

cta

tgg

aac

1053

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Asp

Ser

Asn

Leu

Trp

Asn

340

345

350

tga 1056 • · ··· ·

- 83 <210> 10 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met 1

Val

Ala

Gly

ser 5

Asp

Ala

Gly

Arg

Ala 10

Leu

Gly

val

Leu

Ser 15

val

Val

Cys

Leu

Leu 20

HÍS

Cys

Phe

Gly

Phe 25

lle

Ser

Cys

Phe

Ser 30

Gin

Gin

lle

Tyr

Gly 35

Val

Val

Tyr

Gly

Asn 40

Val

Thr

Phe

His

Val 45

Pro

Ser

Asn

Val

Pro 50

Leu

Lys

Glu

Val

Leu 55

Trp

Lys

Lys

Gin

Lys 60

ASp

Lys

Val

Ala

Glu 65

Leu

Glu

Asn

Ser

Glu 70

Phe

Arg

Ala

Phe

Ser 75

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg 80

Val

Tyr

Leu

Asp

Thr 85

Val

Ser

Gly

Ser

Leu 90

Thr

lle

Tyr

Asn

Leu 95

Thr

Ser

Ser

Asp

Glu 100

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met 105

Glu

Ser

Pro

Asn

lle 110

Thr

ASp

Thr

Met

Lys 115

Phe

Phe

Leu

Tyr

Val 120

Asp

Lys

Thr

His

Thr 125

cys

Pro

Pro

Cys

Pro 130

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu 135

Gly Gly

pro

Ser

Val 140

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 145

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 150

Leu

Met

lle

Ser

Arg 15S

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 160

Cys

Val

Val

val

Asp 165

val

Ser

His

Glu

Asp 170

Pro

Glu

val

Lys

Phe 175

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 180

Gly

Val

Glu

Val

His 185

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 190

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 195

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 200

Arg

Val

Val

Ser

Val 205

Leu

Thr

Val

Leu

His 210

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 215

Gly Lys

Glu

Tyr

Lys 220

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 225

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 230

Pro

lle

Glu

Lys

Thr 235

lle

Ser

Lys

Ala

Lys 240

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 245

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 250

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg Asp 255

Glu

Leu

Thr Lys 260

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 265

Thr

cys

Leu

Val

Lys 270

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 275

Asp

lle

Ala

Val

Glu 280

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 285

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 290

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro 295

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 300

Asp Gly

Ser

Phe

Phe 305

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 310

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 315

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly 320

Asn

val

Phe

Ser

Cys 325

Ser

Val

Met

His

Glu 330

Ala

Leu

His

Asn

His 335

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Asp

Ser

Asn

Leu

Trp

Asn

340 345 350

ty ΖηΖ -ζαΜ

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kombinace inhibitoru interakce CD2/LFA-3 s úzkým pásmem UVB záření pro použití při léčení nebo prevenci epidermálních nebo dermálních onemocnění charakterizovaných aberantní aktivitou nebo proliferací T lymfocytů.

   2. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčení nebo prevenci epidermálních nebo dermálních onemocnění charakterizovaných zvýšenou produkcí IFN-γ T lymfocyty.

   3. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčení nebo prevenci chronických zánětlivých onemocnění.

   4. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění.

   5. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčení nebo prevenci psoriázy.

   6. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde inhibitor interakce CD2/LFA-3 je CD2-vazebné agens.

   7. Kombinace podle nároku 6, kde inhibitor interakce CD2/LFA-3 je CD2-vazebný fragment LFA-3 fúzovaný k imunoglobulinu nebo jeho fragmentu.

   • · 9 9 • · 9 9 9 9 9

   - 85 ·· ·♦ • 99 ·

   8. Kombinace podle nároku 7, kde inhibitor interakce CD2/LFA-3 je LFA-3/IgG fúzní polypeptid.

   9. Kombinace podle nároku 1, dále zahrnující monitorování symptomů nebo změny v hladině cytokinů nebo v populaci imunitních buněk, pro použití při léčení nebo prevenci epidermálních nebo dermálních onemocnění charakterizovaných aberantní aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů.

   10. Kombinace podle nároku 1, dále zahrnující agens pro topické použití vybrané ze skupiny, kterou tvoří steroid, vitamín, dehet, anthralin a makrolaktam, pro použití při léčení nebo prevenci epidermálních nebo dermálních onemocnění charakterizovaných aberantní aktivitou nebo proliferaci T lymfocytů.

   11. Kombinace podle nároku 1 pro použití v humánní medicíně.

   12. Kombinace fúzního polypeptidu, který obsahuje CD2-vazebný fragment LFA-3 fúzovaný k fragmentu konstantního úseku IgG, s úzkým pásmem UVB záření dostatečným ke snížení hladiny interferonu-γ v pokožce pacienta, pro použití při léčení nebo prevenci psoriázy.

   13. Kombinace inhibitoru interakce CD2/LFA-3 s úzkým pásmem UVB záření pro použití při léčí nebo prevenci zánětlivých onemocnění.

   • A * A

   AA · AA AA

   AAAA « A · A A A A • A A A · A A A A A • A AAAA AAA AAA A • AA AA A AAAA

   AA AAA AAAA AA AA

   - 86 14.Kombinace inhibitoru interakce CD2/LFA-3 s úzkým pásmem záření UVB pro použití při léčí nebo prevenci autoimunítních onemocnění.

   14, kde autoimunitní onemocnění je kterou tvoří psoriáza, diabetes revmatoidní artritida, juvenilní , osteoartritida, psoriatická multiplex, encephalomyelitis, systémový lupus erythematosis, dermatitida, atopická dermatitida

   Kombinace podle nároku vybráno ze skupiny, mellitus, artritida, revmatoidní artritida artritida, sclerosis myasthenia gravis, autoimunní thymiditis, a ekzém.

   16.Kombinace fúzního polypeptidů, který obsahuje CD2-vazebný fragment LFA-3 fúzovaný k fragmentu konstantního úseku IgG, s úzkým pásmem UVB záření dostatečným ke snížení hladiny interferonu-γ v pokožce, pro použití při léčí nebo prevenci atopické dermatitidy.

   17.Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde se jeden nebo oba inhibitory CD2/LFA-3 interakce a úzké pásmo záření UVB aplikují opakovaně.

   18.Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 16, kde aplikace úzkého pásma záření UVB předchází aplikaci inhibitoru CD2/LFA-3 interakce.

   ·>· 4

   4 4» ·» · 44 4 · · « « « 0 • · 9 4 4 4 4 4 4 4

   4 4 44 4 44444 4 4

   4 4 44 4 4444 *· 444 44 44 44 44

   - 87 19. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 16, kde aplikace úzkého pásma UVB záření následuje po aplikaci inhibitoru CD2/LFA-3 interakce.

   20. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 16, kde aplikace úzkého pásma UVB záření je simultánní s aplikací inhibitoru CD2/LFA-3 interakce.

   21. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 16, kde úzké pásmo UVB záření a inhibitor interakce CD2/LFA-3 jsou aplikovány v nestejných časových intervalech.

   • · • · · · • · · · • · · · · ·· ··

   LFA-3 Signální sekvence l ATG CTT GCT Q3G AGC GAC »3G GGG CGG GCC CIG GGG CTC CTC AGC GÍG CTC TGC l>Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Vat Val Cys

   CIG CTG CAC TGC TTT GCT TTC ATC AGC TCT i9»Leu Leu HIS Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys

   LFA-3

   ITT TCC CAA CAA ΑΊΑ TAT GCT GTT GIG TAT GGG AAT CTA ACT TTC CAT GTA CCA

   29>Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro

   139 AGC AKT CTG OCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GIT GCA

   47>Ser Asn Val Pro Léu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Ala

   193 GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG CTT TAT

   65>Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr

   247 TTA GAC ACT CTG TCA GCT AGC CTC ACT ATC TAC AřC TTA ACA TCA TCA GAT GAA

   83>Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu

   301 GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT

   1O1> Asp Gl u Tyr Gl u Met GluSer ProAsn IteThr AspThr Met Lys Phe Phe Leu 355 TAT CTC u9tTyr Vo' l_gG1( (Kloub, CH2, CH3)

   361 GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG QGA CCG I2i> Asp Lys Thr His Thr tys Pr o Pr o Cys Pr o Al a Pro Gl u Leu Leu Gly Gly Pro 4iS TCA CTC TTC CIO TIC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG ATC TOC CGG ACC i39>Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met l Ie Ser Arg Thr 469 CCT GAG CTC ACA TGC CTG CTG CTG GAC CTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG CTC AAG 157^ Pr o Gl u Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Gl u Asp Pr o Gl u Val Lys 523 TTC AAC TGG TAC CTG GAC GGC CTG GAG CTG CAT AAT GCT AAG ACA AAG CCG CGG ns>Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gtu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 577 GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT CTG GTC AGC GTC CTC ACC CTC CTG CAC 193>©U Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 631 CAG GAC TGG CIG AAT GGC AAG GAG TAC AAG 1GC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC 2ii>G1 n Asp Trp Leu Asn Gly Lys Gl u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a Leu 685 CCA GCC OCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA 229>Pr oAiaPro IleGlu Lys Thr 11 e Ser Lys Al a Lys Gly Gl n Pro Arg Gl u Pro 739 CAG CTG TAC ACC CIG CCC CCA TCC OQG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC 247tGI n Val Tyr Thr Leu Pro Pr o Ser Arg Asp Gl u Leu Thr Lys Asn Gl n Val Ser 793 CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT OCC AGC GAC ATC GCT GTG GAG TGG GAG 26s> Leu T hr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pr o Ser Asp 11 e Ala Val Gl u Trp Gl u 847 AGC AAT GGG CAG 00G GAG AAC AAC TAC AAG ACC AOG CCT OCC GIG TTG GAC TCC 283>Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 901 GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC M3C AAG CTC ACC CTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG 30i>Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 955 CAG GGG AAC CTC TIC TCA TGC TCC CTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC 3i9>Gln Gly Asn Val Phe Ser <^s Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

   1009 ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GAT TCC AAC CIA TGG AAC TGA 337>Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Ser Asn Leu Trp Asn ···