CZ20032540A3 - Synergické kombinace ligandů retinoidního receptoru a vybraných cytotoxických prostředků pro léčení rakoviny - Google Patents

Description

Vynález se vztahuje na chemoterapeutické strategie léčení rakoviny ve kterých se ligandy receptoru kyseliny retinové (RAR), zejména α/β selektivní agonisté nebo RAR panantagonisté podávají v kombinaci s tubulin polymerujícími prostředky jako jsou taxany. Jak bylo autory vynálezu prokázáno, uvedení RAR α/β selektivní agonisté a RAR panantagonisté jsou účinnými prostředky proti rakovině a mají sníženou toxicitu ve srovnání s RAR panagonisty které současně aktivují RAR-gama a přirozenými retinoidy jako je alí-trans-kyselina retinová aktivující RAR-gama a RXR. Dále, RARα/β selektivní agonisté a RAR panantagonisté mají synergististické účinky ve spojení prostředky polymerizujícími tubulin, zejména s taxany, a velmi výrazně snižují účinnou dávku taxanu potřebnou k indukci cytotoxicity v širokém rozmezí tumorových buněčných linií. Předpokládá se, že synergistický účinek s RAR / selektivními agonisty z části souvisí s účinky na expresi/fosforylaci Bel-2 a rovněž souvisí s účinkem na aktivitu JNK a AP-1. Podle toho, podobné synergistické účinky RAR α/β;selektivních agonistú se předpokládají v jejich kombinaci s dalšími prostředky které zvyšují fosforylaci Bcl-2.

Dosavadní stav techniky ·· · · • * · *

« »

Retinoidy jsou biologicky aktivní deriváty vitaminu A které· jsou zahrnuté v mnoha fyziologických funkcích jak během embryogeneze tak během během celého života (Vitamin A in Health a Disease. Ed. Blomhoff, Institute for Nutrition Research, University of Oslo, Oslo, Norsko, 1994; Kastner a sp., Cell, 1995, 83:859-869; Giguere a sp., Ann.

N.Y.Acad.Sci., 1996, 785:12-22). Přirozené retinoidy primárně zahrnují all-trans-kyselinu retinovou (ATRA) a 9-cis-retlnovou kyselinu, které vznikají z vitaminu A jeho irreversibilní oxidací (Vitamin A in Health and Disease, Ed. Blomhoff, Institute for Nutrition Research, University of Oslo, Oslo, Norsko, 1994; Napli J.L., Faseb J., 1996, 10:993-1001). Kromě toho bylo navrženo více syntetických ligandů které vykazují mnoho biologických vlastností přirozených ligandů.

Na buněčné úrovni mohou retinoidní ligandy regulovat proliferaci, diferenciaci a apoptózu v široké paletě jak normálních tak maligních buněk ((Vitamin A in Health and Disease, Ed. Blomhoff, Institute for Nutrition Research, University of Oslo, Oslo, Norsko, 1994; Lotan R., Sem. in Cancer Biol., 1991, 2:197-208; Love J.M. a Gudas L.J.,

Curr. Opinion in Cell Biol., 1994, 6:825-831; Lotan R., Faseb J., 1996, 10:1031-1039; a Fitzgerald a sp., Cancer Res., 1997, 57:2642-2650). Biologické aktivity retinoidů jsou zprostředkované dvěma třídami jaderných receptorů, receptory kyseliny retinové (RAR) a receptory retinoidů X (RXR). Obě třídy receptorů, jak RAR tak RXR obsahují tři isotypy označované alfa, beta a gama, které jsou kódované odlišnými geny (Chambon P., Sem. in Cell Biol., 1994, 5:115-125; Chambon P., Faseb J., 1996, 10:940-954). RAR a RXR patří do superrodiny jaderných hormonálních receptorů a působí jako ligandově závislé transkripční faktory které mohou modulovat expresi cíleného genu vazbou ve formě RAR/RXR heterodimerních komplexů na specificky element reagující na retinoidy (RARE)

DNA sekvence, který se skládá z přímých repetitivních úseků konvenční sekvence PuG (G/A) (T/A)CA (N) PuG(G/T)TCA

ZL — S (Gronemeyer H. a Moras D., Nátuře 1995, 375:190-191). Aktivita RAR/RXR heterodimeru může být represivní nebo stimulační v závislosti na jeho odpovídající apo- (neligandové formě) nebo holo- (v ligandové navázané formě) konformaci. Apo-konformace RAR/RXR heterodimeru je permisivní struktura umožňující interakci proteinu s okolím za iniciace tvorby velkého komplexu korepresor-multiprotein který zahrnuje NCOR a histondeacetylasy, který společně udržuje chromatin v kondenzované transkripčně inaktivní struktuře která reprimuje expresi cílového genu (Xu a sp., Curr.Opinion in Genetic and Development, 1999, 9:140-147; Hu X. a Lazar M.A., Trends in Endocrin. and Metab., 2000, 11:6-10; Robyr a sp., Endocrin., 2000, 14:329-347). Na rozdíl od výše popsaného stavu, vazba agonistického ligandu na RAR je spojená se změnou konformace vazebné domény pro ligand (LBD; Renaud a sp., Nátuře, 1995, 378: 681 -689) která způsobí destabilizaci kompresorového komplexu a současně umožní účinek koaktivátorů zahrnujících koaktivátory rodiny pl60 proteinu, CBP/p300 a multiproteinové komplexy TRAP/DRIP/ARC. Některé z těchto faktorů mají aktivitu histonacetyltransferasy umožňující dekondenzaci chromatinu nutnou pro následnou vazbu holo-RAR/RXR heterodimeru s bazálním transkripčním komplexem k iniciaci exprese cílového genu (Xu a sp., Curr.Opinion in Genetic and Development, 1999, 9:140-147; Robyr a sp., Mol.Endocrin., 2000, 14:329-347).

Bylo zjištěno, že ATRA a syntetické ligandy retinoidního receptoru podporují ve více modelech karcinogeneze na zvířatech regresi tumorů a bylá rovněž prokázaná jejich účinnost u pacientů trpících akutní promyeolidní leukémií (Chomienne a sp., Faseb J., 1996, 10:1025-1030,- Fenaux a sp., • · c ·

Leukemia, 2000, 14:1371-1377). Kombinace 13-cis-retinové kyseliny s paklitaxelem nebo cisplatinou a/nebo alfa-interferonem byla zahrnutá do klinických zkoušek fáze I/II pro léčení spinocelulárních karcinomů hlavy a krku, nemalobuněČných karcinomů plic a karcinomů prostaty (gravis a sp., Anticancer Drugs, 1999, 10:369-374; DiPaolo a sp., J.Clin.Oncol., 1999, 17:2213-2218). RAR agonista, ALRT1550, účinný inhibitor API, byl rovněž zahrnutý do studie fáze I/II heterogenní populace 15 pacientů trpících pokročilým karcinomem, zahrnující nemalobuněčný karcinom plic, štítné žlázy, ledvin, leiomyosarkom dělohy, karcinom prostaty a adeno-cystický karcinom {Soignet a sp.,

Proč.Annu.Meet.Am.Soc.Clin.Oncol., 1998, 17:A826).

Kombinace cytosinarabinosidu s paklitaxelem a ATRA byla již navržena ke kombinační terapii akutní myeloblastické leukemie. Později bylo prokázané, že ATRA senzibilizuje buněčné linie karcinomu prsu smrtícím účinkům paklitaxelu a adriamycinu na buňky (Wang a sp., Cancer Res., 2000, 60:2040-2048).

ATRA, kyselina 13-cis-retinová a ALRT1550 jsou všichni panagonisté RAR což znamená že jsou cílené a aktivují alfa, beta a gama isotypy RAR. Dále, ATRA se in šitu konvertuje na 9-cis-RA, což je panagonista RAR a agonista RXR.

Ze tří isotypů RAR je se supresivními účinky retinoidů na tumory spojený isotyp RARp-2. RARp-2 vzniká z alternativního použití promotoru P2 genu RAR β (Chambon P., Sem. In Cell Biol., 1994, 5:115-125) který obsahuje silný RARE což vede k předpokladu, že exprese RARp-2 je kyselinou retinovou zvýšená a činí z RARp^2 potenciální cílový gen odpovědný za růst buněk potlačující účinky kyseliny retinové. V souladu s jeho • ·

• · ·

úlohou v modulaci růstu buněk vede inaktivace RARp genu v F9 teratokarcinomových buňkách k úbytku růstového arestu závislého na kyselině retinové (Faria a sp., J.Biol.Chem., 1999, 274:26783-26788), zatímco retroviry zprostředkovaná exprese RAR'P v buňkách karcinomu prsu je spojená se zvýšením odezev na kyselinu retinovou zahrnujících inhibici růstu a indukci apoptosy (Seewaldt a sp., Cell Growth and Differentiation,

1995, 6:1077-1088). Z výše uvedených pozorování vyplývá zjištění, že RARp,je důležitý mediátor účinku retinoidů a jeho modulace může být účinná v redukování růstu tumorových buněk.

Nicméně v literatuře je popsaný úbytek exprese RARp 2 v. časných fázích vzniku rakoviny zahrnující tumory prsu a plic (Widschwendter a sp., Cancer Res., 1997, 57:4158-4161). Předpokládá se, že uvedený úbytek vyplývá z represivního stavu chromátinu indukovaného methylací a/nebo deacetylací inaktivující RARp 2 promotor spíše než z genetické alterace {Arapshian a sp., Oncogene, 2000, 19:4066-4070). Čistý RARP ; agonista nemá na proliferaci buněk žádný vliv.

Oproti tomu, exprese RAR a.a RAR-gama rovněž jako RXR a zůstává v maligních tkáních převážně beze změny. Nicméně, mukokutánní toxické účinky, které se pokládají za hlavní toxické projevy indukované retinoidy a limitující jejich použití jako terapeutických prostředků jsou spojené s aktivitou RAR-gama.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnout synergickou chemoterapeutickou kombinaci pro léčení rakoviny. Podle jednoho provedení vynálezu uvedená synergická kombinace • · obsahuje selektivního agonistu RARot/β a druhý prostředek který zvyšuje fosforylaci Bel-2 jako je prostředek polymerizující tubulin, výhodně taxan. V dalším provedení vynálezu vynález zahrnuje synergickou kombinaci obsahující RAR panantagonistů a prostředek polymerizující tubulin, výhodně taxan.

Dalším cílem vynálezu je snížit účinnou dávku zvoleného cytotoxického prostředku nutnou k indukci cytotoxicity v tumorových buňkách podáváním zvoleného cytotoxického prostředku v kombinaci se selektivním agonistou RAR α/β^ nebo RAR panantagonistou.

Ještě dalším cílem vynálezu je poskytnout způsoby léčení pacientů trpících rakovinou pomocí uvedených synergických kombinací. Podle jednoho provedení uvedeného způsobu léčení se pacientovi podává RAR α/β selektivní agonista v kombinaci s druhým prostředkem který zvyšuje fosforylaci Bcl-2 jako jsou prostředky polymerizující tubulin, výhodné taxan. Podle dalšího provedení se pacientovi podává RAR panantagonista v kombinaci s prostředkem polymerizujícím tubulin výhodně s taxanem.

Popis obrázků na připojených výkresech

Na obr.l je znázorněné schéma syntézy příkladných RAR α/β selektivních agonistů vhodných k provedením podle vynálezu.

Na obr. 2 je znázorněné schéma syntézy příkladných panantagonistů vhodných k provedením podle vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Vynález se vztahuje na RAR α/β selektivní agonisty a RAR panantagonisty a jejich použití spočívajícím v synergickém účinku zvyšujícím citlivost tumorových buněk vůči zvoleným cytotoxickým prostředkům.

Pro účely předloženého vynálezu výraz RAR α/β selektivní agonista znamená sloučeninu která aktivuje a, a β isotypy receptoru kyseliny retinové, ale která málo nebo vůbec neaktivuje nebo ve skutečnosti inhibuje gama-isotyp. Příkladné RAR α/β selektivní agonisty vhodné podle vynálezu znázorňuje obecný vzorec (I) :

vzorec I kde R znamená vodík nebo methylovou skupinu a R znamená cis-CH=CH-C(CH ) nebo cis-CH=CH-C(CH ) CH CH . Specifičtější příkladné RAR / selektivní agonisty znázorňují vzorce (Ia) a (lb) :

» · · I * φ φ « ·· φ φ

vzorec lb

Sloučenina vzorce (Ia) a její způsob přípravy pro použití při léčbě kožních chorob a jako protinádorový prostředek jsou podrobně popsané ve WO 00/17147 jejíž popis je plně včleněný do tohoto textu odkazem. Po prostudování předložené přihlášky bude pracovníkům v oboru zřejmé, že podle vynálezu je možné použít i další RAR α/β selektivní agonisty, jiné než jsou specificky popsané v této přihlášce. Další příkladné sloučeniny vykazující selektivitu vůči RAR a RAR jsou popsané například ve WO 97/48672. Schopnost sloučeniny aktivovat ct a β isotypy receptorů kyseliny retinové za současné malé nebo žádné aktivace gama-isfcypu je možné stanovit rutinními způsoby jako jsou způsoby popsané ve WO 97/48672 a v práci Gehina a sp. (Chemistry and Biology 1999, 6:519-529).

Výraz RAR panantagonista znamená sloučeninu která inhibuje α, β a gama isotypy receptoru kyseliny retinové. Příkladem sloučeniny která je RAR panantagonistou znázorňuje vzorec (II):

vzorec II

Sloučeninu vzorce (II> mohou pracovníci zkušení v oboru připravit rutinními způsoby v oboru obecně známými.

Příklad způsobu syntézy výše uvedené sloučeniny je popsaný v příkladu 2. Po prostudování předložené přihlášky bude pracovníkům v oboru zřejmé, že podle vynálezu je možné použít i další sloučeniny mající RAR panantagonistickou aktivitu. Další příkladné sloučeniny vykazující RAR panantagonistickou aktivu jsou popsané ve WO 97/48672. Další sloučeniny vykazující výše uvedenou aktivitu je možné rovněž identifikovat rutinními způsoby známými v oboru jako jsou způsoby popsané popsané ve WO 97/48672.

Ve způsobech a kompozicích podle vynálezu je možné kromě sloučenin vzorců (I), (la), (lb) a (II) ve formě volných kyselin použít i uvedené sloučeniny ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Uvedené farmaceuticky přijatelné soli zahrnují, ale bez omezení jen na uvedené soli, soli alkalických kovů jako je sodík, draslík a lithium; soli kovů alkalických zemin jako je vápník a hořčík; soli s organickými bázemi jako je dicyklohexylamin, tributylamin, pyridin a podobně; a soli s aminokyselinami jako je arginin, lysin a ·· ···· • ·· ; · · · • · · • · · ♦ • * · ·· ···· • · • · • · • · · • · podobně.

«RAR panagonista znamená sloučeninu, která aktivuje α,, β a gama isotypy receptorů kyseliny retinové. Příklady RAR panagonistů zahrnují, ale nejsou omezené je na ně, ATRA, kyselinu 13-cis-retinovou a ALRT15150. I když je známé, že RAR panagonisté inhibují progresi tumoru, léčení uvedenými prostředky je dosud limitované nežádoucími toxickými účinky zahrnujícími, ale bez omezení jen na ně, mukokutánní toxické účinky, bolesti hlavy, teratogenezi, muskuloskeletární toxicitu, dylipidémie, kožní dráždivost a hepatotoxicitu. Uvedené mukokutánní toxické účinky RAR panagonistů, které se pokládají za hlavní toxický účinek indukovaný uvedenými sloučeninami a omezující jejich použití jako terapeutických prostředků, jsou spojené s aktivitou RAR-gama. Dále, přirozený retinoid ATRA se in šitu konvertuje na 9-cis-RA, což je pan-RAR a RXR agonista. Aktivace RXR po podání ATRA je rovněž spojená s nežádoucími vedlejšími účinky.

Výraz vybraný cytotoxický prostředek znamená taxan nebo jiný prostředek působící podobným mechanismem jako taxany. Z toho vyplývá, že uvedený výraz zahrnuje další prostředky polymerizující tubulin. Rovněž v synergických kompozicích obsahujících RAR α/β selektivního agonistu výše uvedený výraz má význam zahrnující i další prostředky které zvyšují fosforylaci Bcl-2. Ve výhodném provedení je uvedený zvolený cytotoxický prostředek paklitaxel nebo docetaxel.

Jak bylo autory vynálezu prokázané, RAR a/pselektivní agonisté a RAR panantagonisté synergicky působí se zvolenými cytotoxickými prostředky na snížení účinné dávky zvoleného cytotoxického prostředku nutné k indukci cytotoxicity v tumorových buňkách. V jednom provedení vynálezu uvedená » · , ► · · 4 ·· ·· • · · « · synergická kombinace obsahuje RAR α/β selektivního agonistů v kombinaci s druhým prostředkem který zvyšuje fosforylaci Bel-2 jako jsou prostředky polymerizující tubulin, výhodně taxan. V dalším provedení vynálezu synergická kombinace obsahuje RAR panantagonistu a prostředek polymerizující tubulin, výhodně taxan.

Předpokládá se, že uvedené synergické kombinace budou účinné při léčení rakoviny za snížení toxických vedlejších účinků spojených se zvolenými cytotoxickými prostředky obsaženými v kombinaci. Dále, použití RARα/β selektivních agonistů nebo RAR panantagonistů v kombinacích podle vynálezu eliminuje nebo snižuje toxické vedlejší účinky spojené s aktivací RAR-gama a RXR po podání RAR panagonistů a ATRA. Předložený vynález se tedy rovněž vztahuje na způsoby léčení rakoviny zahrnující podání RAR _α/β selektivního agonisty nebo RAR panantagonisty v kombinaci se zvoleným cytotoxickým prostředkem pacientovi. Ve výše uvedených způsobech podle vynálezu je výhodné, když uvedený RAR α/β selektivní, agonista nebo RAR panantagonista se podává v kombinaci s prostředkem polymerizujícím tubulin, výhodně s taxanem.

Alternativně může v případě použití RAR α/β selektivních agonistů zvolený cytotoxický prostředek také zahrnovat prostředek který zvyšuje fosforylaci Bcl-2.

Výraz rakovina zahrnuje tumory, neoplazie a jakékoliv další maligní tkáně nebo buňky.

Vynález se rovněž vztahuje na farmaceutické kompozice obsahující zvolený cytotoxický prostředek a RAR α/β selektivního agonistů nebo RAR panantagonistu. Ve výhodném provedení zvolený cytotoxický prostředek obsahuje prostředek »· ···· polymerizující tubulin, ještě výhodněji taxan. Alternativně v kompozicích obsahujících RAR α/β selektivního agonistů může zvolený cytotoxický prostředek rovněž zahrnovat prostředek který zvyšuje fosforylaci Bcl-2.

Kompozice podle vynálezu mohou obsahovat obě složky v jednom farmaceuticky přijatelném přípravku. Alternativně mohou být obě složky zpracované do samostatných forem a podávané ve vzájemné kombinaci. Kompozice podle vynálezu je možné použít v různých farmaceuticky přijatelných formách které jsou pracovníkům v oboru obecně známé. Volbu vhodné lékové formy k použití podle vynálezu může provést pracovník zkušený v oboru na základě zvoleného způsobu podání rozpustností složek obsažených v kompozici.

Pro účely předložené přihlášky výraz kombinace znamená, že RAR a/pselektivní agonista nebo RAR panantagonista se pacientovi podává před podáním, současně nebo po podání zvoleného cytotoxického prostředku. Ve výhodném provedení se RAR α/β selektivní agonista nebo RAR panantagonista podává pacientovi před podáním nebo současně se zvoleným cytotoxickým prostředkem. Výraz současně použitý v tomto textu znamená, že RARcc/β selektivní agonista nebo RAR panantagonista a zvolený cytotoxický prostředek se pacientovi podají vzájemně v průběhu 24 hodin, výhodně 12 hodin, ještě výhodněji 6 hodin a nejvýhodněji 3 hodin nebo méně.

Schopnost RAR α/β selektivních agonistů a RAR panantagonistů vyvolat další nebo synergický účinek na růst buněk při podání v kombinaci se známými chemoterapeutickými prostředky byla nejprve hodnocená na třech různých lidských tumorových buněčných liniích. Inhibice růstu buněk byla porovnaná s buňkami současně léčenými paklitaxelem a buď RAR • · • 0 • ···· • 0 0000 ► · 0 ’ · 0 ► · 0 • 0 0 ·· 00 • 0 • · panagonistou (viz vzorec (III)), RARct/β selektivním agonistou vzorce (Ia) , RAR oí/agonistou (viz vzorec (IV)), RARP agonistou (viz vzorec (V)), RAR-gama agonistou (viz vzorec (VI), RAR panantagonistou vzorce (II) a nebo RXR panagistou (viz vzorec (VII). Struktury sloučenin znázorněné vzorci (III) až (VII) jsou znázorněné níže:

vzorec (IV) ·> 0000

vzorec (V)

vzorec (VI)

vzorec (VII) • · • « • ·

Jak vyplývá z výsledků uvedených v tabulce 1, použití RAR α/βselektivního agonisty vzorce (Ia) významně snižuje účinnou dávku paklitaxelu nutnou k indukci cytotoxicity. V přítomnosti sloučeniny vzorce (Ia) se hodnota IC_so pro buňky MCF7, 0VCAR3 a SQCC-Y1 sníží v příslušném pořadí 8násobně, 15násobně a 32násobně. Výše uvedené hodnoty jsou velmi blízké hodnotám získaným s kombinací paklitaxelu s RAR panagonistou vzorce (III) což podporuje předpoklad hlavní úlohy RAR α/β isotypů v tumor-supresivní aktivitě retinoidů. Rovněž RAR panantagonista vzorce (II) snižuje účinnou dávku paklitaxelu nutnou k vyvolání cytotoxicity. Oproti tomu, čistý RARa agonista (sloučenina vzorce (IV)) vyvolá pouze 2násobné až 4násobné snížení hodnoty IC_so paklitaxelu (tabulka 1), což je ve shodě s nízkou afinitou této sloučeniny pro RAR ave srovnání se sloučeninou vzorce (Ia) . Tkni čistý agonista RAR0 (vzorec V), RAR-gama selektivní agonista (vzorec VI) a ani čistý RXR agonista (vzorec VII) neovlivňují cytotoxicitu paklitaxelu více než 2krát až 3 krát, což podporuje předpoklad, že synergické účinky RAR α/β ligandů ve spojení s paklitaxelem zprostředkovávají především RARa (tabulka 1) . Jednu výjimku představuje použití gama-selektivního agonisty v buňkách 0VCAR3, při kterém došlo k Snásobnému snížení hodnoty IC_so paklitaxelu.

·· ···· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ··

Tabulka :

Inhibice buňky

MCF7 : Selektivita potřebná pro synergickou inhibici růstu buněk kombinací retinoid/paklitaxel růstu {inkorporace [³H]-thymidinu) selektivita paklitaxel

	IC n 50	účinnost
žádná	0,070	100
RAR panagonista (vzorec III))	0,008	100
RARcc/β agonista (vzorec (la))	0,009	98
RAR α agonista (vzorec (IV))	0,017	100
RAR β agonista (vzorec (V))	0,064	100
RAR-gama agonista (vzorec (VI))	0,044	100
RAR panantagonista (vzorec (II))	0,007	100
RXR panagonista (vzorec (VII))	0,068	100

·· ····

• · ·· * ····

Inhibice buňky

SQCC-Y1 růstu (inkorporace [³H] -thymidinu) selektivita paklitaxel

	IC 50	účinnost
žádná	0,160	100
RAR panagonista (vzorec III))	0,008	100
RAR α/β.agonista (vzorec (Ia))	0,005	100
RAR α agonista (vzorec (IV))	0,05	100
RAR β agonista (vzorec (V))	0,113	100
RAR-gama agonista (vzorec (VI))	0,088	100
RAR panantagonista (vzorec (II))	0,037	100
RXR panagonista (vzorec (VII))	0,111	100

Inhibice růstu (inkorporace [³H]-thymidinu) buňky selektivita paklitaxel

IC účinnost

0VCAR3 žádná

0,6 99

RAR panagonista 0,080 (vzorec III))

RAR α/β agonista (vzorec (Ia)) /

RAR a, agonista (vzorec (IV))

0,040 100

0,251 100

RAR β agonista 0,2 (vzorec (V))

100

RAR-gama agonista 0,079 (vzorec (VI))

100

RAR panantagonista 0,100 (vzorec (II))

100

RXR panagonista 0,22 (vzorec (VII))

100

Ve výše uvedené tabulce 1 je účinnost definovaná inhibici v procentech ve srovnání s DMSO. Všechny hodnoty hodnoty IC_so jsou vyjádřené v nanomolárních koncentracích.

« ·

Uvedené výsledky jsou průměry z 2 až 5 pokusů. Standardní odchylky stanovení IC50 jsou v rozmezí 10 až 20 %.

Další pokusy měly za cíl porovnat schopnost MCF7 buněk tvořit kolonie v přítomnosti selektivního RAR α/β agonisty, RAR panantagonisty nebo ATRA. Růst kolonií v přítomnosti selektivního _α/β agonisty vzorce (Ia) zřetelně znázornil diferenciační účinek retinoidu. Buňky ošetřené vehikulem,

DMSO, tvořily velmi kompaktní kolonie kde buňky dokonale uzavíraly cytoplasmu a většina kolonií byla velmi dobře ohraničená. Na rozdíl od toho, ošetření MCF7 buněk agonistou RAR α/β vzorce (Ia) vedlo k významné změně v morfologii jak kolonií tak buněk. Kolonie se jevily dispergované, buňky se objemově zvětšily za exhibice cytoplasmy a měly tendenci se shromažďovat do struktur podobných epiteliální struktuře. Ošetření MCF7 buněk RAR panantagonistou vzorce (II) rovněž významně zhoršilo tvorbu kolonií. Kolonie zůstávaly malé se dvěma zjevnými populacemi buněk z nichž jedna vykazovala apoptózu a druhá vykazovala v procesu diferenciace extenzi plasmy. Dále, ošetření uvedených buněk RAR panantagonistou tři dny předem významně zvýšilo citlivost buněk vůči paklitaxelu. Rovněž ATRA zhoršuje tvorbu kolonií. Nicméně na rozdíl od RAR α/βselektivních agonistů, kolonie ošetřené ATRA vykazují vysoké hladiny apoptózy o kterých se předpokládá že k nim dochází následkem aktivity RXR následující po konverzi in šitu ATRA na 9-cis-RA.

Rovněž byly analyzované účinky jak paklitaxelu tak RAR α/β selektivních agonistů nebo RAR panantagonistů na dráhy přenosu signálu společné pro výše uvedené prostředky. V těchto pokusech byly nejprve zjišťované účinky společného ošetření paklitaxelem/retinoidem na hladiny exprese a stav fosforylace antiapoptotického proteinu, Bcl-2, proteinu zahrnutého jak v

signalizaci retinoidu tak paklitaxelu. MCF7 buňky ošetřené paklitaxelem vykazují zvýšení fosforylace Bcl-2 závisíš na podané dávce. Přídavek selektivního α/β agonisty k buňkám vede ke snížení hladin Bcl-2 proteinu, zatímco samotný RAR panantagonista nemá žádný vliv na hladiny Bcl-2 nebo na jeho fosforylaci. Kombinace paklitaxelu se selektivním RAR agonistou vede ke snížení hladin Bcl-2 a ke zvýšení jeho fosforylace. Na rozdíl od toho, kombinace paklitaxelu s RAR panantagonistou je spojená pouze se zvýšením fosforylace Bcl-2 bez modulace jeho hladin. Z těchto výsledků vyplývá, že synergický účinek paklitaxelu a RARot/β selektivních agonistů by mohl být z části vyvolaný aditivními účinky na snižovaní hladiny a fosforylace Bcl-2 vedoucími k vyvolání proapoptotické aktivity Bax, permeabilizaci mitochondriální membrány a k indukci apoptózy. Proto se předpokládá, že i další prostředky které zvyšují fosforylaci Bcl-2 podobným způsobem jako paklitaxel budou vykazovat podobnou synergickou aktivitu s RAR α/β selektivními agonisty.

Na rozdíl od výše uvedeného, RAR panantagonisté neovlivňují hladiny proteinu Bcl-2 nebo paklitaxelem indukovanou fosforylaci Bcl-2, což indikuje, že synergický účinek mezi prostředky polymerujícími tubulin jako paklitaxel a retinoidními antagonisty mohou mít jiný mechanismus účinku.

Rovněž byl analyzovaný kombinovaný účinek paklitaxelu a RAR α/β agonistů nebo RAR na polymeraci tubulinu. Podíly rozpustného, nepolymerovaného tubulinu byly separované od podílů nerozpustného polymerovaného tubulinu a byly analyzované metodou Western blott s použitím anti- atubulinových protilátek. Byla zjištěná na dávce paklitaxelu závislá polymerace tubulinu indukovaná paklitaxelem. Nicméně selektivní RAR agonisté nebo antagonisté nevykázaly žádný účinek. Dále, při použití kombinace paklitaxelu s každým z retinoidů nedošlo ke zvýšení účinku samotného paklitaxelu. Retinoidy tedy nemají synergický účinek s paklitaxelem působící na cytoskelet k indukci cytotoxicity.

V současné době bylo zveřejněno několik prací ve kterých je popsaná taxolem indukovaná stimulace aktivity Jun N-terminální kinasy (JNK) vedoucí ke zvýšení c-Jun fosforylace a spojeného zvýšení aktivity API transkripčního komplexu (Lee a sp., J.Biol.Chem., 1998, 273:28253-28260; Wang a sp.,

J.Biol.Chem., 1998, 273:4928-2936). Rovněž bylo prokázané, že retinoidy regulují a inhibují transkripční aktivitu API {Chen a sp., EMBO J., 1995, 14:1187-1197). V této souvislosti byl analyzovaný kombinovaný účinek paklitaxelu a retinoidů na aktivitu JNK kinasy a transkripční aktivitu API v buňkách MCF7. Fosforylací c-JTJN imunologicky vysráženou JNK bylo zjištěno, že ošetření MCF7 buněk paklitaxelem vede k průměrně 2,5násobnému zvýšení aktivity JNK, zatímco ošetření samotnými retinoidy nemá na aktivitu JNK žádný účinek. Oproti tomu kombinace paklitaxelu s ct/β selektivním agonistou mírně podporuje paklitaxelem indukovanou aktivitu JNK vedoucí k nejvýše 4násobnému zvýšení aktivity enzymu. Uvedené účinky na JNK byly dále analyzované na úrovni aktivity transkripčního komplexu s použitím stabilní MCF7 buněčné linie stabilně exprimující API reportérový gen (API)5x-tk-Luc. Značná aktivita tohoto reportérového konstruktu indukovaná v buňkách MCF7 forbolesterem (PMA) je selektivním RAR α/β agonistou (vzorec Ia) inhibovaná způsobem závislým na dávce, kde maximální inhibice dosahuje 30 až 45 % při aplikaci 50 nM retinoidů. Oproti tomu paklitaxel, pokud se použije samostatně, dále zvyšuje, o 20 %, PMA-indukovanou transkripční aktivitu API. Retinoid v kombinace s paklitaxelem brání účinku paklitaxelu na PMA-indukovanou aktivitu kolagenasového • · • · · · · · • « • ·

promotoru vedoucí k 30 až 50 % inhibici aktivity API transkripčních faktorů vyvolané kombinací paklitaxelu a PMA. Kombinace paklitaxelu s RAR a/βselektivními agonisty tedy zvyšuje účinek paklitaxelu na aktivitu Jun-N-terminální kinasy která však není spojená s následnou API transkripční aktivací vzhledem k negativně zkřížené regulaci indukované retinoidy. Uvedená zjištění společně s účinky na Bel-2 mohou tvořit podstatu účinného synergického cytotoxického účinku uvedených prostředků. Použitím kombinace paklitaxelu s RAR panantagonistou vzorce (II) nedochází k modifikaci paklitaxelem indukované aktivity JNK. Nicméně uvedená kombinace nezvyšuje účinky paklitaxelu/PMA nebo aktivity API.

K dalšímu znázornění vynálezu slouží níže uvedené příklady, které však vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiály

V uvedených pokusech byly použité buněčné linie T47D,

HT-3, UMSCC-25, MCF-7, 0VCAR3, HCT-1 16 a N-87 které byly získané z ATCC a uchovávané v médiu a při koncentraci séra doporučovanými ATTC. Buněčná linie H3396 byla získaná způsobem popsaným v práci autorů Garrigues a sp.

{Am.J.Pathol., 1993, 142:607-622) a byla uchovávaná v médiu RPMI doplněným 10 % FBS (Gibco-BRL). MDA-PCA.2B a SQCC-YI byly získané z Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Rovněž byly použité buněčné linie rezistentní na léčivo připravené způsoby genového inženýrství zahrnující A2780S a její p27 transgenní variantu A2780p27, HCT-116TYPK (taxol-rezistentní) a HCTTVM46, SAN-1, M109 a její taxol-rezistentní variantu

M109TX a PAT-7 (taxol-rezistentní). Všechny cytotoxické prostředky a forbol-12-myristát-13-acetát (PNIAJ byly získané u firmy Sigma-Aldrich. Myší anti-aBcl-2, anti-a-tubulin a anti-lidské JNK protilátky použité v těchto pokusech byly získané v uvedeném pořadí u firem Biosource International, Sigma-Aldrich a BD-Pharmíngen. Fúzní protein c-jun (1-169)-GST byl získaný u firmy Upstate Biotechnology.

Příklad 2

Syntetické ligandy RAR

Způsoby přípravy a struktury RAR α/βselektivních agonistů a RAR použitých v těchto pokusech jsou znázorněné na obr.l. Syntézy dihydronaftalenylovových sloučenin vzorce (la), vzorce (lb) a vzorce (III) zahrnují kondenzaci žádoucích enol-triflátů (la) nebo (lb) s různými acetyleny způsobem podle Sonogashira. Sloučeniny (2a) a (2b) se připraví v přítomnosti 3,3-dimethylbutynu, diisopropylaminu, jodidu měďného a bis(trifenylfosfin)palladium(II)chloridu. Podobně se použije 3,3-dimethyl-pent-l-yn (Van Boom a sp.,

Rec.Trav.Chim., 1965, 84:31) k přípravě sloučeniny (2c).

Trojná vazba ve sloučeninách vzorců (2a) a (2c) se hydrogenuje s použitím 10% palladia na síranu barnatém a následným zmýdelněním methylesterové skupiny se získají požadované cis-ethylenové deriváty vzorců (la) a (lb). Podobně se zmýdelněním acetylenu (2b) připraví panagonista vzorce (III).

RAR panantagonista vzorce (II), 4-(5,6-dihydroxy-5,5-dimethyl-6-oxo-8-(3-methylfenyl)anthracen-2-yl)benzoová kyselina se připraví způsobem znázorněným na obr.2 a popsaným níže.

Methyl-4-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-6-oxo-8-(3-methylfenyl)anthracen-2-yl)benzoát

Míchaný roztok methyl-4-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylfenyl)anthracen-2-yl)benzoátu (0,181 g, 0,418 mmol) v dioxanu (6 ml) se zpracuje s oxidem seleničitým (0,186 g, l, 672 mmol) a směs se zahřívá při teplotě zpětného toku 5 hodin. Pak se reakční směs zředí ethyl-acetátem a promyje se solným roztokem, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se. Přečištěním zbytku chromatografií na silikagelu se získá titulní sloučenina (0,155 g, 83 %).

¹H NMR 400 MHz C6Ds ⁵ ppm: 1,69 (6H, s, 2X-CHJ, 2,14 (3H, S, -CH3), 6,38 (IH, S, H-7’), 7,03-7,19 (3H, m, aromatický Η), 7,33 (2H, J=8,4 Hz, H-3 a H-5), 7,48-7,49 (2H, m, aromatický Η), 7,59 (IH, d, J=9,l Hz, aromatický Η), 7,78 (IH, s, aromatický Η), 7,89 (IH, s, aromatický Η), 8,24 (2H, d, J=8,4 Hz, H-2 a H-6).

4-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-5-oxo-8-(3-methylfenyl)anthracen-2-yl)benzoová kyselina

Míchaný roztok methyl-4-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-6-oxo-8-(3-methylfenyl)anthracen-2-yl)benzoátu (0,015 g, 0,034 mmol) v ethanolu (2 ml) a tetrahydrofuranu (2 ml) se zpracuje s vodným roztokem hydroxidu sodného (5 mol/1, 0,5 ml) a směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. Pak se rozpouštědla odpaří a zbytek se zředí ethyl-acetátem (4 ml) a okyselí se vodnou kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/1. Organická vrstva se promyje solným roztokem a vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se.

NMR 400 MHz DMSO-d₆δ ppm: 1,59 (6H, s, 2x -CHJ, 2,43 ·· 9 9 9 ·· · 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 99 9

99 9 9999

99999 9 9999 9

9999 9 9 9 9 9 9 • 9 99 999 9999 9· 99 (3Η, s, -CH₃), 6,12 (1H, s, H-7'), 7,35-7,39, 7,46-7,50 <3H a

1H, 3 sady m, aromatických Η), 7,91 (1H, s, aromatický Η),

7,96-8,04 (5H, m, aromatický Η), 8,09 (1H, d, J=8,6 Hz, aromatický Η), 8,25 a 8,34 (1H a 1H, 2s, aromatický H).

Příklad 3

Stanoveni mitogenních účinků

Proliferace buněk se kvantifikuje inkorporací [³H]thymidinu. Buňky se nanesenou do 96jamkových destiček v médiu obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a ponechají se přes noc adherovat. Následující den se médium odstraní a do čerstvého média doplněného 10 % FBS přečištěného na aktivním uhlí (HyClone) se přidá hodnocená sloučenina. Po třech dnech expozice se médium obsahující sloučeninu obnoví.

Po 6 dnech zkoušky se do každé jamky vnese na 2 až 4 hodiny po 4 μ-Ci/ml [³H]thymidinu (NEN Life Science Products). Pak se provede trypsinizace buněk a buňky se oddělí na filtrech ze skleněných vláken GF/B. [³H]thymidin včleněný do DNA se stanoví na scintilačním počítači částic Topcount (Packard). Výsledky se vyjádří v procentech inhibice ve srovnání s vehikulem kterým je DMSO. Hodnota IC_so je definovaná jako koncentrace sloučeniny indukující 50% inhibici a účinnost odpovídá maximální inhibici získané uvedenou sloučeninou ve srovnání s DMSO. Výsledky jsou průměrem ze 2 až 5 nezávislých pokusů.

Příklad 4

Stanovení tvorby kolonií závislé na ukotvení

Ke stanovení účinků RAR agonistů na velikost kolonií závislých na ukotvení a na počet a morfologii se MCF7 buňky v DMEM doplněném 10 % FBS nanesou na 6jamkové destičky • φ • φ (500 buněk/jamka) a kultivují se 5 dní. Pak se médium odstraní a do média doplněného 5 % FBS přečištěného na aktivním uhlí (HyClone) se přidá hodnocená sloučenina. Médium obsahující sloučeninu se obnoví po 3 dnech a kultury se nechají růst další 3 dny. Po 6 dnech expozice hodnoceným sloučeninám se kolonie vybarví krystalovou violetí. Pak se kolonie vyhodnotí z hlediska jejich počtu a plochy a vyfotografují se ve světelném mikroskopu k vyhodnocení účinků sloučenin na velikost kolonií a morfologii. Výsledky představují reprezentativní hodnoty ze dvou nezávislých pokusů. Pak se připraví MCF-7 buněčné lyzáty pro Western imunoblotting způsoby popsanými autory Sambrook a sp. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2.vydání; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Buněčné lyzáty se připraví přídavkem 200 ,μΐ pufru pro lýzu (Tris-HCl, pH 6,8, 20 mM, EDTA 1 mM, NP-40 0,5 %) obsahujícího směs s inhibitorem proteasi (Roche) do každé jamky 6jamkových destiček. Pak se lyzáty vyčeří odstředěním při 10 000 ot/min, 4EC po dobu 5 minut, superantanty se doplní na potřebný objem Laemmliho pufrem pro vzorky a zpracují se elektroforézou na 10 nebo 15% SDS-pólyakrylamidovém gelu (PAGE) načež se převedou na nitrocelulosové membrány (Biorad). Membrány se zpracují standardními způsoby a inkubují se s primárními protilátkami 1 hodinu při teplotě místnosti nebo přes noc při 4EC. Navázaná protilátka se vizualizuje pomocí sekundární protilátky, kozí anti-IgG konjugované na HRP a pomocí chemiluminiscenčního detekčního systému (EC1, Amersham Pharmacia Biotech).

Příklad 5

Stanovení polymerace tubulinu

Účinky expozice retinoidu a paklitaxelu na hladiny volného a polymerovaného tubulinu se stanoví způsoby popsanými

9999

v práci autorů Giannakakou a sp. (J.Biol.Chem., 1997,

272117118-17125). MCF buňky se nanesou v DMEM doplněném 10 % FBS na 6jamkové destičky a ponechají se přes noc adherovat. Následující den se buněčné médium odstraní a do čerstvého média doplněného 5 % FBS přečištěného na aktivním uhlí (HyClone) se přidá hodnocená sloučenina. Buňky se nechají 3 dny kultivovat v přítomnosti retinoidů a pak se na 1 hodinu přidá paklitaxel. Rozpustný a polymerovaný tubulin se extrahují a příslušné hladiny se stanoví metodou Western blotting jak je popsané výše s použitím anti-ot-tubulinových protilátek (n=2).

Příklad 6

API reportérovy test

API transkripční aktivita se stanoví na MCF7 buňkách stabilně transfektovaných (API)5x-tk-Luc reportérovým genem (IGMC, Francie). (APl)5x odpovídá responsnímu elementu kolagenasového genu 5krát tandémově opakovanému, tk je minimální promotor thymidinkinasy, a Luc je kódující sekvence luciferasového genu. MCF7 buňky se nanesou na 12jamkové destičky v hustotě 400 000 buněk na jamku v DMEM doplněném 10 % FBS a ponechají se přes noc adherovat. Další den se médium odstraní, buňky se promyjí PBS a opatří se DMEM médiem obsahujícím 0,5 % FBS přečištěného na aktivním uhlí (Hyclone). Za dvacetčtyři hodiny se buňky podrobí šestihodinovému ošetření s PMA (10 nM) v nepřítomnosti nebo v přítomnosti ATRA, sloučeniny vzorce la nebo RAR panagonisty vzorce (III) (v koncentracích v rozmezí 0,1, 1 a 50 nM) s paklitaxelem nebo bez paklitaxelu (ΐμΜ). Aktivita luciferasy se měří systémem Luc-lite firmy Packard způsobem doporučeným výrobcem. Výsledky se vyjádří v procentech aktivity ve srovnání s aktivitou samotného PMA (10 nM), • ·

která se pokládá za 100% aktivitu. Uvedené výsledky jsou vyjádřené průměrem ± sem (standardní chyba průměru) ze 3 nezávislých pokusů.

Příklad 7

Stanovení aktivity Jun N-terminální kinasy

Aktivita JNK se měří způsoby popsanými autory Coso asp.

(Cell 1995, 81:1137-1146) s menšími modifikacemi. Buňky MCF-7 se nanesou v DMEM doplněném 10 % FBS do 6jamkových destiček a nechají se přes noc adherovat. Následující den se médium nahradí DMEM doplněným 0,5 % FBS přečištěného na aktivním uhlí (HyClone) a 24 hodin předtím než se buňky inkubují další 2 až 3 hodiny v přítomnosti 0,1 μ M paklitaxelu se přidá 100 nM indikovaných retinoidů nebo 0,1 % DMSO. Z každé jamky se připraví způsobem popsaným výše lyzát který se vyčeří odstředěním. Z každého lyzátu se JNK imunologicky vysráži inkubací přes noc při 4 °C s 1 Pg anti-hJNK (Pharmingen) a 25 μΐ protein G agarosových perliček (Gibco-BRL) předem promytých pufrem pro lýzu. Imunokomplexy se odstředěním po 2 minuty při 10 000 ot/min a 4 °C oddělí do pelet a pelety se promyjí třikrát PBS obsahujícím 1 % NP40 a 2 mM Na₃V0₄, jednou 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM LiCl a jednou pufrem pro reakci s kinasou (KRB: 12,5 mM MOPS pH 7,5, 12,5 mM β-glycerolfosfát,

7,5 mM MgCl₂, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM NaF, 0,5 mM Na₃V0J .

Stanovení aktivity kinasy se provede při 30 °C v průběhu 30 minut resuspendováním perliček v 30 ul KRB obsahujícím 5 pCi [gama-³³P]ATP (NEN Life Science Products), 10 μΜ neaktivního ATP3,3 mM DTT a 2 pjg GST-c-JUN(1-169) fúzního proteinu. Reakce

I kinasy se ukončí přídavkem Laemmliho pufru pro vzorek (ίο μΐ) , vzorek se rozdělí elektroforézou na 10% SDS-PAGE a fosforylovaný GST-c-Jun se vizualizuje autoradiografii a kvantifikuje se densitometricky. Výsledky se uvedou ve formě průměru ± sem

0 0 0 ze třech nezávislých pokusů • 0 0 0 • 0 0 0 .

0 00

0 0 0 0

0 0 0

0 0 0 • 0 0 00 0

0 · · · · 0 • 0 0 0 0 0 · 0 0 0 00 · · 00000 0 ·· 0 0 0 · 0 0 ·· 0« 000 0000

Claims (20)

1. Způsob léčeni rakoviny pacienta vyznačující se tím, že pacientovi kterého je potřebné léčit se podává:

a) vybraný cytotoxický prostředek; a

b) RARct/β selektivní agonista nebo RAR panantagonista.

2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je prostředek polymeruj ící tubulin.

3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je taxan.

4. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je paklitaxel.

5. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený RARft/β selektivní agonista nebo RAR panantagonista se pacientovi podává před podáním vybraného cytotoxického prostředku nebo současně s vybraným cytotoxickým prostředkem.

6. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že zahrnuje podávání:

a) vybraného cytotoxického prostředku který zvyšuje fosforylaci Bcl-2; a

b) RARoc/β selektivního agonisty.

• · • ·

7. Způsob podle nároku Ivyznačující setím, že uvedený RAR ot/β selektivní agonista se zvolí ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce (Ia) a sloučeninu vzorce (lb) a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

8. Způsob podle nároku Ivyznačující se tím, že uvedený RAR panantagonista se zvolí ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce (II) a její farmaceuticky přijatelné sole.

9. Způsob snižování účinné dávky vybraného cytotoxického prostředku potřebné k indukci cytotoxicity v tumorových buňkách vyznačuj ící se tím, že buňkám se podává:

a) vybraný cytotoxický prostředek; a

b) RAR α/β ϊselektivní agonista nebo RAR panantagonista.

10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je prostředek polymerující tubulin.

11. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je taxan.

12. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je paklitaxel.

13. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedený RAR α/β selektivní agonista se zvolí ze skupiny zahrnující sloučeninu vzorce (Ia) a sloučeninu vzorce (lb) a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

14. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že uvedený RAR panantagonista se zvolí ze skupiny zahrnujlei sloučeninu vzorce (II) a její farmaceuticky přijatelné sole.

15. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že zahrnuje podávání:

a) vybraného cytotoxického prostředku který zvyšuje fosforylaci Bcl-2; a

b) RAR α/β selektivního agonisty.

16. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje:

a) vybraný cytotoxický prostředek; a

b) RAR α/β selektivního agonistů nebo RAR panantagonistu.

17. Farmaceutická kompozice podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je prostředek polymerující tubulin.

18. Farmaceutická kompozice podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený vybraný cytotoxický prostředek je taxan.

19. Farmaceutická kompozice podle nároku 16 vyznačující se tím, že obsahuje:

a) vybraný cytotoxický prostředek který zvyšuje fosforylaci Bcl-2; a ····

b) RAR oc/βselektivního agonistů.

20. Sloučenina vzorce (II) nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.