CZ20032665A3 - Způsob detekce molekul nukleové kyseliny - Google Patents

Způsob detekce molekul nukleové kyseliny Download PDF

Info

Publication number
CZ20032665A3
CZ20032665A3 CZ20032665A CZ20032665A CZ20032665A3 CZ 20032665 A3 CZ20032665 A3 CZ 20032665A3 CZ 20032665 A CZ20032665 A CZ 20032665A CZ 20032665 A CZ20032665 A CZ 20032665A CZ 20032665 A3 CZ20032665 A3 CZ 20032665A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
probes
hybridization
nucleic acid
acid molecules
detection
Prior art date
Application number
CZ20032665A
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Schmidt
Axel Mündlein
Martin Huber
Hans Kroath
Original Assignee
Austrian Research Centers Gmbh - Arc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Austrian Research Centers Gmbh - Arc filed Critical Austrian Research Centers Gmbh - Arc
Publication of CZ20032665A3 publication Critical patent/CZ20032665A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Způsob detekce molekul nukleové kyseliny
Oblast techniky
Předmětné řešení se týká způsobu současné detekce přinejmenším dvou od sebe se lišících molekul kyseliny nukleové ve vzorku, přičemž v prvním kroku se provede vícenásobná polymerázová řetězová reakce (multiplex-PCR). a ve druhém kroku se provede hybridizační reakce imobilizovanou sondou na mikrosadě, čímž se detekují x hybridizované produkty PCR a popřípadě se kvantifikují jakož i mikrosada a set pro hybridižaci produktů vícenásobné PCR a ϊ kit pro současnou detekci přinejmenším dvou od sebe se lišících molekul kyseliny nukleové ve vzorku.
Dosavadní stav techniky
Detekce molekul nukleových kyselin ve vzorku se provádí v různých oblastech, například v medicíně, při kontrolách kvality, ve výzkumu atd. Přitom je často nutné, detekovat ve vzorku přinejmenším dvě od sebe se lišící molekuly kyseliny
V nukleové, často 20, 50, 100 nebo více. Přitom je(časových a ekonomických důvodů žádoucí, detekovat ve vzorku současně různé molekuly kyseliny nukleové. Řada prací se týká detekce molekul nukleových kyselin a uvádějí se zde různé způsoby . _ provádění detekce:
V US 5 994 066 se popisuje způsob detekování bakterií příp. rezistence vůči antibiotikům v biologických vzorcích. Podle prvního způsobu se provádí vícenásobná PCR pro současnou detekci více rezistencí vůči antibiotikům. Jako příklady pro detekci amplifikovaných produktů se uvádějí agarová gelová elektroforéza, fluorescenční polarizace a detekce pomocí fluorescenčního označování. Jako další, druhý způsob detekce zkoumaných sekvencí ve vzorku se popisuje způsob hybridizace, při kterém se hybridizace provádí při 65 °C a hybridizace vzorku se specifickou cílovou DNA udává vysoký rozsah shody mezi oběmi nukleotidovými sekvencemi.
V US 6 045996 se popisuje způsob hybridizace nukleotidové sekvence na mikrosadě. Jako hybridizační teploty.se udávají teploty mezi 20 a 75 °C. Jako příklad cílového nukleotidu se uvádějí amplifikované produkty vícenásobné PCR.
Podle US 5 614 388 se amplifikují specifické nukleotidové sekvence pomocí PCR, načež se hybridizací detekují produkty amplifikace. Detekci lze přitom specificky provádět nastavením přísných podmínek. Jako přísné podmínky hybridizace se udávají teploty, které dovolují specifickou hybridizací. Jako příklad teplot hybridizace se uvádí 50 až 55 °C.
US 5 846 783 se týká způsobu detekce nukleotidových sekvencí, přičemž se po vícenásobné PCR provede detekce pomocí hybridizace. Například se hybridizace provádí při teplotě 55 °C.
WO 98/48041 A2 se týká způsobu identifikace kmenů bakterií resistentních vůči antibiotikům, přičemž se geny amplifikují PCR a detekují se hybridizační sondou. Přitom se má hybridizace provádět za přísných podmínek, asi 20 °C pod teplotou tání hybridizované DNA. Oligonukleotidy se s výhodou volí tak, že mají podobné teploty tání a tudíž lze testovat více genů v té samé hybridizační várce za těch samých podmínek. Jako příklad se dále popisuje hybridizace na oligonukleotidové mikrosadě. Jako hybridizační teplota se udává teplota 45 až 60 °C.
Tyto výše uvedené způsoby mají však všechny nevýhodu, že hranice co se týká specifity a maximálního počtu současně detekovaných molekul nukleové kyseliny jsou ustálené (dány). U některých těchto způsobů se provádí v prvním kroku vícenásobná PCR, čímž se zaručuje současná amplifikace více nukleotidových sekvencí. Následná detekce různých nukleotidových sekvencí je však problematická, jelikož podle • 4 β 444444 44 44 44 · těchto způsobů není možné specificky detekovat současně větší počty nukleotidových sekvencí. Provádí-li se po PCR hybridizační reakce, musejí být nastaveny pro každou nukleotidovou sekvenci specifické přísné podmínky hybridizace, přičemž pro kratší sekvence se nastaví nižší teploty než pro delší sekvence, viz. Např. US 6 045 996, čímž se však snižuje možný počet současně detekovatelných nukleotidových sekvencí. V WO 98/48041 A2 se například navrhuje volit oligonukleotidy, které mají podobnou teplotu tání tak, že lze testovat více genů v té samé hybridizační várce, přičemž se však testuje maximálně osm oligonukleotidů v jedné sadě.
Tyto způsoby se tak nehodí pro provádění způsobů detekce více příp. mnoha molekul nukleových kyselin, například k detekci resistence vůči antibiotikům. Pro takové způsoby detekce není způsob, který je omezen na současnou detekci pouze několika málo oligonukleotidů, dostatečný pro praxi, zvláště pro testy čistoty, a je příliš náročný pracovně a časově.
Úlohou tohoto vynálezu je tudíž, dát k dispozici způsob, při kterém lze současně detekovat velký počet molekul nukleové kyseliny, tak že důkaz určitých oligonukleotidů příp. genů je proveditelný v jednom vzorku rychle, za příznivou cenu a s malým nákladem na práci.
Podstata vynálezu
Na začátku uvedený způsob tohoto vynálezu se vyznačuje tím, že sondy, které hybridizují specificky každou molekulu nukleové kyseliny od sebe se lišící, použité při hybridizační reakci, mají teploty tání (Tm) , které se od sebe liší maximálně o 2 °C, výhodně maximálně o 1 °C. Tím, že teploty tání sond použitých při hybridizační reakci se od sebe liší maximálně o 2 °C, výhodně o 1 °C je poprvé možné současně detekovat velký počet molekul nukleové kyseliny ve • · · ···· ·'· ·· • · · · · ··· · · ··· · ··· · · · · · • · · · · · vzorku, jelikož se nastavují pro všechny sondy při hybridizační reakci ty samé podmínky co se týká teplot, ale také koncentrace solí, hodnot pH atd. Teplota tání Tm se definuje jako každá teplota, při které (za daných parametrů jako např. koncentrace solí) se polovina všech molekul nachází ve stavu helixu.
Je možné připravit téměř všechny sekvence molekul nukleové kyseliny s určitou teplotou tání:
Jedna možnost je odhadnout (spočítat) teplotu tání sekvence pomocí komerčního softwaru „Gene Runner 3.0 (© 1994, Hastings Software, lne.). Software dovoluje určení teplot Tm pomocí různých metod/algoritmů.
Údaje v této patentové přihlášce jsou hodnoty tzv. „Nearestneighbor thermodynamic melting temperature metody dle Breslauera a spol. (Proč. Nati. Acad. Sciencies 83:37463750, Predicting DNA dupley stability from the base sequence). Parametry pro přepočet (odhad) mohou být například 660 mM pro koncentraci solí a 7,5 pM pro koncentraci vzorku. Pro zprostředkování teplot Tm více sond pro současný hybridizační experiment nejsou absolutní hodnoty (které mohou být v závislosti na koncentraci soli a DNA vyšší nebo nižší) směrodatné, nýbrž zvolená metoda (tj. pro sondy mezi 15 a 33 basemi délky „termodynamická) a hodnoty pro teploty Tm jednotlivých sond jsou ve vztahu (poměru) jedna k druhé. Tímto způsobem lze vypočítat a zvolit k testované molekule nukleové kyseliny příp. genu hybridizující sekvenci „hybridizační sekvenci, tak že k tomu lze připravit specifické sondy.
V rámci tohoto vynálezu se rozumí pod pojmem molekuly nukleové kyseliny úseky sekvence, kterými jsou například určité geny, části genů nebo genomů, mRNA nebo části mRNA atp.
Pod pojmem „vícenásobná PCR se rozumí v rámci tohoto vynálezu PCR, při které se současně amplifikují přinejmenším • · dvě od sebe odlišné molekuly kyseliny nukleové, tj. že při jedné reakci pomocí různých primer se současně amplifikují různé druhy sekvencí.
Pod pojmem „mikrosada se rozumí nosič, na kterém jsou ve vysoké hustotě imobilizovány velké počty sond, tak že lze za těch samých podmínek současně hybridizovat velký počet molekul nukleové kyseliny. Mikrosady se používají běžně k detekci molekul DNA, jsou to však již mikrosady pro použití k důkazu peptidů. Pomocí mikrosad se v podstatě zjednodušila diagnosa DNA in vitro, tak že komplexní zkoumání lze provádět velmi rychle v jediném pracovním kroku, jelikož více než tisíc specificky vytvořených oligonukleotidů lze imobilizovat na relativně malé mikrosadě. Hybridizace na mikrosadě zaručuje například současné zkoumání mnoha tisíců genů. Používá se již řada různých mikrosad pro detekci nukleotidových sekvencí, přičemž odborník může volit různé parametry v širokém rozmezí (viz. například Lockhart et. AI., Nátuře Biotechnology Vol. 14, prosinec 1996, strany 1675-1679).
V rámci tohoto vynálezu lze přizpůsobit a měnit např. materiál, velikost, strukturu, atd. mikrosad samozřejmě co se týká počtu na nich imobilizovaných sond, délku a sekvenci.
Je možné na jedné straně detekovat pouze molekuly nukleové kyseliny, tj. zkoumat, zda jsou ve vzorku přítomny, přičemž tato zkoumání poskytují výsledek ANO/NE. Podle vynálezu je také možné kvantifikovat množství molekul nukleové kyseliny ve vzorku, přičemž toto lze provádět vysoce specificky na základě použití mikrosady. Přitom lze použít každý způsob detekce, který je odborníkovi,znám, například mohou být použity způsoby chemické, enzymatické, fyzikálně-chemické nebo způsob vazby antigen-protilátka. Přitom lze nukleové kyseliny k detekci označit, například radioaktivní, fluorescenční nebo chemiluminiscenční molekulou. Tyto • · · fc • fcfc • · · · · způsoby detekce jsou odborníkovi velmi dobře známy, tak že se zde jimi blíže nezabýváme, přičemž volba každého způsobu molekul nukleové kyseliny pro detekci závisí na tom, zda má být produkt podroben pouze detekci nebo kvantifikaci. Příprava sond se provádí o sobě známými způsoby.
Vždy méně se od sebe liší teploty tání sond tím, aby se mohly specifičtěji detekovat molekuly nukleové kyseliny, jelikož tím lze nastavit podmínky hybridizace, které pouze zajišťují velmi specifickou hybridizaci, ne však hybridizaci ne zcela komplementárních sekvencí, čímž se sníží příp. zcela vyloučí nebezpečí falešně pozitivních, ale také falešně negativních výsledků.
Primery a sondy mohou být přitom voleny tak, že se amplifikují molekuly nukleové kyseliny, které mají delší sekvence než hybridizační sekvence, tj. ty sekvence, které se hybridizují sondami. Může se však také amplifikovat pouze hybridizační sekvence , tj. že molekuly nukleové kyseliny se skládají jen ze sekvence, se kterou se hybridizují odpovídající sondy.
S výhodou se detekuje podle vynálezu najednou přinejmenším 6, výhodně přinejmenším 8, zvláště výhodně přinejmenším 12 od sebe odlišných molekul nukleové kyseliny v jednom vzorku. Počet od sebe odlišných molekul nukleové kyseliny, který se detekuje ve vzorku, závisí pokaždé na specifickém případě, přičemž jak je zde výše nejsou vlastně žádné hranice.
Zvláště výhodně se detekují molekuly kyseliny nukleové, které jsou obsaženy v genech resistentních vůči antibiotikům. Je známý velký počet genů resistentních vůči antibiotikům, přičemž metody detekce se provádějí zpravidla zdlouhavými a k chybám náchylnými mikrobiologickými kultivačními testy na kultivačních médiích s obsahem antibiotik a následným stanovením schopnosti přežití zárodku. Ačkoliv jsou již popsány způsoby identifikace resistence vůči antibiotikům pomocí genové amplifikace a • · · · následné hybridizace (viz. např. WO 98/48041 A2) , nebylo možné testovat vzorky na více genů resistentních vůči antibiotikům současně bez snížení specifity. Pomocí způsobu podle vynálezu je to možné detekovat neomezený počet genů resistentních vůči antibiotikům v jednom vzorku, což je důležité obzvláště v nemocnicích, jelikož zde dochází k hromadění bakteriálních kmenů resistentních vůči antibiotikům. Všechny standardní metody isolace DNA jsou funkční. V každém případě by se mělo zajistit, aby se menší molekuly (jako např. plasmidy) ko-purifikovaly, aby se neztrácely episomálně kódované resistence.
Jako molekuly nukleové kyseliny se přitom volí části sekvencí genů resistentních vůči antibiotikům, které jsou specifické pro každý gen a nevznikají v jiných genech. Tímto způsobem lze falešně positivní výsledky testů ještě lépe odstranit.
Přitom jsou geny resistentni vůči antibiotikům s výhodou zvoleny ze skupiny sestávající z genů pro beta-Laktamasu blaZ, chloramphenicol acetyltransferasu, fosB protein, adenin methylasu ermC, aacA-aphD aminoglykosidová resistence, 3'5'-aminoglykosid fosfotransferasa aphA-3, mecR,pěnicillin vazebný-protein PBP2', aminoglykosid-3'adenyltransferasu aadA, tetracyklin resistentni protein tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala .ligasu vanB. U těchto často se vyskytující resistence vůči antibiotikům, která způsobuje medicínsky velké těžkosti, a je tedy zvláště důležité pro tyto resistence vůči antibiotikům dát k dispozici rychlý a vysoce specifický způsob testování. Přitom je zvláště příznivé, když se tyto uvedené resistence vůči antibiotikům testují současně v jednom vzorku, tj. že molekuly kyseliny nukleové, které jsou pokaždé specifické pro každý tento gen resistence vůči antibiotikům, se současně amplifikují vícenásobnou PCR a hned potom se sondou hybridizují na mikrosadě, přičemž pokaždé je přinejmenším jedna sonda • ···· ·· ·· ·· · • · · · 9 · · 9 9 ···· · · · ·· · ··· • ··· ·· 9 9 · · 9··· • ········ g ........ ·· specifická pro jednu molekulu nukledvé kyseliny a tím pro jeden gen resistence vůči antibiotikům.
Přitom je zvláště výhodné, když se hybridizační reakce provádí při 30-80 °C, s výhodou při 40-70 °C, zvláště s výhodou při 55-60 °C. Nastavená teplota hybridizace je závislá na teplotě tání sond a lze ji podle vynálezu vypočítat a nastavit pro každou hybridizační reakci, přičemž je zvláště důležité, aby se teplota během hybridizační reakce udržovala konstantní. Ukázalo se, že pro tento způsob je zvláště výhodné nastavit teplotu v rozmezí 55 a 65 °C, jelikož v tomto teplotním rozmezí mají sondy teploty tání, které se pro tento způsob zvláště dobře hodí, obzvláště co se týká specifity a délky.
Pro zvláště přesnou detekci je výhodné, když se hybridizační reakce provádí za vysoce přísných podmínek. To znamená, že se nastaví hybridizační podmínky, které zaručují hybridizaci vysoce komplementárních sekvencí, ne však sekvencí, které se odlišují v několika málo nukleotidech. Přitom je zvláště výhodné, když se podmínky hybridizace zvolí, při kterých se tvoří jen zcela k sobě komplementární sekvence, ne však sekvence, které se odlišují od sebe pouze v jednom jediném nukleotidu. Tímto způsobem se dává k dispozici způsob, který zaručuje vysoce specifickou detekci molekul nukleové kyseliny ve vzorku a nevede k žádným falešně positivním výsledkům. Vysoce přísné podmínky se nastaví volbou teploty a iontové síly reakční směsi. Například se nastaví teplota hybridizace na 5 až 10 °C pod teplotu tání sond; pufr/y se volí podle požadované iontové síly příp. hodnoty pH v závislosti na teplotě hybridizace.
S výhodou se provádí vícenásobná PCR primer, které jsou označeny. Tím se zaručí, že amplifikované produkty PCR mají označení, které lzé po hybridizační reakci detekovat. Označení může přitom, jak je popsáno výše, být v molekule, může být chemicky, fyzikálně-chemicky nebo enzymaticky
V • · ·
9 9 9« 9 9 detekovatelný signál, který například může být stanoven a kvantifikován barevnou reakcí měřením fluorescence, luminiscence, radioaktivity atp.
Pro zvláště specifický způsob je přitom výhodné, když se hybridizační reakce provádí po dělení „+- a „-„-řetězce (vlákna). Tím se zabrání, aby řetězce, které mají identickou sekvenci se sondami, se s těmito sondami vázaly kompetitivním způsobem na jednotlivé molekuly řetězce pro detekci, což by mohlo vést obzvláště při kvantitativních detekcích ke zkresleným výsledkům. Dělením „+- a jednotlivých řetězců jsou přítomny v hybridizační směsi pouze jednotlivé řetězce komplementární k sondám.
Přitom je zvláště výhodné, když „+-jednotlivé řetězce, které mají se sondami identické sekvence, se po vícenásobné PCR oddělí. Tím zůstávají „-„-jednotlivé řetězce, které mají sekvence komplementární k sondám, v hybridizační směsi, tak že lze hned potom provádět hybridizační reakce.
Zvláště výhodný způsob oddělování se vyznačuje tím, že se použijí primery pro elongaci „+-jednotlivého řetězce, které, s výhodou na jejich 5'-terminálním konci, jsou navázány pokaždé na látce, obzvláště výhodně molekule biotinu, která zaručuje oddělení jednotlivého řetězce.
Tím lze již v kroku amplifikace PCR měnit „+-jednotlivé řetězce, tak že je zaručeno jejich úplné specifické oddělení, aniž by se musely do způsobu zabudovat dodatečně mezikroky. Tím se vyloučí nebezpečí, že se také oddělí jednotlivé řetězce. Biotin sena to hodí zvláště dobře, jelikož se lehce navazuje na sekvenci DNA a lze může být specificky oddělen.
K tomu je zvláště vhodné, když se molekuly biotinu naváží na primery pro elongaci „+-jednotlivých řetězců, přičemž se po vícenásobné PCR „+-jednotlivé řetězce oddělí pomocí streptavidinu navázaného na kuličky. Kuličkami se dosáhne, že se vnesou velké plochy streptavidinu do vzorku, čímž se
• · ···· ·· 99 .··. · «· · 9 · · 9 · · • · 9 9 · 9999
9 ·
9· · molekuly biotinu zcela naváží na streptavidin. Dále je použitím kuliček zaručeno, že se sloučenina streptavidinbiotin ze vzorku opět oddělí. K tomu použité kuličky jsou sami o sobě známé a mohou být vyrobeny například ze skla příp. s magnetickým jádrem.
S výhodou se po kroku hybridizace zařadí krok čištění. Tím se látky, které by mohly možným způsobem narušovat hybridizaci, odstraní z hybridizační směsi, přičemž krok čištění lze provádět během nebo po oddělení jednotlivých řetězců. Čištění lze provádět například srážením DNA a zpětným pohlcením DNA v pufru.
Podle dalšího aspektu se tento vynález týká mikrosady pro hybridizaci produktů vícenásobné PCR podle jednoho z výše popsaných způsobů podle vynálezu, přičemž alespoň dvě, s výhodou alespoň šest, zvláště výhodně alespoň dvanáct sond, které se pokaždé specificky hybridizují s od sebe se lišícími molekulami kyseliny nukleové pro detekci, na jejich povrchu jsou navázány a mají teploty tání, které se od sebe liší o maximálně 2 °C, s výhodou o maximálně 1 °C. Co se týká mikrosady a sond platí opět definice uvedené již výše pro způsob. Při tom opět závisí počet sond navázaných na mikrosadu na počtu molekul kyseliny nukleové pro detekci, přičemž samozřejmě mohou být též navázány na mikrosadě jako negativní test dodatečné sondy, které se nehybridizuji s molekulami kyseliny nukleové pro detekci. Důležité je, jak se popisuje již výše, že se teploty tání sond liší od sebe pouze o maximálně 2 °C, s výhodou o 1 °C, přičemž je zaručeno, že lze nastavit podmínky hybridizační reakce, při kterých všechny molekuly kyseliny nukleové, které mají sekvenci, která je komplementární k sondám, se hybridizují hned specificky a pevně se sondami.
Výhodně jsou sondy v bodech s průměrem 100 až 500 pm, zvláště výhodně 240 pm, navázány na povrchu mikrosondy. Ukázalo se, že body s tímto průměrem jsou zvláště vhodné pro ···· ·· ·· ·* · • · · · · * · • · · · · · ·· · · · · ·· · · · ····>
• ···· · · · ·· · ·· ·· ·® · výše popsaný způsob podle vynálezu, přičemž detekce následující hned po hybridizační reakci poskytuje obzvláště jasné a neomylné výsledky. Přitom má pokaždé bod povahu sondy, tj. sondy se stejnou sekvenci. Samozřejmě je také možné použit více bodů se stejnou povahou sondy na mikrosadě jako paralelní pokusy.
Dále je výhodné, když body mají od sebe odstup 100 až 500 jim, výhodně 200 až 300 pm, zvláště výhodně 280 pm. Tímto způsobem je zaručeno, že se požije maximální počet bodů na mikrosadě, přičemž lze současně v každém případě jednoznačně rozlišit mezi různými body a tím sondami a navázanými molekulami nukleové kyseliny pro detekci ve způsobu detekce. S výhodou je mikrosada vyrobena ze skla, syntetického materiálu příp. membrány. Tyto materiály se ukázaly jako zvláště vhodné pro mikrosady. ,
Zvláště výhodné je když jsou sondy kovalentně navázány na povrchu mikrosady. Tím je zaručená pevná vazba sond na mikrosadu, ani by docházelo v průběhu kroku hybridizace a kroku promývání k rozpouštění vazby sondy-mikrosada a tím ke zkresleným výsledkům. Je-li mikrosada vyrobena například z potahovaného skla, mohou reagovat primární aminoskupiny s volnými aldehydickými skupinami skleněného povrchu za vytvoření Schiffovy báze.
Jako výhodné se ukázalo, když sondy mají hybridizační sekvenci zahrnující 15 až 25, s výhodou 20 nukleotidů. Pod pojmem hybridizační sekvence, jak se popisuje již výše, se rozumí sekvence, se kterou se hybridizují molekuly nukleové kyseliny pro detekci. Samozřejmě mohou být sondy v delším provedení než hybridizační sekvence, přičemž však s rostoucí dodatečnou délkou sond může docházet k nežádoucím vazbám s jinými molekulami nukleové kyseliny, což by mohlo zkreslit výsledky. Proto je výhodné, když sondy - vedle částí, které jsou potřebné pro vazbu na povrchu mikrosady - se skládají pouze z hybridizačních sekvencí. Délka 15 až 25, s výhodou »4·· »
ř··
44 • · · _
4 4 44 • 4 4 « • 4 4 «
4 4' 4 4
4' 4 4 4 « nukleotidů se přitom ukázala jako příznivá, jelikož je v této oblasti délek možné najít hybridizační sekvence výše popsaným způsobem, které mají potřebné teploty tání. Tyto délky jsou dostatečné, aby umožnily specifickou vazbu a aby vyloučily nebezpečí, že také jiné molekuly DNA mají náhodou ty samé sekvence, jako molekuly kyseliny nukleové pro detekci.
S výhodou mají sondy na jejich konci 5'pokaždé sekvenci dT10, přes kterou se mohou navázat na mikrosadu. Tím je odstup mezi mikrosadou a hybridizační sekvencí dostatečný, tak že je bez zábran přístupná pro molekuly kyseliny nukleové. Počet Tm činí například pět až patnáct, výhodně deset.
Pro současnou detekci genů rezistentních vůči antibiotikům je výhodné, když sondy mají jako hybridizační sekvenci sekvenci, která se zvolí ze skupiny sestávající z č. 25, č. 26, č. 27, č. 28, č. 29, č. 30, č. 31, č. 32, č. 33, č. 34, č. 35 a č. 36. Tyto sekvence se vyskytují v genech resistentních vůči antibiotikům, které často vznikají zvláště v kmenech bakterií a jsou z medicínského hlediska důležité. To jsou geny resistentní vůči antibiotikům pro beta-laktamasu blaZ, chloramphenicol acetyltransferasu, fosB protein, adenin methylasu ermC, aacA-aphD aminoglykosidová resistence, 3' 5'-aminoglykosid fosfotransferasa aphA-3, mecR, penicillin vazebný-protein PBP2', aminoglykosid-3'adenyltransferasu aadA, tetracyklin resistentní protein tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala,ligasu vanB a mají teploty tání, které se od sebe liší nejvýše o asi 1 °C.
Podle dalšího aspektu se tento vynález týká setu pro hybridizaci produktů vícenásobné PCR podle jednoho z výše popsaných způsobů podle vynálezu, přičemž zahrnuje alespoň dvě, výhodně alespoň šest, zvláště výhodně alespoň dvanáct sond, které se pokaždé specificky hybridizují s od sebe se lišícími molekulami kyseliny nukleové pro detekci a mají
teploty tání, které se od sebe (tedy od pokaždé jiného párumolekuly sond/kyselina nukleová pro detekci v setu) liší o maximálně 2 °C, s výhodou o maximálně 1 °C. Sondy mohou být rozpuštěny přitom v pufru. Dále může mit set více nádobek, přičemž jedna nádobka má sondy se stejnou sekvenci. Tim je možné nanést na mikrosadu na bod sondy se stejnou sekvenci. Samozřejmě je ale také možné použit v jedné nádobce sondy se dvěmi nebo více od sebe odlišnými sekvencemi.
S výhodou mají sondy hybridizační oblast zahrnující 15 až 25, s výhodou 20, nukleotidů.
Dále je výhodné, když mají sondy na jejich konci 5'pokaždé sekvenci dT, přičemž počet Tm činí mezi pěti a patnácti, například deset.
Zvláště je výhodné, když sondy mají pokaždé v jejich oblasti hybridizace sekvenci, která se zvolí ze skupiny sestávající zč. 25, č. 26, č. 27, č. 28, č. 29, č. 30, č. 31, č. 32, č. 33, č. 34, č. 35 a č. 36.
Podle dalšího aspektu se tento vynález týká kitu pro současnou detekci alespoň dvou od sebe odlišných molekul kyseliny nukleové ve vzorku, přičemž zahrnuje
- mikrosadu podle vynálezu popsanou výše alespoň jednu nádobku s primery pro specifickou amplifikaci molekul kyseliny nukleové pro detekci a
- případně set podle vynálezu jak se popisuje výše.
Přitom může jedna nádobka obsahovat primery s tou samou sekvencí, ale také pár primer k amplifikaci molekuly nukleové kyseliny nebo koneckonců také více párů primer pro amplifikaci více od sebe se lišících molekul nukleové kyseliny, přičemž primer by však měl být přítomen v určité koncentraci. Samozřejmě může kit dále mít návod k použití s protokolem k provádění výše popsaného způsobu podle vynálezu jakož i různé další pufry, soli, roztoky atd., které jsou potřebné pro amplifikační reakci, hybridizační reakci příp. detekci.
• 44
4 4 444
4
4'
Mikrosada může mít přitom již na sobe imobilizované sondy.
Set obsahující sondy může být přitom oddělen od mikrosady (pro případ, že mikrosada je holá, tj. že nemá žádné navázané sondy), může být ale také integrovaným dílem mikrosady.
Výhodně obsahuje kit dále alespoň jednu nádobku s alespoň jednou molekulou kyseliny nukleové pro detekci jako pozitivní vzorek. Také zde může mít opět nádobka molekuly kyseliny nukleové se stejnou sekvencí, přičemž je možné, že je v kitu přítomno více nádobek, ale je také možné, že v jedné nádobce jsou molekuly kyseliny nukleové s více od sebe se lišícími sekvencemi. Je-li kit určen například pro detekci genů resistentních vůči antibiotikům, lze kit použít jako pozitivní vzorek molekuly nukleové kyseliny se sekvencemi s hybridizační sekvencí SEQ ID č. 25 až SEQ ID č. 36.
Zvláště výhodné je, když kit dále obsahuje nádobku se streptavidinem navázaným na kuličky. To umožňuje oddělení amplifikovaných „+- nebo jednotlivých řetězců, jestliže „+- nebo „-„- jednotlivé řetězce jsou navázány na biotin, například použitím primer navázaných na biotin. Vynález se blíže vysvětluje na základě následujících příkladů provedení jakož i obrázků, na něž se však nemá omezit. Obrázky ukazují :
Obr.l Rozdělení produktů PCR všech dvanácti ABR míst pomocí gelové elektroforézy
Obr. 2 nákres mikrosady ABR-štěpu
Obr. 3 schéma průběhu pokusu
Obr. 4 vyobrazení kontrolní hybridizace na ABR-štěpu a Obr. 5 výsledek detekce ABR-části po vícenásobné amplifikaci.
Příklady provedení vynálezu
1. Genová syntéza referenčního „ABR-targetu (místa) • ···· fcfc fcfc *· · • fcfc · · · · · · • ··· fc ···· · ··· fc fcfcfc fcfc ··· · fcfcfc· • · fc··· fcfcfc ····«· fcfc fcfc ·· *
Řada (ABR) sekvencí resistentních vůči antibiotikům byla připravena genovou syntézy in vitro, jelikož buď „typy strains nebyly k dispozici nebo práce s organismy, které přicházejí v úvahu nebyla možná z důvodů bezpečnosti („bio safety level 2 nebo vyšší). V tabulce 1 jsou shrnuta všechna místa a jsou opatřeny číslem (č.), přičemž jsou odvozeny „kontrola resistentních genů od vektorů a v první řadě slouží k validaci částí (chips). Pro tato místa jsou sondy prototypu ABR-část.
Tabulka 1
č. Antibiotiková resistence specie „TARGET resistentní gen
8 Ampicillin (kontrola) S. aureus,E. faecalis Beta-laktamasa blaZ
9 Chloramphenicol (kontrola) Bacillus sp., Corynebacterium sp. Chloramphenicol Acetyltransferasa
11 Fosformycin S. epidermidis, Staphylocočcus sp. FosB protein
7 Erythromycin Staphylococcus sp. Adenin methylasa ermC
12 Gentamycin S. aureus AacA-aphD aminoglykosid resistentní gen
2 Kanamycin S. aureus,E. faecalis 3'5'-aminoglykosid resistentní gen
3 Methicillin S. aureus mecR
1 Penicillin S. aureus PBP2'protein vážící penicillin
5 Streptomycin, Spéctinomycin Salmonella: Aminoglykosid-3'- adenyltransferasa aadA
10 Tetracyclin (kontrola) Salmonella sp. Tetracyclin resistentní protein tetC
φφ ·· φ ' φ φ φ φφφ φ φφφφ • φφφ φ φ · φ φ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ ·· φφφφ
Φ· · φ » φ φ φφφ φ φ φ φφφφ • φ φ φφ φ
4 Trimethoprim S. aureus DHFR DfrA
6 Vancomycin- VanB-Typ Enterococcus, Straptococcus D-Ala:D-Ala ligasa vanB
Tabulka 2 uvádí sekvence primer PCR a délky produktů . PCR, které byly vyvinuty pro prototyp, na Obr. 1 lze vidět všech 12 produktů PCR po agarozové gelové elektroforéze.
Tabulka 2
Č. jméno PCR primer (SEQ ID č.) Produkt PCR
1 PBP2 1+2 423 bp
2 KanR 3 + 4 532 bp
3 MecR 5+6 517 bp
4 DhfrA 7 + 8 279 bp
5 StrR 9+10 54 9 bp
6 VanB 11+12 498 bp
7 MlsR 13+14 564 bp
8 AmpR 15 + 16 219 bp
9 CmR 17 + 18 247 bp
10 TetR 19+20 245 bp
11 FosB 21+22 304 bp
12 AacA 23+24 4 97 bp
2. Vzhled mikrosady
Pomocí bioinformačních standardních metod byly zjištěny vysoce specifické DNA sondy pro každou (PCR) molekulu nukleové kyseliny, která je k dispozici, genů (ABR) resistentních vůči antibiotikům přicházejících v úvahu. Obecně byl použit Software „Gene Runner 3.0 (© 1994, Hastings Software, lne.), pro PCR a Hyb Primer selekci byl použit „Primer 3, Steve Rozen & Helen J. Skaletsky (1998)
Primer 3, pro Homologie Suché und Datenbank cross-checks: „Fasta3, w.R.Pearson and D.J.Lipman (1988), „Improved Tools for Biological Sequence Analysis, PNAS 85:2444-2448, W.R. Pearson (1990) „Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymology 183:63-98, pro aligments:ClustalX 1.8, Thompson, J.D., Gibson, TJ., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. (1997), The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence aligment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 24:4876-4882. Přitom se obzvláště dbalo na to, aby se mohly vyloučit potenciální křížové hybridizace s jinými možnými ABR místy. Přitom byly použity také extensivní EMBL a GenBank Datenbankrecherchen, aby se zajistila, že příslušné sondy nedovolí žádné chybné hybridizace s „cizími sekvencemi. Sondy jsou lokalizovány v oblastech fragmentů PCR bohatších v A/T, aby se zaručily optimální podmínky při hybridizací s produkty PCR. Optimální podmínky znamenají v tomto případě, že hybridizace obecně jsou efektivní, když sonda „rozpozná oblast v dsDNA, která lépe denaturuje (protože E:G. V bohatší oblasti A/T).
Každá sonda má hodnotu Ts 65 °C +/- 1 a má extra sekvenci dTio na 5'-konci jako mezerník mezi povrchem části a hybridizační sekvencí (viz. tabulka 3). Všechny oligonukleotidy byly syntetizovány s modifikací 5'(CH2) 6-NH2a čištěny pomocí „reversed phase chromatography HPLCprotokolu. Sondy jsou nastaveny na koncentraci 1 mM a. uchovávány při -20 °G v MT-plotně.
Tabulka 3
č. jméno Sekvence (SEQ ID č.) Tm [°C]
1 PBP2 25 64,8 .
2 KanR 26 65,1
3 MecR 27 64,8
• · · · · • · ·· · • · · · »· ·· 4
4 DhfrA 28 65,5
5 StrR 29 63, 7
6 VanB 30 64,4
7 MlsR 31 64,9
8 AmpR 32 65, 4
9 CmR 33 64,9
10 TetR 34 65, 9
11 FosB 35 64,2
12 AacA 36 65,0
Co BSreverse 37 65, 9
hCo AT-M33 38 65,3
3. Array Layout j
Sondy jsou kovalentně navázány na skleněný povrch, přitom reagují 5'primární aminoskupiny s volnými aldehydickými skupinami skleněného povrchu za vzniku Schiffovy báze („Silylated Slides, CEL Associates). Sondy byly naneseny na skleněný nosič pomocí bodů (Affymetrix 417 Arrayer). Přitom byly optimalizovány protokoly nanášení laodů pro dobrou reprodukovatelnost a hustotu bodů. Nanášení bodů nastalo v 3 ' x SSC 0,1% SDS s hits/dot. Body mají průměr asi 240 pm a jsou naneseny s odstupem bod od bodu 280 pm na mikrosadě.
Od každého bodu jsou dvě repliky. Pro validaci části jsou naneseny kontrolní sondy (Bluesčript polylinker Sequenz) v typickém vzoru („guide dots) a negativní kontroly (Leerwěrte, tzv. „buffer-dots).
Obr. 2 ukazuje průběh pokusu.ABR-části. Pozice 12 ABR místa je vyznačena příslušným číslem (č.). „Gúide dots jsou černé, „buffer dots bílé, pozice heterólogních kontrol jsou značeny šedě.
, 1 1 -^ή|
4. validace-části & hybridizace kontrol ·· ·
.....· ·· ·· ·· .
Hybridizační podmínky byly v prvé řadě optimalizovány pomocí setu kontrolních sond na mikrosadě. Šest bodů na mikrosadě obsahuje jednu kontrolní sondu s jedními BS polylinkeremspecifické sekvence. Hybridizace se prováděla v objemu 7 μΐ s 3' koncově Cy5-dCTP označeným óligonukleotidem (Bsrevco, 5'AAGCTCACTGGCCGTCGTTTTAAA SEQ ID č. 39) v pufru SSARC pod 15 x 15 mm (2,25 mm2) krycím sklem 1 hodinu při 55 °C. Štěp se promyl pomocí standardního protokolu1 (2 x SSC 0,1% SDS, pak 0,2 x SSC 0,1% SDS, pak 0,2 x SSC a nakonec 0,1 x SSC pokaždé 2 min.). Skleněný nosič se scannoval poté konfokálním fluorescenčním scannerem (Affymetrix 418 Array Scanner) vhodným laserovým výkonem a hodným PMT nastavením napětí.
Na Obr. 3 je ukázána kontrolní hybridizace na ABR-části. Lze vidět výsledek celkem 12 jednotlivých provedení hybridizačních experimentů pokaždé jedním ze specifických míst (č. 1 až 12) s „guide dot kontrolami (zleva doprava pokaždé č. 1 až č. 3, č. 4 až č. 6, č.7 až č.9 a č. 10 až č. 12) .
5. Pilotní studie s prototypem ABR části
V prvním funkčním testu ABR části byly připraveny dvě různé směsi vzorků („MixA a „MixB) z pokaždé tří různých ABR míst a dvou kontrolních míst (Ampicillin č. 8a Tetracyclin č, 10): „MixA” obsahovala dodatečně ke kontrolnímu místu Kanamycin (apha-3 č. 2), Trimethroprim (dhfrA č. 4) a Gentamycin (aacA č. 12), „MixB” obsahovala dodatečně ke kontrolnímu místu Vancomycin (vanB č. 6), Erythromycin (ermC č. 7) a Fosfomycin (fosfB č. 11). Přitom se použily syntetické „templáty, aby bylo umožněno co možná nejexaktnější nastavení množství „templátů. Vícenásobní amplifikace se provedla za standardních podmínek PCR ve 35 cyklech, přičemž primery pro amplifikaci „+”-jednotlivého řetězce, které jsou identické se sondami, byl navázán na
molekulu biotinu. Primery pro.jednotlivé řetězce, které mají komplementární sekvence k sondám, byly navázány na makromolekuly 5'Cy-5: Reakční vsázka se čistila, jednotlivé řetězce se isolovaly alkalickou denaturací na Dynabeads a hybridizovaly se v pufru SSARC 1 hodinu při 55 °C na prototyp ABR Arrays (viz. Obr. 4):
A) PCR (kontroly v jednotlivých vsázkách) μΐ objem:
1,0 μΐ templat (3 fmol/μΐ)
1,0 μΐ primer plus (25 μΜ) 5'-biotin [VBC-GENOMICS]
1,0 μΐ primer minus (25 μΜ) 5'-Cy-5 [VBC-GENOMICS]
2,5 μΐ HotStar™ pufr (lOx) [Qiagen]
0,5 μΐ dNTPs (10 mM) [Roche]
TM μ
0,1 μΐ HotStar Taq DNA polyměrasa [Qiagen] ad 25 μΐ dvakrát destilovanou -vodou cycling: 15 min 95 °C 30 x [30 ;sec 95 °C 20 sec 60 °C 40 sec 72 °C] 10 min 72 °C čištění vsázky PCR purifikačním kitem PCR QIAquick™
B)vícenásobná PCR μΐ objem:
x μΐ templat (x fmol/μΐ)
6,0 μΐ primer „coctail plus ( vždy 25 μΜ) 5'-biotin [VBCGENOMICS]
6,0 μΐ primer „coctail” minus (vždy 25 μΜ) 5'-Cy-5 [VBCGENOMICS]
5,0 μΐ HotStar™ pufr (lOx) [Qiagen]
1,0 μΐ dNTPs (10 mM) [Roche]
0,2 μΐ HotStar Taq DNA polyměrasa [Qiagen] ad 50 μΐ dvakrát destilovanou vodou ·1.1 · cycling: 15 min 95 °C 35 x [30 sec 95 °C: 20 sec 55 °C 40 sec °C] 10 min 72 °C čištění vsázky PCR purifikačním kitem PCR QIAquick™
C) isolace jednořetězců (single-strand) μΐ Dynabeads (10 μρ/μΐ) [Roche] 2 x 200 μΐ 1 x TS-pufrem promýt rozptýlit v 8 μΐ 6 x TS-pufru inkubovat se 40 μΐ vsázky PCR 30 min při 37 °C promýt Dynabeads 2 x 200 μΐ 1 x TS-pufrem denaturovat DNA 2 x 20 μΐ 0,2 N NaOH 5 min při teplotě místnosti srážení 120 μΐ 90% EtOH/0,3 M4,NaOAc (20 min -20 °C, 30 min při 16 500 ot/min 4 °C) pelety promýt 70% EtOH, sušit a ve 14 μΐ pufru SSARC rozptýlit
D) hybridizace μΐ hybridizačního vzorku denaturovat v pufru SSARC s 0,1 μΐ Bsrevco-Cy5 (1 μΜ) 3 min při 98 °C a hned umístit na led 1 h při 55 °C hybridizovat, pod krycím sklem 15 x 15 mm slide promýt (2 x SCC 0,1% SDS 5 min při teplotě místnosti, 0,2 x SSC 5 min teplota místnosti, 0,2 x SSC 5 min teplota místnosti, 0,1 x SSC 2 min teplota místnosti) slide scannovat
E) pufry
TS-pufr: 100 mM Tris-Cl, pH 7,6, 150 mM NaCl; z autoklávu SSARC-pufr: 4 x SSC, 0,1% (w/v) Sarkosyí; 0,2 μιη. filtrované SSC-pufr: 20x: 3 M NaCl, 0,3 M tri-natriumcitrat (dihydrát), pH 7,0 • ·'· ·-» • β · «'« ·Α • · • · · · • · • 99 · · ·
Části se promyly a scannovaly. Obr. 5 ukazuje vícenásobnou arnplifikaci a následnou detekci ABR-štěpu dvou různých syntetických míst a dvou kontrolních míst, vlevo „MixA, vpravo „MixB. Lze vidět „falše color-obrázky fluorescenčních scanů, pokaždé pod negativem se správným .
I připojením ABR-míst. Jak lze vidět na Obr. 5 je jednoznačně možné připojení správných míst do dvou rozdílných směsí vzorků. To ukazuje, že současná detekce: 12 molekul nukleové kyseliny způsobem podle vynálezu vede k. jednoznačným výsledkům.

Claims (27)

1. Způsob současné detekce alespoň dvou od sebe odlišných molekul kyseliny nukleové ve vzorku, při kterém se v prvním kroku provádí vícenásobná PCR a ve druhém kroku se provádí hybridizační reakce se sondou imobilizovanou na mikrosadě, načež se detekují případně kvantifikují hybridizované produkty PCR vyznačující se tím, že sondy použité pro hybridizační reakci, které se pokaždé hybridizují specificky s od sebe odlišnými molekulami kyseliny nukleové mají teploty tání, které se liší od sebe maximálně o 2 °C, s výhodou o maximálně 1 °C.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se současně detekuje alespoň 6, s výhodou alespoň 8, zvláště s výhodou alespoň 12 od sebe odlišných molekul kyseliny nukleové ve vzorku.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že se detekují molekuly kyseliny nukleové, které jsou obsaženy v genech resistentních vůči antibiotikům.
4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že geny resistentní vůči antibiotikům jsou zvoleny ze skupiny sestávající z genů pro beta-Laktamasu blaž, chloramphenicol acetyltransferasu, fosB protein, adenin methylasu ermC, aacA-aphD aminoglykosidovou resistenci,
3'5'-aminoglykosid fosfotransferasu aphA-3, mecR,penicillin vazebný-protein PBP2', aminoglykosid-3 ' adenyltransferasu aadA, tetracyklin resistentní protein tetC, DHFR DfrA a D-Ala:D-Ala ligasu vanB.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že se hybridizační reakce provádí při 30-80 °C, s výhodou při 40-70 °C, zvláště s výhodou při 55-65 °C.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že se hybridizační reakce provádí za vysoce přísných podmínek.
9 9 • ·
9 9 9 ,99994 • ···· • · · • · · · • · • ·« • 9 • ·
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že se provádí vícenásobná PCR s primery, které jsou značeny.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že se hybridizační reakce provádí po rozdělení „+a „-„-jednotlivých řetězců.
9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že se „+jednotlivé řetězce, které mají identické sekvence se sondami, oddělí po vícenásobné PCR.
10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že se použije primer pro elongaci „+-jednotlivých řetězců, které s výhodou na jejich 5'konci jsou navázány pokaždé na látku, obzvláště alespoň jednu molekulu biotinu, které zaručují oddělení „+-jednptlivých řetězců.
11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že se molekula biotinu naváže na primer pro elongaci „+-jednotlivých řetězců, přičemž se po vícenásobné PCR oddělí „+jednotlivé řetězce pomocí streptavidinu navázaného na kuličky.
12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že kroku hybridizace je předřazen krok čištění.
13. Mikrosada pro hybridizaci produktů vícenásobné PCR podle způsobu podle některého z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že se alespoň dvě, s výhodou alespoň 6, zvláště s výhodou alespoň 12 sond hybridizuje pokaždé specificky s od sebe odlišnými molekulami kyseliny nukleové pro detekci, na jejichž povrchu jsou vázány a mají teploty tání, které se liší od sebe maximálně o 2 °C, s výhodou o maximálně 1 °C.
14. Mikrosada podle nároku 13 vyznačující se tím, že sondy jsou vázány na povrchu mikrosady v bodech s průměrem 100 až 500 pm, s výhodou 200 až 300 pm, zvláště s výhodou 240 pm.
··
4 4 4441
4 4 I • 4 1
15. Mikrosada podle nároku 14 vyznačující se tím, že body mají od sebe odstup 100 až 500 pra, s výhodou 200 až 300 pm, zvláště s výhodou 280 pm.
16. Mikrosada podle některého z nároků 13 až 15 vyznačující se tím, že je vyrobena ze skla, syntetického materiálu případně membrány.
17. Mikrosada podle některého z nároků 13 až 16 vyznačující se tím, že jsou sondy kovalentně vázány na povrchu mikrosady.
18. Mikrosada podle některého z nároků 13 až 17 vyznačující se tím, že sondy mají hybridizační sekvenci obsahující 15 až 25, s výhodou 20 nukleotidů.
19. Mikrosada podle některého z nároků 13 až 18 vyznačující se tím, že sondy mají na svém konci 5' pokaždé sekvenci dT, přes kterou se váží na .mikrosadě.
20. Mikrosada podle nároku 19 nebo 20 vyznačující se tím, že sondy mají jako hybridizační sekvenci sekvenci, která se zvolí ze skupiny sestávající z č. 25, č. 26, č. 27, č.
28, č. 29, č. 30, č. 31, č. 32, č. 33, č. 34, č. 35 a č. 36.
21.Set pro hybridizaci produktů vícenásobné PCR podle způsobu podle některého z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dvě, s výhodou alespoň 6, zvláště s výhodou alespoň 12 sondy, které se hybridizují pokaždé specificky s od sebe odlišnými molekulami kyseliny nukleové pro detekci a mají teploty tání, které se liší od sebe maximálně o 2 °C, s výhodou o maximálně 1 °C.
22.Set podle nároku 21 vyznačující se tím, že sondy mají hybridizační oblast obsahující 15 až 25, s výhodou 20 nukleotidů.
23.Set podle nároku 21 nebo 22 vyznačující se tím, že sondy mají na svém konci 5' pokaždé sekvenci dT.
• 9
9 9 • · · • · 9 · ·
24.Set podle nároku 22 nebo 23 vyznačující se tím, že sondy pokaždé mají ve své hybridizační oblasti sekvenci, která je zvolena ze skupiny obsahující č. 25, č. 26, č. 27, č.
28, č. 29, č. 30, č. 31, č. 32, č. 33, č. 34, č. 35 a č.
36.
25. Kit pro současnou detekci alespoň dvou od sebe odlišných molekul kyseliny nukleové ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje mikrosadu podle některého z nároků 13 až 20, alespoň jednu nádobku s primery pro specifickou amplifikaci molekul kyseliny nukleové pro detekci a případně set podle některého z nároků 21 až 24.
26. Kit podle nároku 25 vyznačující se tím, že obsahuje dále alespoň jednu nádobku s alespoň jednou molekulou kyseliny nukleové pro detekci jako positivní test.
27. Kit podle nároku 25 nebo 26 vyznačující se tím, že dále obsahuje jednu nádobku se streptavidinem navázaným na kuličky.
CZ20032665A 2001-03-02 2002-03-01 Způsob detekce molekul nukleové kyseliny CZ20032665A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0033701A AT410444B (de) 2001-03-02 2001-03-02 Verfahren zur detektion von nukleinsäuremolekülen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20032665A3 true CZ20032665A3 (cs) 2005-02-16

Family

ID=3672000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032665A CZ20032665A3 (cs) 2001-03-02 2002-03-01 Způsob detekce molekul nukleové kyseliny

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20050196756A1 (cs)
EP (1) EP1366195B1 (cs)
JP (2) JP2004520838A (cs)
KR (1) KR100892184B1 (cs)
AT (1) AT410444B (cs)
AU (1) AU2002238274B2 (cs)
CA (1) CA2439531A1 (cs)
CZ (1) CZ20032665A3 (cs)
DE (1) DE50204680D1 (cs)
DK (1) DK1366195T3 (cs)
ES (1) ES2252427T3 (cs)
HU (1) HUP0303377A3 (cs)
NO (1) NO20033884L (cs)
PL (1) PL365022A1 (cs)
SK (1) SK287793B6 (cs)
WO (1) WO2002070736A2 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003144153A (ja) * 2001-11-09 2003-05-20 Gifu Univ 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット
KR100619189B1 (ko) * 2004-10-08 2006-08-31 굿젠 주식회사 성교전파성질환 원인균 탐지용 프로브 및 이를 이용한성교전파성질환 원인균 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩,분석키트 및 유전형 분석방법
EP1674583A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-28 Eppendorf Array Technologies SA Method and kit for the detection of a large number of genes related to antibiotic resistance in microorganisms
US20070059714A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-15 Birgit Strommenger Detection of presence and antibiotic susceptibility of enterococci
AT504194B1 (de) * 2006-09-07 2008-07-15 Oesterr Rotes Kreuz Bakteriennachweis
EP2270203A1 (en) 2009-06-29 2011-01-05 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Oligonucleotide hybridization method
EP2856177B1 (en) * 2012-05-25 2020-11-18 The University of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
RU2015122794A (ru) * 2012-11-15 2017-01-10 Молекуляр Детекшн Израиль Лтд. Реакционные смеси для пцр и способы применения
EP3313573A2 (en) 2015-07-22 2018-05-02 The University of North Carolina at Chapel Hill Fluidic devices with bead well geometries with spatially separated bead retention and signal detection segments and related methods
PL3523448T3 (pl) * 2016-10-07 2021-10-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sposób i system analizy do badania próbki
JP2019537706A (ja) * 2016-10-07 2019-12-26 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ サンプルを検査するための方法及び分析システム
CA3037217A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Analysis system and method for testing a sample
EP3794080B1 (en) 2018-05-18 2024-04-10 The University of North Carolina at Chapel Hill Compositions, devices, and methods for improving a surface property of a substrate

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988003171A1 (en) * 1986-10-30 1988-05-05 Synergen Biologicals, Inc. Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same
AU4216689A (en) * 1988-08-11 1990-03-05 California Biotechnology, Inc. Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5491225A (en) * 1991-12-19 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. PCR primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6045996A (en) * 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6063566A (en) * 1994-05-13 2000-05-16 The Scripps Research Institute Catalytic RNA molecules
US6150093A (en) * 1994-08-18 2000-11-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6001564A (en) * 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5702895A (en) * 1995-01-19 1997-12-30 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Method and kit for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5627054A (en) * 1996-04-05 1997-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
GB9902970D0 (en) * 1999-02-11 1999-03-31 Zeneca Ltd Novel matrix
GB9904804D0 (en) * 1999-03-02 1999-04-28 King S College London Identification of bacteria
CN1117161C (zh) * 1999-09-24 2003-08-06 东南大学 高密度基因芯片的制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030092009A (ko) 2003-12-03
AT410444B (de) 2003-04-25
US20050196756A1 (en) 2005-09-08
PL365022A1 (en) 2004-12-27
NO20033884L (no) 2003-10-28
KR100892184B1 (ko) 2009-04-07
EP1366195B1 (de) 2005-10-26
AU2002238274B2 (en) 2007-06-28
CA2439531A1 (en) 2002-09-12
ATA3372001A (de) 2002-09-15
SK10832003A3 (sk) 2004-05-04
NO20033884D0 (no) 2003-09-02
DE50204680D1 (de) 2005-12-01
JP2011101652A (ja) 2011-05-26
HUP0303377A2 (hu) 2004-01-28
WO2002070736A8 (de) 2003-01-23
ES2252427T3 (es) 2006-05-16
JP2004520838A (ja) 2004-07-15
DK1366195T3 (da) 2006-03-13
HUP0303377A3 (en) 2005-12-28
WO2002070736A3 (de) 2003-09-12
SK287793B6 (sk) 2011-10-04
EP1366195A2 (de) 2003-12-03
US20100317535A1 (en) 2010-12-16
WO2002070736A2 (de) 2002-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4860869B2 (ja) 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
US20100317535A1 (en) Methods and Compositions For Detecting Nucleic Acid Molecules
US8207319B2 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
US8129108B2 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2003527867A (ja) ポリヌクレオチド配列改変のマイクロアレイベースの分析
JP2009505651A (ja) 微生物および抗生物質耐性マーカーの検出の方法およびそのための核酸オリゴヌクレオチド
JP2008118905A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
WO2007114504A1 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
WO2007114515A1 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
WO2007114519A1 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118909A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP4972104B2 (ja) 病原体の同定のためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ
Consolandi et al. Development of oligonucleotide arrays to detect mutations and polymorphisms
JP5094181B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
US8187803B2 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP5089223B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5089220B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5089222B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5089221B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP5116341B2 (ja) プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP2008142020A (ja) 核酸マイクロアレイの品質管理方法および品質管理試薬
JP2007289180A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
WO2007114516A1 (en) Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2007006747A (ja) 複数の標識を用いる遺伝子検出方法およびキット
HK1035213A (en) Personal gene library