CZ20032706A3 - Izolovaný polypeptid a nukleová kyselina a farmaceutický přípravek, který je obsahuje, pro diagnostiku, prevenci a léčení degenerativních onemocnění sitníce - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká přípravků pro detekci a léčbu degenerativních chorob sítnice. Konkrétně se vynález týká proteinu, který chrání proti degeneraci čípků, molekul nukleové kyseliny, které kódují takový protein, protilátky, které rozpoznávají protein degenerativních chorob sítnice.

způsobů diagnostiky

Dosavadní stav techniky

Fotoreceptory jsou specializovanou podmnožinou neuronů sítnice (retiny), které zodpovídají za vidění. Fotoreceptory se skládají z tyčinek a čípků, což jsou fotosenzitivní buňky sítnice. Každá tyčinka a čípek vytváří specializovanou řasinku, nazývanou vnější segment, kde sídlí fototransdukční aparát. Tyčinky obsahují specifický vizuální pigment absorbující světlo, rodopsin. U lidí existují tři skupiny čípků, charakterizované expresí rozdílných vizuálních pigmentů: čípek pro modrý pigment, čípek pro zelený pigment a čípek pro červený pigment. Každý typ proteinu vizuálního pigmentu je přizpůsoben tak, aby maximálně absorboval světlo v různých vlnových délkách. Rodopsin tyčinek zprostředkovává skotopické vidění (za šera), zatímco čípkové pigmenty zodpovídají za fotopické vidění (v jasném světle). Červený, • · · ·

modrý a zelený pigment také tvoří základ barevného vidění u lidí. Vizuální pigmenty v tyčinkách a čípkách reagují na světlo a vytvářejí akční potenciál ve výstupních buňkách, tyčinkových bipolárních neuronů, který je pak přenášen gangliovými neurony sítnice za vzniku vizuálních podnětů ve zrakové kůře.

U lidí velký počet chorob sítnice zahrnuje progresivní degeneraci a eventuální úmrtí fotoreceptorů, vedoucí neúprosně ke slepotě. Degenerace fotoreceptorů, jako například dědičnými retinálními dystrofiemi (např. retinitis pigmentosa), makulární degenerace se vztahem k věku a další makulopatie nebo odchlípení sítnice, jsou všechny charakterizovány progresivní atrofií a ztrátou funkce vnějších segmentů fotoreceptorů. Kromě toho úmrtí fotoreceptorů nebo ztráta fotorecepční funkce HAS za následek parciální deaferentaci retinálních neuronů druhého řádu (bipolárních buněk tyčinek a horizontálních buněk) u pacientů s retinální dystrofií, proto klesá celková účinnost propagace elektrického signálu tvořeného fotoreceptory. Sekundární změny gliového a pigmentového epitelu sekundární k degeneraci fotoreceptorů HAS za následek vaskulární změny vedoucí k ischémii a glióze. Trofické faktory, které jsou schopné zachránit fotoreceptory před buněčnou smrtí a/nebo obnovovat funkce dysfunkčních (atrofických nebo dystrofických) fotoreceptorů, mohou představovat použitelnou terapii na léčbu těchto chorobných stavů.

Progrese těchto chorobných stavů směřuje k následné ztrátě těchto dvou skupin fotoreceptorů: zpočátku jsou tyčinky ztráceny jako přímý důsledek genetické léze nebo léze způsobené vlivy prostředí nebo neznámého původu, což HAS za následek noční slepotu a redukci zorného pole následovanou • · · ·

nevyhnutelně ztrátou čípků vedoucí k celkové slepotě, čípky umírají nepřímo, protože neprojevují primární lézi.

Ne všechny z genů spojených s retinální dystrofií už byly identifikovány. Identifikace takových genů by umožnila jak diagnostikovat onemocnění tak poznat účinnou terapii.

Podstata vynálezu

Vynález se týká obecně nové genové rodiny, a sice faktoru životaschopnosti čípků pocházejícího z tyčinek (Rdcvf, „Rodderived Cone Viability Factor).

První aspekt vynálezu poskytuje izolovaný polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v přihlášce v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4. Bylo zjištěno, že takový polypeptid nebo jeho fragment se v oku pacientů trpících retinální dystrofií vyskytuje v mnohem menší míře než v oku jednotlivců bez retinální dystrofie. Fragmenty izolovaného polypeptidu s aminokyselinovou sekvencí SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4 zahrnují polypeptidy obsahující přibližně 5 až 10 aminokyselin, výhodně přibližně 10 až přibližně 20 aminokyselin, výhodněji přibližně 20 až přibližně 100 aminokyselin a nejvýhodněji přibližně 20 až přibližně 50 aminokyselin. Tento aspekt vynálezu poskytuje nový polypeptid konkrétně myšího nebo humánní původu, a také nebo terapeuticky použitelné savčího původu, biologicky, diagnosticky fragmenty, varianty a deriváty polypeptidu, deriváty jeho fragmentů a jejich analogy.

varianty a Do rozsahu předkládaného vynálezu jsou zahrnuty také polypeptidy, který jsou v podstatě podobné sekvencí uvedenou jako SEKV.

polypeptidu s aminokyselinovou ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4,

99*9 · 99 ·· ···· «· 9 · · · · · · · • 99 9 · · 9 9 9

9 99 999*99 · ···· ··· · · · · * * · · ··· 99 99 99

- 4 jako je např. aminokyselinová sekvence uvedená zde jako SEKV.

ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14.

Druhý aspekt předkládaného vynálezu poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID.

Č. 3. Do rozsahu předkládaného vynálezu jsou zahrnuty také nukleové kyseliny, které jsou v podstatě podobné nukleovým kyselinám s nukleotidovou sekvencí uvedenou jako SEKV. ID. Č.

nebo SEKV. ID. Č. 3, např. nukleotidová sekvence uvedená v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV.

ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11 nebo SEKV. ID. Č. 13. Ve výhodném provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid vybraný ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4,

SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č.

a SEKV. ID. Č. 14, např. nukleotidy 45 až 374 ze SEKV. ID.

Č. 1, nukleotidy 26 až 676 ze SEKV. ID. Č. 3, nukleotidy 24 až 353 ze SEKV. ID. Č. 5, nukleotidy 48 až 686 ze SEKV. ID. Č. 7, nukleotidy 265 až 570 ze SEKV. ID. Č. 9, nukleotidy 300 až 770 ze SEKV. ID. Č. 11 nebo nukleotidy 331 až 738 ze SEKV. ID. Č.

13. Ve výhodném provedení izolovaná DNA má formu molekuly vektoru obsahující DNA uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 3.

Třetí aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu diagnózy retinální dystrofie u člověka, který zahrnuje detekci snížené transkripce mediátorové RNA (messenger RNA, mRNA) transkribované z DNA kódující Rdcvfl nebo Rdcvf2 DNA v oku savce, výhodně člověka, kde tato snížená transkripce je indikací toho, že organismus trpí retinální dystrofií nebo patologickým stárnutím (ARMD). Další aspekt vynálezu poskytuje způsob pro diagnózu retinální dystrofie v savčím organismu,

výhodně u člověka, kdy se měří množství polypeptidu Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jejich fragmentů v oku člověka, u kterého je podezření, že trpí nějakou formou retinální dystrofie, přičemž přítomnost sníženého množství polypeptidu nebo jeho fragmentu vzhledem k množství polypeptidu nebo jeho fragmentu v oku zdravého jedince (který netrpí retinální dystrofií) je indikací toho, že pacient trpí retinální dystrofií.

Další aspekt vynálezu poskytuje antisense polynukleotidy, které regulují transkripci genu Rdcvfl nebo Rdcvf2, a v dalším provedení poskytuje dvojvláknovou RNA, která může regulovat transkripci genu Rdcvfl nebo Rdcvf2.

Další aspekt vynálezu poskytuje způsob přípravy výše uvedeného polypeptidu, polypeptidového fragmentu, jejich variant a derivátů, fragmentů variant a derivátů a jejich analogů. Ve výhodném provedení vynálezu je poskytnuty způsob přípravy výše uvedeného Rdcvfl polypeptidu, který zahrnuje kroky kultivace hostitelské buňky mající v sobě vložený expresní vektor obsahující exogenně získaný polynukleotid kódující Rdcvfl nebo Rdcvf2, a to v podmínkách vhodných pro expresi polypeptidu Rdcvfl nebo Rdcvf2 v hostiteli, a pak získání takto exprimovaného polypeptidu.

Další aspekt vynálezu poskytuj produkty, kompozice, způsoby a metody, které užívají výše uvedené polypeptidy a polynukleotidy pro, inter alia, výzkum, biologické produkty, klinické a terapeutický účely.

Další výhodný aspekt vynálezu poskytuje protilátku, nebo fragment této protilátky, která specificky váže polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6 nebo SEKV. ID. Č. 8, tj . Rdcvfl, nebo SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14, tj . Rdcvf2. Ve zvláště výhodném aspektu vynálezu protilátky jsou vysoko selektivní pro savčí, výhodně myší a

konkrétně humánní Rdcvfl nebo Rdcvf2 polypeptidy nebo části Rdcvfl nebo Rdcvf2 polypeptidů. Další výhodný aspekt poskytuje protilátku nebo fragment protilátky, která se váže k fragmentu nebo části aminokyselinové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14.

Další aspekt vynálezu se týká léčení onemocnění u pacienta, kde onemocnění je zprostředkováno a nebo asociováno se změnou v expresi genu Rdcvfl nebo Rdcvf2, např. snížení množství RDCVF1 nebo RDCVF2 polypeptidů přítomného v oku, přičemž léčení spočívá v tom, že se podává terapeuticky účinné množství proteinu RDCVF1 nebo RDCVF2 se SEKV. ID. Č. 2 SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 nebo příbuzného proteinu nebo fragmentu nebo jeho části. Dále se vynález týká způsobu pro diagnózu onemocnění nebo stavu asociovaného se snížením exprese genu Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo snížením množství RDCVF1 nebo RDCVF2 polypeptidů u pacienta, přičemž diagnostický test zahrnuje krok, kdy se v imunotestu užije protilátka, která váže polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14, nebo její fragment nebo část.

Ještě další aspekt vynálezu poskytuje buňky, které mohou být množeny in vitro, výhodně buňky obratlovců, které jsou schopné při růstu v kultuře produkovat polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14, nebo její fragmenty, přičemž buňky obsahují transkripční kontrolní DNA sekvence, jiné než myší nebo humánní Rdcvfl nebo Rdcvf2 transkripční kontrolní sekvence, kde tyto transkripční

	- 7 -	• · · · · · • · · · • · · • · · · • · · · ·	• · · • · · • · · • · · • · · ·
kontrolní	sekvence regulují transkripci	z DNA kódující
polypeptid	s aminokyselinovou sekvencí SEKV.	ID. Č. 2	, SEKV.
ID. Č. 4,	SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8,	SEKV. ID.	Č. 10,
SEKV. ID.	Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 nebo jejími fragmenty.
Další	aspekt předkládaného vynálezu	poskytuj e	způsob
přípravy	Rdcvfl nebo Rdcvf2 polypeptidu,	kterýžto	způsob

zahrnuje kultivaci hostitelské buňky mající v sobě vložený expresní vektor obsahující exogenní polynukleotid kódující Rdcvfl nebo Rdcvf2 v podmínkách, které jsou dostatečné pro expresi Rdcvfl nebo Rdcvf2 polypeptidu v hostitelské buňce, čímž dochází k produkci exprimovaného polypeptidu, a získání exprimovaného polypeptidu.

Ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje testovací metody a soupravy obsahující složky nutné pro detekci abnormální, např. nižší než normální, exprese Rdcvfl nebo Rdcvf2 polynukleotidu nebo polypeptidu nebo jejich fragmentu ve vzorku tkáně z organismu pacienta, přičemž taková souprava obsahuje např. protilátky, které vážou k Rdcvfl nebo Rdcvf2, nebo oligonukleotidovou sondu, která hybridizuje s polynukleotidy podle vynálezu. Ve výhodném provedení takové soupravy také obsahují instrukce popisující postup, jakým mají být jednotlivé složky soupravy použity.

Další aspekt vynálezu se týká polypeptidu Rdcvfl nebo Rdcvf2 pro použití při léčení lidského nebo zvířecího organismu. Další aspekt se týká použit Rdcvfl nebo Rdcvf2 polypeptidu nebo jeho fragmentu, nukleotidu kódujícího Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jeho fragment, nebo protilátky, která váže Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jejího fragmentu pro výrobu léku k léčení retinální dystrofie.

Další aspekt vynálezu poskytuje retinoprotektivní agens obsahující polypeptid vybraný ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10,

- 8 • ·· ·

SEKV. ID. C. 12 nebo SEKV. ID. C. 14, a, volitelně farmaceuticky přijatelný nosič. V dalším aspektu vynález poskytuje farmaceutické Rdcvf2 polypeptid nebo přípravky obsahující Rdcvfl nebo jeho fragment, nukleotid kódující Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jeho fragment, pro léčení retinální dystrofie. V dalším aspektu vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidů vybraného ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14, a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu se vynález týká léčení retinální dystrofie, které zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství polypeptidů vybraného ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 a farmaceuticky přijatelného nosiče pacientovi, který takovou léčbu potřebuje.

Další aspekt vynálezu se týká metod identifikace molekul, které se mohou vázat na Rdcvfl nebo Rdcvf2 a/nebo modulovat aktivitu Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo molekul, které se mohou vázat k sekvencím nukleové kyseliny, které modulují transkripci nebo translaci Rdcvfl nebo Rdcvf2. Takové metody jsou popsány např. v patentech USA č. 5,541,070, 5,567,317, 5,593,853, 5,670,326, 5,679,582, 5,856,083, 5,858,657, 5,866,341, 5,876,946, 5,989,814, 6,010,861, 6,020,141, 6,030,779 a 6,043024, které jsou v plném znění zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Molekuly identifikované takovými metodami také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Ještě další aspekt vynálezu se týká metod vnesení nukleové kyseliny podle vynálezu do jedné nebo více tkání pacienta, který potřebuje léčbu vedoucí k tomu, že jeden nebo více proteinů kódovaných nukleovými kyselinami jsou exprimovány a nebo sekretovány buňkami v tkáni.

• ·· ·

Další aspekt vynálezu poskytuje způsob přípravy fotoreceptorové buňky pro implantaci, kdy se fotoreceptorová buňka kultivuje společně s RdCVFl nebo RdCVF2.

Další předměty, rysy, výhody a aspekty předkládaného vynálezu budou zřejmé odborníkům z následujícího podrobného popisu. Je třeba připomenout, že následující popis a specifické příklady ukazující výhodná provedení vynálezu jsou pouze ilustrační a rozsah vynálezu nijak neomezují. Různé změny a modifikace, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky a rozsahu popsaného vynálezu, budou odborníkovi zřejmé na základě předloženého popisu, příkladů, obrázků a nároků.

Popis obrázků

Obrázek 1: Myší nukleotidová sekvence Rdcvfl z expresní klonování a myší aminokyselinová sekvence RdCVFl.

Obrázek 2: Myší nukleotidová sekvence RdcvflL a odpovídající aminokyselinová sekvence.

Obrázek 3: Humánní Rdcvfl a humánní aminokyselinová sekvence Rdcvfl.

Obrázek 4: Humánní nukleotidová sekvence RdcvflL a humánní aminokyselinová sekvence RdcvflL.

Obrázek 5: Myší nukleotidová sekvence Rdcvf2 myší aminokyselinová sekvence Rdcvf2.

Obrázek 6: Myší nukleotidová sekvence Rdcvf2L a myší aminokyselinová sekvence Rdcvf2L.

·««·

•4 *· 4444 • · ♦ · · 4 4 4 4 4

- 10 Obrázek Ί: Humánní nukleotidová sekvence Rdcvf2 a humánní aminokyselinová sekvence Rdcvf2.

Obrázek 8: ukazuje porovnání aminokyselinových sekvencí krátkých forem Rdcvf (SEKV. ID. Č. 2, 6, 10 a 14) a dlouhých forem Rdcvf (SEKV. ID. Č. 4, 8, 12 a 14).

Obrázek 9 ukazuje oligonukleotidové primery pro GST-Rdcvfl.

Obrázek 10: Vícenásobné porovnání RDCVF1/RDCVF2.

Obrázek 11: Srovnání myší a humánní sekvence RDCVF2.

Obrázek 12: Vícenásobné porovnání myšího Rdcvf2 s EST klony be552141, bi517442, bg707818 a bi603812.

Obrázek 13: Vícenásobné porovnání Rdcvf1 s EST klony bg299078, ai716631, bg294111, bel08041 a bg395178.

Obrázek 14: EST sekvence bg299078 upravená na nejvyšší shodu („match) s Rdcvf1.

Obrázek 15: EST sekvence bg294111 upravená na nejvyšší shodu s Rdcvf1L.

Obrázek 16: RT-PCR analýza v reálném čase exprese arrestinu tyčinek (Ά) a RdCSFl (B) v sítnici ve stáří 5 týdnů u C57BL/6@N (zelená) a C3H/HE@N (červená).

Obrázek 17: RT-PCR analýza ukazující, že Rdcvf2 je exprimován způsobem závislým na tyčinkách a je exprimován v jiné části CNS.

Obrázek 18: PCR analýza ukazující, že RdCVFl je exprimován způsobem závislým na tyčinkách.

Podrobný popis vynálezu

Všechny v tomto textu citované patentové přihlášky, patenty a další literatura jsou tímto v plném rozsahu zahrnuty formou odkazu.

····

- 11 Při realizaci předkládaného vynálezu se užívají běžné metody molekulární biologie, mikrobiologie a rekombinantní DNA. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a byly popsány například v Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.) ; Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academie Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds.).

Termín diferenčně exprimovaný gen užívaný v předkládaném textu se týká (a) genu, který obsahuje alespoň jednu z DNA sekvencí popsaných v tomto textu (např. sekvence na obr. 1 a SEKV. ID. Č. 1 nebo sekvence na obr. 2 a SEKV. ID. Č. 3), (b) jakékoliv DNA sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí popsanou v tomto textu (např. sekvence na obr. 1 a SEKV. ID. Č. 2 nebo sekvence na obr. 2 a SEKV. ID. Č. 4) nebo (c) jakékoliv DNA sekvence, která je v podstatě podobná kódující sekvenci popsané v tomto textu.

Termín v podstatě podobná, ve svém nej širším významu, jak se používá v tomto textu, pokud se týká nukleotidová sekvence, znamená nukleotidovou sekvenci odpovídající referenční nukleotidové sekvenci, kde odpovídající sekvence kóduje polypeptid mající v podstatě stejnou strukturu a funkci ·· ·**· ·· ·· jako polypeptid kódovaný referenční nukleotidovou sekvencí, např. kde změny aminokyselin, které se vyskytují, nepostihují funkci polypeptidu. Je žádoucí, aby v podstatě podobná nukleotidová sekvence kódovala polypeptid kódovaný referenční nukleotidovou sekvencí. Procento identity mezi v podstatě podobnou nukleotidovou sekvencí a referenční nukleotidovou sekvencí by mělo být alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, ještě výhodněji alespoň 99 %. Srovnání sekvencí je prováděno s použitím Smith-Watermanova algoritmu pro porovnávání sekvencí (viz např. Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Halí. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0, nebo viz také http://www-hto.use.edu/software/seqaln/index.html. Program LocalS, verze 1,16, byl použit s následujícími parametry: Shoda („match): 1, penalta za záměnu: 0,33, penalta za otevřenou mezeru: 2, penalta za rozšířenou mezeru: 2. Nukleotidová sekvence v podstatě podobná referenční nukleotidové sekvenci hybridizuje s referenční nukleotidovou sekvencí v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C, po promytí v 2X SSC, 0,1% SDS v 50°C, nebo výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C, po promytí v IX SSC, 0,1% SDS v 50°C, nebo ještě výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C, po promytí v 0,5X SSC, 0,1% SDS v 50°C, výhodně v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C s promytím v 0,lX SSC, 0,1% SDS v 50°C, výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C s promytím v 0,lX SSC, 0,1% SDS v 65°C, přičemž stále kóduje funkčně rovnocenný genový produkt.

Diferenčně exprimované geny popsané v tomto textu jsou exprimovány v oční tkáni a konkrétně v tyčinkách (tyčinkových buňkách), nicméně u člověka postiženého retinální dystrofií, φ<* · »· ·

Μ ··<· * ·« • · · · · · · · · · « · ··*··· ·· 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 *· 999 99 99 99

- 13 jako například onemocnění retinitis pigmentosa, makulární degenerace se vztahem k věku, Bardetův-Biedlův syndrom, Bassenův-Kornzweigův syndrom, Bestova nemoc, choroidom, spirálovitá atrofie, kongenitální amauróza, Refsumův syndrom, Stargardtova nemoc a Usherův syndrom, se tvoří v menším množství než v odpovídající tkáni u lidí, kteří netrpí retinální dystrofií. Mediátorová RNA (mRNA) transkribovaná z diferenčně exprimovaných genů a proteiny translatované z této mRNA, jsou přítomny tyčinkové tkáni a/nebo spojeny s takovými tkáněmi v množství nejvýše přibližně polovina, výhodně nejvýše pětkrát menším, výhodněji nejvýše deset krát, nejvýhodněji nejvýše 100 krát menším než jsou hladiny mRNA a proteinu zjištěné v odpovídajících tkáních u lidí, kteří netrpí retinální dystrofií. Takové snížení transkripce Rdcvf1 nebo Rdcvf2 mRNA je nazýváno v tomto textu jako snížená transkripce.

Termín hostitelská buňka jak se v tomto textu používá, se týká prokaryotické nebo eukaryotické buňky, která obsahuje heterologní DNA, která byla do buňky vnesena kteroukoliv ze známých metod, např., elektroporací, precipitací s fosforečnanem vápenatým, microinjekcí, transformací, virovou infekcí apod.

Termín heterologní znamená totéž co odlišného přírodní původu nebo představuje „nepřírodní stav (stav nevyskytující se v přírodě). Například jestliže hostitelská buňka je transformovaná DNA nebo genem pocházejícím z jiného organismu, konkrétně jiného biologického druhu, pak je gen heterologní ve vztahu k hostitelské buňce a také k potomstvu hostitelské buňky, které nese tento gen. Podobně se termín heterologní týká nukleotidové sekvence pocházející z téhož organizmu, do kterého je pak vložena, ale která je přítomna v „nepřírodním stavu, např. v odlišném počtu kopií nebo pod

- 14 4· * 4»

4 4 4 4 4 β

4 4 · 4 4

4 4 · · · 4

4*4 4 4 4 4 44 kontrolou odlišných regulačních prvků, ve srovnání se stavem, v jakém se vyskytuje v přírodě.

Vektorová molekula je molekula nukleové kyseliny, do které může být vložena heterologní nukleová kyselina, a která pak může být vložena do vhodné hostitelské buňky. Vektory výhodně mají jeden nebo více replikačních počátků a jedno nebo více míst, do kterého může být vložena rekombinantní DNA. Vektory často obsahují výhodné prostředky, jejichž pomocí mohou být buňky obsahující vektory odlišeny od buněk, které vektor neobsahují, např. kódují geny rezistence k léčivům. K obvyklým vektorům patří plazmidy, viry a (primárně v kvasinkách a baktériích) tzv. umělé chromozómy.

Plazmidy, obecně označované tomto textu názvem, kterému předchází písmeno malé p, a pak následují zpravidla velká písmena a/nebo čísla, v souladu s mezinárodní konvencí o názvech, jsou odborníkům dobře známy. Plazmidy popsané v tomto textu jsou buďto komerčně dostupné, veřejně dostupné bez omezení nebo mohou být zkonstruovány z dostupných plazmidů rutinní aplikací dobře známých postupů, které byly publikovány. Mnohé plazmidy a další klonovací a expresní vektory, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, jsou odborníkům známy a jsou pro ně snadno dostupné. Navíc odborník snadno může zkonstruovat rutinním postupem libovolný počet dalších plazmidů, které budou vhodné pro použití ve vynálezu. Vlastnosti, konstrukce a použití takových plazmidů, a také dalších vektorů v předkládaném vynálezu je odborníkům jasné z předloženého popisu.

Termín izolovaná znamená, že látka je odstraněna ze svého původní prostředí (např. přírodního prostředí, jestliže se normálně vyskytuje v přírodě). Například v přírodě se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přítomný v žijícím zvířeti není izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo

• fc		• •fcfc	fc	fcfc	fcfc		• fcfcfc
•	«	fc	• fc fc	fc	fc	•	•
•	fc	Λ	fc ·	fc	♦	fc	•
• 1 fc	fc	• · • fc	• fc • fcfc	• fcfc	• • fc	•	• · fcfc

polypeptid, oddělený od některých nebo všech látek, se kterými se v přírodním systému společně vyskytoval, je považován za izolovaný, a to dokonce i v takovém případě, jestliže byl následně znovu vnesen do přírodního systému. Tak izolované polynukleotidy mohou být částí vektoru a/nebo izolované polynukleotidy nebo polypeptidy mohou být části kompozice nebo přípravku, a přitom jde stále o izolované látky, neboť vektor nebo kompozice nejsou přírodním prostředím.

Termín transkripční kontrolní sekvence se týká DNA sekvence, jako například iniciační sekvence, enhancerové (zesilovací) sekvence a promotorové sekvence, které indukují, zesilují, potlačují nebo jinak regulují transkripci sekvence nukleové kyseliny kódující protein, ke které jsou operativně připojeny.

Termíny transkripční kontrolní sekvence Rdcvfl nebo transkripční kontrolní sekvence Rdcvf2 označují jakékoliv z transkripčních kontrolních sekvencí, které se normálně nacházejí asociované se savčím genem Rdcvfl nebo Rdcvf2, výhodně s genem Rdcvf2 v myším nebo humánním genomu.

Termín transkripční kontrolní sekvence jiného než lidského původu se týká jakékoliv transkripční kontrolní sekvence nevyskytující se v humánním genomu.

Termín polypeptid se užívá v tomto textu zaměnitelně s termíny polypeptidy a protein a „proteiny.

Termín chemický derivát polypeptidu podle vynálezu, jak se v tomto textu používá, označuje polypeptid podle vynálezu, který obsahuje další chemické skupiny, které nejsou normálně částí molekuly. Takové skupiny mohou např. zlepšit rozpustnost molekuly, absorpci, biologický poločas apod. Skupiny může alternativně snížit toxicitu molekuly, vyloučit nebo zmírnit nežádoucí vedlejší účinky molekuly apod. Skupiny schopné

zprostředkovat takové účinky byly popsány například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).

Termín neuroprotektivní agens označuje v kontextu předkládaného popisu sloučeninu, která zabraňuje degeneraci neuronových buněk nebo chrání neuronové buňky před degenerací. Podobně retinoprotektivní agens je sloučenina, která zabraňuje degeneraci buněk sítnice (retiny) nebo chrání buňky sítnice před degenerací.

Vynález zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, výhodně DNA molekuly, jako například (1) izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uveden v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 3, (2) izolované molekuly nukleové kyseliny, které obsahují sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s izolovanou DNA uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 3 a (3) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje s (1) nebo (2). Tyto hybridizační podmínky mohou být velmi přísné (vysoká stringence) nebo méně přísné (nízká stringence). V příkladech, kde molekuly nukleové kyseliny jsou deoxyoligonukleotidy (oligos), jsou doporučené vysoce stringentní podmínky naapř. promytí v 6X SSC/0,05% difosforečnan sodný ve 37 °C (pro oligonukleotid sestávající zel4 baží), 48 °C (pro oligo zel7 baží) , 55 °C (pro oligo ze 20 baží) a 60 °C (pro oligo ze 23 baží). Vhodné rozsahy takových stringentních podmínek pro nukleové kyseliny odlišného složení jsou popsány v publikaci: Krause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556 in addition to Maniatis et al.(citováno výše)

Tyto molekuly nukleové kyseliny mohou působit jako antisense molekuly na cílový gen, a jsou použitelné například k regulaci cílového genu a/nebo jako antisense primery v amplifikační reakci sekvence nukleové kyseliny cílového genu. Dále taková sekvence může být použita jako část ribozymu a/nebo trojšroubovicové molekuly, která je také použitelná pro regulaci cílového genu. A dále tyto molekuly mohou být použity jako složky diagnostických postupů, kdy je detekována přítomnost alely RdCVFl nebo RdCVF2, která je příčinou nemoci.

Vynález také zahrnuje (a) vektory, který obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí (tj. sense sekvence) a/nebo k nim komplementárních sekvencí (tj. antisense sekvence), (b) expresní vektory, které obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí operativně spojenou s regulačním prvkem, který řídí expresi kódující sekvence, a (c) geneticky modifkované hostitelské buňky, které obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí operativně spojenou s regulačním prvkem, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Jak se v tomto textu používá, regulační prvky zahrnují, ale bez omezení, indukovatelné a neindukovatelné promotory, enhancery (zesilující elementy), operátory a další elementy řídící a regulující expresi, které jsou odborníkům známy.

Vynález dále zahrnuje fragmenty kterýkoliv sekvencí nukleových kyselin popsaných v tomto textu. Fragmenty úplného („full-length) Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu mohou být použity jako hybridizační sonda pro cDNA knihovnu k izolaci kompletního genu a k izolaci dalších genů, které mají vysokou sekvenční podobnost s Rdcvfl nebo Rdcvf2 gen a podobnou biologickou aktivitu. Sond tohoto typu mají výhodně alespoň 30 bází, a obsahují například přibližně od 30 přibližně 50 bází, přibližně 50 až přibližně 100 bází, přibližně 100 až přibližně 200 bází nebo více než 200 bází (např. 300) . Sonda může také být použita k identifikaci cDNA klonu odpovídajícího kompletnímu transkriptu genomového klonu, nebo klonu, který

obsahuje kompletní Rdcvfl nebo Rdcvf2 gen včetně regulačního a promotorového úseku, exonů a intronů. Příklad screeningu zahrnuje izolaci kódujícího úseku Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu tak, že se použije známá DNA sekvence pro syntézu oligonukleotidové sondy nebo se užije postup s náhodným primerem a izolovaná sekvence popsaná na obrázku 1 až 8. Značené oligonukleotidy mající sekvence komplementární k sekvenci genů podle předkládaného vynálezu se použijí pro screening knihovny humánní cDNA nebo genomové DNA k určení, který individuální klon knihovny hybridizuje se sondou.

Kromě genových sekvencí popsaných výše mohou být identifikovány také orthology těchto sekvencí, které mohou být například přítomny u jiného biologického druhu, a mohou být pak snadno izolovány, rutinními molekulárně biologickými postupy, které jsou známy v oboru, bez nepřiměřeného experimentování. Déle mohou existovat geny v jiných genetických lokusech v genomu, které kódují proteiny, které mají rozsáhlou homologii (homologie) s jednou nebo více doménami genových produktů podle vynálezu. Tyto geny mohou být také identifikovány podobnými postupy. Příklady orthologů nebo homologů jsou poskytnuty na Obr. 8, 10, 11, 12 a 13.

Například izolovaná exprimovaná genová sekvence může být značena a použita ke screeningu cDNA knihovny konstruované z mRNA získané z požadovaného organizmu. Hybridizační podmínky budou s nižší stringencí, když cDNA knihovna byla získána z organizmu odlišného od organizmu, ze kterého pochází značená sekvence. Jinak může být značený fragment použit ke screeningu genomových knihoven pocházejících zpožadovaného organizmu, a sice také s použitím podmínek přiměřeně nízké stringence. Takový podmínky nízké stringence jsou dobře znám odborníkům a předvídatelně se mění v závislosti fylogenezi specifických organizmů, ze kterých byly získány knihovna a značená sekvence. Pro instrukce ohledně volby vhodných podmínek viz například Sambrook et al. (cit. výše).

Dále, dříve neznámá exprimovaná sekvence typu genu může být izolována pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) s použitím dvou degenerovaných oligonukleotidových příměrových poolů navržených na základě aminokyselinové sekvence požadovaného genu. Templát pro reakci může být cDNA získaná reverzní transkripcí z mRNA připravené z buněčné linie nebo tkáně humánního nebo jiného než humánního původu, o které je známo nebo o které se domníváme, že exprimuje homolog nebo sestřihovou variantu.

PCR produkt může být subklonován a sekvencován, aby se zajistilo, že amplifikovaná sekvence představuje sekvenci exprimované genu podobné sekvence nukleové kyseliny. PCR fragment může pak být použit pro izolaci klonu kompletní cDNA celou řadou metod. Například amplifikovaný fragment může být značen a použit pro screening bakteriofágové cDNA knihovny. Alternativně značený fragment může být použit pro screening genomové knihovny.

PCR technika může také být použita k izolaci kompletní cDNA sekvence. Například může být izolována RNA, a sice standardní postupy, z vhodného buněčného nebo tkáňového zdroje. Reverzní transkriptázová reakce může být provedena na RNA s použitím oligonukleotidového primeru specifického pro 5' konec amplifikovaného fragmentu jako očka pro syntézu prvního vlákna. Výsledný RNA/DNA hybrid může pak být dolplněn guaniny s použitím standardní reakce s terminální transferázou, hybrid může být štěpen Rnázou H a syntéza druhého vlákna pak může být zahájena prostřednictvím poly-C primeru jako očka. Takže cDNA sekvence v protisměru („upstream) od amplifikovaného fragmentu může být snadno izolována. Pro přehled klonování • · • · · · · · · ·· · ··· ······

- 20 strategií, které mohou být použit, viz např., Sambrook et al., 1989 (viz výše).

V případy, kdy identifikovaný diferenčně exprimovaný gen je normální gen nebo gen divokého typu, pak tento gen může být použit k izolaci mutantní alely genu. Taková izolace je výhodná u procesů a chorobných stavů, který jsou známy nebo podezřelé tím, že mají genetický základ. Mutantní alely mohou být izolovány z jednotlivců buďto známých nebo podezřelých z toho, že mají genotyp, který přispívá k symptomům onemocnění. Mutantní alely a produkty mutantních alel pak mohou být použity v diagnostických testovacích systémech popsaných níže.

cDNA mutovaného genu může být izolována, například tak, že se použije RT-PCR technika, která je dobře známa odborníkům. V takovém případě první cDNA vlákno může být syntetizováno hybridizací oligo-dT oligonukleotidu (nebo náhodných hexamerů) k mRNA izolované z tkáně známé nebo podezřelý tím, že se exprimuje v jedinci domněle nesoucím mutantní alelu, a dále extenzí nového vlákna reverzní transkriptáou. Druhé vlákno cDNA je pak syntetizováno s použitím oligonukleotidu, který hybridizuje specificky k 5' konci normálního genu (nebo kterýmkoliv jiným známým způsobem). S použitím těchto dvou primerů je pak možné pomocí PCR amplifikovat celý produkt, klonovat do vhodného vektor a podrobit ho DNA sekvenční analýze, a to metodami, které jsou dobře známy odborníkům. Porovnáním DNA sekvence mutovaného genu a normálního genu mohou být zjištěny mutace zodpovědné za ztrátu nebo změnu funkce mutovaného genového produktu.

Alternativně genomová nebo cDNA knihovna mohou být zkonstruovány a podrobeny screeningu s použitím DNA nebo RNA, z tkáně známé nebo podezřelé tím, že exprimuje požadovaný gen u jednotlivce, který domněle nese mutantní alelu. Normální gen knihovny mohou být konstruovány s nebo cDNA syntetizované z tkáně známé požadovaný gen, z jedince, nebo kterýkoliv jeho vhodný fragment může pak být značen a použit jako sonda k identifikaci odpovídající mutantní alely v knihovně. Klon obsahující tento gen pak může být purifikován metodami rutinně užívanými v oboru a pak podroben sekvenční analýze, jak bylo popsáno výše.

A dále, expresní využitím DNA izolované nebo podezřelé tím, že exprimuje který je suspektně nositelem mutanní alely. Tímto způsobem jsou exprimovány genové produkty tvořené v domněle mutantní tkáni a ty mohou bát dále podrobeny screeningu s použitím standardních metod užívajících protilátky vytvořenými proti normálním genovým produktům, jak bude dále popsáno. (Metody screeningu viz např. například Harlow, E. and Lané, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). V případech, kdy mutace vedou produktu se změněnou funkcí (např.

beze smyslu („missense)), soubor polyklonálních protilátek pravděpodobně bude zkříženě reagovat s mutovaným genovým produktem. Klony z knihovny identifikované prostřednictvím jejich reakce s takovými značenými protilátkami mohou být dále purifikovány a podrobeny sekvenční analýze, jak bylo popsáno výše.

k expresi genového v důsledku mutace

Diferenčně exprimované genové produkty zahrnují proteiny kódované nukleotidovými sekvencemi uvedenými jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11 nebo SEKV. ID. Č. 13, konkrétně se jedná o polypeptid, který má nebo obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 nebo jejich fragmenty.

Kromě toho, proteiny, které diferenčně

Substituce exprimované genové produkty zahrnují i představují funkčně rovnocenné genové produkty. Takový ekvivalentní genový produkt může obsahovat delece, adice nebo substituce aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekvenci kódované sekvencí diferenčně exprimovaného genu, popsaného výše, která ale vede k tzv. umlčené změně, takže je produkován funkčně rovnocenný genový produkt (polymorfismy).

může být provedena na základě podobnosti zúčastněných aminokyselinových zbytků v polaritě, náboji, rozpustnosti nebo hydrofóbních, hydrofilních a/nebo amfipatických vlastností a na srovnání s aminokyselinovou sekvencí jiného biologického druhu.

exprimovaný aminokyselin

Například nepolární (hydrofobní) aminokyseliny jsou alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin, polární neutrální aminokyseliny jsou glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin, pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny jsou argínin, lysin a histidin a záporně nabité (kyselé) aminokyseliny jsou asparagová kyselina a glutamová kyselina.

Termín funkčně ekvivalentní jak se v tomto textu používá, označuje protein nebo polypeptid schopný vykazovat v podstatě podobnou in vivo nebo in vitro aktivitu jako endogenní diferenčně expřimovaný genový produkt kódovaný diferenčně exprimovanou genovou sekvencí popsanou výše. Termín funkčně ekvivalentní se týká také proteinů nebo polypeptidů schopných interakce s jinými buněčnými nebo extracelulárními molekulami způsobem podobným, kterým by reagovala odpovídající část endogenního diferenčně exprimovaného genového produktu. Například funkčně ekvivalentní peptid by byl schopný v imunotestu snížit vazbu protilátky k odpovídajícímu peptidu (tj. peptidové aminokyselinové sekvenci, která byla modifikována, aby se endogenního proteinu když protilátka byla nukleové kyseliny sekvence. Metody, získal funkčně ekvivalentní peptid) nebo k endogenní proteinu samotnému, připravena proti odpovídajícímu peptidu endogenního proteinu. Ekvimolární koncentrace funkčně rovnocenného peptidu sníží výše zmíněnou vazbu odpovídajícího peptidu alespoň přibližně o' 5 %, výhodně přibližně o 5 % až 10 %, výhodněji přibližně od 10 % do 25 %, dokonce ještě výhodněji přibližně o 25 % až 50 % a nejvýhodněji přibližně o 40 % až 50 %.

Diferenčně exprimované genové produkty mohou být připraveny užitím technologie rekombinantní DNA, která je odborníkům dobře známa. Takže jsou zde popsány způsoby přípravy polypeptidů a peptidu diferenčně exprimovaných genů podle vynálezu tím, že se exprimující kódující diferenčně exprimované genové které jsou odborníkům známé, mohou být použity ke konstrukci expresních vektorů obsahujících kódující sekvenci genu pro expresi proteinu a vhodné transkripční/translační kontrolní signály. Tyto metody zahrnují, například in vitro rekombinantní DNA techniky, syntetické techniky a in vivo rekombinaci/genetickou rekombinaci. Viz, například techniky popsané v publikaci Sambrook et al., 1989, výše a Ausubel et al., 1989 (cit. Výše). Alternativně RNA nebo cDNA schopná kódovat sekvenci genu pro expresi proteinu mohou být chemicky syntetizovány s použitím například automatických syntetizátorů. Viz například techniky popsané v publikaci Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford, která je zahrnuta formou odkazu.

Celá řada systémů hostitel - expresní vektor může být použita pro expresi kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu podle vynálezu. Takový systém hostitel - expresní vektor představuje vehikulum, jehož prostřednictvím může být • · · · «· · • · • *· ·

- 24 požadovaná sekvence vytvořena a následovně purifikována, ale také představuje buňky, které mohou, když byly transformovány nebo transfekovány vhodnou nukleotidovou kódující sekvencí, in šitu exprimovat protein diferenčně exprimovaného genu podle vynálezu. Patří k nim, ale bez omezení, mikroorganizmy jako například baktérie (např. E. coli, B. subtilis) transformované rekombinantním bakteriofágovým, plazmidovým nebo kozmidovým DNA expresním vektorem, který obsahuje kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, kvasinky (např. Saccharomyces, Pichia) transformované rekombinantním kvasinkovým expresním vektorem obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, systémy hmyzích buněk infikovaných rekombinantním virovým expresním vektorem (např. bakulovirus) obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, systémy rostlinných buněk infikovaných rekombinantním virovým expresním vektorem (např. virus mozaiky květáku, CaMV, virus mozaiky tabáku, TMV) nebo transformované rekombinantním plazmidovým transformačním vektorem (např. Ti plazmid) obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu nebo systémy savčích buněk (např. buňky COS, CHO, BHK, 293, 3T3) nesoucí rekombinantní expresní konstrukty obsahující promotory pocházející z genomu savčích buněk (např., metalothioneinový promotor) nebo ze savčích virů (např. adenovirový pozdní promotor, 7,5K promotor viru vakcínie, promotor časných genů cytomegaloviru).

Exprese polypeptidů RDCVF1 nebo RDCVF2 buňkou z genu Rdcvfl nebo Rdcvf2, který je pro buňku nativní, může být také realizována. Metody vhodné pro takovou expresi byly popsány např. v patentech USA č. 5,641,670, 5,733,761, 5,968,502 a 5,994,127, které jsou výslovně zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Buňky, které byly indukovány k expresi RDCVF1 nebo RDCVF2 metodami podle kteréhokoliv z patentů USA č. 5,641,670, ···· · · · · · · · ·· 99 999 99 99 ··

5,733,761, 5,968,502 a 5,994,127, mohou být implantovány do požadované tkáně v žijícím zvířeti, aby se zvýšila lokální koncentraci RDCVF1 nebo RDCVF2 v tkáni.

V bakteriálních systémech lze výhodně vybrat celou řadu expresních vektorů pro expresi proteinu diferenčně exprimovaného genu v závislosti na zamýšleném použití. Například když má být produkováno velké množství takového proteinu, pro přípravu protilátek nebo screening peptidových knihoven, jsou výhodné například vektory, které regulují vysokou hladinu exprese fúzních proteinových produktů. K takovým vektorům patří, ale bez omezení, E. coli expresní vektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), ve kterém sekvence kódující protein diferenčně exprimovaného genu může být ligována individuálně do vektoru ve shodném čtecím rámci s kódujícím úsekem lacZ takže se vytvoří fúzní protein, pIN vektory (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:31013109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:55035509). Mohou také být použity PGEX vektory exprimující cizorodé polypeptidy jako fúzní proteiny s glutathion-Stransferázou (GST). Obecně, takové fúzní proteiny jsou rozpustné a mohou být snadno purifikovány z lyžovaných buněk adsorpcí na glutathion-sefarózové perličky následovanou elucí za přítomnosti volného glutathionu. PGEX vektory jsou navrženy tak, že obsahují štěpná místa trombinu nebo proteázy faktoru Xa, takže protein klonovaného cílového genu může být odštěpen od GST skupiny s použitím uvedených endopeptidáz.

Promotorové úseky mohou být vybrány z kterýkoliv požadovaných genů použitím vektorů, které obsahují reportérovou transkripční jednotku postrádající promotorový úsek, jako například chloramfenikolacetyltransferázovou (CAT) nebo luciferázovou transkripční jednotku, po směru („downstream) od restrikčního místa nebo místa pro vložení •0 0000 0 0 0 0 0 0

0 0 0 00 00 zkoumaného promotorového fragmentu, tj. fragmentu, který může obsahovat promotor. Jak je dobře známo, vložení promotoru obsahujícího fragmentu do restrikčního místa vektoru v protisměru od CAT nebo luciferázového genu vede k produkci CAT nebo luciferázové aktivity, které mohou být detekovány standardními CAT testy nebo luminometry. Vektory vhodné pro tento účel jsou dobře známy a jsou snadno dostupné. Tři příklady takových vektorů jsou pKK232-8, pCM7 a pGL3 (Promega, E1751, Genebank č. u47295). Takže promotory pro expresi polynukleotidů podle předkládaného vynálezu zahrnují nejen známé a snadno dostupné promotory, ale také promotory, které mohou být získány výše popsaným způsobem užitím testu s reportérovým genem.

Ke známým bakteriálním promotorům vhodným k expresi polynukleotidů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu patří E. coli láci a lacZ promotory, T3 a T7 promotory, T5 tac promotor a promotory lambda PR, PL a trp. Mezi známé eukaryotické promotory vhodné v tomto směru patří CMV bezprostředně časný promotor, promotor thymidinkinázy z HSV, časný a pozdní promotor z SV40, promotory z retrovirových LTR, jako například viru Rousova sarkomu (RSV) a metalothioneinové promotory, jako například myší promotor metalothionein-I.

V hmyzích systémech, virus polyhedrose jádra (AcNPV) z Autographa californica je jeden z několika hmyzích systémů, které mohou být použity jako vektory pro expresi cizorodých genů. Virus se množí v buňkách Spodoptera frugiperda. Kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu může být klonována individuálně do neesenciálních úseku (například gen polyhedrinu) viru a vložen pod kontrolu AcNPV promotor (například promotor polyhedrinu). Úspěšná inzerce kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu povede k inaktivaci polyhedrinového genu a produkci neobaleného rekombinantního ·« 9999

9999

9

- 27 viru (tj . viru postrádajícího proteinový obal kódovaný gene pro polyhedrin). Tyto rekombinantní viry jsou pak použity k infekci buněk Spodoptera frugiperda, ve kterých je pak vložený gen exprimován. (např. viz Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent 4,215,051).

V savčích hostitelských buňkách může být použita také celá řada expresních systémů založených na virech. V případech, kdy je užit adenovirus jako expresní vektor, kódující sekvence požadovaného diferenčně exprimovaného genu může být ligována k adenovirovému kontrolnímu komplexu transkripce/translace, jako je např. pozdní promotor a tripartitní vedoucí sekvence. Tento chimérický gen pak může být vložen do adenovirového genomu rekombinací in vitro nebo in vivo. Inzerce do neesenciálního úseku virového genomu (např. úsek El nebo E3) poskytne rekombinantní virus, který je životaschopný a je schopný exprimovat protein diferenčně exprimovaného genu v infikované hostitelské buňce (např., Viz Logan & Shenk, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Specifické iniciační signály mohou být požadovány pro účinnou translaci vložené kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu. Tyto signály zahrnují ATG iniciační kodon a přilehlé sekvence. V případech, kdy celý diferenčně exprimovaný gen, včetně jeho vlastního iniciačního kodonu a přilehlých sekvencí, je vložen do vhodného expresního vektoru, žádný další translační kontrolní signál již není potřeba. Nicméně v případě, kdy je vložena jen část kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu, exogenní translační kontrolní signál, případně včetně ATG iniciačního kodonu, musí být poskytnut. Kromě toho, iniciační kodon musí být ve fázi s čtecím rámcem požadované kódující sekvence, aby se zajistila translace celého inzertu. Tyto exogenní translační kontrolní signály (Kozackovy sekvence) a iniciační kodony mohou pocházet z různých zdrojů, »· ··»· » · · 4

99 jak přírodního tak i syntetického původu. Účinnost exprese může být zesílena vložením vhodného enhanceru transkripce, terminátoru transkripce apod. (viz Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Selekce vhodných vektorů a promotorů pro expresi v hostitelské buňce je dobře známým postupem a potřebné postupy pro konstrukci expresního vektoru, zavedení vektoru do hostitele a expresi v hostiteli jsou rutinními postupy, které jsou v oboru známy.

Obecně, rekombinantní expresní vektory obsahují počátek replikace, promotor pocházející z genu s vysokou hladinou exprese pro řízení transkripce po směru („downstream) ležícího strukturálního genu a volitelně selekční markér umožňující po kontaktování buněk a vektoru izolaci buněk, které obsahují vektor.

Kromě toho může být vybrán i hostitelský buněčný kmen, který moduluje expresi vložené sekvence nebo modifikuje a zpracovává genový produkt specifickým způsobem. Takové modifikace (např. glykosylace) a opracování (např. štěpení) proteinových produktů mohou být důležitými faktory pro funkce proteinu. Různé hostitelské buňky mají charakteristické a specifický mechanismy pro posttranslační opracování a modifikace proteinů. Vhodný buněčné linie nebo hostitelské systémy mohou být zvoleny, aby se zajistila správná modifikace a opracování exprimovaného cizorodého proteinu. Pro tento účel mohou být použity eukaryotické hostitelské buňky, které mají vlastní buněčný aparát pro správné opracování primárního transkriptu, glykosylaci a fosforylací genového produktu. Takové savčí hostitelské buňky jsou, ale bez omezení, buňky CHO, VĚRO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 apod.

Pro dlouhodobou produkci rekombinantního proteinu s vysokým výtěžkem je výhodná stabilní exprese. Například může ·· ··· · ·· ·»» ·

- 29 být geneticky zkonstruována buněčná linie, která trvale exprimuje diferenčně exprimovaný protein. Spíše než expresními vektory, které obsahují virový počátek replikace, hostitelské buňky mohou být transformovány DNA řízenou vhodnými expresními kontrolními prvky (jako je např. promotor, enhancer, sekvence, transkripce terminátory, polyadenylace místa apod.) a obsahující selekční markér. Po vložení cizí DNA se geneticky upravené buňky ponechají růst po dobu 1-2 dny v obohacených médiích a pak jsou přeneseny do selektivního média. Selekční markér v rekombinantním plazmidu poskytne rezistenci k selekci a umožní, aby buňky, které trvale inkorporovaly plazmid do chromozómů, rostly za vzniku „fokusů, které mohou být klonovány a pak namnoženy do buněčné linie. Tento způsob může výhodně být použit ke genové manipulaci buněčné linie, která exprimuje diferenčně exprimovaný protein. Taková geneticky upravená buněčná linie může být konkrétně použitelná pro screening a hodnocení sloučenin, které ovlivňují endogenní aktivitu diferenčně exprimovaných proteinů. Takové stabilní buněčné linie mohou být použity přímo jako prostředek buněčné terapie přímo nebo po obalení.

Může být použita celá řada selekčních systémů, jako je např. (aniž by výčet byl omezující) thymidin kináza viru herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáza (Szybalska & Szybalski, 1962, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026), adeninfosforibosyltransferáza (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817), které mohou být užity v buňkách tk, hgprt nebo aprť , v daném pořadí. Také rezistence k antimetabolitům může být použita jako základ selekce na dhfr, který udělí rezistenci k methotrexatu (Wigler, et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527), gpt, který udělí rezistenci k mykofenolové kyselině

• «	• •	• •	* • · · • ·	··	•		·♦· · • •
« •	• •
«	♦	« ·	• ·		•	•	•	• ·
• a			·· ·	4«		··		♦ ·

(Mulligan & Berg, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072), neo, který udělí rezistenci k aminoglykosidu G-418 (ColberreGarapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) a hygro, který udělí rezistenci k hygromycinu (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147) .

Alternativní systém fúzních proteinů umožňuje rychlou purifikací nedenaturovaného fúzního proteinu exprimovaného v humánní buněčné linii (Janknecht, et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). V tomto systému je požadovaný gen subklonován do rekombinantního plazmidu vakcínie, takže otevřený čtecí rámec genu je translačně fúzován k aminokoncové „značce, kterou tvoří šest histidinových zbytků. Extrakty z buněk infikovaných rekombinantním virem vakcínie jsou pak naneseny na kolony s Ni²⁺ nitrilooctovou kyselinouagarosou a histidinem značené proteiny jsou pak selektivně eluována imidazol-obsahujícím pufrem.

Když se použijí jako složky v testovacích systémech, jako například popsaných dále, diferenčně exprimovaný protein může být označen, buď přímo nebo nepřímo, pro usnadnění detekce komplexu vytvořeného mezi diferenčně exprimovaným proteinem a testovací látkou. Kterýkoliv z celé řady značících systémů může být použit, včetně (bez omezení) radioizotopů, jako je například ¹²⁵I, enzymatických značících systémů, které vytvářejí detekovatelný kolorimetrický signál nebo světlo, když jsou exponovány k substrátu, a fluorescenční značky.

Když je užita technologie rekombinantní DNA k produkci diferenčně exprimovaného proteinu pro takové testovací systémy, může být výhodné zkonstruovat fúzní proteiny, které usnadňují značení, imobilizaci a/nebo detekci.

Nepřímé značení zahrnuje použití proteinu, jako například značené protilátky, který se specificky váže k produktu diferenčně exprimovného genu. Takové protilátky zahrnují, ale

• fc		fcfcfcfc	•	fcfc	··		• fcfcfc
fc	fc	fc	fcfc ·	fc	•	•	fc
•	•	fc	fc fc	•	fc	fc	fc
• • fc	•	fc fc • >	• fc • fcfc	• fcfc	• • fc	•	• fc fcfc

bez omezení, polyklonální, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty vytvořené z Fab expresní monoklonální fragmenty knihovny.

chimérické, protilátek a

V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny obsahující sekvence kódující protein RDCVFl nebo RDCVF2 nebo jeho funkční derivát jsou podávány, aby podporovaly funkci čípků, metodami genové terapie. Genová terapie se týká prováděné podáváním nukleové provedení vynálezu nukleová protein, který zprostředkuje podporuje funkce čípků.

a sice terapie V tomto kódovaný tím, že kyseliny pacientovi, kyselina produkuje terapeutický účinek

Kterákoliv z dostupných metod genové terapie může být použita pro realizaci předkládaného vynálezu. Příklady metod jsou popsány dále.

Ve výhodném aspektu léčivý přípravek obsahuje nukleovou kyselinu Rdcvfl nebo Rdcvf2, který je částí expresního vektoru, který exprimuje protein RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jeho fragment nebo jeho chimérický protein ve vhodném hostiteli. Konkrétně tato nukleová kyselina má promotor operativně spojený s Rdcvfl nebo Rdcvf2 kódujícím úsekem, přičemž promotor je indukovatelný nebo konstitutivní, a volitelně tkáňově specifický. V dalším konkrétním provedení je použita molekula nukleové kyseliny, kde Rdcvfl nebo Rdcvf2 kódující sekvence a jakákoliv jiná požadovaná sekvence jsou obklopeny oblastmi, které podporují homologní rekombinaci v požadovaném místě genomu, takže dochází k intrachromozomové expresi nukleové kyseliny Rdcvfl nebo Rdcvf2 (Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342:435-438).

Podání nukleové kyseliny pacientovi může být buďto přímé, v takovém případě je pacient přímo exponován nukleové kyselině nebo vektoru nesoucímu nukleovou kyselinu, nebo nepřímé, v takovém případě jsou nejdříve buňky transformovány nukleovou kyselinou in vitro a pak jsou transplantovány pacientovi. Tyto dva přístupy jsou známy, v daném pořadí, jako in vivo nebo ex vivo genová terapie.

Ve specifickém provedení nukleová kyselina je přímo podávána in vivo, kde je exprimována za vzniku kódovaného produktu. Tento postup může být uskutečněn kteroukoliv z četných metod známých v oboru, např. tak, že se nukleová kyselina vloží jako část vhodného expresního vektoru a podá se tak, že se stane intracelulární složkou, např. infekcí s použitím defektního nebo atenuovaného (oslabeného) retrovirového nebo jiného viru (adenovirus, adeno-asociovaný virus, lentivirus) (viz např. patent USA č. 4,980, 286 a další, citované výše) , nebo přímým vstřikem holé DNA nebo použitím ostřelování mikročásticeni (např. genová „puška, Biolistic, Dupont) nebo potaženou lipidy nebo receptory buněčného povrch nebo transfekčními činidly, obalenou v lipozomech, v mikročásticích nebo mikrotobolkách, nebo navázanou na peptid, o kterém je známo, že vstupuje do jádra, nebo navázanou k ligandu, který pak podléhá receptoremzprostředkované endocytóze (viz např. patenty USA č. 5,166,320, 5,728,399, 5,874,297 a 6,030,954, které jsou zahrnuty formou odkazu), kterýžto postup může být použit k cílení na buněčné typy specificky exprimující receptory, apod. V dalším provedení mohou být vytvořeny komplexy nukleová kyselina - ligand, ve kterých ligand obsahuje fusogenní virový peptid pro narušení endosomů, což dovolí nukleové kyselině vyhnout se lysosomální degradaci. V ještě dalším provedení nukleová kyselina může být zaměřena in vivo pro buněčně specifický příjem a expresi, cílením na specifický receptor (viz např. PCT Publikace WO 92/06180/, WO 92/22635/, WO92/20316, WO93/14188 a WO 93/20221/). Alternativně nukleová kyselina může být vložena intracelulárně a vnesena do DNA hostitelské buňky pro expresi homologní rekombinací (viz např. patenty USA č. 5,413,923; 5,416,260; a 5,574,205; a Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342:435-438).

Ve specifickém provedení je použit virový vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu Rdcvfl nebo Rdcvf2. Například může být použit retrovirový vektor (viz např. patenty USA č. 5,219,740, 5,604,090 a 5,834,182). Tyto retrovirové vektory byly modifikovány odstraněním retrovirových sekvencí, které nejsou nutné pro sbalení virového genomu a integraci do DNA hostitelské buňky. Nukleová kyselina Rdcvfl nebo Rdcvf2 pro použití v genová terapii je klonována do vektoru, který usnadní aplikaci genu do pacienta.

Adenoviry jsou další virové vektory, které mohou být použity v genové terapii. Adenoviry jsou obzvláště atraktivní vehikula pro přenos genů do respiračního epitelu. Adenoviry přirozeně infikují respirační epitel, kde způsobují mírná onemocnění. Dalším cílem pro aplikační systémy založené na adenovirech jsou játra, centrální nervový systém, endotelové buňky a sval. Adenoviry mají výhodu, že jsou schopny infikovat nedělící se buňky. Metody použití adenovirů v genové terapii jsou popsány např. v patentech USA č. 5,824,544, 5,868,040,

5,871,722, 5,880,102, 5,882,877, 5,885,808, 5,932,210,

5,981,225, 5,994,106, 5,994,132, 5,994,134, 6,001,557 a

6,033,8843, které jsou zahrnuty formou odkazu.

Adeno-asociované viry (AAV) byly také navrženy pro použití v genové terapii. Adeno-asociované viry jsou obzvláště atraktivní vehikula pro přenos genů do sítnice. Metody využívající AAV jsou popsány např. patentech USA č. 5,173,414,

5,252,479, 5,552,311, 5,658,785, 5,763,416, 5,773,289, 5,843,742, 5,869,040, 5,942,496 a 5,948,675, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.

Další přístup v genové terapii zahrnuje přenos genu do buněk ve tkáňové kultuře takovými metodami jako je elektroporace, lipofekce, transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým nebo virovou infekcí. Obvykle způsob přenosu zahrnuje také přenos selekčního markéru do buněk. Buňky jsou pak umístěný pod selekční tlak, aby byly izolovány ty buňky, které přijaly a exprimují přenesený gen. Tyto buňky jsou pak podány pacientovi přímo nebo po obalení.

V tomto provedení je nukleová kyselina vnesena do buňky před podáním in vivo výsledné rekombinantní buňky. Toto vnesení může být provedeno jakýmkoliv způsobem známým v oboru, který zahrnuje, avšak bez omezení, transfekci, elektroporaci, microinjekci, infekci virovým nebo bakteriofágovým vektorem obsahujícím požadovanou sekvenci nukleové kyseliny, buněčnou fúzí, chromozomem zprostředkovaným přenosem genu, mikrobuňkou zprostředkovaným přenosem genu, fúzí sferoplastů apod. Pro vnášení cizorodých genů do buněk jsou znám četné techniky a mohou být využity při realizaci předkládaného vynálezu, za předpokladu, že nebudou narušeny nutné vývojové a fyziologické funkce příjemce buňky. Použitý postup by měl zajistit stabilní přenos nukleové kyseliny do buňky, aby nukleová kyselina mohla být v buňce exprimována a výhodně dědičná a exprimovatelná i v buněčném potomstvu.

Výsledné rekombinantní buňky mohou být podávány pacientům různými metodami známými v oboru. Ve výhodném provedení epiteliální buňky jsou injikovány, např. subkutánně. V dalším provedení rekombinantní kožní buňky mohou být použity jako kožní štěp (transplantát) u pacienta. Rekombinantní krvinky (např. hematopoetické kmenové buňky nebo progenitorové buňky)

jsou výhodně podávány intravenózně. Množství použitých buněk v genové terapii závisí na žádaném efektu, stavu pacienta a dalších faktorech, a může být odborníkem rutinně stanoveno.

Buňky, do kterých se může vnášet molekula nukleové kyseliny pro účely genové terapie, jsou jakékoliv požadované buňky, např. (aniž by výčet byl omezující) epitelové buňky, endotelové buňky, keratinocyty, fibroblasty, svalové buňky, hepatocyty, krevní buňky jako jsou T lymfocyty, B lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofily, eosinofily, megakaryocyty, granulocyty, různé kmenové a progenitorové buňky, zejména hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, které jsou např. získány z kostní dřeně, pupečníkové krve, periferní krve, fetálních jater apod.

V provedení, kdy jsou v genové terapii použity rekombinantní buňky, Rdcvfl nebo Rdcvf2 nukleová kyselina je zavedena do buněk tak, že je exprimována buňkami nebo jejich potomstvem a rekombinantní buňky jsou pak podávány in vivo pro dosažení terapeutického účinku. Ve specifickém provedení jsou použity kmenové nebo progenitorové buňky. Kterékoliv kmenové a/nebo progenitorové buňky, které mohou být izolovány a udržovaný in vitro, mohou být potenciálně použity v souladu s tímto provedením podle předkládaného vynálezu. Takové kmenové buňky zahrnují, ale bez omezení, hemopoetické kmenové buňky (HSC), kmenové buňky epitelových tkání, jako je například kůže a epitel střev, embryonální srdeční svalové buňky, jaterní kmenové buňky (viz např. WO 94/08598) a nervové kmenové buňky (Stemple a Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

Epitelové kmenové buňky (ESC) nebo keratinocyty mohou být získány z tkání, jako je například kůže a epitel střev, známými postupy (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). Ve vrstevntaé epitelové tkáni, jako je například kůže, obnova nastává mitózou kmenových buněk v germinativní vrstvě, vrstva

- 36 nejbližší lamina basalis. Kmenové buňky ve střevním epitelu zajišťují rychlé tempo obnovy této tkáně. ESC nebo keratinocyty získané z kůže nebo střevního epitelu pacienta nebo dárce mohou být pěstovány ve tkáňové kultuře (Pittelkow a Scott, 1986, Mayo Clinic Proč. 61:771). Jestliže ESC jsou poskytnuty dárcem, může také být použit nějaký způsob suprese reakce štěpu proti hostiteli (např. ozáření, podávání léčiv nebo protilátek pro podporu mírné imunosuprese) . Kmenové buňky sítnice byly také popsány (Tropepe et al., 2000, Science, 287: 2032) .

Co se týká hemopoetických kmenových buněk (HSC), kterákoliv technika, která zajistí izolaci, rozmnožování a udržování HSC in vitro, může být použita v tomto provedení vynálezu. Techniky, kterými to může být uskutečněno, zahrnují (a) izolaci a založení HSC kultur z buněk kostní dřeně izolovaných z budoucího hostitele nebo dárce nebo (b) použití dříve založených dlouhodobých HSC kultur, které mohou být alogenní nebo xenogenní. Neautologní HSC jsou použity výhodně ve spojení se způsobem suprese transplantačních imunitních reakcí budoucího hostitele/pacienta. V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu humánní buňky kostní dřeně mohou být získány z hřebene zadní kosti kyčelní aspirací jehlou (viz např. Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu, HSCS mohou být ve vysoce obohacené nebo v podstatě v čisté formě. Toto obohacení může být uskutečněno před dlouhodobou kultivací, během kultivace nebo po ní a může být prováděno kteroukoliv technikou v oboru známou. Dlouhodobé kultivace buněk kostní dřeně mohou být založeny a udržovány například s použitím modifikovaných technik pro tkáňové kultury podle Dextera (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335) nebo technikami pro tkáňové kultury podle Witlocka a Witteho (Witlock a Witte,

1982, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:3608-3612).

Ve specifickém provedení nukleová kyselina, která HAS být zavedena pro účely genové terapie, obsahuje indukovatelný promotor operativně spojený s kódujícím úsekem tak, že exprese nukleové kyseliny je kontrolovatelná řízením přítomnosti nebo nepřítomnosti vhodného induktoru transkripce.

Takové protilátky mohou polyklonální protilátky,

V tomto textu jsou popsány způsoby produkce protilátek schopných specificky rozpoznávat jeden nebo více diferenčně exprimovaných genových epitopů.

zahrnovat, ale bez omezení, monoklonální protilátky (mAb), humanizované nebo chimérické protilátky, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty, F(ab’)₂ fragmenty, fragmenty vytvářené Fab expresní knihovnou, antiidiotypové (anti-Id) protilátky a fragmenty vázající epitop kterékoliv výše uvedené protilátky. Takové protilátky mohou být použity například pro detekci „otisku prstů, cílového genu v biologickém vzorku nebo alternativně jako způsob inhibice abnormální aktivity cílového genu. Tyto protilátky tedy mohou být použity jako součást léčebných způsobů nemocí a/nebo mohou být použity jako součást diagnostických technik, přičemž pacienti mohou být testováni na abnormální hladiny Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo na přítomnost abnormálních forem Rdcvfl nebo Rdcvf2 odběrem vzorků komorové vody a/nebo sklivce metodami známými odborníky v v oboru (např. Forster, RK, Abbott, RL, Gelender, H., 1980, Management endophthalmitis Ophthalmology 87,313-319)].

of infectious

Pro produkci protilátek k diferenčně exprimovanému genu mohou být různá hostitelská zvířata imunizována injekcí diferenčně exprimovaného proteinu nebo jeho částí nebo DNA imunizací. Taková hostitelská zvířata mohou zahrnovat, ale bez omezení, králíky, myši a laboratorní potkany, aby byla

jmenována alespoň některá. Pro zesílení imunologické reakce mohou být použita různá adjuvancia, v závislosti na druhu hostitele, zahrnující bez omezení včetně Freundovo adjuvans (kompletní a nekompletní), minerální gely, jako je například hydroxid hlinitý, povrchově účinné látky, jako je například lysolecitin, polyoly typu „pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemokyanin přílipky, dinitrofenol a potenciálně použitelná humánní adjuvancia, jako je například BCG (bacil Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populací protilátkových molekul pocházejících ze séra zvířat imunizovaných antigenem, jako je například produkt cílového genu nebo jeho antigenní funkční derivát. Pro produkci polyklonálních protilátek mohou být hostitelská zvířata, jako jsou například ta popsaná výše, imunizována injekcí diferenčně exprimovaného genového produktu doplněného adjuvancii, jak také bylo popsáno výše.

Monoklonální protilátky, které jsou homogenní populací protilátek ke konkrétnímu antigenu, mohou být získány kteroukoliv technikou, která zajistí produkci protilátkových molekul kontinuální buněčnou linií v kultuře. Ty zahrnují, ale bez omezení, techniku hybridomu podle autorů Kohler a Milstein, (1975, Nátuře 256:495-497, a patent Spojených Států č. 4 376 110), techniku hybridomu humánních B lymfocytů (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72, Cole et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) a techniku EBV hybridomu (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., s. 77-96). Takové protilátky mohou být kterékoliv třídy imunoglobulinů včetně IgG, IgM, IgE, IgA, IgD a kterékoliv její podtřídy. Hybridom produkující mAb podle tohoto vynálezu může být kultivován in vitro nebo in

vivo. Produkce vysokých titrů mAb in vivo činí z této metody v současnosti výhodný způsob produkce.

Kromě toho mohou být použity techniky vyvinuté pro produkci chimérických protilátek (Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, Nátuře, 312:604-608, Takeda et al., 1985, Nátuře, 314:452-454) sestřihem genů z myší protilátkové molekuly vhodné antigenní specifity společně s geny z humánní protilátkové molekuly vhodné biologické aktivity. Chimérická protilátka je molekula, ve které odlišné části pocházejí z různých živočišných druhů, jako jsou například protilátky, které mají variabilní nebo hypervariabilní úsek pocházející z myší mAb a konstantní úsek z humánního imunoglobulinu.

Alternativně, techniky popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (patent Spojených Států č. 4 946 778, Bird, 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, a Ward et al., 1989, Nátuře 334:544-546) mohou být přizpůsobeny pro přípravu jednořetězcových protilátek k diferenčně exprimovaným genům. Jednořetězcové protilátky jsou vytvářeny spojením fragmentů těžkého a lehkého řetězce Fv úseku prostřednictvím aminokyselinového můstku, což HAS za následek jednořetězcový polypeptid.

Nejvýhodněji mohou být techniky použitelné pro produkci humanizovaných protilátek přizpůsobeny tak, aby produkovaly protilátky k polypeptidům, fragmentům, derivátům a funkčním ekvivalentům popsaným v tomto textu.

popsány v patentech Spojených Států č

693	761,	5 585	089, 5 530 101,	5 910 771
625	126,	5 633	425, 5 789 650, 5	545 580,
770	429,	popis	každého z nich je	zahrnut

661 016

Takové techniky jsou 5 932 448, 5 693 762,

569 825, formou odkazu ve své celistvosti.

• · · ·

- 40 Protilátkové fragmenty, které rozpoznávají specifické epitopy, mohou být tvořeny fragmenty například zahrnují, fragmenty, které mohou být známými technikami ale bez omezení, : tvořeny štěpením

Takové

F(ab’)_z pepsinem protilátkové molekula a Fab fragmenty, které mohou být tvořeny redukcí disulfidových můstků F(ab')₂ fragmentů. Alternativně, mohou být konstruovány Fab expresní knihovny (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), aby se umožnila rychlá a snadná identifikace monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specifitou.

Pro snadnost detekce je obzvláště výhodný test typu sendviče, jehož existuje velké množství variací, předpokládá se, že každá z nich je zahrnována předkládaným vynálezem.

Například v typickém přímém testu je neznačená protilátka imobilizována na pevném substrátu a testovaný vzorek je přiveden do kontaktu s navázanou molekulou. Po vhodné době inkubace, po časové období dostatečné pro to, aby se umožnila tvorba binárního komplexu protilátka-antigen, v tomto bodě je pak přidána druhá protilátka, značená reportérovou molekulou schopnou indukovat detekovatelný signál, a je inkubována po dobu dostatečnou pro umožnění tvorby trojitého komplexu protilátka-antigen-značená protilátka. Všechna nezreagovaná látka je odmyta a přítomnost antigenu je určena pozorováním signálu nebo může být kvantifikována srovnáním s kontrolním vzorkem obsahujícím známá množství antigenu. Variace přímého testu zahrnují simultánní test, kdy jsou jak vzorek tak protilátka přidány současně k vazebné protilátce nebo reverzní test, ve kterém je značená protilátka a testovaný vzorek nejprve spojeny, inkubovány a přidány k neznačené povrchově vázané protilátce. Tyto techniky jsou odborníkům dobře známy a možnost menších variací je snadno patrná. Je zamýšleno, že termín sendvičový test, jak se v tomto textu používá,

zahrnuje všechny variace základní „dvoumístné techniky. Co se týče imunotestů podle předkládaného vynálezu, jediný limitující faktor je, že neznačené a značené protilátky jsou RdCVFl- nebo RdCVF2-specifická protilátka.

Nejběžněji používané reportérové molekuly v tomto typu testu jsou buď enzymy nebo molekuly obsahující fluorofor či radionuklid. V případě enzymového imunotestu je enzym konjugován ke druhé protilátce, obvykle pomocí glutaraldehydu nebo jodistanu. Nicméně, jak lze snadno připustit, existuje celá řada různých technik ligace, které jsou odborníkovi známy. Běžně používané enzymy zahrnují křenovou peroxidázu, glukózooxidázu, β-galaktosidázu a alkalickou fosfatázu, mimo jiné. Substráty, které se používají se specifickými enzymy, jsou všeobecně vybírány podle tvorby detekovatelných změn barev při hydrolýze odpovídajícím enzymem. Například pnitrofenylfosfát je vhodné použít pro konjugáty s alkalickou fosfatázou, pro konjugáty s peroxidázou je obecně používán 1,2-fenylendiamin nebo toluidin. Je také možné používat fluorogenní substráty, které poskytují fluorescenční produkt, spíše než chromogenní substráty uvedené výše. Roztok obsahující vhodný substrát je pak přidán k trojitému komplexu protilátka-RdCVFl- nebo RdCVF2-značená protilátka. Substrát reaguje s enzymem spojeným s druhou protilátkou za vzniku kvalitativního vizuálního signálu, který může být dále kvantifikován, obvykle spektrofotometricky, za poskytnutí vyhodnocení množství Rdcvfl nebo Rdcvf2, které je přítomné ve vzorku séra.

Alternativně mohou být fluorescenční sloučeniny, jako je například fluorescein a rodamin, chemicky kondenzovány k protilátkám bez změny jejich vazebné kapacity. Když jsou aktivovány ozářením světlem konkrétní vlnové délky, fluorchromem značená protilátka pohlcuje světelnou energii,

• Φ • •	·««»	·· · ·	·· ··· · • · 9
• •	• •
•	«	• ·	• · ·	• · · »
*«		* Φ	♦ · · » ·	»9 9 9

indukuje stav excitability v molekule, následovaný emisí světla v charakteristické delší vlnové délce. Emise se jeví jako charakteristická barva vizuálně detekovatelná světelným mikroskopem. Imunofluorescenční techniky a EIA techniky jsou obě dobře zavedené v oboru a jsou obzvláště výhodné pro předkládaný způsob. Nicméně mohou také být použity další reportérové molekuly, jako jsou například radioizotopy, chemiluminescenční nebo bioluminescenční molekuly. Odborníkovi je ihned zjevné, jak lze měnit postup tak, aby byl vhodný pro požadované použití.

Tento vynález se také týká použití polynukleotidů podle předkládaného vynálezu jako diagnostických reagencií. Detekce mutované formy genu kódující polypeptid vybraný ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14, která je spojována s dysfunkcí, bude poskytovat diagnostický nástroj, který se může přidat k diagnostice onemocnění nebo může definovat nemoc nebo vnímavost na onemocnění, které je důsledkem nízké exprese, nadměrné exprese nebo změněné prostorové nebo časové exprese genu. Jednotlivci nesoucí mutace v genu mohou být detekováni na úrovni DNA celou řadou technik.

Nukleové kyseliny pro diagnostiku mohou být získány z buněk pacienta, jako například z krve, moči, slin, tkáňové biopsie nebo pitevního materiálu. Genomová DNA může být použita přímo pro detekci nebo může být amplifikována enzymaticky s použitím PCR nebo jiné amplifikační techniky před analýzou. Podobným způsobem mohou také být použity RNA nebo cDNA. Delece a inzerce mohou být detekovány změnou velikosti amplifikovaného produktu ve srovnání s normálním genotypem. Bodové mutace mohou být identifikovány hybridizaci amplifikované DNA ke značeným nukleotidovým sekvencím.

·· ····

- 43 Dokonale komplementární srovnané sekvence mohou být odlišeny od nesouhlasných duplexů štěpením RNázou nebo rozdíly v teplotách tání. Rozdíly DNA sekvence mohou také být detekována změnami elektroforetické pohyblivosti DNA fragmentů na gelech, buď s denaturačními činidly nebo bez nich (SSCP) nebo přímým sekvencováním DNA (např. Myers et al., Science, 1985, 230:1242). Změny sekvence ve specifické lokalizaci mohou také být odhaleny nukleázovými protekčními testy, jako je například protekce před RNázou a Sl, nebo metodou chemického štěpení (viz Cotton et al., Proč Nati Acad Sci USA, 1985, 85: 4397-4401). V dalším provedení může být konstruována matice oligonukleotidových sond obsahující Rdcvfl nebo Rdcvf2 nukleotidovou sekvenci nebo její fragmenty pro provádění účinného screeningu např. genetických mutací. Technologické metody používající matice jsou známy a mají obecnou použitelnost a mohou být použity pro řešení celé řady otázek molekulární genetiky, včetně genové exprese, genetické vazby a genetické variability (viz například: M. Chee et al., Science, díl 274, s. 610-613, 1996).

Diagnostické testy nabízejí postup diagnostiky nebo určování vnímavosti na onemocnění prostřednictvím detekce mutace Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu popsanými metodami. Kromě toho tyto nemoci mohou být diagnostikovány metodami zahrnujícími zjišťování abnormální exprese Rdcvfl nebo Rdcvf2 ve vzorku pocházejícím od pacienta: exprese může být měřena na úrovni RNA s použitím kterékoliv metody dobře známé v oboru kvantifikace polynukleotidů, jako je například amplifikace nukleové kyseliny, například PCR, RT-PCR, protekce RNázou, Northern blotování a další hybridizační metody. Techniky testování, které mohou být použity pro určování hladin proteinu, jako je například polypeptid podle předkládaného vynálezu, ve vzorku pocházejícího od hostitele, jsou

I ···· · ·· 99 9999 • 9 9 99 9999 9

999 999999

9 · 9 999 9999 *· 99 99999 99 99

- 44 odborníkům v oboru známy. Takové testovací metody zahrnují radioimunotesty, kompetitivní vazebné testy, analýzu Western blotováním a testy ELISA.

V dalším aspektu se tedy předkládaný vynález týká diagnostické soupravy, která obsahuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, výhodně nukleotidová sekvence kódující polypeptid vybraný ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID.

Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV.

ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14, nebo jeho fragment, (b) nukleotidová sekvence komplementární k sekvenci uvedené v bodě (a) , (c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, výhodně polypeptid nebo jeho fragment nebo (d) protilátka k polypeptidu podle předkládaného vynálezu, výhodně k polypeptidu vybranému ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV.

ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14.

Je nutné uznat, že kterákoliv taková souprava, (a), (b) , (c) nebo (d) může zahrnovat podstatnou složku. Taková souprava bude použita při diagnostice onemocnění nebo vnímavosti na onemocnění, obzvláště retinitis pigmentosa, makulární degenerace se vztahem k věku, Bardetův-Biedlův syndrom, Bassenův-Kornzweigův syndrom, Bestova nemoc, choroidom, spirálovitá atrofie, kongenitální amauróza, Refsumův syndrom, Stargardtova nemoc a Usherův syndrom. Nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu je také cenná pro lokalizaci chromozómu. Chromozómové lokalizace může být dosaženo pomocí PCR na DNA připravené z panelu hybridních buněčných linií (myš-křeček). Chromozómová lokalizace humánního genu může být ·· ···· ♦ · · · ·· ·· • ·· 99 ···· ······ · • · · · · · • t · · · · « ··· ·· 99 99 předpovězena z lokalizace myšího genu na základě syntenie (McCarthy et al., 1997, Genome Research, 7, 1153). Sekvence je specificky cílena do konkrétní lokalizace a může hybridizovat s konkrétní lokalizací na individuálním chromozómu, včetně myšího nebo humánního chromozómu. Zmapování relevantních sekvencí k chromozómům podle předkládaného vynálezu je důležitý první krok pro korelaci těchto sekvencí s nemocemi sdružovanými s geny. Jakmile byla jednou sekvence vyznačena do přesné chromozómové lokalizace, fyzická poloha sekvence na chromozómu může být korelována s daty genetických map. Taková data lze nalézt například v práci V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupná on-line prostřednictvím Johns Hopkins University Welch Medical Library, RetNet). Vztah mezi geny a nemocemi, které byly mapovány do stejné chromozómové oblasti je pak identifikován prostřednictvím vazebné analýzy (společná dědičnost fyzicky přilehlých genů).

Mohou také být určeny rozdíly v cDNA nebo genomových sekvencích mezi postiženými a nepostiženými jedinci. Jestliže mutace je pozorována u některých nebo u všechny postižených jedinců, ale ne u kterýchkoliv normálních jedinců, pak je mutace pravděpodobně kauzativní agens onemocnění.

Další provedení vynálezu se týká podávání farmaceutického přípravku, ve spojitosti s farmaceuticky přijatelným nosičem, pro kterýkoliv terapeutický účinek projednaný výše. Takové farmaceutické přípravky se mohou skládat z Rdcvfl nebo Rdcvf2, mimetik nebo agonistů. Přípravky mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s alespoň jedním dalším činidlem, jako je například stabilizátor, který může být podáván ve kterémkoliv sterilním biologicky kompatibilním farmaceutickém nosiči, včetně, ale bez omezení, fyziologického roztoku, pufrovaného fyziologického roztoku, dextrózy a vody. Přípravky mohou být ····

	- 46 -	♦ · · · · • * • 0 0 • 0 • 0 0 0· ·♦	• «00 • 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 00
podávány	pacientovi samotné	nebo v	kombinaci	s dalšími
činidly,	léky nebo hormony.
Farmaceutické přípravky zahrnované	vynálezem	mohou být
podávány	kteroukoliv cestou:	např.	aplikací	biologicky

reaktivního proteinu přes skléru k cévnatce a sítnici (Ambati et al., 2000, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41, 1186). Formulace topických oftalmických preparátů, včetně očních roztoků, suspenzí a mastí, jsou odborníkům známy (viz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, kapitola 86, stránky 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990) . K dispozici jsou další způsoby podávání, včetně injekcí do komor (které mohou být prováděny přímo do přední komory nebo přímo do komory sklivce), subkonjunktivální injekce a retrobulbární injekce a jsou také dobře známy metody a prostředky pro výrobu očních preparátů vhodných pro takové způsoby podávání.

Jak se používá v této přihlášce, termín extraokulární se týká očního povrchu a (vnějšího) prostoru mezi oční bulvou a víčkem. Příklady extraokulární úseků zahrnují spojivkovou klenbu nebo spojivkový vak, povrch spojivek a povrch rohovky. Tato lokalizace je externí pro všechny oční tkáně a pro přístup do této oblasti není vyžadován invazívní postup. Příklady extraokulárních systémů zahrnují inzerty a topicky aplikované kapky, gely nebo masti, které mohou být použity pro aplikaci terapeutické látky do těchto úseků. Extraokulární zařízení jsou všeobecně snadno odstranitelná, dokonce i pacientem.

Následující patenty popisují extraokulární systémy, které jsou používány pro aplikaci léků do extraokulárních úseků. Higuchi et al. popisuje v patentech Spojených Států č. 3 981 303, 3 986 510 a 3 995 635, biologicky rozložitelný oční inzert, který obsahuje lék. Inzert může být vytvořen v různých tvarech pro udržení ve spojivkovém vaku oční bulvy,

- 47 extraokulárním prostorem mezi oční bulvou a víčkem. Některé běžné biologicky kompatibilní polymery byly popsány jako vhodné pro použití při konstrukci tohoto zařízení. Tyto polymery zahrnují alginát zinečnatý, póly(mléčnou kyselinu), póly(vinylalkohol), póly(anhydridy) a kyselinu). Patenty také popisují membránou potažená zařízení se sníženou permeací pro lék a duté komůrky zadržující formulaci léčiva.

Patent Spojených Států č. 4 217 898, popisuje mikroporézní zásobníky, které jsou používány pro řízenou aplikaci léčiv. Tato zařízení jsou umístěna extraokulárně ve spojivkovém vaku. Požadované polymerové systémy zahrnují kopolymery póly(vinylchlorid)-ko-poly(vinylacetát) . Kaufman popisuje v patentech Spojených Států č. 4 865 846 a 4 882 150 aplikační systém pro oční léčiva, který zahrnuje alespoň jednu biologicky rozrušitelnou látku nebo nosič mastí pro spojivkový vak. Patent popisuje polymerové systémy, jako je například póly(laktid), póly(glykolid), póly(vinylalkohol) a zesítěný kolagen, jako vhodné aplikační systémy.

V současnosti popsané použití RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu pro léčbu onemocnění nebo poranění sítnice je také výhodné, protože topicky aplikovaná oční formulace zahrnuje agens pro podporu penetrace nebo transportu terapeutického agens do oka. Taková agens jsou v oboru známa. Například autoři Ke et al., patent Spojených Států č. 5 221 696, popisují použití látek pro zvýšení penetrace očních preparátů přes rohovku.

Intraokulární systémy jsou ty systémy, které jsou vhodné pro použití v kterémkoliv tkáňovém kompartmentu v tkáňových vrstvách oka samotného, mezi nimi nebo kolem nich. Tyto lokalizace zahrnují subkonjunktivální (pod oční sliznici přilehlé k oční bulvě), orbitální (za oční bulvou) a póly(glykolovou »4 4444 léčiva pro zavedení do použity v tomto systému, intrakomorovou (v komorách samotné oční bulvy). Na rozdíl od extraokulárních systémů je pro přístup do těchto úseků vyžadován invazívní postup skládající se z injekce nebo implantace.

Následující patenty popisují intraokulární zařízení. Wong, patent Spojených Států č. 4 853 224, popisuje mikroopouzdřená komory oka. Polymery, které jsou zahrnují polyestery a polyethery.

Lee, patent Spojených Států č. 4 863 457, popisuje biologicky rozložitelné zařízení, které je chirurgicky implantováno intraokulárně pro prodloužené uvolňování terapeutického agens. Zařízení je určeno pro chirurgickou implantaci pod konjunktivu (sliznice oční bulvy). Krezancaki, patent Spojených Států č. 4 188 373, popisuje farmaceutické vehikulum, které vytváří gel při tělesné teplotě člověka. Toto vehikulum je vodná suspenze léčiva a gum nebo syntetických derivátů na základě celulózy. Haslam et al. Popisuje v patentu Spojených Států č. 4 474 751 a 4 474 752 systém polymer-léčivo, který je kapalný při teplotě místnosti a vytváří gel při tělesné teplotě. Vhodný polymery použité v tomto systému zahrnují polyoxyethylen a polyoxypropylen. Davis et al. Popisují v patentu Spojených Států č. 5 384 333 biologicky rozložitelný injikovatelný lékový aplikační polymer, který zajišťuje dlouhodobé uvolňování léčiva. Kompozice léku je tvořena farmaceuticky účinnou látkou v biologicky rozložitelné polymerové matrici, kde polymerová matrice je pevná při teplotách v rozsahu 20 °C až 37 °C a je tekutá při teplotách v rozsahu 38 °C až 52 °C. Lékový aplikační polymer není omezený na aplikaci rozpustných nebo kapalných formulací léčiva. Například polymer může být použit jako matrice pro stabilizaci a zadržení mikrosfér obsahujících léčivo v místě injekce, lipozomů nebo dalších léčiv navázaných na částice.

·* 9999

9999 ·

99

9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 99 99 99

- 49 Obzvláště vhodné vehikulum pro intraokulární injekci je sterilní destilovaná voda, ve kterém RDCVFl nebo RDCVF2 proteinový produkt je formulován jako sterilní, izotonický roztok, vhodně konzervovaný. Ještě další oční přípravek může zahrnovat formulaci RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu s agens, jako jsou například injikovatelné mikrosféry nebo lipozomy, které zajišťují pomalé nebo prodloužené uvolňování proteinu, který pak může být aplikován jako depotní injekce.

Další vhodné prostředky pro intraokulární zavedení RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu zahrnují implantovatelná léková aplikační zařízení nebo zařízení, která obsahují RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinový produkt.

Oční preparáty podle předkládaného vynálezu, obzvláště topické preparáty, mohou zahrnovat další složky, například oftalmicky přijatelná konzervační činidla, tonizační činidla, společná rozpouštědla, smáčedla, komplexační činidla, pufrovací činidla, antimikrobiální činidla, antioxidanty a surfaktanty, jak jsou v oboru známy. Například vhodná zesilující tonizační činidla zahrnují halogenidy alkalických kovů (výhodně chlorid sodný nebo draselný), mannitol, sorbitol apod. Činidlo zesilující dostatečně tonicitu je výhodně přidáváno tak, že formulace, která HAS být instilována do oka je hypotonická nebo v podstatě izotonická. Vhodná konzervační činidla zahrnují, ale bez omezení, benzalkoniumchlorid, thimerosal, fenethylalkohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidin, kyselinu sorbovou apod. Jako konzervační činidlo může také být použit peroxid vodíku. Vhodná společná rozpouštědla zahrnují, ale bez omezení, glycerin, propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodná komplexační činidla zahrnují kofein, polyvinylpyrolidon, β-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-p-cyklodextrin. Vhodné surfaktanty nebo smáčedla zahrnují, ale bez omezení, estery sorbitanu, polysorbáty, jako

9	i	•	• ·· 9	99 9	«	99 9	999
9	9	•	• ·	9	9	9	9
•	•	• ·	• 9	•	9	9	9
··		a·	999	··		99	99

je například polysorbát 80, tromethamin, lecitin, cholesterol, tyloxapol apod. Pufry mohou být běžné pufry, jako je například borát, citrát, fosfát, hydrouhličitan nebo Tris-HCl.

Složky formulací jsou přítomny v koncentracích, které jsou přijatelné pro extraokulární nebo intraokulární místo podávání. Například pufry jsou použity pro udržování přípravku ve fyziologickém pH nebo v mírně nižším pH, typicky v rozsahu pH přibližně od 5 do přibližně 8. Další složky formulací mohou zahrnovat látky, které zajišťují prodloužený pobyt v oku extraokulárně podávaného terapeutického agens, aby se maximalizoval topický kontakt a podporovala absorpce. Vhodné látky zahrnují polymery nebo látky vytvářející gel, které zajišťují zvýšenou viskozitu očního přípravku. Chitosan je obzvláště vhodná látka jako činidlo řídící rychlost uvolňování v oku v tekutých formulacích oftalmických léčiv s prodlouženým uvolňováním (viz patent Spojených Států č. 5 422 116, Yen, et. Al.) Vhodnost formulací podle předkládaného vynálezu pro řízené uvolňování (např. prodloužené a déle trvající aplikace) očního léčivého agens do oka může být určována různými postupy v oboru známými, např. jak bylo popsáno v Journal of Controlled Release, 6:367-373, 1987, a také jejich variacemi.

Kromě toho účinných složek tyto farmaceutické přípravky mohou obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnující excipienty a pomocné látky, které usnadňují zpracování účinných sloučenin do přípravků, které mohou být použity farmaceuticky. Další detaily o technikách formulace a podávání mohou být zjištěny v posledním vydání Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Farmaceutické přípravky pro perorální podávání mohou být formulovány s použitím farmaceuticky přijatelných nosičů v oboru dobře známých v dávkách vhodných pro perorální podávání. Takové nosiče umožní to, že farmaceutické přípravky • · · · · · • · • · ·

- 51 jsou formulovány jako tablety, pilulky, dražé, tobolky, kapaliny, gely, sirupy, kaše, suspenze, apod. pro užívání pacientem.

Farmaceutické přípravky pro perorální použití mohou být získány kombinací účinných sloučenin s pevným excipientem, volitelně mletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných látek, je-li žádoucí, za zisku jader tablet nebo dražé. Vhodné excipienty jsou sacharidová nebo proteinová plnidla, jako jsou například cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, škrob z kukuřice, pšenice, rýže, brambor nebo dalších rostlin, celulóza, jako methylcelulóza, sodná sůl hydroxypropylmethylcelulóza například nebo karboxymethylcelulózy, gumy včetně arabské gumy a tragantu, a proteiny, jako je například želatina a kolagen. Je-li žádoucí, mohou být přidána rozvolňovadla nebo solubílizační činidla, jako je například zesítěný polyvinylpyrolidon, agar, alginová kyselina nebo její sůl, jako je například alginát sodný.

Jádra dražé mohou být použita ve spojení s vhodnými obaly, jako jsou například koncentrované sacharidové roztoky, které mohou také obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol, a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. K obalům tablet nebo dražé mohou být přidány pigmenty nebo barviva pro identifikaci produktu nebo charakterizaci množství účinné sloučeniny, tj. dávky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být použity perorálně, zahrnují „push-fit tobolky vytvořené ze želatiny, a také měkké uzavřené tobolky vytvořené ze želatiny a povlaku, jako je například glycerol nebo sorbitol. Push-fit tobolky mohou obsahovat účinné složky smíchané s plnidlem nebo pojivý, jako je například laktóza nebo škroby, lubrikanty, jako je

- 52 například talek nebo stearát hořečnatý, a volitelně, se stabilizátory. V měkkých tobolkách mohou být účinné sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou například kapalné mastné oleje, nebo kapalný polyethylenglykol se stabilizátory nebo bez nich.

Farmaceutické formulace vhodné pro parenterální podávání mohou být formulovány ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je například Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo pufrovaný fyziologický roztok. Vodná injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je například sodná sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran. Dále mohou být suspenze účinných sloučenin připraveny jako vhodné olejnaté injekční suspenze. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné oleje, jako je například sezamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je například ethyloleát nebo triglyceridy nebo lipozomy. Pro aplikaci mohou také být použity nelipidové polykationtové aminopolymery. Volitelně, suspenze může také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost sloučenin, aby se umožnila příprava vysoce koncentrovaných roztoků.

Pro topické nebo použita penetrující přestoupena konkrétní jsou v oboru všeobecně nazální činidla překážka známa.

podávání jsou ve formulaci vhodná k tomu, aby byla

Taková penetrující činidla

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být vyráběny způsobem, který je v oboru znám, např. pomocí obvyklých postupů míchání, rozpouštění, granulování, tvorby dražé, leštěním, emulgace, opouzdřování, zachytávání nebo lyofilizace.

Farmaceutický přípravek může být poskytován jako sůl a může být formulován s mnoha kyselinami, jako je například bez

omezení včetně, kyselina chlorovodíková, sírová, octová, mléčná, vinná, jablečná, jantarová, apod. Soli inklinují k tomu, že jsou rozpustnější ve vodných nebo jiných protonových rozpouštědlech než jsou odpovídající formy volných bází. V dalších případech výhodný přípravek může být lyofilizovaný prášek, který může obsahovat kteroukoliv nebo všechny následující látky: 1 až 50mM histidin, 0,1% - 2% sacharóza a 2 až 7% mannitol, v pH rozsahu od 4,5 do 5,5, který je smíchán s pufrem před použitím.

Poté, co byly farmaceutické přípravky připraveny, mohou být umístěny ve vhodné nádobce a označeny pro léčení indikovaného chorobného stavu. Co se týče podávání Rdcvfl nebo Rdcvf2, takové označení by zahrnovalo množství, frekvenci a způsob podávání.

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v tomto vynálezu zahrnují přípravky, kde účinné složky jsou obsaženy v množství účinném pro dosažení zamýšleného cíle. Stanovení účinné dávky je ve schopnosti daného odborníka.

Pro kteroukoliv sloučeninu terapeuticky účinná dávka může být stanovena zpočátku buď v testech na tkáňových kulturách, např. neoplastických buněk, nebo na zvířecích modelech, obvykle myších, králících, psech nebo prasatech. Zvířecí model může také být použit pro určování rozsah vhodných koncentrací a způsobu podávání. Taková informace může pak být použita pro určení dávek a způsobů podávání použitelných u lidí.

Terapeuticky účinný dávka se týká takového množství účinné složky, například Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jejich fragmentů, protilátek k Rdcvfl, agonistů, které zlepší symptomy nebo chorobný stav. Terapeutická účinnost a toxicita mohou být určeny standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. ED50 (dávka terapeuticky účinná u 50 % populace) a LD50 (dávka smrtelný

pro 50 % populace). Poměr dávek mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutický index a může být vyjádřen jako poměr LD50/ED50. Farmaceutické přípravky, které projevují vysoké terapeutické indexy, jsou preferovány. Data získaná z testů na tkáňových kulturách a ze studií se zvířaty jsou použita při formulaci rozsahu dávek pro humánní použití. Dávka obsažená v takových přípravcích je výhodně v rozsahu cirkulujících koncentrací, které mají ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávka se mění v tomto rozsahu v závislosti na použité lékové formě, senzitivitě pacienta a způsobu podávání.

Přesná dávka bude určen praktickým lékařem ve světle faktorů vztahujících se k pacientovi, který vyžaduje léčbu. Dávka a podávání jsou upraveny tak, aby poskytly dostatečné hladiny účinné skupiny nebo udržely žádaný efekt. Faktory, které mohou brány do úvahy, zahrnují závažnost stavu nemoci, všeobecné zdraví pacienta, věk, hmotnost a pohlaví pacienta, stav výživy, čas a frekvenci podávání, lékovou kombinaci(kombinace), citlivost reakce a toleranci/reakci na terapii. Dlouhodobě působící farmaceutické přípravky mohou být podávány každé 3 až 4 dny, každý týden nebo jednou každé dva týdny v závislosti na poločase a rychlosti clearance konkrétní formulace.

konkrétních v literatuře

Normální dávkové množství se může měnit od 0,1 až do 100 000 mikrogramů, až do celkové dávky přibližně 1 g v závislosti na způsobu podávání. Směrnice, co se týče dávek a způsobů aplikace je poskytnuto a všeobecně dostupné odborníkům v oboru.

Odborníci budou používat odlišné formulace pro nukleotidy než pro proteiny nebo jejich inhibitory. Podobně, aplikace polynukleotidů nebo polypeptidů bude specifická pro konkrétní buňky, chorobné stavy, lokalizace, apod. Farmaceutické formulace vhodné pro perorální podávání proteinů jsou popsány

např. 5 641

853 v patentech Spojených Států č. 5 008 114, 5 505 962,

515, 5 681 811, 5 700 486, 5 766 633, 5 792 451,

748, 5 972 387, 5 976 569 a 6 051 561.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, aniž by jakýmkoliv způsobem omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Expresní klonování

Izolace celkové RNA z normální sítnice myší starých pět týdnů

Knihovna cDNA byla konstruována ze sítnic myší C57BL/60N starých pět týdnů obecně podle způsobu autorů Glissin et al, 1974, Biochemistry, 13, 2633-2637. Stručně, po utracení byla zvířata enukleována a oči byly nejdříve umístěny ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) doplněném 0,1% diethylpyrokarbonátem (DEPC). Nervová část sítnice byla rychle disekována (retinální pigmentový epitel byl vynecháván v tomto tkáňovém preparátu). Rychle po každé disekci byly tkáně homogenizovány v čerstvém 6M guanidiniumchloridu. Deset sítnic bylo sloučeno do 2,4 ml GC do sterilních zkumavek o objemu 4 ml a tkáň byla porušena kompletně silnou homogenizací po dobu 1 minuty při teplotě místnosti.

Izolace messenger RNA (mRNA) z normální sítnice myší starých pět týdnů

MRNA byla izolována na oligo-dT potažených porézních perličkách (Oligotex, Qiagen) ve stringentních podmínkách podle metody autorů Kuribayashi et al, 1988,.Nucleic Acids Res. Symposium series, 19, 61-64. stručně, 100-150 gg celkové RNA myší sítnice bylo mícháno s 15 μΐ oligo-dT perliček ve vazebném pufru [lOmM Tris pH 7,5, 0,3M NaCl, O,1M EDTA, 0,5% hmotnost/objem dodecylsulfát sodný (SDS)] a inkubováno 6 minut v 65 °C v kádince o objemu 0,5 1 s vodou, pak postupně ochlazeno na teplotu místnosti po dobu asi 3 až 4 hodin, a pak stočeno při teplotě místnosti, a by se znovu získaly agarózové perličky. Byly pak dvakrát promyty inkubací po dobu 10 minut v 0,4 ml pufru (0,lM Tris pH 7,5, 0,lM NaCl, lmM EDTA, 0,5 % hmotnost/objem SDS). Navázaná RNA (mRNA) byla eluována ve dvou krocích 50 μΐ vody o teplotě 70 °C bez RNázy, precipitována 10 μΐ acetátu sodného, pH 5,2, a 0,25 ml ethanolu a inkubována 12 hodin v -70 °C. mRNA byla sbírána centrifugací (1 hodina v 15 000 rpm, následováno dvěma promytími 70% ethanolem) a resuspendována ve 20 μΐ vody bez RNázy. mRNA koncentrace byla měřena ve 260 nm a nepřítomnost kontaminace rRNA byla kontrolována gelovou elektroforézou v denaturačních podmínkách, jak uvedeno výše.

Syntéza cDNA

Byla prováděna podle metody autorů Okayama a Berg, 1982, Mol Cell Biol., 2, 161-170. Syntéza prvního vlákna byla započata primerem, 2,5 μς Notl adaptérového oligonukleotidu

(5'TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA(T)i₈ 3') a inkubována po dobu 2 hodin s 50 jednotkami modifikované reverzní transkriptázy viru Moloneyho myší leukémie (M-MLV) (Superscript II, Life Technology) v podmínkách doporučených dodavatelem. Co se týče syntézy druhého vlákna, reakce byla inkubována 4 hodiny ve 14 °C se 4 jednotkami RNázyH a 100 jednotkami DNA polymerázy I v SS pufru [40mM Tris pH 7,2, 85mM chlorid draselný, 4,4mM chlorid horečnatý, 3mM DTT, 5 μg/ml bovinní sérový albumin (BSA)] v konečném objemu 0,25 ml. Adaptéry EcoRI (5'-OH AATTCGGCACGAGG 3'-OH/3'-OH GCCGTGCTCC5'PO₄) byly ligovány na oba konce dvojvláknové cDNA během 14 hodin v 16 °C s použitím 40 jednotek T4 DNA ligázy (Promega, Madison, USA) v celkovém objemu 20 μΐ v podmínkách doporučených dodavatelem. Produkty této reakce jsou dscDNA, které mají poloviční místo EcoRI v 5' a Notl poloviční místo ve 3', která mohou být orientována v klonovacím vektoru.

Ligace dscDNA do pcDNA3

Byla prováděna podle práce Maniatis T., 1992, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. vyd., s použitím 10 μg plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) připraveného štěpením s EcoRI a Notl (Promega, Madison, USA) v podmínkách doporučených dodavatelem.

Množení rekombinantních klonů

Bylo prováděno obecně podle způsobu autorů Birnboim et al, 1979, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523. stručně, aby vytvořili pool 100 primárních klonů, původci mírně modifikovali XL1 Gold

(Strategene) transformační protokol (poskytovaný firmou Stratagene) takto. Po inkubaci v růstovém médiu byla transformační reakce vložena do 20% (objem/objem) glycerolu a 8% (objem/objem) koňského sérového albuminu (HAS, Life Technologies). HAS a glycerol zabránily odumření po zmražení a rozmražení. Titrace byla prováděna vynesením na agarové misky (100 μg/ml ampicilin) zvyšováním objemu každé transformační reakce, aby se vypočetl objem poskytující 100 kolonií, zatímco zásoba transformační reakce byla uložena v -80 °C. Rekombinantní plazmidy z knihovny byly purifikovány po 96 najednou. Aby bylo připraveno 96 poolů ze 100 klonů, vypočtený objem odpovídající 100 klonům byl nanesen na agar a pěstován 20 hodin ve 37 °C. DNA byla purifikována přímo z kolonií snesených z agarových misek. Zásobní roztok každé kultury ve 23% glycerolu byl uložen v -80 °C. DNA byla purifikována s použitím Qiawell ultra (Qiagen) s použitím protokolu doporučeného dodavatelem. Typicky, 10 μg purifikovaného plazmidu bylo získáno, koncentrace každého preparátu byla měřena s použitím optické denzity ve 260 nm. Pro další rozdělení vybraných poolů po 100 do poolů po 10, 50 μΐ ředění 1/250 000 glycerolového zásobního roztoku z původního poolu bylo naneseno na agarovou misku s koncentrací ampicilinu 100 μρ/ιηΐ. Po růstu po dobu 16 hodin ve 37 °C, jednotlivých 160 kolonií bylo replikováno na 16 agarových miskách (10 na misku) a pěstováno po dobu 16 hodin ve 37 °C. 10 kolonií z každé misky bylo získáno a pěstováno v tekutém médiu [Luria Broth (LB) , 100 μς/ιηΐ ampicilin] po dobu 3 hodin ve 37 °C. Zásobní roztok těchto kultur ve 30% glycerolu byl uložen v -80 °C. Plazmidová DNA byla připravena tak, jak je uvedeno výše. Pro další rozdělení podskupin poolů po 10 na individuální klony, 50 μΐ ředění 1/250 000 glycerolového zásobního roztoku z podskupin poolů po 10 bylo naneseno na agarovou misku

s koncentrací ampicilinu 100 gg/ml. Po růstu po dobu 16 hodin ve 37 °C, 16 individuálních kolonií bylo vybráno a pěstováno po dobu 16 hodin ve 2 ml LB s koncentrací ampicilinu 100 μg/ml. Zásobní roztok těchto kultur ve 30% glycerolu byl uložen v -80 °C. Plazmidová DNA byla připravena tak, jak je uvedeno výše.

Přechodná (tranzientní) transfekce v buňkách Cos-1

Byla prováděna s použitím metody autorů Chen a Okayama, 1987, High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA (Mol Cell Biol., 7, 2745-2752).

Tkáňové kultury sítnice kuřecího embrya

Protokol byl přizpůsoben podle autorů Adler a Hatlee [1989, Science, 243, 391]. sítnice kuřecího embrya (6 dnů in ovo} byla oddělena a nanesena na misky v jednovrstevné kultuře. V těchto kultivačních podmínkách s nepřítomností diferenciačních signálů, čípky představují 60 až 80 % buněk. Původci vytvořili polyklonální protilátky v králíkovi proti visinini (markér kuřecích čípků, Genbank přístupové č. M84729) a ověřili, že podíl čípků kultuře byl 60 až 80 %. Jednoduché prostředí modelu původců vynálezu (chemicky definované médium, nepřítomnost buněk buněčných kontaktů) kromě snadnosti a rychlosti metody činí z něj velmi vhodný systém pro studii trofických faktorů zapojených do přežívání čípků. Stručně, sítnice embryí pocházejících z kontrolních izolátů, byly pitvány po šesti dnech vývoje in ovo, buňky byly rozděleny a naneseny na misky v nízké denzitě (10⁵ buněk/cm²) . Během deseti dnů byla sledována životaschopnost buněk (60-80 % čípků) • · · · ·♦ ·· s použitím testu LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, USA), testu, který kvantifikuje živé a mrtvé buňky. Počet živých buněk poklesl na 8 % počátečního počtu buněk po sedmi dnech v kultuře v chemicky definovaném médiu. Když byl test prováděn v přítomnosti kondicionovaného média z COSI buněk transfekovaných pooly klonů z knihovny, živé buňky byly počítány po sedmi dnech in vitro.

Kuřecí progenitorové buňky (kmen 657 červené označení) byly udržovány v odděleném kompartmentu pro účel tohoto experimentu v líhni 25 km od laboratoře. Oplodněná vejce získaná přirozenou cestou byla sbírána týdně a udržována v 17 °C (odpovídající biologická nula) v laboratoři po vylíhnutí. Denně bylo inkubováno 5 vajec po dobu 24 hodin ve 20 °C, pak 136 hodin ve 37 °C s intermitentní obracením sklonu vajec ve zvlhčované komoře. V den kultury byl povrch vejce omyt Mucocit-A, pak byl rozbit, a kuřecí embrya byla přenesena do PBS. Bylo ověřeno, že fáze vývoje každého embrya odpovídá stupni 29. Vizuálním srovnáním s prací autorů Hamburger a Hamilton, (1951, v Essential Development Biology, Stern and Holland vyd.). Dvě embrya byla vybrána a enukleována, oči byly přeneseny do C0₂-nezávislého média (Life Technologies). Sítnice byly disekovány a přeneseny do Ringerova pufru a dvakrát promyty. Sítnice byly nařezány na malé kusy a ošetřovány 20 minut ve 37 °C roztokem trypsinu (0,25 % hmotnost/objem). Reakce byla zastavena přidáním kultivačního média (M199, Life Technologies) doplněného 10% deaktivovaným FCS. Buněčná suspenze byla ošetřena několik minut ve 25 μΐ DNAázy I v koncentraci 1 mg/ml (Sigma). Buněčná suspenze pak byla dvakrát promyta chemickým definovaným kultivačním médiem [CDCM, stejné objemy médií DMEM a M199 (Life Technologies) a AB s doplňky (5gg/ml inzulín, 5gg/ml transferrin, 64nM progesteron, 0,lmM putrescin, 5ng/ml selen, 3mM taurin, 2,7μΜ

cytidin 5'-difosfoethanolamin, 5,2 μΜ cytidin 5¹-difosfocholin, 0,2μg/ml hydrokortison, 30nM 3,3'-5-trijodo-L-thyronin, ImM pyruvát sodný), 0,3μΜ prostaglandin D2, 0,1 mg/ml linolová kyselina], aby se odstranilo FCS. Koncentrace buněk obarvených trypanovou modří byla měřena pomocí Mallassezovy komůrky a upravena na dvě koncentrace (5,6 a 1,12 x 10⁵ buněk) odpovídající dvěma hustotám nanášení na misky (2 a 4 x 10⁵ buněk/cm²) .

Kondicionovaná média z Cos-1 transfekovaných buněk jsou rozmražena na ledu a 50 μΐ přeneseno se na dvě 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury ošetřené černí (Corning Costar), které byly potaženy roztokem 100 μg/ml Poly-L-lysinu (Sigma) podle schématu:

První kolo screeningu:

1	1	1	1	2	C	2	2	2	3	3	P
c	3	3	4	4	4	C	4	5	5	5	5
6	C	6	6	6	7	7	C	7	7	8	8
8	8	C	9	9	9	9	10	C	10	10	10
11	11	11	C	11	12	12	12	12	C	13	13
13	13	14	14	C	14	14	15	15	15	C	15
16	16	16	16	17	C	17	17	17	18	18	C
18	18	19	19	19	19	P	20	20	20	C	20

Kde čísla odkazují na počet poolů 100 klonů, C znamená kondicionovaná média z Cos-1 buněk transfekovaných prázdným vektorem (pcDNA3) a P pozitivní kontroly (kondicionovaná média transfekovaná pcDNA-myšíGDNF).

* · · φ · * ·

ΦΦΦ ·· ·«·· φ φ · • · φ

Druhé a třetí kolo screeningu:

X.(y). 01	x.(y). 01	x. (y). 01	x. (y) · 01	X.(y)· 02	C	x.(y). 02	x. (y). 02	x.(y). 02	x. (y). 03	X. (y). 03	P
C	x.(y)· 03	x. (y). 03	x. (y) · 04	x.(y). 04	x.(y). 04	C	x.(y). 04	x.(y)· 05	x. (y). 05	x.(y) · 05	x.(y)· 05
x.(y). 06	C	x.(y)· 06	x. (y) · 06	x.(y). 06	x. (y). 07	x.(y). 07	C	x. (y). 07	x. (y). 07	x.(y). 08	x.(y). 08
x.(y)· 08	x.(y)· 08	C	x. (y) · 09	x.(y)· 09	x.(y)· 09	x·(y). 09	x. (y)· 10	C	x. (y) · 10	x.(y)· 10	x.(y). 10
x.(y). 11	x.(y). 11	x.(y) 11	C	x.(y). 11	x.(y). 12	x.(y). 12	x.(y). 12	x.(y). 12	C	x.(y). 13	x.(y). 13
x.(y). 13	x.(y)· 13	x.(y)· 14	x. (y) . 14	C	x. (y). 14	x.(y). 14	x.(y). 15	x.(y)· 15	x.(y)· 15	C	x.(y)· 15
x.(y). 16	x.(y)· 16	x.(y)· 16	X. (y) · 16	x. <y)	c	x. (y)	x. (y)	x. (y)	C57	C57	c
C57	C57	C3H	C3H	C3H	C3H	P	0	0	0	c	0

Kde x (druhé kolo) a y (třetí kolo) představují počet poolů vybraných v prvním a druhém kole, v daném pořadí. 01 až 16 představují použité podskupiny poolů. x(y) reprezentuje parentální pool, ze kterého pochází 16 poolů. C znamená totéž, co v prvním kole. P byl modifikován jako pCMVScript-CNTF v druhém kole a postupně pcDNA-939.09.08 ve třetím kole. 0 reprezentuje kuřecí buňky čípků pouze v CDCM mediu. C57 a C3H, kondicionovaná média z explantátů sítnic připravená tak, jak bylo popsáno v části týkající se přípravy kondicionovaných médií z explantátů sítnic myší ze sítnic myší C57BL/6@N a C3H/He@N ve věku 5 týdnů, v daném pořadí.

μΐ buněčných suspenzí odpovídajících dvěma hustotám (2 a 4 x 10⁵ buněk/cm²) bylo přidáno do jamek dvou 96-jamkových destiček naplněných kondicionovaným médiem 8 kanálovou motorizovanou pipetou (Biohit), aby se minimalizovaly experimentální chyby. Buňky byly inkubovány po dobu 7 dnů ve 37 °C v 5% CO₂.

9« ·· 999·

9 9 « * 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 99

Příprava kondicionovaných médií z explantátů sítnic myší

Druhé a třetí kolo screeningu zahrnovalo pozitivní kontroly adaptované dle Mohand-Said et al., 1998. Myši kmenů 5C57BL/6@N (divokého typu) a C3H/He@N (rdi) ve věku pěti týdnů byly utraceny a enukleovány. Dvě sítnice byly disekovány a inkubovány po dobu 24 hodin ve 37 °C v 5% C0₂ v 1,5 ml CDCM na 12-jamkových destičkách. Kondicionovaná média byla získána a 40 krát koncentrována ultrafiltrací na přístroji Vivaspin (Sartorius, hraniční velikost 10 kD) . Kondicionovaná média byla zmražena v kapalném dusíku a skladována v alikvotech v -20 °C před použitím. V den použití byla kondicionovaná média rozmražena na ledu, naředěna 10 krát CDCM a sterilizována filtrací přes 0,22 pm filtr (Acrodisk 13, Gelman Sciences).

Funkční test, test LIVE/DEAD

Funkční test je založen na počtu buněk kuřecích sítnice životaschopných po 7 dnech inkubace in vitro. Původci používali testovací soupravu LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, USA), která je založena na použití dvou fluorogenních barviv (Calcein AM a dimer ethidia), které barví živé a mrtvé buňky, v daném pořadí. Buňka, která je živá, vyvíjí metabolickou aktivitu (v tomto případě esterázovou aktivitu), která konvertuje substrát (Calcein AM) na jeho fluorescenční produkt emitující v 520 nm. Permeabilita membrány mrtvé buňky je změněna a umožňuje DNA barvení jádra dimerem ethidia emitujícím v 635 nm. Buňka je živá: emituje v 520 nm po excitaci 485 nm nebo mrtvá: emituje v 635 nm po excitaci 520 nm. S použitím epifluorescenční mikroskopie mohou být tyto dva typy fluorescenčních buněk zobrazeny odděleně. Po 7 dnech

• » ·999

9 9

9 9

9 9 9

99

- 64 in vitro byly buňky inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě s 2,7μΜ Calcein-AM a 0,3mM dimerem ethidia.

Získání snímků

Stručně, získání snímků sestávalo z autofokusace každé jamky, automatického počítání buněk ve dvou fluorescencích následovaném zpracováním hrubých údajů s použitím specializovaného software, např. Metamorph (Universal Imaging Corporation, West Chester, USA), čímž se získal digitalizovaný obraz každé jamky na destičce. Původci používaly invertovaný mikroskop (Nikon TE 200) vybavený rtuťovou epifluorescenční lampou s dvěma excitačními filtry 485 a 520 nm, dvěma emisními filtry 520 a 635 nm, objektivem (xlO) a počítačem řízeným motorizovaným stolkem (Multicontrol 2000, Martzauzer a CCD kamera (Cohu).

Pro snímání byla destička umístěna na motorizovaném stolku a zaostření bylo prováděno ručně na první jamce, a tato zaostřovací rovina byla zaznamenána (výchozí). Práh obrazu mrtvého a živého je nastaven z první jamky.

Střed první jamky je nastaven s použitím bílého světla tím, že se ručně nastaví dno jamky na spodek obrazu na počítačovém monitoru, a pak se zarovná pravý kraj první jamky s pravou hranou obrazu na počítačovém na počítačovém monitoru a tyto dvě polohy se zaznamenají. Střed první jamky se pak vypočte a určí polohu střed všech dalších jamek na destičce. Při vývoji metody se původci povšimli, že existuje nepatrně vyšší denzita buněk u okraje jamky a vyřadili proto okraje ze sběru dat. kání. Je důležité, aby obraz každé jamky byl perfektně vycentrován, aby se zabránilo jakýmkoliv klamným výsledkům. Když je vše nastaveno, první skenování destičky ·· ·*·0 <0 • 0

Φ ·

0· 0000

0 0

0 0

0 0 0 10

0 *

0 0 0

00 zaznamená mrtvé buněk. Denzita mrtvých buněk je za těchto podmínek méně variabilní. Program provede automatické zaostřování tím, že sejme obrazy v různých ohniskových rovinách a vybere ten nej jasnější, pak koriguje zaostření. Tato poloha je pak uchována uložena a motorizovaný stolek koná naprogramované pohyby ve směru os x a y a sejme celkem 4 obrazy, které po reorganizaci do jednoho obrazu reprezentují 2/3 povrchu jamky. Řada obrazů z ohniskových rovin je uchována pro kontrolu. Stolek vykoná automatické zaostřování a provede čtyři snímky pro každou jamku destičky počínaje jamkami Al až A12, pak B12 až Bl, Cl až C12 atd. Na konci se stolek posune mimo destičku, aby se přeexponoval poslední jamka (Hl). Skenování mrtvých buněk trvá 30 minut. Druhé skenování (živé buňky) se provede po výměně filtru. Toto druhé skenování se provádí s použitím zaznamenané polohy každé jamky z přechozího skenování mrtvých buněk. Pro každou jamku jsou provedeny čtyři snímky stejně jako pro mrtvé buňky. Na konci druhého skenování (22 minut) reorganizované obrazy mrtvých a živých buněk jsou uloženy do datového souboru, který je automaticky označen datem dne. Počty buněk (mrtvých a živých) jsou počítány automaticky s předem nastavenými morfometrickými parametry (průměrnými) a jsou ukazovány na počítači, aby bylo možné kontrolovat, zda experiment probíhá správně. Je důležité kontrolovat denně, zda počet živých buněk není příliš vysoký. Původci zjistili, že jestliže se nanese příliš vysoká denzita buněk, buňky kuřecí sítnice přežívají déle pravděpodobně proto, že produkují vlastní přežívací faktor. Buky byly proto skenovány v nepřítomnosti nepřítomnosti tohoto účinku. Před skenováním druhé destičky (stejný experimentovat, ale s dvakrát vyšší hustotou nanesených buněk) bylo přidáno „a na konec jména uloženého souboru pro první destičku. Snímky z každého experimentu pak byly uloženy na CD-ROM. Byla tak vytvořena knihovna s více než 250 CD-ROM.

- 66 Počítání buněk a poolů

Počty buněk (živé a mrtvé) byly určeny ze snímků archivovaných pro každý experiment na CD-ROM. Sběrný datový soubor z experimentu byl nejdříve uložen do počítače (počítání off-line) a otevřel s použitím softwaru Metamorph. V prvním kroku se otevřely obrazy odpovídající 14 jamkám C (kondicionovaná média z Cos-1 buněk transfekovaných prázdným vektorem). Poté, co byl nastaven práh obrazu, příkaz Integrated Morphometry Analysis byl použit ke zjištění distribuce oblastí mezi 10 a 250 objekty (počet živých buněk pro každou celkovou oblast) pro tyto kontrolní jamky. Distribuce sledovala Gaussovu křivku s maximálním počtem objektů odpovídajících izolované buňce. Tato standardní hodnota (SV) pak byla použita k výpočtu hodnot pro oblasti vyšší, kde objekt je počítán jako dvě buňky (standardní řez objektu, SOC) na základě vlastní emirické funkce: SOC = 29/20,74/ SV. Hodnota SOC každé individuální destičky je pak určena k výpočtu množství živých buněk na destičce. Tyto hodnoty se pak přenesou do tabulky v programu Excel.

V prvním kole screeningu byly hodnoty získané pro každý pool vyneseny jako násobky (zvýšení nebo snížení počtu živých buněk) proti průměru ze 14 kontrolních jamek + směrodatná odchylka. Aby se potlačila variabilita způsobená rozdílnou polohou na destičce, byl vypočten průměr rozdílu individuálně mezi 80 jamkami odpovídajícími polohám, kde jsou testované pooly, a 14 kontrolním jamkám pro 200 nezávislých destiček. V průměru byly pozorované rozdíly jen důsledek rozdílné polohy a počty buněk pak byly korigovány takto získaným koeficientem. Pro přísnější diskriminaci při výběru poolů byly počty živých buněk vyneseny do grafu jako násobky rozdílu proti kontrole a všechny hodnoty byly menší než 1,3 ale větší než 0,4. Tímto • ·· · • · · • · · · • · · · ·· · ·

- 67 způsobem bylo určeno, že všechny pooly s násobkem rozdílu proti průměru 14 jamek odpovídajících prázdnému vektoru ležící v intervalu od 0,4 do 1,3 byly považovány za neúčinné a byly použity jako kontrola. Po korekci násobek rozdílu proti kontrolním dvěma destičkám vynásoben a výsledek byl roztříděn podle klesajícího násobku. Pooly na vrcholu tohoto seznamu byly dále vizuálně kontrolovány prohlídkou grafu odpovídajícího 20 poolům z experimentu (obě destičky) a snímků živých a mrtvých buněk, aby se zabránilo screeningu klamných poolů.

Pro druhé a třetí kolo screening destiček na podskupiny poolů zahrnoval další kontroly. Původci připravili kondicionovaná média z retinálních explantátů myší ve věku 5 týdnů. Původci vybrali experimenty, kde byly zaznamenány pozitivní účinky na explantáty sítnic myší C57BL/60N, a vyloučili ostatní. Výsledky byly vyneseny do grafu jako násobek rozdílu proti 14 kontrolním jamkám, nebylo prováděno žádné přepočítávání kontrol. Násobek rozdílu proti kontrolám ze dvou destiček byl vynásoben a výsledky byly tříděny podle poklesu násobku rozdílu pro 16 podskupin poolů.

Izolovaná cDNA byla sekvencována s použitím T7 primerů (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3') na kapilárním sekvenátoru (CEQ2000, Beckman Coulter). DNA sekvence byly srovnány s databázemi s použitím programu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

Identifikace Rdcvf2 a humánních homologů

S použitím Rdcvfl sekvence (nukleotidové sekvence kódující polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4) a programu BLAST byly identifikovány homologní myší a humánní polypeptidy (obrázek 8) . Byly identifikovány EST klony

• · · ··

- 68 s homologií k myší RdCVF2 (GenBank přístupové č. Bc016199): GenBank přístupová č. : be552141, bi517442, bg707818, bi603812, ai433287, be088414, bg297383, bg297304 (viz také obrázek 12). Byly identifikovány EST klony s homologií k myší Rdcvfl (SEKV. ID. Č. 1): GenBank přístupové č. Bg299078, ai716631, bg294111, bel08041, bg395178 (viz také obrázek 13).

RT-PCR analýza Rdcvfl exprese v reálném čase

Retinální exprese Rdcvfl kmeny myší C57BL/6@N a C3H/He@N, také ve věku stejném jako kongenní C3H (+/+ a rd/rd) 5 týdnů, byla studována s použitím RT-PCR v reálném čase na cykleru (Roche) PCR soupravou s barvivém sybergreen (Roche). cDNA jsou tvořeny s použitím primeru, a to náhodným hexamerním Óligonukleotidem (pdN6, Amersham), M-MLV reverzní transkriptázou (Superscript II, Life Technologies) a celkové RNA z myší sítnice připravené jako v bodě 1). cDNA jsou standardizovány s použitím všudypřítomné raessenger RNA glukózo-6-fosfátdehydrogenázy (G6PDH). Syntéza 0,2 μΐ prvního vlákno cDNA (ekvivalent 10 ng celkové RNA) je amplifikována 2 μΜ oligonukleotidy SEKV. ID. Č. 24 a SEKV. ID. Č. 25 v trojím opakování v celkovém objemu 25 μΐ s použitím následujícího programu: 30 sekund v 95 °C a 35 cyklů sledu (1 sekunda v 95 °C, 18 sekund v 55 °C, 10 sekund v 72 °C) . Analýza (obrázek 16) ukazuje, že exprese Rdcvfl se snižuje po degeneraci tyčinek u rdi myší (C3H/He@N). Bylo také ukázáno pomocí RT-PCR v reálném čase s použitím RNA připravené z vnější vrstvy sítnice z řezů na vibratomu, že Rdcvfl je přímo exprimován fotoreceptory.

Produkty byly kontrolovány elektroforézou na agarózovém gelu. Podobné výsledky byly získány s dalším párem Rdcvfl • · • ·

- 69 specifických primerů. Jako pozitivní kontrola byla monitorována exprese arrestinu tyčinek (klon č. M24086) ve stejných podmínkách s primery (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3' a 5' CATCCTCATCTTTCTTCCCTTC 3'). Potvrzení, že Rdcvfl je protektivní faktor čípků může být získáno přidáním vhodného množství Rdcvfl k retinálnímu explantátu z 5 týdnů staré rdi myši (C3H/He@N). Ke vhodnému množství lze dospět některými výchozími titračními experimenty. Ve srovnání s vhodnými kontrolami po 7 dnech je přežívání čípků zvýšeno.

RT-PCR analýza Rdcvf2

RT-PCR pro expresi Rdcvf2 bylo prováděno s použitím primerů:

5'-GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC-3 ’ a

5'-AAGCCCTGCCTGCTCTAACATC-3' .

Analýza ukazuje, že RdCVF2 je exprimován způsobem závislým na tyčinkách a že Rdcvf2 exprese není restringována na sítnici, ale že také další neuronové buňky exprimují Rdcvf2 (obrázek 17), zatímco exprese Rdcvfl se jeví být restringována na buňky sítnice.

Testy LIVE/DEAD Rdcvfl nebo Rdcvf2

Buňky COS-1 jsou transfekovány vhodným expresním vektorem nesoucím Rdcvfl nebo Rdcvf2 pod kontrolou indukovatelného promotoru. Kontrolní buňky jsou transfekovány prázdným vektorem. Buňky jsou inkubovány po vhodné časové období po indukci Rdcvfl nebo Rdcvf2 exprese.

přežívajících buněk čípků inkubovaných

Následně, počet s kondicionovaným

- ΊΟ médiem z COS-1 buněk transfekovaných Rdcvfl nebo Rdcvf2 a počet přežívajících kontrolních buněk je počítán podle výše popsaného způsobu. Buňky exprimující Rdcvfl nebo Rdcvf2 ukazují významně vyšší množství přežívajících buněk.

Faktor specifický pro tyčinky

Analýza RT-PCR v reálném čase, prováděná ve standardních podmínkách, exprese arrestinu tyčinek (kontrola) a Rdcvfl na 5 týdnů starých retinálních explantátech myší C57BL/6@N ve věku 5 týdnů a C3H/HE@N, s použitím primerů:

SEKV. ID. Č. : 24: 5' TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG 3'

SEKV. ID. Č.: 25: 5 TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3'

Analýza prokázala, že RdCVFl je exprimován pouze v přítomnosti tyčinek (tyčinkovýCVFl).

Produkce polyklonálních protilátek

Polyklonální protilátky byly připraveny injekcí purifikovaného fúzního proteinu s gluthation-S-transferázou (GST) (GST-Rdcvfl), a také aminokyselin z myší RdCVFl peptidové sekvence 11 až 32 ze SEKV ID Č. 2 (Ab č. 2) a aminokyselin peptidové sekvence 79 až 96 ze SEKV ID Č. 2 (Ab č. 3) do králíka. Fúzní konstrukt pGST-Rdcvfl byl připraven amplifikací s oligonukleotidy SEKV. ID. Č. 26 a SEKV. ID. Č. 27 s použitím pcDNA-Rdcvfl jako templátu ve standardních podmínkách. Otevřený čtecí rámec (ORF) Rdcvfl byl klonován ve shodném čtecím rámci do pGex2TK (Pharmacia) mezi BamHI a EcoRI restrikční místa a transformován do E. coli [BL21 (DE3) pLysS, Promega] standardním postupem. Jedna kolonie byla pěstována ve • ·· ·

- 71 3 litrech LB tekutého média s ampicilinem v koncentraci 100 Hg/ml ve 30 °C a produkce proteinu byla indukována přidáním isopropylthio-p-D-galaktosidu (IPTG) v koncentraci 1 gg/ml a pokračovala po dobu 5 hodin ve 30 °C. Buňky byly sklizeny, lyžovány sonikací a purifikovány na gluthation-sefaróze podle standardního protokolu. Fúzní protein byl eluován lOmM redukovaným gluthationem při teplotě místnosti. Eluovaný protein byl dialyzován do PBS před injekcí králíkům, čistota proteinu byla monitorována elektroforézou v polyakrylamidovém gelu. Dva králíci byli imunizováni intradermální injekcí v 80 místech 100 μς purifikovaného GST-Rdcvfl. Sérum bylo sklízeno po 8 týdnech.

- 72 ·· ···· • · · • · · • · ·

SEZNAM SEKEVNCÍ

<210>	1
<211>	468
<212>	DNA
<213>	Mus museu!us
<220>
<221>	CDS
<222>	(45)..(374)
<223>
<400>	1

atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc tacc atg gca tet ctc Met Ala Ser Leu

ttc tet Phe ser 5

gga ege atc

ttg atc Leu ile 10

agg aac aac age gac

1 cag gat gaa gtg

Gly Arg

Ile

Arg

Asn Asn Ser 15

Asp

Gin

Asp

Glu

val 20

gag

aca

gag

gca

gag

ctg

age

cgt

agg

tta

gag

aat

cgt

ctg

gtg Val

ttg

gIu

Thr

Glu

Ala

Glu

Leu

Ser

Arg Arg

Leu

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

25

30

35

ctg

ttc

ttc

gac

gcc

sgc Gly

gcc

tgt

ccc

cag

tgc

cag

gcc

ttt

gcc

cca

Leu

Phe

Phe

Gly

Ala

Ala

Cys

Pro

Gin

Cys

Gin

Ala

Phe Ala

Pro

40

45

50

gtc

ctc

aaa

gac

ttc

ttc

gtg val

cgg

ctc

act

gac

gag

ttc

tac

gtg Val

ctg

val

Leu

Asp

Phe

Phe

Arg 60

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe 65

Tyr

Leu

cgg

gca

gca

cag

ctg

gcc

ctg

gtc

tat

gtg Val

tcc

cag

gac

cct

aca

gag

Arg

Ala

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr Glu

70

75

80

gag

caa

cag

gac

ctc

ttc

ctc

agg

gac atg

cct

gaa

aaa

tgg

ctc

ttc

Glu

Gin

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Arg Asp

Met

pro

Glu

Lys

Trp

Leu

Phe

85

90

95

100

ctg

ccg

ttc

cat

gat

gaa

ctg

agg

agg

tga

ggccccaggg i

aagaccaggg

Leu

Pro

Phe

His

Asp 105

Glu

Leu

Arg Arg

agggcttcct ggagaaggca tttccctgga ggtttactgt cctggtacta cttgtgcata aagaggtatt cctc

104

152

200

248

296

344

394

454

468 ·· *···

- 73 • ·· ·

<210>	2
<211>	109
<212>	PRT
<213>	mus museu!us
<4Q0>	2

Met

Ala

Ser

Leu

Phe

ser

Gly

Arg

Ile

Leu

Ile

Arg

Asn

Asn

ser

Asp

1

5

10

15

Gin

Asp

Glu

Val

Glu

Thr

Glu

Ala

Glu

Leu

Ser

Arg

Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

Val

Leu

Leu

Phe

Phe

Gly

Ala

Gly

Ala

cys

pro

Gin

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Phe

Ala

Pro

Val

Leu

Lys

Asp

Phe

Phe

val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

val

Leu

Arg

Ala

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

val

Tyr

val

ser

Gin

65

70

75

80

Asp

Pro

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Arg

ASp

Met

Pro

Glu

85

90

95

Lys

Trp

Leu

Phe 100

Leu

Pro

Phe

His

Asp 105

Glu

Leu

Arg

Arg

<210> 3 <211> 764 <212> DNA
<213>	Mus musculus
<220>
<221>	CDS
<222> <223>	(26)..(676)

- 74 9999 ··· · 9 9 9 9 9 , « · · ······ · : j. · · . · ·♦♦*.·

Λ » · 999 99 99 99 <400> 3 ccccagctcc ttgcatactg ctacc atg gca tet ctc ttc tet gga ege atc 52

Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile

ttg Leu 10

atc agg aac aac age gac cag gat gaa gtg gag aca gag gca gag

100

Ile

Arg

Asn Asn

Ser 15

Asp Gin

Asp

GlU

val 20

Glu

Thr

Glu

Ala

Glu 25

ctg

age

cgt

agg

tta

gag

aat

cgt

ctg

gtg Val

ttg

ctg

ttc

ttc

ggc Gly

gcc

148

Leu

ser

Arg

Arg

Leu

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Leu

Phe

Phe

Ala

30

35

40

ggc

gcc

tgt

ccc

cag

tgc

cag

gcc

ttt

gcc

cca

gtc

ctc

aaa

gac

ttc

196

Gly

Ala

cys

Pro

Gin

Cys

Gin

Ala

Phe Ala

Pro

Val

Leu

Lys

ASp

Phe

45

50

55

ttc

gtg val

cgg

ctc

act

gac

gag

ttc

tac

gtg val

ctg

cgg

gca

gca

cag

ctg

244

Phe

Arg

Leu

Thr

ASp

Glu

Phe

Tyr

Leu

Arg

Ala

Ala

Gin

Leu

60

65

70

gcc

ctg

gtc

tat

gtg Val

tcc

cag

gac

cct

aca

gag

g?g

caa

cag

gac

ctc

292

Ala

Leu

Val

Tyr

ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

Asp

Leu

75

80

85

ttc

ctc

agg

gac

atg

cct

gaa

aaa

tgg

ctc

ttc

ctg

ccg

ttc

cat

gat

340

Phe

Leu

Arg

Asp

Met

Pro

Glu

Lys Trp

Leu

Phe

Leu

pro

Phe

His

Asp

90

95

100

105

gaa

ctg

agg

agg

gac

ctc

ggg Gly

ege

cag

ttc

tet

gtc

cgt

caa

ctg

cca

388

Glu

Leu

Arg

Arg Asp

Leu

Arg Gin

Phe

ser

val

Arg

Gin

Leu

Pro

110

115

120

9cg

gtt

gtg Val

gta

ctt

aag

cct

ggt ggg Gly Gly

gac

ss

ctg

aca

age

gac

gcc

436

Ala

Val

val

Leu

Lys

Pro

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Ala

125

130

135

acg

gag

gag

atc

cag

cgt

ctg

gga

ccc

gcc

tgc

ttt

gcc

aac

tgg

cag

484

Thr

Glu

Glu

Ile

Gin

Arg

Leu

Gly

Pro

Ala

cys

Phe Ala

Asn

Trp

Gin

140

145

150

g?g

gcc

gca

gag

ctc

ctg

gac

ege

age

ttc

ctg

caa

ccg

gag

gat

ttg

532

Glu

Ala

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

Arg

Ser

Phe

Leu

Gin

pro

Glu

Asp

Leu

155

160

165

gat

gag

cct

gcg

cgg

ege

age

atc

acc

9*9

cct

ctg

ege

cgt

ege

aag

580

Asp 170

Glu

pro

Ala

Arg

Arg 175

ser

Ile Thr

Glu

Pro 180

Leu

Arg Arg Arg

Lys 185

tac ega gta gac cgg gat gtc gqc ggg age ggg gcg aaa cgg ege gac 628

Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp

190 195 200 tet gat gaa ccc cag ggg gac gcg ggt aca agg gcg gag ctc tgg tga 676

Ser Gly Glu Pro Gin Gly Asp Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp

205 210 215 ctcccagggt aggagtgggg accggagetc tggtgacacc aaagtaccgg tgcacgaccg 736 ·· ···· • ·

- 75 aggttgatga ccctcccgaa ggaaccgg 764 <210> . 4 <211> 216 <212> PRT <213> Mus museu!us <400> 4

Met

Ala

ser

Leu

Phe ser

Gly Arg

ile

Leu

Ile

Arg Asn

Asn

Ser

ASp

1

5

10

15

Gin

ASP

Glu

val

Glu Thr

Glu Ala

Glu

Leu

ser

Arg Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

Val

Leu

Leu

Phe

Phe

Gly

Ala Gly

Ala

Cys Pro

Gin

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Phe Ala

pro

val

Leu

Lys

ASp

Phe

Phe

val

Arg Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60

phe

Tyr

Val

Leu

Arg

Ala Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

Val Tyr

val

Ser

Gin

65

70

75

80

ASp

Pro

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

ASp

Leu

Phe

Leu

Arg Asp

Met

Pro

Glu

85

90

95

Lys Trp

Leu

Phe

Leu

pro

Phe

His

Asp

Glu

Leu

Arg Arg Asp

Leu

Gly

100

105

110

Arg Gin

Phe

ser

Val

Arg

Gin

Leu

pro

Ala Val

val val

Leu

Lys

pro

115

120

125

Gly Gly

Asp

Val

Leu

Thr

ser

Asp

Ala Thr Glu Glu ile Gin

Arg

Leu

130

135

140

Gly 145

Pro Ala

cys

Phe Ala 150

Asn

Trp

Gin Glu Ala Ala Glu 155

Leu

Leu

Asp 160

Arg Ser Phe

Leu

Gin

pro

Glu

Asp

Leu Asp Glu

Pro Ala

Arg

Arg

Ser

165

170

175

ile Thr Glu

pro

Leu

Arg Arg Arg

Lys Tyr Arg

Val Asp

Arg

Asp

Val

180

185

190

Gly Gly ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp ser Gly Glu Pro Gin Gly Asp 195 200 205

4·4·

- 76 _Φ· 4444

4 ·

4 4 · ·

4 4 4

Ala Gly 210

Thr Arg Ala Glu Leu Trp 215 <210> 5 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <22O>

<221> CDS <222> (24)..(353) <223>

<400> 5 cccagcaccc aacccaggtt acc atg gcc tcc ctg ttc tet ggc ege atc ctg Met Ala Ser Leu Phe ser Gly Arg ile Leu 15 10

atc	ege	aac	aat	age	gac	cag	gac
Ile	Arg	Asn	Asn	ser 15	Asp	Gin	Asp
agt	ege	agg	ctg	gag	aac	cgg	ctg
Ser	Arg	Arg	Leu 30	Glu	Asn	Arg	Leu
get	tgt	cca	cag	tgc	cag	gcc	ttc
Ala	Cys	Pro	Gin	cys	Gin	Ala	Phe
	45				50
gtg Val	cgg Arg	ctc Leu	aca Thr	gat Asp	gag Glu	ttc Phe	tat Tyr
	60				65
ctg Leu	gtg val	tac Tyr	gtg Val	tcc Ser	cag Gin	gac Asp	tcc ser
75				80
ctc	aag	gac	atg	cca	aag	aaa	tgg
Leu	Lys	Asp	Met	pro 95	Lys	Lys	Trp
ctg	agg	agg	tga
Leu	Arg	Arg
<210> '	6
<2ii> :	109
<212> i	PRT
<21;	3> 1	Homo	sap-	iens

gag	ctg	gat	acg	gag	get	gag	gtc
Glu	Leu	Asp	Thr	Glu	Ala	Glu	val
	20				25
gtg Val	ctg Leu	ctg Leu	ttc Phe	ttt Phe	ggt Gly	get Ala	ggg Gly
35					40
gtg	ccc	atc	ctc	aag	gac	ttc	ttc
val	pro	Ile	Leu	sT	Asp	Phe	Phe
Sta	ctg	cgg	seg	Set	cag	ctg	gcc
Val	Leu	Arg	Ala	Ala	Gin	Leu	Ala
		70
acg	gag	gag	cag	cag	gac	ctg	ttc
Thr	Glu	Glu	Gin	Gin	Asp	Leu	Phe
		85				90
ctt	ttc	ctg	ccc	ttt	gag	gat	gat
Leu	Phe 100	Leu	pro	Phe	Glu	Asp 105	Asp

101

149

197

245

293

341

353

- 77 fcfc fcfcfc· fcfc fcfcfc·

<400> 6

Met

Ala

ser

Leu

Phe

ser

Gly

Arg

Ile

Leu

Ile

Arg

Asn

Ásn

Ser

Asp

1

5

10

15

Gin

Asp

Glu

Leu

ASp

Thr

Glu

Ala

Glu

val

ser

Arg

Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

val

Leu

Leu

Phe

phe

Gly

Ala

Gly

Ala

cys

pro

Gin

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Phe

val

pro

ile

Leu

Lys

Asp

phe

phe

Val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60 .

Pbe

Tyr

val

Leu

Arg

Ala

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

val

Tyr

val

Ser

Gin

65

70

75

80

ASp

Ser

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

ASp

Leu

phe

Leu

Lys

Asp

Met

pro

Lys

85

90

95

Lys

Trp

Leu

Phe 100

Leu

Pro

phe

Glu

Asp 105

Asp

Leu

Arg

Arg

<210>	7
<211>	686
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	¢48)..(686)
<223>

·· «·«· • · « « • · ·» ·· * Μ ·

- 78 4 · · • · · • · · • · · · • 4 »* <400> 7 ccggggacca cacgccgcgc tgtccccagc acccaaccca ggttacc atg gcc tcc 56

Met Ala ser 1 ctg ttc tet ggc ege atc ctg atc ege aac aat age gac cag gac gag 104

Leu Phe ser Gly Arg lle Leu ile Arg Asn Asn ser Asp Gin Asp Glu

10 15 ctg gat acg gag get gag gtc agt ege agg ctg gag aac cgg ctg gtg 152

Leu Asp Thr Glu Ala Glu val ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu val

25 30 35 ctg ctg ttc ttt ggt get ggg get tgt cca cag tgc cag gcc ttc gtg 200

Leu Leu Phe Phe Giy Ala Gly Ala cys pro Gin cys Gin Ala Phe val

45 50

ccc

Pro ctg

Leu gag

Glu ttc

Phe

100 tea

Ser tgc

Cys cag

Gin tgc cys

180 ege

Arg

atc ctc

aag Lys 55

gac ttc ttc

gtg val

cgg ctc aca gat gag ttc

tat Tyr

gta val

248

Ile

Leu

ASp

Phe Phe

Arg 60

Leu Thr

Asp

Glu

Phe 65

cgg

gcg

get cag

ctg

gcc

ctg

gtg

tac

gtg val

tec

cag

gac

tec

acg

296

Arg

Ala Ala Gin 70

Leu

Ala

Leu 75

Val

Tyr

Ser

Gin 80

Asp

ser

Thr

gag

c?g

cag

gac

ctg

ttc

ctc

aag

gac

atg

cca

aag

aaa

tgg

ctt

344

Glu

Gin

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Lys

Lys

Trp

Leu

85

90

95

ctg

ccc

ttt

gag

gat

gat

ctg

agg

agg

gac

ctc

ggg Gly

ege

cag

ttc

392

Leu

Pro

Phe

Glu

asp

Asp

Leu

Arg Arg Asp

Leu

Arg

Gin

Phe

105

UO

115

gtg vál

gag GlU

ege Arg

ctg Leu 120

ccg pro

gcg gtc Ala val

gtg val

O 125

ctc Leu

aag Lys

ccg Pro

gac Asp

999 Gly 130

gac ASp

440

ctc

act

ege

gac

ggc Gly

gcc

gac

gag

atc

cag

ege

ctg

ggc

acc

gcc

488

Leu

Thr

Arg 135

Asp

Ala

Asp

Glu 140

Ile

Gin

Arg

Leu

ů

Thr

Ala

ttc

gcc

aac

tgg

cag

gag

gcg

gcc

gag

gtg val

ctg

gac

ege

aac

ttc

536

Phe Ala

Asn

Trp

Gin

Glu

Ala

Ala

Glu

Leu

Asp

Arg

Asn

Phe

150

155

160

ctg

cca

gag

gac

ctg

gag

gac

cag

gag

cca

cgg

age

ctc

acc

gag

584

Leu

Pro

Glu

Asp

Leu

Glu

Asp

Gin

Glu

Pro

Arg

ser

Leu

Thr

Glu

165

170

175

ctg

ege

ege

cac

aag

tac

ege

gtg

gaa

aag

gcg gcg

ega

ggc Gly

ggg Gly 195

632

Leu

Arg

Arg

His

Lys 185

Tyr Arg

val

Glu

Lys 190

Ala Ala

Arg

gac Ásp

ccc Pro

ggg gga Gly Gly

ggg ggt ggg gag Gly Gly Gly Glu

gag Glu

g?c ggg gcc Gly Gly Ala

gag ggg Gly Gly

ctg Leu

680

200

205

210

686 ttc tga Phe fcfc ···« fcfc «··· » · • fc · • fc · fc * fc * fcfcfcfc* ; ; ♦· ······* # ·· · · · · · · · · • ₄ fcfc fcfcfc ·· ·· ·*

<210>	8
<211>	212
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<400> 8

•

Met

Ala

ser

Leu

Phe

ser

Gly

Arg

Ile

Leu

ile

Arg

Asn

Asn

ser

Asp

1

5

10

15

Gin

ASp

Glu

Leu

ASP

Thr

Glu

Ala

Glu

Val

Ser

Arg

Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

val

Leu

Leu

Phe

Phe

Gly

Ala

Gly

Ala

cys

pro

Gin

cys

Gin

35

• 1» 40

45

Ala

Phe

Val

Pro

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe

Phe

val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Val

Leu

Arg

Ala

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

val

Tyr

val

ser

Gin

65

70

75

80

Asp

Ser

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

ASp

Leu

Phe

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Lys

85

90

95

Lys

Trp

Leu

Phe 100

Leu

Pro

Phe

Glu

Asp 105

ASp

Leu

Arg

Arg

Asp 110

Leu

Gly

Arg

Gin

Phe

ser

Val

Glu

Arg

Leu

Pro

Ala

Val

val

Val

Leu

Lys

Pro

115

120

125

Asp

Gly

Asp

Val

Leu

Thr

Arg

Asp

Gly

Ala

Asp

Glu

Ile

Gin

Arg

Leu

130

135

140

Gly Thr Ala cys Phe Ala Asn Trp Gin Glu Ala Ala Glu val Leu Asp 145 150 155 160

Arg Asn Phe Gin Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gin Glu Pro Arg ser 165 170 175

Leu Thr Glu Cys Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu Lys Ala Ala 180 185 190

Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala 195 200 - 205

Gly Gly Leu Phe 210

<210>	9
<211>	600
<212>	DNA
<213>	Mus museu!us
<220>
<221>	CDS
<222>	(265)..(570)
<223>

<400> 9 ataaaataga gctgtcatcg tcaaggtgag cagtgtcatc cctcttcacg gggtgggaga ctgctgtcgc ctgttccagc ttccagctaa ccgagctcgt ggttgatggc gtggctctgc tttttggtgc ggggcaccca agcttctgga gtggccactg tgctctctcc tcccttcggc agaaggcggg gctgagaggc gcctagtgct gcgggaggct caggtggccg tgcagcccag ggctcgtctc tccactgtgt ggcg atg gtg gac gtg ctg ggc ggg Met val Asp val Leu Gly Gly 1 5 cgg cgc y Arg Arg

120

180

240

291

ctg gtg Leu val 10

acc Thr

cgg •Arg

gag ggc acg gtg gtg gag gcc gag gtg gcg ctg cag Glu Gly Thr Val val Glu Ala Glu vaT Ala Leu Gin

339

15

20

25

aac

aag

gtg val

9ta

gct

ttg

tac

ttt gcg gcg ggc cgg Phe Ala Ala Gly Arg

tgc tcg

CCC

age

387

Asn

Lys

val

Ala

Leu

Tyr

cys

ser

Pro

Ser

30

35

40

cgc

gac

ttc

acg

ccg

ctg

ctc

tgc gac ttc tac

acg gag

ctg

gtg val

age

435

Arg Asp

phe

Thr

Pro

Leu

Leu

cys Asp Phe Tyr

Thr Glu

Leu

Ser

45

50

55

gag

gcg

cgg

cgg

ccc

gct

ccc

ttc gag gtg gtt Phe Glu Val Val

ttc

Stg val

tcg

gca

gac

483

Glu Ala

Arg

Arg

Pro

Ala

Pro

Phe

Ser

Ala

Asp

60

65

70

ggc Gly

agt

gcg

gag

gag

atg ttg

gac ttc atg cgc

flag

ctg

cac

ggc Gly

tcc

531

ser

Ala

Glu

Glu

Met

Leu

Asp Phe Met Arg

Glu

Leu

His

ser

75

80

85

tgg

ctg

gca

ttg

ccc

ttc

cac

gac ccc tac cgg

cag

tga gtggggaccc

580

Trp 90

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe 95

His

Asp Pro Tyr Arg

Gin

aggggtcatg gggctggcgc

600

<210>	10
<211>	101
<212>	PRT
<213>	Mus museu!us
<400>	10

Met val Asp val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr 15 10 15 val Val Glu Ala Glu val Ala Leu Gin Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr 20 25 30

Phe Ala Ala Gly Arg cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 40 45

Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val ser Glu Ala Arg Arg pro Ala Pro 50 55 60

Phe Glu val val Phe val ser Ala Asp Gly ser Ala Glu Glu Met Leu 65 70 75 80

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His 85 90 95

Asp Pro Tyr Arg Gin

<210>	11
<211>	1164
<212>	DNA
<213>	Mus museu!us
<220>
<221>	cos
<222>	(300)..(770)
<223>

- 82 <400> 11 ttgactctgg tgggtagaga gggtttgcaa ggcaggataa aatagagggt gggagaggtt 60 gatggcgtgg ctctgctttt tggtgcgggg caccagctgt catcgctgct gtcgcagctt 120 ctggagtggc cactgtgctc tctcctccct tcggctcaag gtgagctgtt ccagcagaag 180 gcggggctga gaggcgccta gtgctgcggg aggctcagtg tcatcttcca gctaacaggt 240 ggccgtgcag cccagggctc gtctctccac tgtgtcctct tcacgccgag ctcgtggcg 299

atg Met 1 va?

gtg gac val Asp gtg gag val Glu

gtg ctg val Leu 5

ggc Gly gtg val

ggg Gly gcg Ala

cgg cgc ctg Arg Arg Leu

gtg acc cgg Val Thr Arg aag gtg gta

gag ggc acg Glu Gly Thr 15 get ttg tac

347 395

ctg cag

10 aac Asn

gcc Ala 20

gag Glu

Leu

Gin 25

Lys

val

val

Ala 30

Leu Tyr

ttt

s?g gcg

ggc Gly

cgg

tgc tcg

ccc

agc

cgc

gac

ttc

acg

ccg

ctg

ctc

443

Pne Ala Ala

Arg

cys

Ser

Pro

ser

Arg Asp

Phe Thr

Pro

Leu

Leu

35

40

45

tgc gac ttc

tac

acg

gag

ctg

gtg val

agc

gag

gcg

cgg cgg

ccc

get

ccc

491

cys Asp phe

Tyr

Thr

Glu

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg Arg

Pro

Ala

Pro

50

55

60

ttc gag gtg Phe Glu val

gtt Val

ttc Phe

gtg Val

tcg ser

gca Ala

gac ggc Asp Gly

agt ser

gcg gag Ala Glu

gag Glu

atg Met

ttg Leu

539

65

70

75

80

gac ttc atg

cgc

gag

ctg

cac

ggc Gly

tcc tgg

ctg

gca ttg

ccc

ttc

cac

587

Asp Phe Met

Arg

Glu

Leu

His

Ser Trp

Leu

Ala Leu

Pro

Phe

His

85

90

95

gac

ccc tac

cgg

cat

gaa

ctg

aag

aag

agg

tac

gaa

atc

acc

gcc

atc

635

ASp

Pro Tyr

Arg

His

Glu

Leu

Lys

Lys

Arg Tyr

Glu

Zle Thr Ala Zle

100

105

no

ccc Pro

aag ctg Lys Leu

gtg val

gtc Val

atc zle

aag Lys

cag Gin

aac Asn

gga Gly

get gtc Ala val

atc acc Zle Thr

aac Asn

aaa Lys

683

115

120

125

999

cgg aag

cag

atc

ega

gag

cgc

ggg

cta

get tgc

ttt

cag

aac

tgg

731

Gly

Arg Lys

Gin

zle

Arg

Glu 135

Arg

Gly

Leu

Ala cys 140

Phe Gin

Asn

Trp

gtg val

gaa gca

gcc

gat

gtt

ttc

caa

aac

ttc

tcg

ggg

tga ccagggcagt

780

Glu Ala

Ala

Asp

val

Phe

Gin

Asn

Phe

ser

Gly

145 150 155

- 83 tgctggaagt tcagggcaac tatcttcaaa aagggcttag ctggttccct tctctgctga 840 ggaatgtcat tgtagagtca ccatgctgtg acagagagca taaactgctc aggaaagaac 900 tacgtctgcc ccctgtgggt cctagagctc cgttgaatgt ttatttctta cacctttctc 960 caccggtgcc taggatccag gacacatcag ccacgagtta acagaactct atgcaagatg 1020 ctctttccta caggaaattt ctttgataaa ttgacctatg gaggtgatac attttctgat 1080 gacatttttg tgatgctttg gtaaacgtat ttattactcg ggtttgtaga ctgtgtaatt 1140 taataaacca acactcacac tttg 1164

<210>	12
<211>	156
<212>	PRT
<213>	mus museu!us

<400> 12

Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu val Thr Arg Glu Gly Thr 15 10 15

Val val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gin Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr 20 25 30

Phe Ala Ala Gly Arg cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 40 45 cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro 50 55 60

Phe Glu val val Phe Val Ser Ala Asp Gly ser Ala Glu Glu Met Leu

70 75 80

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His

90 95

Asp Pro Tyr Arg His Glu Leu Lys Lys Arg Tyr Glu ile Thr Ala ile

105

110 pro Lys Leu Val val Ile Lys Gin Asn Gly Ala Val ile Thr Asn Lys 115 120 125

Gly Arg Lys Gin Ile Arg Glu Arg Gly Leu Ala cys Phe Gin Asn Trp

135

140 val Glu Ala Ala Asp val Phe Gin Asn Phe ser Gly 145 150 155

• ·

<210>	13
<211>	1472
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<22O>
<221>	CDS
<222>	(331)..(738)
<223>
<400>	13

gtgtgggcgg tggccccgct ctgagtgtct ggtgtgggcg cggggcaccg tcgggtctca ggcgcagttg cccagaggcg cattgtcggc catctagggc cggcgctcgc ggtggctgcg ggggagggtg ggtgccgcgc gcgaacacaa aggtcttgag cgccgcctcc tgtctgcgcc atg gtt gac att ctg _ Met Val Asp ile Leu G 1 5 cagagacctg agggcttgag tgtcgcccag gtatctgggg ttgctccagc cacaggcgag aggtccagcg cccggtggtg ccgcaggtga tcatcctcct

gttgcctggc	60
tctctggtgt	120
gcctggccaa	180
cggacagagg	240
gcaggtgtcc	300
ic gag cgg	354

cac	ctg
His	Leu
	10
cag	aac
Gin	Asn
25
agc	cgc
Ser	Arg

sec gag Ala Glu

gtg val	acc Thr	tgt cys	aag Lys	ggc Giy 15
aag Lys	gtg val	gtg val	gca Ala	ctg Leu
		30
gac	ttc	acg	ccg	ctg
Asp	Phe	Thr	Pro	Leu
	45
gcg	cgg	cgg	ccc	gcg
Ala	Arg	Arg	pro	Ala
	60

gcg acg gtg gag gcc gag Ala Thr val Glu Ala Glu
	20
tac Tyr	ttc gcg gcg gcc Phe Ala Ala Ala 35	cgg Arg
ctc Leu	tgc gac ttc tat acg cys Asp Phe Tyr Thr 50
ccc Pro	ttc gaa gtg gtc ttc Phe Glu Val Val Phe 65

gcg	gcg	ctg	402
Ala	Ala	Leu
tgc	gcg	ccg	450
cys	Ala	Pro
	40
gcg Ala	ctg Leu		498
	55
gtg Val	tca Ser	gcc Ala	546

gac

ggc

agc

tgc

cag

g?g

atg

ctg

gac

ttc

atg

cgc

gag

ctg

cat

ggc

594

Asp

Gly

ser

cys

Gin

Glu

Met

Leu

Asp

Phe

Met

Arg

Glu

Leu

His

Gly

75

80

85

gcc

tgg

ctg

gcg

ctg

ccc

ttc

cac

gac

ccc

tac

cgg

caa

cgg

agt

ctc .

642

Ala

Trp

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe

HIS

Asp

Pro

Tyr

Arg

Gin

Arg

Ser

Leu

90

95

100

get

ctg

ttg

ccc

agg

ctg

gag

tgc

agt

ggc

gtg

atc

tta

get

cac

tgc

690

Ala

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Glu

Cys

ser

Gly

val

ile

Leu

Ala

His

Cys

105

110

115

120

aac

ctt

tgc

ctc

ctg

ggt

tca

agt

gat

tet

cta

gcc

tta

gcc

tcc

tga

738

Asn

Leu

cys

Leu

Leu

Gly

Ser

Ser

Asp

Ser

Leu

Ala

Leu

Ala

Sér

125 130 135

- 85 gcatctggga ctacagccat tgctgtgaat ggacactccg agagtgcagc tgttctcccc tctgtgctca ttaacaatgt gctgtgacca tacccgaaag aaaggaaaag gaagccagta attgcagcac tgttcacaac agccaagatt gaatggataa agaaaacgtg gtacatatac atgagattct gtcatttgca ataatataga taagccaggc acagaaagac aaacatcaca caaaacaatt gaactcttgg acatagagag aaagtggggt tgggaggaag gtgggaatgg ataagaccta atatttgata gcacaacagt catttaaaaa taactataat tgcattgttt aaaaaaaaaa aaaa tacgtgaggg aaagatattg aagaggagtt ccgcaccatc cgtgtcctgc attctgcgag tgtgactcag caatcctgct gctgggtata tattgaagag gtatctgcac ccccatgttt tggaagcaac ctaagtgtcc atcaacagat acaatggagt actcttcagc cattaaaaaa tggaaaagga ggcccttatg tgaagtgaaa tgttctcact tatttgtggg atctaatgat tagaaggttg gttaccagaa gctggaaagg ttaataggta caaaaaaata caaagaataa gtgactactg tcaataatca tttaattgta gtaacacaaa agataaatgc ttgaggagaa

798

858

918

978

1038

1098

1158

1218

1278

1338

1398

1458

1472 <210> 14 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met val Asp lie Leu Gly Glu 1 5

Thr val Glu Ala Glu Ala Ala 20

Phe Ala Ala Ala Arg cys Ala

Arg

Leu pro

His Leu val Thr cys Lys Gly Ala 10 15

Gin Asn Lys val Val Ala Leu Tyr 25 30

Ser Arg Asp Phe thr Pro Leu Leu 45

Cys Asp Phe Tyr Thr	Ala Leu 55	Val Ala Glu	Ala Arg 60	Arg	Pro	Ala	Pro
	50
Phe	Glu va! val Phe	val Ser	Ala Asp Gly	ser Cys	Gin	GÍU	Met	Leu
65		70		75				80
ASp	Phe Met Arg Glu	Leu His	Gly Ala Trp	Leu Ala	Leu	Pro	Phe	His
	85		90				95
Asp	Pro Tyr Arg Gin	Arg ser	Leu Ala Leu	Leu Pro	Arg	Leu	Glu	Cys
	100		105			110
Ser	Gly Val Ile Leu	Ala His	Cys Asn Leu	cys Leu	Leu	Gly	Ser	Ser
	115		120		125
ASp	Ser Leu Ala Leu	Ala ser
	130	135

<210> 15 <211> 702 <212> DNA <213> Mus museu!us <400> 15 atcggatcct ctctgggtcc ccagctcctt gcatactgct accatggcat ctctcttctc 60 tggacgcatc ttgatcagga acaacagcga ccaggatgaa gtggagacag aggcagagct 120 gagccgtagg ttagagaatc gtctggtgtt gctgttcttc ggcgccggcg cctgtcccca 180 gtgccaggcc ttgccccagt cctcaaagac ttcttcgtgc ggctcactga cgagttctac 240 gtgctgcggg cagcacagct ggccctggtc tatgtgtccc aggaccctac agaggagcaa 300 caggacctct tcctcaggga catgcctgaa aaatggctct tcctgccgtc ccactgatga 360 actgaggagg tgaggcccca gggaagacca gggagggctt cctggagaag gcatttccct 420 ggaggtttac tgtcctggta ctacttgtgc actaaagagg tattcctcca caccaaccac 480 aggcgacaac aacacacaag aggtgtccca tccgctcttc catcacagcc cactgacgcc 540 agacagcatc gcgacgctca cggctcagaa aaacacaggt agtctcacag gcctgccatc 600 ctaatactgg ccaccctgag cacaagagcg atggctacaa gcctcaaggc tagaatctaa 660 aaccacgagg tggggaccgt aggccccact ccccgggagc gc 702 • ♦ · ·

- 87 <210> 16 <213> 387 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 16 cggccgctta attaagacgg atccccgact catcttgatc aggaacaaca gcgaccagga ccggttagag aatcgtcttg tgctactgtt ggccttcgcc ccagtcctca aagacttctt acgggcagca cagctggccc tggtctatgt cctgttcctc cgggacatgc ctgaaaagtg gagagacctc gggcgccagt tctccgt <210> 17 <211> 759 <212> DNA <213> Mus muscďl us <400> 17 cagctccttg catactgcta ccatggcatc caacagcgac caggatgaag tggagacaga tctggtgtgc tgttcttcgg cgccggcgcc tcaaagactt cttcgtgcgg ctcactgacg ccctggtcta tgtgtcccag gaccctácag tgcctgaaaa atggctcttc ctgccgttcc agttctctgt ccgtcaactg ccagcggttg caagcgacgc cacggaggag atccagcgtc aggccgcaga gctcctggac cgcagcttcc ggcgcagcat caccgagcct ctgcgccgtc flgagcggggc gaaacggcgc gactctggtg agctctggtg actcccaggg taggagtggg gtgcacgacc gaggttgatg áccctcccga acgtagtcgg gaattcggca cgaggggccg tgaagtggag acagaggcag agctgagccg cttcggtgct ggggcctgtc cccagtgcca cgtgcggctc actgatgagt tctacgtgct gtcccaggac cctacagagg agcaacagga gctcttcctg ccgttccatg atgacctgag

120

180

240

300

360

387 tctcttctct ggacgcatet tgatcaggaa ggcagagctg agccgtaggt tagagaatcg tgtccccagt gccaggcctt gccccagtcc agttctacgt gctgcgggca gcacagctgg aggagcaaca ggacctcttc ctcagggaca atgatgaact gaggagggac ctcgggcgcc tggtacttaa gcctggtggg gacgtgctga tgggacccgc ctgctttgcc aactggcagg tgcaaccgga ggatttggat gagcctgcgc gcaagtaccg agtagaccgg gatgtcggcg aaccccaggg ggacgcgggt acaagggcgg gaccggagct ctggtgacac caaagtaccg aggaaccgg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

759

- 88 <210> 18 <211> 443 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> různé vlastnosti <222> (46)..(46) <223> jakýkoliv nukleotid <400> 18 acgaggtcaa ccttggctac acagggagtc tgaggacagc atgggntaca agaaaccctc 60 tctcaaaacc aaacaaggcc tggcagtact agtgcácttg ggaggcagag gaacaacagc 120 gaccaggatg aagtggagac agaggcagag ctgagccgcc ggttagagaa tcgtcttgtg 180 ctactgttct tcggtgctgg ggcctgtccc cagtgccagg ccttcgcccc agtcctcaaa 240 gacttcttcg tgcggctcac tgatgagttc tacgtgctac gggcagcaca gctggccctg 300 gtctatgtgt cccaggaccc tacagaggag caacaggacc tgttcctccg ggacatgcct 360 gaaaagtggc tcttcctgcc gttccatgat gacctgagga gtaataaaaa ttagaggttg 420 tggctcaaaa aaaaaaaaaa aaa 443

<210>	19
<211>	889
<212>	ONA
<213>	Hotno sapiens

<400> 19 acgccgcgct gtccccagca cccaacccag gttaccatgg cctccctgtt ctctggccgc 60 atcctgatcc gcaacaatag cgaccaggac gagctggata cggaggctga ggtcagtcgc 120 aggctggaga accggctggt gctgctgttc tttggtgctg gggcttgtcc acagtgccag 180 gccttcgtgc ccatcctcaa ggacttcttc gtgcggctca cagatgagtt ctatgtactg 240 cgggcggctc agctggccct ggtgtacgtg tcccaggact ccacggagga gcagcaggac 300 ctgttcctca aggacatgcc aaagaaatgg cttttcctgc cctttgagga tgatctgagg 360 agggacctcg ggcgccagtt ctcagtggag cgcctgccgg cggtcgtggt gctcaagccg 420 gacggggacg tgctcactcg cgacggcgcc gacgagatcc agcgcctggg caccgcctgc 480 ttcgccaact ggcaggaggc ggccgaggtg ctggaccgca acttccagct gccagaggac 540 ctggaggacc aggagccacg gagcctcacc gagtgcctgc gccgccacaa gtaccgcgtg 600 gaaaaggcgg cgcgaggcgg cgcgacccgg gggaggggct ggggacggag gccggggccc 660 ggggggctgt actgaccgct gggtggagca gagggagggg gattggtgga agaacaacaa 720 ccacacgcag ccagcaccag gtatcccgac taggggagac agggcgaaga cctgacccaa 780 agcacaacca ccggggacac taaacgactc aactcaatcc tgtgggcacc aggacaccgc 840 aaaaaaaaac aaaaaaagca aaatgcaaaa aaagacagga catacgacg 889

<210>	20
<211>	348
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	20

tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct 180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct 240 tcgtgtcagc cgacggcagc tcccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg 300 cctggctggc gctgcccttc cacgacccct accggcacca ttgctgtg 348 <210> 21 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gccggtgcgc gccgagccgc gattcacgcc gctgctctgc 180 gacttctata cggcgctggt ggccgagcgc ggggccgcgc cttcgaagtg gtcttcgtgt 240 cagccgacgg cagctcccag gagatgctgg acttcatgcg cgagctgatg gcgcctggct 300 ggcgctgcct tccacgaccc ctaccggcac agccggagcc 340 <210> 22 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct 180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct 240 tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg 300 cctggctggc gctgcccttc cacgaaccct accggcaacg gagtctcg 348

<210>	23
<211>	350
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

- 91 • · φ · · *· <400> 23 tgtcctcggg acctggtgac tggcactgta gcgacttcta tcgtgtcagc gcctggcttg tctcaggtgg ctgtaagggc cttcgcggcg tacggcgctg cgacggcagc gcgctgccct ctgcgtgtct gcgacggtgg gcccggtgcg gtggccgagg tgccaggaga tccacgaccc gcgccatggt aggccgaggc cgccgagccg cgcggcggcc tgcttggact ctaccggcaa

tgacattctg	ggcgagcggc	60
ggcgctgcag	aacaaggtgg	120
cgacttcacg	ccgctgctct	180
cgcgcccttc	gaagtggtct	240
tcatgcgcga	gctgcattgc	300
cggagtctcg		350

<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Přiměř <400> 24 tctatgtgtc ccaggaccct acag 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22O>

<223> Přiměř <400> 25 tttatgcaca agtagtacca ggacag 26 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence »· 9·· ·

- 92 <220>

<223> Primer <400> 26 cgggatccat ggcatctctc ttctctggac gc 32 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 27 ggaattctca cctcctcagt tcatcatgga a 31 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <400> 28 tgttaccaat ctgaagtggg agcggccgac aatttttttt tttttttttt 50 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <400> 29 aattcggcac gagg <210> 30 <211> 10 <212> DNA

9 9 99 ·· 9999 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <40G> 30 cctcgtgccg <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 31 gtaatacgac tcactatagg gc <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> primer <400> 32 ctattacgtc aagcctgtag cc <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 33 catcctcatc tttcttccct tc <210> 34 <211> 22 <212> DNA • Φ φφφφ φ φ φ φ φ φ · φ · · · φφφφ φφφ φφφφ φφ φ φ φφφ φ· ·· · *

- 94 <213> Umělá sekvence <400> 34 gccagcgttt tctgcctttt ac 22 <210> 35 <213> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 35 aagccctgcc tgctctaaca to • · · »♦»· • · φ · • φ · • · · φ • · · φ φ · · · φ ·· ····

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující polypeptidy uvedené v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2 a SEKV. ID. Č. 4.

   2. Izolovaný polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny obsahující polypeptidy uvedené v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2 a SEKV. ID. Č. 4.

   3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle nároku

   2.

   4. Hostitelská buňka obsahující izolovanou molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3.

   5. Vektorová molekula obsahující alespoň fragment izolované DNA podle nároku 3.

   6. Vektorová molekula podle nároku 5 obsahující transkripční kontrolní sekvence.

   7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která za podmínek vysoké stringence hybridizuje s izolovanou DNA podle nároku 3.

   8. Hostitelská buňka obsahující vektorovou molekulu podle nároku 5.

   9. Hostitelská buňka obratlovce, která může být množena in vitro a která je schopné při růstu v kultuře produkovat • · * ·

   - 96 • · · · fc · · · fcfc ·* fcfc fcfc polypeptid podle nároku 1, přičemž buňka obsahuje alespoň jednu transkripční kontrolní sekvenci, a tato jedna nebo více transkripčních kontrolních sekvencí reguluje transkripci DNA, která kóduje polypeptid podle nároku 1.

   10. Buňka obratlovce podle nároku 9, kde jedna nebo více transkripčních kontrolních sekvencí jsou transkripční kontrolních sekvence jiného než humánního původu.

   11. Způsob diagnostiky retinální dystrofie u člověka vyznačující se tím, že zahrnuje kroky: detekce snížené transkripce mediátorové RNA transkribované z DNA kódující polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 v oku člověka,

   přičemž snížená transkripce je trpí retinální dystrofií. indikací toho, že člověk 12. Způsob diagnostiky retinální dystrofie u člověka vyznačující se tím, že zahrnuje kroky: měření množství polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jej ich

   fragmentů v tyčinkových buňkách člověka, přičemž přítomnost sníženého množství polypeptidu nebo jeho fragmentu, ve srovnání s množstvím polypeptidu nebo jeho fragmentu v normální oční tkáni, je indikací toho, že člověk trpí retinální dystrofií.

   13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že krok detekce zahrnuje kroky, kdy se tkáň uvede do kontaktu s protilátkou, která se specificky váže na polypeptid RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jejich fragment, a v tkáni se detekuje tato specifická vazba protilátky na polypeptid, přičemž zjištění specifické vazby protilátky na polypeptid indikuje přítomnost polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jejich fragmentu.

   ·« 9««· 9 ·· 99 ··*· «9 9 «9 9999 9 « « « «««999

   99 999999 9 «••9 999 «999 «· 99 »99 99 99 99

   - 97 14. Purifikovaná protilátky nebo fragment protilátky, která se váže na polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14 nebo její fragment.

   15. Fragment protilátky F(ab')2 fragment. podle nároku 14, který je Fab nebo 16. Protilátka podle nároku 14, která je polyklonální protilátka. 17. Protilátka podle nároku 14, která je monoklonální

   protilátka.

   18. Souprava pro diagostiku retinální dystrofie u člověka vyznačující se tím, že obsahuje prostředky k odběru vzorku a protilátku podle nároku 14.

   19. Způsob přípravy polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 vyznačující se tím, že obsahuje kroky: kultivace hostitelské buňky mající v sobě vložený expresní vektor obsahující exogenní polynukleotid kódující RDCVF1 nebo RDCVF2 v podmínkách, které jsou dostatečné pro expresi polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 v hostitelské buňce, čímž dojde k produkci exprimovaného polypeptidu, a izolace polypeptidu produkovaného buňkami.

   20. Způsob prevence nebo ochrany nervových buněk před degenerací vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se nervové buňky transfekují vektorem, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid RDCVF1 nebo • 4 ·*·· « ·· *· «*«· • * · · · · · · · ♦ « « ··♦·*♦ • · · « ««»*·· · « · · · · ♦· 9 · · * »· ·«· ·· 99 99

   - 98 RDCVF2 operativně spojenou s transkripční kontrolní sekvencí, a kdy je polypeptid exprimován v buňkách.

   21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že nervové buňky jsou retinální buňky.

   22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že vektor je odvozen z adenoviru nebo adeno-asociovaného viru.

   23. Retinoprotektivní agens vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID.

   Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.

   24. Retinoprotektivní agens vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství nukleové kyseliny vybrané ze skupiny SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV.

   ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11 nebo SEKV. ID. Č. 13, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.

   25. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidů vybraného ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV.

   ID. Č. 14, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.

   26. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství nukleové kyseliny vybrané ze skupiny SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV.

   ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11

   9··· 9 9« 9· 9«·· · 9 9* 9999 9

   999 999999

   9999 999 9 9 9 9

   99 999 99 99 99 nebo SEKV. ID. Č. 13, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.

   27. Způsob léčení retinální dystrofie vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství polypeptidů vybraného ze skupiny SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID.

   Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č . 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 a farmaceuticky přijatelného nosiče pacientovi, který takovou léčbu potřebuj e. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že je

   určen k léčení nemoci ze skupiny zahrnující nemoci: retinitis pigmentosa, makulární degenerace se vztahem k věku, Bardetův-Biedlův syndrom, Bassenův-Kornzweigův syndrom, Bestova nemoc, choroidom, spirálovitá atrofie, kongenitální amauróza, Refsumův syndrom, Stargardtova nemoc a Usherův syndrom.

   ·· ····