CZ20033016A3 - Varianty polpeptidu interferonu gamma - Google Patents

Abstract

Řešení popisuje nové varianty polypeptidu interferonu gamma, které vykazují aktivitu interferonu gamma (IFNG), způsoby jejich přípravy, farmaceutické prostředky obsahující varianty polypeptidu a jejich použití při léčbě onemocnění, zvláště při léčbě intersticiálního onemocnění, jako je idiopatická pulmonámi fibróza. Tyto nové varianty polypeptidu všechny obsahují substituci S99T v porovnání s aminokyselinovou sekvencí huIFNG nebo jeho fragmentů. Provedením této mutace se podstatně lépe využívá přirozeně se vyskytující N-glykosybční místo přítomné v poloze 97. Je výhodné, když varianty obsahují další úpravy, například za účelem zvýšení hodnot AUC takových variant v případě, že se aplikují subkutánně.

Description

Oblast techniky

Popisují se nové varianty polypeptidu které vykazují aktivitu interferonu gamma jejich přípravy, farmaceutické prostředky obsahující varianty fY ' 3cf(, interferon gamma, (IFNG), způsoby

polypeptidu a jejich použití při léčbě onemocnění,	zvláště při
léčbě intersticiálního pulmonárního idiopatická pulmonární fibróza.	onemocnění,	jako	je
Dosavadní stav techniky
Interferon gamma (IFNG) je cytokin a přirozenými buňkami K a existuje	produkovaný T-lymfocyty jako homodimér dvou

nekovalentně vázaných polypeptidových podjednotek. Zralá forma každého dimeru obsahuje 143 aminokyselinových zbytků (uvedeno v SEQ ID NO: 17), přičemž jeho forma prekurzoru zahrnuje 166 aminokyselinových zbytků (uvedeno v SEQ ID NO: 18).

Každá podjednotka vykazuje dvě potencionální Nglykosylační místa (popisuje se v publikaci Aggarwal et al., Hurtian Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) v polohách 25 a 97. V závislosti na stupni glykosylace molekulová hmotnost IFNG ve formě diméru je 34 000 až 50 000 (popisuje se v publikaci Farrar et al., Ann. Rev. Immunol. 1993, 11: 571-611).

Primární sekvence lidského IFNG divokého typu (huIFNG) se popisuje v publikaci Gray et al., Nátuře 298: 859-863, 1982,

Taya et al., EMBO J. 1: 953-958, 1982, Devos et al. , Nucleic

Acids Res. 10: 2487-2501, 1982 a Rinderknech et al., J. Biol. Chem. 259: 6790-6797, 1984 a v patentovém dokumentu EP 0 0077

670, EP 0 089 676 a EP 0 110 044. Struktura 3D huIFNG se popisuje v publikaci Ealick et al., Science 252: 698-702,

1991.

• · · • · • 9» ·· ·· » · · · • · · • · · ·

Popisují se různé přirozeně se vyskytující nebo mutované formy podjednotky polypeptidů IFNG, které zahrnují ty podjednotky obsahující N-terminální aminokyselinovou sekvenci Cys-Tyr-Cys (polohy (-3) až (-1) vztaženo k sekvenci SEQ ID NO: 17), dále ty podjednotky obsahující N-terminální methionin (poloha -1 vztaženo k sekvenci SEQ ID NO: 17) a různé formy zkrácené na C-konci obsahující 127 až 134 aminokyselinových zbytků. Je známo, že z C konce se může odstranit 1 až 15 aminokyselinových zbytků, aniž se poruší IFNG aktivita molekuly. Dále heterogennost C-konce huIFNG se popisuje v publikaci Pan et al Eur. J. Biochem. 166: 145-149, 1987

Muteiny huIFNG se popisují v publikaci Slodowski et al, Eur. J. Biochem. 202: 1133-1140, 1991, Luk et al, J. Biol.

Chem. 265:13314-13319, 1990, Seelig et al., Biochemistry 27:

1981-1987, 1988, Trousdale et al., Invest. Ophthalmol. Vis.

Sci. 26: 1244-1251, 1985 a v patentovém dokumentu EP 146354.

Přirozená varianta huIFNG se popisuje v publikaci Nishi et al, J. Biochem. 97: 153-159, 1985.

Patentový dokument USA č. 6 046 034 popisuje termostabilní rekombinantní varianty huIFNG (rhuIFNG), které mají začleněny až 4 páry cysteinových zbytků, aby umožnily tvorbu disulfidového můstku a tak se stabilizovala varianta IFNG ve formě homodiméru.

Patentový dokument WO 92/08737 popisuje varianty IFNG obsahující přidaný methionin na N-terminálním konci celé (zbytky 1 až 143) nebo částečné (zbytky 1 až 132) aminokyselinové sekvence lidského IFNG divokého typu. Patentový dokument EP 0 219 781 popisuje částečné sekvence huIFNG obsahující aminokyselinové zbytky 3 až 124 (sekvence SEQ ID NO: 17). Americký patentový dokument č. 4 832 959 popisuje částečné sekvence huIFNG obsahující zbytky 1 až 127, 5 až 146 a 5 až 127 aminokyselinové sekvence, která při porovnání se sekvencí SEQ ID NO: 17 má tři další N-terminální aminokyselinové zbytky (Cys-Tyr-Cys) . Americký patentový dokument č. 5 004 689 popisuje sekvenci DNA kódující huIFNG bez 3 N-terminálních aminokyselinových zbytků (Cys-Tyr-Cys) a jeho expresi v mikroorganizmu E. coli. V patentovém dokumentu EP 0 446 582 se popisuje rhuIFNG produkovaný v mikroorganizmu

E. coli, který neobsahuje N-terminální methionin. V americkém patentovém dokumentu č. 6 120 762 se popisuje peptidový fragment huIFNG obsahující zbytky 95 až 134 (vztaženo k sekvenci SEQ ID NO: 18).

Silná exprese rhuIFNG se popisuje v publikaci Wang et al. Sci. Sin. B 24: 1076-1084, 1994.

Glykosylační varianta v rhuIFNG se popisuje v publikaci Cyrling et al, Biochem. J. 272:333-337, 1990 a Hooker et al., J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287-295.

Úprava polymeru rhuIFNG se popisuje v publikaci Kita et al Drug Des. Delív. 6: 157-167, 1990 a v patentovém dokumentu EP 236987 a v americkém patentovém dokumentu č. 510 91 20.

Patentový dokument WO 92/22 310 se popisují deriváty interferonů tvořené asialoglykoproteinovým konjugátem, mimo jiné huIFNG.

Popisují se také fúzní proteiny IFNG. Například patentový dokument EP 0 237 019 popisuje jednořetězcový polypeptid, který vykazuje aktivitu vykazující aktivitu IFNG. popisuje jednořetězcový β a jedné dokument 0 obsahuj ící oblasti 158 198 oblast interferonů Patentový polypeptid vykazující aktivitu IFNG a oblast vykazující aktivitu IL-2. Jednořetězcové dimérové proteiny IFNG se popisují v řadě citací, například v publikaci Landar et al., J. Mol. Biol. 2000, 299:169-179) .

• · · · · • tttt·* • tttt ·· *·

Patentový dokument WO 99/02710 popisuje jednořetězcové polypeptidy, jedním příkladem je IFNG.

Patentový dokument WO 99/03887 popisuje varianty polypeptidů upravené PEG patřící k super rodině růstových hormonů, kde nepodstatný aminokyselinový zbytek lokalizovaný ve specifikované oblasti polypeptidů se nahradil cysteinovým zbytkem. IFNG se uvádí jako jeden příklad členů super rodiny růstového hormonu, ale jeho úprava není detailněji popsána.

Naznačuje se, že IFNG je možné použít k léčbě intersticiálního onemocnění plic (také známé jako intersticiální pulmonární fibróza (IPF)) (popisuje se v publikaci Ziesche et al., N. Engl. J. Med. 341: 1264-1269, 1999 a Chest 110: Suppl:25S, 1996 a v patentovém dokumentu EP 0 795 332) a může se použít v kombinaci s prednisolonem. Vedle IPF, je možné pomocí IFNG léčit granulomatozní onemocnění (popisuje se v publikaci Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11: 834-850), jisté mykobakteriální infekce (N. Engl. J. Med. 330: 1348-1355, 1994), karcinom ledvin (J. Urol. 152: 841-845, 1994), osteopetrózu (N. Engl. J. Med. 332: 1594-1599, 1995), skleroderma (J. Rheumatol. 23: 654-658, 1996), hepatitidu B (Hepatogastroenterology 45: 2282-2294), hepatitidu C (Int. Hepatol. Communic. 6: 264-273, 1997), septický šok (nátuře Medicine 3: 678-681, 1997) a revmatoidní artritidu.

používá případě výhodou séru se je 30 rhuIFNG účinky bolesti

Farmaceutický prostředek obsahující rhuIFNG se s jistým úspěchem proti některým virovým infekcím a v nádorů. rhuIFNG se obvykle aplikuje parenterální s podkožní subkutánní injekcí. Maximální koncentrace v dosáhne po sedmi hodinách. Poločas rozpadu v plazmě minut po aplikaci. Z tohoto důvodu účinná léčba pomocí vyžaduje častou aplikaci injekcí. Hlavní nežádoucí zahrnují horečku, mrazení, pocení, bolesti hlavy,

svalů a ospalost. Tyto účinky jsou spojeny s injekcí rhuIFNG a pozorují se v prvních hodinách po aplikaci injekce. Řídce dochází k projevům, jako je lokální bolest a erytém, zvýšení jaterních enzymů, reverzibilní granulopeni a trombopeni a kardiotoxicita.

Patentový dokument WO 01/36001 popisuje nové konjugáty IFNG obsahující nepolypeptidovou část zachycenou na polypeptid IFNG, která se upravila zavedením a/nebo delecí míst zachycení pro takové nepolypeptidové části, jako jsou například místa vhodná pro PEG a glykosylační místa.

Je známo, že když se v glykosylačním hostiteli produkují N-glykosylované molekuly, jako je IFNG, nevyužiji se všechny N-glykosylační místa. To znamená, že docela často se získá směs proteinů, které vykazují kolísající stupeň N-glykosylace in vivo, což naopak vede k tomu, že je nutné následné čištění. Často je časově náročné a obtížné separovat shodné proteiny, které vykazují odlišný stupeň glykosylace. Překvapivě se zjistilo, že substitucí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků lokalizovaných blízko místa N-glykosylace in vivo (nezávisle na skutečnosti, zda N-glykosylační místo je v IFNG přirozené nebo zda se zavedlo, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 01/36001) je možné získat zvýšený podíl zcela glykosylovaných molekul IFNG. Zvláště se zjistilo, že při změně přirozeně se vyskytujícího N-glykosylačního místa N-Y-S v polohách 97, 98 a 99 hIFNG na N-Y-T dochází k dramatickému zvýšení podílu plně glykosylovaných molekul IFNG.

Podstata vynálezu

První předmětnou věcí vynálezu je varianta polypeptidu interferonu gamma (IFNG) vykazující aktivitu IFNG a aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 ( [S99T]huIFNG) nebo její frakvent vykazující aktivitu IFNG.

· ·44· 4444 · · 4 £ 4 · · * 4444

Ο 4444 · 4444 ·

444 44 4444

444 44 4444444 44 ·4

Vynález dále popisuje variantu sekvence SEQ ID NO: 1 zahrnující variantu fragmentů SEQ ID NO: 1 (tak jako SEQ ID NO: 2 až 16) , kde uvedená varianta obsahuje alespoň jednu další úpravu a vykazuje aktivitu IFNG.

Vynález dále popisuje nukleotidovou sekvenci kódující variantu polypeptidu podle vynálezu.

Dále vynález popisuje expresívní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle vynálezu a glykosylační hostitelskou buňku obsahující nukleotidovou sekvenci nebo expresívní vektor podle vynálezu.

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující variantu polypeptidu podle vynálezu, variantu polypeptidu podle vynálezu nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu vhodný pro použití jako léčebný prostředek.

Dále vynález popisuje použití varianty polypeptidu podle vynálezu nebo použití farmaceutického prostředku podle vynálezu při výrobě léčebného prostředku pro léčbu intersticiálního onemocnění plic.

Analogicky, vynález dále popisuje způsob léčby nebo prevence intersticiálního plicního onemocnění, přičemž uvedená metoda zahrnuje aplikaci savci, zvláště člověku, který to potřebuje, účinného množství varianty polypeptidu podle vynálezu nebo farmaceutického prostředku podle vynálezu.

Vynález dále popisuje populaci variant polypeptidu IFNG nebo prostředku, který obsahuje populaci variant polypeptidu IFNG, kde uvedená populace obsahuje alespoň 70 % varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu.

Vynález dále popisuje způsob zvýšení stupně in vivo Nglykosylace rodičovského polypeptidu IFNG, který obsahuje alespoň jedno in vivo N-glykosylační místo s aminokyselinovou • · · · · ·

sekvencí N-X-S, kde symbol X znamená libovolný aminokyselinový zbytek s výjimkou prolinu, přičemž uvedený způsob zahrnuje substituci serinového zbytku v uvedené aminokyselinové sekvenci N-X-S s threoninovým zbytkem, aby se získala varianta IFNG.

Vynález dále popisuje způsob produkce varianty polypeptidů IFNG podle vynálezu, přičemž uvedený způsob zahrnuje

a) kultivaci glykosylační hostitelské buňky obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje variantu polypeptidů IFNG podle vynálezu za podmínek podporujících expresi varianty polypeptidů.

b) možnou reakci uvedené varianty polypeptidů s nepolypeptidovou částí in vitro za podmínek přispívajících ke konjugaci a

c) získání varianty polypeptidů.

Další předmětné věci vynálezu jsou zjevné z následujícího popisu.

Definice

V souladu s vynálezem se aplikovaly následující definice.

Termín „konjugát (nebo je možné zaměnit za „konjugovaný polypeptid nebo „konjugovaná varianta) zahrnuje heterogenní (ve smyslu kombinovanou nebo chimérickou) molekulu vytvořenou kovalentním zachycením jedné nebo více polypeptidových variant na jednu nebo více nepolypeptídových částí. Termín kovalentní zachycení znamená, že varianta polypeptidů a nepolypeptidová část jsou buď přímo vzájemně kovalentně spojeny nebo jsou nepřímo kovalentěn spojeny prostřednictvím interferující části nebo částí, jako je můstek, mezerník nebo spojovací část nebo části. Je výhodné, aby konjugovaná varianta polypeptidů byla rozpustná v relevantní koncentraci a za relevantních podmínek, to znamená, být rozpustná ve fyziologických tekutinách, jako • · · ·

je krev. Příklady variant konjugovaného polypeptidu podle vynálezu zahrnují varianty polypeptidu upravené glykosylací a/nebo PEG. Termín „nekonjugovaná varianta polypeptidu zahrnuje polypeptidovou část konjugované polypeptidové varianty.

Termín „nepolypeptidová část znamená molekulu, která je schopná konjugovat ze zachycenou skupinou varianty polypeptidu IFNG. Výhodné příklady takových molekul zahrnují polymerní molekuly, lipofilni sloučeniny, cukerné části nebo organická derivatizační činidla. Rozumí se, že nepolypeptidová část je spojena s polypeptidem prostřednictvím záchytné skupiny varianty polypeptidu. Výjimku tvoří případ, kde je počet nepolypeptidových částí, jako polymerní molekula(y), zachycených na variantě polypeptidu IFNG výslovně označen, pak odkaz na „nepolypeptidovou část zachycenou na variantě polypeptidu IFNG nebo jinak používanou podle vynálezu znamená jednu nebo více nepolypeptidových částí zachycených na variantě polypeptidu IFNG.

Termín „polymerní molekula se definuje jako molekula vytvořená kovalentním spojením jednoho nebo více monomerů, kde žádný z monomerů není aminokyselinový zbytek. Termín „polymer je možné zaměnit s termínem „polymerní molekula.

Termín „cukerná část znamená molekulu sacharidu zachycenou in vivo nebo in vitro glykosylací, jako je Nglykosylace nebo O-glykosylace.

„N-glykosylační místo má sekvenci N-X-S/T/C, kde symbol X je libovolný aminokyselinový zbytek s výjimkou prolinu a symbol N je asparagin a S/T/C je buď serin, threonin nebo cystein, s výhodou serin nebo threonin, a nejvýhodněji threonin. „O-glykosylační místo je skupina OH serinového nebo threoninového zbytku.

·· • ·

označuje skupinu se spojovat s relevantní polymerní molekula nebo skupiny a jejich párování zřejmé z tabulky uvedené ·· ····

Termín „záchytná skupina aminokyselinových zbytků schopnou nepolypeptidovou částí, jako je cukerná složka. Použitelné záchytné s nepolypeptidovými skupinami jsou dále v textu.

záchytná skupina	aminokyseli- na	příklady nepolypepti- dové části	způsob konjugace/ aktivovaný PEG	citace
-nh2	N-	polymer,	mPEG-SPA	Shearwater
	terminální,	např. PEG	tresylovaný	lne.
	Lys		mPEG	Delgado et al., Critical reviews in therapeutic drug cancer syatems9(3, 4):249-304 (1992)
-COOH	C-	polymer,	mPEG-Hz	Shearwater
	terminální,	např. PEG		lne.
	Asp, Glu	cukerná	spojování
		část	in vitro
-SH	Cys	polymer,	PEG-	Shearwater
		např. PEG	vinylsulfon	lne.
			PEG-	Delgado et
			maleimid	al.,
				Critical
		cukerná	spojení in	reviews in

·· ···· • · · · · ···· ·· ··

		část	vitro	therapeutic drug cancer syatems9(3, 4):249-304 (1992)
-OH	Ser, Thr, OH-, Lys	cukerná část	0- glykosylace in vivo
-CONH2	Asn jako část N- glykosylačn ího místa	cukerná část	glykosylace ín vivo
aromatický	Phe, Tyr,	cukerná	spojení in
zbytek	Trp	složka	vitro
-CONH2	Gin	cukerná část	spojení in vitro	Yan and Wold, Biochemistr y, 1984, Jul 31, 23(16):3759 -65
aldehyd	oxidovaný	polymer,	úprava PEG	Andresz et
keton	uhlovodík	např. PEG, PEG- hydrazid		al., 1978, Makromol. Chem. 179:301, WO 92/16555, WO 00/23114
guanidino	Arg	cukerná část	spojení in vitro	Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modifica-

• 11 •	99 · ·· ·· ···· • · ·♦···♦ · J · · · · · · • · « · ···· · JJ · · ···· • ·· ··· ···· ·· ♦·
				tion, CRC Press lne. Boča Raton, FI
imidazolový kruh	His	cukerná část	spojení in vitro	stejně jako v případě guanidinu

V případě N-glykosylace in vivo termín „záchytná skupina se používá nekonvenčním způsobem k označení aminokyselinových zbytků tvořících N-glykosylační místo (se sekvencí N-X-S/T/C, kde symbol X je libovolný aminokyselinový zbytek s výjimkou prolinu, symbol N je asparagin a S/T/C je buď serin, threonin nebo cystein, s výhodou serin nebo threonin, nejvýhodnější je threonin). Ačkoli asparaginový zbytek N-glykosylačního místa je ten, na kterém se zachytí cukerná část během glykosylace, tak zachycení není možné dosáhnout pokud nejsou v Nglykosylačním místě přítomny ostatní aminokyselinové zbytky.

V případě, že nepolypeptidovou částí je cukerná část a konjugace se dosáhne N-glykosylací, termín „aminokyselinový zbytek obsahující záchytnou skupinu pro nepolypeptidovou část, jak se používá ve spojení s úpravou aminokyselinové sekvence polypeptidů IFNG znamená, že jeden, dva nebo všechny aminokyselinové zbytky tvořící N-glykosylační místo jsou změněny takovým způsobem, že se do aminokyselinové sekvence zavede funkční N-glykosylační místo nebo se odstraní nebo se ponechá (například substitucí serinového zbytku, který už tvoří část N-glykosylačního místa, s threoninovým zbytkem a naopak).

V tomto patentovém dokumentu se používají názvy aminokyselin a atomů (například CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, 0, C atd.), jak se definuje v Proteinové databance (PDB) (www.pdb.org), které vycházejí z názvosloví IUPAC (IUPAC

444·

Amino Acids and Peptides

Eur. J. Biochem.. 138, 9-37

Nomennclature and Symbolism for (názvy zbytků, názvy atomů, atd), (1984) spolu s jejich opravami v Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). CA někdy znamená Ca a CB znamená Οβ. Termín „aminokyselinový zbytek znamená aminokyselinový zbytek obsažený ve skupině zahrnující zbytky alanin (Ala nebo A), cystein (Cys nebo C), kyselinu asparagovou (Asp nebo D) , kyselinu glutamovou (Glu nebo E) , fenylalalnin (Phe nebo F) , glycin (Gly nebo G) , histidin (His nebo H) , izoleucin . (Ile nebo I) , lyzin (Lys nebo K) , leucin (Leu nebo L) , methionin (Met nebo M) , asparagin (asn nebo N) , prolin (Pro nebo P) , glutamin (Gin nebo Q) , arginin (Arg nebo R) , serin (Ser nebo S), threonin (Thr nebo T), valin (Val nebo V) , tryptofan (Trp nebo W) a tyrozin (Tyr nebo Y).

Číslování aminokyselinových zbytků v tomto dokumentu probíhá od N-konce [S99T]huIFNG bez signálního peptidu (to je SEQ ID NO: 1) nebo, kde je to relevantní, od N-konce huIFNG bez signálního peptidu (to je SEQ ID NO: 17) .

Terminologie používaná při označení poloh/substitucí aminokyselin je následující: G18 znamená polohu 18 obsazenou glycinem v aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 17. G18N značí, že zbytek Gly v poloze 18 se nahradil Asn. Více substitucí je označeno symbolem například G18N+S20T znamená aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje substituci zbytku Gly v poloze 18 s Asn a substituci zbytku Ser v poloze 20 s Thr. Alternativní substituce jsou označeny symbolem „/. Například G18S/T znamená následující jednotlivé substituce: G18S a G18T. Delece se značí hvězdičkou. Například G18* znamená, že se deletoval zbytek Gly v poloze 18. Začlenění je značeno následujícím způsobem: začlenění dalšího zbytku Ser po zbytku Gly lokalizovaném v poloze 18 je označeno jako G18GS. Kombinace substitucí a začlenění se značí následujícím způsobem: substituce zbytku ·· ·· • ·· · ··

4· · · ·· · · . _ · · · * · · · · · · · · · · ·

44· ·· ··· ····

Gly v poloze 18 zbytkem Ser a začlenění zbytku Ala po aminokyselinovém zbytku v poloze 18 se značí jako G18SA.

Termín „nukleotidové sekvence znamená po sobě jdoucí pás dvou nebo více molekul nukleotidů. Nukleotidové sekvence může být genomová, cDNA, RNA, semisyntetická, syntetického původu nebo libovolná jejich kombinace.

Termín „polymerázová řetězcová reakce nebo také „PCR v obecném případě znamená způsob amplifikace požadované nukleotidové sekvence in vitro, jak se popisuje například v americkém patentovém dokumentu č. 4 683 195. V obecném případě způsob PCR zahrnuje opakované cykly syntézy pomocí extenze primerů za použití oligonukleotidových primerů schopných s výhodou hybridizovat s templátovou nukleovou kyselinou.

Termíny „buňka, „hostitelská buňka, „buněčná linie a „buněčná kultura je možné zaměnit a rozumí se, že znamenají potomstvo, které je výsledkem růstu a kultivace buňky.

Termín „transformace a „transfekce je možné zaměnit a znamenají postup zavedení DNA do buňky.

Termín „operativně spojený znamená kovalentní spojení dvou nebo více nukleotidových sekvencí enzymatickou ligací nebo jiným způsobem do konfigurace tak, že se může uskutečnit normální funkce sekvencí. Nukleotidové sekvence kódující presekvenci nebo sekreční vedoucí sekvence je operativně spojená s nukleotidovou sekvencí polypeptidu, jestliže se exprimuje jako preprotein, který se podílí na vylučování polypeptidu: promotor nebo zesilovač je operativně spojen s kódující sekvencí, jestliže ovlivňuje transkripcí sekvence, vazebné místo ribozomu je operativně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěno tak, že umožňuje translaci. V obecném případě termín „operativně spojený znamená, že znamená,

9 ···* • · 9 • · · • 9 ·

9 9 ·

99 spojené nukleotidové sekvence jsou souvislé a, v případě sekreční vedoucí sekvence, jsou souvislé a ve čtecí fázi. Spojení se provádí ligací ve vhodných restrikčních místech. Jestliže taková místa neexistují, pak se používají syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery ve spojení se standardními metodami rekombinace DNA.

Termín „úprava, jak se zde používá, znamená substituci, začlenění a deleci.

Termíny „mutace a „substituce je možné zaměnit.

Termín „zavedení znamená substituci existujícího aminokyselinového zbytku, ale může také znamenat začlenění dalšího aminokyselinového zbytku.

Termín „odstranit znamená substituci aminokyselinového zbytku, aby se nahradil jiným aminokyselinovým zbytkem, ale může také znamenat deleci (bez substituce), což znamená odstranění aminokyselinového zbytku.

Termín „aminokyselinový zbytek obsahující záchytnou skupinu pro nepolypeptidovou část znamená, že aminokyselinový zbytek je ten, na který se nepolypeptidová část váže (v případě zavedeného aminokyselinového zbytku) nebo měla být vázána (v případě odstraněného aminokyselinového zbytku).

Termín „rozdíl nebo „lišit se od používaný ve spojení se specifickými úpravami umožňuje přítomnost dalších rozdílů bez ohledu na specifikovaný rozdíl aminokyselin. Tak vedle zde popsaných změn aminokyselinových zbytků vedoucích k optimalizací využití glykosylačních míst nebo k odstranění a/nebo zavedení aminokyselinových zbytků obsahujících záchytnou skupinu pro nepolypeptidovou' část, varianta polypeptidu IFNG může, je-li to potřeba, obsahovat jiné úpravy, které se nevztahují k takovým změnám. Ty mohou například zahrnovat zkrácení C-konce o jeden nebo více •4 ···* • · · ··

»* aminokyselinových zbytků, adici jednoho nebo více dalších zbytků na N-konec a/nebo C-konec, například adici zbytku Met na N-konec, adici aminokyselinové sekvence Cys-Tyr-Cys na Nkonec, stejně jako „konzervativní aminokyselinové substituce, to je substituce provedené skupinami aminokyselin s podobnými charakteristikami, například malé aminokyseliny, kyselé aminokyseliny, polární aminokyseliny, bazické aminokyseliny, hydrofóbní aminokyseliny a aromatické aminokyseliny. Příklady konzervativních substitucí podle vynálezu se mohou zvláště vybrat ze skupin uvedených v tabulce dále v textu.

1	alanin (A)	glycin (G)	serin (S)	threonin (T)
2	kys.asparágo vá (D)	kys. glutamová (E)
3	asparagin (N)	glutamin (Q)
4	arginin (R)	histidin (H)	lyzin (K)
5	izoleucin (I)	leucin (L)	metionin (M)	valin (V)
6	fenylalanin	tyrozin (Y)	tryptofan (W)

Termín „alespoň s nepolypeptidovou částí, jeden nebo více.

jeden používaný ve spojení aminokyselinový zbytkem atd. znamená

Termín „AUC_Sc nebo „plocha pod křivkou v případě, že se aplikuje subkutánně znamená plochu pod křivkou vzniklou vynesením aktivity IFNG v séru a času, kde se varianta polypeptidů IFNG aplikovala subkutánně, zvláště když se aplikovala subkutánně u krys. Když se experimentálně stanovily ·· • · • ·· ·· ···· • ···· • · · · • · · · ·· ·9 body křivky aktivita IFNG proti času je možné vypočítat za použití počítačového programu GraphPad Prism 3.01 AUC_sc.

Termín „funkční poločas in vivo znamená čas, po který je stále v těle/v cílovém orgánu 50 % biologické aktivity polypeptidu nebo čas, při kterém aktivita polypeptidu je 50 % počáteční hodnoty.

Jako alternativa pro stanovení funkčního poločasu in vivo se může stanovit „sérový poločas, což znamená čas, při kterém 50 % polypeptidu cirkuluje v plazmě nebo v krevním oběhu. Stanovení sérového poločasu je často jednoduší než stanovení funkčního poločasu in vivo a hodnota sérového poločasu je obvykle dobrá indikace hodnoty funkčního poločasu in vivo. Alternativní termíny v případě sérový poločas zahrnuje „plazmový poločas, „cirkulační poločas, „sérová clearance, plazmová clearance a „poločas clearance. Sérový poločas se může snadno stanovit u krys, jak se popisuje v tomto patentovém dokumentu v sekci Materiály a metody. Je důležité poznamenat, že termín „sérový poločas v případě danné varianty polypeptidu IFNG se musí stanovit v případě vzorku, který se aplikoval intravenózně (iv).

Termín „sérum znamená krevní plazmu bez fibrinogenu a jiných srážecích faktorů.

Polypeptid v normálním případě mizí působením jednoho nebo více retikuloendoteliálních systémů (RES), ledvin, sleziny nebo jater nebo specifickou nebo nespecifickou proteolýzou. Termín „renální clearance se používá k indikaci libovolné clearance probíhající v ledvinách, například glomerulární filtrace, tubulární exkrese nebo tubulární eliminace.

V normálním případě clearance závisí na fyzikálních charakteristikách polypeptidu zahrnující molekulovou hmotnost, velikost (vztaženo k odstranění molekul o určité velikosti glomerulární filtrací), symetrie, tvar/stabilita, náboj, • * zachycené uhlovodíkové řetězce a přítomnost buněčných receptorů pro polypeptid. Molekulová hmotnost přibližně 67 000 se považuje v normálním případě za velikost molekul, které se dají odstranit renální clearance. Renální clearance se může hodnotit libovolným testem, například testem in vivo. Renální clearance se může stanovit aplikací značeného (například radioaktivně značeného nebo fluorescenčně značeného) konjugovaného polypeptidu pacientovi a stanovením aktivity značení v moči shromážděné od pacienta. Omezená renální clearance se stanovila vzhledem k referenční molekule, jako je huIFNG, [S99T]huIFNG nebo Actimmune®. Funkce, která se má zachovat se v normálním případě vybrala z antivirové, antiproliferativní, ímunomodulační aktivity nebo vazebné aktivity receptorů IFNG.

Termín „zesílený používaný v souladu s funkčním poločasem in vivo nebo sérovým poločasem znamená k označení, že relevantní poločas varianty IFNG se statisticky podstatně zvýšil vzhledem k referenční molekule, jako je glykosylovaný huIFNG (SEQ ID NO: 17), glykosylovaný [S99T]huIFNG (SEQ ID NO:

1) nebo Actimme® (SEQ ID NO: 34-produkovaný v mikroorganizmu E. coli) když se aplikuje intravenózně a když se stanovuje za porovnatelných podmínek. Pak zajímavé varianty polypeptidu IFNG jsou také varianty, které vykazují zvýšený funkční poločas in vivo nebo zvýšený sérový poločas, jak se porovnává s libovolnou referenční molekulou zmiňovanou shora v textu.

Zajímavé varianty IFNG jsou takové varianty, kde poměr mezi sérovým poločasem (nebo funkčním poločasem in vivo) uvedené varianty a sérovým poločasem (nebo funkčním poločasem in vivo) HuIFNG nebo [S99T]huIFNG v jejich glykosylovaných formách je alespoň 1,25, výhodněji alespoň 1,75, například alespoň 2, dokonce výhodněji alespoň 3, tak jako alespoň 4, například alespoň 5, když se aplikují intravenózně, zvláště, když se aplikují intravenózně krysám.

Jiné příklady variant IFNG jsou takové varianty, kde poměr mezi sérovým poločasem (nebo funkčním poločasem in vivo) uvedené varianty a sérovým poločasem (nebo funkčním poločasem in vivo) Actimmune® (SEQ ID NO: 34-produkovaného v mikroorganizmu E. coli) je alespoň 2, výhodněji alespoň 3, tak jako alespoň 4, například alespoň 5, dokonce výhodněji alespoň 6, tak jako alespoň 7, například alespoň 8, nejvýhodněji alespoň 9, tak alespoň 10, když se aplikuje intravenózně, zvláště, když se aplikuje intravenózně u krys.

Termín „zvýšený používaný v případě AUC_sc se používá k indikaci plochy pod křivkou v případě varianty IFNG podle vynálezu, když se aplikuje subkutánně a znamená statisticky podstatné zvýšení vztaženo k referenční molekule, jako je glykosylovaný huIFNG (SEQ ID NO: 17), glykosylovaný [S99T]huIFNG (SEQ ID NO: 1) nebo Actimmune® (SEQ ID NO: 34produkovaný v mikroorganizmu E. coli) stanovené za porovnatelných podmínek. Pak výhodné varianty IFNG jsou takové varianty, které zvyšují AUG_SC ve srovnání s libovolnou referenční molekulou uvedenou v shora v textu. Evidentně stejné množství aktivity IFNG by se mělo aplikovat v případě varianty IFNG podle vynálezu a v případě referenční molekuly. Následně za účelem provést přímé porovnání mezi různými molekulami IFNG hodnoty AUC_sc se mohou normalizovat, to znamená, že se mohou vyjádřit jako AUC_sc/aplikovaná dávka.

Zvláště výhodné varianty IFNG jsou takové varianty, kde poměr mezi AUC_sc uvedené varianty a AUC_sc glykosylovaného huIFNG nebo glykosylovaného [S99T]huIFNG je méně než 1,25, tak jako alespoň 1,5, například alespoň 2, výhodněji alespoň 3, tak jako alespoň 4, například alespoň 5 nebo alespoň 6, dokonce výhodněji alespoň 7, tak jako alespoň 8, například alespoň 9 nebo alespoň 10, nejvýhodněji alespoň 12, tak jako alespoň 14, například alespoň 16, alespoň 18 nebo alespoň 20 zvláště, když se aplikuje (subkutánně) u krys.

··· ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

Jinými příklady zvláště výhodných variant IFNG jsou takové varianty, kde poměr mezi AUC_sc uvedené varianty a AUC_sc Actimmune® je alespoň 100, výhodněji alespoň 150, tak jako alespoň 200, například alespoň 250, dokonce výhodněji alespoň 300, tak jako alespoň 400, například alespoň 500, výhodněji alespoň 750, tak jako alespoň 1 000, například alespoň 1 500 nebo alespoň 2 000 zvláště, když se aplikují (subkutánně) krysám.

Termín „T_max,_sc se používá v souladu s časem v křivce aktivita IFNG v seru vyneseném proti času, kdy se pozoruje nejvyšší aktivita v seru. Výhodné varianty IFNG podle vynálezu jsou takové varianty, které zvýší T_max,_sc ve srovnání s Actimmune® a/nebo ve srovnání s glykosylovaným huIFNG. Takové výhodné varianty vykazují T_max<sc (když se stanoví po subkutánní aplikaci u krys) alespoň 200 minut, tak jako alespoň 250 minut, například alespoň 300 minut, výhodněji alespoň 350 minut, tak jako alespoň 400 minut.

Termín „redukovaná imunogennost znamená, že varianta polypeptidu IFNG vykazuje měřitelně nižší imunitní odezvu ve srovnaní s

Actimmune®, například huIFNG nebo srovnatelných podmínek, nebo humorální odezva referenční molekulou, jak se stanovilo za Imunitní odezva může být buněčná (popisuje se například v publikaci Roitt: Essential Immunology (8 th Edition, Blackwell), další definice imunogennosti). Normálně redukovaná protilátková reaktivita je indikací redukované imunogennosti. Redukovaná imunogennost se může stanovit použitím libovolné vhodné metody známé v oboru, jako například in vivo nebo in vitro.

Termíny „zvýšená glykosylace, „zvýšený stupeň in vivo Nglykosylace nebo „zvýšený stupeň N-glykosylace znamená zvýšené množství zachycených sacharidových molekul normálně získaných následkem zvýšeného (nebo lepšího) využití glykosylačního místa. Je dobře známo (popisuje se v publikaci Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287295 a Sarenva et al., 1995, Biochem J. , 308, 9-14), že když se huIFNG exprimoval v buňkách CHO, pouze 50 % molekul IFNG využívá obě glykosylační místa, přibližně 40 % využívá jedno glykosylační místo (IN) a přibližně 10 % není glykosylováno (ON) . Zvýšený stupeň in vivo glykosylace se může stanovit libovolnou vhodnou metodou známou v oboru, jako je například SDS-PAGE. Jedním vhodným testem pro stanovení zvýšené glykosylace je způsob popsaný v sekci s názvem „Stanovení zesílené glykosylace v sekci Materiály a metody.

Zde používaný termín „populace variant polypeptidů IFNG nebo „prostředek obsahující populaci variant polypeptidů IFNG znamená prostředek obsahující alespoň dva polypeptidy IFNG glykosylované v různém rozsahu. Rozumí se, že vynález popisuje způsoby získání populace polypeptidů IFNG, kde zvýšené množství molekul IFNG přítomné v populaci je zcela glykosylováno.

Vynález také popisuje homogenní populaci polypeptidů IFNG podle vynálezu (to je populaci, kde většina polypeptidů IFNG je zcela glykosylovaných) nebo prostředek obsahující homogenní populaci polypeptidů IFNG podle vynálezu. Populace polypeptidů IFNG může obsahovat alespoň 70 % polypeptidů IFNG podle vynálezu, s výhodou alespoň 75 %, jako alespoň 80 %', například alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, tak jako alepsoň 95 %, například alespoň 96 %, dokonce výhodněji alespoň 97 %, tak jako alespoň 98 %, například alespoň 99 %.

Termín „vykazující aktivitu IFNG znamená, že varianta polypeptidů má pouze jednu nebo více funkcí přirozeného huIFNG nebo rhuIFNG, které zahrnují schopnost vázat se na receptor IFNG a způsobovat transdukci signálu transdukovaného při huIFNG-navázání na jeho receptor, jak se stanovilo in vitro ··· · · · · · · ··· ·· «·· ··«· ·· 44 nebo in vivo (to je bioaktivita in vivo nebo in vitro) . Receptor IFNG se popisuje v publikaci Aguet et al. Cell 55: 273-280, 1988 a Calderon et al., Proč. Nati Acad. Sci USA 85: 4837-4841, 1988. Vhodný test pro testování aktivity IFNG je zde popsaný test nazvaný „primární test. Když se používá zde popsaný „primární test, pak polypeptidové varianty „vykazující aktivitu IFNG mají specifickou aktivitu alespoň 5 % ve srovnání s rhuIFNG. Rozumí se, v závislosti na provedených specifických úpravách, například zda varianta je upravena PEG nebo ne, může se intenzita aktivit pohybovat v širokém rozmezí. Tak například specifické aktivity mohou být v rozmezí 5 % až 150 % ve srovnání s rhuIFNG. Například specifická aktivita může být alespoň 10 % (například 10 až 125 %), tak jako alespoň 15 % (například 15 až 125 %), například alespoň 20 % (tak jako 20 až 125 %), alespoň 25 % (například 25 až 125 %), alespoň 30 % (například 30 až 125 %) , alespoň 35 % (například 35 až 125 %), alespoň 40 % (například 40 až 125 %) , alespoň 45 % (například 45 až 125 %) , alespoň 50 % (například 50 až 125 %), alespoň 55% (například 55 až 125 %), alespoň 60 % (například 60 až 125 %) , alespoň 65 % (například 65 až 125 %, alespoň 70 % (například 70 až 125 %), alespoň 75 % (například 75 až 125 %), alespoň 80 % (například 80 až 125 %) nebo alespoň 90 % (například 90 až 110 %) ve srovnání se specifickou aktivitou rhuIFNG.

Termín „polypeptid IFNG je polypeptid vykazující aktivitu IFNG, to znamená, že se používá v souladu s libovolnou molekulou IFNG (nezávisle na tom, zda je tato molekula huIFNG, jeho zkrácená forma nebo jeho varianta) pokud uvedená molekula vykazuje aktivitu IFNG, jak se zde definuje. Termín „polypeptid IFNG se používá, jestliže se polypeptid vyskytuje v monomerní nebo dimérní formě, jak je to vhodné. Když jsou například indikovány specifické substituce, vztahují se k monomeru polypeptidu huIFNG. Když se zmiňuje molekula IFNG podle vynálezu, jde v normálním případě o dimerní formu ···· · · · · · · · ··· ♦ · * · · • · · · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· (obsahuje například dva monomery polypeptidu IFNG upravené, jak se popisuje shora v textu). Dimerní forma polypeptidů IFNG může vzniknout normálním spojením dvou monomerů nebo může být ve formě dimerního polypeptidu IFNG s jedním řetězcem.

Termín „původní znamená polypeptid IFNG, který vykazuje glykosylační místo (a) zdokonalená podle vynálezu. Ačkoli původní polypeptid, který se upraví podle vynálezu, může být libovolný polypeptid s aktivitou IFNG a tak může být získán z libovolného původu, například ze savce, kterým není člověk. Je výhodné, že původní polypeptid je huIFNG s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 17 nebo jeho fragment.

Termín „fragment je část polypeptidové sekvence IFNG celé délky (například fragment polypeptidu huIFNG plné délky zobrazený v SEQ ID NO: 17 nebo fragment celé délky varianty polypeptidu [S99T]huIFNG zobrazený v SEQ ID NO: 1) vykazující aktivitu IFNG, například jeho verze zkrácená na C nebo Nkonci. Specifické příklady fragmentů varianty polypeptidu IFNG zahrnují [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci o 1 až 15 aminokyselinových zbytků, například o 1 aminokyselinový zbytek (SEQ ID NO. 2), o 2 aminokyselinové zbytky (SEQ ID NO: 3), o 3 aminokyselinové zbytky (SEQ ID NO: 4), o 4 aminokyselinové zbytky (SEQ ID NO: 5) , o 5 aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: β), o 6 aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 7), o 7 aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 8), o 8 aminokyselinových

zbytků (SEQ ID NO:	9) , o	9 aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID
NO: 10), o 10 aminokyselinových zbytků (	SEQ ID	NO: 11)	, o	11
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	12) ,	o	12
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	13) ,	o	13
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	14) ,	o	14
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID NO	: 15)	nebo	o	15

aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 16) a/nebo N-terminálně zkrácená forma o 1 až 3 aminokyselinové zbytky. Specifické příklady fragmentů huIFNG zahrnuji huIFNG, který je zkrácený

na C-konci o 1 až 15 aminokyselinových zbytků, například o 1 aminokyselinový zbytek (SEQ ID NO. 19), o 2 aminokyselinové zbytky (SEQ ID NO: 10), o 3 aminokyselinové zbytky (SEQ ID NO:

21) , o 4 aminokyselinové	zbytky	(SEQ	ID	NO: 22)	, o	5
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	23),	o	6
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	24) ,	o	7
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	25) ,	o	8
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	26) ,	o	9
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	27) ,	o	10
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	28) ,	o	11
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	29) ,	o	12
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	30) ,	o	13
aminokyselinových	zbytků	(SEQ	ID	NO:	31) ,	o	14
aminokyselinových	zbytků	(SEQ ID	NO:	32)	nebo	o	15
aminokyselinových	zbytků (SEQ ID NO	: 33)	a/nebo N-terminálně

zkrácený o 1 až 3 aminokyselinových zbytků.

Jak se popisuje shora v textu varianta polypeptidu IFNG může obsahovat alespoň jednu další úpravu vedle substituce S99T dokud varianta vykazuje aktivitu IFNG, to znamená, že varianta může být variantou [S99T]huIFNG nebo variantou fragmentu [S99T]huIFNG. Specifické příklady takových variant jsou varianty vykazující zavedené a/nebo odstraněné aminokyselinové zbytky obsahující záchytnou skupinu nepolypeptidové části. Jiné příklady variant [S99T]huIFNG (a jejich fragmentů) jsou varianty popsané v sekci Dosavadní stav techniky shora v textu a zahrnují například [S99T]huIFNG s Nterminální adicí Cys-Tyr-Cys nebo s Met a varianty upravené cysteinem popsané v americkém patentovém dokumentu 6 046 034.

V normálním případě varianta podle vynálezu je kódovaná nukleotidovou sekvencí, která ve srovnání s nukleotidovou sekvencí kódující původní polypeptid IFNG se upravila v souladu s vynálezem.

• 4

4 4 • 4

To však nemusí být ten případ, protože varianta polypeptidu se může vystavit zkrácení na C-konci nebo N-konci během post-translančního zpracování, například štěpení na Ckonci nebo N-konci proteázami v buňce, v expresním médiu, během čištění atd. tak, že výsledná varianta polypeptidu je zkrácenou verzí původně produkované varianty polypeptidu (například ačkoli se z počátku produkuje varianta o celé délce je možné post-translačním zpracováním získat variantu polypeptidu zkrácenou na C-konci). V tomto případě termín „původní by měl být zkonstruovaný jako zkrácená forma, která se bude upravovat podle vynálezu.

Termín „varianta znamená polypeptid, který se liší jednou nebo více aminokyselinami od svého původního polypeptidu (v normálním případě SEQ ID NO: 17 nebo libovolná z jejích zkrácených forem zobrazených v SEQ ID NO: 19 až 33), v typickém případě obsahuje 1 až 15 aminokyselinových zbytků (jako 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinových zbytků), například 1 až 10 aminokyselinových zbytků, 1 až 5 aminokyselinových zbytků nebo 1 až 3 aminokyselinové zbytky.

Termín „funkční místo znamená jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které jsou podstatné nebo se jinak podílejí na funkci IFNG. Takové aminokyselinové zbytky „se nacházejí ve funkčním místě. Funkční místo se může stanovit způsoby známými v oboru a s výhodou se identifikuje analýzou struktury polypeptidu, který tvoří komplex s relevantním receptorem, jako je receptor IFNG.

Termín „huIFNG znamená zralou formu lidského IFNG divokého typu, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 17.

··· ·· · · · · •·· ·· ···«··· · · ··

Termín rhuIFNG znamená zralou formu lidského IFNG divokého typu obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 17, která se připravuje rekombinací.

Termín „[S99TJhuIFNG se používá k určení zralé formy lidského IFNG divokého typu, kde serinový zbytek v poloze 99 se nahradil threoninovým zbytkem (popsaným v SEQ ID NO: 1).

Termín „glykosylovaný huIFNG znamená, že z polypeptidů huIFNG se připravuje v buňce schopné glykosylovat glykosylovaný polypeptid a proto polypeptid huIFNG je glykosylován v jeho přirozených místech N-glykosylace (poloha 25 a 97 SEQ ID NO: 17) .

Podobně termín „glykosylovaná varianta huIFNG znamená, že varianta polypeptidů IFNG se připravuje v buňce schopné

glykosylovat	variantu polypeptidů.
Termín	„Actimmune® znamená formu IFNG	obsahující 140
aminokyselin	(Actimmune® je forma	zkrácená	na C-konci
obsahující	4 aminokyselinové zbytky	a zahrnuje	na N-konci
zbytek Met)	(popisuje sekvence SEQ	ID NO:	34)	, které se
dosáhlo fermentací geneticky upravené	bakterie	E.	coli. Další
informace	o přípravku Actimmune®	j sou	dostupné na

www.actimmune.com.

Varianty polypeptidů interferonu gamma podle vynálezu

Varianty IFNG podle vynálezu s optimalizovanými glykosylačními místy in vivo

Překvapivě se zjistilo, že je možné zesílit glykosylaci přirozeně se vyskytujícího glykosylačního místa lokalizovaných v poloze 97 huIFNG. To znamená, že může být získána silnější frakce zcela nebo podstatně glykosylovaných molekul IFNG substitucí serinového zbytku lokalizovaného v poloze 97 huIFNG (nebo jeho fragmentů) s threoninovým zbytkem. Prozkoumání Obr.

• · · · ·· ··« · ♦ · · · 9 ♦ • · · * ···· ··· · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· ukázalo, že je možné dosáhnout podstatného zvýšení stupně glykosylovaného polypeptidu IFNG. V případě varianty polypeptidu [S99T]huIFNG (SEQ ID NO: 1) je možné vidět, že přibližně 90 % variant polypeptidu přítomných ve shromážděném médiu využívaly obě N-glykosylovaná místa, zatímco pouze přibližně 60 % polypeptidu rhuIFNG přítomných ve shromážděném médiu bylo plně glykosylováno.

První předmětná věc vynálezu popisuje variantu polypeptidu IFNG vykazující aktivitu IFNG a aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1 (to je [S99T]huIFNG) nebo její fragment vykazující aktivitu IFNG.

Jak se už uvedlo shora v textu, je známo, že formy huIFNG zkrácené na svém C-konci si uchovávají aktivitu a v některých případech dokonce vykazují zvýšenou aktivitu ve srovnání s huIFNG. Pak v zajímavém provedení vynálezu variantou polypeptidu IFNG je fragment SEQ ID NO: 1, který je zkrácený na C-konci a obsahuje 1 až 15 aminokyselinových zbytků. V typickém případě jde o fragment zkrácený na C-konci a obsahující 1 až 10 aminokyselin. Specifické příklady takových forem zkrácených na C-konci je SEQ ID NO: 1, jak se popisuje v SEQ ID NO: 2 až 16. Fragment polypeptidu IFNG v tomto provedení vynálezu vykazuje aktivitu IFNG.

Rozumí se, že glykosylované varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu by se měly exprimovat rekombinantně v glykosylující hostitelské buňce s výhodou v savčí hostitelské buňce, jako je libovolná buňka z těch popsaných v sekci „Spojování se sacharidovou částí

Jak je vysvětleno shora v textu, pouze přibližně 50 až 60 % celkové populace exprimovaných polypeptidů IFNG je zcela glykosylováno, v případě, že rhuIFNG se exprimuje v buňkách CHO. Pak jednou z hlavních výhod variant polypeptidů IFNG podle vynálezu je vyšší využití N-glykosylovaného místa in

4« 4 44 44 4444

44 44 44 ·

4 4 4 4 4 4

444 4 4444 · . 44 44 4444

444 44 4444444 44 44 vivo v poloze 97, což vede k získání více homologní populace ve srovnání s huIFNG. Prostředky (například shromážděné kultivační médium) obsahující takovou populaci variant polypeptidů IFNG nevyžaduje obtížné a časově náročné čištění jako rhuIFNG.

Vynález dále popisuje populaci variant polypeptidů IFNG nebo prostředek obsahující populaci variant polypeptidů IFNG, kde uvedená populace obsahuje alespoň přibližně 70 % varianty polypeptidů IFNG podle vynálezu. Prostředek s výhodou obsahuje alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 % dokonce ještě výhodněji alespoň 85 %, jako přibližně 90 % varianty polypeptidů IFNG podle vynálezu.

Vynález popisuje populaci variant polypeptidů IFNG nebo prostředek obsahující populaci variant polypeptidů IFNG, kde uvedená populace obsahuje alespoň 70 %, s výhodou alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, dokonce ještě výhodněji alespoň 85 %, jako přibližně 90 % varianty polypeptidů IFNG obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.

Analogicky vynález také popisuje populaci variant polypeptidů IFNG nebo prostředek obsahující populaci variant polypeptidů IFNG, kde uvedená populace obsahuje alespoň 70 %, s výhodou alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, dokonce ještě výhodněji alespoň 85 %, jako přibližně 90 % fragmentu varianty polypeptidů IFNG, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:

8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16.

Vedle už zmiňované mutace S99T nutné pro optimalizaci Nglykosylačního místa in vivo v poloze 97 v rhuIFNG je možné optimalizovat i jiná glykosylační místa in vivo, která se zavedla do SEQ ID NO: 1 (například za účelem zvýšení sérového ·· ···· • 4· • · * · · 9 · • · · 9 · • 9 9·· · • 9 9 9 9 9

999 9999 9 9 99 poločasu a/nebo zvýšení AUC_sc. V normálním případě glykosylační místo in vivo je N-glykosylační místo, ale také O-glykosylační místo se považuje za relevantní podle vynálezu. Této optimalizace je možné dosáhnout provedením úpravy, výhodná je substituce v poloze, která se nachází blízko glykosylačního místa, zvláště v blízkosti in vivo glykosylace. V typickém případě takové in vivo N-glykosylační místo je zavedeno do in vivo N-glykosylačního místa. Specifické příklady vhodných poloh pro zavedení in vivo N-glykosylačních míst se popisují v patentovém dokumentu WO 01/36001 a dále v textu.

Aminokyselinový zbytek „lokalizovaný blízko glykosylačního místa se obvykle nachází v poloze -4, -3, -2, 1, +1, +2, +3 nebo +4 vztaženo k aminokyselinovému zbytku glykosylačního místa, na kterém je zachycen sacharid, s výhodou v poloze -1, +1 nebo +3, zvláště v poloze +1 nebo +3. Pak aminokyselinový zbytek lokalizovaný blízko in vivo glykosylačního místa (vykazující sekvenci N-X-S/T/C) se může nacházet v poloze -4,-3, -2, -1, +1, +2, +3 nebo +4 vztaženo k N-zbytku.

V případě, že poloha +2 vztaženo ke N-zbytku je upravena, rozumí se, že je možné provést pouze omezený počet úprav za účelem udržet/zavést in vivo N-glykosylační místo. Aminokyselinovým zbytkem v uvedené poloze musí být buď Ser, Thr nebo Cys.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu úprava aminokyselinového zbytku v poloze +2 vzhledem k in vivo Nglykosylačnímu místu je substituce, kde je aminokyselinový zbytek nahrazen zbytkem Thr. Jestliže na druhou stranu uvedený aminokyselinový zbytek je už Thr, není v normálním případě výhodné nebo nutné provést substituci. V případě, že symbol X je upraven, symbol X by neměl být Pro s výhodou ne Trp, Asp, Glu a Leu. Dále aminokyselinový zbytek, který se bude zavádět, • 4 4 · · · ·· 44 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

444 4 4444 4

444 44 4444

444 44 444 4444 44 44 se s výhodou vybral ze skupiny zahrnující Phe, Asn, Gin, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys a Ser, s výhodou Ala, Met, Ile, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys a Ser, zvláště Ala nebo Ser.

V případě, že se upraví poloha +3 vzhledem k N-zbytku, pak zaváděná aminokyselina se s výhodou vybrala ze skupiny obsahující His, Asp, Ala, Met, Asn, Thr, Arg, Ser a Cys, výhodněji Thr, Arg, Ser a Cys. Takové úpravy jsou zvláště relevantní, jestliže zbytek X je zbytek Ser.

Pak vzhledem k přirozeně přítomné in vivo glykosylaci se předpokládá, že N-glykosylované místo v poloze 97 se může dále optimalizovat provedením úpravy, jako je substituce v poloze vybrané ze skupiny zahrnující E93, K94, L95, T96, Y98, V100 a T101 (to je v poloze -4, -3, -2, -1, +1, +3 nebo +4 vzhledem k N97). Specifické příklady substitucí provedené v poloze 98 SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) zahrnují Y98, Y98N, Y98Q,

Y98V, Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T, Y98H, Y98C a

Y98S, s výhodou Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T,

Y98H, Y98C a Y98S, zvláště Y98S. Specifické příklady substitucí provedených v poloze 100 sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo jejího fragmenty) zahrnují V100H, V100D, V100A, V100M, V100N, V100T, V100R, V100S nebo V100C, zvláště V100T, V100R,

V100S nebo V100C.

Pokud jde o in vivo N-glykosylační místo v poloze 25, předpokládá se, že může být dále optimalizováno úpravou, jako je substituce v poloze vybrané ze skupiny obsahující D21, V22, A23, D24, G26, L28 a F29 (to je poloha -4, -3, -2, -1, +1, +3, nebo +4 vztaženo k N25). Specifické příklady substitucí provedené v poloze 26 sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) zahrnují G26F, G26N, G26Y, G26Q, G26V, G26A, G26M, G26I, G26K, G26R, G26T, G26H, G26C a G26S, s výhodou G26A,

G26M, G26I, G26K, G26R, G26T, G26H, G26C a G26S, výhodnější je

4444 • · 4 · · · · · 4 4 4 4 4 44 4444

444 44 444 4444 44 <4

G26A a G26S, zvláště G26A. Specifické příklady substitucí provedených v poloze 28 sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo jejího fragmentu) zahrnují G28H, G28D, G28A, G28M, G28N, G28T, G28R,

G28S nebo G28S, zvláště G28A, G28T, G28R, G28S nebo G28C.

Libovolné úpravy zmiňované ve spojení s optimalizací glykosylace v poloze 97 se mohou kombinovat s libovolnými ve shora v textu zmiňovanými úpravami provedenými ve spojení s optimalizací glykosylace v poloze 25.

Varianty IFNG podle vynálezu se zvýšenou AUC_sc a/nebo zvýšený sérový poločas

Vynález dále popisuje variantu polypeptidů IFNG obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1, kde uvedená varianta vykazuje aktivitu IFNG.

Vynález dále popisuje variantu fragmentu polypeptidů IFNG obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16, kde uvedená varianta vykazuje aktivitu IFNG.

Taková varianta obsahuje alespoň jednu další úpravu ve srovnání se sekvencí SEQ ID NO: 1 až 16.

Za účelem zabránit porušení struktury a funkce varianty polypeptidů [S99T]huIFNG (nebo její fragmenty) celkový počet aminokyselinových zbytků, které se musí upravit v souladu s vynálezem, v normálním případě nepřekračuje počet 15. Varianta polypeptidů IFNG obvykle obsahuje 1 až 10 úprav vztaženo k aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO: 1, jako jsou úpravy v poloze 1 až 8, 2 až 8, 1 až 5, 1 až 3 nebo 2 až 5 vztaženo k aminokyselinové sekvenci zobrazené v sekvenci SEQ ID NO: 1. Úpravou je s výhodou substituce.

·· ···· ·· ·· · · tt * · tttt tt tttttt· • tttt · · * · · · • · tttt · · · · ··· tttt tttttt tttttttt ·· tt·

Rozumí se, že podobná uvažování platí v případě variant fragmentů varianty polypeptidů IFNG obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1.

V případě, že varianta je variantou libovolné ze sekvencí popsané v SEQ ID NO: 2 až 16, pak taková varianta obvykle obsahuje méně než 15 úprav, v typickém případě 1 až 10 úprav vzhledem k relevantní aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO: 2 až 16, jako jsou úpravy v polohách 1 až 8, 2 až 8, 1 až 5, 1 až 3 nebo 2 až 5 vztaženo k relevantní aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO: 2 až 16. Úpravou je s výhodou substituce.

V normálním případě taková varianta polypeptidů IFNG (to je varianta, která obsahuje alespoň další úpravu vedle substituce S99T) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence zobrazené v SEQ ID NO: 1 (nebo její fragment) 1, 2, 3, 4, 5, β, Ί, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14 nebo 15 aminokyselinovými zbytky.

Ve výhodném provedení vynálezu varianta IFNG (dále) obsahuje alespoň jeden zavedený a/nebo alespoň jeden odstraněný aminokyselinový zbytek obsahující záchytnou skupinu vhodnou pro nepolypeptidovou část.

Odstraněním nebo zavedením aminokyselinového zbytku obsahujícího záchytovou skupinu pro nepolypeptidovou část je možné specificky adaptovat polypeptid tak, aby se vytvořila molekula více náchylná ke konjugaci se zvolenou nepolypeptidovou částí na povrchu varianty polypeptidů IFNG a čímž se získá nová konjugovaná molekula, která vykazuje aktivitu IFNG a navíc jednu nebo více zdokonalených vlastností, což je možné porovnat s molekulami založenými na huIFNG nebo rhuIFNG, které jsou v současné době dostupné. Například zavedením záchytných skupin je varianta polypeptidů IFNG zesílena nebo jinak změněna, co se týká obsahu ·· ···· ··· · » « » » 9 1 • · · · 1 • ···* *· specifických aminokyselinových zbytků, na které se váží relevantní nepolypeptidové části, čímž se dosáhne účinnější, specifické a/nebo rozsáhlejší konjugace. Odstraněním jedné nebo více záchytných skupin je možné zabránit konjugaci s nepolypeptidovou částí v částech polypeptidu, ve kterých je taková konjugace nevýhodná, například aminokyselinový zbytek lokalizovaný ve funkčním místě polypeptidu nebo v jeho blízkosti (protože konjugace v takovém místě může vést k deaktivaci nebo redukci aktivity IFNG konjugovaného polypeptidu, což je způsobené rozeznáním receptoru).

výsledného nesprávným

Dále může být výhodné odstranit záchytnou skupinu lokalizovanou blízko jiné záchytné skupiny za účelem zabránit heterogenní konjugaci takových skupin. V zajímavých provedeních vynálezu se změní více než jeden aminokyselinový zbytek polypeptidu, například změna obsahuje odstranění stejně jako zavedení aminokyselinových zbytků obsahujících záchytná místa pro zvolenou nepolypeptidovou část. Toto provedení se považuje za zvláště zajímavé tím, že je možné specificky navrhnout variantu polypeptidu IFNG tak, aby se získala optimální konjugace s nepolypeptidovou částí.

Vedle odstranění a/nebo zavedení aminokyselinových zbytků varianta polypeptidu může obsahovat jiné úpravy, například substituce, které nejsou vztaženy k zavedení a/nebo odstranění aminokyselinových zbytků obsahujících záchytnou skupinu pro nepolypeptidovou část. Příklady takových úprav zahrnují konzervativní substituce aminokyselin a/nebo zavedení Cys-TyrCys nebo Met na N-konci.

Přesný počet záchytných skupin dostupných pro konjugaci a přítomných ve variantě polypeptidu IFNG v dimérové formě závisí na požadovaném účinku, kterého se musí dosáhnout konjugací. Účinek, který je nutné dosáhnout závisí například na podstatě a stupni konjugace (například identita nepolypeptidové části, počtu nepolypeptidových částí nutných nebo možných pro konjugaci polypeptidu, případy, kde by se měly konjugovat nebo kde by se mělo konjugaci předejít atd.).

Rozumí se, že aminokyselinový zbytek obsahující záchytnou skupinu pro nepolypeptidovou část, který se buď odstraní nebo zavede, se vybral na základě podstaty nepolypeptidové části a ve většině případů na základě používané konjugační metody. Například, jestliže nepolypeptidové část je polymerní molekula, jako je polyetylenglykol nebo polyalkylenoxid, pak molekula aminokyselinových zbytků, která může fungovat jako záchytná skupina se může vybrat ze skupiny obsahující cystein, lyzin, kyselinu asparágovou, kyselinu glutamovou a arginin. Zvláště výhodný je cystein. V případě, že nepolypeptidovou částí je cukerná část, záchytovou skupinou je například in vivo glykosylační místo s výhodou N-glykosylační místo.

Jakmile se zavede záchytová skupina pro nepolypeptidovou část do polypeptidu IFNG nebo se z ní odstraní, přičemž aminokyselinová sekvence vykazuje sekvenci SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty), upravovaná poloha polypeptidu se s výhodou vybrala následujícím způsobem:

Poloha se s výhodou nachází na povrchu polypeptidu IFNG a výhodněji obsazuje aminokyselinový zbytek, který má více než 25 % svého postranního řetězce exponovaného v rozpouštědle, s výhodou více než 50 % svého postranního řetězce exponovaného v rozpouštědle, jak se stanovilo na základě struktury 3D nebo na základě modelu IFNG ve své dimerové formě, struktura nebo model může dále obsahovat jednu nebo dvě molekuly receptorů IFNG. Takové polohy jsou uvedeny v příkladu 1.

Zajímavá také je úprava libovolného z 23 aminokyselinových zbytků C-konce rodičovského polypeptidu IFNG (zvláště zavedením aminokyselinových zbytků obsahujících záchytnou ··· ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· skupinu nepolypeptidové části, jako jsou zbytky Cys), protože se věří, že se nacházejí na povrchu polypeptidu IFNG.

Navíc může být zajímavé upravit jeden nebo více aminokyselinových zbytků lokalizovaných v oblastech smyček polypeptidu IFNG, protože většina aminokyselinových zbytků v těchto oblastech smyčky je exponováno na povrchu a nachází se dostatečně daleko od funkčních míst tak, že nepolypeptidové části, jako jsou polymerní molekuly, zvláště molekuly PEG a/nebo N-glykosylační místa se mohou zavést, aniž dojde k porušení funkce molekuly. Takové oblasti smyček se mohou identifikovat zkoumáním třírozměrné struktury huIFNG. Aminokyselinové zbytky obsahující uvedené oblasti smyček jsou zbytky N16-K37 („smyčka A-B), F60-S65 („smyčka B-C), N83-S84 („smyčka C-D) a Y98-L103 („smyčka D-E).

Aminokyselinové zbytky obsahující vazebné místo pro receptor IFNG jsou Ql, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K34, K37, K108, Hlll, E112, 1114, Q115, A118, E119 (také se popisuje v příkladu 2).

V obecném případě je výhodné, že záchytové skupiny pro nepolypeptidovou část (jako jsou další N-glykosylační místa a/nebo cysteinové zbytky) nejsou zavedeny do tohoto místa molekuly.

Za účelem stanovit optimální rozložení záchytových skupin vzdálenost mezi aminokyselinovými zbytky, které se nacházejí na povrchu polypeptidu IFNG se vypočítaly na základě struktury 3D dimérového polypeptidu IFNG. Stanoví se vzdálenost mezi CB aminokyselinových zbytků obsahujících takové záchytné skupiny nebo vzdálenost mezi funkční skupinou (NZ v případě lyzinu, CG v případě kyseliny asparágové, CD v případě kyseliny glutamové, SG v případě cysteinu) jedné a CB jiného aminokyselinového zbytku, který obsahuje záchytnou skupinu.

V případě glycinu se místo CB použije CA. V části polypeptidu

IFNG podle vynálezu libovolná z uvedené vzdlenosti je s výhodou více než 8 Á, zvláště více než 10 Á za účelem předejít nebo zredukovat heterogenní konjugaci.

Také aminokyselinová sekvence varianty polypeptidů IFNG se může lišit od sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) tím, že se odstraní jeden nebo více aminokyselinových zbytků, které tvoří část epitopu. Tyto aminokyselinové zbytky se s výhodou substituují aminokyselinovým zbytkem obsahujícím záchytovou skupinu nepolypeptidové části, aby se porušil nebo deaktivoval epitop. Epitopy [S99T]huIFNG, huIFNG nebo rhuIFNG se mohou identifikovat použitím metod známých v oboru, které jsou také známy, jako je mapování epitopu (popisuje se například v publikaci Romagnoli et al., Biol. Chem. 1999, 380(5):553-9, DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96: 11-20, Van de Wateret al., Clin. Immunol. Immunopathol, 1997, 85(3): 229-35, SaintRemy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81 a Lané DP a Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71. Jednou metodou je zavedení knihovny vyjevující fága exprimující náhodné oligopeptidy, například 9 aminokyselinových zbytků. Protilátky IgGl ze specifického antiséra určenému proti [S99T]huIFNG, huIFNG nebo rhuIFNG se čistily ímunosrážením a reaktivní fágy se identifikovaly imunologickým přenosem. Sekvenací DNA čištěných reaktivních fágů je možné stanovit sekvenci oligopeptidu a pak následuje lokalizace sekvence v 3D struktuře IFNG. Identifikovaná oblast ve struktuře tvoří epitop, které je možné vybrat jako cílovou oblast pro zavedení záchytové skupiny nepolypeptidové části.

Funkční poločas in vivo a sérový poločas například závisí na molekulové hmotnosti polypeptidové varianty a počet záchytových skupin potřebných pro zvýšení poločasu může záviset na molekulové hmotnosti nepolypeptidové části.

V jednom provedení vynálezu varianta polypeptidů podle vynálezu má molekulovou hmotnost alespoň 67 000, zvláště pomocí testu SDS-PAGE

Nátuře vol 227(1970), alespoň 70 000, jak se satnovilo popsaného v publikaci Laemmli, U.K. p680-85). IFNG vykazuje molekulovou hmotnost v rozmezí přibližně 34 000 až 50 000 a proto je nutných dalších 20 000 až 40 000, aby se získal požadovaný účinek. To je například možné provést se 2 až 4 molekulami PEG o molekulové hmotnosti 10 000 nebo kombinací dalších in vivo glykosylačních míst a dalších molekul PEG nebo jinými zde popsanými způsoby.

Varianta polypeptidu IFNG podle vynálezu s výhodou obsahuje 1 až 10 (dalších) nepolyeptpdiových částí, jako je 1 až 8, 2 až 8, 1 až 5, 1 až 3 nebo 2 až 5 (dalších) nepolypeptidových částí. V typickém případě konjugovaná varianta obsahuje 1 až 3 (další) nepolypeptidové části, jako je 1, 2 nebo 3 (další) nepolypeptidové částí.

Jak se popisuje shora v textu HuIFNG existuje jako dimérový polypeptid. Polypeptid je v normálním případě jako homodimérní forma (například připravený spojením dvou molekul polypeptidu IFNG připravených zde popsaným způsobem). Avšak, jestliže je to nutné varianta polypeptidu IFNG se může připravit jako jednořetězcová forma, kde dva monomery polypeptidu IFNG jsou spojeny prostřednictvím peptidové vazby nebo peptidového linkeru. Příprava varianty polypeptidu IFNG v jednořetězcové formě má výhodu, že dva konstituentní polypeptidy IFNG mohou být odlišné, což může být i výhodné, umožňují například asymetrickou mutagenezi polypeptidů. Místa upravená PEG se mohou například odstranit z vazebného místa pro receptor z jednoho z monomerů, ale zůstávají v dalších monomérech. Čímž po úpravě jednoho monomeru pomocí PEG vykazují intaktní vazebné místo pro receptor, zatímco ostatní mohou být zcela upraveny PEG (a tak umožňují podstatné zvýšení molekulové hmotnosti).

··· ·· ···· ··· ·· ··· ···· ·· tt

Varianty IFNG podle vynálezu, kde nepolypeptidovou částí je cukerná část.

Ve výhodném provedení vynálezu varianta IFNG SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) obsahují alespoň jedno zavedené glykosylační místo a/nebo jedno odstraněné glykosylační místo. Glykosylační místo je s výhodou in vivo glykosylační místo, to znamená, že nepolypeptidovou částí je cukerná část, například O-vázaná nebo N-vázaná cukerná část, s výhodou N-vázaná cukerná část.

V jednom výhodném provedení vynálezu uvedená varianta obsahuje alespoň jedno zavedené glykosylační místo, zvláště glykosylační místo zavedené substitucí.

N-glykosylační místo in vivo se může například zavést do polohy polypeptidu IFNG sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) obsahující aminokyselinový zbytek exponovaný na povrchu. Uvedený aminokyselinový zbytek exponovaný na povrchu má alespoň 25 % postraního řetězce exponovaného na povrchu, zvláště alespoň 50 % postraního řetězce exponovaného na povrchu. Detaily týkající se stanovení takových poloh se popisují v příkladu 1.

N-glykosylační místo se zavádí takovým způsobem, že Nzbytek uvedeného místa se nachází v uvedené poloze. Analogicky O-glykosylační místo se zavedlo tak, že zbytek S nebo T, které tvoří uvedené místo, jsou lokalizovány v uvedené poloze. Rozumí se, že termín „alespoň 25 % (nebo 50 %) svého postraního řetězce exponovaného na povrchu se používá ve spojení se zavedením in vivo N-glykosylačního místa a znamená povrchovou dostupnost postranního řetězce aminokyseliny v poloze, kde je skutečně zachycena cukerná složka. V mnoha případech je nutné zavést serinový nebo threoninový zbytek do polohy +2 vztaženo na asparaginový zbytek, na kterém je skutečně zachycena cukerná část a tyto polohy, kam se zavedly • · · · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· serin a threonin, se nechají „pohřbít, to znamená, že méně než 25 % (nebo 50 %) jejich postraních řetězců je exponováno na povrchu molekuly.

Za účelem zajistit účinnou glykosylaci je výhodné, aby in vivo glykosylační místo, zvláště N-zbytek N-glykosylačního místa nebo zbytek S nebo T O-glykosylačního místa, se nachází ve 118 N-terminálních aminokyselinových zbytcích polypeptidu IFNG, výhodněji v 97 N-terminálních aminokyselinových zbytcích. Výhodnější je, když in vivo glykosylační místo se zavede do polohy, kde je nutná pouze jedna mutace pro vytvoření uvedeného místa (v molekule se už vyskytují libovolné jiné aminokyselinové zbytky nutné pro vytvoření funkčního glykosylačního místa).

Například substituce, které vedou k zavedení dalšího Nglykosylačního místa do poloh exponovaných na povrchu polypeptidu IFNG a obsazených aminokyselinovými zbytky, které mají alespoň 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (ve struktuře s molekulou receptoru) zahrnují:

Q1N + P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F6OS/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, T101N+L103S/T, D102N+N104S7T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S7T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T,

R140N a R140N+S142T, substituce se indikuje vzhledem k [S99T]huIFNG s aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1 (nebo vztaženo k jejímu relevantnímu fragmentu, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16) . S/T indikuji substitucí serinového nebo threoninového zbytku, s výhodou threoninového zbytku.

Substituce, které vedou k zavedení dalšího glykosylačního místa do poloh exponovaných na povrchu polypeptidu IFNG vykazující alespoň 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (ve struktuře s molekulou receptorů) zahrnují:

P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, G18S/T, D21N+A23S/T,

G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T,

R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N a R140N+S142Tj substituce je indikována vzhledem k [S99T]huIFNG s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 1 (nebo vztaženo k jejímu relevantnímu fragmentu, který vykazuje aminokyselinové sekvence zobrazené v SEQ ID NO: 2 až 16) . S/T indikuje substituci serinovým nebo threoninovým zbytkem, s výhodou threoninovým zbytkem.

Substituce, kde je nutná substituce pouze jednoho aminokyselinového zbytku, aby se zavedlo N-glykosylační místo zahrnuje K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N a R140N, zvláště K12S/T, G18N, G18S/T, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T,

• · · ·· ··· ··· ·· ··· ···· ·· ··

K94N, Q106S/T, A124N, K130N a R140N (polohy s více než 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (ve struktuře bez molekuly receptoru)) nebo výhodněji G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N a R140N (polohy s více než 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu ve struktuře bez molekuly receptoru).

Obvykle není výhodné zavedení N-glykosylačních míst do oblasti obsahující vazebné místo receptoru (s výjimkou speciálního případu, popisuje se v sekci „Varianty s redukovanou receptorovou afinitou) . Mutace Q1N+P3S/T, E9N+L11S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E119N a E119N+S121T by se neměly v normálním případě provést, pokud není nutná redukovaná receptorová afinita.

Zvláště výhodné varianty podle vynálezu zahrnují variantu SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty vykazující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16), kde uvedená varianta vykazuje aktivitu IFNG a obsahuje alespoň jednu substituci vybranou ze skupiny obsahující K12S, K12T, G18S, G18T, E38N, E38N+S40T, K61S, k61T, N85S, N85R, K94N, Q106S a Q106T, výhodněji vybrané ze skupiny zahrnující K12T, G18T, E38N+S40T, K61T, N85T, K94N a Q106T, dokonce ještě výhodnější jsou ty vybrané ze skupiny zahrnující K12T, G18T, E38N+S40T, K61T a N85T, zvláště E38N+S40T.

V jiném zajímavém provedení vynálezu varianta sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16) obsahují alespoň dvě zavedená glykosylační místa, zvláště alespoň dvě zavedená Nglykosylační místa. Alespoň dvě úpravy, zvláště substituce, vedoucí k zavedení alespoň dvou zavedených N-glykosylačních míst, se s výhodou vybraly ze skupiny obsahující K12S, K12T, G18S, G18T, E38N, E38N+S40T, K61S E38N+S40T, K61T, N85S, N85T,

ΦΦ φ··· φφφ φφφ«

Κ94Ν, Q106S a Q106T, výhodněji se vybraly ze skupiny obsahující K12T, G18T, E38+S40T, K61T, N85T, K94N a Q106T, dokonce výhodněji se vybraly ze skupiny obsahující K12T, G18T,

E38N+S40T, substitucí, příklady takových obsahuj ící

K61T a N85T. Specifické na základě kterých vzniká varianta alespoň dvě další N-glykosylační místa zahrnují K12T+G18T, K12T+E38+S40T, K12T+K61T, K12T+N85T, G18T+E38+S40T, G18T+K61T,

G18T+N85T, E38+S40T+K61T, E38+S40T+N85T a K61T+N85T.

Ze shora uvedeného seznamu substitucí je výhodné vybrat substituce lokalizované ve 118 N-terminálních aminokyselinových zbytcích, zvláště v 97 N-terminálních aminokyselinových zbytcích.

Varianta polypeptidu IFNG podle vynálezu může obsahovat jedno další in vivo glykosylační místo na jeden monomer (jak se porovnává se SEQ ID NO: 1 nebo její fragmenty) . Avšak za účelem dosáhnout dostatečné velikosti, aby se zvýšil sérový poločas, je často nutné, aby polypeptid obsahoval více než jedno další místo in vivo N-glykosylace, zvláště 2 až 7 nebo 2 až 5 dalších in vivo N-glykosylačních míst, tak jako 2, 3, 4 nebo 5 in vivo N-glykosylačních míst. In vivo N-glykosylační místa se s výhodou zavedla jednou nebo více substitucemi popsanými v libovolném shora uvedeném seznamu.

Dále se rozumí, že libovolné shora v textu uvedené úpravy se mohou kombinovat s libovolnou z úprav popsaných v sekci nazvané „varianta IFNG podle vynálezu s optimalizovanými in vivo glykosylačními místy, zvláště se substitucí G26A.

Varianty IFNG podle vynálezu, kde nepolypeptidové část je molekula, která má jako záchytnou skupinu cystein.

V jiném výhodném provedení vynálezu varianta IFNG sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) obsahují alespoň jeden zavedený cysteinový zbytek. Cysteinový zbytek se může ·· · ·· ······ • · ♦· · · · 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99 například zavést do polohy polypeptidů IFNG SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) obsahující aminokyselinový zbytek exponovaný na povrchu. Uvedený aminokyselinový zbytek exponovaný na povrchu má alespoň 25 % svého postranního řetězce exponovaného na povrchu, zvláště alespoň 50 % svého postranního řetězce exponovaného na povrchu. Detaily spojené se stanovením takových poloh jsou popsány v příkladu 1.

Například substituce, které vedou k zavedení cysteinového zbytku do poloh exponovaných na povrchu polypeptidů IFNG a obsazených aminokyselinovým zbytkem vykazujícím alespoň 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (ve struktuře s molekulou receptoru) zahrnuje:

QIC, D2C, P3C, K6C, E9C, N10C, K13C, Y14C, N16C, G18C, H19C, D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, N35C, K37C, E38C, E39C, S40C, K55C, K58C, N59C, K61C, D62C, D63C, Q64C, S65C, Q67C, K68C, E71C, T72C, K74C, E75C, N78C, V79C, K80C, N83C, S84C, N85C, K86C, K87C, D90C, E93C, K94C, T101C, D102C, L103C, N104C a E119C, substituce se indikovala vzhledem k [S99T]huIFNG s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 1 (nebo vztaženo k relevantnímu fragmentu s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16).

Substituce, které vedou k zavedení cysteinového zbytku do poloh exponovaných na povrchu polypeptidů IFNG a obsazených aminokyselinovým zbytkem, který vykazuje alespoň 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (ve struktuře s molekulou receptoru zahrnuje P3C, K6C, N10C, K13C, N16C,

D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, K37C, E38C, E39C, K55C, K58C,

N59C, D62C, Q64C, S65C, K68C, E71C, E75C, N83C, S84C, K86C,

K87C, K94C, T101C, D102C, L103C a N104C, substituce se indikuje vzhledem k [S99T]huIFNG s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 1 (nebo se vztahuje k jejímu relevantnímu fragmentu, který má aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16) . Obvykle není výhodné zavést cysteinový zbytek (a následně zachytit cysteinový zbytek na • · · · · · nepolypeptidové části) v oblasti obsahující vazebné místo pro receptor (s výjimkou speciálních případů, popisuje se v sekci „Varianty s redukovanou receptorovou afinitou). Mutace QIC, E9C, G18C, H19C, D21C, G16C, K34C, K37C a E119C by se neměly v normálním případě provést, s výjimkou případu, že je nutná redukovaná afinita receptoru.

Nej výhodnější je, když uvedený cysteinový zbytek se zavede substitucí vybranou ze skupiny obsahující N10C, N16C, E38C,

N59C, N83C, K94C, N104C a A124C.

V jiném zajímavém provedení vynálezu varianta SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2 až 16) obsahuje alespoň dva zavedené cysteinové zbytky. Alespoň dvě úpravy, zvláště substituce, vedoucí k zavedení alespoň dvou cysteinových zbytků se mohou s výhodou vybrat ze skupiny obsahující N10C, N16C, E38C, N59C, N83C, K94C, N104C a A124C. Specifické příklady takových substitucí, při kterých vzniká varianta obsahující alespoň dva zavedené cysteinové zbytky zahrnuj í N10C+N16C, N10C+E38C, N10C+N59C, N10C+N83C, N10C+K94C, N10C+N104C, N10C+A124C, N16C+E38C, N16C+N59C,' N16C+N83C, N16C+K94C, N16C+N104C, N16C+A124C, E38C+N59C, E38C+N83C, E38C+K94C, E38C+N104C, E38N+A124C, N59C+N83C, N59C+K94C, N59C+N104C, N59C+A124C, N83C+K94C, N83C+K94C, N83C+N104C, N83C+A124C, K94C+N104C, K94C+A124C a N104C+A124C.

Rozumí se, že zavedené cysteinové zbytky se mohou s výhodou konjugovat s nepolypeptidovou částí, jako je PEG nebo výhodněji s mPEG. Konjugace mezi variantou polypeptidů obsahující cystein a polymerní molekulu se může dosáhnout libovolným vhodným způsobem, jak se například popisuje v sekci nazvané „Konjugace s polymerní molekulou, například při použití metody s jedním krokem nebo při postupném způsobu v uvedené sekci. Výhodná metoda pro úpravu varianty polypeptidů IFNG pomocí PEG je kovalentní zachycení PEG na cysteinové zbytky za použití molekul PEG, které reagují s PEG.

• · · · ·· ··

Počet vysoce specifických molekul PEG, které reagují s cysteinem s různými skupinami (například ortopyridyldisulfid, maleimid a vinylsulfon) a různé veliskosti molekul PEG (molekulová hmotnost 2 až 20 000, jako je molekulová hmotnost 5 000, 10 000, 12 000 nebo 15 000) jsou běžně dostupné, například od firmy Shearwater Polymers lne., Huntsville, AL, USA).

Rozumí se, že shora v textu popsané úpravy se mohou kombinovat s libovolnou z úprav popsanou v sekci „Varianty IFNG podle vynálezu s otpimalizovanými in vivo glykosylačními místy zvláště se substitucí G26A.

Varianty IFNG podle vynálezu, kde první nepolypeptidovou částí je cukerná část a druhou nepolypeptidovou částí je molekula, která vykazuje jako záchytnou skupinu cystein

V dalším výhodném provedení vynálezu varianta IFNG sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo jejích fragmentů) obsahuje alespoň jedno zavedené glykosylační místo a alespoň jeden zavedený cysteinový zbytek. Takové varianty se mohou připravit výběrem zbytků popsaných ve dvou předchozích sekcích popsaných ve vhodných polohách pro zavedení N-glykosylačních míst a cysteinových zbytků. Avšak ve výhodném provedení vynálezu uvedená varianta obsahuje substituce vybrané ze skupiny obsahuj ící

K12T+N16C, K12T+E38C, K12T+N59C, K12T+N83C, K12T+K94C, K12T+N104C, K12T+A124C, G18T+N10C, G18T+E38C, G18T+N59C, G18T+N83C, G18T+K94C, G18T+N104C, G18T+A124C, E38N+S40T+N10C, E38N+S40T+N16C, E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94C, E38N+S40T+N104C, E38N+S40T+A124C, K61T+N10C, K61T+N16C, K61T+E38C, K61T+N83C, K61T+K94C, K61T+N104C, K61T+A124C, N85T+N10C, N85T+N16C, N85T+E38C, N85T+N59C, N85T+K94C, N85T+N104C, N85T+A124C, K94N+N10C, K94N+N16C, K94N+E38C, K94N+N59C, K94N+N83C, K94N+N104C, K94N+A124C, Q106T+N10C, Q106T+N16C, Q106T+E38C, Q106T+N59C, Q106T+N83C, Q106T+K94C a Q106T+A124C, • ·* • · :

• · výhodnější je ze skupiny obsahuj ící E38N+S40T+N10C, E38N+S40T+N16C,

E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94C a E38N+S40T+N104C.

Rozumí se, že zavedený cysteinový zbytek se může s výhodou konjugovat výhodněj i s nepolypeptidovou s mPEG. Konjugace obsahující cystein a polymerem se může dosáhnout libovolným vhodným způsobem, například, jak se popisuje v sekci nazvané „Konjugace s polymerní molekulou, například při použití způsobu s jedním krokem nebo postupným způsobem. Vhodný polymer je VS-mPEG nebo OPSS-mPEG.

částí, jako je PEG nebo mezi variantou polypeptidů

Dále se rozumí, že libovolná ze shora v textu zmiňovaných úprav se může kombinovat s libovolnou z úprav popsaných v sekci „Varianta IFNG podle vynálezu s optimalizovanými in vivo glykosylačními místy, zvláště se substitucí G26A.

Varianty IFNG s redukovanou receptorovou afinitou

Jedním ze způsobů, jak zvýšit sérový poločas polypeptidů IFNG by mělo být zvýšení internalizace zprostředkované receptorem a čímž se sníží rozpad zprostředkovaný receptorem.

Internalizace zprostředkovaná receptorem závisí na afinitě diméru IFNG vůči receptorovému komplexu IFNG a obdobně se očekává, že varianta IFNG se sníženou afinitou k receptorovému komplexu IFNG se začlení v menším rozsahu.

Afinita diméru IFNG vůči receptorovému komplexu se může snížit provedením jedné nebo více úprav, zvláště substitucemi do vazebného místa receptoru polypeptidů IFNG. Aminokyselinové zbytky, které tvoří vazebné místo pro receptor, jsou definovány v příkladu 2. Jedna třída substitucí, které se mohou provést jsou konzervativní aminokyselinové substituce. V jiném provedení vynálezu provedená úprava vede k zavedení Nglykosylačního místa.

4 4 ·· 4 4 4 4

4·· 44 444 4444 44 44

V dalším určitém výhodném provedení vynálezu varianta IFNG se sekvencí SEQ ID NO: 1 (nebo její fragmenty) obsahuje alespoň jednu úpravu, jako je substituce ve vazebném místě pro receptor (jak se definuje). Polypeptid IFNG obsahuje alespoň jednu úpravu, s výhodou substituci do uvedeného vazebného místa pro receptor, která tvoří N-glykosylační místo in vivo. Takové substituce se mohly například vybrat ze skupiny zahrnuj ící:

V5N+E7S/T, E9N+L11S/T, K12N+Y14S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, V22N+D24S/T, D24N+G26S/T, G26N+L28S/T, L30N+I32S/T, K34N+W36S7T, K37N+E39S/T, K108N+I110S/T, H111N+L113S/T, E112N+I114S/T, I114N+V116S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T, E119N and E119N+S121T, Q1N+P3S/T, D2N+Y4S/T, Y4N+K6S/T a E119N+S121T s výhodou ze skupiny obsahující Q1N+P3S/T, D2N+Y4S/T, E9N+L11S/T, K12N+Y14S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, Hl 11N+L113S/T, Q115N+M117S/T, ' A118N+L120S/T, E119N a E119N+S121T (zavedení N-glykosylačního místa do poloh obsahujících aminokyselinový zbytek vykazující 25 % postranního řetězce exponovaného na povrchu), výhodněji ze skupiny obsahující E119N+S121T, Q1N+P3S/T,D2N+Y4S/T,

E9N+L11S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T, E119N (zavedení N-glykosylačních míst do poloh obsahujících aminokyselinový zbytek vykazující alespoň 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu), dokonce výhodněji ze skupiny obsahuj ící Q1N+P3T, D2N+Y4T, E9N+L11T, G18N+S20T, H19N+D21T,

S20N+V22T, D21N+A23T, K34N+W36T, K37N+E39T, Q115N+M117T, A118N+L120T a E119N+S121T, výhodněji ze skupiny obsahující G18N+S20T, H19N+D21T, D21N+A23T a E119N+S121T, zvláště D21N+A23T.

Předpokládá se, že receptorovou afinitu ve Actimmune®. Receptorová vhodným způsobem a je takové varianty vykazují srovnání s huIFNG nebo s afinita se může měřit známa v oboru. Jedním redukovanou přípravkem libovolným příkladem ·· ····

• · · · · ♦ 9 · 9 • 9 9 9 · • · · 9 *

99·9 ·· 99 stanovení receptorové vazebné afinity je test BIAcore®popsaný v publikaci Michiels et al.Int. J. Biochem. Cell. Biol. 30: 505-516 (1998). Použitím shora v textu popsaného testu varianty IFNG se považují za použitelné pro zde popsané účely, pokud jejich vazebná afinita (Ka) je 1 až 95% hodnoty K_d glykosylovaného [S99T]huIFNG nebo přípravku Actimmune®. Hodnota K_d polypeptidu IFNG může být 1 až 75 % nebo 1 až 50 %, tak jako 1 až 25 %, například 1 až 20 % nebo dokonce 1 až 15 %, 1 až 10 % nebo 1 až 5 % hodnoty K_d glykosylovaného [S99T]huIFNG nebo přípravku Actimmune®.

V typickém případě takové varianty IFNG mající redukovanou receptorovou afinitu budou vykazovat redukovanou aktivitu IFNG, například když se testují ve zde popsaném „primárním testu. Například varianta polypeptidu může vykazovat 1 až 9 % specifické aktivity přípravku Actimmune® nebo rhuIFNG, například 1 až 75%, jako 1 až 50 %, například 1 až 20 % nebo 1 až 10 % specifické aktivity přípravku Actimmune® nebo rhuIFNG.

Jak se zmiňuje shora v textu, takové varianty IFNG mají prodloužený sérový poločas, což je způsobino redukovaným rozpadem způsobeným receptorem. Proto varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu jsou nutné s ohledem na zvýšený sérový poločas popsaný dříve v textu ve spojení s definicí zvýšeného sérového poločasu.

Libovolná ze shora v textu uvedených úprav vedoucí k redukované receptorové vazebné afinitě se může kombinovat s libovolnými jinými zde popsanými úpravami, zvláště úpravy zmiňované v sekcích nazvaných „Varianty IFNG podle vynálezu s optimalizovanými N-glykosylačními místy, „Varianty IFNG podle vynálezu, kde nepolypeptidovou částí je cukerná část, „Varianty IFNG podle vynálezu, kde nepolypeptidovou částí je molekula, která má jako záchytnou skupinu cystein a „Varianty IFNG podle vynálezu, kde první nepolypeptidovou částí je cukerná část a druhou nepolypeptidovou částí je molekula, která má jako záchytnou skupinu cystein, jako je G26A, E38N+S40T a jejich kombinace.

Konjugační metody

Nepolypeptidové část

Jak se popisuje dále v textu, nepolypeptidové část se s výhodou vybrala ze skupiny obsahující polymerní molekulu, lipofilní sloučeninu, cukernou část (například způsobem in vivo N-glykosylace) a organické derivatizační činidlo. Všechny tato činidla mohou variantě polypeptidu IFNG udělit požadované vlastnosti, zvláště zvýšenou hodnotu AUC_S zvýšený sérový poločas a/nebo redukovanou imunogennost. Polypeptidová varianta je v normálním případě konjugována pouze s jedním typem nepolypeptidové části, ale může také být konjugována se dvěma nebo více různých typů nepolypeptidových částí, například s polymerní molekulou a cukernou částí, s lipofilní skupinou a cukernou částí, s organickým derivatizačním činidlem a cukernou složkou, s lipofilní skupinou a polymerní molekulou atd. Když dochází ke konjugaci se dvěma různými typy nepolypeptidových částí, může být konjugace provedena současně nebo následovně. V následujících sekcích „Konjugace s lipofilní sloučeninou, „Konjugace s polymerní molekulou, „Konjugace s cukernou částí, a „Konjugace s organickým derivatizačním činidlem se popisují konjugace se specifickými typy nepolypeptidových částí.

Konjugace s lipofilní sloučeninou

Polypeptidová varianta a lipofilní sloučenina se mohou navzájem konjugovat buď přímo nebo použitím linkeru. Lipofilní sloučeninou může být přirozená sloučenina, jako je saturovaná nebo nesaturovaná mastná kyselina, diketon mastné kyseliny, terpen, prostaglandin, vitamin, karotenoid nebo steroid, nebo • ·· · ·· 444444 • · · · 44 4 4 4 · · • · · 4 4444

4 · 4 · · 4 · · · ··· 44 4 4 4 4

444 44 444 4444 44 44 syntetická sloučenina, jako je kyselina karbonová, alkohol, amin a kyselina sulfonová obsahující jednu nebo více alkylů, arylů, alkenylů nebo jiné nesaturované sloučeniny. Konjugace mezi variantou polypeptidu a lipofilní sloučeninou prostřednictvím linkeru se může provést použitím metod známých v oboru, jak se například popisuje v publikaci Bodanzsky, Peptide synthesis, Jahn Wiley, New York, 1976 a v patentovém dokumentu WO 96/12505.

Konjugace s polymerní molekulou

Polymerní molekulou, aby se spojila s variantou polypeptidu, může být libovolná vhodná polymerní molekula, jako je přirozený nebo syntetický homopolymer nebo heteropolymer, v typickém případě s molekulovou hmotností v rozmezí 300 až 100 000 nebo 1 000 až 50 000, jako v rozmezí 2 000 až 40 000 nebo 2 000 až 30 000, například v rozmezí 2 000 až 20 000, 2 000 až 10 000 nebo 1 000 až 5 000. Zvláště je vhodná polymerní molekula, jako je PEG, zvláště mPEG, která má v typickém případě molekulovou hmotnost přibližně 2 000, 5

000, 10 000, 12 000, 15 000, 20 000, 30 000, 40 000 nebo 50

000, zvláště molekulou hmotnost přibližně 5 000, přibližně 10 000, přibližně 12 000, přibližně 15 000 nebo 20 000.

Když se v případě polymerních molekul použije slovo „přibližně označuje přibližný průměr molekulové hmotnosti a odráží skutečnost, že existuje normální jisté rozložení molekulové hmotnosti v daném polymerním přípravku.

Příklady homopolymerů zahrnují polyol (to je poly-OH), polyamin (to je poly-NH₂) a polykarboxylovou kyselinu (to je poly-COOH). Heteropolymer je polymer, který obsahuje jednu nebo více různých spojovacích skupin, jako je například hydroxylová skupina a amin.

•4 44 4444

4 4 4 4 • 4 4 4 • 4 4 4 4

4 4 4 4

4444 44 44

Příklady vhodných polymerních molekul zahrnují polymerní molekuly vybrané ze skupiny obsahující polyalkylenoxid (PAO) zahrnující polyalkylenglykol (PAG), jako je polyetylenglykol (PEG) a polypropylenglykol (PPG), větvený PEG, polyvinylalkohol (PVA), polykarboxylát, polyvinylpyrolidon, anhydrid kyseliny polyetylen-ko-maleinové, anhydrid kyseliny polystyren-ko-maleinové, dextran zahrnující karboxymetyldextran nebo libovolný jiný biopolymer vhodný pro redukci, imunogennosti a/nebo zvýšení funkčního poločasu in vivo a/nebo sérového poločasu. Jiným příkladem polymerní molekuly je lidský albumin nebo jiný plazmatický protein. V obecném případě polymery odvozené z polyalkylenglykolu jsou biologicky kompatibilní, netoxické, neantigenní, neimunogenní, vykazují různou rozpustnost ve vodě a živé organizmy je jednoduše vylučují.

PEG je výhodná polymerní molekula, protože vykazuje pouze několik reaktivních skupin schopných se řetězit ve srovnání například s polysacharidy, jako je dextran a podobně. Zvláště jako je jeho spojování konjugaci se záchytnými zajímavý je monofunkční PEG, monometoxypolyetylenglykol (mPEG), protože probíhá relativně jednoduše (pro skupinami na polypeptidů je dostupná pouze jedna reaktivní skupina). Nebezpečí řetězení se odstraní, výsledné konjugované varianty polypeptidů jsou více homogenní a reakce polymerních molekul s polypeptidem se jednodušeji řídí.

Za účelem ovlivnění kovalentního zachycení polymerní molekuly na variantě polypeptidů musí být v aktivované formě hydroxylové koncové skupiny polymerní molekuly, to je s reaktivními funkčními skupinami (zahrnují například primární aminoskupiny, hydrazid (HZ) , thiol, sukcinát sukcinimidylsukcinát (S) , sukcinimidylsukcinamid (SUC), (SSA), sukcinimidylproprionát (SPA), sukcinimidykarboxymetylát (SCM), benzotriazolkarbonát (BTC), N-hydroxysukcinimid (NHS),

aldehyd, nitrofenylkarbonát (NPC) a tresylát (TŘES)). Vhodně aktivované polymerní molekuly jsou běžně dostupné například u firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, AL, USA. V jiném případě polymerní molekuly mohou být aktivovány běžnými metodami známými v oboru, popisují se například v patentovém dokumentu WO 90/13540. Specifické příklady aktivovaných lineárních nebo větvených molekul vhodných pro použití podle vynálezu se popisuje v publikací Shearwater Polymers, lne. 1997 a 2000, Catalogue (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives). Specifikované příklady aktivovaných polymerů PEG zahrnují následující lineární molekuly PEG: NHS-PEG (například s PA- PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, and SCM-PEG), NOR- PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG,IODO-PEG a Mal-PEG a větvené PEG, jako je PEG2-NHS a a ty popsané v americkém patentovém dokumentu č. 5 932 4 62 a 5 643 575. Následující publikace popisují použitelné polymerní molekuly a/nebo úpravu pomocí PEG: US 5 824 778 US 5 476,653, WO

97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 a: EP 154 316.

Specifické příklady aktivovaných polymerů PEG zvláště výhodných pro spojování cysteinových zbytků zahrnují následující lineární PEG: vinylsulfon-PEG (VS-PEG), s výhodou vinylsulfon-mPEG (VS-mPEG) , maleimid-PEG (MAL-PEG), s výhodou maleimid-mPEG (MAL-mPEG) a ortopyridyldisulfid-PEG (OPSS-PEG), s výhodou ortopyridyldisulfid-mPEG (OPSS-mPEG). V typickém případě takové polymery PEG nebo mPEG mají molekulovou hmotnost přibližně 5 000, přibližně 10 000, přibližně 12 000 nebo přibližně 20 000.

Ke konjugaci varianty polypeptidu a aktivovaných polymerních molekul dochází použitím libovolné vhodné metody, například jak se popisuje v publikaci (tyto publikace také popisují metody vhodné pro aktivaci polymerních molekul) : Harris and

Zalipsky, eds., Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor, (1991), Protein imxnobilisation. Fundamental and applications, Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, BocaRaton; G.T. Hermanson et al., (1993), ímmobilized Affinity Ligand Techniques,

Academie Press, N.Y.). V případě úpravy cysteinových zbytků pomocí PEG (popisuje se shora v textu) varianta IFNG je obvykle ošetřena redukčním činidlem, jako je dithiothreitol (DDT) dříve než se upraví pomocí PEG. Redukční činidlo se následně odstraní libovolnou vhodnou metodou, jako je odstranění solí. Konjugace PEG s cysteinovým zbytkem v typickém případě probíhá ve vhodném pufru s hodnotou pH 6 až 9 při teplotě kolísající od 4°C do 25 °C po dobu až 16 hodin.

Odborník si je vědom, že aktivační metoda a/nebo typ konjugace závisí na záchytné skupině varianty polypeptidu, stejně jako na funkčních skupinách polymeru (například aminoskupina, hydroxyl, karboxyl, aldehyd nebo sulfydryl). Úprava pomocí PEG může být řízena směrem ke konjugaci všech dostupných záchytných skupin na variantě polypeptidu (to je takové záchytné skupiny, které jsou exponované na povrchu polypeptidu) nebo mohou být řízeny směrem ke specifickým záchytným skupinám, jako je například N-terminální aminoskupina (popisuje se v americkém patentovém dokumentu č.

985 265) . Dále konjugace se může dosáhnout v jednom kroku nebo postupným způsobem (například jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 99/55377).

Rozumí se, že úprava pomocí PEG se navrhla tak, aby vznikla optimální molekula s ohledem na počet zachycených molekul PEG, na velikost a formu (například zda je lineární nebo větvená) takových molekul a na lokalizaci zachycených molekul ve variantě polypeptidů. Molekulová hmotnost použitého polymeru se může vybrat na základě požadovaného účinku, kterého se má dosáhnout. Například, jestliže se musí dosáhnout primárního účelu konjugace, což znamená, že konjugát musí mít vysokou molekulovou hmotnost (například aby se redukovalo odbourávání v ledvinách) je obvykle nutné konjugovat tak málo polymerních molekul s vysokou molekulovou hmotností, jak je to možné, aby se dosáhlo požadované molekulové hmotnosti. Jestliže je nutné dosáhnout vysokého stupně stínění epitopu, je možné použít dostatečně vysoký počet polymerů s nízkou molekulovou hmotností (například s molekulovou hmotností přibližně 5 000), aby došlo k účinnému stínění všech nebo většiny epitopů polypeptidů. Je možné použít 2 až 8, 3 až 6 takových polymerů.

Ve spojení s konjugací s pouze jedinou záchytnou skupinou na proteinu (jak se popisuje v americkém patentovém dokumentu č. 5 985 265), je výhodné, že polymerní molekula, která může být lineární nebo větvená, vykazuje vysokou molekulovou hmotnost, například přibližně 20 000.

V normálním případě se konjugace polymeru provede za podmínek, které umožňují reakci všech dostupných polymerních záchytných skupin s polymerními molekulami. V typickém případě molární poměr aktivovaných polymerních molekul s variantou polypeptidů je 1 000-1. zvláště 200-1, například 100-1, jako 10-1 nebo 5-1 za účelem získat optimální reakci. Může se však také použít ekvimolární poměr.

Také se uvažuje o spojování polymerních molekul s variantou polypeptidů prostřednictvím linkeru. Vhodné

linkery jsou dobře známy v boru. Výhodným příkladem je kyanurchlorid (popisuje se v publikaci Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem. 252, 3578-3581, Shafter et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378, v americkém patentovém dokumentu č. 4 17 9 337) .

Po konjugaci se blokují zbytkové aktivované polymerní molekuly metodami známými v oboru, například přidáním primárního aminu do reakční směsi a výsledné deaktivované polymerní molekuly se odstraní vhodnou metodou.

Spojení s cukernou částí

Spojení cukerné části probíhá in vivo nebo in vitro. Za účelem dosáhnout in vivo glykosylace polypeptidu s aktivitou IFNG, který se upravil tak, že se zavedlo jedno nebo více in vivo glykosylačních míst (popisuje se v sekci nazvané „Varianty IFNG podle vynálezu, kde nepolyeptidovou částí je cukerná část), se nukleotidová sekvence kódující polypeptid musí začlenit do glykosylačního eukaryontního expresivního hostitele. Exprimující hostitelská buňka se může vybrat z buňky hub (vláknité houby nebo kvasinky), hmyzí nebo zvířecí buňky nebo transgenní rostlinné buňky. Glyskosylace se může dosáhnout v lidském těle za použití nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidu podle vynálezu při genové terapii. V jednom provedení vynálezu je hostitelskou buňkou savčí buňka, jako je buňka CHO, BHK nebo HEK, například buňka HEK293 nebo hmyzí buňka, jako je buňka SF9, nebo kvasinková buňka, například Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris nebo libovolný jiný vhodný glykosylační hostitel, jak se například popisuje dále v textu. Cukerné části zachycené na variantě polypeptidu IFNG pomocí glykosylace in vivo jsou dále upraveny glykosyltransferázou, například použitím technologie glycoAdvance^(tm) produkovanou firmou Neose, Horsham, PA, USA. Čímž je možné například zvýšit sialyaci glykosylované varianty polypeptidu IFNG následující expresí a in vivo glykosylací pomocí buněk CHO.

Kovalentní in vitro spojování glykosidů s aminokyselinovými zbytky polypeptidu IFNG se může použít k úpravě nebo zvýšení počtu nebo profilu sacharidových substituentů. V závislosti na použitém módu spojení, cukr se může zachytit na

a) arginin a histidin

b) volné karboxylové skupiny

c) volné sulfhydrylové skupiny, jako obsahuje cystein,

d) volné hydroxylové skupiny, jako obsahuje serin, threonin, tyrozín nebo hydroxyprolin

e) aromatické zbytky, jako obsahuje fenylalanin nebo tryptofan nebo

f) amidovou skupinu glutaminu.

Tyto aminokyselinové zbytky tvoří příklady záchytných skupin pro cukernou část, které se mohou zavést a/nebo odstranit z polypeptidu IFNG. Vhodné metody spojení in vitro se popisují například v patentovém dokumentu WO 87/05330 a v publikaci Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem, pp. 259-306, 1981. Spojování in vitro cukerných částí nebo PEG se zbytky Gin vázanými na protein nebo peptid se může také provést transglutaminázami (TGáza), jak se například popisuje v publikaci Sáto et al., 1996, Biochemistry 35, 13072-13080 nebo v patentovém dokumentu EP 725145.

Spojování s organickým derivatizačním činidlem

Kovalentní úprava varianty polypeptidu IFNG se může provést reakcí záchytné skupiny varianty polypeptidu s organický derivatizačním činidlem. Vhodná derivatizační činidla a metody jsou dobře známy v oboru. Například cysteinylové zbytky nejběžněji reagují s α-haloacetáty (a s odpovídajícími aminy), jako je kyselina chloroctová nebo chloracetamídem za vzniku karboxymetylderivátů nebo karboxyamidometylderivátů. Cysteinylové zbytky se také upravily reakcí s bromotrifluoracetonem, s kyselinou a-bromoβ-(4-imidozoyl)propionovou, chloracetylfosforečnanera, Nalkylmaleimidy, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, metyl-2pyridyldisulfidem, p-chloromerkuribenzoátem, 2-chloromerkuri4-nitrofenolem nebo chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazolem.

derivatizovaly reakcí

Histidylové zbytky se s dietylpyrokarbonáteátem při pH 5,5 až 7,0, protože toto činidlo je realtivně specifické pro histidylový postranní řetězec. Také je možné použít parabromofenacylbromid. Reakce s výhodou probíhá v 0,1 M kakodylátu sodném při pH 6,0. Lysinyl a N-terminální zbytky reagují s anhydridy kyseliny jantarové a jiných karboxylových kyselin. Derivatizace s těmito činidly mají účinek, že obracejí náboj lysinylových zbytků. Jiná vhodná činidla pro derivatizaci zbytků obsahujících α-aminoskupinu zahrnují imidoestery, jako je metylpikolinimidát, pyridoxalfosforečnan, pyridoxal, chloroborohydrid, trinitrobenzebsulfonovou kyselinu, 0metylisomočovina, 2,4-pentandion, a reakce s glyoxylátem katalyzováné transaminázou. Arginylové zbytky se upravily reakcí s jedním nebo několika běžnými činidly, mezi něž patří fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizace argininových zbytků vyžaduje, aby se reakce provedla v alkalickém prostředí, vzhledem k vysoké hodnotě pKa funkční skupiny guanidinu. Dále tyto činidla mohou reagovat se skupinami lyzinu stejně jako guanidinoskupinou argininu. Skupiny C-konce (aspartyl nebo glutamyl) se selektivně upravily reakcí s karbodiimidy (R-N=C=N-R'), kde symbol R a R'jsou různé alkylové skupiny, jako je l-cyklohexyl-3- (2morfolinyl-4-etyl)karbodiimid nebo l-etyl-3-(4-azonia-4,4dimetylpentyl)karbodiimid. Dále zbytky aspartyl a glutamyl se převedou na asparaginyl a glutaminyl reakcí s amonnými ionty.

Blokování funkčního místa například odstraněním funkčním místě nebo

Popisuje se, že nadměrná konjugace polymeru může vést ke ztrátě aktivity polypeptidu, na který se polymer konjugoval. Tento problém je možné eliminovat záchytných skupin lokalizovaných na zablokováním funkčního místa dříve než dojde ke konjugaci. Tyto strategie tvoří další provedení vynálezu, přičemž první strategie se popisuje shora v textu. Jde například o odstranění lyzinových zbytků, které se mohou nacházet blízko funkčního místa a/nebo zavedení cysteinových zbytků a/nebo in vivo glykosylačních míst do poloh, které neinterferuji s funkčními místy.

Podle druhé strategie konjugace mezi variantou polypeptidu a nepolypeptidovou částí se provádí za podmínek, kde funkční místo varianty polypeptidu je blokováno pomocnou molekulou schopnou vázat se na funkční místo varianty polypeptidu. Je výhodné, když pomocná molekula je ta, která specificky rozeznává funkční místo varianty polypeptidu, jako je receptor. V jiném případě pomocnou molekulou může být protilátka, zvláště monoklonální protilátka rozeznávající variantu polypeptidu. Pomocnou molekulou může být neutralizační monoklonální protilátka.

Polypeptidové varianta se pak nechá interagovat s pomocnou molekulou dříve než dojde ke konjugaci. To zaručuje, že funkční místo varianty polypeptidu je stíněno nebo chráněno a následně se stává nedostupné pro derivatizaci nepolypeptidovou částí, jako je polymer. Po jehož eluci z pomocné molekuly se může získat konjugát mezi nepolypeptidovou částí a variantou polypeptidu s alespoň z části chráněným funkčním místem.

Následná konjugace varianty polypeptidu, která vykazuje zablokované funkční místo, s polymerem, s liofilní sloučeninou, s cukernou složkou, s organickým derivatizačním činidlem nebo s libovolnou jinou sloučeninou probíhá normálním

9 • · způsobem, například jak se popisuje v sekcích shora v textu nazvaných „Konjugace s........,

V dalším provedení vynálezu se pomocná molekula nejprve váže na pevnou fázi, jako jsou materiály, které se balí do kolon, například Sephadex nebo částice agarózy nebo různé povrchy, například reakční nádoby. Následně se na materiál, kterým je naplněna kolona nesoucí pomocnou molekulu, nanese varianta polypeptidu a provede se konjugace způsobem dobře známým v oboru, jak se například popisuje v sekcích nazvaných „Konjugace s .......... Tento postup umožňuje konjugované variantě polypeptidu oddělit se od pomocné molekuly elucí. Konjugovaná varianta polypeptidu se eluuje běžnou metodou za fyzikálně chemických podmínek, které nevedou k podstatné degradaci konjugované varianty polypeptidu. Kapalná fáze obsahující konjugovanou variantu polypeptidu se oddělila od pevné fáze, na které pomocná molekula zůstává kovalentně navázána. Separace se může dosáhnout jiným způsobem. Pomocná molekula se může derivatizovat druhou molekulou (například biotinem), kterou je možné rozeznat specifickým vazebným činidlem(například streptavidinem) . Specifické vazebné činidlo se může vázat na pevnou fázi, což umožňuje oddělení konjugované varianty polypeptidu z komplexu tvořeného pomocnou molekulou a druhou molekulou prostřednictvím pasážování přes druhou kolonu, která obsahuje pevnou fázi s pomocnou látkou, na které zůstane po následné eluci komplex pomocná molekuladruhá molekula, ale nikoliv konjugovaná varianta polypeptidu. Konjugovaná varianta polypeptidu se může uvolnit z pomocné molekuly libovolným vhodným způsobem. Odstranění ochrany je možné dosáhnout nastolením podmínek, při kterých se pomocná molekula oddělí z funkčního místa varianty polypeptidu, na kterou je vázána. Napříkla komplex mezi protilátkou, se kterou je polymer konjugován, a anti-ídiotypickou protilátkou se může disociovat úpravou pH na hodnotu alkalického nebo kyselého prostředí.

• 44 4 » 4 4 4 4

444 44 444 4444 44 4·

Konjugace značené varianty polypeptidů

V jiném provedení vynálezu se varianta polypeptidů IFNG exprimuje jako fúzní protein se značkou, to je aminokyselinová sekvence nebo pruh peptidu, který je tvořen v typickém případě 1 až 30 aminokyselinovými zbytky, to je 1 až 20 aminokyselinovými zbytky. Mimo to, aby se dosáhlo rychlého a jednoduchého čištění, značka je vhodný nástroj pro dosažení konjugace mezi značenou variantou polypeptidů IFNG a nepolypeptidovou částí. Značka se může zvláště použít pro dosažení konjugace v mikrotitračních destičkách nebo na jiných nosičích, jako jsou paramagnetické částice, na který se značený polypeptid imobilizoval prostřednictvím značky. Konjugace značené varianty polypeptidů IFNG, například na mikrotitračních destičkách, má výhodu, že značená varianta polypeptidů může být imobilizována na mikrotitračních destičkách přímo z kultivační půdy (v principu bez čištění) a může proběhnout konjugace. Tím se může redukovat celkový počet kroků (od exprese až do konjugace). Dále značka může sloužit jako molekula mezerníku, která zajišťuje lepší dosažitelnost zmobilizované varianty polypeptidů pro konjugaci. Konjugace používající značenou variantu polypeptidů může proběhnout s libovolnou ze zde popsaných nepolypeptidových částí, například polymerní molekula, jako je PEG.

Identita specifické značky, která se bude používat, není kritická, pokud značka je schopna být exprimována s variantou polypeptidů a je schopna být imobilizována na vhodném povrchu nebo nosičovém materiálu. Celá řada vhodných značek je obecně dostupných, například od firmy Unizyme Laboratories, Dánsko. Značkou mohou být následující sekvence:

His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:35),

Met-Lys-His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO.36),

Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His (SEQ ID NO:37),

Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln (SEQ ED NO:3S),

	• 4	4 ··	44		4···
• 4	4	♦ 4 4·	4	4	4
• 4	4	4 4	4	4	4
• 4 4 4	4 • ·	4 4 •44 4444	4 4 4	•	• 4 • 4

(všechny jsou dostupné u firmy Unizyme Laboratories, Dánsko) nebo libovolná z následujících sekvencí:

EQKLI SEEDL (SEQ ID NO: 39) (C-terminální značka popsaná v publikaci Mol. Cell. Biol. 5: 3610-16, 1985),

DYKDDDDK (SEQ ID NO: 40) (C-terminální nebo N-terminální značka),

YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 41).

Protilátky proti shora v textu popsaným značkám jsou běžně dostupné, například od firmy ADI, Aves Lab a Research Diagnostics.

Následného odštěpení značky z polypeptidů se může dosáhnout použitím komerčně dostupných enzymů.

Metody přípravy varianty polypeptidů IFNG podle vynálezu

Varianta polypeptidů IFNG se může připravit libovolnou vhodnou metodou známou v oboru. Takové metody zahrnují konstrukci nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidů a exprimující sekvenci ve vhodném transformovaném nebo transfekovaném hostiteli. Mohou se připravit varianty polypeptidů podle vynálezu, ačkoliv jsou méně účinné, chemickou syntézou nebo kombinací chemické syntézy nebo kombinací chemické syntézy a technologie rekombinace DNA.

Nukleotidová sekvence podle vynálezu kódující variantu polypeptidů IFNG (v monomeru nebo v jednořetězcové formě) může být konstruována izolací nebo syntézou nukleotidové sekvence kódující původní IFNG, jako je huIFNG s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 17 nebo její fragment, a pak úpravou nukleotidové sekvence tak, že umožňuje zavedení (to je začlenění nebo substituci) nebo deleci (to je odstranění nebo substituci) relevantního aminokyselinového zbytku(ů)).

Nukleotidová sekvence se vhodně upravila místně řízenou mutagenezí v souladu s dobře známými metodami, jak se popisuje • · · ·

·· · · « · v publikaci Merk et al., Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984) a v americkém patentovém dokumentu č.4 588 585.

V jiném případě nukleotidová sekvence se připravila chemickou syntézou, například použitím oligonukleotídového syntetizéru, kde oligonukleotidy jsou navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadované varianty polypeptidu a s výhodou se vyberou ty kodony, které jsou výhodné pro hostitelskou buňku, ve které vznikne varianta rekombinantního polypeptidu. Například, se může syntetizovat a uspořádat pomocí PCR, ligací nebo ligační řetězcovou reakcí (LCR) několik malých oligonukleotidů kódujících části požadované varianty polypeptidu. Jednotlivé oligonukleotidy v typickém případě obsahují přesahy 5'-konce nebo 3'-konce v případě komplementárního uspořádání.

Po provedení uspořádání (syntézou, místně řízenou mutagenezí nebo jiným způsobem) se nukleotidová sekvence kódující variantu polypeptidu začlení do rekombinantního vektoru a je operativně spojena s řídící sekvencí nezbytnou pro expresi varianty polypeptidu IFNG v požadované transformované hostitelské buňce. Rozumí se, že ne všechny vektory a sekvence řídící expresi fungují stejně dobře, aby se dosáhlo exprese popsané varianty polypeptidu IFNG. Ani všichni hosté nefungují stejně dobře ve stejném expresívním systému. Odborník může provést výběr mezi vektory, sekvencemi kontrolujícími expresi a hostiteli, aniž je nutné provést experimenty. Při selekci vektoru je nutné například zvažovat hostitele, protože vektor se v něm musí replikovat nebo musí být schopen se začlenit do chromozomu. Musí se také uvažovat počet kopií vektoru, schopnost řídit počet kopií a exprese libovolných jiných proteinů kódovaných vektorem, jako jsou antibiotikové markéry. Při výběru sekvence řídící expresi je ·· 9··· nutné zvažovat řadu faktorů. Tyto faktory zahrnují například relativní pevnost sekvence, její řiditelnost a její kompatibilitu s nukleotidovou sekvencí kódující variantu polypeptidu, zvláště s ohledem na potencionální sekundární struktury. Hostitelé by se měly vybrat na základě jejich kompatibility s vybraným vektorem, toxicity produktu kódovaného nukelotidovou sekvencí, jejich charakteristik vylučování, jejich schopností správně sbalit polypeptid, jejich fermentace nebo požadavků kultivace a jednoduchosti izolace produktů kódovaných nukleotidovou sekvencí.

Rekombinantní vektor může být samostatně se replikující vektor, to je vektor, který existuje jako extrachromozomální entita, replikace kterého je závislá na chromozomální replikaci, například plazmid. V jiném případě je vektorem ten plazmid, který, když se vnese do hostitelské buňky se začlení do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromozomem, do kterého se začlenil.

Vektorem je s výhodou expresívní vektor, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující variantu polypeptidu IFNG operativně spojena s dalšími segmenty nutnými pro transkripci nukleotidové sekvence. Vektor se v typickém případě získal z plazmidu nebo z virové DNA. Řada zde zmiňovaných vhodných expresívních vektorů vhodných pro expresi v hostitelských buňkách jsou běžně dostupné a popisují se v literatuře. Expresívní vektory použitelné v eukaryontních hostitelích zahrnují například vektory obsahující sekvence řídící expresi pocházející z SV40, z bovinního papilomaviru, adenoviru a cytomegaloviru. Specifickými vektory jsou například pCDNA3.1(+)\Hyg (od firmy Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a pCI-neo (od firmy Stratagene, La Jola, CA, USA) . Použitelné expresívní vektory pro bakteriální hostitele zahrnují známé bakteriální plazmidy, jako jsou plazmidy z mikroorganizmu E. coli, které zahrnují pBR322, pET3a a pET12a (od firmy Novagen *· ····

*.· »· «··· ··· *· ··· ···· ·· ·· lne., WI, USA) a širší hostitelské rozmezí plazmidů, jako je RP4, fágové DNA, například řada derivátů fágu lambda, například NM989 a jiné DNA fágy, jako je M13 a vláknité jednořetězcové DNA fágy. Použitelné expresívní vektory vhodné pro kvasinkové buňky zahrnují plazmid 2μ a jeho deriváty, vektor POTÍ (popisuje se v americkém patentovém dokumentu č. 4 931 373), vektor pJSO37 popsaný v publikaci Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996) a pPICZ A, B nebo C (Invitrogen). Vektory vhodné pro hmyzí buňky zahrnují pVL941, pBG311 (popisuje se v publikaci Cate et al., Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerien Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells, Cell, 45, pp. 685-98 (1986)), pBluebac 4.5 a pMelcbac (oba dostupné u firmy Invitrogen).

Jiné vektory vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují ty, které umožňují nukleotidové sekvenci kódující variantu polypeptidů IFNG, aby se amplifikovala s určitým počtem kopií. Takové amplifikované vektory jsou dobře známy v oboru. Tyto vektory zahrnují například vektory, které je možné amplifikovat pomocí DHFR amplifikace (popisuje se například v americkém patentovém dokumentu Kaufman, č. 4 470 461, a v publikaci Kaufman and Sharp, Construction of a modular dihydrafolate reductase cDNA gene: Analysis of Signals utilized for efficient expression, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)), a amplifikací za pomoci glutaminsyntetázy (GS) (popisuje se na příklad v americkém patentovém dokumentu č. 5 122 464 a EP 338 841).

Rekombinantní vektor může dále obsahovat sekvenci DNA umožňující vektoru se replikovat v hostitelské buňce. Příkladem takové sekvence (pokud je hostitelská buňka savčí buňkou) je počátek replikace u SV40. V případě, že hostitelskou buňkou je kvasinková buňka, vhodné sekvence umožňující vektoru se replikovat jsou replikační geny REP 1 až • 9 také obsahovat selekční kterým doplňuje defekt ·· 9994 a počátek replikace. Vektor může markér, například genový produkt, v hostitelské buňce, jako gen kódující dihydrofolátovou reduktázu (DHFR) nebo gen TPI organizmu Schizosaccharomyces pombe (popisuje se v publikaci P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130) nebo který udílí rezistenci vůči lékům, jako je například ampicilin, kanamycin, tetracyklin, chloramfenikol, neomycin, hygromycin nebo methotrexát. V případě vláknitých hub selekční markéry zahrnují amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.

Termín „řídící sekvence zahrnuje všechny složky, které jsou nezbytné nebo výhodné pro expresi varianty polypeptidu IFNG. Každá řídící sekvence může být pro nukleotidovou sekvenci kódující variantu polypeptidu přirozená nebo cizorodá. Takové řídící sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na vedoucí sekvenci, polyadenylační sekvenci, propeptidovou .sekvenci, promotor, zesilovač nebo aktivační sekvenci proti směru exprese genu, sekvence signálního peptidů a terminátor transkripce. Kontrolní sekvence minimálně zahrnuje promotor.

Podle vynálezy je možné použít širokou škálu sekvencí řídících expresi. Takové použitelné sekvence řídící expresi zahrnují sekvence řídící expresi spojené se strukturními geny expresívních vektorů, stejně jako libovolnou sekvenci, která řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů a různé jejich kombinace.

Příklady řídících sekvencí vhodných pro řízenou transkripci v savčích buňkách zahrnují časné a pozdní promotory SV40 a adenoviru, například hlavní pozdní promotor adenoviru 2, promotor MT-1 (gen metalothioneinu), gen středně časného promotoru lidského cytomegaloviru (CMV), promotor lidského elongačního faktoru la (EF-la), promotor proteinu minimálního teplotního šoku 70 organizmu Drosophila, promotor viru Rousova Sarcomu (RSV), promotor lidského ubikvitinu C •· ····

	65	• ·· • Φ · · • · · • · · · • · · ··· · ·	• ·· ·· · « • · • · · • · ··· ····	·· ···· • · · • · · ♦ · · • · · · 99 99
(UbC), terminátor lidského	růstového hormonu,	SV4 0 nebo
polyadenylační signály oblasti	adenoviru	Elb	a Kozáková
konvenční sekvence (popisuje	se v	publikaci	Kozák,	M. J. Mol.

Biol. 1987, aug. 20, 196(4):947-50).

Za účelem zlepšit expresi v savčích buňkách je možné do 5'nepřekládáné oblastí nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidu IFNG začlenit syntetický intron. Příkladem syntetického intronu je syntetický intron z plazmidu pC-Neo (dostupný u firmy Promega Corporation, WI, USA).

Příklady vhodných řídících sekvencí pro řízení transkripce v hmyzích buňkách zahrnují promotor polyhedrinu, promotor P10, promotor základního proteinu polyhedrózy Autographa californica, promotoru středně časného genu 1 bakuloviru a promotoru zpožděného časného genu bakuloviru 39K a polyadenylační sekvence SV40.

Příklady řídících sekvencí vhodných při použití v kvasinkových hostitelských buňkách zahrnují promotory kvasinkového systému množení a, promotor kvasinkové triózofosfátové izomerázy (TPI), promotory z kvasinkových glykolytických genů nebo nebo genů dehydrogenázy alkoholu, promotor ADH2-4c a indukovatelného promotoru GAL.

Příklady řídících sekvencí vhodných pro použití v hostíteslkých buňkách vláknitých hub zahrnují promotor ADH3 a terminátor, promotor získaný z genů kódujících TAKA amylázu, triózofosfátovou izomerázu nebo alkalickou proteázu mikroorganizmu Aspergillus oryzae, α-amylázu mikroorganizmu A. niger, glukoamylázu mikroorganizmu A. niger nebo A. nidulans, acetamidázu mikroorganzimu A. nidulansi_r asparágovou proteinázu mikroorganizmu Rhizomucor miehei nebo lipázu, terminátor TPIl a terminátor ADH3.

·· ···« • tttt ····

Příklady řídících sekvencí vhodných pro v bakteriálních hostitelských buňkách zahrnují systému lac, systému trp, systému TAC nebo TRC a hlavní promotorové oblasti fága lambda.

použití promotory

Nukleotidová sekvence podle vynálezu, ať už je připravena místně řízenou mutagenezí, syntézou nebo jinými metodami, může nebo nemusí také zahrnovat nukleotidovou sekvenci, která kóduje signální peptid. Signální peptid je přítomen, jestliže polypeptid je vylučován z buněk, ve kterých je exprimován. Takový signální peptid, jestliže je přítomen by měl být rozeznán buňkou vybranou pro expresi varianty polypetidu. Signální peptid může být homologní (například může být v normálním případě asociovaný s huIFNG) nebo heterologní (to znamená, že může pocházet z jiného zdroje než je huIFNG) vůči polypetidu nebo může být homologní nebo heterologní s hostitelskou buňkou, to znamená, že signální peptid je normálně exprimovaný z hostitelské buňky nebo není normálně exprimovaný z hostitelské buňky. Signální peptid může být prokaryotický, například získaný z bakterie, jako je E. coli nebo eukaryotický, například získaný ze savce, nebo hmyzí nebo kvasinková buňka.

Přítomnost nebo absence signálního peptidů bude například záviset na expresi hostitelské buňky používané pro produkci varianty polypeptidů, na exprimovaném proteinu (zda je vnitrobuněčný protein) a zda je nutné dosáhnout sekrece. V případě použití ve vláknitých houbách, signální peptid může být s výhodou získán z genu, který kóduje amylázu nebo glukoamylázu mikroorganizmu Aspergillus sp., gen kódující lipázu nebo proteázu mikroorganizmu Rhizomucor miehei nebo lipázu mikroorganizmu Humicola lanuginosa. Signální peptid se s výhodou získal z genu kódujícího TAKA amylázu organizmu A. oryzae, neutrální α-amylázu mikroorganizmu A. niger, amylázu stabilní v kyselém prostředí mikroorganizmu A. niger nebo ·· ·

• · ·«»» ··> ···· *·· • · *

9 9

9 9

9 9 · ·· ·· glukoamylázu mikroorganizmu A. niger. Pro použití ve hmyzích buňkách se signální peptid může běžně získat z hmyzího genu (popisuje se v publikaci WO 90/05783), jako je prekurzor adipokinetického hormonu lepidopteran Manduca sexta (popisuje se v americkém patentovém dokumentu 5 023 328), včelí melitin (Invitrogen), ekdysteroid UDPglukosyltransferázy (egt) (popisuje se v publikaci Murphy et al., Protřen Expression and Purification 4, 349-357 (1993) nebo lidské pankreatické lipázy (hpl) (popisuje se v publikaci Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997).

Výhodný signální peptid vhodný pro použití v savčích buňkách je ten pocházející z huIFNG nebo signální peptid lehkého řetězce kappa myšího Ig (popisuje se v publikaci Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104). V případě použití v buňkách kvasinek se zjistilo, že vhodným signálním peptidem je signální peptid faktoru a z kvasinek S. cereviciae (popisuje se v americkém patetnovém dokumentu č. 4 870 008), signální peptid amylázy myších slin (popisuje se v publikaci O. Hagenbuchle et al., Nátuře 289, 1981, pp. 643-646), upravený signální peptid karboxypeptidázy (popisuje se v publikaci L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), kvasinkový signální peptid BARI (popisuje se v patetnovém dokumentu WO 87/02670) a signální peptid kvasinkové asparágové proteázy 3 (YAP3) (popisuje se v publikaci M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137).

Libovolný vhodný hostitel se může použít k produkci varianty polypeptidu (zahrnující kvasinky), bakterie, nebo jiné

IFNG zahrnující rostliny, savce zvířecí buňky nebo buněčné linie, stejně jako transgenní zvířata nebo rostliny. Příklady bakteriálních hostitelských buněk zahrnují grampozitivní bakterie, jako jsou kmeny Bacillus, například B. brevi nebo B. subtilis, Pseudomonas nebo Streptomyces nebo gramnegativní bakterie, jako jsou kmeny houby vhodné • · · · 4 • · · · • · · · 1 • · · · I • ···· ·· ·· • · • · • ·* ··«»

E. coli. Zavedení vektoru do bakteriální hostitelské buňky může být například provedeno transformací protoplastů (popisuje se například v publikaci Chang and Cohen, 1979,

Molecular General za použití

Genetics 168: 111-115) kompetentních buněk (popisuje se například v publikaci Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 nebo

Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal

Biology 56: 209-221), elektroporací (popisuje v publikaci Shigekawa and Dover, 1988, Biotechniques 6: 742751) nebo konjugací (popisuje se například v publikaci Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

of Molekular se například

Příklady vhodných hostitelských buněk vláknitých hub zahrnují kmeny Aspergillus, například A. oryzae, A. niger nebo A. nidulas, Fusarium nebo Trichoderma. Buňky hub se mohou transformovat způsobem, který zahrnuje tvorbu protoplastů, transformaci protoplastů a regeneraci buněčné stěny způsobem dobře známým v oboru. Vhodné postupy transformace hostitelských buněk Aspergillus se popisují v patentovém dokumentu EP 238 023 a v americkém patentovém dokumentu č. 5 679 543. Vhodné metody pro transformaci specie Fusarium se popisují v publikaci Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 a v patentovém dokumentu WO 96/00787. Kvasinky se mohou transformovat za použití postupů popsaných v publikaci Becker and Guarente, Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to yeast genetics and molekular biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academie Press, lne., New York, Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163 a Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75: 1920.

Příklady vhodných kvasinkových hostitelských buněk zahrnují kmeny Saccharomyces, například S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, jako je P. pastoris nebo P. methanolica , Hansenula, jako je H.

* · ·· ····

polymorpha nebo Yarrowia. Způsoby transformace kvasinkových buněk s heterologní DNA a produkující heterologní peptidy dokládá firma Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA (v protokolu pro Yeastmarker ^(tm)Yeast Transformation Systém Kit) a popisuje se v publikaci Reeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415 a Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.

Příklady vhodných hmyzích hostitelských buněk zahrnují buněčnou linii Lepidoptora, jako je Spodoptera frugiperda (Sf9 nebo Sf21) nebo buňky Trichoplusioa (High Five) popisuje se v americkém patentovém dokumentu č. 5 077 214). Transformace hmyzích buněk a produkce heterologních polypeptidů se provede postupem popsaným firmou Invitrogen.

Příklady vhodných savčích hostitelských buněk zahrnují buněčnou linii z vaječníků křečků (CHO) (například CHO-K1, ATCC CCL-61), opičí buněčné linie (COS) (například COS 1 (ATCC CRL-1650), COS7 (ATC CRL-1651)), myší buňky (například NS/O), buněčné linie ledvin mláďat křečků (BHK) (například ATCC CRL1632 nebo ATCC CCL-10) a lidské buňky (například HEK 293 (ATCC CRL-1573)), stejně jako rostlinné buňky v tkáňové kultuře. V oboru jsou známy další buněčné linie a je možné je získat ve veřejných sbírkách, jako je instituce „American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Savčí buňka, jako je buňka CHO, se může upravit, aby exprimovala sialyltransferázu, například 1,6-sialyltransferázu, například jak se popisuje v americkém patentovém dokumentu č. 5 047 335 za účelem dosáhnout zlepšené glykosylace varianty polypeptidů IFNG.

Způsoby pro zavedení exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým, elektroporaci, transfekci zprostředkovanou DEAEdextranem, transfekci zprostředkovanou lipozomy, virové ·

> · · • · • · ·

ΊΟ vektory a Technologies způsob transfekce popsaný v publikaci Life Ltd, Paisley, UK za použití přípravku

Lipofectamin 2000. Tyto metody jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Ausbelet al. (eds.), 1996,

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, USA. Kultivace savčích buněk se provedla podle zavedených metod, jak se popisuje v publikaci Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press lne., Totowa, New Jersey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).

Za účelem produkovat glykosylovaný polypeptid v eukarytické hostitelské buňce je možné použít například buňky popsané shora v textu.

Při způsobech produkce podle vynálezu se buňky kultivovaly v nutričním kultivačním médiu vhodném pro produkci varianty polypeptidu za použití metod známých v oboru. Buňka se může například kultivovat v míchané nádobě v malém měřítku nebo fermentací ve velkém měřítku (zahrnuje kontinuální, vsádkovou, nátokovou fermentaci nebo fermentací na pevné fázi) v laboratorních nebo průmyslových fermentátorech, které se provedly ve vhodném kultivačním médiu a za podmínek, které umožňují exprimovat a/nebo izolovat variantu polypeptidu. Kultivace probíhá ve vhodném nutričním médiu obsahujícím zdroj uhlíku nebo dusíku a anorganické sole, za použití postupů známých v oboru. Vhodná kultivační média jsou obecně dostupná a mohou se připravit podle publikovaného složení (například v katalogu instituce „American Type Culture Collection). Jestliže se vylučuje varianta polypeptidu do nutričního média, variantu polypeptidu je možné získat přímo z kultivačního média. Jestliže varianta polypeptidu není vylučována, je možné ji získat z buněčných lyzátů.

• ·

• 4

Výsledná varianta polypeptidů se může získat způsoby známými v oboru. Varianta polypeptidů se může získat z nutričního média běžnými postupy, které zahrnují, ale nejsou omezeny centrifugací, filtrací, extrakcí, lyofilizací, odpařováním nebo srážením.

Varianty polypeptidů se mohou čistit různými postupy známými v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na chromatografii (například chromatografie s výměnou iontů, afinitní nebo hydrofóbní chromatografie, chromatofokusování a exkluze podle velikosti), elektorforetické postupy (například preparativni izoelektrické fokusování) , metody založené na různé rozpustnosti (například srážení síranem amonným), HPLC nebo extrakce (popisuje se například v publikaci Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publischers, New York, 1989). Specifické způsoby izolace polypeptidů vykazující aktivitu IFNG se popisují v patentovém dokumentu EP 0 110 44 a v japonském patentovém dokumentu č. 186995/84.

Biologická aktivita varianty polypeptidů IFNG se může testovat libovolnou vhodnou metodou známou v oboru. Takové testy zahrnují protilátkovou neutralizaci antivirové aktivity, vyvolání aktivit proteinové kinázy, oligoadenylátové 2,5-Asyntetázy nebo fosfodiesterázy, jak se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 041 313 Bl. Takové testy také zahrnují imunomodulační testy (jako se například popisují v americkém patentovém dokumentu č. 4 753 795), testy inhibice růstu a měření navázání na buňky, které exprimují interferonové receptory. Specifické testy se popisují v sekci Materiály a metody.

Farmaceutické prostředky a jejich použití

Vynález dále popisuje zdokonalené metody ošetření nebo prevence zvláště zánětlivých onemocnění například • · · 9 · 9 intersticiální plicní onemocnění, jako je pulmonární fibróza, ale také granulomatózní zhoubné bujení, zvláště karcinom vaječníků, infekce, jako je pulmonární atypická mykobakteriální infekce, kostní poruchy (například poruchy kostního metabolizmu, jako je maligní osteopetróza), autoimunitní onemocnění, jako je revmatoidní artritida, stejně jako jiná onemocnění, jako je multirezistentní tuberkulóza, kryptokokální meningitida, cystická fibróza a jaterní fibróza, zvláště jaterní fibróza, která následuje po hepatitidě C, uvedená metoda zahrnující aplikaci savci, zvláště člověku, který to potřebuje, účinné množství varianty polypeptidu podle vynálezu nebo prostředek podle vynálezu. Klíčovou výhodou je méně časná a/nebo méně intrusivní aplikace účinější terapie a menší nebezpečí vyvolání imunitních reakcí na terapeuticky aktivní sloučeninu(y) .

idiopatická onemocnění,

Molekula podle vynálezu se s výhodou aplikuje v prostředku, který zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcipient. Termín „farmaceuticky přijatelný znamená nosič nebo ekcipient, který pacientovi nezpůsobuje žádné nežádoucí účinky. Takové farmaceuticky přijatelné nosiče a ekcipienty jsou dobře známy v oboru (popisují se v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th Edition, A. R. Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company (1990), Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor and Francis (2000), a Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000) .

Molekuly podle vynálezu se mohou použít tak, jak jsou a/nebo ve formě jejich solí. Vhodné sole zahrnují, ale nejsou omezeny na sole alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako jsou sole sodíku, draslíku, vápníku a hořčíku, stejně • · jako například sole zinku. Tyto sole nebo komplexy mohou být přítomny jako krystalická a/nebo amorfní struktura.

Varianta podle vynálezu se aplikuje v dávce, která je přiližně paralelní té, která se používá při terapii se známými běžnými přípravky IFNG, jako je Actimmune® nebo jak se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 795 332. Správná dávka, která se má aplikovat, závisí na okolnostech. V normálním případě by dávka měla být schopna zabránit nebo zmírnit vážnost nebo rozšíření léčeného stavu nebo indikací. Odborníkovi je jasné, že účinné množství varianty nebo prostředku podle vynálezu závisí kromě jiného na onemocnění, dávce, rozvrhu aplikace, zda varianta polypeptidu nebo prostředek se aplikují samotné nebo ve spojení s jinými terapeutickými činidly, na sérovém poločase a obecném zdravotním stavu pacienta.

Vynález také popisuje variantu polypeptidu IFNG podle vynálezu nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu vhodný pro použití jako léčebný prostředek.

Vynález dále popisuje použití

i) varianty IFNG podle vynálezu nebo ii) farmaceutického prostředku podle vynálezu pro výrobu léčebného prostředku, farmaceutického prostředku nebo částí sady pro léčbu onemocnění vybraného ze skupiny zahrnující zánětlivé onemocnění, jako je intersticiální plicní onemocnění, zvláště idiopatickou pulmonární fibrózu, zhoubné bujení, zvláště karcinom vaječníků, infekce, jako jsou pulmonární atypické mykobakteriální infekce, kostní poruchy (například poruchy kostního metabolizmu, jako je maligní osteopetróza), granulomatózní onemocnění, autoimunní onemocnění, jako je revmatoidní artritida, multirezistentní tuberkulóza, kryptokokální ·· ····

·· · * ·· ♦ · • · · · · ··· ·· ··· ···· meningitida, cystická fibróza a jaterní fibróza, zvláště jaterní fibróza následující hepatitidu C. Nejvýhodnější je, když onemocnění je intesticiální plicní onemocnění, zvláště idiopatická pulmonární fibróza.

Také se popisují zdokonalené způsoby zavedení molekul nebo přípravků, které mohou navíc obsahovat glukokortikoidy.

Výhodné dávkování je 1 až 4, výhodněji 2 až 3 mikrogramů polypeptidové složky na jeden kilogram tělesné hmotnosti pacienta. Výhodné dávkování je 100 až 350, výhodněji 100 až 150 mikrogramů glukokortikoidu na jeden kilogram tělesné hmotnosti pacienta.

Vynález také popisuje sadu částí vhodných pro léčbu intersticiálního plicního onemocnění obsahujícího první farmaceutický prostředek obsahující aktivní složky i) nebo ii) uvedené shora v textu a druhý farmaceutický prostředek obsahující alespoň jeden glukokortikoid, každý může být společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ekcipientem.

Varianta podle vynálezu se může připravit jako farmaceutický prostředek metodami známými podle vynálezu. Vhodné prostředky se popisují v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin a v americkém patentovém dokumentu č. 5 183 746.

Farmaceutický prostředek se může připravovat v různých formách, které zahrnují tekutou, gelovou, lyofilizovanou, práškovou, pevnou stlačenou formu nebo jinou vhodnou formu. Výhodná forma bude zvláště záviset na určité indikaci, která se léčí a pro odborníka bude zjevná.

Farmaceutický prostředek se může aplikovat orálně, subkutánně, intravenózně, intracerebrálně, intranasálně, ·· 9999 intrámuskulárně, intraokulárně nebo například použitím

Přípravky se mohou je také přijatelná • 9 99 transdermálně, intrapulmonárně, libovolným jiným intraperitoneálně, vaginálně, rektálně, přijatelným způsobem, technologie PowerJect nebo ProLease. aplikovat kontinuálně infuzí, ačkoliv injekce aplikující jedinou dávku, za použití postupů, které jsou dobře známy v boru, jako jsou čerpadla nebo implantáty. V některých příkladech se mohou přípravky aplikovat přímo, jako roztok nebo sprej. Výhodný mód aplikace bude záviset na určité indikací, která se bude léčit, a bdue pro odborníka zřejmá.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu se může aplikovat ve spojení s jinými terapeutickými činidly. Tato činidla se mohou začlenit jako část stejného farmaceutického prostředku nebo se mohou aplikovat odděleně od varianty polypeptidu podle vynálezu, buď souběžně nebo v souladu s libovolným jiným přijatelným léčebným rozvrhem. Navíc varianta polypeptidu nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu se může použít jako doplněk k jiným terapiím. Zvláště se zvažuje kombinace s glukokortikoidy, jak se popisuje v patentovém dokumentu EP 0 795 332.

Vynález dále popisuje způsob léčby savce vykazujícího cirkulující protilátky proti huIFNG nebo rhuIFNG. Tento způsob zahrnuje aplikaci varianty IFNG, která vykazuje bioaktivitu IFNG a nereaguje s uvedenými protilátkami. Sloučeninou je s výhodou zde popsaná varianta, a savcem je s výhodou člověk. Léčení savci mohou trpět libovolným onemocněním uvedeným na seznamu shora v textu, které je možné léčit pomocí IFNG. Dále vynález popisuje způsob přípravy farmaceutického produktu pro použití při léčbě savců, kteří vykazují cirkulující protilátky proti huIFNG nebo rhuIFNG, kde varianta IFNG, která vykazuje biologickou aktivitu IFNG a která nereaguje s uvedenými protilátkami se připraví jako injektovatelný nebo jiným způsobem vhodný přípravek. Termín „cirkulující protilátky znamená autoprotilátky vytvořené v savcích jako odezva na léčbu libovolným běžně dostupným přípravkem IFNG.

Také se zvažuje použití nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidů podle vynálezu při aplikacích genové terapie. Zvláště může být zajímavé použití nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidů IFNG popsané v sekci shora v textu nazvané „Varianty IFNG podle vynálezu, kde polypeptidovou částí je cukerná část. Glykosylace varianty polypeptidů je pak možné dosáhnout během průběhu genové terapie, to je po expresi nukleotidové sekvence v lidském těle.

Uvažované aplikaci genové terapie zahrnují léčbu takových nemocí, kde varianta polypeptidů složí jako účinná terapie.

Lokální zavedení varianty IFNG použitím genové terapie může dopravit terapeutické činidlo do cílové oblasti, zatímco se předchází potencionálním problémům toxicity spojených s nespecifickou aplikací.

Zvažují se metody genové terapie in vitro nebo in vivo.

Je známo několik metod přenosu potencionálně terapeutických genů do definované buněčné populace. Další odkazy jsou uvedený například v publikaci Mulligan, The basic science of gene therapy, Science, 260, pp. 926-31 (1993). Tyto metody zahrnují:

Přímý přenos genů, například jak se popisuje v publikaci Wolf et al., Direct gene transfer into mouše muscle in vivo, Science 247, pp. 1465-68 (1990).

Přenos DNA prostřednictvím lipozomů, například jak se popisuje v publikaci Caplen et al., Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epíthelíum of patients with cystic ·· · ···· π π ··· · · ♦ · / / ····· · · · · .

• · · ···· ·· ··· ···· ·· · fibrosis, Nátuře Med., 3, pp. 39-46 (1995), Crystal, The Gene as a drug, Nátuře Med., 1, pp. 15-17 (1995), Gao and Huang, A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells., Biochem. Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991),

Přenos DNA prostřednictvím retroviru, jak se například popisuje v publikaci Kay et al., In vivo gene therapy of hemophilia B: Sustained partial correction in factor IXdeficient dogs, Science, 262, pp. 117-19 (1993), Andesron, Human gene therapy, Science, 256, pp. 808-13 (1992),

Přenos DNA prostřednictví, DNA viru. Takové DNA viry zahrnují adenoviry (s výhodou vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpesviry (s výhodou vektory založené na viru herpes simplex) a parvoviry (s výhodou vektory založené na „defektních nebo neautonomních parvovirech, s výhodou vektory založené na adenoasociovaných virech, nej výhodněji vektory založené na AAV-2). Tato metoda se popisuje například v publikaci Ali et al., The use of DNA viruses as vectors for gene therapy, Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994), v americkém patentovém dokumentu č. 4 797 368 a 5 139 941.

Prostředky aplikovatelné parenterálně

Příkladem farmaceutického prostředku je roztok navržený pro parenterální aplikaci. Ačkoliv v mnoha případech farmaceutické přípravky se vyskytují v kapalné formě a tak jsou vhodné pro okamžité použití, takové parenterální prostředky se mohou také vyskytovat ve zmrazené nebo lyofilizované formě. V předešlém případě se musí prostředek před použitím rozmrazit. Později zmiňovaná forma se často používá k zesílení stability aktivní sloučeniny obsažené v prostředku v různých podmínkách skladování. Odborníkovi je známo, že lyofilizované prostředky jsou v obecném případě více stabilní ve srovnání s jejich kapalnými protějšky. Takové

lyofilizované přípravky je možné před použitím rekonstituovat přidáním jednoho nebo více vhodných farmaceutických ředidel, jako je sterilní voda v případě injekcí nebo sterilní fyziologický roztok.

V případě parenterálně aplikovaných prostředků se připravují za účelem skladování v lyofilizované formě nebo ve formě vodných roztoků smícháním varianty polypeptidu, která má požadovaný stupeň čistoty s jedním nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, ekcipientů nebo stabilizátorů, které se v typickém případě používají v oboru (všechny se nazývají ekcipienty), například pufrující činidla, stabilizační činidla, konzervační činidla, izotonické roztoky, neinogenní detergenty, antioxidanty a/nebo jiná rozličná aditiva.

Pufrovací činidla pomáhají udržovat pH v rozmezí blízkém fyziologickým podmínkám. Jsou v typickém případě přítomny v koncentraci v rozmezí od přibližně 2 mM do přibližně 50 mM. Pufrovací činidla vhodná pro použití podle vynálezu zahrnují organické a anorganické kyseliny a jejich sole, jako jsou citrátové pufry (například směs citrátu sodného a citrátu disodného, směs kyseliny citrónové a citrátu trisodného, směs kyseliny citrónové a citrátu sodného atd.), sukcinátové pufry (například směs kyseliny jantarové a sukcinátu monosodného, směs kyseliny jantarové a hydroxidu sodného, směs kyseliny jantarové a sukcinátu disodného atd.), vinanové pufry (například směs kyseliny vinné a vinanu sodného, směs kyseliny vinné a vinanu draselného, směs kyseliný vinné a hydroxidu sodného atd.), fumarátové pufry (například směs kyseliny fumarové a fumarátu sodného, směs kyseliny fumarové a fumarátu disodného, směs fumarátu sodného a fumarátu disodného atd.), glukonátové pufry (například směs kyseliny glukonové a glukonátu sodného, směs kyseliny glukonové a hydroxidu sodného, směs kyseliny glukonové a glukonátu draselného atd.), oxalátové pufry (například směs kyseliny oxalové a oxalátu ·· ···· sodného, směs kyseliny oxalové a hydroxidu sodného, směs kyseliny oxalové a oxalátu draselného atd.), laktátové pufry (například směs kyseliny mléčné a laktátu sodného, směs kyseliny mléčné a hydroxidu sodného, směs kyseliny mléčné a laktátu draselného atd.) a acetátové pufry (například směs kyseliny octové a acetátu sodného, směs kyseliny octové a hydroxidu sodného atd.). Další možnosti jsou fosfátové pufry, histidinové pufry a trimetylaminové sole, jako je Tris.

Aby se zpomalil růst bakterií mohou se přidat konzervační činidla a v typickém případě se přidávají v množství přibližně 0,2 až 1 % (hmotnost/objem). Konzervační činidla vhodná pro použití podle vynálezu zahrnují fenol, benzylalkohol, metakresol, metylparaben, propylparaben, oktadecyldimetylbenzylamonium-chlorid, benzalkonium-halid (například chlorid, bromid nebo jodid benzalkonia), hexametonium-chlorid, alkylparabeny, jako je metylparaben nebo propylparaben, katechol, rezorcín, cyklohexanol a 3-pentanol.

Izotonická činidla se mohou přidat za účelem zaručení izotonicity kapalných prostředků a zahrnují vícemocné sacharidové alkoholy, s výhodou trojmocné nebo vyšší cukerné alkoholy, jako je glycerin, erytritol, arabitol, xylitol, sorbitol a manitol. Vícemocné alkoholy mohou být přítomny v množství v rozmezí 0,1 až 25 hmotnostních procent, v typickém případě v rozmezí 1 až 5 %, přičemž se bere v úvahu relativní množství jiných složek.

Stabilizační činidla znamenají rozsáhlou kategorii pomocných látek, jejichž funkce může být v rozmezí od objemového činidla až k aditivům, které rozpouští terapeutické činidlo nebo zabraňují denaturaci nebo adherenci na stěnu nádoby. Typická stabilizační činidla mohou být vícemocné cukerné alkoholy (vyjmenované shora v textu), aminokyseliny, jako je arginin, lyzin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, « « · ribitol, myoinistol, zahrnující cyklitoly, alanin, omitin, L-leucin, 2-fenylalanín, kyselina glutamová, treonin, například organické cukry nebo cukerné alkoholy, jako je laktóza, trehalóza, stachyóza, manitol, sorbitol, xylitol, galaktitol, glycerol a podobně, jako je inositol, polyetylenglykol, aminokyselinové polymery, redukční činidla obsahující síru, jako je močovina, glutathion, kyselinu thioktovou, thioglykolát sodný, thioglycerol, α-monothioglycerol a thiosulfát sodný, polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností (to je míně než 10 zbytků) , proteiny, jako je lidský sérový albumin, bovinní sérový albumin, želatinu nebo imunoglobuliny, hydrofilní polymery, jako je polyvinylpyrolidon, monosacharidy, jako je xylóza, manóza, fruktóza a glukóza, disacharidy, jako je laktóza, maltóza a cukróza, trisacharidy, jako je rafinóza a polysacharidy, jako je dextran.

Stabilizační činidla jsou v typickém případě přítomny v rozmezí od 0,1 do 10 000 hmotnostních částí, což se hodnotí na základě hmotnosti aktivního proteinu.

Neinogenní povrchově aktivní činidla a detergenty (také známy jako „smáčecí činidla mohou napomáhat rozpouštět chránit terapeutický mícháním, které také který je vystaven zabraňuj i povrchovému terapeutická činidla, stejně jako polypeptid proti agregaci vyvolané denaturaci polypeptidů, napětí. Vhodná neinogenní povrchově aktivní činidla zahrnují polysorbáty (20, 80 atd.), polyoxamery (184,

188 atd.), Pluronic® polyoly, monoetery polyoxyetylensorbitanu (Tween®-20, Tween®-80, atd.).

Další různé pomocné látky zahrnující objemová činidla nebo plnidla (například škrob), chelatační činidla (například EDTA), antioxidanty (například kyselina askorbová, metionin, vitamin E) a pomocná rozpouštědla.

* • ♦

····

Aktivní složka může také být zachycena v mirkokapsulích připravených například metodou ko-ascervace nebo mezifázovou polymerizací, například hydroxymetylcelulóza, želatina nebo polymetylmetacylátové mikrokapsule, koloidní zaváděcí systémy léků (například lipozomy, albuminové mikrosféry, mikroemulze, nanočástice a nanokapsule) nebo v makroemulzích. Takové metody se popisují například v publikaci Remington^zs Pharmaceutical Sciences, 18 th Edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990), Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins.

Parenterální přípravky používané pro in vivo aplikaci musí být sterilní. To se často provádí například filtrací pomocí sterilních filtračních membrán.

Ve výhodném provedení vynálezu uvedený farmaceutický prostředek obsahuje

i) variantu IFNG podle vynálezu, ii) pufrující činidlo, zvláště sůl organické kyseliny, schopnou udržovat hodnotu pH v rozmezí 5,0 až 6,5, iii) stabilizátor, zvláště organický cukr nebo sacharidový alkohol, iv) neinogenní povrchově aktivní činidlo a

v) sterilní vodu.

Pufrovací činidlo se zvláště vybralo ze skupiny zahrnující acetát, sukcinát a citrát, stabilizační činidlo je manitol nebo sorbitol, neinogenní povrchově aktivní činidlo je Tween®20 nebo Tween®-80. Je výhodné, když farmaceutický prostředek nezahrnuje konzervační činidla.

Přípravky pro nepřerušované uvolňování

Vhodné příklady přípravků pro nepřerušované uvolňování zahrnují semi-permeabílní matrice pevných hydrofóbních polymerů, které obsahují variantu, matrice, které mají vhodnou formu, jako je film nebo mikrokapsule. Příklady matric ·*·· t ♦ s nepřerušovaným uvolňováním zahrnují polyestery, hydrogely (například póly(2-hydroxyetylmetakrylát) nebo póly(vinylalkohol)), polylaktidy, kopolymery kyseliny Lglutamové a etyl-L-glutamát, nedegradovatelný etylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyseliny mléčnékyseliny glykolové, jako je technologie ProLease® nebo Lupron Depot® (injektovatelné mikrosféry složené z kopolymeru kyselina mléčná-kyselina glykolová a acetátu leuprolidu) a poly-D-(-)-3-hydroxymáselná kyselina. Zatímco polymery, jako je etylenvinylacetát a kyselina mléčná-kyselina glykolová umožňují uvolňování molekul po dlouhou dobu, až 100 dní, jisté hydrogely uvolňují proteiny po kratší časové úseky. Pokud polypeptidy uzavřené v kapsulích zůstávají v těle po delší dobu, mohou se denaturovat nebo agregovat, jako výsledek vystavení vlhkosti při teplotě 37 °C, což vede ke ztrátě biologické aktivity a k možným změnám imunogennosti. Racionální strategie je postavena na stabilizaci v závislosti na mechanizmu. Jestliže například se zjistilo, že mechanizmus agregace je tvorba intermolekulárních S-S vazeb prostřednictvím thio-disulfidových změn, stabilizace je možné dosáhnout úpravou sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv a vývojem specifických polymerních matricových prostředků.

Orální aplikace

V případě orální aplikace farmaceutickým prostředkem může být pevná nebo kapalná forma, například forma kapsulí, tablet, suspenze, emulze nebo roztoku. Farmaceutický prostředek se s výhodou připravuje ve formě dávkové jednotky obsahující dané množství aktivní složky. Vhodná denní dávka pro člověka nebo jiného savce může kolísat v závislosti na stavu pacienta a jiných faktorech, ale také může být stanovena odborníkem za použití rutinní metody.

9999 ·< · : 9 * • 9

999 9999 » · 9 ► 9 <

I 9 9 «

99

Pevné dávkové formy vhodné pro orální aplikaci mohou zahrnovat kapsule, tablety, čípky, prášek granule.

V takových pevných dávkových formách je aktivní sloučenina smíchána s alespoň s jedním inertním ředidlem, jako je sacharóza, laktóza nebo škrob. Taková dávková forma může také obsahovat další látky, například lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. V případě kapsulí, tablet a pilulek dávkové formy mohou také obsahovat pufrovací čindila. Tablety a pilulky mohou být dále připraveny jako enterosolventní.

Varianty se mohu smíchat s adjuvans, jako je laktóza, sacharóza, škrobový prášek, celulózové estery alkanových kyselin, kyseliny stearové, talek stearát hořečnatý, oxid hořečnatý, sodné nebo vápenaté sole kyseliny fosforečné a sírové, arabská guma, želatina, alginát sodný, polyvinylpyrrolidin a/nebo polyvinylalkohol, a připravují se ve formě tablet nebo kapsulí vhodných pro běžnou aplikaci. V jiném případě se mohou rozpustit ve fyziologickém roztoku, ve vodě polyetylenglykolu, propylenglykolu, etanolu, olejích (jako je kukuřičný olej, olej z burských oříšků, olej ze semen bavlníku nebo sezamový olej), tragant a/nebo různé pufry. Jiná adjuvans a módy aplikace jsou dobře známy v oboru. Nosič nebo ředidlo může zahrnovat materiál způsobující prodlevu, jako je glycerylmonostearát nebo samotný glyceryldistearát nebo vosk nebo jiný materiál, který je dobře znám v oboru.

Farmaceutické prostředky se mohou vystavit běžným farmaceutickým operacím, jako je sterilizace a/nebo mohou obsahovat běžné adjuvans, jako jsou konzervační činidla, stabilizační činidla, smáčecí činidla, emulgační činidla, pufry, plnící činidla atd..

Kapalné dávkové formy pro orální aplikaci mohou zahrnovat farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, syrupy a elixíry, které obsahují běžně užívaná inertní ředidla, jako je

4444

4 4 • 44 ♦ · · · · ·

44 voda. Takové prostředky mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou smáčecí činidla, sladidla, ochucovadla a parfumační činidla.

Povrchová aplikace

Přípravky vhodné pro povrchovou aplikaci zahrnují kapalné nebo semi-kapalné přípravky vhodné pro penetraci kůží (například linimentum, roztok k omývání, mastí, krémy nebo pasty) a kapky vhodné pro aplikaci do očí, nosu nebo uší.

Zavedení do plic

Přípravky vhodné pro aplikaci nebulizátorem, buď s tryskou nebo ultrazvukové, budou v typickém případě obsahovat variantu polypeptidu rozpuštěnou ve vodě v koncentraci například přibližně 0,01 až 25 mg varianty v jednom mililitru roztoku, s výhodou přibližně 0,1 až 10 mg/ml. Přípravek může zahrnovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku) a/nebo lidský sérový albumin v koncentraci 0,1 až 10 mg/ml. Příklady takových použitelných pufrů jsou acetát sodný, citrát nebo glycin. Pufr bude vykazovat s výhodou složení a molaritu vhodnou pro úpravu pH roztoku v rozmezí 3 až 9. V obecném případě pro tyto účely se hodí molarita pufru v rozmezí 1 mM až 50 mM. Příklady cukrů, které se mohou využívat, jsou laktóza, maltóza, manitol, sorbitol, trehalóza a xylóza, obvykle v množství, které je v rozmezí 1 až 10 hmotnostních procent přípravku.

Rozprašovaný prostředek může také obsahovat povrchově aktivní činidlo, aby se redukovala nebo aby se zabránilo povrchové agregaci proteinu způsobené atomizací roztoku při tvorbě aerosolu. Mohou se použít různá běžná povrchově aktivní činidla, jako jsou estery a alkoholy polyoxyetylenu mastných kyselin a estery polyoxyetylensorbitanu mastných kyselin. Množství se v obecném případě bude pohybovat mezi 0,001 a 4 ·· φ··· • · · • · · φ · · φ · · · φφ φφ hmotnostními procenty přípravku. Výhodná povrchově aktivní činidla pro účely vynálezu jsou polyoxyetylensorbitanmonooleát.

Specifické přípravky a metody tvořící vhodné disperze kapalných částic podle vynálezu se popisují v patentovém dokumentu WO 94/20069, v americkém patentovém dokumentu č. 5 915 378, 5 960 792, 5 957 124, 5 934 272, 5 915 378, 5 855

564, 5 826 570 a 5 522 385.

Přípravky vhodné pro inhalaci, kde dávku odměřuje inhaliční zařízení, v obecném případě obsahují jemně rozmělněný prášek. Tento prášek může vznikat lyofilizací a pak mletím kapalné varianty přípravku a může také obsahovat stabilizační činidlo, jako je lidský sérový albumin (HSA). V typickém případě se může přidat 0,5 % (hmotnost/hmotnost) HSA. Jestliže je to nezbytné, k přípravku se může přidat jeden nebo více cukrů nebo sacharidových alkoholů. Příklady zahrnují laktózu, maltózu, manitol, sorbitol, sorbitózu, trehalózu, xylitol a xylózu. Množství přidané k formulaci může být v rozmezí přibližně 0,01 až 200 hmotnostních procent, s výhodou přibližně 1 až 50 % přítomné varianty. Takové přípravky se pak mohou lyofilizovat a mlít na požadovanou velikost částic.

Správně velké částice se pak suspendují v hnací látce za pomoci povrchově aktivního činidla. Hnací látkou může být libovolný pro tyto účely používaný materiál, jako je freon, hydrochlorfluorouhlovodík, hydrofluorouhlovodík nebo uhlovodík zahrnující trichlorfluorometan, dichlordifluorometan, dichlortetrafluorometan a 1,1,1,2-tetrafluoroetan nebo jeho kombinace. Vhodné povrchově aktivní látky zahrnují sorbitantriolát a sojový lecitin. Jako povrchově aktivní činidlo je možné použít kyselinu olejovou. Tato směs se pak nanese do zaváděcího zařízení. Příkladem běžně dostupného • 4

4 * · * · • 4 4 • 4

inhalačního zařízení, které odměřuje dávky a je vhodné pro použití podle vynálezu je inhalační přístroj Ventolin od firmy Glaxo lne., Research Triangle Park, N.C..

Přípravky vhodné pro práškové inhalátory budou obsahovat jemně rozmělněný suchý prášek obsahující variantu polypetidu a může také zahrnovat objemové činidlo, jako je laktóza, sorbitol, sacharóza nebo manitol v množství, které umožňuje rozptýlení prášku ze zařízení, například 50 až 90 hmotnostních procent přípravku. Částice prášku by měly v plicích vykazovat aerodynamické vlastnosti odpovídající částicím s hustotou přibližně 1 g/cm², které mají střední průměr menší než 10 mikrometrů, s výhodou mezi 0,5 až 5 mikrometry, nej výhodněji mezi 1,5 a 3,5 mikrometry. Příkladem práškového inhalačního zařízení vhodného pro použití v souladu s vynálezem je Spinhalerův práškový inhalační přístroj od firmy Fisons Corp., Bedford, Mass.

Prášky pro tyto přístroje se mohou připravovat a/nebo zavádět způsoby popsanými v amerických patentových dokumentech č. 5 997 848, 5 993 783, 5 985 248, 5 976 574, 5 922 354, 5 785 049 a 5 654 007.

Mechanická zařízení navržená pro zavádění terapeutických produktů do plic zahrnují, ale nejsou omezeny na rozprašovače, inhalátory s odměřenou dávkou a práškové inhalátory, které jsou dobře známy v oboru. Specifické příklady běžně dostupných přístrojů vhodných pro praktické použití podle vynálezu jsou rozprašovač Ultravent od firmy Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri, rozprašovač Acorn II od firmy Marquest Medical Products, Englewood, Kolorado, inhlátor s odměřenou dávkou Ventolin od firmy Glaxo lne., Research Triangle Park, Severní Karolina, Spinhalerův práškový inhalátor od firmy Fisons Corp., Bedford, Massachusetts, inhalátor od firmy Inhale Therapeutic Systems, lne., San Carlos, Kalifornie, inhalátor

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

9999 99 99 *

« 4 ·· ····

AIR od firmy Alkermes, Cambridge, Massachusetts a pulmonární zaváděcí systém pro léčebné prostředky AERx od firmy Aradigm Corporation, Hayward, Kalifornia.

Materiály a metody

Materiály

Buňky CHO-Kl (dostupné u instituce „American Type Collection (ATCC #CCL-61)).

Buňky HeLa. (dostupné u instituce „American Type Collection (ATCC #CCL-2)).

ISRE-Luc získaný od firmy Stratagene, La Jolla, USA.

pCDNA3.1/Hygro se získal od firmy Invitrogen, Carlsbad, USA.

Restrikční enzymy a polymerázy se získaly od firmy New England Biolabs lne., Beverly, USA.

Kultivační médium DMEM: Dulbeccovo upravené Eagle médium (DMEM), 10 % fetální bovinní sérum a hygromycin B se získaly od firmy Life Technologies A/S, Kodaň, Dánsko.

Substrát LucLite se získal od firmy Packard Bioscience, Groningen, Holandsko.

Luminometr TopCount se získal od firmy Packard Bioscience, Groningen, Holandsko.

Biotinylované polyklonální protilátky proti lidskému IFNG BAF285 se získaly od firmy R&D Systems lne., Minneapolis, USA.

Streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou P0397 se získal od firmy DAKO, Kodaň, Dánsko.

Blotační činidlo TMB ze získalo od firmy KEM-EN-TEC,

Kodaň, Dánsko.

1

111 1

• · • · ··· 1111

11 · 11 11

Metody

Hlavní rysy interferonového testu

Dříve se publikovalo, že IFNG reaguje s receptory IFNG na buňkách HeLa a aktivuje je. Následně se aktivuje transkripce v promotorech obsahujících element odezvy stimulované interferonem (ISRE). Pak je možné testovat přítomnost agonistů receptorů interferonu použitím ISRE spojeného s luciferázovým reportním genem (ISRE-luc) umístěným v buňkách HeLa.

Primární test

Buňky HeLa se transfekuji společně s ISRE-Luc a pCDNA 3.1/hygro a buněčné klony se vytvořily výběrem v kultivačním médiu DMEM, které obsahuje Hygromycin B. U buněčných klonů se testuje luciferázová . aktivita v přítomnosti nebo bez přítomnosti IFNG. Tyto klony vykazující nejvyší poměr stimulované luciferázové aktivity ku nestimulované luciferázové aktivitě se pak používají v dalších testech.

Za účelem testování variant polypeptidů na destičky s 96 prohlubněmi se naneslo 15 000 buněk do jedné prohlubně a vše se inkubovalo přes noc v kultivačním médiu DMEM. Příští den se varianty polypeptidů stejně jako známé standardy přidaly k buňkám v různých koncentracích. Jako známý standard se použil přípravek Actimmune®. Přípravek Actimmune® ve zkumavce se ředil na koncentraci 300 IU/ml kultivačním médiem DMEM, 5 % FBS a uchovával se při teplotě -80 °C až do použití.

Destičky se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře vzduchu s 5 % CO₂ a pak se do každé prohlubně přidal substrát LucLite (od firmy Packard Bioscience, Groningen, Holandsko). Destičky se zatavily a měřila se luminiscence na luminometru TopCount (od firmy Packard) v modu SPC (stanovení jednotlivých fotonů).

• · • · *

Každá jednotlivá destička obsahuje prohlubně inkubované s IFNG, které slouží jako stimulované kontroly, a jiné prohlubně obsahující normální kultivační médiu, které slouží jako nestimulované kontroly. Poměr mezi stimulovanou a nestimulovanou luciferázovou aktivitou slouží jako vnitřní standard pro obě aktivity IFNG a určení odchylek jednotlivých experimentů. V případě každého vzorku IFNG se stanovilo množství v jednotkách vztažené ke standardu, kterým je přípravek Actimmune® a je vyjádřen jako AU.

Stanovení zvýšeného stupně glykosylace

Za účelem stanovení různých stupňů glykosylace monomerů varianty IFNG, se provedla elektroforéza na SDS-PAGE gelu za standardních podmínek a přenesl se na nitrocelulózovou membránu. Westernův přenos se provedl podle standardních postupů, kde se jako primární protilátky použily biotinylované polyklonální protilátky proti lidskému IFNG (BAF285 od firmy R&D Systems) a jako sekundární protilátka se použil streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou (P0397 od firmy DAKO). Pak následuje barvení pomocí blotačního činidla TMB (KEM-EN-TEC, Kodaň, Dánsko). Distribuce monomerů varianty IFNG vykazující různé stupně glykosylace se provedla pozorováním obarvené membrány.

Stanovení AUC_sc

AUC_sc se stanoví podkožní aplikací jedné dávky o objemu 200 μΐ stejného množství (vztaženo na aktivitu) varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu jak se aplikuje v případě krys.

V dalších experimentech se použily samice krys SpragDawley, jejichž tělesná hmotnost je 220 až 260 gramů. Polypeptid IFNG se smíchal se sukcinátem sodným (720 mg/1), manitolem (40 g/ml), polysorbátem (100 mg/1) při pH 6,0.

• 9	• 9 9	9 99 99 9 9	9 9 9	9	999 9 9
• 9	9	9 9	9	9	9
• ·	9	9 9	9	9	9 9
• 9	9 9	999 9999	99		99

Dříve než dojde k subkutánní aplikaci, odebral se z ocasní žíly krev, aby bylo jisté, že se nedetekuje aktivita IFNG. Po aplikace se z ocasní žíly odebíraly vzorky krve po 10 minutách, 20 minutách, 40 minutách, 60 minutách, 120 minutách, 240 minutách, 480 minutách, 720 minutách, 1 440 minutách, 1 620 minutách, 1 920 minutách a 2 880 minutách (někdy také po 3 600 minutách). Sérum se připravilo postupem: vzorky krve se odebraly venepunkcí a nechaly koagulovat po dobu 20 minut při teplotě místnosti, pak následovala centrifugace při 5 000 g po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Sérum se pak izolovalo a uchovávalo při teplotě -80°C až do okamžiku, kdy se stanovila aktivita IFNG za použití primárního testu popsaného shora v textu. Mělo by se poznamenat, že když se ve vzorku séra stanovilo množství jednotek ze studie PK u krys, standard Actimmune® se ředil v DMEM, 5% FBS a 5% krysím séru.

Do grafu se vyneslo množství jednotek v seru (AU/ml) proti času (minuty) a pak se za použití programu GraphPad Prism 3.01 vypočítala AUC_sc.

Podobné experimenty se provedly v případě glykosylované formy huIFNG za účelem odhadnout zvýšenou hodnotu AUC_sc varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu ve srovnání s huIFNG v jeho glykosylované formě a/nebo ve srovnání s přípravkem Actimmune®.

Sérový poločas

Sérový poločas se stanoví intravenózní aplikací jedné dávky o objemu 200 μΐ stejného množství (vztaženo na aktivitu) varianty polypeptidu IFNG podle vynálezu jak se aplikuje v případě krys.

V dalších experimentech se použily samice krys SpragDawley, jejichž tělesná hmotnost je 220 až 260 gramů.

·* «··· ··

9

• ·

9 9

99

Polypeptid IFNG se smíchal se sukcinátem sodným (720 mg/1), manitolem )40 g/ml), polysorbátem (100 mg/1) při pH 6,0.

Dříve než dojde k intravenózní aplikaci, odebral se z ocasní žíly krev, aby bylo jisté, že se nedetekuje aktivita IFNG. Po aplikace se z ocasní žíly odebíraly vzorky krve po 5 minutách, 10 minutách, 20 minutách, 40 minutách, 60 minutách, 120 minutách, 240 minutách, 480 minutách, 720 minutách, 1 440 , minutách, 1 620 minutách, 1 920 minutách a 2 880 minutách.

Sérum se připravilo následující emtodou: vzorky krve se odebraly venepunkcí a nechaly se koagulovat po dobu 20 minut při teplotě místnosti, pak následovala centrifugace při 5 000 g po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Sérum se pak izolovalo a uchovávalo při teplotě -80°C až do okamžiku, kdy se stanovila aktivita IFNG za použití primárního testu popsaného shora v textu. Mělo by se poznamenat, že když se ve vzorku séra stanovilo množství jednotek ze studie PK u krys, standard Actimmune® se ředil v DMEM, 5% FBS a 5% krysím séru.

Do grafu se vyneslo množství jednotek v seru (AU/ml) proti času (minuty) a pak se za použití programu WinNonLinPro 3.3 vypočítal sérový poločas.

Podobné experimenty se provedly v případě glykosylované formy huIFNG za účelem odhadnout zvýšenou hodnotu sérového poločasu varianty polypeptidů IFNG podle vynálezu ve srovnání s huIFNG v jeho glykosylované formě a/nebo ve srovnání s přípravkem Actimmune®.

Stanovení aminokyselinových zbytků exponovaných na povrchu

Struktury

Experimentální struktury 3D huIFNG stanovené krystalografií s paprsky X se popisují v publikaci Ealick et al., Science 252: 698-702 (1991) na stopách C-alfa homodiméru

IFNG. V publikaci Walter et al., Nátuře 376:230-235 (1995) se ·· ···· • ·* «· · · · • · · • · · · • · · ··· · · · ·· • · ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· popisuje struktura homodimeru IFNG v komplexu se dvěmi molekulami rozpustné formy receptoru IFNG. Souřadnice této struktury nebyly nikdy publikovány, v publikaci Thiel et al., Structure 8: 927-936 (2000) se popisuje struktura homodimeru IFNG v komplexů se dvěma molekulama rozpustné formy receptoru IFNG vykazující třetí ·molekulu recepotru ve struktuře, která netvoří interakce s homodimerem IFNG.

Přístupné povrchové plochy (ASA)

Počítačový program Acess (popisuje se v publikaci B. Lee and F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400, (1971) version 2 (Copyright ©. 1983 Yale University) se použil ke stanovení přístupné povrchové plochy (ASA) jednotlivých atomů ve struktuře. Tato metoda v typickém případě používá velikost sondy 1,4 Á a definuje přístupnou povrchovou plochu (ASA) jako plochu tvořenou středem sondy. Před tímto výpočtem se ze sady souřadnic odstraní všechny molekuly vody, atomy vodíku a jiné atomy, které nejsou přímo spojené s proteinem.

Dílčí ASA postraního řetězce

Dílčí ASA atomů postraního řetězce se stanoví dělením součtu ASA atomů ve postranním řetězci hodnotou reprezentující ASA atomů postraního řetězce toho typu zbytku v prodlouženém (popisuje se v publikaci (1991) J. Mol. Biol.: 220, na atom CA pohlíží jako ale

Hubbard, 507-530. na část nikoliv tripeptidu ALA-x-ALA Campbelland Thornton V tomto příkladu se postranního řetězce glycinových zbytků, zbývajících zbytků. Následující tabulka zobrazuje hodnoty, které se používají jako standardy 100 % hodnot ASA pro postraní řetězce:

Ala

69.23 Á²

Leu

140.76

Á² • 4 4 4 44 4444

444 4 444 4 4 ·

4 4 4 4 4 4

4444 4 4444

444 44 444

444 44 444 4444 44 4

Arg	200.35	Á2	Lys	162.50	Á2
Asn	106.25	Á2	Met	156.08	Á2
Asp	102.06	Á2	Phe	163.90	Á2
Cys	96.69	Á2	Pro	119.65	Á2
Gin	140.58	Á2	Ser	78.16	Á2
Glu	134.61	Á2	Thr	101.67	Á2
Gly	32.28	Á2	Trp	210.89	Á2
His	147.00	Á2	Tyr	176.61	Á2
fle	137.91	Á2	Val	114.14	Á2

Zbytky, které se ve struktuře nestanovily se definují jako vykazující 100 % expozici a uvažuje se, že se nacházejí ve flexibilních oblastech.

Stanovení vzdáleností mezi atomy

Vzdálenost mezi atomy se stanovila za použití molekulového grafického softwaru, jako je například InsightlI v. 98.0 od firmy MSI INC.

Stanovení vazebného místa pro receptor

Vazebné místo pro receptor obsahuje všechny zbytky, jejichž přístupný povrchová plocha se po navázání receptorů mění. To se stanoví alespoň dvěma výpočty ASA. Jeden výpočet je pro izolovaný ligand(y) v komplexu ligand(y)/receptor(y) a v případě úplného komplexu ligand(y)/receptor(y).

Přehled obrázků na výkrese

Na Obr. 1 je zobrazen westernův přenos optimalizovaných glykosylačních variant rhuIFNG.

Levá strana westernová přenosu: dráha 1: standard, dráha 2: přípravek Actimmune®, dráha 3: rhuIFNG, dráha 4: [E38N]huIFNG.

Střední část westernová přenosu: dráha 1: standard, dráha 2: rhuIFNG, dráha 3: [E38N+S40T]rhuIFNG.

Pravá strana westernová přenosu: dráha 1: standar, dráha 2: rhuIFNG, dráha 3: [S99T]rhuIFNG, dráha 4: [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG.

Obr. 2 zobrazuje aktivitu IFNG v křivce serum-čas po subkutánní aplikaci v případě krys. Symbol · znázorňuje přípravek Actimmune®, symbol _a znázorňuje rhuIFNG, symbol ▲ znázorňuje [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG. V případě všech přípravků se aplikovala stejná dávka 1,15 χ 10⁷ AU/kg.

Obr. 3 zobrazuje aktivitu IFNG v křivce serum-čas po subkutánní aplikaci v případě krys. Symbol · znázorňuje přípravek [N16C+S99T]rhuIFNG (molekulová hmotnost 5 000 a zachycený mPEG), symbol _a znázorňuje [N16C+S99T]rhuIFNG (molekulová hmotnost 10 000 a zachycený mPEG), symbol ▲ znázorňuje [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG.

Varianta [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG se aplikovala v dávce

1,15 χ 10⁷ AU/kg, zatímco dvě varianty upravené pomocí PEG se aplikovaly v dávce 4,6 χ 10⁶ AU/kg.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Stanovení aminokyselinových zbytků exponovaných na povrchu

Užívaná struktura stanovená paprsky X byla homodimér IFNG v komplexu se dvěmi molekulami rozpustné formy receptorů IFNG vykazující třetí molekulu receptorů IFNG ve struktuře netvořící interakce s homodimerem IFNG (popisuje se v publikaci Thiel et al., Structure 8: 927-936 (2000). Strukturu tvoří homodimér IFNG, kde dvě molekuly jsou označeny A a B. Pro účely konstrukce existuje před sekvencí IFNG označenou M0 další metionin a sekvence je na C-konci zkrácena o deset zbytků (Q133 je poslední zbytek v konstruovaných molekulách). MO se odstraní ze struktury ve všech výpočtech tohoto vzorku. Struktura dvou monomerů IFNG vykazuje po zbytku 120 velmi slabou hustotu elektronů a zbytky byly modelovány pouze do zbytku T126. Před výpočtem tohoto příkladu se proto zbytky S121 až T126 odstranily ze struktury. Dva fragmenty receptorů značené C a D tvoří přímé interakce s homodimérem a třetí receptorová molekula značená E není v kontaktu s homodimérem a nezahrnuje tyto výpočty.

Povrchová expozice:

Provedení výpočtů dílčí ASA v případě homodimeru molekul A a B zahrnující MO a S121 až T126 v obou molekulách vede k následujícím zbytkům, které mají více než 25 % svého postraního řetězce exponovaného na povrchu v alespoň jednom z monomerů:

D2, P3, K6, E9, N10, K12, K13, Y14, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99, T101,D102, L103.N104, H111,Q115, A118,Q1, E119.

Následující zbytky vykazují více než 50 % postraního řetězce exponováno na povrchu v alespoň jednom z monomerů:

A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104, Q115, A118,

E119, Ql, D2, P3, K6, E9/N10, K13, N16, G18, H19, S20, D21.

Provedení výpočtu dílčí ASA v případě jednoho homodimeru molekul A a B zahrnující MO a A121 až T126 v obou molekulách a zahrnující receptorové molekuly C a D vede k tomu, že následující zbytky měly více než 25 % svého postraního řetězce exponovaného na povrchu v alespoň jednom z monomerů:

H19, D21, N25, G26, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63,

Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90,

E93, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104,E119 Ql, D2, P3, K6, E9, N10, K13, Y14, N16,

G18,

Následující zbytky vykazovaly více než 50 % jejich postraního řetězce exponovaného na povrchu alespoň jednoho z monomerů: P3, K6, N10, K13, N16, D21, N25, G26, G31, K34, K37,

E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S99, T101, D102, L103 a N104.

S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97,

Všechny shora popsané polohy jsou cíle pro úpravy v souladu s vynálezem.

Porovnání dvou seznamů se K12, S20, A23, D24, T27, Hlll, Q115 a A118 odstraní ze seznamu ASA z více než 25 % postraního řetězce po navázání receptorů a Ql, D2, E9, G18, H19, S20, A23, D24, T27, Q115, A118 a E119 se odstraní z více jak 50 % seznamu ASA postraních řetězců po navázání receptorů.

	Zbytky,	které	nej sou	ve struktuře stanovené jsou ošetřeny,
jako	plně exponované na	povrchu, to jsou zbytky S121,	P122,
A123,	A124,	K125,	T126,	G127, K128, R129, K130, R131,	S132,
Q133,	M134,	L135,	F136,	R137, G138, R139, R140, A141,	S142,
Q143.	Tyto	zbytky	také	tvoří oddělené cíle pro zavedení

záchytných skupin podle vynálezu (nebo se na ně může nahlížet jako, že patří ke skupině aminokyselinových zbytků exponovaných na povrchu, které mají více než 25 % nebo více než 50 % exponovaného postraního řetězce).

Příklad 2: Stanovení vazebného místa pro receptor

Provedení výpočtu ASA popsaného shora v textu vede k následujícím zbytkům molekuly IFNG, které vykazují redukovanou hodnotu ASA v alespoň jednom z monomerů v komplexu, jak se porovnalo s výpočtem v řípadě jednoho izolovaného dimeru: Ql, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K34, K37, K108, Hlll, E112, 1114, Q115, A118, E119.

Příklad 3: Návrh kazety pro expresi IFNG s použitím optimálního kodonu

Sekvence DNA (GenBank, přístupové číslo X13274) zahrnující plnou délku cDNA kódující zralou huIFNG se svým přirozeným signálním peptidem se upravila za účelem umožnit silnou expresi v buňkách CHO. Kodony nukleotidové sekvence huIFNG se upravily provedením posunutí v použití kodonu směrem ke kodonům, které se často používají v případě Homo sapiens. Následně jisté nukleotidy v sekvenci se nahradily jinými za účelem zavést rozeznávací místa v DNA pro restrikční endonukleázy. Primery se navrhly tak, aby se mohl syntetizovat gen.

Primery se sestavily tak, aby se mohl syntetizovat pomocí PCR v jednom kroku syntetický gen za použití sady „Platinium Píx-polymerase a standardních parametrů cyklů PCR provedené ve třech krocích. Sestavený gen se amplifikoval PCR za použití stejných podmínek a měl sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 42. Syntetizovaný gen se klonoval do pcDNA3.1/hygro (InVitrogen) mezi místa rozeznávaná restrikčními enzymy BamHI a Xbal, což vede ke vzniku pIGY-22.

pIGY-22 se transfekovala do buněk CHO KI použitím přípravky Lipofectaim2000 (od firmy LifeTechnologies) jako transfekčního činidla. 0 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a test ELISA se použil pro stanovení aktivity IFNG a koncentrace. Použitím zde popsaného primárního testu se získala aktivita l,4xl0⁷ AU/ml.

Příklad 4: Místně řízená mutageneze

Vytvoření glykosylačních variant

Aby se zavedly mutace do IFNG, navrhly se oligonukleotidy takovým způsobem, že změny vytvořené v PCR by se mohly zavést do expersívního plazmidu (pIGY-22) klasickou PCR ve dvou krocích.

Dva primery vektoru se použily dohromady se specifickými mutačními primery:

ADJ013: 5'-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3' (vektorový pozitivní primer, po směru exprese) (SEQ ID NO: 43) a ADJ014: 5'TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3' (SEQ ID NO: 44) (vektorový negativní primer, proti směru exprese).

Varianta S99T se vytvořila klasickou PCR ve dvou krocích za použití ADJ013 a ADJ014 jako vektorových primerů a ADJ093 (5'-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3' ) (SEQ ID NO: 45) a ADJ094 (5'-AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3') (SEQ ID NO: 46) jako mutační primery a pIGY-22 jako templát. Produkt PCR o velikosti 447 bp se subklonoval do pcDNA3.1/Hygro (InVitrogen) za použití restrikčních enzymů BamHI a Xbal za vzniku pIGY-48.

pIGY-48 se transfekoval do buněk CHO K1 za použití přípravku Lipofectim2000 (Life Technologies) jako transfekční činidlo. 0 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita IFNG. Za použití zde popsaného primárního testu se získala následující aktivita 5,lxl0⁶ AU/ml.

Varianta E38N+S40T+S99T se vytvořila klasickou metodou PCR ve dvou krocích za použití ADJ013 a ADJ014 jako vektorových primerů, ADJ091 (5'-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3 ' ) (SEQ ID NO: 47) a AD JO 92 (5 '-AATTGGAAGAACGAGACCGATCGGAAGATCATG-3 ' ) (SEQ ID NO: 48) jako mutačních primerů a pIGY-48 jako templátu. Produkt PCR o velikosti 447 bp se subklonoval do pcDNA3.1/Hygro (InVitrogen) za použití BamHI a Xbal za vzniku pIGY-54.

pIGY-54 se transfekovalo do buněk CHO K1 za použití přípravku Lipofectaim2000 (Life Technologies) jako transfekčního činidla. 0 24 hodin později se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita IFNG. Za použití popsaného primárního testu se získala aktivita l,3x!0⁷ AU/ml.

9999 • 9 · 9 · · ···· 9» * 9 9 9 9 ··· · · · 9 9 y y ···<«·····

9 9 · 9 9 9 9 9 • •9 99 999 9999 9· 99

Použitím podobných zde popsaných standardních postupů se připravila řasa glyskosylačních variant IFNG plné délky. Tyto varianty jsou uvedeny v tabulce č. 1 dále v textu.

Vytvoření variant IFNG zkrácených na C-konci

Varianty IFNG zkrácené na C-konci obsahující stop kodon bezprostředně vedle kodonu pro Leul35 po směru exprese genu se vytvořily pomocí PCR v jednom kroku za použití pIGY-22, pIGY48 a pIGy-54 jako templátu. Pak následuje subklonování produktů PCR do pcDNA3.1/Hygro (InVitrogen) za použití restrikčních enzymů BamHI a Xbal. Primery používané ke konstrukci těchto variant jsou ADJ09 (uvedený shora v textu, proti směru exprese genu) a 5 '-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT3' (SEQ ID NO:49) (po směru exprese genu). Výsledné plazmidy se označily jako pIGY-72 (IFNG divokého typu zkrácený po Leul35), pIGY-73 (varianta S99T zkrácená po Leul35) a pIGY-74 (E38N+S40T+S99T zkrácený po Leul35).

Vytvoření variant IFNG obsahující cystein

Varianty IFNG obsahující cysteinové zbytky se vytvořily za použití sady pro místně řízenou mutagenezi QuickChange^ítm)XL od firmy Stratagene, podle specifikace výrobce. Za použití pIGY48 jako templátu se vytvořilo sedm variant IFNG, kdy každá obsahuje zavedený cystein: N10C+S99T, N16C+S99T, E38C+S99T,

N59C+S99T, N83C+S99T, K94C+S99T a S99T+N104C. Podobně za použití pIGY-54 jako templátu se vytvořilo šest variant IFNG, kdy každá obsahuje jeden zavedený cysteinový zbytek:

N10C+E38N+S40T+S99T, N16C+E38N+S40T+S99T, E38N+S40T+ N59C+S99T, E38N+S40T+ N83C+S99T, E38N+S40T+ K94C+S99T z E38N+S40T+S99T+N104C. Příklad 5: Úprava variant obsahujících cystein pomocí PEG.

Všechny pufry se před použitím deoxidovaly. Koncentrace proteinů se odhadla měřením absorbance při vlnové délce 280 nm.

100 • · « «· ······

Úprava pomocí PEG za použití OPSS spojování

Směs o objemu 7,2 ml obsahující 1,3 mg/ml varianty IFNG N16C+S99T (plné délky) v pufru obsahujícím 5 mM sukcinát sodný, 4% manitol, 0,01 % Tween 20, pH 6,0 se redukovala inkubací s 300 μΐ 0,5 M DTT po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Z varianty IFNG se odstranily sole tak, že 3 alikvoty o objemu 2,5 ml prošly gelovou filtrační kolonou NAP25 (Pharmacia) v pufru A (který obsahuje 50 mM fosforečnan sodný, 1 mM EDTA, pH8,l). Každý alikvót se eluoval v 3,5 ml.

mPEG-OPSS (molekulová hmotnost 10 000) se rozpustil v pufru A na konečnou koncentraci 2 mg/ml a přidal se ve stejném objemu, aby se redukovala a odsolila varianta IFNG a vše se inkubovalo po dobu 60 minut za stálého míchání při teplotě místnosti.

U reakční směsi o objemu 11 ml se snížil objem na 1 až 6 ml za použití kolony Vivaspin20 (VivaScience) a zbývající mPEG se odstranil gelovou filtrací za použití kolony Sephacryl S100 (od firmy Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy za použití pufru A.

Varianta IFNG upravená PEG se diafiltrovala do pufru obsahujícího 5 mM sukcinát sodný, 4 % manitol pH .6,0 za použití kolony Vivaspin 6 (VivaScience) a přidal se Tween 20 do dosažení konečné koncentrace 0,01 %. Čištěná varianta IFNG upravená PEG měla specifickou variantu l,3xl0⁶ AU/mg, jak se zjistilo primárním testem (15 % specifické aktivity odpovídající variantě IFNG, která není upravená PEG).

Úprava pomocí PEG za použití MAL spojování

Objem 1,6 ml obsahující 1,5 mg/ml varianty IFNG N59C+S99T (plné délky) v pufru obsahujícím 5 mM sukcinát sodný, 4% manitol, 0,01 % Tween 20, pH 6,0 se redukovalo inkubací s 64 μΐ 0,5 M DTT po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Varianta ·· ··· ·

101 ·· · · a · · · · a · ·«· · ···· • · a · · a · · a · a a a a· a a a * ··· a· ··· aaaa ·· aa

IFNG se odsolila na gelové filtrační koloně NAP25 (Pharmacia) v pufru A (který obsahuje 50 mM fosforečnan sodný, 1 mM EDTA, pH8,l). Varianta IFNG se eluovala do objemu 3,5 ml.

mPEG-MAL (molekulová hmotnost 5 000) se rozpustil v pufru A na konečnou koncentraci 0,5 mg/ml a přidal se ve stejném objemu, aby se redukovala a odsolila varianta IFNG a vše se inkubovalo po dobu 120 minut za stálého míchání při teplotě místnosti.

Síran amonný se přidal v koncentraci 0,9 M a varianta IFNG upravená PEG se aplikovala na fenylovou kolonu Resource^(tm) o objemu 1 ml (od firmy Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy použitím pufru B (20 mM fosforečnan sodný, 0,9 M síran amonný pH 6,6). Kolona se promyla 5 objemy pufru B a pak se provedla eluce vázané varianty IFNG upravené PEG pomocí pufru C s lineárním gradientem s koncentrací 0 až 50 % (20 mM fosforečnan sodný, pH 6,6), kdy se použilo více než 30 objemů kolony. Varianta IFNG upravená PEG se eluovala přibližně 0,6 M síranem amonným.

Frakce obsahující variantu IFNG upravenou PEG se shromáždily a diafiltorvaly se do pufru obsahujícího 5 mM sukcinát sodný, 4 % manitol pH 6,0 za použití kolony Vivaspin 6 (VivaScience) a přidal se Tween 20 tak, aby konečná koncentrace byla 0,01 %. Čištěná varianta IFNG upravená PEG měla specifickou aktivitu 2,4xl0⁶ AU/mg, jak se stanovilo zde popsaným primárním testem (15 % specifické aktivity odpovídající variantě IFNG upravené PEG).

Příklad 6: Exprese IFNG a variant IFNG v savčích buňkách

Za účelem dočasné exprese IFNG se buňky nechaly růst do dosažení 95 % konfluentnosti v kultivačním médiu (Dulbeccovo MEM/Nut.-mix F-12 (Ham) L-glutamin, 15 mM Hepes, pyridoxin-HCl (od firmy Life Technologies Kat. č. 31330-038) obsahující

102 • · fetální bovinní sérum v poměru 1:10 (BioWhittaker, kat. č. 02701F) a penicilín a streptomycin v poměru 1:100 (BioWhittaker, Kat. č. 17-602E). Plazmidy kódující IFNG se transfekovaly do buněk za použití přípravku Lipofectamine2000 (LifeTechnologies) podle specifikací výrobce. 24 hodin po transfekci se shromáždilo kultivační médium a testovala se aktivita IFNG. Dále, za účelem stanovit relativní počet využívaných glykosylačních míst se provedl westernův přenos za použití shromážděného kultivačního média.

Transfekci buněk CHO K1 plazmidy kódujícími IFNG se vytvořily stabilní klony a následovala inkubace buněk v kultivačním médiu, který obsahuje 0,36 mg/ml hygromycinu. Izolovaly se stabilně transfekované buňky a subklonovaly limitovaným ředěním. Klony produkující vysoké množství IFNG se identifikovaly testem ELISA.

Příklad 7: Produkce ve velkém měřítku

Stabilní buněčné linie exprimující IFNG nebo varianty se nechaly růst v Dulbeccově kultivačním médiu Mem/Nut.-mixF12(Ham) L-glutamin, 15 mM Hepes, pyridoxin-HCl (od firmy Life Technologies, Kat. č. 31330-038), fetální bovinní sérum v poměru 1:10 (BioWhittaker, kat. č. 02-701F), penicilin a streptomycin v poměru 1:100 (BioWhittaker, kat. č. 17-602F) v roračních nádobách s plochou 1 700 cm² (od firmy Corning, ket. č. 431200) až do dosažení konfluentnosti. Kultivační médium se pak zaměnilo za 300 ml UltraCHO s L-glutaminem (BioWhittaker, kat. č. 12-724Q) a přidal se EX-CYTE VLE v poměru 1:500 (od firmy Serological Proteins lne., kat. č. 81-129) a streptomycin a penicilin v poměru 1:100 (BioWhittaker, kat. č. 17-602E). Po 48 hodinách růstu se kultivační médium nahradilo čerstvým UltraCHO se stejnými aditivy. Po dalších 48 hodinách růstu se kultivační médium nahradilo Dulbeccovým kultivačním médiem MEM/Nut.-mixF-12(Ham)

103

L-glutamin, pyrídoxín-HCl (od firmy Life Technologies, Kat. č. 21041-025), přidal se ITS-A v poměru 1:100 (Gibco/BRL, kat. č. 51300-044), 1:500 EX-CYTE VLE (Serological Proteins lne., kat. č. 81-129) a penicilín a streptomycin v poměru 1:100 (BioWhittaker, kat. č. 17-602F). Následně každých 24 hodin se shromáždilo kultivační médium a nahradilo se 300 ml čerstvého kultivačního média bez sera se stejnými doplňky. Shromážděné kultivační médium se filtrovalo přes filtr s póry o velikosti 0,22 pm, aby se odstranily buňky.

Příklad 8: Čištění

Filtrát se před ultrafiltrací filtroval přes mikrofiltr (velikost pórů 0,22 pm) na přibližně 1/15 objemu za použití systému Milipore TFF. Ve stejném systému se koncentrace upravila diafiltrací za použití 10 mM Tris pH 7,6. Síran amonný se přidal tak, aby konečná koncentrace byla 1,7 M a po promíchání se sraženina odstranila centrifugací při 8 000 ot./min. po dobu 25 minut v centrifuze Sorvall za použití rotoru GS3.

Supernatant se aplikoval na fenylovou vysoko výkonnou kolonu (od firmy Pharmacia) o objemu 25 ml, která se předem uvedla do rovnovážného stavu pufrem obsahujícím 10 mM Tris,

1,7 mM síran amonný pH 7,6 a vázaná varianta IFNG se pak eluovala v lineárním gradientu přes 10 objemů kolony do 100 % 10 mM Tris s hodnotou pH 7,6. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce. Shromáždily se frakce obsahující dostatečné množství varianty IFNG a pufr se vyměnil diafiltrací do 10 mM Tris pH 9,0 za použití systému Vivaflow200 (od firmy VivaScience) , přičemž se oddělí molekuly s molekulovou hmotností 10 000.

Varianta IFNG se pak aplikovala na kolonu Fast Flow (od firmy Pharmacia) obsahující Q-sefarózu o objemu 18 ml, která se uvedla do rovnováhy 10 mM Tris pH 9,0. Po aplikaci se

4444

104 • 99 9 9 4 4 4 4 »99 49 999 4999 «9 99 kolona promyla 3 objemy kolony s 10 mM Tris pH 9,0 a pak se provedla eluce vázaného IFNG gradientem 0 až 100 % 10 mM Tris, 0,5 M NaCl pH 9,0 přes 15 objemů kolony. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce. Shromáždily se frakce obsahující dostatečné množství varianty IFNG a pufr se vyměnil diafiltrací do 10 mM Tris pH 9,0 za použití systému Vivaflow200 (od firmy VivaScience), přičemž se oddělí molekuly s molekulovou hmotností 10 000.

Pak se varianta IFNG aplikovala na CHT keramickou hydroxyapatitovou kolonu (od firmy Biorad), která se dříve uvedla do rovnováhy 10 mM fosofrečnanem sodným, pH 7,0. Po aplikaci se kolona promyla 5 objemy kolony 10 mM fosforečnanu sodného, pH 7,0, a provedla se eluce vázané varianty IFNG gradientem 0 až 60 % 50 mM fosforečnanu sodného pH7,0, přes 30 objemů kolony. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce. Shromáždily se frakce obsahující dostatečné množství varianty IFNG a pufr se vyměnil diafiltrací za pufr obsahující 5 mM sukcinát sodný, 4 % manitol, pH6,0 za použití systému VivaSpin20 (od firmy VivaScience) a následně se přidal Tween 20, aby konečná koncentrace byla 0,01 %. Varianta IFNG se sterilně filtrovala a uchovávala se při teplotě -80 °C.

V jiném případě se varianty IFNG mohou čistit podle následujícího schématu čištění.

Filtrát se před ultrafiltrací filtroval přes mikrofiltr (velikost pórů 0,22 pm) na přibližně 1/15 objemu za použití systému Milipore TFF. Ve stejném systému se koncentrace upravila diafiltrací za použití 10 mM Tris pH 7,6. Pak se pH upravilo na hodnotu .9,0 a sraženina se odstranila mikrofiltrací.

Vzorek se pak aplikoval na kolonu Fast Flow (od firmy Pharmacia) obsahující Q-sefarózu, která se uvedla do rovnováhy »4 4444

105

mM Trís pH 9,0. Po aplikaci se kolona promyla 3 objemy kolony s 10 mM Tris pH 9,0 a pak se provedla eluce vázané varianty IFNG gradientem 0 až 100 % 10 mM Tris, 0,5 M NaCl pH 9,0 přes 15 objemů kolony. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce. Shromáždily se frakce obsahující dostatečné množství varianty IFNG a hodnota pH se upravila na 7,6. Přidal se síran amonný tak, aby konečná koncentrace byla 1,5 M a po zamíchání se sraženina odstranila centrifugací.

Varianta IFNG se aplikovala na vysoko výkonnou kolonu (od firmy Pharmacia) obsahující fenylsefarózu. Kolona se předem uvedla do rovnovážného stavu pufrem obsahujícím 10 mM Tris,

1,5 mM síran amonný pH 7,6. Po aplikaci se kolona promyla 3 objemy kolony pufru obsahujícího 10 mM Tris, 1,5 M síran amonný pH7,6 a vázaná varianta IFNG se pak eluovala lineárním gradientem přes 10 objemů kolony se 100 % 10 mM Tris pH7,6. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce. Shromáždily se frakce obsahující dostatečné množství varianty IFNG a koncentrace síranu amonného se upravila na hodnotu 1,7 M.

Varianta IFNG se pak aplikovala na kolonu obsahující butylsefarózu, která se dříve uvedla do rovnováhy pufrem, který obsahuje 10 mM fosforečnan sodný, 1,7 mM síran amonný, pH7,6. Po aplikaci se kolona promyla 10 mM fosforečnanem sodným, 1,7 mM síranem amonným pH7,6, pak se z kolony eluovala vázaná varianta IFNG za použití 10 mM fosforečnanu sodného pH 6,5. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělil na frakce.

Shromáždily se pak frakce obsahující podstatné množství varianty IFNG a nanesly se na hydroxyapatitovou kolonu, která se dříve uvedla do rovnováhy 10 mM fosforečnanem sodným pH6,5. Po aplikaci se kolona promyla 5 objemy kolony 10 mM

4444

444 4 44 ·· 44 44 44 4

-1 p r 444 4 4444 lUO 4444 4 4444 4

444 44 44 4 4

444 44 444 4444 44 44 fosforečnanu sodného pH 6,5. Pak se vázaná varianta IFNG eluovala lineárním gradientem 0 až 100 % 50 mM fosforečnanem sodným pH6,5 přes 30 objemů kolony. Průtok stejně jako eluovaná varianta IFNG se rozdělily na frakce.

Shromáždily se frakce obsahující variantu IFNG a pufr se vyměnil za pufr obsahující 5 mM sukcinát sodný, 4 % manitol pH 6,9. Následně se přidal Tween 20 tak, aby koncentrace byla 0,01 %. Varianta IFNG se sterilně filtrovala a uchovávala se při teplotě -80 °C.

Příklad 9: Aktivita variant a varianty upravené pomocí PEG

Použitím primárního testu popsaného shora v textu se získaly následující data (po dočasné transfekci):

Tabulka č. 1: Aktivita variant polypeptidů rhuIFNG celé délky a zkrácené délky po dočasné transfekci.

mutace	aktivita (AU/ml)	% aktivity divok. typu plné délky
divoký typ (celá délka)	l,4xl07	-
S99T (celá délka)	5,IxlO6	36 %
E38N (celá délka)	l,4xl07	100 %
E38N+S40T (celá délka)	9,9xl06	71 %
E38N+S40T+S99T (celá délka)	l,3xl07	93 %
E38N+K61T (celá délka)	l,2xl07	86 %
E38N+K61T+S99T (celá délka)	1,4xl06	10 %
N10C+S99T (celá délka)	2,5xl06	18 %

·· φφφφ

107 •· φ φ φ φ · φ · · φ φφφ φ φφφφ • φ · · φ φφφφ · φφφ φφ φφφφ φφφ «φ φφφ φφφφ φφ φφ

N16C+S99T (celá délka)	Ι,ΙχΙΟ7	79 %
E38C+S99T (celá délka)	1,OxlO7	71 %
S99T+N104C (celá délka)	5,OxlO6	36 %
N10C+E38N+S40T+S99T (celá délka)	l,5xl06	11 %
N16C+E38N+S40T+S99T (celá délka)	3,7xl06	26 %
E38N+S40T+N59C+S99T (celá délka)	Ι,ΙχΙΟ7	79 %
E38N+S40T+N83C+S99T (celá délka)	7,2xl05	5 %
E38N+S40T+K94C+S99T (celá délka)	9,4xl05	7 %
E38N+S40T+S99T+N104C (celá délka)	2,3xl05	16 %
divoký typ (zkrácený)	6,3xl06	45 %
S99T (zkrácený)	3,5xl06	25 %
E38N+S40T+S99T (zkrácený)	4,OxlO6	29 %

Použitím primárního testu popsaného shora v textu se získaly následující data (po dočasné transfekci):

Tabulka č. 2: Aktivita variant polypeptidů rhuIFNG celé délky po čištění.

mutace	aktivita (AU/ml)	% aktivity divok. typu plné délky
divoký typ (celá délka)	2,lxl07	-
S99T (celá délka)	2,2xl06	105 %
E38N+S40T+S99T (celá délka)	l,4xl07	67 %

108 • · ··« ·· ··· ···· ·· 99

N10C+S99T (celá délka)	3,8x10®	18 %
N16C+S99T (celá délka)	2,3x10®	11 %
N16C+S99T (celá délka+mPEG o mol. hm. 10 000)	1,3x10®	6 %
E38C+S99T (celá délka)	3,4x10®	16 %
N59C+S99T (celá délka)	6,3x10®	30 %
N59C+S99T (celá délka+mPEG s mol.hm. 5 000)	2,4x10®	11 %
S99T+N104C (celá délka)	3,5x10®	71 %

Aktivita řady variant upravených PEG se měřila porovnáním aktivity produktů upravených PEG vzorky, které se vystavily stejnému postupu úpravy pomocí PEG (popisuje se například v příkladu 5 shora v textu), ale bez současného přidání PEG do reakčního média. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3 dále v textu.

Tabulka č. 3: Aktivita variant polypeptidů rhuIFNG celé délky upravených PEG

Mutace	aktivita vztažená k produktu upravenému PEG vystavenému
postupu úpravy	pomocí PEG (%)
N10C+S99T (celá délka+mPEG		23
s mol.hm. 5 000)
N16C+S99T (celá délka+mPEG		59
s mol.hm. 5 000)
E38C+S99T1’ (celá délka+mPEG		41
s mol.hm. 5 000)

· · · 9 ·

109

	999 ··	999 9999	99 9
S99T+N104C (celá délka+mPEG	42
s mol.hm. 5 000)

“'použitá metoda spojení je ODSS spojení. Metoda Mal spojení se použila v případě všech jiné varianty upravené pomocí PEG.

Mělo by se zdůraznit, že aktivita zobrazená v tabulce č. 1 odráží kombinace specifické aktivity a síly exprese v buňkách CHO-Kl. Všechny varianty vykazují porovnatelnou sílu exprese/specifickou aktivitou vztaženou k rhuIFNG.

Jak je možné vidět v tabulce č. 2 všechny varianty obsahující cystein vykazují sníženou specifickou aktivitu ve srovnání s rhuIFNG, zatímco varianty obsahující mutace E38N, S40T a/nebo S99T si uchovávají specifickou aktivitu porovnatelnou s rhuIFNG. Když varianty cysteinu se upravily pomocí PEG s molekulovou hmotností 5 000 nebo 10 000, pozoroval se 2 až 3 násobný pokles specifické aktivity (zobrazeno v tabulce č. 3) . Spekuluje se, že snížení specifické aktivity je způsobeno snížením navázání receptorů způsobené prostorovou zábranou konjugované skupiny PEG.

Příklad 10: Odhad využití N-glykosylačních míst

Za účelem stanovit relativní počet využívaných glykosylačních míst se provedl westernův přenos za použití shromážděného buněčného kultivačního média (popisuje se na Obr. 1). V případě rhuIFNG divokého typu (celé délky) se odhadlo, že přibližně 50 % využívá obou glykosylačních míst (2N) , přibližně 40 % využívá jedno glykosylační místo (IN) a přibližně . 10 % není glykosylováno (ON) . Tyto data jsou v souladu s dříve publikovanými daty v publikaci Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295 a Sarenva et al., 1995, Biocehm J., 308, 9-14.

φφ ····

110

• φ · · · • φ φ φ φφφφ φ φ φφφφ «**· Φ· φφ

Jak je možné vidět z Obr. 1, varianta S99T (v celé délce) využívá dvě glykosylační místa účinněji než odpovídající divoký typ. V případě varianty S99T se odhadlo, že přibližně 90 % využívá obou glykosylačních míst (2N), přibližně 7 % využívá jedno glykosylační místo (IN) a přibližně 3 % nejsou glykosylována (ON).

Z Obr. 1 je zřejmé, že zavedené glykosylační místo v poloze 38 je podstatně lépe využívané v případě varianty E38N+S40T (v plné délce) ve srovnání s neoptimalizovanou variantou E38N (v plné délce).

Tyto data jasně demonstrují lepší využití glykosylačních míst nezávisle na skutečnosti, zda se tato místa vyskytují přirozeně nebo jsou zavedená, může se jich dosáhnout zavedením threoninového zbytku spíše než serinového zbytku v poloze +2 vzhledem k asparaginovému zbytku.

Příklad 11: Farmakokinetické studie

Zde popsaným postupem se v případě řady variant IFNG stanovila hodnota AUC pro subkutánní aplikaci (AUC_sc) . Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 4 a na Obr. 2 a 3.

Tabulka č. 4: Farmakokinetická data pro subkutánní aplikaci u krys

varianta	AUCsc/dávka (minxg)/ml	AUCsc, varianta	AUCsc, varianta AUCsc, dt, celá délka	Tmax, sc (min)
AUCsc, Actimmune®
Actimmune®	0,3 až 0,4		0,013 až 0,0027	43
rhuIFNG(celá délka)	15 až 24	37 až 80		362 až 446
E38N+S40T+S9 9T1’	111 až 119	277 až 640	4,6 až 13	308 až 374
N16C+S99T21	37	92 až 123	1,5 až 2,5	247

• ·· · ·· ·· » 111 ··· · ··· • · · · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 999 99 999 9999 99
N16C+S99T3)	114	285 až 380	4,8 až 7,6	249
1)celá délka 2>celá délka, mPEG o molekulové hmotnosti 5 000 zachycený na

zavedeném cysteinovém zbytku ³⁾celá délka, mPEG o molekulové hmotností 10 000 zachycený na -zavedeném cysteinovém zbytku

Z Obr. 2 a 3 a z tabulky 4 je jasné, že varianty (zahrnující varianty upravené PEG) mají podstatně výší AUC, když se aplikují subkutánně, ve srovnání s rhuIFNG a zvláště, když se porovnávají s běžně dostupným přípravkem Actimmune®. S odvoláním na Obr. 3 je nutné poznamenat, že aplikovaná dávka dvou variant upravených pomocí PEG se 2,5x snižuje ve srovnání s aplikovanou dávkou varianty E38N+S40T+S99T.

Tato skutečnost otevírá možnost aplikovat nižší dávky, což způsobuje menší vedlejší účinky, a/nebo snížení frekvence aplikace, což umožňuje zlepšit kompliance pacienta.

112 • 4 · · 4 4 44 44 4· ·· 4 4 44 4 4 4 4 4

4·· 4 4444

444 44 4444

444 44 444 4444 44 44

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 143 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(X

i)

Popis sekvence:

: SEQ ID

NO:

1:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hi S

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

HÍ S

Gl u

100

105

110

Leu

Ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

Gin

130

135

140

113

4 4 44 444444 ·« 4444 44 4

4 · 4 4 4 4

44» 4 4444 4

4 4 4444

444 44 444 4444 44 44 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 142 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(xi

)

Popi

.S S6

íkver

ice:

SEQ

ID F

[O: 2

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

ΗΊ S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

130

135

140

114 • · · · · 9 · 9 · ··· 99 9·· 9900 «« ·· (2) Informace ο SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 141 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Gin 1

Asp

pro

Tyr

val 5

Lys

Glu

Ala

Glu

i Asn 10

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hl s

ser

ASp

val

Ala

Asp

Asn

i Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn 35

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser 40

Asp

' Arg

Lys

ile

Met 45

Gin

Ser

Gin

ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

: Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hl s

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Al a

130

135

140

115

• 44	• ··	44		4444
• · ·	44 · 4	4	4	•
• · ·	• 4	4	4	4
4 4 4 44 44	• 4 • 44 4444	4 44	4	4 4 44

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 140 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(xi)

Pop

is s

ekve:

nce:

SEQ

ID

NO:

4:

Gin

Asp

pro

Tyr

val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl S

ser

ASp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

ASP

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

HIS

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

phe

Arg

Gly

Arg

Arg

130

135

140

116 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 139 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácená na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Gin Asp 1

Pro Tyr val 5

Lys Glu

Al a

Glu

Asn 10

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Ala

Gly

HIS

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

ASp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Al a

Ile

HÍ S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

ser

Gin

Met

Leu

phe

Arg

Gly

Arg

130

135

			• · · · ·· 999999 • · · · 9··· 117 .... . ..... -1- ' «99 99 9999 999 99 999 9999 99 99
Informace o SEQ ID NO: (i) CHARAKTERISTIKA (A) DÉLKA: 138	6: SEKVENCE: aminokyselinových zbytků

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácená na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(xi)

P

opis

sek

venc

e: S

EQ I

D NO

: 6:

Gin

Asp

pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gl n

35

40

45

ile

Val 50

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys 55

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe 60

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser 65

Ile

Gin

Lys

Ser

val 70

Glu

Thr

ile

Lys

Glu 75

Asp

Met

Asn

val

Lys 80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

ASp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

His

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin 115

val

Met

Ala

Glu

Leu 120

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys 125

Thr

Gly

Lys

Arg Lys Arg ser Gin Met Leu Phe Arg Gly

130 135

118 • · • · • · · · · • · (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 137 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácená na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

:i)

Popis

sekvence:

: SEQ ID

NO:

7:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hi S

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

phe

Tyr

phe

Lys

Leu

phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

Val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

pro

Al a

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg

130 135

119 • · • · (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 136 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(:

xi)

Po

pis

sekv

ence

: SE

Q ID

NO:

8:

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

ΗΊ S

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

ASp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe

130 135

120 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 135 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Gin Asp 1

pro Tyr val 5

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn 10

Leu Lys Lys Tyr

Phe 15

Asn

Ala

Gly

ΗΊ S

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

HIS

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg ser Gin Met Leu

130 135

121 • · · · · · ······ • · · · · · · · ·· · (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 134 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hi s

Ser

ASp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gl n

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

ser

Val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

His

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

ser

Gin

Met

130

122

(2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 133 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence

(xi)

E

‘opis

sek

:venc

:e: S

EQ I

D NC

>: 11

•

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl s

ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

ASp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

His

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

130

123

(2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 132 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Gin 1

Asp Pro

Tyr

val 5

Lys

Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe

Asn

10

15

Ala

Gly

Hl s

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

ser

ASP

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

ASp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hl s

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser 130

124 • · · · · · ··*··· • · · · · ♦ · · · · t ··· ·· · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B)	DÉLKA: 131 aminokyselinových zbytků TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Gin 1

Asp

Pro Tyr

val 5

Lys Glu Ala

Glu Asn Leu 10

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg 130

125 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B)	DÉLKA: 130 aminokyselinových zbytků TYP: aminokyselinová DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE:
	(C) (D)
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený	na C-konci
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umělá	sekvence

xi)

Pc

>pis

sekv

'ence

: SE

Ό id

NO:

14:

Gin

Asp

pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

HIS

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

phe

Asn

ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

ASp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys 130

126 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 129 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

	(xi)	Popis sekvence:	SEQ
Gin 1	Asp	Pro	Tyr	val 5	Lys	Glu	Ala
Ala	Gly	Hi s	Ser 20	Asp	val	Ala	Asp
Leu	Lys	Asn 35	Trp	Lys	Glu	Glu	ser 40
ile	val 50	Ser	phe	Tyr	phe	Lys 55	Leu
Ser 65	ile	Gin	Lys	Ser	val 70	Glu	Thr
Phe	phe	Asn	Ser	Asn 85	Lys	Lys	Lys
Asn	Tyr	Thr	val 100	Thr	ASp	Leu	Asn
Leu	ile	Gin 115	val	Met	Ala	Glu	Leu 120

Arg

ID NO: 15:

Glu	Asn	Leu	Lys	Lys	Tyr	phe	Asn
	10				15
Asn	Gly	Thr	Leu	phe	Leu	Gly	ile
25				30
ASp	Arg	Lys	ile	Met 45	Gin	Ser	Gin
Phe	Lys	Asn	phe	Lys	Asp	Asp	Gin
		60
Ile	Lys	Glu	Asp	Met	Asn	val	Lys
	75				80
Arg	ASp	Asp	phe	GlU	Lys	Leu	Thr
90					95
val	Gin	Arg	Lys	Ala	ile	Hi s	Glu
105			110
Ser	pro	Al a	Ala	Lys	Thr	Gly	Lys

125 • 4 · · · ·

127 • 4 4 4 ·« · · · · · • · · · · · · · • 4 4 · · 44·· 4 *44 44 4444 ··· 44 444 ···· 44 44 (2) Informace ο SEQ ID NO: 16:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 128 aminokyselinových zbytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(íí;	i DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klič: [S99T]huIFNG zkrácený na C-konci
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(x

i)

Pop

lis s

iekve

;nce:

SEQ

ID

NO:

16:

Gin

Asp

pro

Tyr

val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Ala

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Thr

val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

His

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

4444

128

4 4 4 4 4 4 4 4 • 44 44 ··· 4444 44 44 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 143 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Gin 1

Asp

Pro Tyr val 5

Lys Glu

Ala Glu Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hl S

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Al a

Ser

Gl n

130

135

140

129 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 166 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi)

Popis sekvence:

SEQ

ID

NO:

18:

Met

Lys

Tyr

Thr

ser

Tyr

ile

Leu

Al a

Phe

Gin

Leu

cys

ile

val

Leu

1

5

10

15

Gly

Ser

Leu

Gly

cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

20

25

30

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

ser

Asp

50

55

60

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

ser

Gin

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

65

70

75

80

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

85

90

95

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

phe

phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

100

105

110

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

ASp

Leu

Asn

val

115

120

125

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

His

Glu

Leu

ile

Gin

val

Met

Al a

Glu.

Leu

ser

130

135

140

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Gly Arg Arg Ala Ser Gin 165

130

• ·*	v ··		··	···*
• « ·	·· · ·		•	•
• · ·	• ·	•	•	Φ
• · · ··	• · ··· ··»·	•	• ··	• Φ **

(2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 142 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Gin 1

Asp

Pro Tyr val 5

Lys Glu

Ala Glu Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

phe 15

Asn

Ala

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

τ rp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

ASp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

130

135

140

131 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 141 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi)

Po

pis

sekv

ence

: SE

Q ID

NO:

20:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl s

Ser

ASp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

His

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

val

Met

Al a

Glu

Leu

ser

pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Al a

130

135

140

132 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 140 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

Gin 1 Ala

Asp Gly

Pro His

Tyr val 5

Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys 10

Lys Tyr

Phe 15 Gly

Asn Ile

phe

Leu 30

Ser 20

Asp

Val

Ala

Asp

Asn 25

Gly Thr Leu

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gl n

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg

130 135 140

133

(2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 139 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Gin 1

Asp

Pro Tyr val 5

Lys Glu Ala Glu

Asn 10

Leu

Lys

Lys Tyr Phe 15

Asn

Ala

Gly

Hi S

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

ASp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

ASp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

HÍS

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gl n

val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg

130 135

134

·· 4 ···

4 4 ·4 (2) Informace ο SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 138 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

Gin 1

Asp Pro

Tyr

val 5

Lys

Gl u Al a Gl u

Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

tri s

Ser

ASp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hi s

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg ser Gin Met Leu Phe Arg Gly

130 135

135 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 137 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umšlá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Gin Asp Pro Tyr val

Lys

Gl U

Al a Glu

Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

phe 15

Asn

1

5

Al a

Gly

His

ser

ASp

Val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

Phe

phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

Hi s

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg

130 135 • · · ·

136 • · · · · · · ·· ···· · · • · · · · · · ··· · · · · · · • · ·· · · · · ·· ······· · · · · (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 136 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Gin 1

Asp Pro

Tyr

val 5

Lys Glu Ala Glu

Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe

130 135

137

(2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 135 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi)

Po

pis

sekv

•ence

: SE

Q ID

NO:

26:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl s

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gl n

Arg

Lys

Ala

Ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

130

135

• · · ·

(2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 134 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi)

P

opis

sek

venc

e: S

EQ I

D NO

: 27

•

Gin

Asp

pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl s

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a-

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

130

4444

139 · 4 4 · · · 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 44 4444444

Informace o	SEQ ID NO: 28:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 133 aminokyselinových z	bytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	; MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: huIFNG zkrácený na	C-konci
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

Gin 1

Asp Pro

Tyr

val 5

Lys Glu Ala Glu

Asn Leu Lys 10

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hl s

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

lle

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

lle

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

lle

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

lle

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

lle

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

lle

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

lle

Gin

Val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser Gin

130 • · ·· · φ

140

(2) Informace ο SEQ ID NO: 29:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 132 aminokyselinových zbytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

Gin 1

Asp

Pro Tyr

val 5

Lys Glu Ala

Glu Asn Leu 10

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hl s

Ser

Asp

val

Al a

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

T rp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

ser

Gin

35

40

45

ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gl n

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

Phe

phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hl S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys Arg Ser

130

141

(2) Informace o SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 131 aminokyselinových zbytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(li)	DRUH MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klič: huIFNG zkrácený na C-konci
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

Hl S

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

L.eu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

ser

Gin

35

40

45

Ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg

Lys

Arg

130

···· (2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 130 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

Gin 1

Asp

Pro Tyr val 5

Lys Glu Ala Glu

Asn 10

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

HÍS

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Al a

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg Lys

130 ·· ♦··*

143 (2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 129 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-koncí (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

(xi)

P

opis

sek

venc

e: S

EQ I

D NO

: 32

Gin

Asp

Pro

Tyr

val

Lys

Glu

Al a

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

phe

Asn

1

5

10

15

Al a

Gly

HIS

ser

ASp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

ASp

Met

Asn

val

Lys

65

70

75

80

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

HIS

Glu

100

105

110

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Al a

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

Arg • ·» · ·· »· ···· ···· ···· 4 9 9

9 9 9 4 9 9 9

144

9 9 9 9 9 9 4 4

499 99 999 9499 94 49 (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 128 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: huIFNG zkrácený na C-konci (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:

Gin 1

Asp

Pro Tyr

val 5

Lys Glu Ala

Glu Asn Leu 10

Lys

Lys

Tyr

Phe 15

Asn

Al a

Gly

Hi s

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

ile

20

25

30

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

35

40

45

ile

val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

50

55

60

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

65

70

75

80

phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Tyr

Ser

val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Ala

ile

Hi S

Glu

100

105

110

Leu

ile

Gin

val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Al a

Lys

Thr

Gly

Lys

115

120

125

145 • β·

0 9 • · · • · 0 ·

0 0 • •0 09 ··

0 · • 9

0 • · 990 99*« • 9 9999

9 9 >99 • 99 9 • 9 9 9

99 (2) Informace ο SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 140 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: Actimmune® (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

Met 1

Gin

Asp

Pro

Tyr val 5

Lys

Gl u Al a Gl u 10

Asn Leu Lys

Lys

Tyr 15

Phe

Asn

Al a

Gly

Hl S

Ser

Asp

val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

20

25

30

ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

ile

Met

Gin

ser

35

40

45

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

50

55

60

Gin

Ser

ile

Gin

Lys

Ser

val

Glu

Thr

ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

65

70

75

80

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

85

90

95

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

val

Gin

Arg

Lys

Al a

ile

Hl s

100

105

110

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

115

120

125

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

130

135

140

146 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:

HÍS HÍS HÍS HÍS HIS HÍS 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:

Met Lys His His His His His His 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

. (A) DÉLKA: 10 aminokyselinových zbytků

	147 : : :. 4 4 4	4 4 4 4 4 4 4 4 4
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY
	(A)	Název/klíč: značka
	(D)	Jiné informace: /poznámka=	umělá sekvence
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:
	Met	Lys His His Ala His His Gin	His His
	1	5	10

147 (2) Informace o SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:

Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin 1 5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein

4444

148

4 4 4 4 4 4 •44 4 4444 4 • 4 4 44 4444 •44 44 444 4444 44 44 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 39:

Glu Gin Lys Leu ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 (1) Informace o SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: značka (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence

149

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 41:

Tyr pro Tyr Asp val Pro Asp Tyr Ala 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 42:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 498 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: Expresívní kazeta optimalizovaná
	pro	expresi interferonu gamma v buňkách CHO
	(D)	Jiné informace: /poznámka=umšlá sekvence
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:

atgaagtaca caagctatat cctggccttt cagctgtgca tcgtgctggg ctccctgggc 60 tgctattgcc aggaccctta cgtgaaggag gccgagaacc tgaagaagta ctttaacgcc 120 ggccacagcg atgtggccga caatggcaca ctgtttctgg gcatcctgaa gaattggaag 180 gaggagagcg atcggaagat catgcagtcc cagatcgtgt ccttctattt caagctgttt 240 aagaatttca aggacgatca gtccatccag aagtccgtgg agaccatcaa ggaggacatg 300 aacgtgaagt ttttcaatag caataagaag aagagagacg atttcgagaa gctgaccaat 360 tactccgtga cagacctgaa cgtgcagaga aaggccatcc acgagctgat ccaggtgatg 420 gccgagctgt cccccgccgc caagaccggc aagagaaaga gaagccagat gctgttcaga 480 ggcagacggg ccagccag

498 (2) Informace o SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 19 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: primer

150 (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 43: gatggctggc aactagaag 19 (3) Informace o SEQ ID NO: 44:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 19 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
(II)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: primer (D) Jiné informace: /poznámka=umšlá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 44:

tgtacggtgg gaggtctat 19 (2) Informace o SEQ ID NO: 45:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 33 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: primer (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 45:

gttcaggtct gtcacgctgt aattggtcag ctt 33 (2) Informace o SEQ ID NO: 46:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 33 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

151 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: Primer (D) Jiné informace: /poznámka=umělá (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:

aagctgacca attacaccgt gacagacctg aac (2) Informace o SEQ ID NO: 47:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 33 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: primer (D) Jiné informace: /poznámka=umělá (xi( Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:

catgatcttc cgatcggtct cgttcttcca att (2) Informace o SEQ ID NO: 48:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 33 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: primer (D) Jiné informace: /poznámka=umělá (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:

aattggaaga acgagaccga tcggaagatc atg (2) Informace o SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží sekvence sekvence sekvence

152 • · * • « (B) TYP: nukleová kyselina (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: primer (D) Jiné informace: /poznámka=umělá sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 49:

gagtctagat tacagcatct ggcttctctt

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   153 • · 4 4 4 4

   4 4 4

   4 4 4

   4 4 4 4

   4 4 4 4

   ÁZ 5 1. Polypeptid interferonu gamma (IFNG) vykazující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1 nebo jeho fragment, kde uvedený polypeptid IFNG nebo jeho fragment vykazují aktivitu IFNG.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1, kde uvedený polypeptid je fragmentem aminokyselinové sekvence zobrazené v SEQ ID NO: 1, která je zkrácená na C-konci o 1 až 15 aminokyselinových zbytků.
4. 4. Polypeptid podle nároku 3, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ

   ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

   NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID

   NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID

   NO: 15 a SEQ ID NO: 16.
5. 5. Polypeptid podle libovolného z nároků 1 až 4, kde uvedený polypeptid je glykosylovaný.
6. 6. Varianta polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo její fragment, kde uvedený polypeptid obsahuje 1 až 10 úprav týkajících se sekvence SEQ ID NO: 1 nebo jejího fragmentu a vykazuje aktivitu IFNG.
7. 7. Polypeptid podle nároku 6, který obsahuje 1 až 10 úprav týkajících se fragmentu SEQ ID NO: 1, která je zkrácena na C-konci o 1 až 15 aminokyselinových zbytků.

   • ·

   154
8. 8. Polypeptid podle nároku 7, který obsahuje 1 až 10 úprav týkajících se aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID

   NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
9. 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:

   13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16.

   9. Polypeptid podle nároku 8, který obsahuje 1 až 10 úprav vzhledem k aminokyselinové sekvenci zobrazené v SEQ ID NO:

   12.
10. 10. Polypeptid podle libovolného z nároků 6 až 9, který obsahuje alespoň jeden zavedený a/nebo alespoň jeden odstraněný aminokyselinový zbytek obsahující zachytnou skupinu pro nepolypeptidovou část.

    11. Polypeptid podle nároku 10, k^- zavedené glykosylační místo. terý obsahuj e alespoň jedno 12.Polypeptid podle nároku 11, místem je N-glykosylační msto. kde uvedeným glykosylačním 13.Polypeptid podle nároku 12, kde uvedené N-glykosylační místo je zavedeno do polohy obsahuj ící aminokyselinový

    zbytek, který má alespoň 25 % svého postranního řetězce exponovaného na povrchu (jak se definuje v příkladu 1).
11. 14. Polypeptid podle nároku 13, kde uvedené N-glykosylační místo se zavedlo do polohy obsahující aminokyselinový zbytek, který má alespoň 50 % postranního řetězce exponovaného na povrchu (jak se definuje v příkladu 1).
12. 15. Polypeptid podle nároku 13 nebo 14, kde uvedené Nglykosylační místo je zavedeno substitucí.

    155

    4 4 4 44 4444

    444 44 444 4444 44 44
13. 16. Polypeptid podle nároku 15, kde uvedená substituce se vybrala ze skupiny zahrnující K12S, K12T, G18S, G18T, E38N,

    E38N+S40T, K61S, K61T, N85S, N85T, K94N, Q106S a Q106T.
14. 17. Polypeptid podle nároku 16, kde uvedená substituce se vybrala ze skupiny zahrnující K12T, G18T, E38N+S40T, K61T,

    N85T, K94N a Q106T.
15. 18. Polypeptid podle nároku 17, kde uvedená substituce je E38N+S40T.
16. 19. Polypeptid podle nároku 10, který obsahuje alespoň jeden zavedený cysteinový zbytek.
17. 20. Polypeptid podle nároku 19, kde uvedený cysteinový zbytek se zavedl do polohy obsahující aminokyselinový zbytek, který má alespoň 25 % svého postranního řetězce exponovaného na povrchu (jak se definuje v příkladu 1).
18. 21. Polypeptid podle nároku 20, kde uvedený cysteinový zbytek je zaveden do polohy obsahující aminokyselinový zbytek, který má alespoň 50 % svého postranního řetězce exponovaného na povrchu (jak se definuje v příkladu 1).
19. 22. Polypeptid podle nároku 20 nebo 21, kde uvedený cysteinový zbytek je zaveden substitucí.
20. 23. Polypeptid podle nároku 22, kde uvedená substituce se vybrala ze skupiny obsahující N10C, N16C, E38C, N59C, N83C, K94C, N104C a A124C.
21. 24. Polypeptid podle libovolného z nároků 19 až 23, kde uvedený cysteinový zbytek je kovalentně zachycen na nepolypeptidové části.
22. 25. Polypeptid podle nároku 24, kde uvedená nepolypeptidové část je polymerní molekula.

    •9 999«

    9 9 9 9

    156 :::

    9 99

    99 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 ·

    9 9 9 9 9 ·

    999 9999 99 99
23. 26. Polypeptid podle nároku 25, uvedená polymerní molekula je lineární nebo větvený polyetylenglykol.
24. 27. Polypeptid podle nároku 10, kde uvedený polypeptid obsahuje alespoň jedno zavedené N-glykosylační místo a alespoň jeden zavedený cysteinový zbytek.
25. 28. Polypeptid podle nároku 27, kde uvedené N-glykosylační místo se zavedlo do polohy podle libovolného z nároků 13 až 18 a cysteinový zbytek se zavedl do polohy podle libovolného z nároků 20 až 23.
26. 29. Nukleotidové sekvence polypeptidu podle libovolného z nároků 1 až 28.
27. 30. Expresívní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci, jak se definuje v nároku 29.
28. 31. Glykosylační hostitelská buňka obsahující nukleotidovou sekvenci, jak se definuje v nároku 29 nebo expresívní vektor podle nároku 30.
29. 32. Hostitelská buňka podle nároku 31, kterou je buňka CHO nebo BHK.
30. 33. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid podle libovolného z nároků 1 až 28 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo adjuvans.
31. 34. Polypeptid podle libovolného z nároků 1 až 28 nebo farmaceutický prostředek podle nároku 33 pro použití jako léčebný prostředek.
32. 35. Použití polypeptidu podle libovolného z nároků 1 až 28 nebo farmaceutický prostředek podle nároku 33 pro výrobu léčebného prostředku pro léčbu intersticiálního pulmonárního onemocnění.

    157

    ΦΦ φφ ···· φφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ
33. 36. Použití podle nároku 35, kde uvedené interstíciální pulmonární onemocnění je idiopatická pulmonární fibróza.
34. 37. Způsob léčby nebo prevence intersticiálního pulmonárního onemocnění, vyznačující se tím, že uvedená metoda obsahuje aplikaci savci, zvláště člověku, který to potřebuje, účinného množství polypeptidu podle libovolného z nároků 1 až 28 nebo prostředku podle nároku 33.
35. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, ž e uvedené intersticiální pulmonární onemconění je idiopatická pulmonární fibróza.
36. 39. Způsob přípravy polypeptidu IFNG podle libovolného z nároků 1 až 28, vyznačující se tím, že zahrnuje

    a) kultivaci glykosylační hostitelské buňky obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid IFNG podle libovolného z nároků 1 až 28 za podmínek podporujících expresi polyeptidu,

    b) reakce uvedeného polypeptidu s nepolypeptidovou částí in vitro za podmínek podporujících uskutečnění konjugace a

    c) získání polypeptidu.

    1/3