CZ2003324A3 - Vakcína proti infekci způsobené herpesvirem, rekombinantní virový genom, použití genomu a způsob omezení rizik vzniku a projevu choroby - Google Patents

Description

VAKCÍNA PROTI INFEKCI ZPŮSOBENÉ HERPESVIREM, REKOMBINANTNÍ VIROVÝ GENOM, POUŽITÍ GENOMU A ZPŮSOB OMEZENÍ RIZIK VZNIKU A / PROJEVU CHOROBY

Oblast technikv

Vynález se vztahuje k oblasti očkování proti tzv. herpesvirům vázaným na hostitelskou buňku, jako je virus Markovy choroby (MDV) u drůbeže a lidský virus varicella zoster (VZV, způsobující po reaktivaci z latence plané neštovice a pásový opar) a k očkování proti chorobě způsobené těmito viry a konkrétně se vztahuje k chorobám drůbeže konkrétně pak k oblasti očkování proti Markově chorobě.

Dosavadní stav technikv

Markova choroba byla problémem drůbežářského průmyslu již od počátku intenzivní výroby drůbežího masa. Jedná se o chorobu způsobenou herpesviry, která vyvolává řadu různých klinických projevů od imunosuprese, neurologických onemocnění, anémie a nespecifikovaných apatiií až po závažné lymfatické karcinomy v pozdnějších fázích infekce. Na počátku historie Markovy choroby neexistovala žádná léčba ani preventivní měření. Později byl z krocanů izolován nepatogenní příbuzný virus (HVT) (sérotyp 3) a byl jako první použit pro očkování.

Avšak po určité době od zavedení očkování pomocí HVT se Markova choroba objevila znovu a bylo zřejmé, že se cirkulující oblastní viry změnily a obelstily tak ochranu vyvolanou kmenem HVT. V této době byl objeven nový nepathogenní virus (kmen Rispens), který byl obecně stejného sérotypu jako viry způsobující chorobu. Tento očkovací kmen byl velmi rychle uveden na trh a vykazoval velmi dobré výsledky.

Avšak přibližně po 10 letech se znovu vyskytly nové epidemie choroby, znovu se volně cirkulující viry změnily, čímž obelstily ochranu vyvolanou běžně používaným očkovacím kmenem. Poté byla za účelem ochránit zvířata použita kombinace obou vakcín (HVT a Rispens), avšak uspokojivé výsledky byly pozorovány pouze dočasně. V současné době se navzdory všem těmto očkováním vyskytují nové epidemie choroby. Důvod tohoto jevu není dosud znám, avšak vyplývá z něj zřetelná nutnost uvést nové účinné vakcíny.

Problémem spojeným s očkováním proti Markově chorobě je skutečnost, že navzdory tomu, že Markovy vakcíny byly vyráběny již velmi dlouho, nemohl být způsob přípravy vakcín zlepšen. Důvodem je fakt, že podstatná část virů vázaných na hostitelskou buňku může být kultivována v podstatě pouze v primárních hostitelských buňkách bez patogenů, jako v případě MDV nebo HVT v primárních buňkách jako jsou fíbroblasty připravené z drůbeže jako jsou kuřata, a v případě viru varicella zoster v (v podstatě primárních) lidských buňkách (opět samozřejmě bez kontaminujících patogenů) a nelze toho dosáhnout vůbec nebo pouze s velkými obtížemi bez specifické buňky příslušného hostitele. Toto činí vakcínu proti virovým infekcím nebo chorobám, které jsou těmito typy virů způsobené, obtížně, ne-li téměř zcela vůbec z praktického hlediska připravitelnou a tudíž velmi drahou.

Například vakcína Rispens proti Markově chorobě, která je v současnosti považována za jedinou dostatečně účinnou, je jako všechny Markovy viry sérotypu-1 striktně vázaná na hostitelskou buňku. Infekčnost viru vázaného na buňku (jako například sérotyp 1 a 2) je v průběhu běžného zmrazení nebo lyofilizace zcela ztracena. Proto tedy příprava vakcíny zahrnuje velmi komplikovaný a drahý krok, při kterém musí být celé buňky zmrazený v kapalném dusíku. Vakcína musí být, před tím, než je použita, skladována, transportována a uchovávána pod kapalným dusíkem, což způsobuje obrovské náklady a problémy během transportu.

V místě použití pak musí být vakcína používána velmi opatrně, protože infikované buňky jsou velmi citlivé na faktory prostředí. Faktory jako jsou zvýšené teploty, vystavení světlu a vystavení zbytkovým detergentům na použitém nádobí často virus zničí, takže nelze připravit dostatečně životaschopnou vakcínu, což vede k jejímu úplnému selhání. Tato selhání mohou však být zjištěna pouze tehdy, když choroba již vypukne a drůbež vykazuje příznaky choroby.

V krátkosti, do současné doby všechny pokusy poskytnout inaktivované, podjednotkové nebo rekombinantní vakcíny na ochranu proti Markově chorobě selhaly a tudíž v současnosti neexistuje alternativa k živým na buňku vázaným vakcínám obsahujícím virus Markovy choroby. Markova choroba zůstává kontrolovatelná pouze prostřednictvím preparátů infikované buňky použitých jako vakcíny. Tyto preparáty neobsahují pouze živé buňky suspendované v médiu obsahujícím DMSO a celou řadu buněčných antigenů, ale také musí být skladovány pod kapalným dusíkem. V důsledku toho musí být udržováno chladné prostředí po celou dobu od výroby vakcíny, přes uživatele až do aplikace vakcíny. Kromě toho, je-li vakcína jednou rozmražena, musí být aplikována v průběhu velmi krátké doby a očkován musí být každý pták. Některé tyto problémy jsou sdíleny rovněž těmi, kteří věří v přípravu vakcíny proti jiným herpesvirům, které jsou v podstatě vázané na buňku, jako je virus varicella zoster.

• · · · • ·

Virus Markovy choroby (MDV) je členem Alphaherpesvirinae, podrodiny Herpesviridae, (Lee a kol., 2000, Murphy a kol., 1995). Na základě virulence pro kuřata a schopnosti indukovat lymfomy T buněk jsou MDV obecně děleny do 3 sérotypů (MDV-1, MDV-2 a MDV-3). MDV-3 představuje herpesvirus krocanů (HVT), který je po celém světě používán pro očkování proti chorobám příbuzným s MDV. Avšak po selhání očkování a vývoji tzv. virulentního nebo velmi virulentního MDV-1 (Witter, 1985), byly v očkovacích formulacích použity oslabené kmeny MDV-2 a později oslabené kmeny MDV-1 (např. kmen VIC 988 Rispens) (Witter, 1985). V posledních letech se objevily a prvně byly oznámeny v USA ještě virulentnější MDV-1, tzv. velmi virulentní plus (w+) varianty MDV-1, které způsobily vysoký výskyt Markovy choroby a úmrtnost způsobenou vývojem nádorů a imunosupresí velmi brzo po infekci (Witter, 1997). Jeden w+ kmen, 584A, byl pasážován více než 100 krát na fíbroblastech kuřecího embrya (CEF) a bylo zjištěno, že pro kuřata ztratil patogenitu (Witter, 1997). Avšak zvýšená patogenita vv+ MDV-1 a podobně ztráta virulence jsou z molekulárního pohledu velmi málo prozkoumány, protože molekulární analýzy MDV-1 jsou velmi těžko proveditelné. Na jedné straně není v kultivovaných buňkách uvolňováno žádné nebo jsou uvolňována pouze malá množství potomstva infekčního viru, na druhé straně je příprava rekombinantů MDV-1 pracná a vzhledem k tomu, že jsou povahy vázané na buňku, je třeba provést několik purifikací virových rekombinantů (Cantello a kol., 1991; Sakaguchi a kol., 1993; Parcells a kol., 1994; Schat a kol., 1998; Anderson a kol., 1998).

Závěrem je možno uvést, jak již bylo zmíněno dříve, že očkování nemůže zaručit ochranu zvířat proti všem virům spadajícím do oblasti Markovy choroby. Virus, jako všechny Herpesviry, je schopen nalézt cesty, jak se imunitní odezvě vyvolané vakcínou vyhnout. Proto tedy existuje potřeba rychle vakcíny adaptovat na situaci v dané oblasti. V současné době se toto uskutečňuje prostřednictvím izolování izolátů dané oblasti (jako je HVT nebo Rispens) a/nebo dalším oslabením in vitro. Izolace sama o sobě způsobuje veliké problémy, protože je velmi složité dostat infekční virus vázaný na buňku z kuřat a infekčních buněk v buněčné kultuře. Kroky vedoucí k oslabení, které by následovaly, jsou velmi pracné a časově náročné, zejména protože purifikace plaků je velmi obtížná, což je opět z důvodu povahy viru, který je vázaný na buňku.

Výsledek oslabení není jasný. Výsledkem těchto faktů je to, že na trh nebyly již dlouho uvedeny žádné vakcíny, které by poskytovaly zmírnění tam, kde současné HVT a Rispens typy vakcín selhávají. Kromě toho se často v průběhu výroby vakcíny vyskytuje nadměrné oslabení, protože virus byl pasážován příliš mnohokrát. Toto dále zhoršuje již nízkou účinnost vakcín typu HVT a Rispens v dané oblasti. Krátce, velký podíl na současné • · · · ·· · ·· · • ···· ··· • · · · · ···· · • · · · · · ···· ······· ·· ·· ·· ·· bezvýchodné situci související s regulací MDV mají následující problémy. Existuje nízká reprodukovatelnost klasické výroby vakcín, je spatřováno nadměrné oslabení očkovacího viru, nedefinované oslabení viru vakcíny, vysoké výrobní náklady, vysoké náklady na skladování a transport, vysoká citlivost vakcíny na faktory prostředí a pomalý vývoj nových očkovacích kmenů zejména u virů vázaných na buňku.

Tyto problémy jsou komplikovány tím, že současné cirkulující viry poskytují zvýšené až vysoké titry protilátek u surovin drůbežářské výroby. Tyto vysoké titry protilátek jsou prostřednictvím mateřské protilátky ve vajíčku předávány přes potomstva. Vliv těchto mateřských protilátek v průběhu počáteční infekce současným očkovacím virem dále snižuje účinnost očkování proti Markově chorobě.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje vakcínu proti infekci, která je způsobena herpesvirem, který jev podstatě vázaný na hostitelskou buňku, obsahující rekombinantní virový genom pocházející ze zmíněného herpesviru. Zmíněný genom umožňuje rekombinaci v podstatě bez zmíněné hostitelské buňky. Za tímto účelem vynález poskytuje rekombinantní virový genom pocházející z herpesviru, který je považován v podstatě za vázaný na hostitelskou buňku, zmíněný genom výhodněji schopný alespoň určitého měření replikace ve zmíněné hostitelské buňce a současně umožňuje rekombinaci v podstatě bez zmíněné hostitelské buňky nebo nezávisle na ní, přičemž homologní rekombinace v eukaryotickýchch buňkách není více požadována. Detailnější popis tohoto genomu je poskytován pro virus podobný viru Markovy choroby.

Jako příklad lze uvést genom viru Markovy choroby sérotyp 1 (MDV-1), kmen 584Ap80C, který byl klonován v Escherichia coli'}&x> bakteriální umělý chromozom (BAC). Sekvence vektoru BAC byly začleněny do místa Us2 v genomu MDV-1 prostřednictvím homologní rekombinace po transfekci fibroblastů kuřecího embrya (CEF) s virovou DNA a rekombinantním plasmidem pDS-pHAl, který obsahoval sekvence BAC a gen Eco-gpt místo genu Us2 MDV-1 a koncové sekvence. Potomstva transfekce byla pasážována na CEF buňkách v přítomnosti kyseliny mykofenolové a xantin/hypoxantinu. Po čtyřech selekcích byla připravena virová DNA a byla použita k transformaci kmene Escherichia coli DH10B. Jednotlivé kolonie nesoucí kompletní genom MDV-1 byly identifikovány. Tyto BAC MDV-1 byly transfekovány do CEF buněk a počínaje 3 dnem po transfekci byl získán infekční

MDV-1. Růst MDV-1 získaných z různých BAC byl nerozeznatelný od růstu rodičovského viru, což bylo stanoveno prostřednictvím tvorby plaků a stanovení růstových křivek.

Vynález také poskytuje způsob výroby nebo získání genomu rekombinantního na hostitelskou buňku vázaného herpesviru obsahujícího (je-li to žádoucí téměř nebo zcela kompletní) infekční herpesvirovou nukleovou kyselinu pocházející z MDV a/nebo VZV izolátu.

Nyní, když je získán v podstatě kompletní genom bez hostitelských buněk, o němž se původně předpokládalo, že je pevně vázán na buňku, poskytuje vynález také genom podle vynálezu, který umožňuje aplikaci všech rekombinantních technik dostupných odborníkovi v oblasti molekulární biologie. Vynález také poskytuje například vakcínu podle vynálezu alespoň obsahující (replikativní) mini genom.

Vynález například poskytuje minigenom, který poskytuje expresi pouze pár glykoproteinů (jako je gB, gC, gD nebo jejich kombinace) a např. ICP4 nebo jiného produktu genu, u kterého bylo zjištěno, že indukuje buněčnou imunitu u herpesvirů. Tento minigenom například umožňuje identifikovat geny, které jsou důležité při ochraně, uvážíme-li, že replikace genomu v (eukaryotických) hostitelských buňkách už není poskytována. Přidání například HCMV nebo SV40 promotoru před každý gen nebo genový konstrukt by poskytlo pro konečnou identifikaci minimální ochranou jednotku. Pro replikačně kompetentní minigenom vynález také poskytuje odstranění celé nebo hlavní části US oblasti, čímž se výsledný mini virus replikuje rovněž v hostitelských buňkách.

V jiném provedení vynález poskytuje takový genom, který obsahuje v podstatě stejně dlouhou kopii pocházející ze zmíněného herpesviru, přičemž v podstatě stejná délka zde naznačuje, že je přítomna velká část genů zmíněného virového genomu, kromě těch, které jsou výhodněji (alespoň funkčně) vynechány jako je gen nepostradatelný pro replikaci či rozšíření viru v hostiteli nebo kultuře hostitelské buňky, jak je poskytnuto v podrobném popisu. Například v jednom ze získaných genomů podle vynálezu, BAC20, byly sekvence kódující glycoprotein B (gB) deletovány jednokrokovou mutací zprostředkovanou rec-E za pomoci lineárního DNA fragmentu.

Glykoprotein B-negativní MDV-1 vytvořený po transfekci gB-negativní BAC20 DNA (20DgB) byl schopen růst pouze na buňkách poskytujících gB in trans, ukazující, že gB je nepostradatelný pro růst MDV-1 v kultivovaných hostitelských buňkách. Jinými geny, které jsou nepostradatelné pro růst a pro něž mohou být poskytovány hostitelské buňky, které produkují genový produkt in trans, jsou gH, ICP4, UL15, UL28 a UL9 nebo jiný gen považovaný za nepostradatelný pro růst, které jsou uvedeny níže.

Vynález dále poskytuje použití genomu podle vynálezu pro přípravu vakcíny, v jednom provedení jako vakcíny proti chorobě, která je způsobena infekcí herpesvirem v podstatě vázaným na hostitelskou buňku, avšak, v dalším provedení může být tato vakcína použita jako vektor vakcíny a může obsahovat jiné nebo další patogeny nebo části nukleové kyseliny, které je kódují. U MDV obsahuje výhodnější další patogenní nukleová kyselina ~ nukleovou kyselinu pocházející například z viru choroby Newcastle, Eimeria spp, Salmonella spp, viru infekční anemie u kuřat, viru chřipky, viru infekční váčkové choroby, reoviru nebo jiné patogeny běžně se vyskytující u drůbeže.

Vynález také poskytuje vakcínu, ve které zmíněný genom obsahuje funkční deleci v genu, který je nepostradatelný pro replikaci a/nebo rozšíření zmíněného herpesviru v hostitelské buňce nebo ve které zmíněný virový genom alespoň obsahuje nukleovou kyselinu kódující antigenní látku schopnou vyvolat (výhodněji v podstatě ochrannou) imunitní odezvu na infekci jedince zmíněným herpesvirem. Mezi typický nepostradatelný gen nebo jeho fragment, který má být deletován, patří například homolog MDV ULl=glykoprotein L; UL5; UL8; UL9; UL15; UL18; UL19; UL22=glykoprotein H; UL26; UL26.5; UL27=glykoprotein , B; UL28; UL29; UL30; UL52; UL53; ICP4 nebo geny nebo jejich fragmenty vybrané z US oblasti genomu (obr. 1).

Ve výhodnějším provedení poskytuje vynález vakcínu obsahující funkční deleci v genu, který je nepostradatelný pro vyvolání určité imunitní odezvy specifické pro zmíněný herpesvirus umožňující imunologické rozlišení mezi jedinci očkovanými zmíněnou vakcínou a jedinci infikovanými zmíněným na buňku v podstatě vázaným herpesvirem. Výhodnějšími odezvami jsou například odezvy zaměřené na gC, gM, gD nebo gE, přičemž podrobný popis dále vysvětluje (zde v případě gM) tuto deleci v genu, který je nepostradatelný pro vyvolání specifické imunitní odezvy.

Vynález dále poskytuje vakcínu podle vynálezu, kde zmíněný virový genom alespoň obsahuje nukleovou kyselinu kódující bílkovinnou látku, která je schopna regulovat transkripci a/nebo translaci nukleové kyseliny kódující antigenní látku schopnou vyvolat imunitní odezvu na infekci jedince zmíněným herpesvirem.

Zmíněná vakcína výhodněji obsahuje v podstatě stejně dlouhou kopii pocházející ze zmíněného herpesviru a to proto, aby byly zachovány všechny funkce, které jsou vyžadovány k účinné regulaci transkripce a/nebo translace očkovacího genomu v očkovaném hostiteli, avšak rovněž je zde poskytnuto očkování pomocí minigenomu. Je samozřejmě výhodnější účinně regulovat transkripci a/nebo translaci nukleové kyseliny kódující cizí patogen nebo antigenní látku od něho odvozenou, je-li exprimován další patogen nebo antigenní látka • · ·· ···· · · ···· • · ·«·· ···· ······· ·· ·· · ·· odvozená z té ze zmíněného genomu a lze očekávat, že jsou poskytovány do zmíněného genomu také cizí (tzn. neherpesvirové regulační prvky), je-li poskytována vakcína podle vynálezu vybavená nukleovou kyselinou kódující další patogen.

Vynález konkrétně poskytuje vakcínu podle vynálezu, ve které zmíněný herpesvirus zahrnuje virus podobný viru Markovy choroby. Konkrétně je výhodnější poskytnout takovou vakcínu, kde virus podobný viru Markovy choroby zahrnuje sérotyp 1. Teď když jsou poskytovány způsoby manipulace genomu zahrnovaného nad rámec kontextu hostitelské buňky, na kterou byl genom původně vázán, je také poskytována taková vakcína, která místo, aby byla odvozena od normálních oslabených nebo nevirulentních izolátů viru podobného viru Markovy choroby, je odvozena z virulentního, velmi virulentního nebo velmi virulentního plus oblastního viru, protože nyní je možná rychlá izolace infekčních klonů z oblastních izolátů, umožňující přípravu DNA vakcín pro prevenci pro vakcíny Markovy choroby u kuřat a krůt, kde je možno velmi rychle do genomu mutace začlenit. Stejný systém je možno použít také pro jiné v podstatě na buňku vázané herpesviry jako je virus varicella zoster.

Použití replikativních virových genomu, jako jsou zde poskytovány, obsahující části nebo celý genom infekčního viru Markovy choroby (MDV-1), otevírá řadu nových možností jak připravit účinnější, biologicky bezpečné a stabilní MDV-1 vakcíny. V důsledku toho, že rekombinantní MDV-1 jsou získány z klonované DNA, může být potomstvo viru, které je výsledkem DNA transfekce, lépe charakterizováno a je možno se vyvarovat nadměrného oslabení vakcinačních virů. Např. počet repeticí o velikosti 132-bp, které se zdá, že souvisí s oslabením (Maotani a kol., 1986) může být přesně určen a - je-li to nezbytné- je možno ho snížit nebo zvětšit podle potřeby produkce vakcíny nebo podle situace v dané oblasti (viz níže). Tvorba mutantu MDV-1 je mnohem snadnější. Dosud byly MDV-1 mutanty získávány pracnými a časově náročnými homologními rekombinacemi a selekčními postupy v eukaryotických buňkách. Výsledkem těchto selekčních postupů - jak je uvedeno pro jiné herpesviry - jsou často mutace genomu jiné než které jsou žádoucí, zejména protože v případě MDV-1 nemůže být získán virus bez buňky, což činí selekční postupy, výtěžek a množení mutantů ještě obtížnějším. Na druhé straně vynález poskytuje způsob manipulace virového genomu založený na mutaci prostřednictvím genu recE, recT a recB/C -potlačující λ gam gen přítomný na plasmidů pGETrec (Narayanan a kol., 1999). Výhodami systému jsou (i) že k zaměření specifické sekvence, která má být deletována, jsou potřeba homologní ramena o velikosti pouze 30 až 50 bp, tzn. delece jakéhokoliv otevřeného čtecího rámce je možno dosáhnout bez klonování rekombinantní kazety, (ii) způsob je velmi rychlý a (iii) že pGETrec vektor nesoucí mutační systém a exprimující ampicilinovou rezistenci je v nepřítomnosti ampicilinu z bakteriálních buněk rychle ztracen.

Použitím výkonných technik pomocí tzv. E/T klonovacích postupů je možná jednokroková mutace a selekce v Escherichia coli (Muyrers a kol., 1999; Narayanan a kol., 1999; Zhang a kol., 1998) Tato technika také umožňuje deleci nezbytných MDV-1 genů bez potřeby komplementující buněčné linie, protože replikace genomů mutovaných MDV-1, které jsou zde poskytovány, nevyžadují trans-komplementaci deletovaných nepostradatelných genů. Kromě toho jsou zcela nezbytné klonovací postupy.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob přípravy MDV-1 nebo jiných (v podstatě vázaných na buňku herpes) virových BAC obsahující transformování např. buněk Escherichia coli DH10B s plasmidem ρΒΑϋαβγ, pGETrec nebo jakýmkoliv jiným plasmidem, který induktivně nebo stabilně exprimuje recE, recT a ygam gen, poté následuje příprava cirkulámí virové DNA z lyricky nebo latentně infikovaných buněk vzatých např. ex vivo nebo z buněčných kultur. V paralelně probíhajícím nebo samostatném postupu jsou poskytnuty lineární DNA nesoucí BAC vektorové sekvence a sekvence, které umožňují homologní rekombinaci vektorových sekvencí BAC s virovou DNA. Tato lineární DNA může být např. vyrobena pomocí PCR nebo linearizací plasmidové DNA. Poté je poskytnuta exprese recE, recT a gam genu v Escherichia coli a jsou poskytnuty elektrokompetentní buňky (např. Sambrook a kol., 1989). Virová DNA je poté elektroporací vpravena spolu s lineární DNA nesoucí vektorové sekvence BAC do kompetentní Escherichia coli. Rozetření na agar obsahující příslušná antibiotika slouží k tomu, aby byla(y) sklizena(y) kolonie a poté může být připravena DNA BAC jako je např. popsáno v podrobném popisu. Infekčnost klonované virové DNA BAC je sledována prostřednictvím transfekce citlivých buněk. V souvislosti s tím vynález poskytuje způsob jak geneticky rekombinovat genom herpesviru v podstatě vázaného na hostitelskou buňku pocházející z hostitelské buňky nebo tkáně bez toho, aby bylo třeba provést (homologní) rekombinaci v eukaryotických buňkách umožňující získat (je-li třeba téměř nebo zcela kompletní) infekční genom nebo herpesvirovou nukleovou kyselinu pocházející z oblastních izolátů nebo stejných oslabených izolátů.

Způsob, který je zde poskytnut, bude také umožňovat další oslabení vakcíny MDV-1 nebo přípravu MDV-1 mutantů nesoucích geny jiných důležitých kuřecích patogenů. Kromě toho objevení oblastních izolátů MDV-1 s možnými odlišnými a měnícími se vlastnostmi může být vyváženo poskytnutím vakcíny založené na výměně dotyčných mutovaných genů mezi klonovaným MDV-1 a běžným oblastním izolátem (izoláty). Tyto změny - jak jsou popsány výše - mohou být provedeny stejnými E/T klonovacími technikami a jako takové ···· ♦· · ·· · • ···· ··· • ···· ·«·· · • · ···· ···· ······· ·· ·· ·· ·· poskytnout možnost reagovat na změny MDV-1 v dané oblasti velmi rychle. Atraktivní výhodou zisku infekčního MDV-1 způsobem, jaký je zde popsán, je však použití genomu, který je zde poskytnut, jako DNA vakcíny. Dosud je Markova choroba regulována prostřednictvím aplikace preparátů infikovaných buněk.

Tyto preparáty neobsahují pouze živé buňky suspendované v médiu obsahujícím DMSO a celou řadu buněčných antigenů, ale také musí být skladovány v kapalném dusíku. Následně musí být chlad udržován po celou dobu od přípravy vakcíny, přes uživatele vakcíny až k jejímu podání. Kromě toho jednou rozmražená vakcína musí být podána v průběhu velmi krátké doby a musí být očkován každý pták. U genomové DNA MDV-1, jak je zde poskytována, je purifikace vakcíny (DNA) snadno dostupná a reprodukovatelná. DNA je extrémně stabilní, není třeba vytvořit chladový řetězec a infekční DNA může být aplikována několika způsoby (intramuskulámě, podkožně, in-ovo, orálně, respirační cestou apod.) a v různých formulacích (s nebo bez nosiče atd.). Kromě toho přítomnost mateřských protilátek neinterferuje s primární injekcí imunogenu.

MDV-1 genomy, jak jsou zde poskytnuty, poskytují poprvé možnost vyrobit a zpracovat vysoce účinné a biologicky bezpečné vakcíny proti nádorovým a ekonomicky významným chorobám. Vynález tak obecně poskytuje způsob jak omezit rizika vzniku choroby nebo zcela patrného onemocnění způsobeného infekcí herpesvirem v podstatě vázaným na hostitelskou buňku. Daný způsob zahrnuje podání vakcíny podle vynálezu nebo genomu podle vynálezu zmíněnému jedinci.

Virus Markovy choroby (MDV) je členem Alphaherpesvirinae podrodiny Herpesviridae (van Regenmortel a kol., 1999). Na základě virulence pro kuřata, schopnosti indukovat lymfomy T buněk a antigenních vlastností jsou MDV děleny do 3 sérotypů (MDV-1, MDV-2 a MDV-3) (Payne, 1985). MDV-3 reprezentuje herpesviry krocanů (HVT), které byly rozsáhle používány pro očkování proti chorobám spojeným s MDV. Podle nejnovějšího názvosloví je MDV-1 klasifikován jako gallid herpesvirus 2 (GHV-2), MDV-2 jako GHV-3 a HVT jako meleagrid herpesvirus. Všechny tři viry patří do nového rodu virů v rámci Alphaherpesvirinae podobných těm, které způsobují Markovu chorobu.

Kontrolní infekce MDV-1 byla provedena pomocí očkování primárně HVT, avšak po selhání očkování a po popisu tzv. velmi virulentního MDV-1 (Witter, 1989) byly v očkovacích formulacích použity kmeny MDV-2 a později oslabené kmeny MDV-1 (např. kmen CVI988 Rispens) (Witter, 1985).

• · · · · · ···· ······· ·· · · ·· ··

V posledních letech se objevily a poprvé byly oznámeny v USA ještě virulentnější MDV-1, velmi virulentní plus (vv+), varianty MDV-1 a způsobily vyšší úmrtnost dokonce u očkovaných souborů (Witter, 1997). Jeden z těchto vv+ kmenů, 584A, byl pravidelně pasážován na fibroblastech kuřecího embrya (CEF) a ztratil tím patogenitu pro kuřata (Witter, 1997). Molekulární podstata zvýšení patogenity vv+ MDV-1 a podobně ztráty virulence jsou velmi málo známy, protože molekulární analýzy MDV-1 jsou velmi těžko proveditelné.

Na jedné straně není v kultivovaných buňkách uvolňováno žádné infekční potomstvo viru, na druhé straně je produkce rekombinantů MDV-1 pracná a vzhledem k povaze látky, která je vysoce vázaná na buňku, in vitro, je třeba provést více purifikaci rekombinantů viru (Cantello a kol., 1991; Sakaguchi a kol., 1993; Parcells a kol., 1994, 1995; Schat a kol., 1998; Anderson a kol., 1998). Kromě toho musí být pro růst MDV-1 použity primární buňky (Payne), jehož výsledkem je fakt, že analýza nepostradatelných genů MDV-1 je téměř nemožná, protože nelze vytvořit žádné trans-komplementující buněčné linie.

Genomy myši a lidských cytomegalovirů (MCMV a HCMV; Messerle a kol., 1997; Borst a kol., 1999), virus herpes simplex typ 1 (HSV-1; Suter a kol., 1998), virus pseudovztekliny (PrV; Smith a kol., 1999, 2000) a virus Epstein-Barrové (EBV; Delecluse a kol., 1998) byly pomocí této techniky klonovány jako infekční BAC.

Cílem této studie bylo poskytnout základ pro rychlou a účinnou výrobu rekombinantů MDV-1 pomocí klonování úplného genomu o velikosti 180 kbp v Escherichia coli. Infekční MDV-1 byl snadno získán po transfekci klonované MDV-1 BAC DNA pomocí CEF buněk a BAC MDV-1 byly po několika cyklech bakteriálního růstu nebo po sériovém zmnožení v CEF buňkách stabilní.

Nakonec, protože byla možná jednokroková delece nepostradatelného genu MDV-1 v Escherichia coli, může mít systém velkou schopnost usnadnit budoucí analýzu nepostradatelných a postradatelných genů MDV-1 a může sloužit jako prostředek pro výrobu biologicky bezpečného modifikovaného živého viru a/nebo DNA vakcín.

Přehled obrázků ve výkresech

Obrázek 1 Schematické znázornění postupu klonování za účelem vyrobit kompletní genomy MDV-1 nesoucí BAC. Ukázáno je uspořádání přibližně 180 kbp genomu MDV-1 (A) a BawHI-restrikční mapa (B) podle Fukuchiho a kol. (11). Je ukázána specifická krátká oblast (Us) a otevřený čtecí rámec ORF umístěné v Us (C a D). Fragmenty o velikosti 2,1 a 3,1 kbp nesoucí Us2 gen (šedá pole) byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány do plasmidu pTZ18R, aby poskytly počátek rekombinantnímu plasmidu pDS. Vektor BAC o velikosti 7,2 kbp uvolněný z rekombinantního plasmidu pHAl (15) byl inzertován do pDS za vzniku plasmidu pDS-pHAl (E). Místa pro restrikční enzymy podle (2) jsou zkrácena následujícími zkratkami: B=R«/nHI, E=£c<3RI, Ρ=Λ7ΐ, Pa=7’acl, S=.SaZI.

Obrázek 2 Digitálně snímaný obraz 0,8% agarózového gelu fixovaného ethidium bromidem. DNA izolovaná z klonů Escherichia coli DH10B BAC 19, BAC20 a BAC24 byla naštěpena BamHl nebo £coRI a byla separována. Štěpy vzniklé působením restrikčního enzymu jsou ohraničeny markérem o velikosti 1 kb (Gibco-BRL). Hvězdičky naznačují další proužky nebo variace co se týče velikostí jednotlivých fragmentů mezi třemi BAC klony.

Obrázek 3 Digitálně snímaný obraz DNA z 584Ap80C (V), BAC 19, BAC20 a BAC24 naštěpených Ba/ziHI nebo £coRI, separovaných elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu a fixovaných ethidium bromidem (levý panel). Po Southern blotu DNA fragmentů na nylonové membrány, byla provedena hybridizace s digoxigeninem značenými fragmenty uvolněnými z plasmidu pDS nebo pHAl. Velikost markérů (1 kb , Gibco-BRL) a velikosti reaktivních proužků jsou uvedeny.

Obrázek 4 Digitálně snímaný obraz Southern blotů použitých pro analýzu variací velikosti u DNA BAC19, BAC20 a BAC24. Virová DNA kmene 584Ap80C (V) a jednotlivé BAC byly naštěpeny Ru/wHI nebo EcoRl a přeneseny na nylonové membrány. Membrány byly inkubovány s digoxigeninem značenou DNA BAC 19 nebo značenými RazwHI-C nebo RawHI-D fragmenty. Velikosti markérů (1 kb, Gibco-BRL) jsou uvedeny. Proužky, které mají charakter skvrny, v případě DNA 584Ap80C hybridizované s Ru/wHI-D sekvencemi, jsou naznačeny závorkami.

Obrázek 5 (A)IIF analýza MDV-1 plaků po transfekci DNA BAC 19, BAC20 nebo BAC24. 5 dní po transfekci byly infikované buňky fixovány a podrobeny nepřímé imunofluorescenci pomocí protilátky proti gB mab 2K11. Detekce proužků protilátek byla provedena s myší protilátkou anti-mouse Alexa™ 488 (molekulové próby) a jádra byla fixována propidium jodidem. Zvětšení - 400x (B) Růstové křivky MDV-1 kmene 584A a různých BAC. Po infekci CEF buněk 100 p.f.u. 584Ap80C nebo transfekci potomstva BAC 19, BAC20 nebo BAC24 byly v určitých

časech p.i. stanoveny titry a to prostřednictvím současného zaočkování čerstvými CEF buňkami. Plaky byly po imunofluorescentním fixování mab 2K11 spočítány.

Obrázek 6 Digitálně snímané obrazy Southern blotů, za účelem analyzovat stabilitu vektorových BAC sekvencí ve virech získaných po transfekci BAC 19 a BAC20. Potomstvo po transfekci bylo 4 krát pasážováno a po každé pasáži byla izolována virová DNA. Virová DNA byla naštěpena BamHI nebo EcoRI, separována elektroforézou v 0,8% agarozovém gelu a převedena na nylonové membrány. Hybridizace Southern blotem byla provedena pomocí digoxigeninem značených fragmentů plasmidů pDS nebo pHAl. Zkratky: V=584Ap80C, 19=BAC19, 20=BAC20. Pasáže 1 až 4 po transfekci BAC19 DNA jsou označeny čísly 1 až 4. Pasáž 4 po transfekci DNA BAC20 byla nanesena do poslední dráhy a je označena jako 4a. Velikosti reaktivních fragmentů jsou uvedeny. Hvězdičky naznačují reaktivní 1,6 kbp velký proužek markéru (1 kb, Gibco-BRL).

Obrázek 7 (A) Schematické znázornění mutace BAC20 za účelem odstranit sekvence kódující gB. Rekombinantní plasmid pGETrec kódující L-arabinosou indukovaný recE, recT a gam gen byl transformován do buněk DH10B obsahujících BAC20. Po amplifikaci PCR genu kan^R z plasmidu pEGFP-Nl (Clontech) s primery, které rovněž obsahovaly 50 nt homologní ramena nesoucí gB deleci, byl amplikon po PCR o velikosti 1,6 kbp elektroporací vpraven do buněk DH10B nesoucích BAC20 a pGETrec. Bakteriální suspenze byla nanesena na agar obsahující 30 pg/ml kanamycinu a 30 pg/ml chloramfenikolu. Kolonie s dvojnásobnou rezistencí byly sebrány a podrobeny další analýze.

(B) Schematické znázornění umístění genu gB v MDV-1 a delece přítomné v BAC 20DgB.

Obrázek 8 Snímaný obrázek 0,8% agarozového gelu fixovaného ethidium bromidem obsahujícího DNA BAC20 a 20DgB naštěpené ItawíHI, EcoRI, Bgll nebo Stul a separované elektroforézou v 0,8% agarozovém gelu (levý panel). DNA fragmenty byly převedeny na nylonové membrány a byly hybridizovány s digoxigeninem značenou kan^R nebo gB-specifickou probou. Velikostí reaktivních DNA fragmentů jsou naznačeny. Zkratky: B=2ta>wHI, E=£coRI, Bg=£g/I, S= Stul.

Obrázek 9 Konfokální laserová snímací analýza buněk MgB 1 významně exprimujících gB

MDV-1. Buňky MgBl nebo QM7 byly zaočkovány na skleněné desky a byly inkubovány s protilátkou proti gB mab 2K11 nebo s obnoveným kuřecím sérem MDSI. Sekundárními • fc · · ···· ·« ····

protilátkami byly konjugáty protilátek proti myším nebo kuřecím IgG Alexa™ 488 (molekulové proby). Jádra byla fixována propidium jodidem. Sloupec představuje 10 pm.

Obrázek 10 IIF analýza MgBl, QM7 nebo CEF buněk po transfekci s BAC20 (horní panely) nebo 20DgB (spodní panely). 5. den po transfekci byly buňky fixovány acetonem a byly inkubovány s protilátkou proti pp38 mab H19. Sekundární protilátkou byla protilátka proti myším IgG Alexa™ 488 (molekulové proby). Zatímco plaky MDV-1 byly pozorovány u všech buněčných linií po transfekci DNA BAC 19, virové plaky byly pozorovány pouze u buněk MgBl po transfekci s 20DgB. Pouze jednotlivé infikované buňky byly pozorovány u QM7 a CEF buněk (šipky). Zvětšení = 400x.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Virus a buňky

Primární nebo sekundární fibroblasty kuřecího embrya (CEF) nebo buňky ochablého svalstva (QM7) byly uchovávány v modifikovaném základním médiu Dulbecco (DMEM) obohaceném 5 až 10% zárodečným telecím sérem (FCS). Kmen MDV-1 584Ap80C byl laskavě poskytnut Dr. Richardem Witterem, ADOL, East Lansing, Michigan, USA. Kmen 584Ap80C reprezentuje nevirulentní pasážované potomstvo buněčné kultury vv+ kmene 584A (Witter, 1997). Kmen byl kultivován na primárních a sekundárních CEF buňkách, jak již bylo popsáno dříve (Osterrieder, 1999). U buněk QM7 byla před tím, než byly použity pro namnožení MDV-1, testována nepřítomnost sekvencí MDV-1 pomocí PCR a hybridizace Southern blotem, která byla zaměřena na různé oblasti genomu (Zelnik a Osterrieder, nepublikováno). Růstové křivky viru byly zjištěny popsaným avšak mírně modifikovaným postupem (Parcells a kol., 1994). Stručně, jednotky vytvářející 100 plaků (p.f.u) byly použity pro infekci 2 x 10⁶ čerstvě umístěných CEF buněk. V různých časech po infekci (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 h) byly infikované buňky trypsinovány a byly titrovány na čerstvé buňky CEF. Byl stanoven počet plaků a výsledky reprezentují průměr dvou nezávislých experimentů.

Buněčná linie QM7, která podstatně exprimuje gB MDV-1, byla získána transfekci lxlO⁶ QM7 buněk s 10 pg pcMgB (obr. 1), která je na bázi pcDNA3 (Invitrogen) a obsahuje gB gen MDV-1 z kmene Rispens CVI988 a probíhá pod kontrolou ranného brzkého promotoru lidského cytomegaloviru. Buňky QM7 obsahující pcMgB byly selektovány v

přítomnosti G418 o koncentraci 1 mg/ml a klony exprimující gB byly identifikovány pomocí monoklonální protilátky proti gB (mab) 2K11 (laskavě poskytl Dr. Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, Francie). Výsledná buněčná linie exprimující gB MDV-1 byla označena jako MgBl.

Příklad 2 Konstrukce MDV-1 BAC

DNA MDV-1 byla přečištěna z infikovaných buněk pomocí extrakce systémem dodecylsulfát sodný-Proteinase K, jak bylo popsáno již dříve (Morgan a kol., 1990). Plasmid pDS-pHAl byl konstruován následovně. Fragmenty o velikosti 2,1 a 3,1 kbp na každé straně Us2 genu MDV-1 (obr. 1) byly amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití standardních primerů obsahujících místa pro příslušné restrikční enzymy (tab.l). Oba fragmenty byly klonovány do pTZ18R (Pharmacia-Amersham). Vektor BAC obsahující gen Eco-gpt pod kontrolou ranného brzkého promotoru HCMV byl z plasmidu pHAl (laskavě poskytl Dr. M. Messerle, LMU, Mnichov, SRN; Messerle a kol., 1997) uvolněn a byl inzertován do míst Pacl začleněných do obou fragmentů o velikosti 2,1 i 3,1 kbp přítomných v plasmidu pDS (obr. 1).

Primární buňky CEF byly transfekovány s 2 pg 584Ap80C DNA a 10 pg pDS-pHAl. 5. den po transfekci byly buňky rozetřeny na primární CEF buňky v přítomnosti 250 pg/ml kyseliny myko feno lově (MPA), 50 pg/ml xanthinu a 100 pg/ml hypoxanthinu. Selekce pomocí MPA/xanthin/hypoxanthinu byla provedena celkem 4 krát. Poté co po čtvrtém cyklu selekce došlo k úplnému cytopatickému efektu (cpe), byla z infikovaných buněk připravena virová DNA. 1 pg DNA infikované buňky byl elektroporací vpraven do buněk DHB10 Escherichia coli. Kolonie byly detekovány po transfekci na agaru obsahujícím 30 pg/ml chloramfenikolu (Sambrook a kol., 1989) počínaje 16 h. Jednotlivé kolonie byly sklizeny a standardní alkalickou lýzí (Sambrook a kol., 1989) byla z Escherichia coli připravena DNA BAC. Příprava DNA BAC ve větším měřítku byla provedena pomocí afinitní chromatografie na bázi silikagelu za použití komerčně dostupných souprav (Qiagen, Macherey & Nagel). Pro další analýzu byly vybrány tři klony BAC 584Ap80C MDV-1 (BAC19, BAC20 a BAC24).

• * < · · · ··· · · ···· • · · · ·· · « · · • ···· ··· • · ···· ···· ······· ·· ·· ·· ··

Příklad 3 Mutace BAC MDV-1

Pro mutaci DNA MDV-1 klonované v Escherichia coli byly provedeny reakce katalyzované recE podporující homologní rekombinaci mezi lineárními fragmenty DNA označované jako E/T klonování (Zhang a kol., 1998; Narayanan a kol., 1999). Plasmid pGETrec (laskavě poskytl Dr. Panoš Ioannou, Murdoch Institute, Melboume, Austrálie) nesoucí recE, recT a gam gen bakteriofága 1 byl transformován do buněk DH10B obsahujících BAC20 (Narayanan a kol., 1999). Po indukci recE, recT a gam přídavkem 0,2% arabinosy byly připraveny elektrokompetentní buňky, v podstatě již popsané (Narayanan). Aby byl deletován gB gen v BAC20, byl pomocí PCR amplifikován gen rezistence vůči kanamycinu (kan^R) plasmidu pEGFP-Nl (Clontech). Navržené primery obsahovaly 50 nukleotidová homologní ramena nesoucí požadovanou deleci v rámci gB a 20 nukleotidů pro amplifikaci kan^R (tab.l). Vzniklý fragment o velikosti 1,6 kbp byl z agarosového gelu přečištěn (Qiagen) a elektroporací vpraven do buněk BAC20 obsahujících pGETrec. Kolonie nesoucí geny cam^R a kan^R byly identifikovány na miskách obsahujících obě antibiotika (Narayanan a kol., 1999).

Příklad 4 DNA analýzy

BAC nebo virová 584Ap80C DNA byla naštěpena pomocí EcoRl, BamHI, Bglll nebo Stul a byla separována v 0,8% agarosových gelech. DNA fragmenty byly přeneseny na kladně nabité nylonové membrány (Pharmacia-Amersham) a pomocí digoxigeninem značené DNA BAC 19 nebo pomocí jednotlivých RazwHI fragmentů MDV-1 kmen GA byla provedena hybridizace Southern blotem (Fukuchi a kol., 1991; Osterrieder, 1999).

Kromě toho byla pro analýzu gB-negativní BAC MDV-1 připravena gB-specifická proba z plasmidu pcgB a proba nesoucí gen kan^R. Byla provedena detekce DNA hybridů chemiluminiscenčně pomocí CSPD™ podle návodů výrobce (Roche Biochemicals).

Příklad 5 Nepřímá imunofluorescence

Pro analýzu nepřímou imunofluorescencí (IIF) byly buňky kultivovány v 6 nebo 24 jamkových destičkách (Greiner) nebo na skleněných deskách a poté byly infikovány. Buňky byly fixovány 90% acetonem v různých časech po infekci nebo transfekci a IIF byla provedena přesně tak jak je popsáno (Meindl a Osterrieder, 1999). Vzorky byly analyzovány

4 · Φ · · · * »··· • * · · · · • · · « · · · • · · · · ·· · • · · · ·· · · fluorescenční mikroskopií nebo konfokální laserovou mikroskopií (CLSM). Protilátky, které byly použity, byly anti-gB mab 2K11, anti-pp38 mab H19 (laskavě poskytla Dr. Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) nebo ozdravné sérum z kuřete infikovaného MDV-1 (MSDI).

Příklad 6 Konstrukce a analýza BAC obsahujících kompletní genomy MDV-1

Jeden milion primárních CEF byl infikován lxlO⁴ p.f.u. kmene MDV-1, tzn. infikované buňky byly smíchány s buňkami neinfíkovánými. Poté, co došlo k úplnému cytopatickému efektu, byla z infikovaných buněk připravena DNA. 2 pg virové DNA byly transfekovány do lxlO⁶ primárních buněk CEF spolu s 10 pg DNA plasmidu pDS-pHAl. Pět dnů po transfekci byly buňky spolu s čerstvými CEF buňkami naneseny a převrstveny selekčním mediem.

Tento postup byl proveden celkem 4 krát. Nakonec byla z rekombinantního MDV-1, který byl schopen růst v přítomnosti MPA/xanthin/hypoxanthinu, izolována DNA a byla podrobena analýze Southern blotem pomocí značeného pHAl jako proby. Bylo by možné ukázat, že část virové DNA obsahovala inzertované sekvence F plasmidu (data však nejsou uvedena). Jeden mikrogram této virové DNA byl použit pro transformaci buněk Escherichia coli DH10B. Transformované bakterie byl rozetřeny na agar obsahující 30 pg/ml chloramfenikolu a jednotlivé kolonie byly sklizeny. DNA bakteriálních kolonií byla extrahována standardními postupy pro přípravu plasmidů (Sambrook a kol., 1989) a byla separována v 0,8% agarosových gelech.

U několika bakteriálních kolonií bylo zjištěno, že obsahují vysokomolekulámí extrachromozomální DNA a pro další analýzu byly vybrány 3 klony (BAC 19, BAC20 a BAC24) (obr. 2). Pro další charakterizaci izolovaných klonů BAC byla provedena analýza Southern blotem 584Ap80C a BAC DNA po štěpení 5amHI nebo £coRI se značenou DNA BAC19 jako probou. Je možno uvést, že po srovnání s DNA rodičovského 584Ap80C vykazovala DNA BAC 19, BAC20 a BAC24 téměř identický profil fragmentů vzniklých štěpením restrikčními enzymy (obr. 3A a B). Byly však rozpoznány dvě zřetelné výjimky. BamHl-A. fragment o velikosti 20 kbp přítomný v DNA 584Ap80C nebyl přítomen v žádném analyzovaném BAC klonu. Místo toho byly v DNA BAC19, BAC20 a BAC24 detekovány fragmenty o velikosti 16 a 10 kbp (obr. 3B). Tyto dva proužky reprezentovaly zvětšený 5az«HI-A fragment, v němž v důsledku inzerce F plasmidu a delece Us2 sekvencí vzniklo další Bamiíl místo (obr. 1).

« * · »« «·« • © · · · · * · · · * • · · · « ····««· ·« « «

V DNA BAC naštěpené EcoRI byl zjištěn jeden další proužek odpovídající velikosti 5,8 kbp (BAC sekvence) a minoritní změny velikosti fragmentů způsobené deleci genu Us2 (obr. 1 a 3B). Správné začlenění sekvencí BAC do různých klonů bylo dále analyzováno prostřednictvím hybridizací Southern blotem s použitím značených inzertů plasmidu pDS nebo pHAl jako proby a byl zjištěn očekávaný reakční profil u RazziHI nebo EcoRl naštěpené DNA. U BamHI naštěpených DNA BAC reagovaly BamHI fragmenty o velikosti 16 a 10 kbp specificky s pDS probou, zatímco pouze fragment o velikosti 10 kbp reagoval s probou pocházející z plasmidu pHAl (obr. 1; obr. 3C a D).

U DNA BAC 19, BAC20 nebo BAC24 naštěpených EcoRI reagovaly fragmenty o velikosti 4,3, 2,8 a 1,7 kbp specificky s pDS probou, zatímco fragmenty o velikosti 5,8 a 1,7 kbp specificky hybridizovaly s pHAl probou (obr. 1., obr. 3C a D). Tyto fragmenty přesně odpovídaly těm, které byly předpovězeny po inzertování pHAl sekvencí (obr. 1). Byl učiněn závěr, že sekvence F plasmidu byly správně začleněny místo Us2 ORF u všech analyzovaných BAC MDV-1. Kromě toho byly zjištěny určité variace v profilech BAC 19, BAC20 a BAC24 a to buď u DNA naštěpené BamHI nebo EcoRI např. další proužek odpovídající velikosti přibližně 6,2 kbp u DNA BAC 19 naštěpené RozmHI nebo další proužky u DNA BAC20 a BAC24 naštěpené EcoRI (obr. 2, 3A a B). Za účelem zaměření se na otázku pozorovaných variací ve velikosti jednotlivých restrikčními enzymy naštěpených fragmentů byla provedena hybridizace se značeným EowHI-D fragmentem, protože variace ve velikosti u terminálních a vnitřních repeticí jednoznačně dlouhé oblasti (TRL a IRL) jsou běžné.

Pomocí Southern blotu bylo ukázáno, že další fragmenty zjištěné u DNA BAC19, BAC20 nebo BAC24 naštěpené buď Εα/wHI nebo EcoRI jsou jistě výsledkem variací v TRL a IRL. Zatímco při použití RomHI-D proby byly ve virové DNA 584Ap80C naštěpené BamHI detekovány dvě široké skvrny, které odpovídaly velikosti v rozmezí přibližně 9 až 15 kbp a 4 až 8 kbp (odpovídající EozwHI-D a -H fragmentům virulentního MDV-1, obr. 1), u všech analyzovaných klonů BAC byly pozorovány zřetelné ale různé proužky (obr. 4). Všechny ostatní fragmenty různých BAC klonů naštěpené restrikčními enzymy se jevily jako totožné s fragmenty virové DNA 584Ap80C. Toto bylo potvrzeno pomocí několika dalších značených Eo/wHI fragmentů jako prob, včetně Eo/wHI-A, -B, -C a -L fragmentů (data pro probu EowHI-C jsou uvedena jako příklad na obr. 4).

» « ··* • * · · » « · «· , • O··· · 9 « >

«··· »· ·« «< ·«

Příklad 7 Rekonstituce infekčního MDV-1 z klonované DNA

DNA BAC 19, BAC20 nebo BAC24 byla transfekována do primární CEF. 3 až 7 dní po transfekci se objevily plaky specifické pro MDV-1 virus, což je demonstrováno pomocí IIF s použitím anti-MDV-1 gB mab. MDV-1 zachráněný po transfekci různých BAC byl poté spolu s čerstvými CEF kultivován a velikosti plaků byly porovnávány s plaky indukovanými rodičovským 584Ap80C. Jak je uvedeno například pro plaky fixované v den 2 p.i., nebyly detekovány žádné významné rozdíly velikosti plaku mezi rekombinantními a rodičovskými viry (obr. 5A).

Za účelem další charakterizace biologických vlastností MDV-1 získaného po transfekci BAC byly porovnávány růstové kinetiky těchto virů s rodičovským 584Ap80C. V případě BAC byl pro infikování čerstvých CEF buněk umístěných do destiček se 6 jamkami použit virus získaný v 5. den po transfekci (50 p.f.u. viru bylo použito k infekci jedné jamky obsahující lxlO⁶ buněk). Stejným způsobem bylo použito 50 p.f.u. 584Ap80C k infikování čerstvých CEF. V různých časech p.i. byl virus odebrán a titrován prostřednictvím zaočkování 10 násobného ředění viru do čerstvých CEF buněk. Výsledky těchto experimentů jsou shrnuty na obr. 5B.

Je možno říci, že všechny testované BAC MDV-1 vykazovaly růstové charakteristiky, které byly téměř identické s charakteristikami rodičovského 584Ap80C (obr. 5B). Maximálních titrů bylo dosaženo 72 h p.i. a zůstaly prakticky stejné po celou dobu sledování tj. do 120 h p.i. Na základě velikosti plaků a růstových charakteristik jsme učinily závěr, že biologické vlastnosti BAC MDV-1 in vitro byly prakticky nerozeznatelné od vlastností rodičovského kmene.

Aby byla zjištěna stabilita virů pocházejících z BAC, bylo potomstvo transfekci BAC BAC 19 a BAC20 čtyřikrát pasážováno a byla připravena virová DNA. Virová DNA byla naštěpena ŘaznHI nebo EcoRl, byla separována elektroforézou v 0,8% agarose a přenesena na nylonové membrány. Byla provedena hybrídizace pomocí pDS nebo pHAl proby. Byly zjištěny podobné DNA fragmenty, jako byly popsány výše a profil se s postupným pasážováním transfekovaného potomstva neměnil, což bylo analyzováno pomocí dvou prob (obr. 6). Z těchto výsledků jsme učinili závěr, že sekvence odvozené od F plasmidu zůstaly stabilně inzertované do genomů 584Ap80C získaných z jednotlivých klonů BAC MDV-1 a to i po sériovém pasážování v CEF buňkách.

Avšak jak ukázala hybrídizace s 2?a/nHI-D fragmentem a PCR, byla variabilita opakujících se sekvencí o velikosti 132 bp obnovena a u DNA transfekovaného potomstva naštěpené Barníll nebo EcoRI byla pozorována difúzní skvrna reaktivních proužků a to vždy po prvním pasážování viru (data nejsou uvedena).

Příklad 8 Mutace BAC20 a delece sekvencí kódujících gB

V dalších experimentech byl aplikován postup mutace BAC, který byl nedávno objeven. Cílem bylo odstranit 2,3 kbp z 2,8 kbp velkého gB genu BAC20 (obr. 7). Po transformování plasmidu pGETrec (Narayanan) do DH10B obsahující BAC20 byl gen kan^R amplifikován s příměry, které umožnily homologní rekombinaci se sekvencemi gB MDV-1 (tab. 1; obr. 8) a elektroporací byl vpraven do buněk BAC20-pGETrec. Bakterie byly rozetřeny na LB agar obsahující chloramfenikol a kanamycin a byly vybrány ty kolonie, které vykazovaly dvojnásobnou rezistenci. Po izolaci DNA jednotlivých kolonií byla provedena analýza rekombinantní BAC20 nesoucí deleci v gB genu (20DgB) Southern blotem. Proba specifická pro kan^R a gB detekovala fragmenty 20DgB po štěpení EcoRI, BgUl nebo

S/wI, které se shodovaly s fragmenty, které byly vypočítány po inzerci genu rezistence vůči kan^R do sekvencí kódujících gB (obr. 9). Bylo zjištěno, že - jak bylo uvedeno již drive pGETrec, který nese rezistenci vůči ampicilinu, byl snadno z buněk Escherichia coli, které byly kultivovány v nepřítomnosti antibiotika, ztracen (obr. 9). Z těchto výsledků jsme učinili závěr, že otevřený čtecí rámec gB byl vždy z 20DgB zcela odstraněn.

Příklad 9 Analýza gB-negativního MDV-1 rekonstituovaného z 20 DgB

Protože gB je nepostradatelný pro růst všech herpesvirů, které byly do současné doby analyzovány (shrnuto Pereirou), byla vytvořena buněčná linie QM7, která exprimovala gB MDV-1 pod kontrolou brzkého raného promotoru HCMV. Metoda nepřímé imunofluorescence ukázala, že téměř každá buňka buněčné linie MgBl podstatně exprimuje gB MDV-1, což je ukázáno pomocí mab 2K11 nebo obnoveného kuřecího séra (MDSI) (obr. 10). Aby mohl být analyzován růst BAC20 a 20DgB v různých buněčných liniích, byla připravena DNA a byla použita pro transfekci buněk CEF, QM7 nebo MgBl. 3 až 5 dní po transfekci byly ve všech buňkách transfekovaných BAC20 pozorovány plaky odpovídající viru (obr. 10).

Avšak po transfekci DNA 20DgB byly plaky pozorovány pouze u buněk MgBl exprimujících gB (obr. 11). U CEF a QM7 buněk transfekovaných 20DgB exprimovaly jednotlivé buňky brzký pp38 gen, což je ukázáno prostřednictvím reaktivity s mab H19 (Lee • · · a kol.\ ale tvorba plaků byla inhibována (obr. 11). Tyto výsledky toho, že gB je nepostradatelný pro rozšíření MDV-1 z buňky na buňku in vitro, byly potvrzeny současným zaočkováním buněk MgBl infikovaných 20 DgB a CEF, QM7 nebo čerstvých MgBl buněk. Jak bylo patrné po primární transfekci, byla tvorba plaků pozorována pouze po zaočkování buněk exprimujících gB (tab. 2). Na základě těchto výsledků jsme učinili závěr, že gB MDV-1 je nezbytně vyžadován pro rozšíření MDV-1 z buňky na buňku v kultivovaných buňkách.

Ačkoliv je virus Markovy choroby významným patogenem kuřat, který u infikovaných zvířat způsobuje nádory T buněk a vysokou úmrtnost, o funkci jednotlivých genů a o produktech genů v lytické, latentní nebo nádorové fázi infekce je známo velmi málo. Analýza genů MDV-1 a produktů genu byla velmi narušena dvěma hlavními důvody. Za prvé kultivované buňky infikované MDV-1 nevedou ke zisku volných infekčních virů a za druhé účinný růst MDV-1 v kultivovaných buňkách je omezen na primární nebo sekundární fibroblasty kuřecího embrya.

Proto je tedy mutace používající běžnou homologní rekombinaci k mutaci jiných Alphaherpesvirinae pracná, časově náročná a vyžaduje neustálý přísun primárních buněk. Zatímco mutace HSV a PrV je zajisté technologií BAC usnadňována, běžná mutace, která spoléhá na homologní rekombinaci v eukaryotických buňkách, představuje pro tyto dva viry standardní techniku a bylo vytvořeno mnoho mutantních virů. Naopak pro mutaci MDV-1 je BAC klonování a mutageneze hlavní předností. Jakmile je genom MDV-1 klonován jako BAC a může být tedy stabilně uchováván v Escherichia coli, mělo by být vytvoření mutantů a analýzy nepostradatelných genů relativně snadné. Fakticky je možné klonovat kompletní genom kmene 584Ap80C jakožto infekční BAC. Kmen 584Ap80C je potomstvem velmi virulentního plus (vv+) MDV-1 kmene 584A po 80 následných pasážích na buňkách CEF (Witter, 1997). Analýza klonovaných genomů MDV-1 přítomných v BAC 19, BAC20 a BAC24 ukázala, že variace v profilech působení restrikčních enzymů byly zřetelné.

Tato heterogenita může být připisována variacím v 5awHI-D a -H fragmentech. Je známo, že v různých kmenech MDV-1 je přítomen různý počet 132 bp tandemových repeticí a že se tento počet repeticí po sériovém pasážování v kultivovaných buňkách zvyšuje (Maotani, Silva, Fukuchi). Kromě toho počet tandemových 132-bp repeticí byl spojen se ztrátou onkogenicity, protože u virulentních kmenů byl prokázán konstantní počet těchto jednotek (Fukuchi a kol., 1985; Bradley a kol., 1989), ačkoliv nedávné práce na rozsáhle používaných očkovacích kmenech Rispens CVI 988 ukázaly, že by nemusel existovat přímý vztah mezi malým počtem 132-bp repeticí a virulencí. V případě kmene MDV-1 584Ap80C vedla hybridizace virové DNA naštěpené restrikčními enzymy s fragmentem 5íz/mHI-D ke zisku difuzního profilu proužků, což naznačovalo různý počet repeticí přítomných ve virové populaci. Naopak pouze jednotlivé velmi reaktivní proužky byly identifikovány v každém klonu BAC se stejnou probou. Avšak velikosti reaktivních proužků po štěpení BamHI nebo £coRI se u BAC 19, BAC20 a BAC24 lišily, což naznačovalo, že byly klonovány genomy obsahující různý počet 132-bp repeticí. Tato interpretace byla prokázána pomocí PCR zacílené na 132-bp repetice. Protože byl u DNA 584Ap80C (Becker a kol., 1993) získán typický žebříku podobný obraz PCR produktů, byly v případě BAC 19, BAC20 nebo BAC24 jednotlivé proužky amplifikovány z klonované virové DNA.

Proto byl tedy učiněn závěr, že různé profily štěpeni různých klonů BAC restrikčními enzymy jsou výsledkem různých počtů tandemových 132-bp repeticí přítomných v jednotlivých klonech, které neovlivnily infekčnost klonované DNA, protože infekční virus byl získán po transfekci DNA izolované z každého různého BAC klonu.

Po klonování kompletního genomu MDV-1 a po prokázání infekčnosti klonované DNA MDV-1, byl použit nedávno vyvinutý systém mutace, ve kterém může být lineární DNA fragment rekombinován do DNA v bakterii a který je katalyzován recE (Narayanan, Muyrers), k deleci sekvence BAC20 kódující gB. Mutace je založena na recE, recT a recB/C supresorovém λ gam genu přítomném v plasmidů pGETrec (Narayanan a kol., 1999).

Velkými přednostmi systému, který byl poprvé použit k manipulaci virového genomu, jsou (i) že k tomu, aby byla zacílena specifická sekvence, která má být deletována, jsou potřeba homologní ramena pouze o 30 až 50 bp, tzn. delece jakéhokoliv otevřeného čtecího rámce je možno dosáhnout bez toho, aby byly klonovány rekombinační kazety, (ii) způsob je velmi rychlý a (iii) že vektor pGETrec propůjčený mutaci a exprimující resistenci vůči ampicilinu je v nepřítomnosti ampicilinu z bakteriálních buněk rychle ztracen. Po elektroporací produktu PCR bez gB do buněk BAC20 obsahujících pGETrec bylo získáno 10 až 30 kolonií cam^R a kan^R dvojnásobně rezistentních. Jedna kolonie byla označena jako 20DgB-l a byla vybrána pro další analýzy, protože ztratila pGETrec bezprostředně po nanesení na agar obsahující chloramfenikol a kanamycin.

Analýzy Southern blotem ukázaly úspěšnou deleci genu gB a inzertování genu kan^R do 20DgB-l. MDV-1 získaný po transfekci buněk CEF s 20DgB-l nebyl schopen se rozšířit z infikovaných buněk do sousedních buněk, což naznačovalo, že gB MDV-1 stejně jako jejich analogy u jiných herpesvirů je nepostradatelný pro rozšíření infekčnosti z buňky na buňku. Protože MDV-1 je v kultivovaných buňkách vysoce vázaný na buňku a neuvolňuje infekční virus do kultivačního media, nebyli jsme schopni zjistit pravděpodobnou roli gB MDV-1 při vstupu viru. Vytvořený mutant gB představoval první příklad MDV-1 s delecí nepostradatelného genu a ukazuje sílu BAC klonování a mutačního systému, který je použitelný zejména v případě MDV-1. Pomocí BAC MDV-1 a permanentní linie buněk QM7, která umožňuje množení MDV-1 a která - na rozdíl od oslabené linie buněk fíbroblastů QT35 - nenese sekvence MDV-1 (Zelnik a kol., nepublikováno), představuje skvělou kombinaci jak důkladně analyzovat nepostradatelné geny MDV-1. Kromě toho srovnávací analýzy genových funkcí různých Alphasherpesvirinae mohou nyní zahrnovat MDV-1 a umožnit tím studie na velmi vzdáleně příbuzných jedincích jedné rodiny virů jako je N7N nebo BHV-4.

U klonovaných genomů, které jsou zde poskytovány, je pro virus, u něhož byly možnosti genetické manipulace velmi omezeny, poskytováno další podrobnější zhodnocení genů lytických, latentních a indukujících nádor.

Literatura:

1. Anderson, A.S., Parcells, M.S. a R.W.Morgan. 1998. The glycoprotein D (US6) homolog is not essential for oncogenicity or horizontál transmission of Marek's disease virus. J. Virol. 72: 2548 až 2553.

2. Becker, Y., E. Tábor, Y. Asher, I. Davidson, M. Malkinson a R.L. Witter. 1993. PCR detection of amplified 132 bp repeats in Marek's disease virus type 1 (MDV-1) DNA can serve as an indicator for critical genomic rearrangement leading to the attenuation of virus virulence. Virus genes T. 277 až 287.

3. Borst, E.M., G. Hahn, U.H. Koszinowski a M. Messerle. 1999. Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genom as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J. Virol. 73: 8320 až 8329.

4. Bradley, G., M. Hayashi, G. Lancz, A. Tanaka a M. Nonoyama. 1989. Structure of Marek 's Disease virus BamHI-H gene family: Genes of putative importance for tumor induction. J. Virol. 63: 2534 až 2542.

5. Bradley, G., G. Lancz, A. Tanaka a M. Nonoyama. 1989. Loss of Marek's disease virus tumorigenicity is associated with truncation of RNAs transcribed within BamHI-H. J. Virol. 63: 4129 až 4235.

6. Brune, W., C. Menard, U. Hobom, S. Odenbreit, M. Messerle a U.H. Koszinowski. 1999. Rapid Identification of essential and nonessential herpesvirus genes by direct transposon mutagenesis. Nat. Biotechnol. 1T. 360 až 364.

7. Brunovskis, P., a L.F. Velicer. 1995. The Marek's disease virus (MDV) unique short region: alphaherpesvirus-homologous, fowlpox virus-homologous, and MDV-specific genes. Virology 206: 324 až 338.

8. Cantello, J.L., A.S. Anderson, A. Francesconi a R.W. Morgan. 1991. Isolation of Marek's disease virus (MDV) recombinant containing the lacZ gene of Escherichia coli stably inserted within the MDV US2 gene. J. Virol. 65: 1584 až 1588.

9. Cui, Z.Z., D. Yan a L.F. Lee. 1990. Marek's disease virus gene clones encoding virusspecific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. Virus Genes 3: 309 až 322.

10. Delecluse, H.J., T. Hilsendegen, D. Pich, R. Zeidler a W. Hammerschmidt. 1998. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8245 až 8250.

11. Fuckuchi, K., M. Sudo, Y.S. Lee, A. Tanaka a M. Nonoyama. 1984. Structure of Marek's disease virus DNA: detailed restriction enzyme map. J. Virol. 51: 102 až 109.

12. Lee, L.F., P. Wu, D. Sui, D. Ren, J. Kamil, H.J. Kung a R.L. Witter. 2000. The complete unique long sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek's disease virus. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97: 6091 až 6096.

13. Maotani, K., K. Kanamori, K. Ikuta, S. Ueda, S. Kato a K. Hirai. 1986. Amplification of a tandem repeat within inverted repeats of Marek's disease virus DNA during seriál in vitro passage. J. Virol. 58: 657 až 659.

14. Meindl, A. a N. Osterrieder. 1999. The equine herpesvirus type 1 Us2 homolog encodes a nonessential membrane-associated virion component. J. Virol. 73: 3430 až 3437.

15. Messerle, Μ., I. Cmkovic, W. Hammerschmidt, H. Ziegler a U.H. Kozsinowski. 1997. Cloning and mutagenesis of herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 14759 až 14763.

16. Morgan, R.W., J.L. Cantello a C.H. McDermott. 1990. Transfection of chicken embryo fíbroblast with Marek's disease virus DNA. Avian Dis. 34: 345 až 351.

17. Muyrers, J.P., Y. Zhang, G. Těsta a A.F. Stewart. 1999. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27: 1555 až 1557.

18. Narayanan, K., R. Williamson, Y. Zhang, A.F. Stewart a P.A. Ioannou. 1999. Effícient and precise engineering of 200 kb beta-globin human/bacterial artificial chromosome in E. coli DH10B using an inducible homologous recombination systém. Gene Ther. 6: 442 až 447.

• · • ·

19. Osterrieder, Ν. 1999. Sequence and initial characterization of the UlIO (glycoprotein M) and Ul.11 homologous genes of serotype 1 Marek's Disease Virus. Arch. Virol. 144, 1853 až 1863.

20. Osterrieder, N., A. Neubauer, C. Brandmuller, B. Braun, O.-R. Kaaden a J.D. Baines. 1996. The equine herpesvirus type 1 glycoprotein gp21/22a, the herpes simplex virus type 1 gM-homolog, is involved in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. J. Virol 70: 4110-4115.

21. Parcells, M.S., A.S. Anderson, J.L. Cantello a R.W. Morgan. 1994. Characterization of Marek's disease virus insertion and deletion mutants that lack US1 (ICP22 homoiog), US 10, and/or US2 and neighboring short-component open reading fřames. J. Virol. 68: 8239 až 8253.

22. Parcells, M.S., A.S. Anderson a R.W. Morgan. 1994. Retention of oncogenicity by a Marek's disease virus mutant lacking six unique short region genes. J. Virol. 69: 7888 až 7898.

23. Parcells, M.S., A.S. Anderson a R.W. Morgan. 1994. Characterization of Marek's disease virus mutant containing a lacZ insertion in the US6 (gD) homologue gene. Virus Genes 9: 5 až 13.

24. Payne, L.N. 1985. Pathology. v: LN Payne (ed) Marek's Disease. Kluwer Academie Publishers, Hingham, MA, U.S.A., 43 až 76.

25. Pereira, L. 1994. Function of glycoprotein B homologues of the family herpesviridae. Infect. Agents Dis. 3: 9 až 28.

26. Ross, N.L.J., Binns, M.M. a J. Pastorek. 1991. DNA sequence and organization of genes in a 5.5 kbp EcoRI fragment mapping in the short unique segment of Marek's disease virus (strain RB1B). J. Gen. Virol. 72: 949 až 954.

27. Sakaguchi, Μ., T. Urakawa, Y. Hirayama, N. Miki, M. Yamamoto, G.S. Zhu a K. Hirai. 1993. Marek's disease virus protein kinase gene identified within the short unique region of the viral genome is not essential for viral replication in cell culture and vaccineinduced immunity in chickens. Virology 195: 140 až 148.

28. Sambrook, J., D.F. Fritsch a T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

29. Schat, K.A. 1985. Characteristics of the virus, v: LN Payne (ed) Marek's Disease. Kluwer Academie Publishers, Hingham, MA, U.S.A., 77 až 112.

• · · · · · · • ·

30. Schat, K.A., B.J. van Iddekinge, H. Boerrigter, P.H. O'Connell a G. Koch. 1998. Open reading frame LI of Marek's disease herpesvirus is not essential for in vitro and in vivo virus replication and establishment of latency. J. Gen. Virol. 79: 841 až 849.

31. Silva, R.F. a R.L. Witter. 1985. Genomic expansion of Marek's disease virus DNA is associated with seriál in vitro passage. J. Virol. 54: 690 až 696.

32. Smith G.A. a L.W. Enquist. 1999. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-lenght infectious cloně of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J. Virol. 73: 6405 až 6414.

33. Smith, G.A. a L.W.Enquist. 2000. A self-recombining bacterial artificial chromosome and its application for analysis of herpesvirus pathogenesis. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97: 4873 až 4878.

34. Suter, Μ., A.M. Lew, P. Grob, G.J. Adema, M. Ackermann, K. Shortman a C. Fraefel. 1999. BAC-VAC, a novel generation of (DNA) vaccines: A bacterial artificial chromosome (BAC) containing a replication-competent, packaging-defective virus genome induces protective immunity against herpes simplex virus 1. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96: 12697 až 12702.

35. van Iddekinge, B.J., L. Stenzler, K.A. Schat, H. Boerrigter a G. Koch. 1999. Genome analysis of Marek's disease virus strain CVI-988: effect of cell culture passage on the inverted repeat regions. Avian. Dis. 43: 182 až 188.

36. van Regenmortel, M.H.V., C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop, E. Carstens, M.K. Estes, S. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D. McGeoch, C.R. Pringle a R.B. Wickner (eds.). 1999. Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academie Press, New York, San Diego.

37. Wagner, M., S. Jonjic, U.H. Kozsinowski a M. Messerle. 1999. Systematic excision of vector sequences from the BAC-cloned herpesvirus genome during virus reconstitution. J. Virol. 73: 7056 až 7060.

38. Witter, R.L. 1985. Principles of vaccination. v: L.N. Payne (ed.): Marek's Disease. Kluwer Academie Publishers, Hingham, MA, U.S.A., 203 až 250.

39. Witter, R.L. 1997. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. Avian Dis. 41: 149 až 163.

40. Witter, R.L., J.M. Sharma a A.M. Fadly. 1980. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolants in vaccinated and unvaccinated chickens. Avian Dis. 24: 210 až 232.

41. Zhang, Y., F. Buchholz, J.P. Muyrers a A.F. Stewart. 1998. A new log for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nátuře Genet. 20: 123 až 128.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY /

   1. Vakcína proti infekci způsobené herpesvirem, který je v podstatě vázaný na buňku, vyznačující se t í m, že obsahuje rekombinantni genom pocházející ze zmíněného herpesviru, přičemž zmíněný genom umožňuje rekombinaci v podstatě bez hostitelské buňky
2. 2. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, že zmíněný genom obsahuje funkční delece v genu nepostradatelném pro replikaci v hostitelské buňce a/nebo pro šíření zmíněného herpesviru z hostitelské buňky.
3. 3. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zmíněný genom alespoň obsahuje nukleovou kyselinu kódující antigenní látku, která je schopna vyvolat imunitní odezvu na infekci jedince zmíněným herpesvirem.
4. 4. Vakcína podle nároku laž 3, vyznačující se tím, že zmíněný genom obsahuje funkční deleci v genu, který je nepostradatelný pro vyvolání určité imunitní odezvy specifické pro zmíněný herpesvirus umožňující rozlišení mezi jedincem očkovaným zmíněnou vakcínou a jedincem infikovaným zmíněným herpesvirem, který je v podstatě vázaný na buňku.
5. 5. Vakcína podle jakéhokoliv nároku 1 až 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že zmíněný genom alespoň obsahuje nukleovou kyselinu kódující bílkovinnou látku, která je schopna regulovat transkripci a/nebo translaci nukleové kyseliny kódující antigenní látku schopnou vyvolat imunitní odezvu na infekci jedince zmíněným herpesvirem.
6. 6. Vakcína podle jakéhokoliv nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že zmíněný genom obsahuje téměř stejně dlouhou kopii pocházející ze zmíněného herpesviru.
7. 7. Vakcína podle jakéhokoliv výše uvedeného nároku, vyznačující se t í m, že dále poskytuje nukleovou kyselinu alespoň kódující antigenní látku dalšího pathogenu.
8. 8. Vakcína podle jakéhokoliv výše uvedeného nároku, vyznačující se t í m, že zmíněný herpevirus obsahuje virus Markovy choroby.

   • · · · · · ···· »······ ·· · * ·· · ·
9. 9. Vakcína podle nároku 8, vyznačující se tím, že zmíněný virus Markovy choroby zahrnuje sérotyp 1.
10. 10. Vakcína podle nároku 8 nebo 9, v y z n a č u j í c í se t i m, že zmíněný virus Markovy choroby pochází z virulentního, velmi virulentního nebo velmi virulentního plus oblastního viru.
11. 11. Rekombinantní virový genom, vyznačující se tím, že pochází z herpesviru, který je v podstatě vázaný na buňku, přičemž zmíněný genom umožňuje rekombinaci v podstatě bez zmíněné hostitelské buňky.
12. 12. Genom podle nároku 11,vyznačující se tím, že alespoň obsahuje replikativní minigenom.
13. 13. Genom podle nároku 11,vyznačující se tím, že zmíněný genom obsahuje v podstatě stejně dlouhou kopii, pocházející ze zmíněného herpesviru.
14. 14. Použití genomu podle jakéhokoliv nároku 11 až 13 pro přípravu vakcíny proti chorobě způsobené infekcí herpesvirem, který je v podstatě vázaný na buňku.
15. 15. Způsob omezení rizik vzniku nebo plného projevení se choroby způsobené infekcí herpesvirem, který je v podstatě vázaný na buňku u jedince, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání vakcíny podle jakéhokoliv nároku 1 až 10 nebo genomu podle jakéhokoliv nároku 11 až 13 zmíněnému jedinci.
16. 16. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že zmíněným jedincem je pták.