CZ20033480A3 - Preparáty lipid-polymerových konjugátů - Google Patents

Description

PREPARÁTY LIPID-POLYMEROVÝCH KONJUGÁTŮ

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká koloidně nosičových preparátů obsahujících aktivní složku a lipid-polymerový konjugát.

Dosavadní stav techniky

Koloidní nosičové preparáty zahrnují vesikulární dvojvrstvenné systémy, jako jsou například lipozómy, niozómy a reverzní vezikuly, micelární systémy, nanokapsle, nanosféry atd. Dobře známý příklad takových koloidních nosičových preparátů je tvořen lipozómy. Ačkoli zde jsou obzvláště zmíněny lipozómy, čtenář by si měl být vědom, že diskuse, uvádění a vysvětlení se týkají také dalších koloidních nosičových preparátů.

Lipozómy, které patří do skupiny koloidních nosičových částic, jsou malé vezikuly složené z jedné nebo více koncentrických lipidóvých dvojvrstvev obklopujících vodný prostor. Pro svoji strukturální mnohostrannost, co se týká velikosti, povrchového náboje, složení lipidů, fluidity dvojvrstvy a pro svoji schopnost enkapsulovat téměř každý lék, byl očekáván jejich význam pro transportní systémy léků. Avšak po intravenózním injekčním podání lipozómů jsou lipozómy rozpoznávány Mononukleárním Fagocytárním Systémem (MPS) jako cizí částice a rychle odstraněny z cirkulace k orgánům bohatým na fagocytární buňky, jako jsou játra, slezina a kostní dřeň. Bylo identifikováno několik možností ke snížení tohoto účinku, jako jsou například sníženi velikosti částic lipozómů a změna povrchového náboje lipozómů. Další vývoj se týká povrchové modifikace lipozómů začleněním specifických hydrofilních polymerních složek na lipozomální povrch, kteréžto skupiny snižují adsorpci bílkovin na povrch částice. Následně jsou takové lipozómy chráněny proti rozpoznání buňkami MPS a mají prodloužený residenční čas v systémové cirkulaci. Dobře známý příklad modifikace lipozomálního povrchu je začlenění lipidového derivátu hydrofilního polymeru

polyetylén glykolu (PEG) během přípravy liposomálních preparátů. Obvykle tento polymer je terminálně modifikován hydrofobní skupinou, která je reziduem fosfatidyl etanolaminového derivátu nebo mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Polyetylén glykol jako takový je dosti stabilní polymer, který zabraňuje adhezi bílkovin, a který nepodléhá enzymatické nebo hydrolytické degradaci za fyziologických podmínek. Dobré výsledky s ohledem na prodloužení plazmatického poločasu a zmenšení akumulace v orgánech bohatých na fagocytární buňky byly získány po intravenózním podání lipozómů, majících na povrchu PEG různým živočichům a také lidským jedincům (Storm G., Belliot S.O., Daemen T. a Lasic D.D. : Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by mononuclear phagocyte systém v Adv. Drug Delivery Rev. 17, 31-48, (1995);

Moghimi S.M., Hunter A.C. a Murray J.C.: Long-circulating a targetspecific nanoparticles; theory to practice v Pharmacol. Rev. 53, 283-318, (2001); Boerman O.C., Dams E.T., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M. a Storm G. : Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation v Inflamm. Res. 50. 55-64, (2001)}.

Byly získány marketingové souhlasy pro lipozomální přípravky obsahující doxorubicin..

Mezitím bylo zjištěno několik nevýhod používání polymeru polyetylén glykolu u dlouho cirkujících lipozómů. Akumulace PEG-lipozómů v makrofázích a kůži má svůj význam, protože tyto lipozómy nejsou biodegradovány. Po druhé injekci PEG-lipozómů byla pozorována ztráta dlouho cirkulujících vlastností (rychlé odstranění) (Dams E.T., Laverman P., Oijen W.J., Storm G., Scherphof G.L., Van der Meer J.W., Corstens E.H. a Boerman O.C.: Accelerated blood clearance and altered biodistributiori of repeated injections of sterically stabilized liposomes v J, Pharmacol. Exp. Ther. 292. 1071-1079, (2000)). Nedávné studie s PEG-lipozómy u pacientů prokázaly, že PEG-lipozómy mohou indukovat akutní vedlejší účinky (zrudnutí obličeje, tlak na hrudi, zkrácení dechu, změny krevního tlaku), které mizí okamžitě po ukončení podání (infúzí) PEGlipozomového preparátu. Nedávná data ukazují na úlohu aktivace komplementu pro vyvolání vedlejších účinků (Szebeni J., Baranyi L., a Alving C.R.: Role of to Pegylated liposomal 10. 467-481, (2000)) .

Savay S., Lutz H., Jelezarova E., Hunger R complement activation v hypersensitivity doxorubicin (Doxil) v J. Liposome Res.

Komerčně dostupné přípravky na základě PEG-lipozómů jsou doposud vodné suspenzní přípravky. Je dobře známo, že poločas lipozomálních vodných suspenzních přípravků obecně a také PEG-lipozómů je dosti omezen. Je známo několik technik pro odstranění vehikula nebo pro kontinuální fázi takových přípravků, jako jsou například sprejové vysoušení, diafiltrace, rotační odpařování, atd. a přednostně lyofilizace. Nedávno byl navržen lyofilizační způsob, který zlepšil trvanlivost PEG-lipozómů obsahujících technetium chelatátor hydrazino nikotinamid (Laverman P., van Bloois L., Boerman O.C., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M. a Storm G.: Lyophilisation of Tc-99mHYNIC labelled PEG-liposomes v J. Liposome Res. 10(2&3), strana 117-129 (2000)), ale je vyžadován další výzkum výsledků a aplikovatelnosti této techniky pro lipozomální přípravky.

Nevýhody použití polyetylén glykolu vedly výzkumníky k hledání alternativních polymerů. Mnoho polymerů bylo navrženo jako vhodní kandidáti pro jejich derívatizaci s (vesikuly tvořícími) lipidy pro začlenění do lipozómů (viz např. EP-0688207). Bylo prokázáno, že hydrofilní ve vodě rozpustné polymery póly (vinylpyroiidon), póly (akryloylmorfolin), póly (2-(m)etyl-2-oxazolin, polyakrylamid a polyglycerol mají do určité míry prodloužený cirkulační čas lipozómů po intravenózním podání. Až dosud však takové lipidpolymerové konjugáty nebyly použity v komerčně dostupných lékových přípravcích, zejména protože nevykázaly žádné výhody oproti známým lipid-PEG konjugátům. Proto zde stale existuje potřeba nalézt polymer, který může být derivátizován s lipidem k umožnění začleněni do koloidních nosičových preparátů, jako jsou například lipozómy, kde takový polymer má dlouho cirkulující vlastnosti a navíc má výhody oproti PEG, jako je například biodegradovatelnost.

Popis vynálezu

Poskytnuty jsou koloidní nosičové preparáty, které obsahují aktivní látku a lipid-polymerový konjugát, který je možné získat z a« · amfifilního lipidu, složeného z alespoň jedné hydrofobní apolární skupiny a hydrofilní polární skupiny, polymeru nebo jeho monomerního prekursoru, kde polymerem je póly-(aminokyselina), póly-(aminokyselinový derivát) nebo póly-(aminokyselinový analog).

LEGENDA K OBRÁZKŮM

Obrázek 1 je grafickým zobrazením průměrných hodnot pro vypočtené procento injikované dávky ve vzorcích krve versus čas pro lipozomální přípravky obsahující PEG-DSPE mající odlišné množství celkových lipidů (příklad 25).

Obrázek 2 je grafickým zobrazením průměrných hodnot pro vypočtené procento injikované dávky ve vzorcích krve versus čas pro lipozomální přípravky obsahující PHEA-DODASuc mající odlišné množství celkových lipidů (příklad 25).

Obrázek 3 je grafickým zobrazením procenta enkapsulovaného prednisolon fosfátu v lipozomálních přípravcích obsahujících PEGDSPE a respektive PHEA-DODASuc versus čas (příklad 26).

Obrázek 4 je grafickým zobrazením koncentrace prednisolon fosfátu v lipozomálních přípravcích obsahujících PEG-DSPE a respektive PHEADODASuc v krvi versus čas (příklad 27).

Obrázek 5 je grafickým zobrazením skóre zánětu tlapky versus čas před a po jedné intravenózní injekci fyziologického roztoku a lipozómů obsahujících prednisolon fosfát (potažených PEG-DSPE a respective PHEA-DODASuc) (příklad 27).

Obrázek 6 je grafickým zobrazením procenta injikované dávky lipozómů nalezených v játrech, slezině a játrech+slezině po intravenózním podání lipozómů obsahujících jako lipid-polymerové konjugáty PEG-DSPE, PHEG-diaminobutan DODASuc, PHPG diaminobutan DODASuc, PHBG diaminobutan DODASuc a respective PHEA-DODASuc a konvenční lipozómy (BARE) (Příklad 24).

DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZU

Termín aktivní látka, jak je zde použit, má být rozuměn jako terapeuticky aktivní látka, biologicky aktivní látka, fyziologicky aktivní látka, profylaktická látka a diagnostická látka, zahrnující zobrazovací látky a radioaktivně značené sloučeniny, které mohou být zahrnuty do koloidních nosičových preparátů v množství dostatečném k získání požadovaného účinku. Tyto látky jsou užitečné pro člověka i zvířata. Příklady terapeuticky aktivních látek jsou kortikosteroidy, protinádorové látky, atd. Zobrazovací látky zahrnují sloučeniny v plynném stavu, jako jsou například kyslík, radioaktivně značené excipientní látky, jako jsou například Hcholesteryloleyléter. Podle předkládaného vynálezu nejsou aktivní látky chemicky navázané k amfifilním lipid-polymerovým konjugátům.

Amfifilní lipid-polymerové konjugáty v preparátech předkládaného vynálezu je možno získat z amfifilního lipidu a polymeru nebo jeho monomerního prekursoru.

Amfifilní lipidy, které mají být použity v lipid-polymerovém konjugátu podle vynálezu mohou být vybrány z celé řady syntetických nebo přirozeně se vyskytujících lipidů obsahujících alespoň jeden hydrofobní apolární konec a hydrofilní polární koncovou skupinu, jako jsou například lipidy tvořící vezikuly a membránové lipidy.

Důležitý rys amfifilního lipidu, která má být použit v lipidpolymerovém konjugátu je, že lipid obsahuje funkční skupinu na její polární koncové skupině vhodné pro kovalentní připojení k řetězci polymeru. Polární koncová skupina je například primární nebo sekundární aminová skupina, hydroxylová skupina, aldehydová skupina, halidová nebo karboxylová skupina. Hydrofobní část lipidu umožňuje začlenění lípid-polymerových konjugátů do dvojvrstvenné struktury, jako jsou například lipozómy a účinkuje jako kotva.

Příklady amfifilních lipidů jsou fosfolipídy, glykolipidy, ceramidy, cholesterol a deriváty, nasycené nebo částečně nenasycené, větvené nebo nevětvené Cg-Cso mono- nebo di-alkylaminy, •

« · · a * »

arylalkylaminy, cykloalkylaminy, alkanoly, nebo jejich alkanové kyseliny a anhydridy.

Specifičtěji jsou příklady vhodných fosfátidylcholin, fosfatidyletanolamin, sfingomyelin, stearylamin, myristylalkohol, kyselina.

aldehydy, karbohalidy amfifilních lipidů fosfatióylinositol, cholesterol a palmitová

Přednostní amfifilní lipid v lipid-polymerovém konjugátu je lipid mající dva hydrofobní řetězce, typicky alkylové řetězce, a polární koncovou skupinu, obsahující funkční skupinu, jak je popsáno výše. Fosfatidyletanolaminové deriváty a obzvláště distearyl fosfatidyletanolamin jsou takové přednostní fosfolipidy, protože obsahují reaktivní aminoskupinu.

Další přednostní amfifilní lipidy mají jako hydrofilní polární koncovou skupinu primární nebo sekundární amin a dvě nasycené nebo nenasycené Ce-Cso větvené nebo nevětvené hydrofobní apolární skupiny. Jejich příklady jsou sloučeniny obsahující 1heptadecyloktadecylamin a óistearylamin, takové jako distearylamin a N-sukcinyl-dioktadecylamin (DODASuc).

Poiymerní část iipid-polymerních konjugátů předkládaného vynálezu je tvořena póly-(aminokyselinou), póly-(aminokyselinovým derivátem) nebo póly-(aminokyselinovým analogem). Póly (aminokyselinový derivát) je polymer, který obsahuje aminokyselinové monomery, ke kterým jsou připojeny jeden nebo více substituentů. Jejich příkladem je póly(2-hydroxyetyl)-L-glutamin. Póly-(aminokyselinový analog), jak je zde uveden, je polymer, kde délka řetězce uhlíkových atomů aminokyselinových monomerů je snížena nebo prodloužena. Jejich příklady jsou póly(-homoserin) a póly (pentahomoserin).

Polymer je homo-polymer složený z monomerů, které jsou v průběhu polymexního řetězce stejné. Je také možné, že poiymerní část se skládá z blokových ko-polymerů vybraných ze skupiny složené z póly« · « · · · · «· (aminokyseliny), póly-(aminokyselinového derivátu) a poly(aminokyselinového analoga), nebo že polymerní část je tvořena sérií alternujících monomerů nebo kontrolovaným pořadím monomerů nébo náhodnou polymerizací vhodných monomerů vybraných ze skupiny složené z jedné nebo více aminokyselin, aminokyselinových derivátů a aminokyselinových analog. Polymery mohou být lineářní nebo větvené a zahrnují roubované polymery, ale přednostně jsou lineární.

Užitečné aminokyseliny jsou přirozeně se vyskytující a-amino kyseliny. Avšak také β-aminokyseliny stejně tak jako nonproteinové nebo nepřirozeně se vyskytující aminokyseliny se zdají být zajímavé. Mohou být použity L- i D-konfigurace aminokyselin a jejich derivátů. Je-li aminokyselinová sekvence polymeru v lipidpolymerovém konjugátu tvořena rezidui L-aminokyselin, bude výsledný polymer podléhat enzymatické degradaci. Na druhou stranu, je-li aminokyselinová sekvence polymeru v lipid-polymerovém konjugátu tohoto vynálezu tvořena D-aminokyselinami, bude výsledný polymer pravděpodobně stabilní vůči enzymům degradujícím peptidy. Mohou být použity také směsi L- a D-aminokyselin. Bereme-li v úvahu odlišné vlastnosti polymerů, může být povrchová modifikace koloidníčh nosičových částic, do kterých jsou začleněny lipid-polymerové konjugáty vynálezu, upravena selektivním použitím L- a/nebo D-formy výchozích materiálů pro přípravu konjugátů.

Důležitá vlastnost póly-(aminokyselin), póly-(aminokyselinových derivátů) a póly-(aminokyselinových analogů) sloučeniny, které jsou vhodné pro začlenění do lipid-polymerových konjugátů předkládaného vynálezu, je, že jsou rozpustné ve vodě (alespoň 1 část ve 100 částech vody, přednostně 1 část Ve 30 částech vody a nejpřednostněji 1 část v 10 částech vody nebo méně). Polymery mohou být také charakterizovány svým χ-parametrem ve vodě. Tento interakční parametr mezi polymerem-rozpouštědlem může být určen např. membránovou osmometrií. Polymery, které mohou být s výhodou použity v lipič-polymerních konjugátech podle tohoto vynálezu mají • « · χ-parametr <0.65, přednostně <0.5 ve vodě.

Další důležitý rys polymerů je, že neobsahují významné množství nabitých skupin ve (fyziologickém) pH-rozmezí 4-8. Přednostně neutrální aminokyselinové monomery nebo aminokyselinové analogové monomery jsou použity v přípravě polymerů nebo monomerů aminokyselinových derivátů, které jsou neutrální nebo byly neutralizovány. Jak se zdá, je dovoleno, aby nabité skupiny byly přítomny v nízkém procentu bez narušení dlouho cirkulačních vlastností koloidních nosičových preparátů podle předkládaného vynálezu. Jak bylo demonstrováno pro ko-polymery 2-hydroxyetyl-Lglutaminu a nabitých monomerů, může být dovoleno, aby pozitivně nabité skupiny byly přítomny ve větším procentu než negativně nabité skupiny.

Vhodnými monomery pro přípravu polymeru jsou mezi jiným alanin, threonin, valin, sarcosin, α-aminoadipová kyselina, deriváty α,γdiaminomáselné kyseliny, ornitín, glutamin a deriváty, zahrnující glutamovou kyselinu, asparagin a deriváty, zahrnující aspartovou kyselinu, lysinové deriváty, methionin a deriváty, serin, jeho deriváty a analoga s dalšími CH₂ skupinami, jako jsou například homoserin a pentahomoserin. Vhodné vedlejší skupiny zahrnují (Cx-C₄ alkyl, hydroxyalkyl, dihydroxyalkyl, kyselé amidy a arylové skupiny nebo jejich kombinace, za předpokladu, že polymer zůstává ve vodě rozpustný. Příklady těchto skupin jsou 2-hydroxyetyl, 3hydroxypropyl, 4-hydroxybutyl a 2,3-dihydroxypropyl. Polymery, které mohou být použity jsou např. póly(D,L-serin) (PDLS), poly(2hydroxyetyl)-D,L-glutamin (PDLHEG), póly(2-hydroxybutyl)-L-glutamin (PHBG) a kopolymer póly(HEG-ko-glutamóvá kyselina) 1% glutamové kyseliny (PHEG1%GA). Přednostní polymery jsou póly(D,L-glutamin) (PDLG), póly(D,L-asparagin) (PDLA) , póly(hydroxypropyl)-L-glutamin (PHPG), póly(2-hydroxypropyl)-L-glutamin (P2HPG) a kopolymery betaalaninu a 2-hydroxyetyl-L-glutaminu (PbAHEG), póly(HEG-kodimetylaminoetyl-glutaminu) obsahující 5 a 1% dimetylaminoetyl vedlejší skupiny (PHEG5%DG a PHEG1%DG). Přednostnější polymery jsou homopolymery póly-[N-(2-hydroxyetyl)-L-glutaminu] (PHEG), póly(2-

« * »♦ hydroxyetyl)-L-asparaginu (PHEAJ a póly(D,L-methioninesulfoxidu) (PDLMS).

Polymerový řetězec obsahuje mezi 5 a 500 monomerových podjednotek, přednostně mezi 20 a 100. Průměrná molekulová váha polymer se liší od 500 do 75000, přednostně od 2000 do 15000. Průměrná molekulová váha může být posouzena různými způsoby známými v oboru. V příkladech předkládané přihlášky byl odhad molekulové váhy učiněn na základě NMR údajů.

Pro přípravu lipid-polymerových konjugátů začleněných do preparátů předkládaného vynálezu byly použity přednostně způsoby, kde reaktivní skupiny ve vedlejším řetězci aminokyselinového monomeru byly chráněny před polymerizací a spojením s lipidem.

Lipid-polymeřové konjugáty mohou být připraveny podle způsobů známých v oboru. Dobře známý způsob přípravy polymerů aminokyselin zahrnuje polymerizací s otevřením kruhu odpovídající aminokyseliny N-kařboxy-anhydridu (NCA), volitelně zajištěnou jednou nebo více chránícími skupinami, iniciovanou nukleofily, jako jsou například (Ci-C₄) alkylové primární aminy. Další způsob získání lipidpolymerových konjugátů zahrnuje použití aminu s chráněnou funkční skupinou, například N-Boc-1,4-diaminobutanem, jako iniciátorem otevřeni kruhu NCA polymerizace. Ačkoli jsou v tomto procesu vyžadovány dva extra kroky, zejména deprotekce funkční skupiny a následně připojení k lipidu reaktivní skupinou, jsou lipidpolymerové konjugáty připravené tímto způsobem také vhodný pro inkorporaci do koloidních nosičových preparátů tohoto vynálezu.

Pokud je amfifilním lipidem C₈-C₅₀ větvený nebo nevětvený mono- nebo di-alkyl, -hydroxyalkyl nebo -alkylenamin, alkanol nebo ceramid, může být tento lipid s výhodou použit jako iniciátor v procesu polymerizace s otevřením kruhu. Toto znamená, že během polymerizace je amfifilní lipid připojen k polymeru v jednom kroku. Molekulová váha póly-aminokyseliny silně závisí na rozpouštědle nebo kombinaci rozpouštědel, na čistotě použitých chemikálií a na poměru • · • · · • ·♦·· monomeru/polymerizačního iniciátoru. Obecně vzato, čím je vyšší poměr monomeru/polymerizačního iniciátoru, tím vyšší bude molekulová váha polymeru.

Měl-li by být připraven polymer předdefinovaného preparátu, je přednostně použit způsob syntézy peptidů na pevné fázi.

Chránící skupiny přítomné v opakujících se jednotkách polymeru mohou být odstraněny aminolýzou za použití amino-alkoholů, jako jsou například 2-aminoetanol, 3-aminopropanol nebo 2,3dihydroxypropylamln.

Například příprava PHEG se začleněnou stearylaminovou koncovou skupinou (odtud nazývána jako PHEG-stearylamin) se sestává pouze z následujících kroků: N-karboxyanhydrid γ-benzyl-L-glutamátu (BLG) byl polymerizován přidáním stearylaminu ve vhodném rozpouštědlu a výsledný polyBLG-stearylamin byl zkonvertován na PHEG-stearylamin následnou aminolýzou za použití 2-aminoetanolu. Za použití stearylaminu jako iniciátoru ve dvou odlišných rozpouštědlech byly získány dvě šarže PBLG-stearylaminu s odlišnou molekulovou vahou, které po aminolýze vedly k získání dvou šarží PHEG-stearylaminu s 2 odlišnými molekulovými váhami. První polymerizace v etylacetátu/ dichlorometanu vedla k získání PHEG-stearylaminu s molekulovou váhou 6,000 až 9,000. Druhá polymerizace v dimetylformamidu vedla k získání PHEG-stearylaminu s molekulovou váhou 2000 až 3500.

Koloidní nosičové preparáty vynálezu zahrnují vesikulární dvojvrstvenné systémy, jako jsou například lipozómy, niozómy a reverzní vezikuly, micelární systémy, nanokapsle, nanosféry, atd. Přednostní koloidní nosičové systémy jsou vezikulární dvojvrstvenné systémy.

Při přípravě lipozómů je lipid-polymerový konjugát podle vynálezu smíšen se složkami normálně použitých v přípravku lipozómů, jako jsou například vehikuly tvořící lipidy, stabilizační látky, atd. Konjugát je začleněn v molární koncentraci dostatečné

k několikanásobnému přesáhnutí cirkulačního času lipozómů v krvi v porovnání s odpovídajícími lipozómy postrádajícími polymerlipidový konjugát. Polymerový konjugát je typicky začleněn v 1-15 molárním procentu, přednostně 3-10 molárním procentu, a nejpřednostněji v 5-7.5 molárním procentu.

Průměrná velikost lipozómů, která může být určena technikou Dynamic Light Scattering (DLS), je pod 200 nm, přednostně pod 150 nm a nejpřednostněji pod 100 nm. Spodní limit pro tento typ koloidních nosičových částic je 20 nm.

Polymer-lipidové konjugáty, jsou-li začleněny do nabitých lipozómů, vykazují schopnost snižovat zeta-potenciál, což demonstruje, že polymerové roubování chrání povrchový náboj.

Preparáty mohou být podávány několika způsoby, ale parenterální podávání je přednostní. V závislosti na aktivní složce a na lékařské indikaci nebo onemocnění, které má být léčeno, může být podání intravenózní, subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální, intra-artikulární, atd. injekcí.

Po intravenózním podání lipozomálních přípravků ve shodě s předkládaným vynálezem potkanům bylo prokázáno, že cirkulační čas v krvi lipozómů se může lišit ve shodě s požadovaným účelem. Cirkulační čas v krvi je závislý na použitém lipid-polymerovém konjugátu, obzvláště na volbě kombinace lipid/polymer, molekulové váze polymeru a denzitě roubů. Výsledky podobné výsledkům získaným s odpovídajícími PEG-roubovanými lipozómy byly pozorovány např. pro lipid-PHEG-konjugáty, 1ipid-PHEA-konjugáty a lipid-PDLMS-konjugáty, kde amfifilní lipid obsahuje dvojitě hydrofobní konec (PHEGdiaminobutan DODASuc, PHEA-DODASuC a PDLMS-DODASuc).

Stabilita lipozomálních přípravků připravených s lipid-polymerovými konjugáty ve shodě s předkládaným vynálezem je obecně zlepšena ve srovnání s konvenčními lipozomálními přípravky. Navíc k tomu může být stabilita lipozomálních přípravků dále zlepšena správným výběrem lipid-polymerového konjugátu. Bude oceněno, že tento výběr je také závislý na volbě aktivní látky. Například enkapsulace ve vodě rozpustného derivátu kortikosteroidů místo kortikosteroidů jako takového do lipozomálního přípravku vede ke zvýšené stability lipozomáiního přípravku. Enkapsulace prednisolon fosfátu do lipozómů obsahujícího polyhydroxyetylasparagin-DODASuc-konjugát dává mírně lepší výsledek než začlenění do lipozómů obsahujícího póly(2-hydroxyetyl)-L-glutamin-diaminobutan DODASuc-konjugát. Dalšího zlepšení stability může být dosaženo odstraněním vodného vehikula z lipozomálního preparátu způsoby dobře známými v oboru, jako jsou například sprejové vysoušení, lyofilizace, rotační odpařování, atd.

Lipid-polymerové konjugáty začleněné do koloidních nosičových preparátů podle předkládaného vynálezu poskytuji těmto preparátům dlouho cirkulující vlastnosti. Pod tímto pojmem je rozuměno zvýšení cirkulačního času v krvi koloidních nosičových preparátů ve srovnání s preparátem neobsahujícím lipid-polymerový konjugát. Dlouho cirkulující vlastnosti mohou být určeny způsoby známými v oboru (Torchilin VP, Shtilman MI, Trubetskoy VS, Whiteman K, Milstein AM. : Amphifilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo. Biochimica et Biophysica Acta (1994) 1195: 131-184; Torchilin VP, Trubeiskoy VS., Whiternan KR, Caliceti P, Ferruti P, Verones FM.: New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo. Journal of pharmaceutical Sciences (1995) 84 (9): 1049-1053). Pro lipozómy je způsob poskytnut v příkladech provedení vynálezu. Proto takové preparáty a obzvláště vezikulární preparáty mohou být použity pro celou řadu aplikací. Kromě cirkulujícího lékového reservoáru mohou být použity pro pasivní cílení na místa patologického procesu (tumory, infekce, zánět) a pro aktivní cílení do buněk v krevním řečišti, do endotelu (např. na receptory se vztahem k angiogenezi), např. připojením k naváděcím zařízením, jako jsou například monoklonální protilátky. Dalšími aplikacemi mohou být arteficiální transportní systém pro kyslík, zobrazení krevního objemu a potažení biomateriálů, jako jsou například katétry a protézy krevních cév.

* »· ·· ·· • · · • · »·· • · ♦ I • · * 4 ·♦ «· ·· ·· ► · · I

Navíc k tomu jsou lipid-polymerové konjugáty biodegradovatelné, a proto poskytují mnoho výhod, obzvláště proto, že není riziko akumulace v buňkách lidského nebo zvířecího těla.

Další lipid-polymerové konjugáty prokázaly, že je snížena závislost na dávce lipidu ve srovnání s PEG-lipozómy.

Další, ale velmi důležitou výhodou může být, že zvýšená clearance po druhé injekci preparátu podle vynálezu není vždy pozorována, a že snížení cirkulačního času v krvi je mírné. Toto znamená významnou výhodu ve srovnání s koloidními nosičovými preparáty potaženými PEG.

Koloidní nosičové preparáty podle předkládaného vynálezu poskytují celou řadu možností pro použití v léčbě, diagnóze, profylaxi, atd. V důsledku univerzálnosti lipid-polymerových konjugátů, jejichž složky mohou být vybrány ve shodě s účelem, a celé řady koloidních nosičových systémů, které mohou být zvoleny, bude snadno patrné, že obecně se bude zdát možné pro každou aktivní látku navrhnout příslušný koloidni nosičový preparát. Pokud v prvním případě po intravenózním podání preparátu podle vynálezu není pozorován žádný nebo pouze malý účinek na cirkulační čas v krvi, může osoba znalá v oboru zvolit celou řadu odlišných parameterů lipid-polymerového konjugátu (např. molekulová váha, densita roubování, polymeř, lipid atd,) v preparátu koloidního nosiče ke zvýšení cirkulačního času podle standardního nastavení. Velmi zajímavý účinek je patrný, obsahují-li preparáty podle vynálezu ve vodě rozpustný kortikosteroid jako aktivní složku. Na in vivo experimentálním modelu artritidy se jedna intravenózní injekce takového preparátu zdá být stejně účinná jako opakované injekce non-enkapsulované kortikosteroidní sloučeniny nebo při enkapsulaci v konvenčních lipozómech. Zajímavé ve vodě rozpustné kortikosteroldy jsou budesonid fosfát a ve vodě rozpustné deriváty flunisolidu a fluticason propionátu. Příznivé účinky mohou vést ke kompletní a dlouhotrvající remisi příznaků sdružených s artritidou, zatímco

* · «

« · * e * » ·· ·♦*·

vedlejší účinky sdružené s kortikosteroidní léčbou jsou sníženy v důsledku snížení množství kortikosteroidů, které musí podány a protože mohou být použity kortikosteroidy, které normálně vykazují rychlou clearance z krve. Také u dalších chorob, u kterých kortikosteroidy jsou léky volby nebo jsou používány jako doprovodná léčba, budou prospěšné účinky preparátů podle předkládaného vynálezu snadno rozpoznány. Avšak také další aktivní látky vykazují zajímavé účinky preparátech vynálezu.

Ačkoli výše uvedený vynález byl popsán detailně ilustračním a příkladovým způsobem pro jasnost a porozumění, bude snadno zřejmé osobám běžně znalým oboru ve světle vysvětlení tohoto vynálezu, že určité změny a modifikace mohou být učiněny bez odchýlení od rozsahu připojených patentových nároků.

Následující příklady provedení vynálezu dále ilustrují vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Póly- (γ-Benzyl-L-glutamát) mající stearylaminovou koncovou skupinu (PBLG-stearylamin)

1.1 γ-benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydrid

Komerčně dostupná γ-benzyl-L-glutamová kyselina byla zkonvertována na N-karboxyanhydrid, jak je popsáno v publikaci William D. Fuller et al, (Biopolymers 1976, 15(9), 1869-71) následujícím způsobem:

7.0 g γ-Benzylglutamové kyseliny (29.5 mmol) bylo suspendováno v 70 ml suchého tetrahydrofuranu a hned bylo přidáno 22.4 ml 20% roztoku fosgenu v toluenu. Po promíchávání pod dusíkem 90 minut při 65°C byl roztok ochlazen na pokojovou teplotu a následně přidán k 150 ml petroléteru 40/60. Poté byla směs přes noc umístěna do mrazáku. Bílý krystalický produkt byl zfiltrován a promyt petroléterem 40/60. Po vysušení byl produkt rekrystalizován dvakrát z tetrahydrofuranu a petroléteru 40/60.

Výtěžek: 6.0 g (77%), bod tání: 95-97 °C.

Reakce

• ♦·· • · *

1,2. (PBLG-stearylamin)

Za použití primárního aminu stearylaminu jako iniciátoru ve dvou odlišných rozpouštědlech byly syntetizovány dvě šarže PBLGstearylaminu mající odlišné molekulové váhy.

Reakce:

Příklad rozpouštědla etylacetát/dichlórometan.

500 mg (1.9 mmol) γ-Benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydridu bylo rozpuštěno ve směsi 0.5 ml suchého etylacetátu a 3 ml suchého dichlorometanu. Následně bylo přidáno 0.255 ml 0.37 molárního roztoku (0.095 mmol] stearylaminu v dichlorometanu. Láhev byla vybavena zkumavkou s CaCl₂ a směs byla promíchávána pod dusíkem 24 hodin při pokojové teplotě. Poté byla směs přidána po kapkách k metanolu, precipitovaný polymer byl zfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 376 mg PBLG-stearylaminu ^XH-NMR (CDC1₃) analýza prokázala, že stearyl byl přítomen v produktu: CH₃ signál při δ 0.9 (t) a CH₂ signál při δ 1.3-1.2. Další NMR yýsledky:

δ 7.4-7.2 C₆H_5/ δ 5-0 CH₂C₆H₅, δ 4.1-3.8 aCH, 2.7-1.8 CH₂CH₂.

Maldi TOF ms:

m/z 2045 (n=8), 2263 (n=9), 2482 (n=10), odpovídající hmotnostem sodného adduktu (23 Da) se začleněnou stearylaminovou (269 Da) skupinou. (Hmotnost opakující se jednotky benzylglutamové kyseliny:

* • · η χ 219 Da) .

m/z 1499 (n=5), 1719 (n=6), 1938 (n-7), 2156 (n=8), 2375 (n=9),

2594 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu se začleněnou stearylaminovou skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da).

Příklad rozpouštědla dimetylformamid.

K 500 mg (1.9 mmol) γ-benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydridu ve 4 ml suchého dimetylformamidu bylo přidáno 0.255 ml 0.37 molárního roztoku (0.095 mmol) stearylaminu v dichlorometanu. Láhev byla vybavena zkumavkou s CaCl₂ a směs byla promíchávána pod dusíkem 24 hodin při pokojové teplotě. Poté byla směs přidána po kapkách k metanolu, precipitovaný polymer byl zfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 272 mg PBLG-stearylaminu.

¹H-NMR (CDC1_Z) spektrum bylo téměř identické s předchozím spektrem. Stearylové signály byly také přítomny v produktu: CH₃ signál při δ 0.9 (t) a CH2 signál při δ 1.3-1.2.

Maldi TOF ras:

m/z 1826 (n=7) 2045 (n=8), 2263 (n=9) odpovídající hmotnostem sodného adduktu majícího stearylaminovou skupina.

m/z 1719 (n=6), 1938 (n=7), 2156 (n=8), 2375 (n=9) , 2594 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu majícího stearylaminovou skupinu a cyklickou peptidovou koncovou skupinou.

Struktura PBLG-stearylaminu s cyklickou peptidovou koncovou skupinou:

0'

Přiklad 2

Póly- [N- (2-hydroxyethyl) -L-glutamin] mající_a tearylaminovou koncovou skupinu (PHEG-stearylamin) a molekulovou váhu 6000-^9000

PHEG-stearylamin byl syntetizován aminolýzou PBLG-stearylaminu za použití 2-aminoetanolu a 2-hydoxypyridinu (2-HP) (Literatura: A. de Marre et al, Polymer 1994, 35(11), 2443-2446) podle následující reakce: (X =H nebo cyklický peptid):

287 mg (1.3 mmol) PBLG-stearylaminu připraveného, jak je popsáno v příkladu 1 (rozpouštědlo etylacetát/dichlorometan), a 25 mg 2-HP bylo rozpuštěno v 3.8 ml dimetylformamidu a bylo přidáno 1.63 mi 2aminoetanolu. Po promíchávání 24 hodin při 4 0°C pod dusíkem byl roztok přidán ke směsi éteru a etanolu (4:1). Produkt byl zfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 152 mg.

Nakonec byl polypeptid rozpuštěn ve vodě a purifikován dialýzou trvající 4 dny v dialyzační trubicí MWCO 2000.

Výtěžek: 80 mg.

^ΧΗ NMR (D₂0): δ 4.2-4.1 aCH, δ 3.6-3.4 CH₂0H, δ 3.2-3.1 CH₂NH, δ 2.32.1 yCH₂ , 52.0-1.8 β<3Η₂ , δ 1.2-1.0, 16 CH₂ stearylamin, δ 0.8-0.6

CH₃ stearylamin.

Z intenzity stearylových signálů v NMR spektru byla vypočtena molekulová váha 6,000-9,000.

Maldi TOF ms:

Hmotnost opakujících se jednotek hyóroxyetylglutamové kyseliny: n x 172.

m/z 920 (n=3), 1092 (n=4), 1436 (n=6), 1608 (n=7), 1780 (n-8), 1953 (n=9), 2124 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu majícího stearylaminovou (269 Da) skupinu a cyklickou peptidovou (112 Da) koncovou skupinu.

m/z 1108 (n=4), 1452 (n=6) odpovídající hmotnostem draselného adduktu (39 Da) majícího stearylaminovou (269 Da) skupinu a »· *· · ·* • · · « • · · • · « • · · ·♦ ·♦»· cyklickou peptidovou (112 Da) koncovou skupinu.

Příklad 3

Póly-[N-(2-hydroxyetyl)-L-glutamin mající stearylaminovou koncovou skupinu (PHEG-stearylamin) a molekulovou váhu 2000-3500 Použitím stejného způsobu aminolýzy, jak je zmíněno v příkladu 2, vedlo 209 mg PBLG-stearylaminu připraveného, jak je popsáno v příkladu 1 (rozpouštědlo dimetylformamid) ke vzniku 49 mg PHEGstearylaminu.

¹H NMR (D₂O) : identické PHEG-stearylaminu, jak byl připraven v příkladu 2 s výjimkou, že intenzita stearylových signálů byla poněkud vyšší v příkladu 3.

Z intenzity stearylových signálů v NMR spektru byla vypočtena molekulová váha 2000-3500.

Maldi TOF ms:

m/z 1092 (n=4), 1264 (n=5), 1436 (n=6), 1608 (n=7), 1780 (n=8),

1953 (n=9), 2125 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu majícího stearylaminovou (269 Da) skupinu a cyklickou peptidovou (112 Da) koncovou skupinu.

m/z 1108 (n=4), 1280 (n=5), 1452 (n=6) , 1624 (n=7), 1796 (n=8),

1969 (n=9), 2141 (n=10) odpovídající hmotnostem draselného adduktu majícího stearylaminovou (269 Da) skupinu a cyklickou peptidovou (112 Da) koncovou skupinu.

Z Maldi TOF ms a NMR výsledků byla navržena následující struktura: Struktura PHEG-stearylaminu:

Příklad 4

Póly (γ-benzyÍ-L-glutamát)_mající heptadecyl ok tadecyl aminovou koncovou skupinu (PBLG-hQptadecyloktadecylarain)

0.94 g (3.6 mmol) γ-benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydrid (NCA) byl rozpuštěn v 5 ml suchého DMF pod dusíkovou atmosférou. Hned byl přidán roztok 25 mg (0.05 mmol) 1-heptadecyloktadecylaminu (Sigma ····

Aldrich) v 1 ml suchého chloroformu. Téměř okamžitě se začly tvořit bubliny plynu (C0₂) . Roztok byl promícháván 1 den při pokojové teplotě a poté precipitován do 10-20 násobného nadbytku vody. Bílý precipitát byl sbírán a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 0.75 g. Charakterizace:

¹H-NMR v CDCI3 (δ v ppm relativně k vrcholu rozpouštědla):

Benzylglutamát: 7.2 (C₆Hs) , 5.0 (benzylový CH₂) , 3.9 (a-CH), 2.8 &

2.2 (β&γ CH₂) ,

Alkylový řetězec: 1.2 (CH₂ alkyl řetězec), 0.85 (CH₃)

Příklad 5

Poiy(N-(2-hydroxyetyl)-L-glutamin) mající_hep tadecy 1 okt adecýl aminovou koncovou skupinu (PHEG-heptadecyíoktadBcylamin)

K roztoku 0.60 g PBLG-heptadecyloktaděcylaminu (viz výše) v 5 ml suchého DMF bylo přidáno 0.15 g 2-hydroxypyridinu a 0.8 ml etanolaminu. Tento roztok byl promícháván 3 dny při pokojové teplotě pod dusíkovou atmosférou. Roztok byl precipitován do 10-20 násobného nadbytku dietyléteru. Produkt byl sbírán a vysušen ve vakuu. Ve vodě-rozpustný polymerní produkt byl 2 dny dialyzován proti vodě v celulóza ester dialyzačních střevech (MWCO 500). Purifikovaný PHEG mající heptadecyloktadecyl koncovou skupinu byl získán po lyofilizaci. Výtěžek: 0.30 g. Charakterizace:

¹H-NMR v DMSO-d6 (δ v ppm relativně k vrcholu rozpouštědla):

Hydroxyetylglutamin: 4.1 (a-CH), 2.2 & 1.8-1.9 (β&γ CH₂), 3.4 (CH₂OH) , 3.1 <CV₂-NH₂),

Alkylový řetězec: 1.2 (CH₂ alkylový řetězec), 0.8 (CH₃) .

Z poměru integrálů stearylových signálů a α-CH signálu byla odhadnuta molekulová váha PHEG na 12000.

Příklad 6

Póly- [N-(2-hydroxyetyl-L-glutamin]_mající_distearylaminovou koncovou skupinu začleněnou pomoci N-Boc-1,4-diaminobutanu jako iniciátoru (PHEG-di ami nobutan-DODASuc)

2.5 g (9.5 mmol) γ-benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydridu bylo rozpuštěno ve směsi 2.5 ml suchého etylacetátu a 12.5 ml suchého

dichlormetanu, a bylo přidáno 0.95 ml (0.95 mmol) 1 molárního roztoku N-Boc-1,4-diaminobutanu v dichlorometanu jako iniciátoru. Směs byla promíchávána 3 dny pod dusíkem při pokojové teplotě a poté precipitována v metanolu. Výtěžek: 1.48 g PBLG-N-Bocdiaminobutanu.

^H-NMR (CDC1₃) spektrum prokázalo N-Boc-1,4-diaminobutanové signály při δ 1.4-1.3.

Maldi TOF ms:

Hmotnost opakující se jednotky benzylglutamové kyseliny: η x 219. m/z 1417(n=5), 1636 (n=6), 1855 (n=7), 2074 (n=8) odpovídající hmotnostem sodného adduktu s N-Boc-1,4-diaminobutanovou (187 Da) skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da). m/z 1433{n=5), 1652 (n=6), 1872 (n=7) odpovídající hmotnostem draselného adduktu s N-Boc-1,4-diaminobutanovou (187 Da) skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da).

Deprotekce PBLG-N-Boc-diaminobutanu.

738 mg PBLG-N-Boc-diaminobutanu bylo promícháváno 3.5 hodiny v 5 ml roztoku 4N HC1 v dioxanu. Následně byla reakční směs odpařena na zařízení Rotavap. Reziduum bylo rozpuštěno v 5 ml tetrahydrofuranu a přidáno po kapkách k 80 ml roztoku NaHC0₃ (6.5 g ve vodě) . Produkt byl zfiltrován, promyt vodou a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 677 mg PBLG-diaminobutanu.

²H-NMR (CDCI3) prokázala, že chránící skupina byla úspěšně odstraněna.

Maldi TOF hmotnostní analýza prokázala požadované molekulové hmotnosti.

Hmotnost opakující se jednotky benzylglutamové kyseliny: n x 219. m/z 1318(n=5), 1537 (n=6), 1756 (n=7), 1976 (n~8), odpovídající hmotnostem sodného adduktu s 1,4-diaminobutanovou (87 Da) skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da).

Připojení k DODASuc:

mg (0.1 mmol) N-sukcinyl-dioktadecylaminu (DODASuc, Schmitt et al, J. Am. Chem. Soc.1994, 116, 19, 8485-8491), 13.7 mg (0.12 mmol) N-hydoxysukcinimidu a 0.66 mg dimetylaminopyridinu (DMAP) bylo rozpuštěno v 2 ml dichlorometanu. Po ochlazení na 0°C bylo přidáno • ··

24.6 mg (0.12 mmol) N,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Roztok byl promícháván 1 hodinu při 0°C a přes noc při pokojové teplotě. Poté byla nerozpustná dicyklohexylurea zfiltrována, a filtrát byl přidán k roztoku 200 mg PBLG-diaminobutanu v 3 ml dichlorometanu a 14 ul trietylaminu. Po promíchávání přes noc při pokojové teplotě byl roztok přidán po kapkách do metanolu, zfiltrován a vysušen. Výtěžek: 135 mg. ¹H-NMR (CDC1₃) spektrum prokázalo, že distearyl byl přítomen, CH₂ signály při δ 1.4-1.2 a CH₃ signály při δ 0.9-0.8.

Maldi TOE hmotnostní analýza prokázala požadované molekulové hmotnosti, což ukazuje, že DODASuc byl připojen k PBLGdiaminobutanu .

m/z 1922 (n=5), 2141 (n=6), 2360 (n=7), 2580 (n=8), 2799 (n=9) , 3018 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu PBLGdiaminobutan-DODASuc s cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da) .

Struktura:

Aminolýza.

120 mg PBLG-diaminobutan DODASuc a 10.8 mg 2-HP bylo rozpuštěno v

1.3 ml dimetylformamidu a bylo přidáno 0.68 ml 2-aminoetanolu. Po promíchávání 24 hodin při 40°C pod dusíkem byl roztok přidán po kapkách do chloroformu. Produkt byl zfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 83 mg PHEG-diaminobutan-DODASuc. ¹H-NMR (DMSO) prokázala distearylové signály při δ 1.2-1.4 (CH₂) a δ 0.8-0,9 (CH₃) . Z poměru integrálů stearylových signálů a α-CH signál byla odhadnuta molekulová váha PHEG na 4000.

Struktura:

O^! ·· r * · · · • ·

Příklad 7

Póly- [N- (2-hydroxyetyl) -L-glutamin] mající skupinu začleněnou distearylaminem jako aminovou koncovou iniciátorem (PHEGdí s tearylamin)

1.0 g (3.8 mmol) γ-benzyl-L-glutamát N-karboxyanhydridu byl rozpuštěn ve směsi 1 ml suchého etylacetátu a 5 ml suchého chloroformu. Následně byly přidány 2 ml (0.19 mmol) roztoku 163 mg distearylaminu v 3.26 ml chloroformu. Láhev byla vybavena zkumavkou s CaCl₂ a směs byl promíchávána pod dusíkem 4 dny při pokojové teplotě. Směs byla přidána po kapkách k metanolu, polymer byl izolován filtrací a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 757 mg PBLGdistearylaminu.

Reakce:

distearylaaiín

¹H-NMR (CDCI3) analýza prokázala distearylové signály v produktu: CH₃ signál při δ 0.9 (t) a CH₂ signál při δ 1.3-1.2.

Maldi TOF ms:

Hmotnost opakující se jednotky benzylglutamové kyseliny: n x 219: m/z 1971 (n=6) , 2190 (n=7), 2410 (n^S), 2629 (n=9) , 2848 (n=10) odpovídající hmotnostem sodného adduktu s distearylaminovou (521 Da) skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da) . m/z 2206 (n=7), 2427 (n-8) odpovídající hmotnostem draselného adduktu s distearylaminovou (521 Da) skupinou a cyklickou peptidovou koncovou skupinou (112 Da).

Aminolýza

Amninolýza výše připraveného PBLG-distearylaminu (600 mg) s aminoetanolem a 2-hydroxypyridinem jako katalyzátorem v

··· · dimetylforrnamidu vedla k získání 430 mg PHEG-distearylaminu. ¹H-NMR (DMSO-Ó6) prokázala distearylaminové signály.

Struktura:

Příklad 8

Póly-[N-(hydroxyalkyl)-It-glutamin] mající díaminobutanovou DODASuc koncovou skupinu

PBLG-diaminobutanBOC:

K roztoku 3 g benzyl-L-y-glutamát N-karboxyanhydridu (NCA) v 8 ml suchého DMF byl přidán roztok 0.1 g N-BOC-1,4-diaminobutanu v 1 ml chloroformu. Tvorba plynu (oxid uhličitý) byl zaznamenána během prvních hodin. Tento roztok byl promícháván 1 den pod dusíkovou atmosférou při pokojové teplotě. Po precipitaci do cca 100 ml metanolu byl polymer zfiltrován a vysušen, což vedlo k zisku 2 g PBLG obsahujících BOC-chráněných aminoskupin.

^XH-NMR (CDCI3) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

BOC:1.4(CH₃)

PBLG: 2.2 & 2.6 (β,γ-ΟΗ₂) , 4.0 (α-CH), 5.0 (benzyl CH₂) , 7.3 (fenyl)

PBLG-diaminobutan (odstranění chránících BOC skupin):

Roztok 1.1 g PBLG-diaminobutanBOC v 5 ml 4N HCl/dioxanu byl promícháván 3-4 hodiny a poté byl přidán po kapkách k cca 80 ml NaHCO₃ roztoku (6.5 g ve vodě). Produkt byl zfiltrován, promyt vodou a vysušen ve vakuu. Výtěžek: 1 g PBLG-diaminobutan.

¹H-NMR (CDCI3) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

PBLG: 2.2 & 2.6 (β, y-CH₂), 4.0 (α-CH) , 5.0 (benzyl CH₂) , 7.3 (fenyl)

BOC signály nepřítomny

PBLG-diaminobutan DODASuc (DCC připojení):

·· ·

0 mg N-sukcinyl-dioktadecylaminu (DODASuc) , 90 mg DCC a 10 mg 4(dimetyl-amino)pyridinium 4-toluen sulfonátu (DPTS) bylo rozpuštěno v 4 ml dichlorometanue. Roztok byl promícháván 1 hodinu při pokojové teplotě. Byl přidán roztok 0.73 g PBLG-diaminobutanu a 40 ul trietylaminu v 3 ml chloroformu. Po promíchávání přes noc při pokojové teplotě byl roztok (obsahující precipitát dicyklohexylurey) přidán po kapkách k nadbytku metanolu (cca 100 ml). Polymerní produkt byl zfiltrován a vysušen. Výtěžek: 0.5 g. ¹H-NMR (CDC1₃) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearylové signály při 0.8-0.9 (GH₃) a 1,2-1.4 (metylenové protony) PBLG: 2.2 & 2.6 (β,y-CH₂), 4.0 (a-CH), 5.0 (benzyl CH₂) _r

7.3 (fenyl)

8.1 PHEG-dxamlnobutan DODASuc

PHEG-diaminobutan DODASuc byl získán aminolýzou PBLG-diaminobutan DODASuc s etanolaminem následujícím způsobem:

0.5 g PBLG-diaminobutan DODASuc a 15 mg 2-hydroxypyridinu bylo rozpuštěno v 4 ml DME. Poté byly přidány 2 ml etanolaminu. Po promíchávání 24 hodin při 40°C pod dusíkovou atmosférou byl roztok precipitován do cca 100 ml dietyléteru. PHEG-diaminobutan DODASuc byl rozpuštěn ve vodě, dialyzován (MWCO 500) a následně lyofilizován, což vedlo k zisku 0.35 g purif ikovaného PHEG diaminobutan DODASuc konjugátu, ^XH-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearylové signály při 0.8-0-85 (CH?) a 1.2-1.5 (metylenové protony)

PHEG: 1.7-2.2 (β, y-CH_z), 3.1 & 3.3 (hydroxyetyl) , 4.2 (α-CH), 4.7 (OH) , 7.8 6 8,2 (NH). E poměru integrálů distearylových signálu a α-CH signálu byla vypočtena molekulová váha PHEG 4000.

Maldi-TQF potvrzuje molekulární strukturu PHEG diaminobutan DODASuc konjugátu.

Na⁺-addukt: m/z 3064.5 (n-13), 3236.1 (n-14), 3408.7 (n-15), 3580.6 (n-16), 3752.9 (n=17), 3924.7 (n-18), 4096.7 (n^l9), 426&4-(n=20),

4441.1 (n=21), 4613.3 (n-22), 4785.1 (n-23), atd.

g.2 Póly-[(2-hydroxypropyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc

Póly- [ (2-hydroxypropyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc byl získán aminolýzou PBLG-diaminobutan DODASuc s 2-propanelamínem (isopropanolaminem) následujícím způsobem:

0.15 g PBLG-diaminobutan DODASuc a 0.05 g 2-hydroxypyridínu bylo rozpuštěno v 4 ml DMF. Poté byl přidán 1 ml 2-propanolamin, Po promíchávání 24 hodin při 40°G pod dusíkovou atmosférou byl roztok precipitován do cca 100 ml dietyléteru. 0.1 g PHisoPG-diaminobutan DODASuc bylo získáno po vysušení. Polymer byl rozpuštěn ve vodě, dialyzovén (MWCO 500) a následně lyofilízován, což vedlo k zisku purifikovaného póly-[(2-hydroxypropyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc, ¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearylové signály při 0.8-0.85 (CH3) a 1.2-1.5 (metylenové protony)

PHPG: 1.7-2.2 (β,γ,-CHz), 1.0 (CH₃) & 3.0 & 3.3 & 3.7 (hydroxypropyl), 4.2 (α-CH), 4.7 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).

Vypočtená molekulová váha: cca 4Q00.

8.3 Póly- [ (3-hydroxypropyl) -L-glutamin] diaminobutan DODASuc

Póly-[(3-hydroxypropyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc byl získán aminolýzou PBLG-diaminobutan DODASuc s 3-propanolaminem:

0.3 g PBLG-diaminobutan DODASuc a 0.1 g 2-hydroxypyridinu byly rozpuštěny v 4 ml DMF. Poté byly přidány 2 ml 3-propanolaminu. Po promíchávání 24 hodin při 40°C pod dusíkovou atmosférou byl roztok precipitován do cca 100 ml dietyléteru. 0.25 g PHPG5000diaminobutan DODASuc bylo získáno po vysušení. Polymer byl rozpuštěn ve vodě, dialyzován (MWCO 500) a následně lyofilízován, což vedlo k zisku purifikovaného póly-[(3-hydroxypropyl)-Lglutamin] diaminobutan DODASuc.

^XH-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearylové signály při 0.8-0.85 {CH₃) a 1.2-1.5 (metylenové protony)

PHPG: 1.7-2.2 (β,γ-0Η₂) , 1.5 & 3.1 & 3.3 (hydroxypropyl), 4.2 (aCH), 4.6 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).

• ···

Molekulová váha: cca 5000.

Maldi-TOF:

Na⁺-addukt: m/z 3623 (n=15), 3810 (n=16) , 3996 (n~17), 4182 (n=18), 4368 (n=19), 4555 (n-20), atd.

8.4 Póly-[4-hydroxybutyl]-L-glutamin) diaminobutan DOPASuc

Póly-[(4-hydroxybutyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc byl získán aminolýzou PBLG-diaminobutan DODASuc s 4-butanolaminem:

0.3 g PBLG-diaminobutan DODASuc a 0.1 g 2-hydroxypyridinu bylo rozpuštěno v 4 ml DMF. Poté byly přidány 2 ml 4-butanolaminu. Po promíchávání 48 hodin při 40°C pod dusíkovou atmosférou byl roztok precipitován do cca 100 ml dietyléteru. Polymer byl rozpuštěn ve vodě, dialyzován (MWCO 500) a následně lyofilizován, což vedlo k zisku 0.2 g purifikovaného póly-[(4-hydroxybutyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc.

J-H-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla) :

distearylové signály při 0.8-0.85 (CH3) a 1.2-1.5 (metylenové protony)

PHBG: 1.7-2.2 (β,γ-ΟΗ_ζ), 1.4 & 3.1 & 3.3 (hydroxybutyl), 4.2 (aCH), 4.5 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).

Molekulová váha: cca 4000

8.5 Póly- [ (2,3-dihydroxypropyl) -L-glutamin] diaminobutan DODASuc

Póly-[ (2,3-dihydroxypropyl)-L-glutanmin] diaminobutan DODASuc byl získán aminolýzou PBLG-diaminobutan DODASuc s 2,3dihydroxypropylaminem:

0.15 g PBLG-diaminobutan DODASuc a 0.06 g 2-hydroxypyridinu bylo rozpuštěno v 3 ml DMF. Poté byl přidán 1 ml 2,3dihydroxypropylamin. Po promíchávání 1 den při 4 0°C pod dusíkovou atmosférou bzl roztok precipitován do cca 100 ml dietyléteru. Polymer byl rozpuštěn ve vodě, dialyzován (MWCO 500) a následně lyofilizován, což vedlo k zisku 0.1 g purifikovaného póly-[(2,3dihydroxypropyl)-L-glutamin] diaminobutan DODASuc.

¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearylové signály při 0.8-0.85 (CH₃) a 1.2-1.5 (metylenové protony)

Póly(dihydroxypropyl)G: 1.7-2.2 (β,y-CH₂) , 3.1 & 3.3-3.6 (dihydroxypropyl), 4.2 (α-CH), 4.6 & 4.8 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).

Molekulová váha: cca 4000.

Příklad 9

Cholesteryl-PHEG

K roztoku 0.2 g PBLG-NHa a 20 ul trietylaminu v 2 ml chloroformu byl přidán roztok 0.07 g cholesteryl chloroformátu v 1 ml chloroformu. Roztok byl promícháván cca 1 hodinu při pokojové teplotě a poté precipitován do díetyléteru. Po odebrání a vysušení bylo získáno 0.13 g polymerního produktu.

Aminolýza s etanolaminem (2-hydroxypyridin v úloze katalyzátoru) den při 40°C vedla k získání cholesteryl-PHEG. Polymerní produkt byl purifikován dialýzou (MWCO 500)_t ^LH-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

PHEG: 1.7-2.2 {β,γ-ΟΗ₂) , 3.1 & 3.3 (hydroxyetyl), 4.2 (α-CH) , 4.7 (OH), 7,8 & 8.2 (NH) cholesteryl: 0.6-1.6.

Molekulová váha: cca 4000.

Maldi TOF potvrzuje molekulární strukturu cholesteryl-PHEG konjugátu

Na⁺-addukt: m/z 3046 (n=14), 3218 (n=15), 3390 (n=16), 3562 (n=17), 3735 (n=18), 3907 (n=19),4080(n=20), atd.

Příklad 10

Póly(2-hydroxyetyl)-DL-glutamin diaminobutan DODASuc

Syntéza je analogická syntéze póly(2-hydroxyetyl)-L-glutamin diaminobutan DODASuc (příklad 8), avšak liší se několika detailech:

γ-Benzyl-DL-glutamin NCA byl syntetizován z 1:1 směsi γ-benzyl-L- a γ-benzyl-D-glutamátu a krystalizován z etylacetát/hexanu (cca 1:5) (viz příklad 1).

Póly(benzyl-DL-glutamin) diaminobutan BOC byl precipitován do vody

·* ·· místo do metanolu.

Póly(benzyl-DL-glutamin) diaminobutan DODASuc byl precipitován do metanolu.

NMR spektrum je skutečně identické se spektrem póly(2hydroxyetyl)-L-glutamin diaminobutan DODASuc (příklad 8.1). Molekulová váha: cca 3000.

Příklad 11

PHEG kopolymery: póly(HEG-ko-glutamová kyselina) diaminobutan

DODASuc; 5% glutamová kyselina

Roztok 0.14 g PBLG diaminobutan DÓDASuc, 0.05 g 2-hydroxypyridinu, cca 1 ml etanolaminu v 1.5 ml DMF byl promícháván pod dusíkovou atmosférou 1 den při pokojové teplotě. Roztok byl poté precipitován do dietyléteru. Produkt, částečně etanolaminaminolyzován PBLG diaminobutan DODASuc (PHEG s 5% benzyl esterovými postranními skupinami), byl sbírán a vysušen. NMR v DMSO prokázala přítomnost 5% nezreagovaných benzylových skupin. Řečený polymer byl rozpuštěn v 8.5 ml 1 M NaOH a promícháván 4 hodiny. Roztok byl neutralizován 1 N HCI, a poté dialyzován (MWCO 500) několik dnů. Negativně nabitý (při fyziologickém pH) kopolymer-lipidový konjugát (0.1 g) byl získán po lyofilizaci díalyzovaného roztoku.

NMR v DMSO prokázala plnou konverzi benzolových skupin.

Maldi TOF bylo použito k potvrzení přítomnosti opakujících se jednotek glutamové kyseliny i hydroxyetylgiutaminu.

Molekulová váha: cca 3500.

Příklad 12

PHEG_kopolymer:_póly_(HEG-ko-dimetylaminoetylglutamin) diaminobutan DOPASuc; 5 % dimetylaminoetylových postranních skupin

Roztok 0.25 g PBLG diaminobutan DODASuc, 0.08 g 2-hydroxypyridinu, a 1 ml etanolaminu ve 2.5 ml DMF byl promícháván pod dusíkovou atmosférou dva dny při pokojové teplotě. Výsledný roztok byl precipitován do dietyléteru. Částečně etanolaminem-aminolyzovaný PBLG diaminobutan DODASuc (PHEG s 5 % benzyl esterovými vedlejšími skupinami) byl sbírán a vysušen. NMR v CDCI3 prokázala přítomnost » ·

5% nezreagovaných benzylových skupin.

Roztok 0.16 g tohoto částečně etanolaminem aminolyzovaného PBLG diaminobutan DODASuc, 0.06 g 2-hydroxypyridinu, 1 mi N,Ndimetyletylendiaminu ve 2.5 ml DMF byl promícháván 1 den pod dusíkovou atmosférou při 40°C. Precipitace do dietyléteru vedla ke vzniku prášku, který byl sbírán a vysušen ve vakuu. NMR v DMSO prokázala plnou konverzi zbývajících benzylových skupin. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a dialyzován (MWCO 500) několik dnů a následně lyofilizován. Výtěžek: 0.1 g pozitivně nabitého PHEG kopolymer-lipidového konjugátu.

Molekulová váha: cca 4000.

Příklad 13

Póly (2-hydroxyetyl)-L-asparagin (PHEA) mající atearylaminovou a heptadecyloktadecyl aminovou koncovou skupinu β-benzyl-L-aspartát N-karboxyanhydrid (NCA):

Suspenze 5 g β-benzyl L-aspartátu v 50 ml destilovaného THF obsahující cca 16 ml 20% roztoku fosgenu v toluene byla zahřívána při 60-65°C (proud dusíku nad roztokem). Po cca 10 minutách byl získán čistý roztok. Po cca 1.5 hodině byl roztok pomalu nalit do cca 140 ml n-hexanu. Krystaly byly tvořeny téměř okamžitě. Po další krystalizaci během 1 noci při -20°C byl izolován NCA krystalický produkt. Další krystalizace z THE/hexanu a z horkého chloroformu vedly k získání 4.3 g jemných jehliček. (Biopolymers 1976, 15(9) 1869-71).

¹H-NMR (CDC13) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

benzylová skupina: 7.3 (Fenyl), 5.1 (CH₂) aspartát NCA; 2.8 & 3.0 (p-CH₂) , 4.5 (<X~CH) , 6.4 (NH) stearyl-PBLA:

K roztoku 0.95 g β-benzyl L-aspartát NCA ve 2 ml DMF byl přidán roztok 0.04 g stearylaminu v 0,5 ml chloroformu. Po promíchávání několik hodin při 60^ο0 byl zakalený roztok precipitován do metanol. Po vysušení bylo získáno 0.56 g polyíbenzyl L-aspartát) • * ·♦· stearylaminu.

heptadecyl oktadecyl-PBLA:

K roztoku 0.5 g β-benzyl L-aspartát NCA v 2 ml DMF bylo přidáno 0.1 g 1-heptadecyl oktadecylaminu v cca 1 ml chloroformu. Po promíchávání 3 dny při pokojové teplotě byl zakalený roztok precipitován do metanolu. Výtěžek: 0.2 g polymerního produktu PBLA-heptadecyl oktadecyl aminu.

stearyl-7heptadecyl oktadecyl-PHEA:

Aminolýza výše uvedených PBLA-konjugátů za použití etanolaminu a 2-hydroxypyridinu jako katalyzátoru při 4Q°C 1 den následována precipitací do dietyléteru vedla k získání ve vodě rozpustného póly(hydroxyetyl) L-asparaginu (PHEA) obsahujícího stearylový nebo heptadecyl oktadecylový konec, Lipid-polymerové konjugáty byly purifikovány dialýzou (MWCO 500).

stearyl-PHEA:

Maldi TOF:

Na⁺ addukt m/z 2823 (n-16), 2981 (n=17), 3139 (n-18), 3297 (n-19), 3455 (n-20), 3613 (n=21), atd,

Z Maldi TOF bylo uzavřeno, že každý PHEA řetězec obsahuje volnou amino koncovou skupinu, heptadecyl oktadecyl-PHEA:

NMR, (DMSO-d6) (S relativně k vrcholu rozpouštědla) : heptadecyl oktadecyl; 0.8 & 1,2

PHEA: 2,2-2.6 (β-CHz), 3.1 & 3.4 (hydroxyetyl), 4.5 (OH + a-CH), 7.8 & 8.3 (NH) Molekulové váhy: cca 6000.

Přiklad i4 Póly(2-hydroxyetyl)-L-asparaginDODASuc

PBLA DODASuc:

K roztoku 1.7 g β-benzyl L-aspartát N-karboxyanhydridu (NCA) v 5 ml DMF bylo přidáno 0.2 ml 2 M roztoku metylaminu v THF. čistý roztok byl promícháván 1 den a poté precipitován do směsi metanolu (cca 100 ml) a vody (250 ml). Výtěžek 1.3 g PBLA obsahující metyl amidovou a amino koncovou skupinu.

• · · * ··· « · i · · • ···

Roztok 0.4 g PBLA, 30 mg DCC, 10 mg DPTS a 100 mg N-sukcinyldistearylaminu v 5 ml DMSO a 1 ml chloroformu byl promícháván 1 den a poté precipitován do vody. Polymerni produkt byl promícháván/promyt dietyléterem a vysušen.

PHEA DODASuc

Aminolýza PBLA DODASuc s etanolaminem (za použití 2hydroxypyridinu jako katalyzátoru) v roztoku DMF při 4 0°c 1 den vedla k získání PHEA DODASuc (0.2 g po dialýze a lyofilizaci).

(DMSO’d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla): distearyl: 0.8 (CH₃) , 1.2 (CH₂₎, 1.4 (CH₂-N)

PHEA: 2.4-2.8 (β-0Η₂) , 3.2 & 3.4 (hydroxyetyl) , 4.6 (α-CH + OH),

7.8-8.5 (NH)

Vypočtená molekulová váha; cca 3000.

Maldi TQF potvrzuje molekulární strukturu PHEA DODASuc konjugátu: Na⁺ addukt: m/z 2084 (n-9), 2243 (n-10), 2401 (n=ll), 2559 (n=^;12), 2718 (n-13), 2876 (n-14). atd.

Příklad 15

Póly (2-hydroxyetyl)-L-asparagin DSPESuc konjugát.

Amino-terminovaný PHEA byl získán po aminolýze PBLA (polybenzyl-Laspartát) získaného z metylamin-iniciované polymerizace benzyl-Laspartát NCA popsané pro zkonvertován

Sukcinylovaný DPPE v JACS, na svůj NHS (dicyklohexylkarbodiimid):

Roztok 70 mg sukcinylovaného

DSPE (syntéza analogická syntéze

116, 8485 (1994) ) byl nejprve ester in-situ za použití DCC

DSPE, mg hydroxysukcinimid), 5 (dicyklohexylkarbodiimid) mg

DMAP

NHS mg (NDCC v 2 ml dichlorometanu byl promícháván cca 3-4 hodiny. K této směsi byl přidán roztok 0.13 g aminoterminovaného PHEA (molekulová váha cca 4 000) v 2 ml DMSO. Po promíchávání přes noc byla směs precipitována do éteru. Precipitát byl odebrán a rozpuštěn ve vodě a dialyzován (MWCO 500) několik dnů. Po lyofilizaci bylo získáno cca 80 mg PHEA-DSPE.

¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

DS?F: 0.8 (CH₃), 1.2 (CH₂>, 1.4 (CH₂-N)

PHEA: 2.4-2.8 O~CH₂) , 3.2 & 3.4 (hydroxyetyl), 4.6 (α-CH + OH),

7.8-8.4 (NH)

Vypočtená molekulová váha: cca 4000

Přiklad 16

Póly(DL-serin) DODASuc

O-benzyl-DL-serin N-karboxyanhydrid (NCA):

Suspenze 2.5 g O-benzyl-DL-serinu v 30 ml destilovaného (suchého) THF obsahující cca 10 ml 20% roztoku fosgenu v toluenu byla zahřívána při 60-65°C (proud dusíku nad roztokem). Po cca 5 minutách byl získán čistý roztok. Po cca 1.5 hodině byl roztok pomalu nalit do cca 100 ml n-hexanu. Produkt se oddělil jako olej. Rozpouštědlo bylo dekantováno a olej byl rozpuštěn v cca 25 ml etylacetátu, do kterého bylo pomalu přidáno 100 ml hexanu. Po intenzívním protřepávání láhve a zamražení na -20°C začal 0benzyl-DL-serin NCA krystalizovat. Podobné rekrystalizace z etylacetát/hexanu a/nebo z chloroform/hexanu vedly k získání 2 g krystalického materiálu. (Biopolymers 1976,15(9) 1869-71) ^H-NMR (CDC1₃) (8 relativně k vrcholu rozpouštědla) :

benzylová skupina: 4.5 (CH₂), 7.2 (Fenyl) serin NCA: 3.7 (p-CH₂), 4.4 (a-CH), 5.8 (NH) póly(O-benzyl-DL-serin):

K roztoku 0.9 g O-benzyl-DL-serin NCA v 2.5 ml DMF bylo přidáno 0.08 ml roztoku 2 M metylaminu v THF. Po promíchávání několik hodin při pokojové teplotě se roztok zakalil a stal se viskózním. Po 1 dni byl viskózní, ''krystalizovaný roztok smíšem »« • · • · • ·*<

·«·· metanolem/vodou, aby se zcela precipitoval polymerní produkt. Výtěžek: 0.6 g polymerního produkt póly(O-benzyl-DL-serin).

¹H-NMR v DMSQ-C6 (5 relativně k vrcholu rozpouštědla): benzylové skupiny: 4.4 (CH₂), 7,2 (Fenyl) polyserin: 3.5 <β-ΟΗ₂) , 4.7 (a-CH), 8,2 (NH)

Póly(O-benzyl-DL-serin) DODASuc:

150 mg N-sukcinyl-dloktadecylaminu (DODASuc), 80 mg DCC a 5 mg DPTS bylo rozpuštěno v 4 ml chloroformu. Roztok byl promícháván 1 hodinu při pokojové teplotě. Byl přidán roztok 0.6 g poly(Qbenzyl-DL-serinu) a cca 50 ul trietylaminu v cca 5 ml chloroformu. Po promíchávání přes noc při pokojové teplotě byl roztok (obsahující precipitát dicyklohexylurey) přidán po kapkách k nadbytku metanolu (cca 100 ml) , Polymerní produkt byl zfiltrován a vysušen. Výtěžek: 0.4 g.

“Ή-NMR v DMSO-d6 (δ relativně k vrcholu rozpouštědla) :

distearyl: 0,8 (CH₃), 1.2 (CH₂), 1,6 (CH₂-N) benzylové skupiny: 4.4 (CH₂), 7.2 (Fenyl) polyserin: 3.5 <β-ΟΗ₂) , 4.7 (a-CH), 8.2 (NH)

Póly(DL-serln) DODASuc:

0.1 g póly(O-benzyl-DL-serin) DODASuc bylo rozpuštěno v cca 4 ml 33¾ roztoku HBr/AcOH a roztok byl promícháván 1 hodinu. Roztok byl poté precipitován do vody. Polymerní precipitát byl zfiltrován, promyt vodou, odebrán a následně rozpuštěn (1-2 hodiny) v 4 ml 1M NaOH. Výsledný roztok byl neutralizován 1 N roztokem HCI, a poté dialyzován (MWCO 500) několik dnů. Dialyzovaný roztok byl lyofilizován. Výtěžek: 20 mg póly(DL-serin) DODASuc.

^XH-NMR v DMSO-d6 (δ relativně k vrcholu rozpouštědla): distearyl: 0.8 (CH₃) , 1.2 (CH₂), 1,6 <CH₂-N) polyserin: 3.6 (p-CH₂), 4.3(OH), 5.0 (a-CH), 8.0 (NH)

Z poměru integrálů dístearylových signálů a α-CH signálu byla vypočtena molekulová váha polyserinu 1500.

• *

Příklad 17

Poly-L-threonin DODASuc

Syntéza je analogická syntéze póly(D,L-serin) DODASuc a byla provedena pomocí O-benzyl-L-threonín N-karboxyanhydridu (NCA) vycházejíce z O-benzyl-L-threonin.HCI a fosgenu.

Poly-L-threonin DODASuc (M = cca 2000):

Mí-NMR v DMSO-d6 (5 relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearyl: 0.8 (CH₃), 1.2 (CH₂) , 1.6 (CH₂-N) polythreonine: 1.0 (CH₃), 4.0 (β-CH) , 4.3(a-CH ), 5.0 (OH), 7.8 (NH)

Příklad 18

Póly(D,L-methionin sulfoxid) DODASuc

DL-methionin N-karboxyanhydrid (NCA) :

Suspenze 2.5 g DL-methionin v 40 ml destilovaného (suchého) THF obsahující cca 15 ml 20% roztoku fosgenu v toluenu byla zahřívána při 60-65 °C. (Proud dusíku nad roztokem). Téměř okamžitě byl tvořen čistý roztok. Po cca 1 hodině byl roztok pomalu nalit do cca 140 ml n-hexanu. DL-methionin NCA byl krystalizován při -20°C (trvá několik dnů). Rekrystalizace z etylacetát/hexanu vedla k získání cca 0.7 g krystalického materiálu. (Biopolymers 1976,15(9) 1869-71) .

¹H-NMR (CDC1₃) (5 relativně k vrcholu rozpouštědla):

methionin NCA: 2.0-2.4 (p-CH₂ + CH₃) , 4.5{a-CH), 6.8 (NH) póly(DL-methionin) :

K roztoku 0.7 g DL-methionin NCA v 2.5 ml DMF bylo přidáno 0.1 ml roztoku 2 M metylaminu v THF. Po 1 dnu byl zakalený roztok precipitován do cca 100 ml metanolu a následně vysušen. Výtěžek: 0.33 g polymerního produktu póly (DL-methionin).

¹H-NMR v CDCl₃/TF-d (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

• · * .

• · · · ·· ··

polymethionin: 2.0-2.3 (CH₂ & CH₃), 2.6 (CH₂), 4.7 (α-CH) .

Póly(DL-methionin) DODASuc:

mg N-sukcinyl-dioktadecylaminu (DODASuc) , 45 mg DCC a 5 mg DPTS bylo rozpuštěno v 2 ml chloroformu. Roztok byl promícháván 1 hodinu při pokojové teplotě. Roztok 0.33 g póly(DL-methioninu) a bylo přidáno cca 20 ml trietylaminu v cca 2.5 ml DMSO. Po promíchávání přes noc při pokojové teplotě byl roztok (obsahující precipitát dicyklohexylurey) přidán po kapkách k nadbytku metanolu (cca 100.ml). Polymerni produkt byl zfiltrován a vysušen. Výtěžek: 0.22 g.

¹NMR v DMSO-d6 (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearyl: 0.8 (CH₃) , 1.2 (CH₂₎, 1.4 (CH₂-N) polymethionin: 1.8 (β-ΟΗ₂) , 2.0 (CH₃), 2.4 (γ-ΟΗ₂) , 4.4 (α-CH), 8.1 (NH)

Póly(DL-methionin sulfoxid) DODASuc:

mono-oxidace póly(DL-methioninu) DODASuc:

Roztok 0.3 g sodného perjodátu ve 2 ml vody byl pomalu přidán k suspenzi 0.22 g póly(DL-methionin) diaminobutan DODASuc v cca 6 mi octové kyseliny. Výsledný oranžový/červený roztok (který byl tvořen několik hodin) byl promícháván přes noc. Poté bylo přidáno cca 15 ml vody a výsledný oranžový/červený roztok byl dialyzován (MWCO 500) několik dnů. Po lyofilizaci bylo získáno 0.25 g produktu.

¹H-NMR v D₂0 (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearyl: 0.7 (CH₃) , 1-2 (CH₂) (široké vrcholy) polymethionin sulfoxid: 2.0 (p-CH₂), 2.5 (CH₃) , 2.8 (y-CH₂) , 4.3 (aCH), 8.5 (NH)

Vypočtená molekulová váha: cca 4000.

• *

Příklad 19

Póly(DL-glutamin) DODASuc

Póly(DL-glutamin) DODASuc konjugát byl syntetizován pomocí Ansynth Service B.V. za použití způsobu syntézy peptidů na pevné fázi (cca 50 mg měřítko). Póly(DL-glutamin) (n=20) navázaný k pryskyřici byl vytvořen krok za krokem za použití Fmoc-chráněných aminokyselin. K N-konci byl připojen N-sukcinyl-distearylamin. C-konec byl transformován na amid. ¹H-NMR spektrum potvrdilo strukturu.

¹H-NMR v DMSO-d6 (δ relativně k vrcholu rozpouštědla):

distearyl: 0.8 (CH₃) , 1.2 (CH₂), 1.4 (CH₂-N) polyglutamin: 1.7 - 2.2 (β, y-CH₂), 4.2 (CH), 6.8 & 7.3 (NH₂) , 8.2 (NH)

Příklad 20

Póly-(DL-asparagin) DODASuc

Póly(DL-asparagín) DODASuc konjugát byl syntetizován pomocí Ansynth Service B.V. za použití způsobu syntézy peptidů na pevné fázi vycházejíce z Fmoc-chráněných aminokyselinn (cca 50 mg měřítko). Póly(DL-asparagin) (n=20) navázaný k pryskyřici byl vytvořen krok za krokem. K N-konci byl připojen N-sukcinyldístearylamin. C-konec byl transformován na amid. ¹H-NMR spektrum v DMSO potvrdilo strukturu.

^H-NMR v DMSO-d6 (δ relativně vrcholu rozpouštědla):

distearyl: 0.8 (CH₃), 1.2 (CH₂) , 1.4 (CH^N) polyasparagin: 2.5 (CH2), 4.5 (CH), 7.0 & 7.4 (NH₂) , 8.1 (NH) • ft

Příklad 21

Póly-(D,L-alanin) DODASuc mg poiy-DL-alaninu (Sigma; MW: cca 2000) bylo rozpuštěno ve 4 ml DMSO. K tomuto roztoku bylo přidáno 40 ml trietylaminu.

Následně byl tento roztok přidán k roztoku 0.1 g DODASuc, 70 mg

DCC a 5 mg DPTS ve 2 ml chloroformu, který byl promícháván 1 hodinu. Po promíchávání 1 den byla směs precipitována do metanol/dietyléteru. Precipitát byl zfiltrován a vysušen.

^XH-NMR v DMSO:

Distearyl: 0.8 (CH₃), 1.2 (CH₂), 1.4 (CH₂)

Polyalanin: 1.2 (CH₃, 4.2 (CH), 8.0 (NH)

Příklad 22

Kopolypeptid β-alaninu a hydroxyetyl L-glutaminu

DODASuc- (β-Ala) ₃-Glu(OBzl) - (β-Ala)₄~G1u (OBzl) - (β-Ala) ₃-Glu (OBzl) - (βA1 a)₂—NH ₂:

Kopolypeptid β-alaninu a benzylglutamátu byl syntetizován pomocí způsobu na pevné fázi pomocí Ansynth Service B.V. vycházejíce z Fmoc chráněných monomerů.

C-konec: amid; N-konec: DODASuc.

DODASuc- (β-Ala) ₃-HEG- (β-Ala) ₄-HEG- (β-Ala) ₃-HEG- (β-Ala) ₂-NH₂:

Poté byly jednotky benzylglutamátu zkonvertovány na hydroxyetyl glutamin (HEG) aminolytickou reakcí (etanolamin) provedenou v DMF) .

³H-NMR v DMSO prokázalo nepřítomnost/konverzi benzylových skupin.

• · · · * ·

Příklad 23

Příprava lipozómů obsahujících PHEG-stearylamin

33,8 mg vaječného fosfatidylcholinu (EPC) (Lipoid Ludwigshafen), 9,67 mg cholesterolu (Sigma Alsrích) a 30,0 mg póly-[N-(2hydroxyetyl)-L-glutamin]- stearylaminu (PHEG-stearylamin) (syntetizován) bylo naváženo a přeneseno do 50 ml láhve s kulatým dnem. Jako lipidový markér bylo přidáno 500 kBq tritiem značeného cholesteryloleyléteru. Lipidy a značka byly rozpuštěny ve zhruba 10 ml etanolu. Poté bylo provedeno odpaření do sucha na zařízení Rotavapor po dobu 1 hodiny při 4 0°C následované promytím dusíkem 1 hodinu.

K suchému lipidovému filmu byl přidán PBS a protřepáván 1 hodinu v přítomnosti skleněných kuliček, aby se dosáhlo úplné hydratace lipidového filmu.

Lipozomální suspenze byla přenesena do vytlačovacího zařízení (Avestin, maximální objem 15 ml) a vytlačena pod tlakem za použití dusíkového plynu 6 krát přes 2 polykarbonátové filtry umístěné jeden na druhém a mající velikost pórů 200 a 100 nm, a 18 krát )přes filtry mající velikost pórů 100 a 50 nm. Následně byla lipozomální suspenze dialyzována v dialyzačním kompartmentu (Slide-A-Lyzer, 10000 MWCO) dvakrát během 24 hodin proti 1 litru sterilizovaného PBS.

Průměrná velikost částic lipozómů byla určena prostřednictvím rozptylu světla (zařízení Malvern Zeta) a byla 93.6 + 0.9 nm s indexem polydisperzity 0.099 ± 0.02. Ztráta lipidů během přípravy lipozómů byla 25%, jak bylo určeno srovnáním finální radioaktivity přípravku s aktivitou před vytlačením. Suspenze lipozómů byly uskladněny v dusíkové atmosféře při 4“C.

Příklad 24

Příprava dalších lipozómů obsahujících lipid-polymarových konjugáty

Lipozómy byly připraveny za použití filmového způsob, jak je popsáno v příkladu 23. Místo vaječného fosfatidylcholinu byl použit dipalmitoyl fosfatidylcholin. 5 mM HEPES pufr byl přidán k suchému lipidovému filmu a protřepáván 5 minut v přítomnosti skleněných kuliček, aby se dosáhlo kompletní hydratace lipidového filmu. Lipozómy byly rozděleny podle velikosti vytlačením 12 krát přes 2 PC membrány mající velikosti pórů 100 a 200 nm. Výsledné lipozómové disperze byly dialyzovány (MWCO 10,000) a průměrná velikost částic byla určena za použití techniky dynamického rozptylu světla. Viz tabulka 1 uvádějící vlastnosti lipozomálních přípravků.

Příklad 25

Srovnávací kinetiky ³H-značených polyxaer-lipidových konjugátů začleněných do lipozómů po jedné intravenózní injekci potkanům

Potkaní samci (Wistar, Crl: (WI)BR (outbrední, SPF-kvalita) (Charles River, Sulzfeld, Německo) měly volný přístup ke standardní peletizované dietě pro laboratorní zvířata (Altromin, kód VRF 1, Lage, Německo) a k tekoucí vodě. Jedna dávka intravenózní injekce lipozomálních přípravků, každá obsahující ³Hoznačený cholesteryloleyléter (Amersham) mající 40-50 kBq radioaktivity, (preparáty na 50 umol lipidů jsou uvedeny v Tabulce 1) byla podána do ocasní žíly. Celkové množství podaných lipidů bylo 5 umol s výjimkou uvedených případů. Vzorky krve byly odebrány z ocasní žíly každého potkana při v následujících časových bodech po podání dávky: 5 minut a 4, 24 a 48 hodin. Množství odebraného vzorku bylo přibližně 300 ul na jeden odběr.

Odebraná krev byla přenesena do heparinizovaných zkumavek a uskladněna při -20 °C. Jedna alikvóta 100 ul byla solubilizována podle následujícího způsobu:

* 100 ul bylo přeneseno do scintilační vialky (20 ml).

* bylo přidáno 100 ul látky Šolvable. Tato směs byla inkubována alespoň 1 hodinu.

* byl přidáno 100 ul 1 mM EDTA a 200 ul 30% H₂0₂. Tato směs byla inkubována 24 hodin při pokojové teplotě a poté přes noc při 50 °C.

• ··· • Ultima Gold (10 ml) byla přidána jako scintilační tekutina.

• Radioaktivita byla měřena pomocí LSC.

Všechna radioaktivní měření byla provedena za použití scintilačního počítače Packard (1900TR). Počítací čas byl pro Statistickou přesnost ± 0.2% nebo maximálně 5 minut. Packard

1900TR byl programován na automatické odečtení pozadí a konverzi počtů za minutu (CPM) na dezintegrace za minutu (DPM).

Pro některé zmíněné přípravky byly játra a slezina disekovány 48 hodin po injekci a lokalizace lipozómů byla posouzena následujícím způsobem:

Orgány byly homogenizovány a homogenáty naředěny na 25 ml (játra) nebo 5 ml (slezina). 1 ml homogenátů byl přenesen do scintilačních vialek, ke kterým bylo následně přidáno:

200 ml látky Solvable (smíšený vzorek inkubovaný při 50 °C přes noc) • 200 ml 0.5 M roztoku EDTA • 250 ml roztoku H2O2 (30%) (inkubovaný při 50 °C přes noc) • 10 ml scintilační tekutiny Ultima Gold (vortexováno a vzorek inkubován 24 hodin. Poté byly vzorky počítány v beta-scintilačním počítači 10 minut. Výsledky některých lipozomálních přípravků jsou uvedeny na Obrázku 6.

Preparáty lipozomálních přípravků připravených podle Příkladu 24 a výsledky získané v in vivo testu tohoto příkladu jsou uvedené v Tabulce 1. Bylo posouzeno zvýšení cirkulačního času v krvi, kde:

• Dobrý znamená účinek na cirkulační čas srovnatelný s účinkem PEG-DSPE-obsahujících lipozómů.

• Mírný znamená účinek na cirkulační čas mezi účinky PEG DSPEobsahujících lipozómy a samotných lipozómů bez potažení polymerem.

• Malý znamená účinek na cirkulační čas za daných podmínek, který je téměř podobný účinkům samotným lipozómům.

Tabulka 1

Preparát lipozómů na 50 umol lipidů a vlastnosti

• φ *·φφ

DPPC (mg)	Cholesterol (rng)	Lipid- polymerový konjugát (mg)	Průměrná velikost částic (nm)	Index polydispersity	Zvýšení cirkulačního času v krvi
23.1	6.4	Ex. 2: 15	134 ±0.5	0.100	Malý
23.1	6.4	Ex. 6: 10	153 + 0.5	0.056	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 5: 30	l43 ±2	0.205	Mírný
23.1	6.4	Ex. 9.1: 11.2	140.3 ±	0.090	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 8,2: 13,8	153. 0 ±0,9	0.090	Mírný
23.1	6.4	Ex. 8.4: 11.2	148.2 +1.7	0,071	Malý
23.1	5.5	Ex. 9: 11.0	138,711.8	0,116	Malý
23.1	6.4	Ex. 14: 8.9	146.0 +2.1	0.092	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 14: 13.9	147.0 +1.1	0.Q68	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 14: 8.9	141.7 +2.3	0.044	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 8.2:11.2	163.9 ±3.0	0.068	Mírný
23.1	6.4	Ex. 23: 2.2	171.6 +2.5	0.167	Malý
23.1	6.4	Ex. 11: 10.1	180.7 ±6.1	0.113	Malý

DPPC (mg)	Cholesterol (mg)	Lipid-polymerový konjugát (mg)	Průměrná velikost částic (nm)	Index polydispersity	Zvýšení cirkulačního času v krvi
23.1	6.4	Ex. 8.1:11.2	159.0±3.8	0.073	Dobrý §
23.1	6.4	Ex. 14: 8.9	152.9±3.4	0.050	Dobrý §
23.1	6.4	Ex. 12: 11,2	170.3+2.5	0.039	Mírný
23.1	6.4	Ex. 12: 2.24 + Ex. 8.1: 8.96	166.0±0.9	0.056	Mírný
23.1	6.4	Ex. 11:10.1	167.7±0.6	0.170	Malý

DPPC (mg)	Cholestero 1 (mg)	Lipid-polymerový konjugát (mg)	Průměrná velikost částic (nm)	Index polydispersi ty	Zvýšení cirkulačního času v krvi
23.1	6.4	Ex. 18: 11.2	159.9+2.3 0.062	Dobrý
23.1	6.4	Ex. 16: 5.0	162,7±1.6	0.159	Malý

• *

23.1	6.4	Ex. 19: 8.8	156.3+3.2	0.059	Mírný
25.0	6.4	Ex. 20: 8.8	164.7+4.0	0.116	Mírný
23.1	6.4	Ex. 10: 8.8	159.0+3.8	0.073	Malý
23.1	6.4	Ex. 22: 8.8	152.9+3.4	0.050	Mírný
23.1 *	6.4*	Ex. 14: 8.8*	167.7±0.6	0.170	Dobrý
23.1 **	6.4**	Ex. 14: 8.8**	149.9+2.3	0.062	Dobrý
23.1 * -íe *	6.4***	Ex. 14: 8.8***	162.7±.024	0.159	Malý
23.1	6.4	PEG-DSPE: 6.9	156.3 3.2	0.059	Dobrý
23.1*	6.4*	PEG-DSPE: 8.8*	170.3 2.5	0.039	Dobrý
23.1**	6.4**	PEG-DSPE: 6.9**	166.0 0.9	0.056	Dobrý
23.1***	6.4***	PEG-DSPE: 6.9***	170.5 0.3	0.110	< Malý

* : Celkové množství podaných lipidů 0.5 umol (viz Obrázky 1 a 2) ** : Celkové množství podaných lipidů 0.05 umol (viz Obrázky 1 a 2) ***: Celkové množství podaných lipidů 0.005 umol (viz Obrázky 1 a 2) §: když byla podána druhá injekce (TL 1 umol) po 1 týdnu, bylo patrné snížení v cirkulačním čase pro lipozómy obsahující lipidpolymerový konjugát z příkladu 5.1. Lipozómy obsahující konjugát z příkladu 14 také vykázaly takové snížení, ale u 2 zvířat byl tento účinek pozorován jako mírný.

Příklad 26

Příprava lipozómů obsahujících lipid-polymerový konjugát a prednisolon fosfát

750 mg dipalmitoyl fosfatidylcholinu (DPPC) (Lipoid Ludwigshafen), 220.0 mg cholesterolu (Sigma Aldrich) a 270.0 mg lipidpolymerového konjugátu z příkladu 14 a 750 mg dipalmitoyl fosfatidylcholinu, 250.8 mg cholesterol a 267.6 mg PEGdistearoylfosfatidyletanolaminu (PEG-DSPE) (Avanti Polar Lipids) bylo naváženo a smíšeno ve 100 ml láhvi s kulatým dnem. Lipidy byly rozpuštěny ve zhruba 30 ml 1:1 směsi metanolu a chloroformu (lipid-polymerový konjugát z příkladu 14) nebo etanolu (PEG-DSPE).

• »·*

····

Poté odpařeny do sucha v zařízení Rotavapor během 1 hodiny pod vakuem při 4 0°C, následováno promýváním dusíkem během 1 hodiny.

1200 mg prednisolon disodium fosfátu (PLP) (OPG Nieuwegein) bylo naváženo a rozpuštěno ve 12 ml sterilizovaného PBS. Roztok byl přidán k suchým lipidovým filmům a protřepáván 1 hodinu v přítomnosti skleněných, aby byla umožněna kompletní hydratace lipidových filmů.

Lipozomální suspenze byly přeneseny do vtlačovacího zařízení (Avestin, maximální objem 15 ml) a vytlačeny pod tlakem za použití dusíku 6 krát přes 2 filtery s póry, kdy jeden byl umístěna na vrcholu druhého, majících velikost pórů 200 a 100 nm, 100 a 50 nm, a 50 a 50 nm. Následně byly lipozomální suspenze dialyzovány v dialyzačním kompartmentu (Slide-A-Lyzer, 10.000 MWCO) 2 krát během 24 hodin proti 1 litru sterilizovaného PBS.

Průměrná velikost částic lipozómů byla určena pomocí rozptylu světla (zařízení Malvern Zeta) a bylo zjištěno, že je zhruba 85 a 90 nm s indexem polydispersitý < 0.1. Účinnost enkapsulace prednisolon fosfátu byla určena pomocí HPLC a bylo zjištěno, že je 2.6%. Suspenze lipozómů byly uskladněny v dusíkové atmosféře při 4°C a bylo zjištěno, že jsou stabilní alespoň 5 týdnů, kde lipozomální přípravky obsahující lipid-polymerový konjugát z příkladu 14 se chovaly o něco lépe než lipozomální přípravky obsahující referenční lipid-polymerový konjugát PEG-DSPE (viz obrázek 3).

PE (viz obrázek 3).

Příklad 27

Posouzení cirkulačního času a terapeutické účinnosti lipozomálních přípravků obsahujících prednisolon fosfát na modelu adjuvantní artritidy u potkanů

Potkani kmene Lewis byly imunizováni subkutánně na kořenu ocasu teplem inaktivovaným Mycobacterium tuberculosis v neúplném Freundově adjuvans. Zánět tlapky se objevil mezi 9 a 12 dny po • * • ♦··

···· imunizaci, dosáhl maximální intenzity přibližně po 20 dnech a poté postupně ustoupil.

Posouzení onemocnění bylo provedeno vizuálně skórováním závažnosti zánětu tlapky od 10. dne do 35. dne po imunizaci. Když skóre zánětu dosáhlo zhruba hodnot poloviny maximálního Skóre (14-15 den), byli všichni potkani rozděleni do skupin po 5 se stejnými průměrnými skóre a léčeni jednou intravenózní injekcí:

1.	10 mg/kg PLP v PHEA-DODASuc příkladu 26 nebo	lipozómech připravených	podle
2.	10 mg/kg PLP v PHEA-DSPE	lipozómech připravených	podle
	příkladu 26 (reference) nebo
3.	PBS (kontrola)
V	čase t - 0, 24 a 48 hodin	byly odebrány vzorky	krve a

analyzovány na plazmatickou koncentraci lipozomálního PLP.

Cirkulační vlastnosti PHEA a PEG lipozómů v krvi jsou uvedeny profily plazmatických koncentrací PLP, které jsou zobrazeny na obrázku 4. Oba typy lipozómů vykazují stejně dobrý cirkulační poločas.

Obrázek 5 uvádí terapeutickou aktivitu 10 mg/kg PLP-PHEA a 10 mg/kg PLP-PEG lipozómů na adjuvantní artritidu potkanů versus potkani léčení fyziologickým roztokem jako kontroly.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Koloidní nosičovy preparát obsahující aktivní látku a lipidpolymerový konjugát, který je možné získat z amfifilního lipidu, a který je složen z alespoň jedné hydrofobní apolární skupiny a hydrofilní polární skupiny, a polymeru nebo jeho monomerního prekursoru charakterizovaný tím, že polymer je poly(aminokyselina) , póly-(aminokyselinový derivát) nebo poly{aminokyselinový analog) a, že lipid-polymerový konjugát poskytuje dlouho-cirkulační vlastnosti koloidnímu nosičovému preparátu.
2. 2. Preparát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že koloidním nosičem je vezikulární systém.
3. 3. Preparát podle patentového nároku 1 nebo 2 charakterizovaný tím, že amfifilní lipid je vybraný ze skupiny obsahující fosfolipidy, glykolipidy, ceramidy, cholesterol a deriváty, nasycené nebo nenasycené, větvené nebo nevětvené řetězce Cg-Cso mono- nebo di-alkylaminů, arylalkylaminů, cykloalkylaminů, alkanolů, aldehydů, karbohalidů nebo alkanové kyseliny a jejich anhydridy.
4. 4. Preparát podle patentového nároku 3 charakterizovaný tím, že amfifilní lipid obsahuje alespoň dvě hydrofobní apolární skupiny.
5. 5. Preparát podle patentového nároku 4 charakterizovaný tím, že amfifilní lipid je vybraný ze skupiny obsahující 1heptadecyloktadecylamin, N-sukcinylčioktadecylamin a distearylfosfatidyletanolamin.
6. 6. Preparát podle jakéhokoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že polymer má χ ve vodě < 0.65, přednostně <

   0.5.
7. 7. Preparát podle jakéhokoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že polymer neobsahuje významné množství nabitých skupin ve fyziologické rozmezí pH 4-8.
8. 8, Preparát podle patentového nároku 7 charakterizovaný tím, že polymer se skládá z aminokyselinových monomerů, monomerů aminokyselinových analog nebo monomerů aminokyselinových derivátů, které jsou neutrální nebo, které byly neutralizovány při fyziologickém pH rozmezí 4-8.
9. 9. Preparát podle jakéhokoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že polymer se skládá z α-aminokyseliny a jejích derivátů nebo analog.
10. 10. Preparát jakéhokoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že polymer má molekulovou váhu mezí 500 a 75000, přednostně mezí 2000 a 15000.
11. 11. Preparát podle jakéhokoli z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že polymer je biodegradovatelný,
12. 12. Preparát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že polymer je poly[N-(2-hydroxyetyl)]-L-glutamin.
13. 13. Preparát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že polymer je póly(2-hydroxyetyl)-L-asparagin.
14. 14. Preparát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že polymer je póly(D,L-methionin sulfoxid).