CZ200377A3 - 7-Hydroxyepiandrosteron s neuroprotektivním účinkem - Google Patents

Description

7-qýdroxyepiandrosteron s neuroprotektivním účinkem

Oblast techniky

Vynález se týká použití řady 7-hydroxysteroidních sloučenin pro ochranu před smrtí mozkových buněk, které jsou tak užitečné při léčbě a prevenci stavůjako Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, zhoršení kognice, které není demencí (CIND), mrtvice, mozkové trauma, poranění páteřní míchy a periferních nervů nebo následků těchto stavů; jsou též užitečné pro zlepšení kognice.

Dosavadní stav techniky

Produkce 7a-hydroxylovaných metabolitů dehydroepiandrosteronu (DHEA) in vivo je známa od roku 1959, kdy byl identifikován 7a-hydroxydehydroepiandrosteron v moči (Schneider, J.J.; Lewbart, M.L.: Recent Progr. Horm. Res. 15 (1959), 201-230; Starka, L. et al·. Clin. Chim. Acta 7 (1961) 309-316). Od té doby byla publikována řada zpráv o rozsáhlé 7a-hydroxylaci 3P-hydroxysteroidních substrátů (včetně DHEA a epiandrosteronu - ΕΡΙΑ) ve tkáňových preparátech mnoha lidských orgánů, včetně jater dospělých i plodu, varlat, nadvarlat, pokožky, savčí tkáně, prostaty, tukových stromálních buněk a mandlí. Hydroxylace DHEA v poloze 7 byla též doložena v krysích játrech a v řadě myších tkání a orgánů. Ve všech těchto studiích byl 7a-hydroxydehydroepiandrosteron zdaleka nevíce produkovaným metabolitem např. Doostzadech et al (Steroids 63 (1998) 608-614) uvedli, že rychlost produkce 7a-hydroxydehydroepiandrosteronu mikrosomy myších jater byla více než 15krát vyšší než rychlost produkce 7p-hydroxyanalogu.

Bylo též doloženo, že ΕΡΙΑ, DHEA a pregnenolon jsou v krysím mozku rychle a rozsáhle transformovány na odpovídající 7a-hydroxymetabolity (Guiraud, J.M. et al·. Steroids 34 (1979) 241-248; Warner, M. et al·. Endocrinology 124 (1989) 2699-2706; Akwa, Y. et al·. Biochem. J. 288 (1992) 959-964).

Dokument WO 97/37664 popisuje použití řady sloučenin včetně

7a-hydroxysubstituovaných steroidů v léčbě neuropsychiatrických, imunitních nebo endokrinních poruch. Mezi poruchami, které lze podle dokumentu WO 97/37664 těmito sloučeninami léčit, je Alzheimerova choroba. Mechanismus těchto poruch však podle dokumentu WO 97/37664 spočívá v nedostatku 7a-hydroxysubstituovaných steroidů v mozku, a léčba tedy zahrnuje podávání 7a-hydroxysubstituováných steroidů, aby byl tento předpokládaný deficit doplněn. Postup popsaný v dokumentu WO 97/37664 léčí již existující stav, spíše než by se snažil předcházet jeho vzniku nebo zhoršení prevencí dalšího mozkového poškození. Dokument WO 97/37664 tedy nepopisuje neuroprotektivní účinek. Nenaznačuje ani, že tyto sloučeniny lze použít pro prevenci poškození způsobených náhlými a traumatickými příhodami, jako je mrtvice.

S překvapením jsme zjistili, že 7-hydroxyepiandrosteron, ať už α, β nebo jejich směs, lze použít při ochraně proti akutním a chronickým mozkovým poškozením způsobeným např. mrtvicí, mozkovým traumatem a mozkovou ischémií vyvolanými např. subarachnoidálním krvácením nebo vznikajícími při zavedení srdečního bypassu.

Při stavech jako prodloužená hypoxie nebo ischémie, které mohou a nemusejí souviset s hypoglykémií, dochází někdy k mozkovému poškození v různém rozsahu.

K ischémií dochází typicky při srdečních infarktech, avšak poškození, které v těchto případech vzniká, je omezeno v podstatě na srdeční tkáně; kromě toho byly již vyvinuty určité způsoby léčby. Tento vynález se týká spíše krátkodobé i dlouhodobé ischémie mozku, která vzniká jako důsledek mrtvice nebo poranění hlavy. Vážnost ischemického stavu závisí na charakteru mrtvice nebo poranění, jde však vždy o poškození mozku, kterého se týká tento vynález.

V dosavadním stavu techniky jsou známa různá neuroprotektivní činidla, která mají zmírňovat problém mozkového poškození, jsou však většinou spojena s vážnými vedlejšími účinky. Např. MK801 (maleát dizocilpinu) je poměrně jednoduchá molekula, která prokazatelně poskytuje určitou úroveň neuroprotekce ischemickým pacientům. Je však spojena též s „alarmujícími psychotropními účinky“ (Martindale) a vážnými motorickými poruchami. Neuroprotektivní účinky jsou detailně popsány v Brain Research 755 (1997) 36-46 (Pringle, A.K.

et al), citovaném zde tímto jako odkaz. Tíž autoři dříve popsali i neuroprotektivní účinky konotoxinu; také u této sloučeniny byly nicméně pozorovány vážné vedlejší účinky in vivo.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití 7-hydroxyepiandrosteronu (7-hydroxy-EPIA) pro přípravu léčiva pro ochranu před akutním nebo chronickým mozkovým poškozením.

Tato sloučenina je znázorněna vzorcem I

(I) a její 7oc a 7β isomery jsou znázorněny vzorci la a Ib (v tomto pořadí)

(la)

(lb)

Vynález též zahrnuje použití prekurzorů těchto sloučenin a sloučenin, které vznikají metabolizací těchto sloučenin in vivo.

Isomery a a β lze použít samostatně nebo ve směsi a v případě směsi v jakémkoli poměru. Isomer 7β má však, jak se zdá, větší aktivitu, a proto je výhodnější.

Sloučeniny podle vynálezu lze připravit různými postupy, v podstatě známými, které vycházejí z příslušných steroidů. Lze např. použít postup popsaný v literatuře, který je uveden výše, kdy vznikne směs odpovídajících sloučenin 7β a 7α, dále separovatelných známými technikami.

Např. 7a-hydroxyepiandrosteron a/ nebo 7 β -hydroxyepiandrosteron lze připravit z dehydroepiandrosteronu allylickou oxidací po protekci 3β-hydroxyskupiny a 17-ketoskupiny běžnými postupy. Produkt je pak zredukován rozpustnou kovovou sloučeninou, jako je hydrid sodný, a 3β-hydroxyskupina a 17-ketoskupina jsou deprotektovány. 7a-Hydroxy- a 7β-hydroxyepimery jsou pak podle potřeby separovány běžnými postupy, např. sloupcovou chromatografií, a lze je krystalizovat za vzniku čistých látek.

Alternativní syntetický postup je popsán ve schématu I

(Schéma I)

V reakčním schématu I je dehydroepiandrosteron II acetylován za vzniku acetátu III, který dále reaguje s ethylenglykolem za vzniku ketalu IV. Ten je oxidován, jak je popsáno v příkladu 3, za vzniku 7-ketosloučeniny V, která je deacetylována za vzniku sloučeniny VI, která dá redukcí vznik 7-hydroxy-17-ketalepiandrosťeronu VII. Ketal je odstraněn reakcí s kyselinou a vzniká

7-hydroxyepiandrosteron VIII, který je následně chromatograficky separován na 7β- a 7a-isomery za vzniku 7a-hydroxyepiandrosteronu IX a 73-hydroxyepiandrosteronu X.

Sloučeniny podle vynálezu lze podávat pacientům, u nichž je podezření na riziko vzniku ischemické příhody, zvláště mrtvice nebo poranění hlavy, nebo u nichž je podezření na vývoj chronického degenerativního onemocnění, např. Alzheimerovy choroby nebo CIDN, jejichž vznik může být stimulován chronickými podprahovými hodnotami ischémie a/ nebo sníženou produkcí energie neuronů - jevy často pozorovanými ve stárnoucím mozku. Taková profylaxe může mít velmi významné účinky. Bylo však doloženo, že sloučeniny podle vynálezu jsou účinné i při podání po ischemické příhodě, je však výhodné podávat tyto sloučeniny co nejdříve, aby se maximálně zabránilo mozkové degeneraci. Za některých okolností je žádoucí podávat sloučeniny opakovaně, zvláště pokud riziko ischemické příhody u pacienta přetrvává.

Vhodným způsobem podávání jsou obecně injekce, které umožňují dosažení požadovaného účinku v nejkratší možné době. Zvláště výhodná je pak intravenózní injekce, v některých případech může být však vhodnější aplikace přímo do mozkomíšní tekutiny.

Dávka sloučeniny podle vynálezu závisí na mnoha faktorech, jako je věk, tělesná hmotnost a celkový stav pacienta, dále způsob, častost a forma podávání. Obecně se však doporučuje dávka 0,01 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou dávka 0,05 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Toto množství lze podávat najednou nebo v několika dávkách.

Vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady, z nichž příklady 1 až 7 ilustrují přípravu sloučenin podle vynálezu a příklady 8 a 9 ilustrují jejich účinek. V příkladech 1 až 7 se římské číslice vztahují na vzorce v reakčních schématech uvedených výše.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: dehydroepiandrosteron-3-acetát III

Roztok 50 ml pyridinu a 50 ml acetanhydridu obsahující 10 g dehydroepiandrosteronu II (34,72 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Reakční médium bylo ochlazeno, vlito do vody a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena do sucha. Bylo získáno 11,0 g (33,33 mmol, 96 hmotn. %) dehydroepiandrosteron-3-acetátu III, který byl rekrystalizován z ethanolu.

Příklad 2: 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetát IV

Roztok 100 ml toluenu obsahující 5 g dehydroepiandrosteron-3-acetátu 111 (15,15 mmol), 5 ml ethylenglykolu a katalytické množství /?-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem při destilaci s vodní parou za použití Dean-Starkovy aparatury po dobu 24 hodin. Reakční médium bylo pak vlito do 100 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu draselného ve vodě. Organická fáze byla dekantována. Vodná fáze byla extrahována ethyl-acetátem. Organické fáze byly spojeny a odpařeny do sucha. Bylo získáno 5,10 g (13,64 mmol, 90 hmotn. %) 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu IV, který byl rekrystalizován z ethanolu.

Příklad 3: 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetát V

Roztok 70 ml pyridinu obsahující 5 g 17-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu IV (13,37 mmol) a katalytické množství bengálské červeně byl ozařováno střednětlakou rtuťovou výbojkou s kyslíkovým výstřelkováním. Po 24 hodinách bylo do reakčního média přidáno katalytické množství acetátu měďnatého. Po 24 hodinách bylo reakční médium odpařeno do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO2/ethyl-acetát:cyklohexan 3/7). Bylo získáno 3,11 g (8,02 mmol, 60 hmotn. %) 7-keto-l 7-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu V.

Příklad 4: 7-keto-l 7-ketaldehydroepiandrosteron VI

Roztok 50 ml methanolu obsahující 1 hmotn. % hydroxidu draselného a 1 g 7-keto-l7-ketaldehydroepiandrosteron-3-acetátu V (2,58 mmol) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Reakční médium bylo pak ochlazeno, neutralizováno a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 802 mg (2,32 mmol, 90 hmotn. %) 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteronu VI, který byl rekrystalizován z methanolu.

Příklad 5: 7-hydroxy-17-ketalepiandrosteron Vil g 7-keto-17-ketaldehydroepiandrosteronu VI (28,90 mmol) bylo při -33 °C přidáno ke kapalnému roztoku amoniaku obsahujícímu 2,65 g sodíku. Po 4 hodinách byl přidáván chlorid amonný, dokud nezmizelo modré zabarvení roztoku. Pak bylo přidáno 2,65 g sodíku a po 4 hodinách byl opět přidáván chlorid amonný, dokud nezmizelo modré zabarvení roztoku. Pak byla přidána voda a amoniak byl odpařen. Reakční médium bylo extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Bylo získáno 6,07 g (17,34 mmol, 60 hmotn. %) 7-hydroxy-17-ketalepiandrosteronu VII.

Příklad 6: 7-hydroxyepiandrosteron VIII

Roztok 100 ml acetonu obsahující 5 ml vody, 10 g 7-hydroxy-l 7-ketalepiandrosteronu VII (28,57 mmol, 50 hmotn. %) a katalytické množství p-toluensulfonové kyseliny byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Reakční médium bylo pak ochlazeno, vlito do 100 ml 10 obj. % roztoku uhličitanu sodného ve vodě a extrahováno ethyl-acetátem. Organická fáze byla usušena nad bezvodým síranem sodným a pak odpařena do sucha. Odparek byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (SiO2/ethyl-acetát). Bylo získáno 5,24 g (17,14 mmol, 60 hmotn. %) 7-hydroxyepiandrosteronu VIII.

Příklad 7: 7a-hydroxyepiandrosteron IX a 7p-hydroxyepiandrosteron X

7-hydroxyepiandrosteron VIII (5 g) obsahující epimery 7α a 7β v poměru 65/35 byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (AI2O3/CHCI3). Nejdříve byl získán

7p-hydroxyepiandrosteron X (2,5 g), pak 7a-hydroxyepiandrosteron IX (1,34 g). 7a-Hydroxyepiandrosteron X a 7P-hydroxyepiandrosteron IX byly rekrystalizovány z ethyl-acetátu.

Příklad 8: Protokol pro studium hypoxického mozkového poškození

Organotypické kultury řezů hippocampu byly připraveny základním postupem podle Pringle et al (1996, 1997) a modifikovány následujícím způsobem:

Mláďata krysy kmene Wistar (8-11 dní stará) byla zabita a hippocampus byl rychle oddělen do ledového Geyova rovnovážného solného roztoku obsahujícího glukosu v množství 4,5 mg/ml. Řezy byly separovány, vloženy do insertů kultury Millicell CM (4 na misku) a udržovány po dobu 14 dní za podmínek 37 °C/ 5 % CO₂. Médium mělo složení 25 % tepelně inaktivovaného koňského séra, 25 % Hankova rovnovážného solného roztoku (HBSS) a 50 % minimálního základního média s přídavkem Earlových solí (MEM) s 1 mM glutaminu a 4,5 mg/ml glukosy. Médium bylo vyměňováno každé 3-4 dny.

Experimentální hypoxie byla provedena, jak bylo dříve popsáno (Pringle et al, 1996, 1997). Stručně shrnuto, kultury byly převedeny do média neobsahujícího sérum (SFM - 75 % MEM, 25 % HBSS s 1 mM glutaminu a 4,5 mg/ml glukosy) obsahujícího 5 pg/ml fluorescenčního exkluzního barviva propidiumjodidu (PI). Kultury byly před měřením fluorescence ekvilibrovány v tomto médiu po dobu 60 minut. Fluorescence PI byla stanovena invertovaným mikroskopem Leica se sadou rhodaminových filtrů. Všechny kultury, u nichž byla v tomto stadiu naměřena fluorescence PI, byly z dalších experimentů vyloučeny. Hypoxie byla indukována převedením kultur do SFM (+ PI), které bylo nasyceno 95% N₂/ 5 % CO₂. Misky s kulturami byly pak umístěny do vzduchotěsné komory, v níž byla atmosféra nasycena 95% N₂/ 5 % CO₂ kontinuálním profukováním plynem rychlostí 10 1/min po dobu 10 minut před uzavřením, a inkubovány po dobu 170 minut (celková doba hypoxie byla tedy 180 minut). Nakonec byly hypoxické kultury vráceny do SFM s PI v normální atmosféře a inkubovány po dobu dalších 24 hodin.

Mozkové poškození bylo stanoveno, jak bylo popsáno dříve (Pringle et al, 1996, 1997), za použití bud’ NIH Image 1.60 na počítači Apple Ilsi, nebo OpenLab 2.1 (Improvision) na počítači Macintosh G4/400. I< zobrazení byla použita monochromní kamera a zobrazení byla uložena na optický disk pro pozdější analýzu. Zobrazení přenosu světla byla zachycena bezprostředně před přídavkem léčiv a zobrazení fluorescence PI byla naměřena na konci dvacetičtyřhodinového posthypoxického zotavovacího období. Oblast buněčné vrstvy CA1 byla určena ze zobrazení přenosu světla. Oblast fluorescence PI v CA1 byla změřena za použití funkce hustoty řezu, která je součástí NIH Image nebo OpenLab, a mozkové poškození bylo stanoveno jako podíl CA1, kde byla fluorescence PI detekována vyšší než pozadí.

Steroidní sloučeniny byly připraveny tak, že výchozí roztok v ethanolu o koncentraci 1 mg/ml byl dále rozředěn SMF. Sloučeniny byly přidány ke kulturám 45 minut před hypoxií, během hypoxie a posthypoxického zotavovacího období. Kontrolní pokusy představovaly kultury ošetřené pouze vehikulem.

Výsledky

Pokus 1

Účelem výchozího pokusu bylo určit, zda jsou 7a-hydroxyepiandrosteron a 7p~hydroxyepiandrosteron neuroprotektivní při vysoké koncentraci 100 nM. Hypoxií vznikla léze ve 25,5±6,4 % CA1. Toto poškození bylo značně sníženo 7a-hydroxyepiandrosteronem i 7p-hydroxyepiandrosteronem podávanými před hypoxií, během ní i po ní (viz tab. 1).

Tabulka 1

Sloučenina	N	Podíl poškození CA1 (%)
Kontrolní hypoxie	17	25,5±6,4
Hypoxie + 100 nM 7a-hydroxyepiandrosteronu	16	4,0±2,9”
Hypoxie + 100 nM 7p-hydroxyepiandrosteronu	16	9,0±4,7’

Pokus 2

Po potvrzení neuroprotektivního účinku 7a-hydroxyepiandrosteronu i 7p~hydroxyepiandrosteronu byla stanovena závislost tohoto účinku na koncentraci sloučenin. Kontrolní hypoxie způsobila mozkové poškození 31,9±4,7 % CA1. 7a-Hydroxyepiandrosteron byl významně neuroprotektivní při koncentraci 100 nM. Malé, ale nestatisticky významné snížení poškození neuronů bylo pozorováno při koncentraci 10 nM a při koncentraci 1 nM nebyl pozorován žádný účinek. Naproti tomu 7P-hydroxyepiandrosteron byl významně neuroprotektivní při koncentraci 10 nM a 100 nM, ale jeho účinek se ztratil, pokud koncentrace klesla na 1 nM, jak dokládá tabulka 2.

Tabulka 2

Sloučenina	N	Podíl poškození CA1 (%)
Kontrolní hypoxie	29	31,9+4,7
Hypoxie + 1 nM 7a-hydroxyepiandrosteronu	14	28,8±5,8
Hypoxie + 10 nM 7a-hydroxyepiandrosteronu	15	21,9±8,1
Hypoxie + 100 nM 7a-hydroxyepiandrosteronu	16	11,812,8^
Hypoxie + 1 nM 7β-hydroxyepiandrosteronu	15	20,6±7,2
Hypoxie + 10 nM 7p-hydroxyepiandrosteronu	12	11,9±4,7*
Hypoxie + 100 nM 73-hydroxyepiandrosteronu	13	14,3±5,0’

Příklad 9: Celková mozková ischémie krys (4 cévní okluze)

Mozková ischémie byla vyvolána 4 cévními okluzemi (4VO) u samce krysy kmene Wistar (250-280 g). Vertebrální artérie byly uzavřeny elektrokauterizací při fenobarbitalní anestézii (60 mg/kg intraperitoneálně). Zvířata byla ponechána 24 hodit se zotavit, přičemž měla volný přístup k vodě, ne však k potravě. Další den byly krční artérie vystaveny anastézii 2% halotanu v 30 % kyslíku/ 70 % oxidu dusného a uzavřeny na dobu 10 minut pomocí mikrovaskulárních svorek. Pak byly svorky odstraněny a u artérií byla zkoumána okamžitá reperfúze. Během operace a 3 hodiny po ní byla normální tělesná teplota zvířat (37,5±0,5 °C) udržována termostaticky kontrolovanou vyhřívanou přikrývkou připojenou k rektálnímu teploměru. U jedné skupiny kontrolních zvířat byly vertebrální artérie též kauterizovány při fenobarbitalní anestézii a pak byly následující den vystaveny anastézii 2% halotanu v 30 % kyslíku/ 70 % oxidu dusného, ovšem bez uzavření svorkami. Zranění bylo ošetřeno lidokainovým gelem a sešito. Zvířata byla umístěna pod zahřívací lampu při 30 °C, dokud nenabyla vědomí.

Bylo studováno 7 skupin zvířat:

1. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7β-hydroxyepiandrosteron (0,1 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 minut po reperfúzi)

2. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7p-hydroxyepiandrosteron (0,3 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 minut po reperfúzi)

3. (8 zvířat) steroidní sloučenina, 7β-hydroxyepiandrosteron (1 mg/kg intravenózně ocasní žilou, 3 injekce: 15 minut před vyvoláním ischémie, během ischémie a 5 miut po reperfúzi)

4. (8 zvířat) NBQX (disodná sůl z důvodu lepší rozpustnosti ve vodě) jako referenční látka a pozitivní kontrola (TOCRIS, SRN, 30 mg/kg intraperitoneálně, 3 injekce, jak je popsáno výše)

5. (8 zvířat) vehikulum (0,9% NaCl s obsahem 100 μΐ ethanolu), 3 injekce, jak je popsáno výše

6. (8 zvířat) pouze ischémie

7. (8 zvířat) operovaná kontrolní zvířata.

NBQX je 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)chinoxalin, což je látka s prokázanou neuroprotektivní aktivitou (Gill, R.; Nordholm, L.; Lodge, D.: The neuroprotective action of 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo(F)quinoxaline (NBQX) in a rat focal ischaemia model. Brain Res. 580, 35-43, 1992).

Látky byly rozpuštěny ve 100 μΐ ethanolu a pak zředěny 0,9% NaCl.

Po přežití 7 dní po ischémii byla zvířatům fixována perfúze 4% paraformaldehydem do srdce. Mozky byly opatrně vyjmuty a fixovány v témž médiu po dobu 2 hodin. Po kryoprotekci v 30% sacharose byly mozky rychle zmraženy v isopentanu a uchovávány při -80 °C. Dvacetimikrometrové kryostatické řezy obsahující útvar hippocampu byly obarveny Nisslovou metodou toluidinovou modří nebo fluorescencí NeuroTrace.

Analýza dat

Vážnost mozkového poškození v oblasti CA1 hippocampu po ischémii byla vyhodnocena počtem přeživších neuronů detekovaných Nisslovým barvením. Pro každou skupinu byl v CA1 oblasti stanoven střední počet morfologicky nepoškozených neuronů na délku 400 pm. Spočítání buněk bylo provedeno v 3-5 sériových řezech u každého zvířete a v šesti 400pm oblastech CA1 v každém řezu pomocí světelného mikroskopu s objektivem 20x. Data byla statisticky vyhodnocena Studentovým T-testem a udána jako střední hodnota ± odchylka.

Výsledky a diskuse

Výsledky znázorňují obrázky 1 až 3.

Morfologicky nepoškozené neurony CA1 hippocampu byly charakterizovány Nisslovým barvením (toluidinová modř nebo fluorescence NeuroTrace, obr. 2) podle následujících kritérií: jasný tvar perikarya neuronu, velké jádro s pozitivně obarveným jadérkem, malá oblast cytoplasmy okolo jádra s pozitivním Nisslovým obarvením, označující přítomnost neporušeného hrubého endoplasmatického retikula s ribosomy, což signalizuje neporušenou schopnost syntézy proteinů.

minut celkové ischémie (mírná ischémie) a doba přežití 7 dní vedou k neurodegeneraci pyramidálních buněk výlučně v oblasti CA1 hippocampu (obr. 1A-1C). Střední počet pyramidálních buněk v CA1 kontrolních operovaných zvířat byl 121,5±4,3 (uvažováno jako 100 %). Po 10 minutách celkové ischémie zahynulo 60 % neuronů CA1 (obr. 1B). Počet neuronů u zvířat ve skupině vystavené ischémii a intravenózní injekci vehikula (NaCl + 100 μΐ ethanolu) aplikované, jak je popsáno výše, bylo srovnatelné se skupinou vystavenou pouze ischémii (obr. 1A, IB). NBQX (30 mg/kg, 3 intravenózní injekce, jak je popsáno výše) vykazoval signifikantní neuroprotekci (p=0,03) pyramidálních buněk CA1 ve srovnání s ischemickou skupinou. V porovnání s čistě ischemickou skupinou vyvolává NBQX 47,5% neuroprotekci, zatímco ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty byl jeho neuroprotektivní účinek 68,5 %.

Neuroprotekce vyvolaná NBQX byla v souladu s Gill et al, 1992, a Gill, 1994, kde byla demonstrována platnost modelu celkové ischémie použitého v našich experimentech. 7p-Hydroxyepiandrosteron má neuroprotektivní účinek na pyramidální buňky CA1 hippocampu po 10 minutách celkové ischémie a 7 dnech přežití, který je závislý na koncentraci (obr. 1A). Analýza T-testem odhalila vysoce signifikantní neuroprotektivní účinek 7P~hydroxyepiandrosteronu v koncentracích 0,1 mg/kg (p=0,01) a 0,3 mg/kg (p=0,000 8). Ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty byl neuroprotektivní účinek 7p-hydroxyepiandrosteronu na pyramidální buňky CA1 74,8 % (pro 0,1 mg/kg) a 83,9 % (pro 0,3 mg/kg) (obr. 1C). 7p-Hydroxyepiandrosteron v koncentraci 1,0 mg/kg vykazoval pouze tendenci neuroprotekce, ale jeho účinek nebyl signifikantní.

V žádném z experimentů s 7P-hydroxyepiandrosteronem injikovaném před ischémií, během ní i po ní nebyly pozorovány žádné abnormality v chování zvířat.

Vysvětlivky k obrázkům:

Počet morfologicky nepoškozených pyramidálních buněk CA1 hippocampu u krys po 7 dnech po celkové mozkové ischémii při vlivu různých sloučenin.

Data byla uvedena jako střední počet ± odchylka nepoškozených neuronů na 400 pm délky oblasti CA1.

Data jsou vyjádřena jako podíl nepoškozených neuronů na 400 pm délky oblasti CA1 ve srovnání s operovanými kontrolními zvířaty (100 %).

Data byla vyhodnocena jako absolutní procento neuroprotekce, když byl počet přeživších neuronů v ischemické skupině považován za 0 % a počet přeživších neuronů ve skupině operovaných kontrolních zvířat považován za 100 %.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká použití 7-hydroxyepiandrosteronu (7-hydroxy-EPIA) pro přípravu léčiva pro ochranu před akutním nebo chronickým mozkovým poškozením.

Claims (6)

1. Použití 7-hydroxyepiandrosteronu pro přípravu léčiva pro ochranu před akutním nebo chronickým mozkovým poškozením.

2. Použití podle nároku 1, kde 7-hydroxyepiandrosteron je 7a-hydroxyepiandrosteron.

3. Použití podle nároku 1, kde 7-hydroxyepiandrosteron je 7p-hydroxyepiandrosteron.

4. Použití podle nároku 1, kde 7-hydroxyepiandrosteron je směs 7a-hydroxyepiandrosteronu a 7p-hydroxyepiandrosteronu.

5. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde je mozkové poškození způsobeno mrtvicí nebo mozkovým traumatem.

6. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde je mozkové poškození způsobeno Alzheimerovou chorobou, Parkinsonovou chorobou, zhoršením kognice, které není demencí, poraněním páteřní míchy nebo periferních nervů.