CZ2004535A3

CZ2004535A3 - Farmaceutický prostředek obsahující polypeptidy faktoru Vlla polypeptidy PAI-1

Info

Publication number: CZ2004535A3
Application number: CZ2004535A
Authority: CZ
Inventors: Rasmus Rojkjaer
Original assignee: Novo Nordisk Health Care Ag
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2005-01-12
Also published as: EP1446146A1; KR20050043733A; CA2464614A1; BR0213952A; HUP0401959A2; AU2002340778B2; WO2003039580A1; NO20042379L; HUP0401959A3; RU2004117535A; ZA200403270B; JP2005510514A; PL370118A1; IL161523A0; CN1596122A; RU2304980C2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1. Vynález se dále týká použití kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 pro výrobu léčiva pro léčbu subjektů trpících záchvaty krvácení nebo pro prevenci těchto záchvatů. Vynález se dále týká způsobu léčby záchvatů krvácení u subjektů a způsobu zvýšené tvorby sraženiny u subjektu. Předkládaný vynález se dále týká souprav obsahujících tyto sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Hemostáza je zahájena vytvořením komplexu mezi tkáňovým faktorem (TF), vystaveným cirkulující krvi po poranění cévní stěny, a FVIIa, přítomným v oběhu v množství odpovídajícím 1 % celkového množství proteinu FVII. Tento komplex se ukotví na buňku nesoucí TF a aktivuje FX na FXa a FIX na FIXa na buněčném povrchu.

FXa aktivuje prothrombin na thrombin, který aktivuje FVIII, FV, FXI a FXIII. Kromě toho, omezené množství thrombinu vytvořeného během tohoto iniciačního kroku hemostázy dále aktivuje krevní destičky. Po aktivaci thrombinem krevní destičky mění tvar a vystaví na svém povrchu fosfolipidy s nábojem. Tento aktivovaný povrch krevních destiček vytvoří templát pro další aktivaci FX a plnou tvorbu thrombinu. K další aktivaci FX na aktivovaném povrchu krevních destiček dochází prostřednictvím komplexu FlXaFVIIIa vytvořeného na povrchu aktivovaných krevních destiček, a FXa poté na povrchu přeměňuje prothrombin na thrombin. Thrombin poté mění fíbrinogen na fibrin, který je nerozpustný a který stabilizuje počáteční zátku z krevních destiček. Tento proces je kompartmentalizovaný, tzn. lokalizovaný na místo exprese nebo expozice TF, čímž je minimalizováno riziko systematické aktivace koagulačního systému. Nerozpustný fibrin tvořící zátkuje dále stabilizovaný zesíťováním fíbrinových vláken, katalyzovaným FXIII.

• · · · · · ·· ···· ·· · • · · · « · · · · • · · · · · · • · · · • ·· ·

FVIIa existuje v plazmě převážně jako jednořetězcový zymogen, který je štěpen FXa do své dvouřetězcové aktivované formy, FVIIa. Jako pro-hemostatické činidlo byl vyvinut rekombinantní aktivovaný faktor Vila (rFVIIa). Podávání rFVIIa nabízí rychlou a velmi účinnou prohemostatickou odezvu u hemofílních subjektů s krvácením, které kvůli tvorbě protilátek nemohou být léčeny produkty s koagulačním faktorem. Faktorem FVIIa mohou být dále úspěšně léčeny subjekty trpící krvácením s deficitem faktoru VII nebo subjekty s normálním koagulačním systémem prodělávající nadměrné krvácení. V těchto studiích nebyly zaznamenány žádné nepříznivé vedlejší účinky rFVIIa (zejména výskyt thromboembolie).

Extra-exogenně podávaný FVIIa zvyšuje tvorbu thrombinu na povrchu aktivovaných krevních destiček. K tomu dochází u hemofílních subjektů s deficitem FIX nebo FVIII, které proto postrádají nejúčinnější způsob plné tvorby thrombinu. Extra FVIIa zvyšuje tvorbu thrombinu také v přítomnosti sníženého počtu krevních destiček nebo krevních destiček s defektní íunkcí.

Komerční přípravky s rekombinantním FVIIa jsou prodávané jako NovoSeven® (NovoNordisk A/S Dánsko). NovoSeven® je indikovaný pro léčbu záchvatů krvácení u pacientů s hemofilií A a B. NovoSeven® je na trhu jediný dostupný rekombinantní FVIIa pro účinnou a spolehlivou léčbu záchvatů krvácení.

Ukázalo se, že inhibitor aktivátoru plasminogenu (PAI-1) hraje důležitou roli při regulaci plasminem zprostředkované proteolýzy. PAI-1, také označovaný jako inhibitor aktivátoru plasminogenu endotelového typu (e-PAI), inhibuje aktivátor plasminogenu urokinázového typu (u-PA) a aktivátor plasminogenu tkáňového typu (t-PA) a typicky se získává z lidských buněk endotelu, lidských krevních destiček a krysích buněk hepatomu (HTC). Inhibitor PAI-1 lze čistit od lidských buněk fibrosarkomu linie HT-1080, jak se popisuje v patentu US č. 6 271 352 nebo od buněk hovězího endotelu, jak popisuje van Mourik J.A. et al., J. Biol. Chem. 259, 14 914-14 921, 1984. PAI-1 je jednořetězcový glykoprotein o molekulové hmotnosti 50 000 (50 kDa) (Van Mourik J.A. et al., J. Biol. Chem. 259, 14 914-14 921, 1984) a je to nejúčinnější známý inhibitor zjedno- a dvouřetězcových forem tPA a uPA (Lawrence D. et al., Eur. J. Biochem. 186, 523-533, 1989). PAI-1 dále inhibuje plasmin a trypsin (Hekman C.M. et al., Biochemistry 27, • ·

2911-2918, 1988) a také inhibuje thrombin a aktivovaný protein C, ačkoliv s mnohem menší účinností.

Je dobře známo, že se u subjektů, které nadměrně krvácejí ve spojení s chirurgickým výkonem nebo velkým úrazem a potřebují krevní transfuzi, vyvíjí více komplikací než u těch, které naprodělávají žádné krvácení. Avšak také nepříliš velká krvácení, která vyžadují podávání lidské krve nebo krevních produktů (destiček, leukocytů, z plazmy získaných koncentrátů pro léčbu poruch koagulace, atd.) mohou vést ke komplikacím spojeným s rizikem přenosu lidských virů (hepatitida, HIV, parvovirus a další, doposud neznámé viry). Nadměrná krvácení vyžadující velké krevní transfuze mohou vést k selhání více orgánů včetně poškození funkce plic a ledvin. Poté, co se u subjektu vyvinuly tyto vážné komplikace, nastartuje se kaskáda stavů zahrnující množství cytokinů a zánětlivých reakcí, což činí jakoukoliv léčbu velmi obtížnou a často naneštěstí neúspěšnou. Proto je hlavním cílem v chirurgii i při léčbě velkého poškození tkáně zamezit nebo minimalizovat krvácení. Aby se krvácení zamezilo nebo se minimalizovalo, je důležité zajistit vytvoření stabilních a pevných hemostatických zátek, které nelze snadno rozpustit fibrinolytickými enzymy. Dále je důležité zajistit rychlý a účinný vznik těchto zátek nebo sraženin.

Dnes jsou subjekty trpící záchvaty krvácení, včetně obětí úrazů a subjektů po prodělání krvácení ve spojitosti s chirurgickým výkonem, často léčeny několika injekcemi nebo infuzemi FVIIa, protože krátký poločas FVIIa (2,5 hodiny) může vyžadovat více než jedno podání k udržení určité úrovně hemostatické schopnosti. Rychlejší zástava krvácení by pro tyto subjekty znamenala velký přínos. Stejně jako pokles počtu podávání potřebných k zástavě krvácení a udržení hemostázy.

Evropský patent Č. 225 160 (Novo Nordisk) se týká prostředků s FVIIa a způsobů léčení krvácivých chorob nezpůsobených poruchou srážecího faktoru nebo inhibitory srážecího faktoru.

Evropský patent č. 82 182 (Baxter Travenol Lab.) se týká prostředku s faktorem FVIIa pro použití k překonání poruch faktorů srážení krve nebo účinků inhibitorů faktorů srážení krve u subjektu.

Mezinárodní patentová publikace č. WO 93/06855 (Novo Nordisk) se týká topické aplikace FVIIa.

• » • · « • ·· <

V oboru je stále zapotřebí zlepšená léčba pro subjekty trpící záchvaty krvácení, včetně subjektů, u nichž jsou záchvaty krvácení způsobené chirurgickým výkonem, úrazem nebo jinými typy poničení tkáně; indukovanou koagulopathií včetně koagulopathie u subjektů po mnohačetných transfuzích; vrozenými nebo získanými poruchami koagulace nebo krvácivými chorobami včetně snížené funkce jater (, jatemí choroby“); defektní funkcí krevních destiček nebo sníženým počtem krevních destiček; chybějícími nebo nenormálními nezbytnými „sloučeninami“ srážení krve (tzn. krevními destičkami nebo proteinem von Willebrandova faktoru); zvýšenou fíbrinolýzou; antikoagulační terapií nebo thrombolytickou terapií; nebo transplantací kmenových buněk.

V oboru je stále zapotřebí zlepšený, bezpečný a široce použitelný způsob zvýšení koagulace, zvýšení nebo zajištění tvorby stabilních hemostatických zátek, nebo zvýšení pohodlí pro léčený subjekt, nebo dosažení plné hemostázy u subjektů, zejména u subjektů se špatnou tvorbou thrombinu. Dále jsou zapotřebí způsoby urychlení zástavy krvácení.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředky, které mohou být účinně použity při léčbě nebo profylaxi záchvatů krvácení a poruch koagulace.

Druhým předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředky v jednojednotkové dávkové formě, které mohou být účinně použity při léčbě nebo profylaxi záchvatů krvácení nebo jako prokoagulans. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředky, způsoby léčby nebo soupravy vykazující synergický účinek.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředky, způsoby léčby nebo soupravy nevykazující žádné podstatné vedlejší účinky, jako je vysoký stupeň systematické aktivace koagulačního systému.

Další předměty předkládaného vynálezu budou jasné po přečtení předkládaného popisu.

V prvním provedení vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI1.

V druhém provedení vynález poskytuje soupravu složek obsahující léčbu pro záchvaty krvácení obsahující

a) účinné množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a farmaceuticky přijatelný nosič v první jednotce dávkové formy;

b) účinné množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 a farmaceuticky přijatelný nosič v druhé jednotce dávkové formy; a

c) obaly obsahující první a druhou jednotku dávkových forem.

V třetím provedení vynález poskytuje použití faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII v kombinaci s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 pro výrobu léčiva pro léčbu záchvatů krvácení u subjektu. V dalším provedení vynález poskytuje použití prostředku popsaného v kterémkoliv z dále uvedených nároků 1 až 18 pro výrobu léčiva pro léčbu záchvatů krvácení u subjektu.

V různých provedeních se poskytují léčiva ke zkrácení času potřebného k dosažení úplné hemostázy, ke zkrácení času potřebného k udržení hemostázy, ke zkrácení doby srážlivosti, prodloužení doby lýzy sraženiny a ke zvýšení pevnosti sraženiny.

V různých provedeních se poskytují léčiva pro léčbu subjektů trpících záchvaty krvácení způsobenými chirurgickým výkonem, úrazem nebo jinými typy poničení tkáně, koagulopathií včetně indukované koagulopathie u subjektů po mnohačetných transfuzích; vrozenými nebo získanými poruchami koagulace nebo krvácivými chorobami včetně snížené funkce jater (,jatemí choroba“); defektní funkcí krevních destiček nebo sníženým počtem krevních destiček; chybějícími nebo nenormálními nezbytnými „sloučeninami“ srážení krve (tzn. krevní destičky nebo protein von Willebrandova faktoru); zvýšenou fíbrinolýzou; antikoagulační terapií nebo thrombolytickou terapií; nebo transplantací kmenových buněk. V jedné ze série provedení se krvácení vyskytuje v orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha, játra, plíce, nádorová tkáň, gastrointestinální trakt; v další sérii provedení to je difuzní krvácení jako je hemoragická gastritida a profuzní děložní krvácení. V další sérii provedení to jsou záchvaty krvácení ve spojení s chirurgickým výkonem nebo úrazem u subjektů s akutní hemartrózou (krvácení v kloubech), chronickou hemofilní artropatií, hematomy (např. svalové, retroperitoneální, sublinguální a retrofaryngální), krvácením v dalších tkáních, hematurií (krvácení z renálního traktu),

• · · *· cerebrálním krvácením, chirurgickým výkonem (např. hepatektomie), dentální extrakcí a gastrointestinálním krvácením (např. UGI krvácení). V jednom provedení je léčivo pro léčbu subjektů se záchvaty krvácení způsobenými úrazem nebo chirurgickým výkonem nebo sníženým počtem nebo aktivitou krevních destiček.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob léčby záchvatů krvácení u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro léčbu krvácení.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob zkrácení doby srážlivosti u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zkrácení doby srážlivosti.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob zlepšení hemostázy u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zlepšení hemostázy.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob prodloužení doby lýzy sraženiny u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro prodloužení doby lýzy sraženiny.

V dalším provedení vynález poskytuje způsob zvýšení pevnosti sraženiny u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zvýšení pevnosti sraženiny.

• · • » • · • ·«

V jedné ze série provedení způsobů se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají v jednojednotkové dávkové formě.

V další sérii provedení se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají ve formě první jednotky dávkové formy obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé jednotky dávkové formy obsahující přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. V sérii provedení se první jednotka dávkové formy a druhá jednotka dávkové formy podávají s časovým odstupem menším než 15 minut.

V dalším provedení vynález poskytuje soupravu obsahující léčbu záchvatů krvácení obsahující

d) účinné množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a účinné množství PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 a farmaceuticky přijatelný nosič v jednojednotkové dávkové formě; a

e) obaly obsahující jednojednotkovou dávkovou formu.

V jedné ze série provedení vynálezu faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru Vlije polypeptid příbuzný faktoru VII. V jedné ze série provedení vynálezu je polypeptid příbuzný faktoru VII variantní aminokyselinová sekvence faktoru VII. V jednom provedení je poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila (divoký typ Vila) při testování v testu „hydrolýzy in vitro“, popsaném v předkládaném popise, nejméně 1,25.

V jedné ze série provedení vynálezu faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII je faktor VII. V jednom provedení faktor VII je lidský faktor VII. V jednom provedení je faktor VII hovězí, vepřový, psí, koňský, myší nebo lososí faktor VII. V dalším provedení je faktor VII rekombinantně připravený. V dalším provedení je faktor VII získaný z plazmy. Ve výhodném provedení je faktor VII lidský rekombinantní faktor VII. V jedné ze série provedení vynálezu je faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII v aktivované formě. Ve výhodném provedení vynálezu je faktor VII rekombinantní lidský faktor Vila.

V jedné ze série provedení vynálezu PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je polypeptid příbuzný PAI-1. V jednom provedení polypeptid příbuzný PAI-1 je variantní ·· ···· ·· · • · · · · · • · · · · · · ' t · · · · ···· • · · · · · ·· « ·· ♦ aminokyselinová sekvence PAI-1. V jednom provedení je poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného PAI-1 a aktivitou přirozeného lidského plazmového PAI-1 (divoký typ PAI-1) při testování v „PAI-1 testu“, popsaném v předkládaném popise, nejméně 1,25. V jednom provedení PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je polypeptid PAI-1. V jednom provedení PAI-1 je lidský PAI-1. V jednom provedení je PAI-1 hovězí, vepřový, psí, koňský, myší nebo krysí PAI-1. Ve výhodném provedení je PAI-1 rekombinantně připravený. V jednom provedení je PAI-1 získaný z krevních destiček; v dalším je získaný z buněk endotelu. Ve výhodném provedení je PAI-1 lidský rekombinantní PAI-1. V jednom provedení polypeptid příbuzný PAI-1 je fragment PAI1. V jednom provedení polypeptid příbuzný PAI-1 je hybridní polypeptid PAI-1, např. hybrid vepřový/lidský.

V jednom provedení jsou faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 přítomné v hmotnostním poměru 100:1 až 1:100 (faktor VII:PAI-1)

V jednom provedení polypeptidy příbuzné faktoru VII jsou aminokyselinové sekvenční varianty, v nichž nahrazeno, vypuštěno nebo vloženo maximálně 20 aminokyselin ve srovnání s faktorem VII divokého typu (např. polypeptid s aminokyselinovou sekvencí zveřejněnou v US patentu č. 4 784 950). V jiném provedení je ve variantách faktoru VII nahrazeno, vypuštěno nebo vloženo maximálně 15 aminokyselin; v dalších provedeních je ve variantách faktoru VII nahrazeno, vypuštěno nebo vloženo maximálně 10, například 8, 6, 5 aminokyselin nebo 3 aminokyseliny ve srovnám s faktorem VII divokého typu. V jednom provedení jsou varianty faktoru VII vybírány ze seznamu L305V-FVIIa, L305V/M306D/D309S-FVIIa, L305I-FVIIa, L305TFVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337AFVIIa, M298Q-FVIIa, V158DZM298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158DZE296V/M298Q/K337A-FVIIa,

V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII a S336G-FVII.

V dalším provedení má polypeptid příbuzný faktoru VII zvýšenou aktivitu independentní na tkáňovém faktoru ve srovnání s přirozeným lidským koagulačním faktorem Vila. V jiném provedení zvýšená aktivita není doprovázená změnami

···· • · · • ♦·· • · v substrátové specifítě. V dalším provedení vynálezu není navázání polypeptidů příbuzných faktoru VII na tkáňový faktor zhoršeno a polypeptidy příbuzné faktoru VII mají alespoň takovou aktivitu jako faktor Vila divokého typu navázaný na tkáňový faktor.

Ve výhodném provedení faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou rekombinantní lidský faktor Vila a rekombinantní lidský PAI-1.

V jednom provedení se zkracuje doba srážlivosti savčí krve. V dalším provedení se zlepšuje hemostáza savčí krve. V jiném provedení se prodlužuje doba lýzy sraženiny savčí krve. V dalším provedení se zvyšuje pevnost sraženiny savčí krve. V jednom provedení savčí krev je krev lidská. V dalším provedení savčí krev je normální lidská krev; v jednom provedení krev je krev subjektu se zhoršenou tvorbou thrombinu.

V jednom provedení je krev krví subjektu majícího nedostatek jednoho nebo více koagulačních faktorů; v dalším provedení krev je krví subjektu majícího inhibitory proti jednomu nebo více koagulačních faktorů; v jednom provedení krev je krví subjektu majícího sníženou koncentraci fibrinogenu; v jednom provedení krev je PAI-1 deficitní lidská krev. V jedné sérii provedení krev je plazma.

V jednom provedení vynálezu faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou jediná hemostatická činidla obsažená v prostředku. V dalším provedení faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou jediná aktivní hemostatická činidla obsažená v prostředku. V jiném provedení faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou jediné koagulační faktory podávané subjektu.

V jednom provedení vynálezu faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou jediná aktivní činidla podávaná pacientu. V jednom provedení je prostředek v podstatě zbavený thrombinu a prothrombinu; v jiném provedení je prostředek v podstatě zbavený FX; v dalším provedení je prostředek v podstatě zbavený FXa.

V jiném provedení je farmaceutický prostředek formulovaný pro intravenózní podávání, výhodně injekcí nebo infuzí, zejména injekcí. V jednom provedení prostředek obsahuje nejméně jeden farmaceuticky přijatelný excipient nebo nosič.

• · « · • · • · ·· ··♦· ·♦ · • · · • · · * • · · ··· • · · • · ·

V jednom provedení vynálezu je prostředek vjednojednotkové dávkové formě, která obsahuje oba koagulaění faktory. V jednom provedení vynálezu je prostředek ve formě soupravy složek obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII jako první jednotku dávkové formy a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 jako druhou jednotku dávkové formy a zahrnující obaly obsahující první a druhou jednotku dávkových forem. V jednom provedení prostředek nebo souprava, co se použije, obsahuje dále pokyny pro podávání prostředku, respektive oddělených složek.

V jednom provedení vynálezu se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají v jedné dávkové formě. V jednom provedení vynálezu se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají ve formě první jednotky dávkové formy obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé jednotky dávkové formy obsahující přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1.

V jednom provedení vynálezu se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají simultánně. V jiném provedení vynálezu se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají postupně. V jednom provedení se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají s časovým odstupem maximálně 15 minut, výhodně 10, výhodněji 5, ještě výhodněji 2 minuty. V jednom provedení se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají s časovým odstupem až 2 hodiny, výhodně 1 až 2 hodiny, výhodněji 1 hodina, výhodněji 30 minut až 1 hodina, ještě výhodněji do 30 minut a ještě výhodněji 15 až 30 minut.

V jednom provedení účinné množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII je množství 0,05 mg/den až 500 mg/den (pro 70-kg subjekt). V jednom provedení účinné množství PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 je množství 0,01 mg/den až 500 mg/den (pro 70-kg subjekt).

V jednom provedení jsou faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 přítomné v hmotnostním poměru 100:1 až 1:100 (faktor VII: PAI-1).

999 9

99·9 • 9 9 • 9 ·

9 9 9 «9 9 9999

9 9 ·

V jednom provedení předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek v jednojednotkové dávkové formě a skládá se vpodstatě z přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 a jedné nebo více složek vybíraných ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních látek a inhibitorů proteáz.

V dalším provedení předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek ve formě soupravy složek, kde první jednotka dávkové formy se skládá vpodstatě z přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a jedné nebo více složek vybíraných ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních látek a inhibitorů proteáz; a druhá jednotka dávkové formy se skládá vpodstatě z přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 a jedné nebo více složek vybíraných ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních látek a inhibitorů proteáz.

V dalším provedení je subjektem člověk; v jiném provedení má subjekt poškozenou tvorbu thrombinu. V jednom provedení má subjekt sníženou koncentraci fibrinogenu v plazmě (např. subjekt po mnohačetných transfuzích). V jednom provedení má subjekt sníženou koncentraci faktoru VIII nebo FIX v plazmě.

V jiném provedení se vynález týká způsobu zlepšení hemostázy u subjektu trpícího syndromem responze na faktor VII ve srovnání se stavem, kdy je subjekt léčen faktorem VII jako jediným koagulačním proteinem, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro zlepšení hemostázy.

V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšení tvorby thrombinu u subjektu, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení tvorby thrombinu.

···· t · • · • » • · · ♦ · ·· ·· · • * * ♦ · · · » · · ···· • · · ·♦ ·

V jiném provedení se vynález týká způsobu zvýšení tvorby thrombinu u subjektu trpícího syndromem responze na faktor VII ve srovnání se stavem, kdy je subjekt léčen faktorem VII jako jediným koagulačním proteinem, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení tvorby thrombinu.

V dalším provedení se vynález týká způsobu snížení počtu podávání proteinu koagulačního faktoru nutných k dosažení hemostázy u subjektu trpícího syndromem responze na faktor VII ve srovnání s počtem podávání potřebných v případě, kdy se faktor VII podává jako jediný koagulační protein; kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro snížení počtu podávání proteinu koagulačního faktoru.

V dalším provedení se vynález týká způsobu léčby krvácení u subjektu trpícího syndromem responze na faktor VII, kdy se subjektu vyžadujícímu tuto léčbu podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro léčbu krvácení.

V jednom provedení faktor VII je lidský rekombinantní faktor Vila (rFVIIa). V dalším provedení rFVIIa je NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko).

V dalším provedení se vynález týká použití faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII v kombinaci s PAI-1 pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby fibrinových sraženin v plazmě u savců.

V dalším provedení se vynález týká způsobu zvýšení tvorby fibrinových sraženin u subjektu, kdy se subjektu s potřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první a druhé množství společně je účinné pro léčbu krvácení.

·· ♦··· ···· ·♦ • · · · · · • · · · · · • · · » · · · • · · · · · · ** ·· ·· · ·· · • » · • · · · • ····« • · · ·· ·

Seznam obrázků

Obr. 1

Přídavek FVIIa má za následek dávkově dependentní prodloužení doby lýzy sraženiny. Tento účinek byl optimální při lOnM FVIIa.

Obr. 2

V přítomnosti lOnM FVIIa měl přídavek PAI-1 za následek další prodloužení doby lýzy sraženiny. Tento účinek byl dávkově dependentní a optimální při lOnM PAI-1.

Obr. 3

Pro analýzu účinku kombinování FVIIa a PAI-1 na maximální pevnost sraženiny (Maximal Clot Firmness, MCF) a na rezistenci sraženin vůči lýzy řízené t-PA se použilo měření thromboelastografíe (roTEG). V normální lidské plazmě přídavek PAI-1 (30 nM) neměnil MCF, ale prodloužil poločas lýzy sraženiny na 16,1 minut. Časová stupnice je v minutách.

Obr. 4

Pro analýzu účinku kombinování FVIIa a PAI-1 na maximální pevnost sraženiny (MCF) a na rezistenci sraženin vůči lýzy řízené t-PA se použilo měření thromboelastografíe (roTEG). Vhemofilní plazmě přídavek samotného PAI-1 zvýšil MCF na 5 mm a prodloužil poločas lýzy sraženiny na 32,4 minut. Časová stupnice je v minutách.

Detailní popis vynálezu

U subjektů, které nadměrně krvácejí ve spojení s chirurgickým výkonem nebo velkým úrazem a potřebují krevní transfuzi, se vyvíjí více komplikací než u těch, které neprodělávají žádné krvácení. Avšak také nepříliš velká krvácení, která vyžadují podávání lidské krve nebo krevních produktů (destiček, leukocytů, z plazmy získaných koncentrátů pro léčbu poruch koagulace, atd.), mohou vést ke komplikacím spojeným s rizikem přenosu lidských virů (hepatitida, HIV, parvovirus a další, doposud neznámé viry) i nevirových pathogenů. Nadměrná krvácení vyžadující velké krevní transfuze mohou vést k selhání více orgánů včetně poškození funkce plic a ledvin. Poté, co se u subjektu vyvinuly tyto vážné komplikace, spouští se kaskáda stavů zahrnující množství cytokinů a zánětlivých reakcí, což činí jakoukoliv léčbu velmi obtížnou a často naneštěstí

neúspěšnou. Při velké ztrátě krve se pacient stává klinicky nestabilním. U těchto pacientů je riziko atriální fibrilace, která může vést k fatální zástavě srdeční aktivity; poškození funkce ledvin nebo výronu tekutiny v plicích (ARDS nebo tzv. „mokré plíce“). Proto je hlavním cílem v chirurgii i při léčbě velkého poškození tkáně zamezit nebo minimalizovat krvácení. Aby se krvácení zamezilo nebo se minimalizovalo, je důležité zajistit vytvoření stabilních a pevných hemostatických zátek, které nelze snadno rozpustit fibrinolytickými enzymy. Dále je důležité zajistit rychlé a účinné vytvoření takových zátek nebo sraženin.

Subjekty s thrombocytopenií (sníženým počtem nebo aktivitou krevních destiček) mají také poškozenou tvorbu thrombinu a defektní stabilizaci fíbrinových zátek, což má za následek, že hemostatické zátky jsou náchylné k předčasnému rozpouštění. Dále subjekty po prodělání velkého úrazu nebo poškození orgánů, které dostaly časté krevní transfuze, mají často snížený počet krevních destiček a sníženou hladinu fibrinogenu, faktoru VIII a dalších koagulačních proteinů. U těchto subjektů dochází k nesprávné nebo snížené tvorbě thrombinu. Tyto subjekty mají proto defektní nebo méně účinnou hemostázu vedoucí k tvorbě fíbrinových zátek, které jsou snadno a předčasně rozpouštěné proteolytickými enzymy, tyto enzymy jsou navíc nadměrně uvolňované při situacích charakterizovaných velkým traumatem a poškozením orgánů.

Krvácení do tkání může dále vést k tvorbě hematomů. Velikosti hematomů (zejména interkraniálních a spinálních) jsou úzce korelovány s rozsahem ztráty neurologické funkce, potíží při rehabilitaci a/nebo závažnosti a stupně trvalého poškození neurologických funkcí po rehabilitaci. Nejzávažnější následky hematomů jsou pozorovány při jejich lokalizaci v mozku, kde mohou dokonce vést ke smrti pacienta.

Hlavním cílem léčby krvácení je tedy dosáhnout hemostázy v co nejkratším čase, a udržet tak ztrátu krve na minimu.

Předkládaný vynález tedy poskytuje výhodné prostředky, použití a způsoby léčby záchvatů krvácení u subjektů vyžadujících takovou léčbu. Prostředky, použití a způsoby mohou být spojeny s výhodnými účinky jako je menší ztráta krve před dosažením hemostázy, menší množství krve potřebné během chirurgického výkonu, udržení krevního tlaku na přijatelné úrovni dokud není dosaženo hemostázy, rychlejší stabilizace krevního tlaku, kratší doba zotavení pro léčeného pacienta, kratší doba rehabilitace pro « · · · · · • · · · · · • « * · · · · • · · · · · · ·♦ ·· ·· · ·« · • * · • · · · • · ··· • ♦ · ·· · léčeného pacienta, redukovaná tvorba hematomů nebo tvorba menších hematomů včetně hematomů v mozku, rychlejší zástava krvácení, snížení počtu podávání potřebných k zástavě krvácení a udržení hemostázy.

Podávání přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, např. faktorem Vila, v kombinaci s přípravkem s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 poskytuje zkrácení doby srážlivosti, pevnější sraženinu a zvýšenou rezistenci vůči fíbrinolýze ve srovnání se srážlivosti, pevností sraženiny a rezistencí při podávání buď samotného faktoru VII, nebo samotného PAI-1.

Podávání přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, např. faktorem Vila, v kombinaci s přípravkem s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 dále poskytuje zkrácenou dobu k zástavě krvácení a snížený počet podávání k udržení hemostázy ve srovnání se situací, kdy se buď faktor VII, nebo PAI-1 podává samotný. Předkládaný vynález poskytuje výhodný účinek simultánního nebo postupného dávkování přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 a přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII. Farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu může být ve formě jediného prostředku nebo ve formě vícesložkové soupravy (souprava složek). Prostředek podle předkládaného vynálezu je užitečný jako terapeutické a profylaktické prokoagulans u savců včetně primátů, např. lidí. Předkládaný vynález dále poskytuje způsob léčby (včetně profylaktické léčby nebo prevence) záchvatů krvácení u subjektů včetně lidí.

Kdykoliv je v předkládaném popise zmíněna první, druhá nebo třetí atd. dávková jednotka, neurčuje se tím výhodné pořadí podávání, ale jedná se pouze o výhodné označení.

Kombinace přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 je výhodný produkt zajišťující krátkou dobu srážlivosti, rychlou tvorbu hemostatických zátek a vznik stabilních hemostatických zátek. Autoři předkládaného vynálezu zjistili, že kombinace přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 je výhodný produkt zajišťující tvorbu pevných, stabilních a rychle vytvořených hemostatických zátek.

·· 9 ·· 9999

• 999 »· • 9 9

9 · • 9 · · * 9 9 9

9 9

Autoři předkládaného vynálezu ukázali, že kombinace faktoru Vila a PAI-1 může zvýšit pevnost sraženiny mnohem účinněji než samotný faktor Vila, nebo samotný PAI1. Dále se ukázalo, že kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 může prodloužit in vitro dobu lýzy sraženiny v normální lidské plazmě mnohem účinněji než samotný faktor Vila, nebo samotný PAI-1. Dále se ukázalo, že kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 může prodloužit poločas lýzy sraženiny v normální lidské plazmě mnohem účinněji než samotný faktor Vila, nebo samotný PAI-1. Dále se ukázalo, že kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 může ochránit sraženinu před fibrinolýzou, zejména fibrinolýzou řízenou tPA, v normální lidské plazmě mnohem účinněji než samotný faktor Vila, nebo samotný PAI-1. Zlepšením koagulace lze tak získat mnohem účinnější léčbu krvácení u subjektů.

Bez vázání se teorií se má za to, že plné generování thrombinu je nezbytné pro tvorbu pevných, stabilních hemostatických zátek, a tím k udržení hemostázy. Fibrinová struktura takové zátky je závislá jak na množství vzniklého thrombinu, tak na rychlosti počátečního generování thrombinu. V případě narušeného generování thrombinu se vytváří porézní zátka, která je vysoce propustná. Fibrinolytické enzymy normálně přítomné na povrchu fibrinu snadno takovou fíbrinovou zátku rozpustí. Vytvoření stabilní fíbrinové zátky je dále závislé na plném generování thrombinu. Kromě toho, nedávno popsaný fibrinolytický inhibitor TAFI, který je aktivovatelný thrombinem, vyžaduje pro svou aktivaci dost vysoké množství thrombinu. V případě ne zcela postačujícího generování thrombinu nemusí být tedy TAFI aktivovaný, což má za následek vytvoření hemostatické zátky, která se snadněji než normálně rozpouští normální fibrinolytickou aktivitou. V případech sníženého počtu krevních destiček, thrombocytopenie, se rychlejší generování thrombinu iniciuje exogenním podáváním extra faktoru Vila. Avšak ani při vysokých koncentracích faktoru Vila není celková tvorba thrombinu normalizovaná.

U subjektů se sníženými koncentracemi fíbrinogenu v plazmě (subjekty po mnohačetných transfuzích jako následku mnohačetných poranění nebo rozsáhlého chirurgického výkonu) nedochází k plné aktivaci thrombinu. Účinnější hemostázy se poté dosahuje podáváním kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1.

·· ··»· ••·· ** • · · <· · · • · · · • · · · ♦ · · · • · · * · · • · · • · · ·· ·

9

9 9

9 9 9

9 99 9

9 9

9

Subjekty s thrombocytopenií mají poškozenou tvorbu thrombinu a defektní stabilizaci fibrinových zátek, což má za následek, že hemostatické zátky jsou náchylné k předčasnému rozpouštění. Dále subjekty po prodělání velkého úrazu nebo poškození orgánů, které následně dostaly časté krevní transfuze, mají často snížený počet krevních destiček a sníženou hladinu fibrinogenu, faktoru VIII a dalších koagulačních proteinů. U těchto subjektů dochází k nesprávné nebo snížené tvorbě thrombinu. Kromě toho snížená hladina fibrinogenu u nich negativně interferuje s aktivací faktoru XIII. Tyto subjekty mají proto defektní nebo méně účinnou hemostázu vedoucí k tvorbě fibrinových zátek, které jsou snadno a předčasně rozpouštěné proteolytickými enzymy; tyto enzymy jsou navíc extenzivně uvolňované při situacích charakterizovaných velkým rozsáhlým traumatem a poškozením orgánů.

Prostředek podle předkládaného vynálezu se podává pro usnadnění tvorby plně stabilizovaných zátek spinou kapacitou kudržení hemostázy u subjektu. Tento prostředek je zejména výhodný u subjektů se sníženým počtem krevních destiček a u subjektů se sníženou hladinou fibrinogenu a/nebo dalších koagulačních proteinů v plazmě.

Polypeptidy faktoru VII

Při provádění předkládaného vynálezu je použitelný libovolný polypeptid faktoru VII, který je účinný pro prevenci nebo léčbu krvácení. To zahrnuje polypeptidy faktoru VII získané z krve nebo plazmy, nebo připravené rekombinantními technikami.

Předkládaný vynález zahrnuje polypeptidy faktoru VII, např. s aminokyselinovou sekvencí zveřejněnou v US patentu č. 4 784 950 (divoký typ lidského faktoru VII). V některých provedeních polypeptid faktoru VII je lidský faktor Vila, zveřejněný např. v US patentu č. 4 784 950 (divoký typ lidského faktoru VII). V jedné sérii provedení polypeptidy faktoru VII zahrnují polypeptidy, které vykazují alespoň 10 %, výhodně nejméně 30 %, výhodněji nejméně 50 % a nejvýhodněji alespoň 70 % specifické biologické aktivity lidského faktoru Vila. V jedné sérii provedení polypeptidy faktoru VII zahrnují polypeptidy, které vykazují alespoň 90 %, výhodně nejméně 100 %, výhodněji nejméně 120 %, ještě výhodněji nejméně 140 % a nejvýhodněji alespoň 160 % specifické biologické aktivity lidského faktoru Vila. V jedné sérii provedení polypeptidy faktoru VII zahrnují polypeptidy, které vykazují alespoň 70 %, výhodně nejméně 80 %, ··»· «·

·« ···* ·· « • · · · • · · · · • · · · ♦·*· • · ♦ * * *· · výhodněji nejméně 90 % a nejvýhodněji alespoň 95 % identity se sekvencí divokého typu faktoru VII, jak je zveřejněná v US patentu č. 4 784 950.

Výraz „polypeptid faktoru VII“ používaný v předkládaném vynálezu zahrnuje bez omezení faktor VII i polypeptidy příbuzné faktoru VII. Výraz „faktor VII“ zahrnuje bez omezení polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí 1-406 divokého typu lidského faktoru VII (jak je zveřejněná v US patentu č. 4 784 950) i divokého typu faktoru VII získaného z jiných druhů, např. hovězí, vepřový, psí, myší a lososí faktor VII, faktor VII je přitom získaný z krve nebo plazmy nebo připravený rekombinantními technikami. Dále jsou zahrnuty přirozené allelové variace faktoru VII, které mohou existovat a vyskytovat se od jedince k jedinci. Dále se může lišit stupeň a poloha glykosylace nebo dalších posttranslačních modifikací v závislosti na vybraných hostitelských buňkách a na povaze hostitelského buněčného prostředí. Výraz „faktor Vil“ dále zahrnuje polypeptidy faktoru VII v jejich neštěpené (zymogenové) formě i ty, které byly proteolyticky upravené za vzniku jejich odpovídajících bioaktivních forem, které mohou být označeny faktor Vila.

Faktor Vlije typicky štěpen mezi zbytky 152 a 153 za vzniku faktoru Vila.

„Polypeptidy příbuzné faktoru Vil“ bez omezení zahrnují polypeptidy faktoru VII, které byly chemicky modifikované ve srovnání s lidským faktorem VII a/nebo které obsahují jednu nebo více aminokyselinových sekvenčních alterací ve srovnání s lidským faktorem VII (tzn. varianty faktoru VII), a/nebo jejichž aminokyselinové sekvence jsou zkrácené ve srovnání s lidským faktorem VII (tzn. fragmenty faktoru VII). Tyto polypeptidy příbuzné faktoru VII mohou vykazovat odlišné vlastnosti ve srovnání s lidským faktorem VII včetně stability, fosfolipidového vázání, změněné specifické aktivity, a tak podobně. Výraz „polypeptidy příbuzné faktoru VII“ dále zahrnuje tyto polypeptidy v jejich neštěpené (zymogenové) formě i ty, které byly proteolyticky upravené za vzniku jejich odpovídajících bioaktivních forem, které mohou být označeny „polypeptidy příbuzné faktoru Vila“ nebo „polypeptidy příbuzné aktivovanému faktoru VII“.

Výraz „polypeptidy příbuzné faktoru VII“ používaný v předkládaném vynálezu zahrnuje bez omezení polypeptidy vykazující vpodstatě stejnou nebo zlepšenou biologickou aktivitu ve srovnání s lidským faktorem VII, i polypeptidy, u kterých byla biologická aktivita faktoru Vila podstatně modifikovaná nebo snížená ve srovnání ·«·· «· • · * * · • · · · · • · Φ « · · • · · · * · ·· · 4» ··

V4 «··· ·* » • · · « • · · · · • * · · ···· • · ♦ » • *· ♦ s aktivitou divokého typu lidského faktoru Vila. Tyto polypeptidy zahrnují bez omezení faktor VII nebo faktor Vila, který byl chemicky modifikovaný, a varianty faktoru VII, do kterých byly zavedené specifické aminokyselinové sekvenční alterace, které modifikují nebo narušují bioaktivitu polypeptidu.

Dále jsou zahrnuty polypeptidy s lehce modifikovanou aminokyselinovou sekvencí, například polypeptidy s modifikovaným /V-terminálním koncem včetně Nterminálních aminokyselinových delecí nebo adici a/nebo polypeptidy, které byly chemicky modifikované ve srovnání s lidským faktorem Vila.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant faktoru VII, ať již vykazují vpodstatě stejnou nebo lepší bioaktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru VII, nebo vykazují podstatně modifikovanou nebo sníženou bioaktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru VII, zahrnují bez omezení polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí, která se liší od sekvence divokého typu faktoru VII insercí, delecí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, zahrnují polypeptidy, které při testování v jednom nebo více testech srážlivosti, proteolytických testech nebo dále popsaných testech vázání TF vykazují alespoň 10 %, alespoň 20 %, alespoň 25 %, alespoň 30 %, alespoň 40 %, alespoň 50 %, alespoň 60 %, alespoň 70 %, alespoň 75 %, alespoň 80 %, alespoň 90 %, alespoň 100 %, alespoň 110 %, alespoň 120 % nebo alespoň 130 % specifické aktivity divokého typu faktoru Vila, který byl připraven ve stejném buněčném typu.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, které mají vpodstatě stejnou nebo zlepšenou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru Vila, zahrnují polypeptidy, které při testování v jednom nebo více testech srážlivosti, proteolytických testech nebo dále popsaných testech vázání TF vykazují alespoň 25 %, výhodně alespoň 50 %, výhodněji alespoň 75 %, ještě výhodněji alespoň 100 %, ještě výhodněji alespoň 110 %, ještě výhodněji alespoň 120 % a nejvýhodněji alespoň 130 % specifické aktivity divokého typu faktoru Vila, který byl připraven ve stejném buněčném typu.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, které mají podstatně sníženou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru Vila, zahrnují polypeptidy, které při testování v jednom nebo více testech srážlivosti, proteolytických testech nebo «« ···· • · · · · • · · · · • · · · · · • * » · · · ·· ·· ·· • v · • · · · • · · · · • · · · ···· • · · · • ·· · dále popsaných testech vázání TF vykazují méně než 25 %, výhodně méně než 10 %, ještě výhodněji méně než 5 % a nejvýhodněji méně než 1 % specifické aktivity divokého typu faktoru Vila, který byl připraven ve stejném buněčném typu. Varianty faktoru VII mající podstatně modifikovanou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru VII zahrnují bez omezení varianty faktoru VII, které vykazují TF-independentní faktor X proteolytickou aktivitu a ty, které váží TF, ale neštěpí faktor X.

V některých provedeních polypeptidy faktoru VII jsou polypeptidy příbuzné faktoru VII, zejména varianty, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila (divoký typ FVIIa) je nejméně 1,25 při testování v „testu hydrolýzy in vitro“ (viz „Testy“, níže); v dalších provedeních je poměr nejméně 2,0; v dalších provedeních je poměr nejméně 4,0. V některých provedeních vynálezu polypeptidy faktoru VII jsou polypeptidy příbuzné faktoru VII, zejména varianty, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila (divoký typ FVIIa) je při testování v „testu proteolýzy in vitro“ (viz „Testy“, níže) nejméně 1,25; v dalších provedeních je poměr nejméně 2,0; v dalších provedeních je poměr nejméně 4,0; v dalších provedeních je poměr nejméně 8,0.

V některých provedeních polypeptid faktoru VII je lidský faktor VII, zveřejněný např. v US patentu č. 4 784 950 (divoký typ faktoru VII). V některých provedeních polypeptid faktoru VII je lidský faktor Vila. V jedné sérii provedení polypeptidy faktoru VII jsou polypeptidy příbuzné faktoru VII, které vykazují nejméně 10 %, výhodně nejméně 30 %, ještě výhodněji nejméně 50 % a nejvýhodněji 70 % specifické biologické aktivity lidského faktoru Víla. V některých provedeních mají polypeptidy faktoru VII aminokyselinovou sekvenci, která se liší od sekvence divokého typu faktoru VII insercí, delecí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin.

Nelimitující příklady variant faktoru VII vykazujících vpodstatě stejnou nebo lepší biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru Vila zahrnují, ale nejsou omezeny na příklady popsané v dánských patentových přihláškách č. PA 2000 00734 a PA 2000 01360 (odpovídá WO 01/83 725) a PA 2000 01361 (odpovídá WO 02/22 776). Nelimitující příklady variant faktoru VII vykazujících vpodstatě stejnou nebo zlepšenou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru VII zahrnují S52A-FVII, S60A-FVII (Iino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352,182-192,1998); L305V-FVII, • · · ·· · » · · » · ·

L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298QFVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,

V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,

K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298KFVII A S336G-FVII; FVIIa varianty vykazující zvýšenou proteolytickou stabilitu zveřejněné v US patentu č. 5 580 560; faktor Vila, který byl proteolyticky štěpen mezi zbytky 290 a 291 nebo mezi zbytky 315 a 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48, 501-505, 1995); a oxidované formy faktoru Vila (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363, 43-54, 1999). Nelimitující příklady variant faktoru VII, které mají podstatně sníženou nebo modifikovanou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru VII, zahrnují R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29, 3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270, 66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15, 515-520, 1998) a faktor Vila postrádající Gla doménu (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317, 245-249, 1993). Nelimitující příklady chemicky modifikovaných polypeptidů faktoru VII a sekvenčních variant jsou popsány např. v US patentu č. 5 997 864.

Biologická aktivita faktoru Vila při srážení krve se odvozuje od jeho schopnosti

i) vázat se na tkáňový faktor (TF) a ii) katalyzovat proteolytické štěpení faktoru IX nebo faktoru X za vzniku aktivovaného faktoru IX nebo X (faktoru IXa, respektive Xa).

Pro účely vynálezu lze biologickou aktivitu polypeptidů faktoru VII („biologickou aktivitu faktoru VII“) kvantifikovat měřením schopnosti přípravku vyvolat srážení krve s použitím faktor VII deficitní plazmy a thromboplastinu, jak se popisuje např. v US patentu č. 5 997 864. V tomto testu je biologická aktivita vyjádřena jako zkrácení doby srážení ve srovnání s kontrolním vzorkem a je převáděna na , jednotky faktoru VII“ po porovnání s usazeným standardem lidského séra obsahujícím 1 jednotku/ml aktivity faktoru VII. Dále lze biologickou aktivitu faktoru Vila kvantifikovat (i) měřením schopnosti faktoru Víla nebo polypeptidů příbuzného faktoru Vila produkovat aktivovaný faktor X (faktor Xa) v systému obsahujícím TF zapuštěný v lipidové membráně a faktor X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272, 19919-19924,1997);

··«· • ·

(ii) měřením hydrolýzy faktoru X ve vodném systému („proteolytický test in vitro, viz dále);

(iii) fyzikálním měřením vazby faktoru Vila nebo polypeptidu příbuzného faktoru Vila na TF s použitím přístroje na bázi povrchové plazmonové rezonance (Persson, FEBS Letts. 413, 359-363,1997);

(iv) měřením hydrolýzy syntetického substrátu faktorem Vila a/nebo polypeptidem příbuzným faktoru Vila („test hydrolýzy in vitro, viz dále); a (v) měřením tvorby thrombinu v TF-independentním in vitro systému.

Výraz „biologická aktivita faktoru VII“ nebo „aktivita faktoru VII“ zahrnuje schopnost generovat thrombin; tento výraz dále zahrnuje schopnost generovat thrombin na povrchu aktivovaných krevních destiček v nepřítomnosti tkáňového faktoru.

Přípravek s faktorem Vila, který lze použít v předkládaném vynálezu, je bez omezení NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko).

PAI-1 polypeptidy

Předkládaný vynález zahrnuje použití PAI-1 polypeptidu, např. PAI-1 polypeptidů s aminokyselinovou sekvencí, jak zveřejňuje Gils et al., Biochim Biophys Acta 1998, 1387 (1-2), 291-7; Sui et al., Biochem J. 1998, 331 (Pt2), 409-15; Ginsburg et al., J. Clin. Invest 78,1673-1680,1986, PAI-1 polypeptidů zveřejněných v US patentu č. 6 303 338; US patentu č. 6 103 498 nebo jak zveřejňuje Pannekoek et al., Journal EMBO 5(10), 2539-2544, 1986 (divoký typ PAI-1).

Při provádění předkládaného vynálezu lze použít libovolný PAI-1 polypeptid, který je účinný pro prevenci nebo léčbu krvácení. To zahrnuje PAI-1 polypeptidy získané z krve nebo plazmy, nebo připravené rekombinantními technikami. Výraz „PAI-1“ zahrnuje všechny přirozeně se vyskytující PAI-1 polypeptidy jak v aktivních formách, včetně konstitučně aktivních forem, např. PAI-1 (14-lb, Molekulové inovace), tak v konformacích latentních.

Výraz „PAI-1“ zahrnuje bez omezení polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí, jak popisuje Pannekoek et al., Journal EMBO 5 (10), 2539-2544, 1986, Gils et al., Biochim Biophys Acta 1998, 1387 (1-2), 291-7; Sui et al., Biochem J. 1998, 331 (Pt2), 409-15; Ginsburg et al., J. Clin. Invest 78, 1673-1680, 1986, nebo popsaných v US

9999 99 ·· · • 9 9 • · · · • · · 999 patentu č. 6 303 338; US patentu č. 6 103 498, a stejně tak divoký typ PAI získaný z jiných druhů, např. hovězí, vepřový, psí, myší nebo krysí PAI-1.

Dále jsou zahrnuty přirozené allelové variace PAI-1, které mohou existovat a vyskytovat se od jedince k jedinci. Dále se může lišit stupeň a poloha glykosylace nebo dalších post-translačních modifikací v závislosti na vybraných hostitelských buňkách a na povaze hostitelského buněčného prostředí. Výraz „PAI-1“ dále zahrnuje polypeptidy PAI-1 v jejich zymogenové formě i ty, které byly proteolyticky upravené za vzniku jejich odpovídajících bioaktivních forem.

„Polypeptidy příbuzné PAI-1“ bez omezení zahrnují polypeptidy PAI-1, které buď byly chemicky modifikované ve srovnání s lidským PAI-1, a/nebo které obsahují jednu nebo více aminokyselinových sekvenčních alterací ve srovnání s lidským PAI-1 (tzn. varianty PAI-1), a/nebo jejichž aminokyselinové sekvence jsou zkrácené ve srovnání s lidským PAI-1 (tzn. fragmenty PAI-1). Tyto polypeptidy příbuzné PAI-1 mohou vykazovat odlišné vlastnosti ve srovnání s lidským PAI-1 včetně stability, fosfolipidového vázání, změněné specifické aktivity, a tak podobně.

Výraz „polypeptidy příbuzné PAI-1“ dále zahrnuje tyto polypeptidy vjejich zymogenové formě i ty, které byly proteolyticky upravené za vzniku jejich odpovídajících bioaktivních forem.

Výraz „polypeptidy příbuzné PAI-1“ používaný v předkládaném vynálezu zahrnuje bez omezení polypeptidy vykazující vpodstatě stejnou nebo zlepšenou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem lidského PAI-1, i polypeptidy, u kterých byla biologická aktivita PAI-1 podstatně modifikovaná nebo snížená ve srovnání s aktivitou divokého typu lidského PAI-1. Tyto polypeptidy zahrnují bez omezení PAI-1, který byl chemicky modifikovaný, a varianty PAI-1, do kterých byly zavedené specifické aminokyselinové sekvenční alterace, které modifikují nebo narušují bioaktivitu polypeptidu.

Dále jsou zahrnuty polypeptidy s lehce modifikovanou aminokyselinovou sekvencí, například polypeptidy s modifikovaným V-terminálním koncem včetně V-terminálních aminokyselinových delecí nebo adicí a/nebo polypeptidy, které byly chemicky modifikované ve srovnání s lidským PAI-1.

···· ·· · ···· ·· « · · · · · · «« · · ·· ·

Polypeptidy příbuzné PAI-1, včetně variant PAI-1, ať již vykazují vpodstatě stejnou nebo lepší bioaktivitu ve srovnání s divokým typem PAI-1, nebo vykazují podstatně modifikovanou nebo sníženou bioaktivitu ve srovnání s divokým typem PAI-1, zahrnují bez omezení polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí, která se liší od sekvence divokého typu PAI-1 insercí, delecí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin.

Polypeptidy příbuzné PAI-1, včetně variant, zahrnují polypeptidy, které při testování testu aktivity PAI-1 popsaném v předkládaném popise vykazují alespoň 10 %, alespoň 20 %, alespoň 30 %, alespoň 40 %, alespoň 50 %, alespoň 60 %, alespoň 70 %, alespoň 80 %, alespoň 90 %, alespoň 100 %, alespoň 110 %, alespoň 120 % nebo alespoň 130 % specifické aktivity divokého typu PAI-1, který byl připraven ve stejném buněčném typu.

Polypeptidy příbuzné PAI-1, včetně variant, které mají vpodstatě stejnou nebo zlepšenou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem PAI-1, zahrnují polypeptidy, které při testování v jednom nebo více popsaných testech specifické aktivity PAI-1 vykazují alespoň 25 %, výhodně alespoň 50 %, výhodněji alespoň 75 %, ještě výhodněji alespoň 100 %, ještě výhodněji alespoň 110 %, ještě výhodněji alespoň 120 % a nejvýhodněji alespoň 130 % specifické aktivity divokého typu PAI-1, který byl připraven ve stejném buněčném typu. Pro účely vynálezu lze biologickou aktivitu PAI-1 kvantifikovat měřením schopnosti přípravku inhibovat tPA-řízenou lýzy sraženiny nebo plazminem-řízenou lýzy sraženiny, např. jak se popisuje v předkládaném vynálezu. V obou testech se biologická aktivita vyjadřuje jako zkrácení doby lýzy sraženiny ve srovnání s kontrolním vzorkem. Dále lze biologickou aktivitu PAI-1 kvantifikovat měřením inhibice tPA amidolytické aktivity PAI-1 a/nebo ekvivalentem PAI-1, jak popisuje např. Chandler et al., Clinical Chemistry 35 (5), 787-793, 1989, nebo v testu na imunosorbentu pro funkční lidský PAI-1 svázaným enzymem (HPAIKT, Molekulární inovace) nebo jinými testy v oboru známými.

Polypeptidy příbuzné PAI-1, včetně variant, které mají podstatně sníženou biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem PAI-1, jsou polypeptidy, které při testování v jednom nebo více testech specifické aktivity PAI, jak je popsáno výše, vykazují méně než 25 %, výhodně méně než 10 %, ještě výhodněji méně než 5 % a

·«·· ♦· • · · • · · • · · · • · · · ·· · · nej výhodněji méně než 1 % specifické aktivity divokého typu PAI-1, který byl připraven ve stejném buněčném typu.

Nelimitující příklady ekvivalentů PAI-1 zahrnují ekvivalenty PAI-1 popsané např. v US patentu č. 6 103 498.

V některých provedeních polypeptidy PAI-1 jsou ekvivalenty PAI-1, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu PAI-1 a aktivitou přirozeného lidského PAI-1 (divoký typ PAI-1) je nejméně 1,25 při testování v „testu PAI-1“ (Chandler et al., Clinical Chemistry 35 (5), 787-793. 1989; viz výše); v dalších provedeních je poměr nejméně 2,0; v dalších provedeních je poměr nejméně 4,0.

Polypeptidy příbuzné PAI-1 dále zahrnují fragmenty PAI-1 nebo polypeptidu příbuzných PAI, které si zachovávají charakteristickou aktivitu spojenou s hemostázou. Aktivitu spojenou s hemostázou lze u polypeptidu PAI-1 měřit například s použitím testu aktivity PAI-1 popsaného v předkládaném popise.

Definice

V předkládaném vynálezu se používají trojpísmenné nebo jednopísmenné kódy aminokyselin v jejich běžném významu, jak jsou uvedeny v tabulce 1. Pokud není uvedeno jinak, jsou zde uváděné aminokyseliny L-aminokyseliny. Pro vysvětlení se uvádí, že první písmeno např. v K337 znamená aminokyselinu přirozeně se vyskytující v uvedené poloze divokého typu faktoru VII, takže např. [K337A]-FVIIa označuje variantu FVII, kde aminokyselina označená jednopísmenným kódem K přirozeně přítomná v uváděné poloze je nahrazena aminokyselinou označenou jednopísmenným kódem A.

····

Tabulka 1. Zkratky aminokyselin

Aminokyselina	Trojpísmenný kód	Jednopísmenný kód
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	Ile	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Fenylalanin	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	W
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gin	Q
Asparagin	Asn	N
Kyselina glutamová	Glu	E
Kyselina aspartová	Asp	D

Výraz „faktor Vila“ nebo „FVIIa“ lze používat zaměnitelně.

Výraz „subjekty s poškozenou tvorbou thrombinu“ v kontextu předkládaného vynálezu znamená subjekty, které nemohou plně generovat výron thrombinu na povrchu aktivovaných krevních destiček, a zahrnuje subjekty, u nichž se generuje thrombin méně než u subjektů s plně funkčním normálním hemostatickým systémem, včetně normálního množství a funkce koagulačních faktorů, krevních destiček a fibrinogenu (např. jako v usazené, normální lidské plazmě), a zahrnuje bez omezení subjekty postrádající faktor VIII; subjekty se sníženým počtem krevních destiček nebo destiček s defektní funkcí ···· *· ·· ···· ♦ · • · · • ···· (např. thrombocytopenií nebo Glanzmannovou thrombastenií nebo subjekty s nadměrným krvácením); subjekty se sníženou hladinou prothrombinu, FX nebo FVII; subjekty se sníženou hladinou několika koagulačních faktorů (např. kvůli nadměrnému krvácení jako následku úrazu nebo velkého chirurgického výkonu); a subjekty se sníženou koncentrací fíbrinogenu v plazmě (např. subjekty po mnohačetných transfuzích).

Výraz „úroveň tvorby thrombinu“ nebo „normální tvorba thrombinu“ znamenají úroveň tvorby thrombinu u pacienta ve srovnání se zdravým subjektem. Úroveň je vyjádřena jako procenta normální úrovně. Kde je to vhodné, mohou být tyto výrazy používány zaměnitelně.

Výraz „zlepšení hemostatického systému“ znamená zlepšení schopnosti tvořit thrombin. Výraz „zlepšení hemostázy“ zahrnuje situace, kdy je měřená tvorba thrombinu u testovaného vzorku obsahujícího přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 při testování ve stejném testu tvorby thrombinu prodloužena ve srovnání s individuální tvorbou thrombinu u kontrolního vzorku obsahujícího pouze faktor VII nebo polyleptid příbuzný faktoru VII, respektive PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1. Tvorbu thrombinu lze testovat způsobem popsaným v testu tvorby thrombinu popsaném v předkládaném popisu (viz část „Testy“).

Výrazy „samotná“ činidla nebo „samotné“ faktory používané v předkládaném vynálezu popisují situace, kdy faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1, brány společně, jsou jediná hemostatická činidla nebo aktivní hemostatická činidla nebo koagulační faktory obsažené ve farmaceutickém prostředku nebo soupravě, nebo to jsou jediná hemostatická činidla nebo aktivní hemostatická činidla nebo koagulační faktory podávané pacientovi během léčby, např. během určitého záchvatu krvácení. Rozumí se, že tyto situace zahrnují situace, kdy jiná hemostatická činidla nebo koagulační faktory, pokud jsou použity, nejsou přítomny buď v dostatečném množství, nebo aktivitě, aby podstatně ovlivňovaly jeden nebo více koagulačních parametrů.

Doba lýzy sraženiny, pevnost sraženiny, tvorba fíbrinové sraženiny a doba srážlivosti jsou klinické parametry používané pro testování hemostatického systému u ···· • · · · » · • · · · • · · · • · · · · • · · « · *· · · • · « · · • ··· • · pacientů. Ve vhodných intervalech se pacientu odebírají vzorky krve a testuje se jeden nebo více parametrů například pomocí thromboelastografie, jak popisuje např. Meh et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis 12, 627-637, 2001; Vig et al., Hematology 6(3), 205213, 2001; Vig et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis 12(7), 555-561,2001; Glidden et al., Clinical and Aplied Thrombosis/Hemostasis 6(4), 226-233, 2000; McKenzie et al., Cardiology 92(4), 240-247, 1999; nebo Davis et al., Journal of the American Society of Nephrology 6(4), 1250-1255,1995.

Výraz „prodloužení doby lýzy sraženiny“ zahrnuje situace, kdy se při testování ve stejném testu lýzy sraženiny měřená doba lýzy sraženiny u testovaného vzorku obsahujícího přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 prodlužuje ve srovnání s individuální dobou lýzy sraženiny u kontrolního vzorku obsahujícího pouze přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, respektive pouze přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. Dobu lýzy sraženiny lze testovat popsaným způsobem.

Výraz „zvýšení pevnosti sraženiny“ zahrnuje situace, kdy se při testování ve stejném testu pevnosti sraženiny měřená pevnost sraženiny, např. mechanická pevnost, u testovaného vzorku obsahujícího přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 zvyšuje ve srovnání s individuální dobou lýzy sraženiny u kontrolního vzorku obsahujícího pouze přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, respektive pouze přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. Pevnost sraženiny lze testovat např. způsobem, který popisuje Carr et al., 1991 (Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation, AM. J. Med. Sci 1991, 302,13-8), nebo jak se popisuje výše pomocí thromboelastografie.

Výraz „zlepšení tvorby fibrinové sraženiny“ zahrnuje situace, kdy se při testování ve stejném testu srážení měřená rychlost nebo stupeň tvorby fibrinové sraženiny u testovaného vzorku obsahujícího přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 zvyšuje ve srovnání s individuální rychlostí nebo stupněm tvorby fibrinové sraženiny u kontrolního vzorku obsahujícího pouze přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem ···· »· ·· «··· příbuzným faktoru VII, respektive pouze přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. Tvorbu fibrinové sraženiny lze testovat způsobem popsaným výše.

Výraz „zkrácení doby srážlivosti“ zahrnuje situace, kdy je při testování ve stejném testu srážení měřená doba vzniku sraženiny (srážlivost) u testovaného vzorku obsahujícího přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 zvýšená ve srovnání s individuální dobou srážlivosti u kontrolního vzorku obsahujícího pouze přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, respektive pouze přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. Srážlivost lze testovat pomocí standardních PT a aPTT testů, které jsou odborníkům známé.

Výraz „snížený počet nebo aktivita krevních destiček“ odpovídá počtu krevních destiček (thrombocytů) přítomných v plazmě subjektu a biologické koagulační aktivitě těchto krevních destiček. Snížené počty mohou být způsobené např. zvýšenou destrukcí krevních destiček, sníženým produkováním krevních destiček a hromaděním větší než normální frakce krevních destiček ve slezině. Thrombocytopenie je například definovaná nižším počtem krevních destiček než je 150 000 krevních destiček v mikrolitru; horní hranice normálního počtu krevních destiček je obecně uznávaná jako 350 000 až 450 000 krevních destiček v mikrolitru. Počet krevních destiček lze měřit pomocí automatických čítačů krevních destiček; to je odborníkům dobře známá metoda. Syndromy sníženého počtu krevních destiček zahrnují bez omezení thrombocytopenii, koagulopatii.,Aktivita“ zahrnuje bez omezení agregaci, adhezi a koagulační aktivitu krevních destiček. Snížená aktivita může být způsobena např. abnormalitami glykoproteinů, abnormální interakcí membrána-cytoskelet, abnormalitami granulí krevních destiček, abnormalitami koagulační aktivity krevních destiček, abnormalitami signální transdukce a sekrece. Aktivita krevních destiček včetně agregace, adheze a koagulační aktivity se měří standardními metodami odborníkům známými, viz např. Platelets. A Practical Approach, Ed. S.P Watson & K.S. Authi: Clinical Aspects of Platelets Disorders (K.J. Clemetson) 15, 299-318, 1996, Oxford University Press; Williams Hematology, Sixth Edition Eds. Beutler, Lichtman, CoIIer, Kipps & Seligson, 2001, McGraw-HilI. Syndromy sníženého počtu krevních destiček zahrnují bez omezení Glanzmannovu thrombasthenii, BemardSoulierův syndrom, antikoagulační léčbu a thrombolytickou léčbu. Výraz „snížený“ se ···· ·· • · « * • · vztahuje k počtu nebo aktivitě vzorku testované plazmy ve srovnání s počtem nebo aktivitou vzorku normální usazené plazmy při měření ve stejném testu.

Výraz „krvácivá choroba“ se zde používá k označení jakéhokoliv defektu, vrozeného, získaného nebo indukovaného, buněčného nebo molekulárního původu, který se projevuje záchvaty krvácení. Příklady záchvatů krvácení zahrnují, ale nejsou omezeny na deficit faktorů srážení (např. deficit koagulačních faktorů VIII, IX, XI nebo VII), inhibitory faktorů srážení, špatnou funkci krevních destiček (např. Glanzmannova thrombasthenie, Bemard-Soulierův syndrom), thrombocytopenii, von Willebrandovu chorobu a koagulopathii způsobenou např. rozpouštěním koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzou a sníženým počtem krevních destiček způsobeným krvácením a/nebo transfuzemi (např. u subjektů po mnohačetných transfuzích, vystavených chirurgickému výkonu nebo úrazu).

Krvácení označuje výron krve z jakékoliv části oběhového systému. Výraz „záchvaty krvácení“ zahrnuje nežádoucí, nekontrolované a často nadměrné krvácení v souvislosti s chirurgickým výkonem, úrazem nebo dalšími formami poničení tkáně, stejně jako nežádoucí krvácení u subjektů skrvácivými chorobami. K záchvatům krvácení může docházet u subjektů, které mají v zásadě normální koagulační systém, ale prodělávají (dočasnou) koagulopathii, nebo u subjektů, které mají vrozené nebo získané poruchy koagulace nebo krvácivé choroby. U subjektů se špatnou funkcí krevních destiček se krvácení může přirovnat krvácení způsobenému hemofilií, protože hemostatický systém, jako při hemofilii, postrádá nebo má abnormální nezbytné srážecí „sloučeniny“ (např. krevní destičky nebo protein von Willebrandova faktoru). U subjektů, které prodělávají nadměrné poničení tkáně, např. ve spojení s chirurgickým výkonem nebo rozsáhlým úrazem, může být normální hemostatický mechanismus překonán požadavkem okamžité hemostázy, a může u nich dojít k nadměrnému krvácení i přes vzásadě normální hemostatický mechanismus (před úrazem nebo před chirurgickým výkonem). U těchto subjektů, které dále často dostávají mnoho transfuzí, se vyvine (dočasná) koagulopathie jako výsledek krvácení a/nebo transfuzí (tzn. rozpouštění koagulačních proteinů, zvýšená fibrinolýza a snížený počet krevních destiček kvůli krvácení a/nebo transfuzím). Ke krvácení může dále docházet v orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha a očí; v těchto oblastech jsou omezené možnosti chirurgické ···· ·* • · « • · « • · • · · • »·· • · hemostázy, a tedy problematické dosažení uspokojivé hemostázy. Podobné problémy mohou nastat při odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, tumorové tkáně, gastrointestinální trakt) stejně jako při laparoskopické chirurgii a radikální retropubické prostatektomii. Společné pro všechny tyto situace je obtížnost dosáhnout hemostázy chirurgickými technikami (sešití, svorky, atd.), což je stejný případ jako difuzní krvácení (např. hemoragická gastritida a profúzní děložní krvácení). Ke krvácení může dále docházet u subjektů procházejících antikoagulační léčbou, u kterých je defektní hemostáza indukovaná podávanou léčbou; tato krvácení jsou často akutní a profuzní. Antikoagulační léčba se často nasazuje jako prevence thromboembolie. Taková léčba může zahrnovat heparin, další formy proteoglykanů, warfarin nebo další formy antagonistů vitamínu K, aspirin a další inhibitory agregace krevních destiček, jako např. protilátky nebo další inhibitory aktivity GP Ilb/IIIa. Krvácení může být způsobeno dále takzvanou thrombolytickou léčbou, která zahrnuje kombinovanou léčbu činidlem působícím proti krevním destičkám (např. kyselina acetylsalicylová), antikoagulantem (např. heparin) a fíbrinolytickým činidlem (např. aktivátor tkáňového plazminogenu, tPA). Záchvaty krvácení dále zahrnují, ale nejsou omezeny na nekontrolovatelné a nadměrné krvácení ve spojení s chirurgickým výkonem nebo úrazem u subjektů trpících akutní hemartrózou (krvácením v kloubech), chronickou hemofilní arthropatií, hematomy (např. svalové, retroperitoneální, sublinguální a retrofaryngální), krvácením v dalších tkáních, hematurií (krvácení zrenálního traktu), cerebrálním krvácením, chirurgickým výkonem (např. hepatektomie), dentální extrakcí a gastrointestinálním krvácením (např. UGI krvácení). Záchvaty krvácení mohou být spojené s inhibitory faktoru VIII; hemofílií A; hemofílií A s inhibitory; hemofílií B; deficitem faktoru VII; deficitem PAI-1; thrombocytopenií; deficitem von Willebrandova faktoru (von Willebrandova choroba); vážným poničením tkáně; vážným úrazem; chirurickým výkonem; laparoskopickým chirurickým výkonem; hemorhagickou gastritidou; odebíráním biopsií; antikoagulační léčbou; horním gastrointestinálním krvácením (UGI); nebo transplantací kmenových buněk. Záchvaty krvácení mohou být profúzní děložní krvácení; krvácení vyskytující se v orgánech s omezenou možností pro mechanickou hemostázu; krvácení v mozku; krvácení v oblasti vnitřního ucha nebo v očích. Výrazy „záchvaty krvácení“ a „krvácení“ lze používat tam, kde to je vhodné, zaměnitelně.

·« **··

·· · «··· ·· • · · « · · « · · · «· ··

V předkládaném vynálezu používaný výraz „léčba“ zahrnuje jak prevenci předpokládaného krvácení, např. při chirurgickém výkonu, tak i regulaci již se vyskytujícího krvácení, např. při úrazu, za účelem zástavy nebo minimalizace krvácení. Výše uváděné „předpokládané krvácení“ může být krvácení očekávané v určitém orgánu nebo tkáni, nebo se může jednat o nespecifikované krvácení. Ve výrazu „léčba“ je tedy zahrnuto profylaktické podávání přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1.

Výraz „subjekt“ používaný v předkládaném vynálezu zahrnuje jakékoliv zvíře, zejména savce, např. lidi, a lze jej, kde to je příhodné, používat zaměnitelně s výrazem „pacient“. Předkládaný vynález dále zahrnuje použití polypeptidů příbuzných faktoru VII nebo PAI-1 a tPA inhibitorů během veterinárních postupů.

Faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidy příbuzné PAI-1, jak jsou definované v předkládaném vynálezu, mohou být podávány simultánně nebo postupně. Faktory mohou být dodávány ve formě jediné dávky obsahující oba koagulační faktory, nebo ve formě soupravy složek obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII jako první jednotku dávkové formy a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 jako druhou jednotku dávkové formy. Kdykoliv je v předkládaném popise zmiňovaná první nebo druhá nebo třetí, atd. dávková jednotka, neurčuje se tím výhodné pořadí podávání, ale jedná se pouze o výhodné označení.

„Simultánní“ dávkování přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 znamená podávání proteinů koagulačích faktorů ve formě jediné dávky, nebo podání proteinu prvního koagulačního faktoru následované podáním proteinu druhého koagulačního faktoru s časovým odstupem menším než 15 minut, výhodně 10, výhodněji 5, ještě výhodněji 2 minuty. Jako první může být podáván libovolný faktor.

„Postupné“ dávkování znamená podání proteinu prvního koagulačního faktoru následované podáním proteinu druhého koagulačního faktoru s časovým odstupem až 2 hodiny, výhodně 1 až 2 hodiny, výhodněji 1 hodina, ještě výhodněji 30 minut až 1 hodina, ještě výhodněji do 30 minut a ještě výhodněji 15 až 30 minut. Jako první lze ·· ···· ♦ · ·♦ • * * · • · • · · • · ·· ♦ · ·· • · • · · • ♦♦· • · podávat libovolnou ze dvou dávkových jednotek nebo proteinů koagulačních faktorů. Výhodně se oba přípravky injekčně vpravují stejným intravenózním vstupem.

„Úroveň PAI-l“ nebo „PAI-1 úroveň“ znamená úroveň PAI-1 aktivity u pacienta ve srovnání s úrovní aktivity zdravých subjektů. Úroveň aktivity je udávána v procentech normální úrovně aktivity. Výrazy lze tam, kde to je vhodné, používat zaměnitelně.

„Snížená úroveň PAI-1“ nebo „snížená PAI-1 úroveň“ znamená sníženou přítomnost nebo aktivitu PAI-1 v krevním toku ve srovnání s úrovní PAI-1 v populaci subjektů bez poruchy PAI-1 nebo inhibitorů PAI-1. Úroveň cirkulujícího PAI-1 lze měřit buď koagulačním, nebo imunologickým testem. Aktivita PAI-1 se stanoví ze schopnosti plazmy pacienta opravit srážlivost PAI-1 deficitní plazmy (např. test APTT, viz dále; viz též část „Testy“ v předkládaném vynálezu).

Jedna jednotka PAI-1 je definovaná jako množství PAI-1 přítomné v jednom mililitru normální (usazené) lidské plazmy (odpovídající PAI-1 úrovni 100 %).

Jedna jednotka faktoru Vlije definovaná jako množství faktoru VII přítomné v 1 ml normální plazmy, odpovídající 0,5 jag proteinu. Po aktivaci odpovídá 50 jednotek 1 μ% proteinu.

„Deficit“ znamená pokles přítomnosti nebo aktivity, např. PAI-1, v plazmě ve srovnání s normálním stavem u zdravých jedinců. Výraz lze tam, kde to je příhodné, použít zaměnitelně s výrazem „redukovaná úroveň PAI-1“.

„APTT“ nebo „aPTT“ znamená aktivovaný parciální thromboplastinový čas (popisuje např. Proctor RR, Rapaport SI: The partial thromboplastin time with kaolin; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiences. Am. J. Clin. Pathol. 36, 212, 1961).

„Syndrom responzivní na PAI-1“ znamená syndrom, kde PAI-1, podávaný exogenně subjektu spotřebou takové léčby, může předcházet, léčit nebo zlepšovat jakékoliv symptomy, stavy nebo choroby, očekávané nebo již nastalé, způsobené syndromem. Bez omezení jsou zahrnuty syndromy způsobené sníženou úrovní PAI-1, např. krvácivé choroby vyvolané inhibitory PAI-1. Syndrom responzivní na PAI-1 lze také léčit prostředkem podle předkládaného vynálezu.

„Syndrom responzivní na faktor VII“ znamená syndrom, kde exogenní faktor VII, výhodně faktor Vila, podávaný subjektu s potřebou takové léčby, může předcházet, léčit

·· ···· ···· ·· • · • · • · · • · nebo zlepšovat jakékoliv symptomy, stavy nebo choroby, očekávané nebo již nastalé, způsobené syndromem. Bez omezení jsou zahrnuty syndromy způsobené sníženou úrovní srážecích faktorů VIII, IX, XI nebo VII, inhibitory srážecích faktorů, špatnou funkcí krevních destiček (např. Glanzmannova thrombasthenie a Bemard-Soulierův syndrom), thrombocytopenií, von Willebrandovou chorobou a koagulopathií např. způsobenou rozpouštěním koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzou a sníženým počtem krevních destiček způsobeným krvácením a/nebo transfuzemi (např. u subjektů po mnohačetných transfuzích, vystavených chirurgickému výkonu nebo úrazu).

„Poločas“ znamená dobu potřebnou k tomu, aby se koncentrace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII nebo PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 v plazmě snížila z určité hodnoty na hodnotu poloviční.

„Primární hemostáza“ znamená počáteční generování thrombinu faktorem Xa a TF: faktorem Vila, následnou aktivaci krevních destiček a tvorbu počáteční řídké zátky zaktivovaných adherovaných krevních destiček, které ještě nebyly stabilizovány fibrinem a nakonec zesíťovaným fibrinem. Pokud není zátka stabilizovaná fibrinem vytvořeným během druhého kroku hemostatického procesu (udržování hemostázy), snadno se rozpouští fibrinolytickým systémem.

„Sekundární hemostáza“ nebo „udržovaná hemostáza“ znamená sekundární, plný a hlavní výron nebo tvorbu thrombinu, k níž dochází na povrchu aktivovaných krevních destiček, a která je katalyzovaná faktorem Vlila a faktorem Vila, následnou tvorbu fibrinu a stabilizaci počáteční zátky z krevních destiček. Stabilizace zátky fibrinem vede k úplné hemostáze.

„Úplná hemostáza“ znamená vytvoření stabilní a pevné fibrinové sraženiny nebo zátky na místě poranění, která účinně zastaví krvácení a která se snadno nerozpouští fibrinolytickým systémem. V tomto kontextu se výraz hemostáza bude používat pro označení úplné hemostázy výše popsané.

Celkové množství proteinu v přípravku lze měřit obecně známými metodami, např. měřením optické hustoty. Množství proteinu PAI-1 nebo faktoru VII („antigenu“) lze měřit obecně známými metodami jako jsou standardní imunologické testy Elisa. Obecně se takový test provádí spojením roztoku přípravku obsahujícího protein PAI-1 s antithrombomodulinovou protilátkou imobilizovanou na desce pro Elisa-test, následně

···· ·* • · ♦ ♦ · ^e ♦ · · »·

9

9 9

9 9 9

9 · ·*·· · · ·· · spojením mobilizovaného komplexu protilátka-PAI-1 s druhou anti-PAI-1 protilátkou opatřenou markérem, jehož množství se měří ve třetím kroku. Množství každého koagulaěního faktoru lze měřit podobným způsobem s použitím odpovídajících protilátek. Celkové množství proteinu koagulaěního faktoru přítomného v přípravku se stanoví součtem množství proteinů individuálních koagulačních faktorů. V jednom provedení přípravek obsahuje isolovaný koagulační faktor. V jiném provedení je přípravek vpodstatě zbavený koagulaěního faktoru II a koagulaěního faktoru Ha (prothrombin a thrombin) a/nebo faktoru X nebo Xa.

Výraz „isolovaný“ se v předkládaném vynálezu používá k označení koagulačních faktorů, např. PAI-1 nebo polypeptidů příbuzných PAI-1, které byly separované z buňky, ve které byly syntetizovány, nebo média, ve kterém se nacházejí v přirozeném stavu (např. plazma nebo krev). Separaci polypeptidů z jejich původní buňky lze provádět libovolným způsobem v oboru známým, včetně a bez omezení na odstranění kultivačního buněčného média obsahujícího žádaný produkt z adherentní buněčné kultury, centrifugace nebo filtrace k odstranění neadherovaných buněk, a tak podobně. Separaci polypeptidů z média, ve kterém se nacházejí v přirozeném stavu, lze provádět libovolným způsobem v oboru známým, včetně a bez omezení na afinitní chromatografii jako je např. na koloně s protilátkou anti-faktor VII, respektive anti-PAI-1; hydrofobní interakční chromatografii, elektroforetické metody (např. preparativní isoelektrická fokuzace (IEF), rozdílnou rozpustnost (např. srážení síranem amonným) nebo extrakci, a tak podobně.

„Účinné množství“ faktoru VII nebo polypeptidů příbuzného faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidů příbuzného PAI-1 je v předkládaném vynálezu definované jako množství faktoru VII nebo polypeptidů příbuzného faktoru VII, např. FVIIa, a PAI-1 nebo polypeptidů příbuzného PAI-1, které společně postačuje k prevenci nebo zmenšení krvácení nebo ztráty krve, aby léčilo, zmírnilo nebo částečně zastavilo chorobu a její komplikace.

Výraz „aktivita faktoru VII“ zahrnuje schopnost generovat thrombin, výraz dále zahrnuje schopnost generovat thrombin na povrchu aktivovaných krevních destiček v nepřítomnosti tkáňového faktoru.

Zkratky

TF

FVII

FVIIa rFVIIa

TAFI

PAI-1 tkáňový faktor faktor VII v neaktivované formě s jediným řetězcem faktor VII v aktivované formě rekombinantní faktor VII v aktivované formě TAFI v zymogenové, neaktivované formě inhibitor aktivátoru plasminogenu

Příprava sloučenin

Čištěný lidský faktor Vila vhodný pro použití v předkládaném vynálezu je výhodně připravený DNA rekombinantní technikou, kterou popisuje např. Hagen at al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 2412-2416, 1986, nebo která je popsaná v evropském patentu č. 200 421 (ZymoGenetics, lne.).

Faktor VII může být dále připraven matodami, které popisují Brože a Majerus, J. Biol. Chem. 255(4), 1242-1247, 1980, a Hedner a Kisiel, J. Clin. Invest. 71, 1836-1841, 1983. Tyto metody poskytují faktor VII bez detekovatelného množství dalších faktorů koagulace krve. Čistší přípravek s faktorem VII lze získat zařazením další gelové filtrace jako finálního čistícího kroku. Faktor VII se poté převádí na aktivovaný faktor Vila známými metodami, např. několika různými plazmovými proteiny, např. PAI-lIa, IXa nebo Xa. Jinak lze faktor VII aktivovat způsobem, který popisuje Bjoem et al., Research Disclosure 269, 564-565, září 1986, průchodem skrz iontoměničovou chromatografickou kolonu, např. Mono Q® (Pharmacia Fine Chemicals), nebo podobně.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII lze připravit modifikací divokého typu faktoru VII nebo rekombinantní technologií. Polypeptidy příbuzné faktoru VII se změněnou aminokyselinovou sekvencí ve srovnání s divokým typem faktoru VII lze připravit modifikováním sekvence nukleových kyselin kódující divoký typ faktoru VII buď alterací aminokyselinových kodonů, nebo odstraněním některých aminokyselinových kodonů vnukleové kyselině kódující divoký typ faktoru VII známými způsoby, např. místně specifickou mutagenezí.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že substituce lze provádět mimo oblasti kritické pro funkci molekuly faktoru Vila nebo PAI-1, a stále budou mít za výsledek «· ·»«· ·· · • · * • · « « · · · • · ·· ·*· aktivní polypeptid. Aminokyselinové zbytky nezbytné pro aktivitu faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII nebo PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1, a tedy výhodně nepodléhající substituci, mohou být identifikované postupy známými v oboru, např. místně řízenou mutagenezí nebo alanin-skenovací mutagenezí (viz např. Cunningham a Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). Při tomto postupu jsou mutace zaváděny do každého pozitivně nabitého zbytku v molekule, a výsledné mutantní molekuly jsou testované na koagulaění aktivitu, respektive aktivitu zesíťování, aby se identifikovaly aminokyselinové zbytky, které jsou kritické pro aktivitu molekuly. Místa interakce substrát-enzym mohou být dále stanovena analýzou trojrozměrné struktury stanovené např. analýzou nukleární magnetické rezonance, krystalografie nebo fotoafinitního značení (viz např. de Vos et al., Science 255, 306-312, 1992; Smith et al., Journal of Molecular Biology 224, 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Letters 309, 59-64, 1992).

Zavedení mutace do sekvence nukleové kyseliny pro záměnu jednoho nukleotidu za jiný nukleotid lze provést místně řízenou mutagenezí s použitím jakékoholiv způsobu známého v oboru. Zejména užitečný je postup využívající superstočený dvojvláknový DNA vektor se zvoleným inzertem a dva syntetické primery obsahující požadovanou mutaci. Oligonukleotidové primery, každý komplementární k opačným vláknům vektoru, se prodlužují během tepelného cyklení prostřednictvím Piu DNA polymerázy. Po inkorporaci primerů se generuje mutovaný plazmid obsahující střídavě uspořádané zářezy. Po tepelném cyklení se k produktu přidá DpnI, specifický pro methylovanou a hemimethylovanou DNA pro štěpení mateřského DNA templátu a pro výběr syntetizované DNA obsahující mutace. Použitelné jsou další postupy známé v oboru pro vytváření, identifikování a isolaci variant, například míchání genů (gene shufflin) nebo technika displeje fágů (phage display).

Separaci polypeptidů z jejich původní buňky lze provádět libovolným způsobem v oboru známým, včetně a bez omezení na odstranění kultivačního buněčného média obsahujícího žádaný produkt zadherentní buněčné kultury, centrifugace nebo filtrace k odstranění neadherovaných buněk, a tak podobně.

Výhodně lze faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII dále čistit. Čištění se provádí s použitím libovolného způsobu v oboru známého, včetně a bez omezení na ···· • · • · • * • · · • · ·« ♦ ·<*·

♦ ·· · • ♦ • · · • ···· • · · ·· · afinitní chromatografii, např. na koloně s protilátkou proti faktoru VII (viz např. Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261, 11097, 1986 a Thim et al., Biochem. 27, 7785, 1988); chromatografii využívající hydrofobní interakce; iontoměničovou chromatografii; velikostně vylučovací chromatografii; elektroforetické metody (např. preparativní isoelektrická fokusace (IEF)), rozdílnou rozpustnost (např. srážení síranem amonným) nebo extrakci, a tak podobně. Viz obecné Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York 1982; a Protein Purification, editors J.C. Janson a Lars Ryden, VCH Publishers, New York 1989. Po čištění přípravek obsahuje výhodně méně než 10 hmot. %, výhodněji méně než 5 hmot. % a nejvýhodněji méně než 1 hmot. % polypeptidů nepatřících faktoru VII nebo polypeptidům příbuzným faktoru VII získaných z hostitelské buňky.

Faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII lze aktivovat proteolytickým štěpením, s použitím PAI-1 Ia nebo dalších proteáz vykazujících specifitu podobnou trypsinu, např. faktor IXa, kalikrein, faktor Xa a thrombin. Viz. Např. Osterud et al., Biochem. 11, 2853, 1972; Thomas, US patent č. 4 456 591; a Hedner et al., J. Clin. Invest 71, 1836, 1983. Dále lze faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII aktivovat průchodem skrz iontoměničovou chromatografickou kolonu, např. Mono Q® (Pharmacia), nebo podobně. Výsledný aktivovaný faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII lze poté formulovat a podávat způsobem popsaným dále.

PAI-1 pro použití v rámci předkládaného vynálezu lze isolovat např. z krevních destiček nebo buněk endothelu známými metodami, výhodné je však použít rekombinantní PAI-1, aby se zamezilo použití produktů odvozených z krve nebo tkáně, které nesou riziko přenosu chorob. Způsoby isolace PAI-1 a přípravy rekombinantního PAI-1 jsou v oboru známé, viz např. Pannekoek et al., Journal EMBO J. 5 (10), 25392544, 1986, Gils et al., Biochim. Biophys. Acta 1387 (1-2), 291-7, 1998; Sui et al., Biochem. J. 331 (Pt 2), 409-15, 1998; Ginsburg et al., J. Clin. Invest 78, 1673-1680, 1986; nebo US patenty č. 6 303 338 a 6 103 498. Varianty PAI-1 lze vyrobit metodami místně cílené mutageneze popsanými výše.

Polypeptidy příbuzné PAI-1 lze vyrobit modifikací divokého typu PAI-1 nebo rekombinantní technologií. Polypeptidy příbuzné PAI-1 se změněnou aminokyselinovou sekvencí ve srovnání s divokým typem PAI-1 lze připravit modifikováním sekvence ·♦** ·» • · · ·« • · · « ·· ♦· ·♦ nukleových kyselin kódující divoký typ PAI-1 buď alterací aminokyselinových kodonů, nebo odstraněním některých aminokyselinových kodonů vnukleové kyselině kódující divoký typ PAI-1 známými způsoby, např. místně specifickou mutagenezí, která se detailněji popisuje výše. Separaci polypeptidů z jejich původní buňky lze provádět libovolným způsobem v oboru známým, včetně a bez omezení na odstranění kultivačního buněčného média obsahujícího žádaný produkt z adherentní buněčné kultury, centrifugace nebo filtrace k odstranění neadherovaných buněk, a tak podobně. Výhodně lze PAI-1 nebo polypeptidy příbuzné PAI-1 dále čistit. Čištění se provádí s použitím libovolného způsobu v oboru známého, včetně a bez omezení na afinitní chromatografii, např. na koloně s protilátkou proti PAI-1; chromatografii využívající hydrofobní interakce; iontoměničovou chromatografii; velikostně vylučovací chromatografii; elektroforetické metody (např. preparativm isoelektrická fokusace (IEF)), rozdílnou rozpustnost (např. srážení síranem amonným) nebo extrakce, a tak podobně, jak je detailněji popsáno výše. Po čištění přípravek obsahuje výhodně méně než 10 hmot. %, výhodněji méně než 5 hmot. % a nejvýhodněji méně než 1 hmot. % polypeptidů nepatřících PAI-1 nebo polypeptidům příbuzným PAI-1 získaných z hostitelské buňky. Výsledný aktivovaný PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 lze poté formulovat a podávat způsobem popsaným dále. ?

Odborníci v oboru ocení, že je výhodné použít PAI-1 polypeptidy a polypeptidy faktoru VII syngenní se subjektem, kvůli minimalizaci rizika vyvolání imunitní odpovědi. Předkládaný vynález dále zahrnuje použití PAI-1 polypeptidů a polypeptidů faktoru VII pro veterinární postupy.

Farmaceutické prostředky a způsoby použití

Prostředky podle předkládaného vynálezu lze použít pro léčbu libovolného syndromu responzivního na faktor VII, např. krvácivých chorob včetně ale bez omezení na syndromy způsobené sníženou hladinou srážecích faktorů VIII, IX, XI nebo VII, inhibitory srážecích faktorů, špatnou funkci krevních destiček (např. Glanzmannova thrombasthenie, Bemard-Soulierův syndrom), thrombocytopenii, von Willebrandovu chorobu a koagulopathii způsobenou např. rozpouštěním koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzou a sníženým počtem krevních destiček způsobeným krvácením • « • ·

9 9 · ·

9

9 9 • 9 9 9

9 9 9999

9 9

9 a/nebo transfuzemi (např. u subjektů po mnohačetných transfuzích, vystavených chirurgickému výkonu nebo úrazu).

Farmaceutické prostředky obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 podle předkládaného vynálezu jsou primárně zamýšlené pro parenterální podávání pro profylaktické a/nebo léčebné účely. Výhodně jsou farmaceutické prostředky podávány parenterálně, tzn. intravenózně, subkutánně nebo intramuskulámě; výhodně intravenózně. Lze je též podávat kontinuální nebo pulzní infuzí.

Farmaceutické prostředky nebo formulace podle předkládaného vynálezu zahrnují faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 formulované buď v jednojednotkové dávkové formě, nebo ve formě soupravy složek, výhodně rozpuštěný ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči nebo rozpouštědle. Farmaceutické prostředky použitelné podle předkládaného vynálezu se připravují smícháním faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII, nebo PAI1 nebo faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII v kombinaci s PAI-1, výhodně v čištěné formě, s vhodnými adjuvanty a vhodným nosičem nebo ředidlem. Lze použít různé nosiče, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4% fyziologický roztok, 0,3% glycin, a tak podobně. Přípravky podle předkládaného vynálezu lze dále formulovat s použitím nevodných nosičů, např. ve formě gelu nebo jako liposomální přípravky pro dodání nebo cílení na místo poranění. Liposomální přípravky jsou obecně popsané např. v US patentech č. 4 837 028; 4 501 728 a 4 975 282. Prostředky lze sterilizovat konvenčními, dobře známými sterilizačními postupy. Výsledné vodné roztoky lze balit pro použití, nebo filtrovat za aseptických podmínek a lyofilizovat, lyofilizovaný přípravek se před podáváním smíchá se sterilním vodným roztokem.

Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky nebo adjuvanty, včetně ale bez omezení na činidla upravující pH a pufrující činidla a/nebo činidla upravující napětí, např. octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, atd.

Formulace mohou dále obsahovat jedno nebo více ředidel, emulgátorů, konzervačních látek, pufřů, excipientů, atd., a mohou být poskytovány ve formě tekutin, prášků, emulzí, s kontrolovaným uvolňováním, atd. Odborník znalý oboru může ·· »··· »» · • * · • * » · » · ·♦*·· • · · ·· · ··«· ·· ♦ · * • · * • · · ♦ • · · ·· · • · · • · · • · · • · · · • · ♦ · formulovat prostředky podle předkládaného vynálezu odpovídajícím způsobem a v souhlase s přijatou praxí, např. zveřejněnou v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Typický farmaceutický prostředek pro intravenózní infuzi může být připraven tak, že obsahuje až 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg přípravku.

Prostředky obsahující přípravky podle předkládaného vynálezu lze podávat pro profylaktické a/nebo léčebné účely. Při léčebné aplikaci se prostředky podávají subjektu již trpícímu chorobou, jak se popisuje výše, v množství postačujícím k léčení, zmírnění nebo částečnému zastavení klinických projevů choroby a jejích komplikací. Množství odpovídající dosažení výše uvedeného je definované jako „terapeuticky účinné množství“. Účinná množství pro daný účel budou záviset na závažnosti choroby nebo poranění i na hmotnosti a obecném stavu subjektu. Rozumí se, že stanovení odpovídající dávky se provádí s použitím rutinních postupů, sestrojením matice hodnot a testováním různých bodů v matici.

Lokální dodávání přípravků podle předkládaného vynálezu, např. topická aplikace, se provádí např. sprejem, perfuzí, cévkami s dvojitým vydutím, stentem inkorporovaným do vaskulámích štěpů nebo stentů, hydrogely použitými pro obalení vydutých cévek nebo dalšími dobře zavedenými způsoby. V každém případě musí farmaceutické postředky poskytovat množství přípravku dostačující pro účinnou léčbu daného stavu.

Koncentrace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII, PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1, nebo faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII v kombinaci s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 v těchto formulacích se může velmi lišit, např. od méně než 0,5 hmot. %, obvykle od nejméně 1 hmot. % do 15 nebo 20 hmot. %, a volí se primárně podle objemů tekutiny, viskozit, atd., v souhlase s vybraným způsobem podávání. Výhodné je podávání injekcí nebo infuzi, zejména injekcí. Faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 se tedy připravují ve formě vhodné pro intravenózní podávání, jako je přípravek ve formě rozpuštěného lyofilizovaného prášku nebo tekuté formulace obsahující jak faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII, tak PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 v jedné dávkové formě, nebo přípravek ve formě ·· ···· »··· • · · • · ♦ • I · · ♦ · · ·

·· · ·» · • · · » · · i • · · ··· • · ♦ ·· * rozpuštěného lyofilizovaného prášku nebo tekuté formulace obsahující faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII v jedné dávkové formě a rozpuštěný lyofilizovaný prášek nebo tekutou formulaci obsahující PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 v jiné dávkové formě.

Rozumí se, že množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a množství PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 společně zahrnuje celkové účinné množství pro léčbu záchvatu krvácení.

Je zapotřebí mít na paměti, že látky podle předkládaného vynálezu mohou být obecně použity při závažných chorobách nebo poraněních, tedy při situacích ohrožujících život nebo při kterých může být život v ohrožení. V takových případech, vzhledem k minimalizaci cizorodých látek a obecného nedostatku imunogenity faktoru Vila a PAI-1 u lidí, je možné, a ošetřujícím lékařem může být považované za žádoucí, podávat podstatný nadbytek těchto prostředků.

Při profylaktickém použití jsou prostředky obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 podávány subjektu náchylnému knebo jinak vystavenému riziku chorobného stavu nebo poranění, ke zvýšení vlastní koagulační schopnosti subjektu. Takové množství je definováno jako „profylakticky účinná dávka“. Rozumí se, že množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a množství PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 společně zahrnuje celkové účinné množství pro prevenci záchvatu krvácení.

Prostředky lze podávat jednorázově nebo mnohočetně, velikost a typ dávek určuje ošetřující lékař. Prostředky lze podávat jednou nebo vícekrát denně nebo týdně. Účinné množství takového farmaceutického prostředku je množství, které poskytuje klinicky signifikantní účinek proti záchvatům krvácení. Takové množství závisí částečně na léčeném stavu, věku, hmotnosti a celkovém zdravotním stavu subjektu, a na dalších faktorech odborníkům v oboru zřejmých.

Prostředek podle předkládaného vynálezu se obecně podává v jednorázové dávce před očekávaným krvácením nebo před začátkem krvácení. Může se však podávat opakovaně (v mnohočetných dávkách), výhodně v intervalech 2-4-6-12 hodin, v závislosti na podávané dávce a na stavu subjektu.

·· »·»· • · ···· ·· • · · • · • · · ·· *· • · ·· • · • · · • ··· • · ·»

Pro lébču ve spojení s uvažovanými zákroky se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 typicky podává 24 hodin před prováděným zákrokem a 7 dní nebo více po zákroku. Podávání koagulantu lze provádět různými způsoby zde popsanými.

Prostředek může být ve formě jednorázového přípravku (ve fomě jednorázové dávky) obsahujícího jak přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII, tak přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 ve vhodných koncentracích. Prostředek může být dále ve formě soupravy složek obsahující první jednotku dávkové formy obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhou jednotku dávkové formy obsahující přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1. V tomto případě se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají jeden po druhém, výhodně s časovým odstupem maximálně 15 minut, například 10 minut, nebo výhodněji 5 minut, nebo ještě výhodněji 2 minuty po sobě. Jako první lze podávat libovolnou z obou jednotek dávkových forem.

Souprava obsahuje nejméně dva oddělené farmaceutické prostředky. Souprava obsahuje obaly obsahující oddělené prostředky, jako je např. rozdělená láhev nebo rozdělený fóliový balíček. Souprava typicky obsahuje instrukce pro podávání oddělených složek. Forma soupravy je obzvláště výhodná, pokud se výhodně podávají oddělené složky v rozdílných dávkových formách, dávky se podávají v různých intervalech, nebo pokud si ošetřující lékař přeje titraci jednotlivých složek kombinace.

Množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a množství PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 podávané podle předkládaného vynálezu se může lišit v poměru 1:100 až 100:1 (hmot). Poměr faktoru VII k PAI-1 tak může být např. 1:100 nebo 1:90 nebo 1:80 nebo 1:70 nebo 1:60 nebo 1:50 nebo 1:40 nebo 1:30 nebo 1:20 nebo 1:10 nebo 1:5 nebo 1:2 nebo 1:1, nebo 2:1 nebo 5:1 nebo 10:1 nebo 20:1 nebo 30:1 nebo 40:1 nebo 50:1 nebo 60:1 nebo 70:1 nebo 80:1 nebo 90:1 nebo 100:1, nebo v rozmezí 1:90 až 1:1, nebo v rozmezí 1:80 až 1:2 nebo v rozmezí 1:70 až 1:5 nebo v rozmezí 1:60 až 1:10 nebo v rozmezí 1:50 až 1:25 nebo v rozmezí 1:40 až 1:30, nebo v rozmezí 90:1 až 1:1 nebo v rozmezí 80:1 až 2:1 nebo v rozmezí 70:1 až 5:1 nebo v rozmezí 60:1 až 10:1 nebo v rozmezí 50:1 až 25:1 nebo v rozmezí 40:1 až 30:1.

·· ·

Dávka faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII se liší v rozmezí dávky odpovídající 0,05 až 500 mg/den divokého typu faktoru VII, např. 1 až 200 mg/den, nebo např. 5 až 175 mg/den pro 70-kg subjekt jako nárazové a udržovací dávky, v závislosti na hmotnosti subjektu, jeho stavu a na závažnosti stavu.

Dávka PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 se liší v rozmezí dávky odpovídající 0,05 až 500 mg/den divokého typu PAI-1, např. 1 až 200 mg/den, nebo např. 5 až 175 mg/den pro 70-kg subjekt jako nárazové a udržovací dávky, v závislosti na hmotnosti subjektu, jeho stavu a na závažnosti stavu.

Kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 vykazuje synergický účinek při in vitro testech pevnosti sraženiny a doby fibrinolýzy. Navíc kombinace faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 vykazuje synergický účinek při vytváření stabilních fibrinových sraženin, při zvyšování poločasu lýzy sraženiny, zvyšování pevnosti sraženiny a zvyšování odolnosti vůči fibrinolýze.

Prostředek může být ve formě jednorázového přípravku obsahujícího jak faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII, tak PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 ve vhodných koncentracích. Prostředek může být dále ve formě soupravy skládající se z první jednotky dávkové formy obsahující faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII, a druhé jednotky dávkové formy obsahující PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1. V tomto případě se faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 podávají následně, výhodně s časovým odstupem 1 až 2 hodiny, například 30 minut po sobě, výhodně 10 minut nebo výhodněji 5 minut po sobě. Jako první lze podávat libovolnou z obou jednotek dávkových forem.

Předkládaný vynález se týká prevence nebo léčby záchvatů krvácení nebo koagulační léčby kombinací aktivních přísad, které lze podávat odděleně, vynález se tedy dále týká kombinování oddělených farmaceutických prostředků ve formě soupravy. Souprava obsahuje nejméně dva oddělené farmaceutické prostředky. Souprava obsahuje obaly obsahující oddělené prostředky, jako je např. rozdělená láhev nebo rozdělený fóliový balíček. Souprava typicky obsahuje instrukce pro podávání oddělených složek. Forma soupravy je obzvláště výhodná, pokud se výhodně podávají oddělené složky • · ···· ··

• · · • ·· · v rozdílných dávkových formách, dávky se podávají v různých intervalech, nebo pokud si ošetřující lékař přeje titraci jednotlivých složek kombinace.

Testy

Test na aktivitu faktoru Vila

Vhodný test pro testování aktivity faktoru Vila, a tudíž pro vyhledávání vhodných variant faktoru Vila, lze provádět jako jednoduchý předběžný test in vitro

Test hydrolýzy in vitro

Přirozený faktor Vila (divoký typ) a varianta faktoru Vila (oba zde dále označované jako „faktor Vila“) mohou být testovány na specifické aktivity. Mohou být dále testovány paralelně pro přímé srovnání jejich specifických aktivit. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Dánsko). Chromogenní substrát D-Ile-Pro-Arg7?-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Švédsko), výsledná koncentrace 1 mM, se přidá k faktoru Vila (výsledná koncentrace 100 nM) v 50mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím O,1M NaCl, 5mM CaCh a 1 mg/ml hovězí sérum albumin. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na SpectraMax™ 340 destičkové čtečce (Molecular Devices, USA). Pro výpočet poměru mezi aktivitami variant a divokým typem faktoru Vila se použije absorbance naměřená během 20-minutové inkubace, po odečtení absorbance slepého vzorku, jamky neobsahující žádný enzym,:

Poměr = (A45o_nm varianta faktoru Vila) / (Atsonm divoký typ faktoru Vila)

Na jeho základě lze identifikovat varianty faktoru Vila s aktivitou srovnatelnou nebo vyšší než je aktivita přirozeného faktoru Vila, jako například varianty, u nichž je poměr mezi aktivitou varianty a aktivitou přirozeného faktoru VII (divoký typ FVII) přibližně 1,0 nebo vyšší.

Aktivitu faktoru Vila nebo variant faktoru Vila lze dále měřit s použitím fyziologického substrátu jako je faktor X, vhodně při koncentraci 100 až 1 000 nM, kdy se generovaný faktor Xa měří po přídavku vhodného chromogenního substrátu (např. S2765). Navíc lze test na aktivitu provádět při fyziologické teplotě.

Proteolytický test in vitro

Přirozený faktor Vila (divoký typ) a varianta faktoru Vila (oba zde dále označované jako „faktor Vila“) se testují paralelně pro přímé srovnání jejich specifických aktivit. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Dánsko). Faktor Vila • · ···· ·· (10 nM) a faktor X (0,8 μΜ) ve 100 μΐ 50mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím O,1M NaCl, 5mM CaCl₂ a 1 mg/ml hovězí sérum albumin, se inkubují 15 minut. Štěpení faktoru X se poté zastaví přídavkem 50 μΐ 50mM Hepes, pH 7,4, obsahujícího 0,lM NaCl, 20mM EDTA a 1 mg/ml hovězí sérum albumin. Množství generovaného faktoru Xa se měří po přídavku chromogenního substrátu Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2765, Chromogenix, Švédsko), výsledná koncentrace 0,5 mM. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na SpectraMax™ 340 destičkové čtečce (Molecular Devices, USA). Pro výpočet poměru mezi proteolytickými aktivitami varianty a divokého typu faktoru Vila se použije absorbance naměřená během 10 minut, po odečtení absorbance slepého vzorku, jamky neobsahující žádný FVIIa:

Poměr = (A450 nm varianta faktoru Vila) / (A450 nm divoký typ faktoru Vila)

Test na generování thrombinu

Schopnost faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII nebo PAI-1 nebo polypeptidů příbuzných PAI-1 (např. variant) generovat thrombin lze měřit testem zahrnujícím všechny relevantní koagulační faktory a inhibitory při fyziologických koncentracích a aktivované krevní destičky (jak popisuje Monroe et al., str. 543, Brit. J. Haematol. 99, 542-547,1997, což je zde zahrnuto v odkaze.)

Test na aktivitu PAI-1

Vhodné testy pro testování PAI-1, a tudíž pro vyhledávání vhodných variant PAI1 použitelných v předkládaném vynálezu, lze provádět jako jednoduché in viiro testy, jak popisuje např. Chandler et al., Clinical Chemistry 35(5), 787-793, 1989 nebo dalšími testy v oboru známými („test PAI-1“).

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nejsou chápány za příklady limitující rozsah ochrany. Znaky zveřejněné v předchozím popisu a v následujících příkladech mohou být jak odděleně, nebo v kombinaci, materiálem k provádění vynálezu v jeho rozmanitých formách.

• ··· · · • · • · · • ···

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zlepšování stability hemostatické sraženiny kombinováním koagulačních faktorů Vila a PAI-1

Metody

Test na lýzu sraženiny: Normální lidská plazma 10-násobně naředěná pufrem (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCh, pH 7,4) obsahující Innovin (Dade Behring, 2000-násobné ředění), rFVIIa (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko; různé koncentrace) a t-PA (American Diagnostics, 8 nM) se přidaly do 96-jamkových ELIS A destiček a po čase se měřila turbidita při pokojové teplotě. Kde je indikováno, byl obsažen čištěný lidský PAI-1 (American Diagnostics, různé koncentrace).

Rotační thromboelastografíe (roTEG): Měření se prováděla na citrátované normální lidské plazmě nebo na plazmě s deficitem faktoru VIII (George King BioMedical, lne. #0800) s přídavkem 5 nM t-PA a analyzoval se účinek přídavku 1 nM FVIIa samotného nebo v kombinaci s30 nM PAI-1. Srážení se iniciovalo přídavkem Innovinu (výsledná koncentrace 2000-násobné ředění, Dade Behring #526945) a vápníku (výsledná koncentrace 15 mM) v 20mM HEPES, 150 mM NaCl, pH pufru 7,4.

Výsledky

Test na lýzu sraženiny: Výsledkem přídavku FVIIa je dávkově dependentní prodloužení doby lýzy sraženiny (Obr. 1). Tento účinek byl optimální při lOnM FVIIa. V přítomnosti lOnM FVIIa měl přídavek PAI-1 za následek další prodloužení doby lýzy sraženiny (Obr. 2). Tento účinek byl dávkově dependentní a optimální u lOnM PAI-1.

Thromboelastografíe: Měření roTEG se použila pro analýzu účinku kombinace FVIIa a PAI-1 na maximální pevnost sraženiny (MCF) a na odolnost sraženiny vůči lýze řízené t-PA. Měření se prováděla jak na normální lidské plazmě, tak na lidské plazmě s deficitem FVIII. Před přidáním FVIIa/PAI-1 byla MCF 25 mm a 4 mm, a poločas lýzy sraženiny byl 12,3 minut a 14,3 minut u normální, respektive hemofilní plazmy (Obr. 3 a 4). V normální lidské plazmě přídavek PAI-1 (30 nM) nezměnil MCF, ale prodloužil poločas lýzy sraženiny na 16,1 minut (Obr. 3). V hemofilní plazmě přídavek samotného

• · · · · • · · · ··· • · · · • ·· ·

PAI-1 zvýšil MCF na 5 mm a prodloužil poločas lýzy sraženiny na 32,4 minut (Obr. 4). Přídavek FVIIa (1 nM) měl za následek ochranu sraženiny před lýzou řízenou t-PA (poločas lýzy sraženiny 16,7 minut) bez významnějšího účinku na MCF u normální plazmy (Obr. 3), zatímco přídavek FVIIa u hemofilní plazmy měl za následek ochranu sraženiny před lýzou (poločas lýzy sraženiny 21,3 minut) a významně zvýšil hodnotu MCF (15 mm, Obr. 4). Přídavek FVIIa společně s PAI-1 však zvyšuje poločas lýzy sraženiny na 29,8 minut a 45 minut, a hodnotu MCF na 27,4 mm a 16,9 mm u normální, respektive hemofilní plazmy.

Závěr

Výsledky ukazují, že přídavek FVIIa a PAI-1 do plazmy synergickým způsobem zlepšuje mechanickou pevnost sraženiny a odolnost vůči fíbrinolýze.

Průmyslové využití

Farmaceutický prostředek obsahující faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je vhodný pro výrobu léčiva pro léčbu subjektů trpících záchvaty krvácení nebo pro prevenci těchto záchvatů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru Vlije polypeptid příbuzný faktoru VII.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že polypeptid příbuzný faktoru VII je aminokyselinová sekvenční varianta faktoru VII.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 2 nebo 3,vyznačující se tím, že poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila, divokého typu FVIIa, je nejméně 1,25 při testování v „testu hydrolýzy in vitro“, popisovaném v předkládaném popise.
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru Vlije faktor VII.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5,vyznačující se tím, že faktor Vlije lidský faktor VII.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že faktor Vlije rekombinantní lidský faktor VII.
8. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, vyznačující se t i m, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII je ve své aktivované formě.

·· ····
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že faktor Vlije rekombinantní lidský faktor Vila.
10. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je polypeptid příbuzný PAI-1.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že polypeptid příbuzný PAI-1 je aminokyselinová sekvenční varianta PAI-1.
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 nebo 11,vyznačující se tím, že poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného PAI-1 a aktivitou přirozeného lidského PAI-1, divokého typu PAI-1, je nejméně 1,25 při testování v „testu PAI1“, popisovaném v předkládaném popise.
13. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je PAI-1 polypeptid.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačuj ící se tím, žePAI1 je lidský PAI-1.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že PAI1 je rekombinantní lidský PAI-1.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15,vyznačující se tím, že PAI1 je ve své aktivované konformaci.
17. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 16, • · · • · · · • · ··· • · ·
18.

18.
19.

19.
20.

20.
21.

21.
22.

22.

vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou přítomné v hmotnostním poměru faktor VII:PAI-1 v rozmezí 100:1 až 1:100.

Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty vhodné pro injekci nebo infuzi, zejména injekci.

Souprava složek pro léčení záchvatů krvácení, vyznačující se tím, že obsahuje

i) účinné množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a farmaceuticky přijatelný nosič v první jednotce dávkové formy;

ii) účinné množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 a farmaceuticky přijatelný nosič v druhé jednotce dávkové formy; a iii) obaly obsahující první a druhou jednotku dávkových forem.

Souprava složek podle nároku 19, vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII je polypeptid příbuzný faktoru VII.

Souprava složek podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptidy příbuzné faktoru VII jsou aminokyselinové sekvenční varianty faktoru VII.

Souprava složek podle nároku 20 nebo 21, vyznačující se tím, že poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila, divokého typu FVIIa, je nejméně 1,25 při testování v „testu hydrolýzy in vitro“, popisovaném v předkládaném popise.

Souprava složek podle nároku 19, vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII je faktor VII.

·· ·♦♦· ···♦ ·· • · · • · ·

9 · · • · · • · · · • · ··· • · · ·· ·
24. Souprava složek podle nároku 23, v y z n a č u j í c í se t í m, že faktor VII je lidský faktor VII.
25. Souprava složek podle nároku 24, vyznačující se tím, že polypeptid faktoru Vlije rekombinantní lidský faktor VII.
26. Souprava složek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 19 až 25, vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII je ve své aktivované formě.
27. Souprava složek podle nároku26, vy zn ačuj í c í se t í m, že faktor VIIje rekombinantní lidský faktor Vila.
28. Souprava složek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 19 až 27, vyznačující se tím, že PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je polypeptid příbuzný PAI-1.
29. Souprava složek podle nároku 28, vy zn a č u j í c í se t í m, že polypeptid příbuzný PAI-1 je aminokyselinová sekvenční varianta PAI-1.
30. Souprava složek podle nároku 28 nebo 29, vy zn a č u j í c í se t í m, že poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného PAI-1 a aktivitou přirozeného lidského PAI-1, divokého typu PAI-1, je nejméně 1,25 při testování v „testu PAI1“, popisovaném v předkládaném popise.
31. Souprava složek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 19 až 27 vyznačující se tím, že PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 je PAI-1.
32. Souprava složek podle nároku 31,vyznačující se tím, že PAI-1 je lidský PAI-1.
33. Souprava složek podle nároku 32, vy zn a č u j í c í se t í m, že PAI-1 je rekombinantní lidský PAI-1.
34. Souprava složek podle nároku 33, v y z n a č u j í c í se tím, že PAI-1 je ve své aktivované konformaci.
35. Souprava složek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 19 až 34, vyznačující se tím, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 jsou přítomné v hmotnostním poměru faktor VII:PAI-1 v rozmezí 100:1 až 1:100.
36. Použití faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII v kombinaci s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1 pro výrobu léčiva pro léčení záchvatů krvácení.
37. Použití prostředku podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 18 pro výrobu léčiva pro léčení záchvatů krvácení.
38. Použití podle nároku 36 nebo 37, kde léčivo je ke zkrácení doby srážlivosti.
39. Použití podle nároku 36 nebo 37, kde léčivo je k prodloužení doby lýzy sraženiny.
40. Použití podle nároku 36 nebo 37, kde léčivo je ke zvýšení pevnosti sraženiny.
41. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 36 až 40, kde léčivo je formulováno pro injekci nebo infuzi, zejména injekci.
42. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 36 až 41, kde záchvaty krvácení jsou způsobené úrazem, chirurgickým výkonem nebo sníženým počtem nebo aktivitou krevních destiček.

·· ··♦· »·«· ·· ♦ · * • · · • » · • · « · 99 99

9 9 9

99 9

9 9 9

9 9 9 9

9 99999

9 9 9

99 9
43. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 36 až 42, kde léčivo je v jediné dávkové formě.
44. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 36 až 42, kde léčivo je připraveno ve formě první jednotky dávkové formy obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé jednotky dávkové formy obsahující přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI1.
45. Způsob léčení záchvatů krvácení u subjektu, vyznačující se t í m, že se • subjektu s potřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro léčbu krvácení.
46. Způsob zkrácení doby srážlivosti u subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu s potřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zkrácení doby srážlivosti.
47. Způsob zlepšení hemostázy u subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu s potřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zlepšení hemostázy.
48. Způsob prodloužení doby lýzy sraženiny u subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu spotřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství ·« ···· ···· ♦· • · · « · ·

9 9 9 9

9 9 9 · • · 9 9

99 9

9 9 9 9 • 9 9 9 9 • 9 · ·♦··· • · · · • ·· · přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro prodloužení doby lýzy sraženiny.
49. Způsob zvýšení pevnosti sraženiny u subjektu, vyznačující se t í m, že se subjektu s potřebou takové léčby podává první množství přípravku s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé množství přípravku s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1, přičemž první množství společně s druhým je účinné pro zvýšení pevnosti sraženiny.
50. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků 45 až 49, v y z n a č u j í c í se t í m, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 se podávají v jediné dávkové formě.
51. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků 45 až 49, v y z n a č u j í c í se t í m, že faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptid příbuzný PAI-1 se podávají ve formě první jednotky dávkové formy obsahující přípravek s faktorem VII nebo polypeptidem příbuzným faktoru VII a druhé jednotky dávkové formy obsahující přípravek s PAI-1 nebo polypeptidem příbuzným PAI-1.
52. Způsob podle nároku 51,vyznačující se tím, že první dávková forma a druhá dávková forma jsou podávány s časovým odstupem maximálně 15 minut.
53. Souprava pro léčbu záchvatů krvácení, vyznačující se tím, že obsahuje

i) účinné množství faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII a PAI-1 nebo polypeptidu příbuzného PAI-1 a farmaceuticky přijatelný nosič vjednojednotkové dávkové formě; a ii) obaly obsahující jednojednotkovou dávkovou formu.