CZ2006206A3 - Modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká modifikovaných antagonistů receptoru IL-4 muteinu, včetně modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu navázaného na polyethylenglykol. Dále jsou popsány farmaceutické prostředky, dávky a způsoby podávání tohoto antagonisty pro terapeutické účely. Tito modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu, s nimi související prostředky a způsoby jsou užitečné pro zajištění možnosti léčby u osob respiračním onemocněním, jako je astma, a to prostřednictvím inhibice hypersenzitivity dýchacích cest zprostředkované IL-4 a IL-13 a eozinofily. Konkrétněji vykazují antagonisté podlevynálezu déle trvající účinek oproti nemodifikovanému IL-4RA, a to díky tomu, že mají delší plazmatický poločas.

Description

Oblast techniky

Tento vynález popisuje antagonistu receptoru IL-4 muteinu, který je navázán na neproteinový polymer, jako je polyethylenglykol. Dále jsou popsány farmaceutické prostředky, dávky a způsoby podáváni tohoto antagonisty pro terapeutické účely.

Tito modifikováni antagonisté receptoru IL-4 muteinu, s nimi související prostředky a způsoby jsou užitečné pro zajištění možnosti léčby u osob s těžkým astmatem, chronickou obstrukční bronchopulmonální chorobou a dalšími souvisejícími plicními onemocněními.

Dosavadní stav techniky

Astma je charakterizováno variabilní, reverzibilní obstrukcí dýchacích cest, jejich hypersenzitivitou (AHR), spojenou s infiltrací bronchiální sliznice aktivovanými T-lymfocyty (T-buňkami) a eozinofily. Tyto buňky, spolu s mastocyty dýchacích cest produkují řadu různých cytokinů a mediátorů, které hrají klíčovou roli v patogenezi uvedeného onemocnění. Předpokládá se, že CD4+ Th2 buňky řídí proces uvedeného onemocnění prostřednictvím uvolňování specifických cytokinů (IL-4, IL-5, IL-9 a IL-13) (viz literární odkazy 1, 2). Jako klíčové v rozvoji a udržování zánětu a hypersenzitivity dýchacích cest se jeví Th2 cytokiny IL-4 a IL-13.

Výsledky četných in vivo studií rovněž podporují klíčovou roli IL-4 a IL-13 v patogenezi astmatu. Při použití zvířecích modelů s nedostatečnou funkcí cytokinů, nebo látek, které ·· ·* ·· ···· ·· ···· • · 9 · ·· · ··· ··· · · · · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· ·· ··· neutralizují buď funkci IL-4 nebo IL-13, byla pozorována důležitá role těchto cytokinů při regulaci primární a sekundární imunitní odezvy, vedoucí k zánětu dýchacích cest a k hypersenzitivitě dýchacích cest (viz literární odkazy 3, 4). Souhrnně lze ze získaných údajů usuzovat, že IL-4 a IL-13 mohou při alergické odezvě dýchacích cest působit jak současně, tak nezávisle na sobě, a že současné ovlivnění obou cytokinů může být výrazně efektivnější než ovlivnění pouze jednoho z nich.

Antagonisté IL-4 byli popsáni v odborné literatuře. Mutované formy IL-4, které působí antagonisticky, zahrnují i IL-4 antagonistický mutein IL-4/Y124D (Kruše, N., Tony, Η. P., Sebald, W., Conversion of human interleukin-4 into a high afinity antagonists by a single amino acid replacement, Embo J. 11:3237-44, 1992) a dvojitý mutein IL-4 [R121D/Y124D] (Tony, H., et al., Design of Human Interleukin-4 Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency, Eur. J. Biochem. 225:659-664(1994)). Prostý mutein představuje substituci tyrosinu v pozici 124 D-helixu kyselinou asparagovou. Dvojitý mutein představuje substituci argininu v pozici 121 kyselinou asparagovou a tyrosinu v pozici 124 D-helixu kyselinou asparagovou. Změny v tomto regionu D-helixu pozitivně korelují se změnami interakcí v druhém vazebném regionu.

Mutantní varianty IL-4 vykazující agonistické nebo antagonistické účinky standardního IL-4 mohou být užitečné pro léčbu stavů souvisejících s jedním z pleiotropních účinků IL-4. Tak například antagonisté IL-4 mohou být využiti k léčbě stavů, které jsou zhoršovány zvýšenou produkcí IL-4, mezi něž • · · · • · · · ·· · · · · • ·· · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··· patří astma, alergie a další stavy související se zánětlivou odezvou. Agonisté IL-4 mohou být využiti k léčbě stavů, kde přítomnost IL-4 vede ke zlepšení nebo zmírnění onemocnění, jako je například autoimunitní onemocnění, jako je revmatoidní artritida, roztroušená skleróza, insulin-dependentní diabetes mellitus atd. Tato autoimunitní onemocnění jsou charakterizována polarizací v produkci populací T-helper buněk, typu 1 a 2 (Thl, Th2). Nativní CD4+ T-buňky se diferencují do Thl nebo Th2 subpopulací, a to podle toho, který cytokin je v průběhu stimulace přítomen. Agonista IL-4 by v ideálním případě posunul produkci směrem k žádoucím T-helper buňkám, tzn. směrem k populaci Th2 buněk, a vykazoval by tak terapeutický účinek.

Mezinárodní přihláška číslo PCT/US93/03613 popisuje variantu IL-4, která obsahuje v οί-helikální doméně sekvence Phe-Leu nebo Tyr-Leu a negativně nabitou aminokyselinu v oblasti ohraničené dvěma aminokyselinami před nebo za sekvencí Phe-Leu nebo Tyr-Leu. Tato varianta vykazuje zvýšenou afinitu k receptoru IL-4, a to díky substituci neutrální aminokyseliny aminokyselinou s negativním nábojem. Dále je v této přihlášce popsáno, že specifická substituce Trp-Leu nebo Phe-Leu v oí-helixu IL-4, ve vzdálenosti do 2 aminokyselin od rezidua s negativním nábojem, má za následek zlepšení afinity. Tato varianta je IL-4 fúzním proteinem (s diphteria toxinem).

Rekombinantní muteinový protein (IL-4RA), odvozený od lidského IL-4, který je mutovaný ve dvou pozicích jeho aminokyselinové sekvence, byl již dříve popsán v patentech Spojených států amerických číslo US 6,028,176 a US 6,313,272.

IL-4RA se váže s vysokou afinitou k α-řetězci receptoru ·· · ·· · ·· ···· • · · · · · • · · · · · · · lidského IL-4, což je důležitá funkčně signalizační složka, jak pro IL-4, tak pro IL-13 receptorový komplex. Tento mutein nevykazuje žádnou agonistickou aktivitu a in vitro působí jako účinný kompetitivní antagonista receptoru IL-4 a IL-13 (viz patenty Spojených států amerických číslo US 6,028,176 a US 6,313,272). Výraznou nevýhodou použití IL-4RA je jeho relativně krátký plazmatický poločas in vivo (přibližně 3 až 6 hodin). Farmakokinetické/farmakodynamické modelování IL-4RA v modelu primáta s astmatem ukázalo, že efektivní průměrná rovnovážná koncentrace pro optimální terapeutický účinek činí přibližně 60 ng/ml.

Jedním z přístupů, jak obejít uvedený krátký poločas, je častější aplikace IL-4RA muteinu pacientovi (obvykle injekčně nebo tracheální intubací), což ale v praxi znamená horší akceptování léčby pacientem a nutnost terapeutického podávání uvedeného muteinu na klinice.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká IL-4RA muteinů s delším poločasem, než mají dříve popsané muteiny. Vynález se rovněž týká reagencií a způsobů inhibice IL-4 a IL-13 zprostředkované imunitní odezvy. Tento a další aspekty tohoto vynálezu jsou uvedeny v jednom nebo více níže vyjmenovaných provedeních.

V jednom provedení se vynález týká přečištěného přípravku na bázi modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu, který zahrnuje antagonistu receptoru IL-4 muteinu vázaného k neproteinovému polymeru vybranými ze skupiny sestávající z polyethylenglykolu, polypropylenglykolu a polyoxyalkylenů.

•9 99·9

9999 · · • · · · 99 9 · · 9

999 9 9 9 9 9999

9 · 9 9 · 999 9 9

9·· 9 9 · 9 99 9

9999 99 99 ·· ·· 999

V jednom aspektu tohoto provedení vynálezu zahrnuje uvedený přečištěný přípravek polypeptid modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu, který je kódován nukleotidovou sekvencí, která je uvedena níže pod označením SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 nebo SEQ ID NO:8. V jiném aspektu tohoto provedení vynálezu uvedený polypeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je uvedená níže pod označením SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11,

SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 nebo SEQ ID NO:16.

V dalším provedení tohoto vynálezu může být polypeptid modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu navázán na neproteinový polymer, a to přes aminokyselinový zbytek IL-4 v pozici 28, 36, 37, 38, 104, 105 nebo 106. Tyto pozice jsou očíslovány podle aminokyselinové sekvence standardního IL-4 (tj. lidského interleukinu 4). V jednom aspektu tohoto provedení vynálezu je aminokyselinovým zbytkem v pozicích 28, 36, 37, 38, 104, 105 nebo 106 cystein.

V dalším provedení tohoto vynálezu je modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu navázán na α-řetězec receptoru IL-4 s K_d od přibližně 0,1 nM do přibližně 10 μΜ, od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ nebo od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM.

V dalším provedení tohoto vynálezu modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu inhibuje proliferativní odezvu TF-1 buněk na IL-4 s IC₅o od přibližně 0,1 nM do přibližně μΜ, od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ nebo od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM.

·* «9 99 9999 99 9999

9999 9 · · 999

99 9 9 · 9 9 999

999 9 999 9 9

99 99·· ·· · ···· ·· ·· ·« ·· ···

V dalším provedení tohoto vynálezu modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu inhibuje proliferativní odezvu TF-1 buněk na IL-13 s IC50 vybranou z následujících rozmezí: od přibližně 0,1 nM do přibližně 10 μΜ, od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ nebo od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM.

V dalším provedení tohoto vynálezu modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu inhibuje proliferativní odezvu lidských B-buněk na IL-4 s IC₅₀ vybranou z následujících rozmezí: od přibližně 0,1 nM do přibližně 10 μΜ, od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ nebo od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM.

V dalším provedení tohoto vynálezu modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu inhibuje proliferativní odezvu lidských T-buněk na IL-4 s IC50 vybrané ze skupiny sestávající z následujících rozmezí: od přibližně 0,1 nM do přibližně μΜ, od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ, od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM.

V dalším provedení tohoto vynálezu modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu podle předmětného vynálezu má plazmatický poločas, který je minimálně 2- až lOkrát delší než plazmatický poločas nemodifikovaného antagonisty receptoru IL-4.

Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž farmaceutické kompozice zahrnující: (a) modifikovaného antagonistu receptoru IL-4 muteinu, který se váže na lidský receptor IL-4 a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.

·· ·· ·» ··♦· ·· ···· • · 9 · · · « · · «

99 9 9 9 9 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 999

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž přečištěný polynukleotid zahrnující (a) nukleotidovou sekvenci uvedenou dále pod označením SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 nebo SEQ ID NO:8; nebo (b) nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou dále pod označením SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 nebo SEQ ID NO:16.

Vynález se rovněž týká expresních vektorů, které obsahují polynukleotidy podle tohoto vynálezu, a hostitelských buněk obsahujících expresní vektory podle tohoto vynálezu.

Dále se tento vynález týká způsobů přípravy modifikovaného antagonisty receptorů IL-4 muteinu, jenž zahrnuje tyto stupně: a) kultivaci výše popsaných hostitelských buněk, a to za podmínek, kdy dochází k expresi uvedeného antagonisty; a (b) očištění antagonisty od kultury hostitelských buněk.

V tomto konkrétním aspektu vynálezu antagonista produkovaný způsobem podle tohoto vynálezu může inhibovat aktivity zprostředkované IL-4 a IL-13 a je vázaný k neproteinovému polymeru vybranému ze skupiny sestávající z polyethylenglykolu, polypropylenglykolu a polyoxyalkylenů.

Dále se tento vynález týká způsobů léčení lidských poruch spojených se zvýšenou aktivitou IL-4 a IL-13, které zahrnují tyto stupně: a) nalezení osoby, která trpí onemocněním spojeným se zvýšenou aktivitou IL-4 a IL-13; a b) podávání účinného množství modifikovaného antagonisty receptorů IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu nebo farmaceutické kompozice ·♦ ···· ···· »· ♦ ··· ·· · · 4» · • ·· · · · · « ··· ······ · « · · · ·······«· · ···· ·· ·· «· »· »·9 podle tohoto vynálezu uvedené osobě. Podle jednoho aspektu je uvedeným onemocněním astma, chronická obstrukční bronchopulmonální nemoc (jako je emfyzém nebo chronická bronchitis), nebo další obdobné plicní onemocnění.

Dále se tento vynález týká způsobu přípravy aktivní formy modifikovaného antagonisty receptor IL-4 muteinu, antagonistů připravených tímto způsobem, kompozic obsahujících tyto antagonisty a způsobu léčby lidských onemocnění, jenž zahrnuje podávání těchto antagonistů, a farmaceutických kompozic, které obsahují tyto antagonisty. Uvedený způsob zahrnuje tyto stupně: a) kultivaci shora popsaných hostitelských buněk, za podmínek, kdy dochází k expresi uvedeného antagonisty; b) umožnění opětného svinutí peptidového řetězce v přítomnosti dithiothreitolu; a c) očištění antagonisty od kultury hostitelských buněk. V jednom provedení tohoto vynálezu uvedený způsob dále zahrnuje tyto stupně: d) navázání antagonisty k neproteinovému polymeru; a e) přečištění uvedeného antagonisty vázaného k neproteinovému polymeru.

Konkrétní výhodná provedení vynálezu budou zjevná z následujícího detailnějšího popisu některých výhodných provedení vynálezu a z patentových nároků.

Popis obrázku

Na obrázku 1 je schématicky znázorněn průběh chemické reakce, při níž dochází k navázání PEG.

Předmětem tohoto vynálezu jsou modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu, které zahrnují antagonistů receptoru ·· ·· ·· ···· ·· ···· • · · · ·· · · ♦ · • ·· · · · · · ··· ······ »··· » • · · · · · · ·· · ···· ·· «· ·· ·· ···

IL-4 muteinu vázaného k neproteinovému polymeru, kterým je výhodně molekula polyethylenglykolu.

Pokud nevyplývá z kontextu jinak, zahrnují výrazy v jednotném čísle i stejné výrazy v čísle množném a výrazy použité v množném čísle zahrnují stejné výrazy v jednotném čísle.

Jednotlivé nadpisy použité v tomto textu slouží jen pro lepší orientaci a neslouží pro omezení rozsahu popisovaného předmětu. Obsah všech publikací citovaných v této přihlášce vynálezu je zahrnut v tomto textu ve formě odkazu.

Definice

Výrazem „polynukleotid nebo „sekvence nukleových kyselin nebo „molekula nukleové kyseliny se v tomto textu rozumí sekvence DNA nebo RNA. Uvedený výraz v sobě zahrnuje molekuly vytvořené z kterýchkoliv známých analogů bází DNA a RNA, jako je například 4-acetylcytosin, 8-hydroxy-N6-methyladenosin, aziridinylcytosin, pseudoisocytosin, 5-(karboxyhydroxymethyl)uráčil, 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-karboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-karboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, inosin, N6-isopentenyladenin, 1-methyladenin, 1-methylpseudouracil, 1-methylguanin, 1-methylinosin,

2,2-dimethylguanin, 2-methyladenin, 2-methylguanin, 3-methylcytosin, 5-methylcytosin, N6-methyladenin, 7-methylguanin, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-mannosylqueosin, 5'-methoxykarbonylmethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenin, methylester kyseliny uracil-5-oxyoctové, kyselina uracil-5φφ φφφφ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ « φ φ « φφφφ φ φ φφ φφφφ oxyoctová, oxybutoxosin, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosin, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methylester kyseliny N-uracil-5-oxyoctové, kyselina uracil-5-oxyoctová, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosin a 2,6-diaminopurin, bez omezeni na tyto příklady.

Výrazem „přečištěný, „očištěný nebo „izolovaný polynukleotid se v tomto textu rozumí molekula nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, která 1) byla očištěna od alespoň 50 % proteinů, lipidů, cukrů a dalších látek, se kterými se přirozeně vyskytuje, pokud je izolována kompletní DNA ze zdrojových buněk, 2) není vázána ke všem nebo k části polynukleotidů, ke kterým je „izolovaná molekula nukleové kyseliny běžně vázána v přírodě, 3) je použitelně navázána na polynukleotid, ke kterému není běžně vázána v přírodě, nebo 4) se nevyskytuje v přírodě jako část delší polynukleotidové sekvence. Ve výhodném provedení není izolovaná molekula nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu v podstatě vůbec kontaminována dalšími molekulami nukleových kyselin nebo jakýmikoliv jinými kontaminujícími látkami, které se nacházejí v jejím přirozeném prostředí, a které by mohly interferovat s jejím použitím při produkci polypeptidu nebo s jejím diagnostickým, profylaktickým či výzkumným využitím.

Výrazem „číslovaný podle standardního IL-4 se v tomto textu rozumí, že pozice dané aminokyseliny v řetězci je udávána podle pozice, ve které se tato aminokyselina nachází ve standardním typu IL-4.

·· ·· ·* ··♦· ·· ···· • · * · · · · · · · • ·· · · · · · ··· ·«««»· t · · · · ········· · ··«· ·· 99 99 99 999

Výraz „vektor je v tomto textu používán pro jakoukoli molekulu (např. nukleovou kyselinu, plazmid, virus), která se používá k transferu kódující informace do hostitelské buňky.

Výrazem „expresní vektor se v tomto textu označuje vektor, který je vhodný k transformaci hostitelské buňky a který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která řídí a/nebo kontroluje expresi inzerované heterologní sekvence nukleové kyseliny. Expresse zahrnuje procesy jako je transkripce, translace a RNA splicing, pokud jsou přítomny introny, bez omezení na tyto příklady.

Výraz „hostitelská buňka se zde používá pro buňku, která byla transformována, nebo je schopna transformace sekvencí nukleových kyselin a následné exprese vybraného genu, který je předmětem zájmu. Uvedený výraz v sobě zahrnuje i potomstvo mateřské buňky, ať je či není toto potomstvo identické v morfologii nebo v genetickém vybavení, pokud však je přítomen vybraný gen.

Výraz „transdukce je v tomto textu používán pro transfer genů z jedné bakterie do druhé, obvykle za pomoci fága. „Transdukce také označuje přijetí a transfer eukaryontní buněčné sekvence retroviry.

Výrazem „transfekce se v tomto textu označuje vychytávání cizorodé nebo exogenní DNA buňkou, a buňka je „transfekována pokud se exogenní DNA dostane na vnitřní stranu buněčné membrány. Odborníkům je známo mnoho transfekčních technik. Viz např. Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Barbor ·· ·· • · · · · · • ·· · ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 99 99 ·· #···

9999

9 9 9

99 999

9 9 9 9

9 9 9

Laboratories, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); a Chu et al., 1981, Gene 13:197.

Tyto techniky mohou být použity k zavedení jedné nebo více exogenních DNA do hostitelských buněk.

Výraz „transformace se zde používá pro změnu genetických vlastností buňky, a buňka je transformována pokud obsahuje novou DNA. Tak například, buňka je transformována pokud dojde ke genetické modifikaci oproti nativnímu stavu. V důsledku transfekce nebo transdukce se transformující DNA může rekombinovat s buněčnou DNA fyzickou integrací do chromozomu buňky, může být uchována přechodně jakožto episomální element, který se nereplikuje, nebo se může replikovat nezávisle jakožto plazmid. Buňka je považována za definitivně transformovanou pokud se DNA replikuje s dělením buňky.

Výraz „identita, tak jak je znám v oboru, popisuje vztah mezi sekvencemi dvou nebo více polypeptidových molekul, nebo mezi dvěma či více molekulami nukleových kyselin, a je dán vzájemným porovnáním těchto sekvencí. V dané oblasti techniky „identita rovněž označuje stupeň sekvenční příbuznosti mezi molekulami nukleových kyselin nebo polypeptidů, podle daného případu, jak je stanovený shodou mezi řetězci dvou nebo více nukleotidů, nebo dvou nebo více sekvencí aminokyselin. „Identita vypovídá o procentu identických úseků mezi dvěma nebo více sekvencemi s ohledem na chybějící úseky (pokud nějaké existují), a to tak, jak je kalkulována daným matematickým modelem nebo počítačovým programem (tj. algoritmem).

Výraz „podobnost souvisí s konceptem použití výrazu „identita, avšak na rozdíl od výrazu „identita, vyjadřuje φφφφ

φ φφφ • Φ φφφφ φφφ φ φ φφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φ φφφ φ podobnost, která zahrnuje jak identické, tak konzervativní substituce. Pokud dvě polypeptidové sekvence mají například 10/20 identických aminokyselin, a všechny ostatní aminokyseliny představují nekonzervativní substituce, pak procento identity i podobnosti je v obou případech 50 %. Pokud ve stejném případě jsou na dalších pěti místech konzervativní substituce, pak procento identitity je 50 %, ale procento podobnosti je 75 % (15/20) . Proto v případech, kde existuje konzervativní substituce, bude procento podobnosti mezi dvěma polypeptidy vyšší, než procento identity mezi těmito dvěma polypeptidy.

Identita a podobnost příbuzných nukleových kyselin a polypeptidů může být přímo vypočítána pomocí známých metod. Mezi takové metody patří metody které jsou popsány v publikacích v COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A. M., ed.)

1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W., ed.), 1993, Academie Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A. M. a Griffin, H. G. ed.), 1994, Humana Press, New Jersey; Von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academie Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. a Devereux, J. ed.) 1991, M.Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; a Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press, bez omezení na tento výčet.

Výhodné metody ke stanovení identity byly vytvořeny tak, aby byly schopné zachytit největší množství shod mezi testovanými sekvencemi. Metody ke stanovení identity jsou popsány v běžně dostupných počítačových programech. Mezi výhodné počí14 ·· ··· • · · • · ·

9 9 9 9

9 9 9

999

9

9

9999 99 tácové metody ke stanovení identity mezi dvěmi sekvencemi patří, mimo jiné, programový balíček GCG, obsahující GAP (Devereux et al., 1984, Nud. Add. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, USA), BLASTP, BLASTN a FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). Program BLASTX je veřejně dostupný z National Center for Biotechnology Information (NCBI) a z dalších zdrojů (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894, USA; Altschul et al., 1990, výše). Dále je možné využít ke stanovení identity dobře známý algoritmus Smith Waterman.

Některé způsoby porovnávání dvou sekvencí aminokyselin mohou vézt k nalezení homologie jenom u krátkých úseků dvou sekvencí a tyto krátké úseky mohou mít velmi vysokou sekvenční identitu, i když příbuznost na úrovni celých sekvencí není nijak významná. V souladu s tím je v některých provedeních vynálezu zvolená srovnávací metoda (program GAP) srovnává úseky cílového polypeptidu o délce minimálně padesáti sousedních aminokyselin.

Například při používání počítačového algoritmu GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison,

WI, USA) jsou si přiřazeny pro optimální srovnávání příslušných aminokyselin (parametr „matched spán, jak je stanoven uvedeným algoritmem) dva polypeptidy, u kterých se má stanovit procento identity sekvence. V některých provedeních se ve spojení s uvedeným algoritmem používá parametr „gap opening penalty (který se vypočte jakožto trojnásobek parametru „average diagonál; kde parametr „average diagonál je průměrná diagonála použité srovnávací matice; „diagonála je skóre nebo číslo přiřazené každé dokonalé shodě aminokyseliny ·· φφφφ • Φ φφφφ φφφ φ · · · φ··· • φφφφφ φφφφ φ φφφ φφφφ φφ · • ΦΦΦ ·· ·· φφ ·· φφφ danou srovnávací maticí) a parametr „gap extension penalty (který má obvykle hodnotu odpovídající jedné desetině hodnoty parametru „gap opening penalty), jakož i srovnávací matice, jako je PAM 250 nebo BLOSUM 62. V některých provedeních tohoto vynálezu uvedený algoritmus používá rovněž standardní srovnávací matrici (viz. Dayhoff et al., 1987, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 pro srovnávací matici PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 pro srovnávací matici BLOSTRUM 62).

V některých provedeních se pro porovnání sekvence polypeptidu používají, mimo jiné, následující parametry:

Algorithm: Needleman et.al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; Comparison matrix: BLOSUM 62 z Henikoff et.al., 1992, výše;

Gap Penalty: 12

Gap Length Penalty: 4

Treshold of Similarity: 0

Uvedený program GAP může být vhodný pro použití s výše uvedenými parametry. V některých provedeních výše uvedené parametry představují výchozí (defaultní) parametry pro srovnání polypeptidu (spolu s vyloučením penalizace chybějících koncových úseků) při použití GAP algoritmu.

Podle tohoto vynálezu je možné použít dvacet základních aminokyselin, které se v tomto textu označují jejich běžně používanými zkratkami. Viz publikaci IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS,

2. vydání, (E. S. Golub a D. R. Gren, Ed.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, USA 1991, jejíž obsah je pro jakýkoli účel zahrnut v tomto textu formou odkazu. Stereo·· 99*9

99 • 9 9 · • 99

9 9 • 9 9 • 9 99 9 9 •9 999· • 9 9 9 9 •9 9 » 999 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · •9 ·· ·9· izomery (např. D-aminokyseliny) uvedených dvaceti základních aminokyselin, v přírodě se nevyskytující aminokyseliny jako jsou například oí-, oí-disubstituované . aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná, a další neobvyklé aminokyseliny, mohou být rovněž složkami pro přípravu polypeptidů podle tohoto vynálezu. Jako příklad neobvyklé aminokyseliny je možné uvést 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Ν-trimetyllysin, ε-N-acetyllysin, 0-fosfoserin, N-acetylserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-metylhistidin, 5-hydroxylysin, σ-N-methylarginin a další podobné aminokyseliny a iminokyseliny. (jako je například 4-hydroxyprolin). Ve zde užité notaci polypeptidů se v souladu se standardy a konvencemi sekvence polypeptidů uvádějí směrem od N-konce k C-konci.

V přírodě se vyskytující zbytky aminokyselin mohou být rozděleny do tříd podle společných vlastností postranního řetězce:

1) hydrofóbní: norleucin (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

3) kyselé: Asp, Glu;

4) bazické: His, Lys, Arg;

5) zbytky, které ovlivňují orientaci řetězce: Gly, Pro; a

6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Konzervativní substituce aminokyselin může zahrnovat výměnu aminokyseliny z jedné z výše uvedených skupin za jinou aminokyselinu z téže skupiny. Konzervativní substituce aminokyselin mohou zahrnovat i zbytky aminokyselin, které se běžně nevyskytují v přírodě a které se obvykle inkorporují do řetězce spíše při chemické syntéze peptidů, než při syntéze v • 9 ·· 99 ··>· 9* ·*··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ··· 9 9 9 99999 • 9 999 9 999 9 9

9······· ·

9999 99 9· ·· ·* ··* biologických systémech. Skupina těchto zbytků zahrnuje peptidomimetika a další reverzní nebo invertované formy aminokyselinových zbytků.

Nekonzervativní substituce mohou zahrnovat výměnu aminokyseliny z jedné z výše uvedených skupin za aminokyselinu z jiné z výše uvedených skupin. Takové substituované zbytky mohou být zaváděny do těch regionů lidského proteinu, který je homologní s nehumánními proteiny, nebo do nehomologních regionů molekul.

Při provádění takových změn podle některých provedení tohoto vynálezu může být brán v potaz hydropatický index aminokyselin. Každé aminokyselině byl přiřazen určitý hydropatický index, a to na základě její hydrofobicity a náboje. Konkrétní hodnoty těchto indexů pro jednotlivé aminokyseliny jsou následující: isoleucin (+4,5), valin (+4,5), leucin (+3,8), fenylalanin (+2,8), cystein/cystin (+2,5), methionin (+1,9), alanin (+1,8), glycin (-0,4), threonin (-0,7), serin (-0,8), tryptofan (-0,9), tyroxin (-1,3), prolin (-1,6), histidin (-3,2), glutamát (-3,5), glutamin (-3,5), aspartát (-3,5), asparagin (-3,5), lysin (-3,9) a arginin (-4,5).

Význam hydropatického indexu aminokyselin při propůjčení interaktivních biologických funkcí proteinu je v oboru dobře znám (viz. např. Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105131). Je známo, že některé aminokyseliny mohou být nahrazeny jinými aminokyselinami s podobným hydropatickým indexem nebo skóre a stále je zachována podobná biologická aktivita. Při provádění změn na bázi hydropatického indexu je v některých

9999

9 9

9 999

9 9

9 9

999

99 » » « « • 99

9999

9999 99

9 9

9 9

9 9 9 9

9 9 9

99 provedeních vynálezu možné provést substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ± 2. V jiných provedeních vynálezu je možné provést substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ± 1 a v dalších provedeních vynálezu je možné provést substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ± 0,5.

Mezi odborníky v oboru je rovněž dobře známo, že substituce obdobných aminokyselin se může efektivně provádět na základě hydrofility, a to zejména tam, kde takto vytvořený funkční protein či peptid má být využit v imunologických provedeních, jak je uvedeno v tomto textu. V některých provedeních tohoto vynálezu největší lokální průměrná hydrofilita proteinu, která je řízena hydrofilitou přilehlých aminokyselin, koreluje s jeho imunogenicitou a antigenicitou, tj. s biologickými vlastnostmi proteinu.

Následujícím aminokyselinám byly přiřazeny tyto hodnoty hydrofility: arginin (+3,0), lysin (+3,0), aspartát (+3,0 ± 1), glutamát (+3,0 ± 1), serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2), glycin (0), threonin (-0,4), prolin (-0,5 ± 1), alanin (-0,5), histidin (-0,5), cystein (-1,0), methionin (-1,3), valin (-1,5), leucin (-1,8), isoleucin (-1,8), tyrosin (-2,3), fenylalanin (-2,5) a tryptofan (-3,4). Při provádění změn na bázi podobnosti hodnot hydrofility je v některých provedeních vynálezu možné provést substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ±2, v jiných provedeních vynálezu je možné provést substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ± 1 a v dalších provedeních vynálezu je možné provést substituce aminokyselin, jejichž • · · • · · · ···· ···· ·· ·· ·* ·· ··· hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ± 0,5. Na základě hydrofHity je rovněž možné z primární sekvence aminokyselin identifikovat epitopy. Tyto regiony se také označují jako „regiony epitopického jádra.

Příklady substitucí aminokyselin jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Původní zbytek	Příklady substitucí	Výhodná substituce
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn	Gin	Gin
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gin	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro, Ala	Ala
His	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucin	Leu
Leu	Met, Norleucin, Ile, Val, Ala, phe	Ile
Lys	Arg, kyselina 1,4-diaminomáselná	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr

• · · · ·

Původní zbytek	Příklady substitucí	Výhodná substituce
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucin	Leu

Zkušený odborník v oboru bude schopen pomocí všeobecně známých technik určit vhodné varianty shora popsaného polypeptidu. V některých provedeních tohoto vynálezu může zkušený odborník identifikovat vhodné regiony molekuly, které je možné měnit, aniž by došlo ke ztrátě aktivity, a to tak, že se zaměří na regiony, o kterých se nepředpokládá, že by byly důležité pro aktivitu daného polypeptidu. V jiných provedeních je zkušený odborník schopen identifikovat zbytky a části molekul, které jsou zachovány v podobných polypeptidech. V dalších provedeních mohou být předmětem konzervativních substitucí aminokyselin dokonce i regiony, které mohou být důležité z hlediska biologické aktivity, a to aniž by došlo ke ztrátě biologické aktivity daného polypeptidu nebo k nepříznivému ovlivnění jeho struktury.

Kromě toho se může zkušený odborník v oboru seznámit se studiemi vztahu struktura-funkce, ve kterých jsou identifikovány zbytky obsažené v podobných polypeptidech, jež jsou důležité z hlediska aktivity nebo struktury. Ve světle těchto srovnání je zkušený odborník v oboru schopen předpovědět důležitost těch aminokyselinových zbytků v daném proteinu, které odpovídají zbytkům aminokyselin, jež jsou důležité z hlediska aktivity nebo struktury podobných proteinů. Zkušený odborník se může v případě takovýchto zbytků aminokyselin, u ·· ·· ·· ···· ·· ··· • · · · ·· · ··« • ·· · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·· ··· kterých byla předpovězena jejich důležitost, rozhodnout pro substituce chemicky podobnými aminokyselinami.

Zkušený odborník v dané oblasti techniky může rovněž analyzovat trojrozměrnou strukturu a sekvenci aminokyselin ve vztahu k trojrozměrné struktuře a sekvenci aminokyselin podobných polypeptidů. Ve světle této informace může uvedený odborník předpovědět seskupení zbytků aminokyselin v daném polypeptidu vzhledem k jeho trojrozměrné struktuře. V některých provedeních se může odborník rozhodnout neprovádět radikální změny ve zbytcích aminokyselin, u kterých bylo předpovězeno, že se budou nacházet na povrchu proteinu, protože tyto zbytky aminokyselin se mohou účastnit důležitých interakcí s jinými molekulami. Kromě toho může odborník přistoupit k vytvoření testovacích variant proteinu, kdy v jednotlivých variantách je nahrazen vždy jen jeden požadovaný zbytek aminokyseliny jinou aminokyselinou. Získané varianty mohou být následně podrobeny screeningu, a to s použitím testů aktivity, jež jsou zkušenému odborníkovi dobře známé. Uvedené varianty tedy mohou být použity pro získání informací o vhodných variantách. Tak například pokud se zjistí, že změna daného zbytku aminokyseliny vede ke ztrátě aktivity, k nechtěnému snížení aktivity, nebo k vyvolání nevhodné aktivity, je na základě těchto zjištění možné varianty s takovouto změnou vyloučit z dalšího výzkumu. Jinými slovy, na základě informací získaných pomocí takovýchto rutinních experimentů je zkušený odborník snadno schopen určit aminokyseliny, kde je třeba se vyhnout dalším substitucím, ať už prováděným samostatně nebo v kombinaci s jinými mutacemi.

·· ··· · ···· e· ·· ·· «· ···

Četné vědecké publikace se věnují předpovědi sekundární struktury. Viz Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; a Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Kromě toho jsou v současné době k dispozici počítačové programy, které jsou schopné pomoci při předpovídání sekundární struktury. Jedna z metod předpovědi sekundární struktury je založena na homologním modelování. Tak například, dva polypeptidy nebo proteiny, které mají sekvenční identitu vyšší než 30 % nebo podobnost vyšší než 40 %, mají často podobné strukturní topologie. Rozšiřování databází proteinových struktur (PDB), ke kterému v poslední době dochází, zajišťuje větší předpovídatelnost sekundární struktury, včetně potenciálního počtu ohybů ve struktuře polypeptidů nebo proteinu. Viz Holm et al. 1999, Nud. Acid. Res. 27:244-247. Byla vyslovena hypotéza (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376), že v daném polypeptidů nebo proteinu je pouze omezené množství ohybů a jakmile dojde k objasnění kritického počtu struktur, dojde k významnému zvýšení přesnosti strukturní předpovědi.

Další způsoby předpovědi sekundární struktury zahrnují „threading (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), „profilovou analýzu (Bowle et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proč. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), a „evoluční řetězení (evolutionary linkage) (viz Holm, 1999, výše; a Brenner, 1997, výše).

• · · · · · · · · · • · · · · · · ···· ··»··· ···· · • · · · · · · ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···

V některých provedeních varianty proteinů zahrnují glykosylované varianty, ve kterých je změněn počet a/nebo typ míst glykosylace ve srovnání se sekvencí aminokyselin základního polypeptidu. V některých provedeních zahrnují varianty proteinů větší či menší počet N-vázaných míst glykosylace než nativní protein. N-vázané místo glykosylace je charakteristické sekvencí: Asn-X-Ser nebo Asn-X-Thr, kde zbytek aminokyseliny označený jako X může představovat zbytek jakékoli aminokyseliny, s výjimkou prolinu. Substituce zbytků aminokyselin za účelem vytvoření této sekvence poskytuje potenciální nová místa pro napojení N-vázaného sacharidového řetězce. V alternativním případě substituce, které tuto sekvenci eliminují, vedou k odstranění existujícího N-vázaného sacharidového řetězce. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají rovněž případy, kdy dochází k přemístění N-vázaných sacharidových řetězců, kdy je eliminováno jedno nebo více N-vázaných míst glykosylace (obvykle těch, která se běžně v přírodě vyskytují) a zároveň je vytvořeno jedno nebo více nových N-vázaných míst glykosylace. Mezi další výhodné varianty patří cysteinové varianty, ve kterých je v porovnání se základní sekvencí aminokyselin provedena delece jednoho nebo více cysteinových zbytků nebo substituce jednoho nebo více cysteinových zbytků jinou aminokyselinou (např. serinem). Cysteinové varianty mohou být užitečné v případech, kdy proteiny musí být znovu zohýbány do biologicky aktivní konformace, jako například po izolaci nerozpustných inkluzních tělísek. Cysteinové varianty obecně obsahují menší počet cysteinových zbytků než nativní protein, a obvykle je počet těchto zbytků sudý, aby se minimalizovala možnost interakcí nepárových cysteinů.

• · • · «· • ·

V dalších provedeních tohoto vynálezu mohou proteinové varianty obsahovat mutace, jako jsou substituce, adice, delece nebo jakékoliv jejich kombinace, a tyto varianty se obvykle produkují pomocí mutageneze směřované na dané místo, a to za použití jednoho nebo více mutagenních oligonukleotidů podle zde popsaných metod, nebo podle metod v oboru dobře známých (viz. např. publikace Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3. vydání, 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. a Berger a Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academie Press, lne., San Diego, CA, USA, jejichž obsah je zahrnut v tomto textu formou odkazu).

Podle některých provedení tohoto vynálezu se provádějí takové substituce aminokyselin, které: 1) snižují sklon k proteolýze, 2) snižují sklon k oxidaci, 3) mění vazebnou afinitu pro tvorbu proteinových komplexů, 4) mění vazebné afinity a/nebo 5) propůjčují nebo modifikují jiné fyzikálněchemické nebo funkční vlastnosti takovýchto polypeptidů. Podle některých provedení tohoto vynálezu může být provedena jedna nebo více substitucí aminokyselin (v některých provedeních se jedná o konzervativní substituce aminokyselin) v přirozeně se vyskytující sekvenci (v některých provedeních pak v části polypeptidu vně domén, které vytvářejí intermolekulární kontakty). Ve výhodných provedeních tohoto vynálezu konzervativní substituce aminokyseliny obvykle podstatně nemění vlastnosti základní sekvence (např. nahrazení aminokyseliny nemusí vézt k rozlomení helixu, který je pozorován u základní sekvence, nebo nemusí dojít k porušení jiného typu sekundární struktury, která charakterizuje danou základní sekvenci). Příklady odborníky rozpoznaných sekundárních a terciálních struktur • · · · • · · · • «· • ·· · • · • · ···· • β

polypeptidů jsou popsány v publikacích PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H.

Freeman and Copany, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden a J.Tooze, Ed.) 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; a Thornton et al., 1991, Nátuře 354:105, jejichž obsah je zahrnut v tomto textu formou odkazu.

Peptidové analogy se obvykle používají ve farmaceutickém průmyslu jako nepeptidová léčiva s vlastnostmi odpovídajícími templátovému peptidu. Tyto typy nepeptidových sloučenin se nazývají „peptidová mimetika nebo „peptidomimetika. Viz publikace Fauchere, 1986, Adv. Drug. Res. 15:29; Veber a Freidinger, 1985, TINS, str. 392; a Evans et al., 1987,

J. Med. Chem. 30:1229, jejichž obsah je pro jakýkoli účel zahrnut v tomto textu formou odkazu. Takové sloučeniny jsou často vytvořeny za pomoci počítačového molekulárního modelování. Peptidová mimetika, která jsou strukturně podobná terapeuticky využitelným peptidům, mohou být využita k produkci podobného terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidová mimetika strukturně podobná vzorovému polypeptidu (tj. polypeptidů, který má biochemické vlastnosti nebo vykazuje farmakologickou aktivitu), jako je lidská protilátka, ale v jejich struktuře je jedna nebo více peptidových vazeb nahrazených vazbou vybranou z následujícího souboru: -CH2-, -NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis a trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH2- a -CH2SO-, a to pomocí v oboru dobře známých způsobů. V některých provedeních může být použita systematická substituce jedné nebo více aminokyselin v konvenční sekvenci za D-aminokyselinu stejného typu (např. D-lysin místo L-lysinu), a to za účelem vytvoření stabilnějších peptidů. Kromě toho mohou být připraveny vázané (constrained) peptidy • · »··· ···· ·· ···· ► · ··· » · « ► · I ·· ··· obsahujících konvenční sekvenci nebo v podstatně identickou variantu konvenční sekvence (viz publikace Řízo a Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387, jejíž obsah je pro jakékoli účely zahrnut v tomto textu formou odkazu), a to metodami v oboru dobře známými, jako je například přidání vnitřního cysteinového zbytku, který je schopen vytvářet intramolekulární disulfidové můstky, které způsobí cyklizaci daného peptidu.

(a) Vlastnosti modifikovaných antagonistů receptorů IL-4 muteinu

Výraz „modifikovaní antagonisté receptorů IL-4 muteinu, který se používá v tomto textu, zahrnuje IL-4RA mutein popsaný v patentech Spojených států amerických číslo US 6,028,176 a US 6,313,272 (jejichž obsah je zahrnut v tomto textu formou odkazu) s dalšími substitucemi aminokyselin, které umožňují místně specifické navázání alespoň jednoho neproteinového polymeru, jako je například polypropylenglykol, polyoxyalkylen nebo polyethylenglykol (PEG), k uvedenému muteinu. Například místně specifické navázání PEG umožňuje vytvoření modifikovaného muteinu, který má výhody polyethylenglykosylované (PEGylované) molekuly, a to konkrétně zvýšený plazmatický poločas a sníženou imunogenicitu, při současném zachování vyšší účinnosti oproti peptidům vytvořeným pomocí strategie nespecifické PEGylace, jako je například PEGylace na N-konci nebo PEGylace postranního řetězce lysinu. Rovněž vlastní tomuto vynálezu je výběr specifického místa substituce aminokyseliny, která umožňuje správné zohýbání molekuly po skončení exprese. Modifikovaní antagonisté receptorů IL-4 muteinu se vážou k IL-4 a IL-13 s maximálně lOkrát zmenšenou ·· ····

9 9

9 9 · · · 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 999 ······ 9 · 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 999 afinitou v porovnání s afinitou, se kterou se k IL-4 a IL-13 váže IL-4RA. Modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu inhibují aktivitu zprostředkovanou IL-4 a IL-13 s maximálně lOkrát nižší účinností než IL-4RA. Kromě toho, modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu mají alespoň 2- až lOkrát delší plazmatický poločas než nemodifikovaný IL-4RA.

IL-4 muteiny podle tohoto vynálezu mohou být také charakteristické inzercemi aminokyselin, delecemi aminokyselin, substitucemi aminokyselin a modifikacemi aminokyselin na jednom nebo více místech v nativním polypeptidovém řetězci IL-4 nebo na jiných zbytcích nativního polypeptidového řetězce IL-4. V souladu s tímto vynálezem by jakákoliv takováto inzerce, delece, substituce a modifikace by měla vést k tvorbě IL-4 muteinu, který má zachovanou aktivitu související s IL-4.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob, pomocí kterého se daný protein exprimuje a znovu svinuje a jenž je popsán v příkladu 2. IL-4 mutein podle tohoto vynálezu se musí správně přečistit, aby byla umožněna jeho účinná PEGylace. Uvedené čištění je popsáno například v dále uvedeném příkladu 2. Pokud dojde ke svinutí muteinu v přítomnosti sulfhydrylového chránícího činidla, jako je například β-merkaptoethanol, glutathion nebo cystein, nemůže být přečištěný mutein PEGylován, protože aktivní sulfhydrylová skupina cysteinu, jenž je zaveden do řetězce IL-4, je deaktivována oxidovaným chránícím činidlem. Mezi volným cysteinem v řetězci IL-4 muteinu a uvedeným chránícím činidlem dochází k vytvoření kovalentní disulfidové vazby. Naopak, při použití sulfhydrylového chránícího činidla dithiothreitolu (DTT), který oxiduje za vzniku stabilní disulfidové vazby, se nebude tvořit kovalentní vazba s volným

9999

9 • 9 99 • · · 9

99

9 9

9 9

9999 99

9

9

9

9 9

99

9 9

999 cysteinem v řetězci IL-4 muteinu, takže sulfhydrylová skupina tohoto cysteinu zůstane volná pro reakci s PEG-maleinimidovým reakčnim činidlem.IL-4 muteiny, které byly přečištěny po----------------------svinutí v přítomnosti β-merkaptoethanolu, glutathionu nebo cysteinu, mohou reagovat s PEG reakčnim činidlem, pokud jsou předem ošetřeny DTT, avšak při tomto postupu dochází ke vzniku směsi monoPEGylovaných a polyPEGylovaných produktů, z čehož lze usuzovat, že dochází rovněž k PEGylaci cysteinů přítomných v řetězci IL-4 před jeho mutací. PEGylace těchto cysteinů přítomných v řetězci IL-4 před jeho mutací by vedla ke vzniku nesprávně svinutých produktů, které nejsou aktivní.

K_d modifikovaných antagonistů receptoru IL-4 muteinu vzhledem k receptoru IL-4 může být stanovena jakoukoliv v oboru dobře známou metodou, včetně technologií, jako je Bimolecular Interaction Analysis (BIA) prováděná v reálném čase, jež je popsána v příkladu 4. BIA je technologie pro studování biospecifických interakcí v reálném čase, bez značení kteréhokoliv z interaktantů (např. BIAcore®) . Změny v optických jevech povrchové plazmonové rezonance (SPR) mohou být použity jakožto indikátor probíhajících reakcí mezi biologickými molekulami.

Schopnost modifikovaných antagonistů receptor IL-4 muteinu inhibovat proliferativní odezvu imunitních buněk může být stanovena za použití proliferativních testů, které jsou popsány v příkladu 5, a tato schopnost se vyjadřuje jako 50% inhibiční koncentrace (IC₅₀) .

Při testu BIAcore® se modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu specificky vážou k ·· *· • 999 9

99 9

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 ··♦· • · · · · • · · · ···

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 999 receptoru lidského IL-4 s K_d výhodně v rozmezí od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM. Ve výhodnějších provedeních předmětného vynálezu se uvedení antagonisté vážou k receptoru lidského IL-4 s K_d v rozmezí od přibližně 0,5 nM do přibližně 1,0 μΜ. V ještě výhodnějším provedení předmětného vynálezu se uvedení antagonisté vážou k receptoru lidského IL-4 s K_d v rozmezí od přibližně 0,1 nM do přibližně 10 μΜ. Kromě toho, jak lze předpokládat, modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu se budou vázat na receptor lidského IL-4 a neutralizovat jeho schopnost podporovat proliferaci imunitních buněk s IC₅₀ výhodně v rozmezí od přibližně 1,0 nM do přibližně 100 nM. Výhodnější lidští antagonisté se vážou k receptor IL-4 a neutralizují jeho schopnost podporovat proliferaci imunitních buněk s IC₅₀ v rozmezí od přibližně 0,5 nM do přibližně 1 μΜ, přičemž nejvýhodnější antagonisté podle tohoto vynálezu se vážou k receptoru IL-4 a inhibují jeho výše uvedenou schopnost s IC₅₀ v rozmezí od přibližně od 0,1 nM do přibližně 10 μΜ.

Současná provedení modifikovaných antagonistů receptoru IL-4 muteinu vykazují rovněž plazmatický poločas, který je výhodně alespoň 2- až lOkrát delší než plazmatický poločas, jaký vykazuje nemodifikovaný IL4RA, přičemž v nejvýhodnějších provedeních tohoto vynálezu je uvedený plazmatický poločas 10až lOOkrát delší než u nemodifikovaného IL-4RA. (viz příklad 7) .

Mnozí modifikovaní antagonisté receptoru IL-4 muteinu s výše popsanými vlastnostmi byli identifikováni pomocí screeningu potenciálních kandidátů za pomoci výše popsaných testů. Provedení tohoto vynálezu zahrnují polypeptidové sekvence uvedené v tabulce 2 (SEQ ID NO :10-16) φφ φφφφ ·· φφφφ • Φ φφ φφφφ · · φ φφφ • ♦· · · φ φ φ φφφ φφφφφφ φφφφ φ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφ

Tabulka 2

Sekvence polypeptidů

SEQ ID NO	Název	Sekvence
9	IL4RA	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAA SKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQ QFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQS TLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
10	IL4-RE-T28C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELCVTDIFAA SKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQ QFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQS TLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
11	IL4-RE-S36C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAA CKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQ QFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQS TLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
12	IL4-RE-K37C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS CNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQF HRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLE NFLERLKTIMDEKDSKCS S
13	IL4-RE-N38C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS KCTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQF HRHKOLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLE HFLERLKTIMDEKDSKCS S
14	IL4-RE-A104C	MHKCDITLQEIIKTLHSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS KNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQF HRHKOLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKECNQSTLE NFLERLKTIHDEKDSKCSS

φφφφ

φ φ φ φ φ φ · φ · · φ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφ φφ φφφφ

SEQ ID NO	Název	Sekvence
15	IL4-RE-N105C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS KNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQF HRHKOLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEACQSTLE NFLERLKTIMDEKDSKCSS
16	IL4-RE-Q106C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS KNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQF HRHKOLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANCSTLE NFLERLKTIMDEKDSKCSS

(b) Polynukleotídy kódující modifikované antagonisty receptoru

IL-4 muteinu

Vynález se rovněž týká polynukleotidů kódujících modifikované antagonisty receptoru IL-4 muteinu. Tyto polynukleotídy mohou být využity například k produkci většího množství uvedených antagonistů pro terapeutické účely.

Polynukleotid podle tohoto vynálezu může být snadno získán různými způsoby, jako například chemickou syntézou, screeningem cDNA nebo genomických knihoven, screeningem expresní knihovny a/nebo PCR amplifikací cDNA.

Metody rekombinantní DNA, které jsou zde popsány, jsou obecně shodné s metodami popsanými v publikaci Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a/nebo v publikaci Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Ed., Green Publisher lne a Wiley and Sons 1994). Do rozsahu tohoto vynálezu spadají molekuly nukleových kyselin popsané v tomto textu a způsoby, které umožňují jejich získání.

·· ····

«· ··*· · · • · ·

99

9 9 9

9 9 99

9 9 9 9

9 9 9

999

Jedním ze způsobů, jak získat vhodnou sekvenci nukleové kyseliny, je polymerasová řetězová reakce (PCR). Při tomto způsobu se připravuje cDNA z poly(A)+RNA nebo z celkové RNA za použití enzymu označovaného jako reverzní transkriptasa. K uvedené cDNA se následně přidávají dva primery, které jsou obvykle komplementární ke dvěma odděleným regionům cDNA modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu, a to spolu s polymerasou, jako je Taq polymerasa, přičemž uvedená polymerasa amplifikuje region cDNA mezi těmito dvěma primery.

Dalším způsobem přípravy molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je chemická syntéza za pomoci metod, které odborník v oboru dobře zná, jako jsou metody popsané v publikaci Engels et al., 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716-34. Skupina těchto způsobů zahrnuje, mimo jiné, fosfotriesterový, fosforamiditový a H-fosfonátový způsob syntézy nukleových kyselin. Výhodným způsobem takovéto chemické syntézy je syntéza na polymerním nosiči, při níž se využívá standardní fosforamiditová chemie. V obvyklém případě má DNA délku několika set nukleotidů. Nukleové kyseliny, které jsou delší než přibližně 100 nukleotidů, mohou být tímto způsobem syntetizovány ve formě několika fragmentů. Uvedené fragmenty mohou být následně spojeny dohromady. Dále je možné použít další způsoby, které jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu, které mohou být použity ke kódování modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu jsou uvedeny v tabulce 3 (SEQ ID NO:2-8).

φφ φφ φφ φφφφ φ* φφφφ φ φ φ · φ φ · φφφ φφφ φ φ φ · φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφ

Tabulka 3

Sekvence polynukleotidu

SEQ ID MO	Název	Sekvence
1	IL4RA	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATC AAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTG TGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCC TCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGG GCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCAT GAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAG CAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTG AAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGC TTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGT ACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATC ATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
2	IL4-RE-T28C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATC AAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTG TGCACCGAGTTGTGCGTAACAGACATCTTTGCTGCC TCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGG GCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCAT GAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAG CAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTG AAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGC TTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGT ACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATC ATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGT TCGAGCTAATAA

9999

9«

9 9 · • 99

9 9 9

9 9

9999 99

9999

9

9

9

9

9

SEQ ID NO	Název	Sekvence
3	IL4-RE-S36C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCA AAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTG CACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTGC AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTG CGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAA GGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTC CACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGC TCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTC CTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAA AACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGA AAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
4	IL4-RE-K37C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATC AAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTG TGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCC TCCTGCAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGG GCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCAT GAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAG CAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTG AAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGC TTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGT ACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATC ATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

• · · · • ·· • · · • · · ···♦ ·· ·· ···· ·· • · · • « 999 • · · • · » ·· ··*

SEQ ID NO	Název	Sekvence
5	IL4-RE-N38C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATC AAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTG TGCACCGAGTTGACCGTAACAGACGGAAACCTTCTG CAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCA CCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGC ACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATT CCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGC GGGCTTGAATTCCTGTOCTGTGAAGGAAGCCAACCA GAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGAC GATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTA ATAA
6	IL4-RE-A104C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCA AAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTG CACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTG CGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAA GGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTC CACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGC TCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTC CTGTCCTGTGAAGGAATGCAACCAGAGTACGTTGGAA AACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGA AAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

·« ··

9 9 9 9 9

99 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 99 99 ·· ···· •ť 9999 9 9 9 9

9 9 999

9 9 9 9

9 9 9

SEQ ID NO	Název	Sekvence
7	IL4-RE-N105C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCA AAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTG CACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTG CGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAA GGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTC CACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGC TCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTC CTGTCCTGTGAAGGAAGCCTGCCAGAGTACGTTGGAA aacttcttggaaaggctaaagacgatcatggacgaga AAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
8	IL4-RE-Q106C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCA AAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTG CACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGOAGGGCTG CGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAA GGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTC CACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGC TCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTC CTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACTGCAGTACGTTGGAA AACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGA AAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž expresní vektory, které obsahují polynukleotidy podle předmětného vynálezu, a hostitelské buňky, které obsahují expresní vektor podle tohoto vynálezu.

Polynukleotid podle předmětného vynálezu může být inzerován do příslušného vektoru pomocí standardních ligačních » · · · · · • · • · · · technik. Uvedený vektor je obvykle vybrán tak, aby byl funkční v dané použité hostitelské buňce, (tj. vektor je kompatibilní s procesy probíhajícími v hostitelské buňce, takže může docházet k amplifikaci genu a/nebo expresi genu). Polynukleotid podle předmětného vynálezu může být exprimován v prokaryontní, kvasinkové, hmyzí (baculovirus systém) a/nebo eukaryontní hostitelské buňce. Výběr hostitelské buňky záleží na mnoha různých faktorech, jako je požadovaný stupeň exprese. Pro přehled expresních vektorů viz. Meth. Enz., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed., Academie Press 1990).

Obvykle se v hostitelských buňkách používají expresní vektory, které obsahují sekvence pro údržbu plazmidu a pro klonování a expresi exogenních nukleotidových sekvencí. Takovéto sekvence, které se všeobecně nazývají „lemovací sekvence v určitých provedeních vynálezu obvykle obsahují jednu nebo více z následujících nukleotidových sekvencí: promotor, jednu nebo více enhancerových sekvencí, počátek replikace, terminační transkripční sekvenci, kompletní sekvenci intronu, která obsahuje donorové a akceptorové místo pro splicing, sekvenci kódující vedoucí sekvenci pro sekreci polypeptidů, vazebné místo ribozomu, polyadenylační sekvenci, polylinkerový region pro inzerci nukleové kyseliny, který kóduje polypeptid, jenž má být exprimován, a volitelný markér. Každá z těchto sekvencí je diskutována v dalším textu.

Lemovací sekvence mohou být homologní (tj. ze stejného druhu a/nebo rodu jako je hostitelská buňka), heterologní (tj. z jiného druhu než je hostitelská buňka nebo kmen), hybridní (tj. může jít o kombinaci lemovacích sekvencí z více než jednoho zdroje), nebo syntetické, nebo mohou být uvedenými ·» ·· ·· ···· ·· ···· • · · · ·· · ··· ··· · · · · · · · · ······ · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··· lemovacími sekvencemi nativní sekvence, které normálně regulují expresi antagonisty receptoru IL-4 muteinu. Zdrojem lemovacích sekvencí může být jakýkoli prokaryontní nebo eukaryontní organismus, jakýkoliv obratlovec či bezobratlý organismus, nebo jakákoliv rostlina, ovšem za předpokladu, že daná lemovací sekvence je funkční v hostitelské buňce a může být aktivována procesy probíhajícími v hostitelské buňce.

Lemovací sekvence, které se používají ve vektorech podle předmětného vynálezu, mohou být získány kterýmkoli z několika způsobů, jež jsou v dané oblasti techniky známy. V obvyklém případě lemovací sekvence používané podle tohoto vynálezu kterými nejsou lemovací sekvence genu antagonisty receptoru IL-4 muteinu - musí být nejdříve identifikovány mapováním a/nebo restrikčním endonukleasovým štěpením a mohou být proto izolovány ze správných tkáňových zdrojů pomocí příslušných restrikčních endonukleas. V některých případech může být známa úplná nukleotidová sekvence lemovacích sekvencí. Lemovací sekvence mohou být syntetizovány pomocí metod, jež jsou v tomto textu popsány pro syntézu nukleových kyselin nebo klonování.

V případech, kdy je známa celá lemovací sekvence nebo jen její část, může být tato získána pomocí PCR a/nebo pomocí screeningu genomové knihovny s vhodným oligonukleotidem a/nebo pomocí fragmentu lemovací sekvence ze stejného nebo jiného druhu. V případech, kdy lemovací sekvence není známa, může být izolován fragment DNA obsahující lemovací sekvenci, a to z větší části DNA, která může obsahovat např. kódující sekvence, nebo dokonce další gen nebo geny. Uvedenou izolaci je možné provést štěpením restrikční endonukleasou, za vzniku • · ·· · · · ··· správného DNA fragmentu, s následnou izolací, která se provádí přečištěním pomocí agarosového gelu, sloupcové chromatografie

Qiagen® (Chatsworth, CA), nebo dalšími metodami, jež jsou odborníkovi dobře známé. Výběr vhodných enzymů k dosažení tohoto cíle je odborníkovi zřejmý.

Počátek replikace je typicky část prokaryontních expresních vektorů, které se získávají komerčně, a tento počátek pomáhá při amplifikaci vektoru v hostitelské buňce. Pokud zvolený vektor neobsahuje počátek replikačního místa, může být chemicky syntetizován podle známé sekvence a ligován do daného vektoru. Například počátek replikace z plazmidu pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) je vhodný pro většinu gramnegativních bakterií a různých zdrojů (např. SV40, polyoma, adenoviry, vesicular stomatitus virus (VSV), papilomaviry, jako je HPV nebo BPV) a využívá se ke klonování vektorů v savčích buňkách. Obecně není počátek replikace pro savčí expresní vektory třeba (např. SV40 zdroj se často využívá jen proto, že obsahuje časný promotor).

Terminační transkripční sekvence je obvykle lokalizována v pozici 3' konce regionu kódujícího polypeptid a slouží k ukončení (terminaci) transkripce. Obvykle je terminační transkripční sekvence v prokaryontních buňkách fragmentem bohatým na G-C a je následována poly-T sekvencí. Ačkoli se tato sekvence může snadno nakloňovat z knihovny, nebo dokonce získat komerčně jako část vektoru, může být rovněž snadno syntetizována za použití metod syntézy nukleových kyselin, jako jsou například metody popsané v tomto textu.

·» «4» ·· ···· ·· ···· ···· ·· · · f » • · · · · · · · · · » • · ··· · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ···

Volitelný genový markér obvykle kóduje protein, který je nutný k přežití a růstu hostitelské buňky v selektivním kultivačním mediu. Typický genový markér kóduje proteiny, které (a) prokaryontním hostitelským buňkám propůjčují rezistenci vůči antibiotikům nebo dalším toxinům, jako je například ampicilin, tetracyklin, kanamycin; (b) komplementují auxotrofní buněčné defekty; nebo (c) produkují kritické nutrienty, které nejsou dostupné z komplexního média.

Výhodnými markéry jsou: gen rezistence vůči kanamycinu, gen rezistence vůči ampicilinu, gen rezistence vůči tetracyklinu. Pro vybrané prokaryontní a eukaryontní buňky může být rovněž použit gen rezistence vůči neomycinu.

Další selekční geny mohou být použity k amplifikaci exprimovaného genu. Amplifikace je proces, při kterém geny, u kterých je požadována zvýšená produkce proteinu kritického pro růst, jsou reiterovány do tandemu uvnitř chromozomů v dalších generacích rekombinantních buněk. Příklady vhodných selekčních markérů pro savčí buňky jsou dihydrofolatreduktasa (DHFR) a thymidinkinasa. Savčí buněčné transformanty jsou vystaveny působení selekčního tlaku, kdy pouze uvedené transformanty jsou unikátně přizpůsobeny pro přežití díky přítomnosti selekčního genu v daném vektoru. Uvedený selekční tlak je vytvořen kultivováním transformovaných buněk za podmínek, kdy koncentrace selekčního činidla v mediu je postupně měněna, což vede k amplifikaci jak selekčního genu, tak DNA, která kóduje modifikovaného antagonistů receptoru IL-4 muteinu. Výsledkem je zvýšené množství modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu, které je syntetizováno z amplifikované DNA.

·· ·· ·· ···· ·· ···· • · · · ·· · ··· • · · · · · · · · ·· ···· ·· ·· ·· ·· ···

Vazebné místo ribozomu je obvykle nutné pro iniciaci translace mRNA a je charakterizováno sekvencí Shine-Dalgamo (prokaryonta) nebo Kozákovou sekvencí (eukaryonta). Uvedený prvek je typicky lokalizován v pozici 3' vzhledem k promotoru a 5' vzhledem ke kódující sekvenci modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu. Uvedená sekvence Shine-Dalgarno je variabilní, ale obvykle se jedná o polypurin (např. s vysokým obsahem A-G). Bylo identifikováno mnoho sekvencí ShineDalgarno a každá z nich může být snadno syntetizována pomocí metod popsaných v tomto textu a použita v prokaryontních vektorech.

Vedoucí, nebo signální, sekvence může být využita k nasměrování modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu ven z hostitelské buňky. Obvykle se nukleotidová sekvence kódující signální sekvenci nalézá v kódujícím regionu molekuly nukleové kyseliny modifikovaného antagonisty receptoru muteinu IL-4, nebo přímo na 5' konci regionu kódujícího modifikovaného antagonistu receptoru IL-4 muteinu. Bylo identifikováno mnoho signálních sekvencí, přičemž každá z nich, která je funkční ve zvolené hostitelské buňce, může být použita ve spojení s molekulou nukleové kyseliny modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu. Proto mohou být signální sekvence homologní (vyskytující se v přírodě) nebo heterologní vzhledem k nukleové kyselině modifikovaného antagonisty receptoru IL-4. Kromě toho mohou být signální sekvence chemicky syntetizovány za použití způsobů popsaných v tomto textu. Ve většině případů vede sekrece modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu ven z hostitelské buňky prostřednictvím přítomnosti signálního peptidů k oddělení signálního peptidů od sekretovaného modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu. Uvedená ·· ··· · • ·· • · · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ··· signální sekvence může být součástí vektoru, nebo může být částí molekuly nukleové kyseliny modifikovaného antagonisty receptorů IL-4 muteinu, která je inzerována do vektoru.

V mnoha případech je transkripce molekuly nukleové kyseliny zvýšena pomocí přítomnosti jednoho nebo více intronů ve vektoru, což platí zejména tam, kde jsou polypeptidy produkovány eukaryontní hostitelskou buňkou, zejména savčími hostitelskými buňkami. Používané introny se mohou běžně vyskytovat v genu modifikovaného antagonisty receptorů IL-4 muteinu, a to zejména pokud je gen používán v plné délce genomické sekvence a nebo jako její fragment. Pokud se intron běžně v genu nevyskytuje, je možné jej získat z jiného zdroje. Pozice intronu vzhledem k lemovacím sekvencím a genu modifikovaného antagonisty receptorů IL-4 muteinu je obecně velmi důležitá, neboť intron musí být transkribován aby byl efektivní. Pokud je tedy molekula nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu transkribována, je výhodnou pozicí intronu pozice 3' vzhledem k místu startu transkripce, a 5' vzhledem k poly-A terminační transkripční sekvenci. Výhodně se intron nebo introny nacházejí na jednom nebo druhém konci cDNA (tj. na 5' nebo 3' konci), takže daný intron nepřerušuje kódující sekvenci. Intron z jakéhokoliv zdroje jak virového, prokaryontního nebo eukaryontního (rostlinného či živočišného) organismu, může být použit při praktickém uskutečnění tohoto vynálezu, a to za předpokladu že je kompatibilní s hostitelskou buňkou, do které je inzerován. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá i použití syntetických intronů. V daném vektoru může být případně použit více než jeden intron.

·· ·· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · · · * • · · · · · · ···· ♦ ····· ·»·· · • ·· ···· · · · ···· ·· ·· ·· «· ···

Expresní a klonující vektory podle tohoto vynálezu budou typicky obsahovat promotor, který je rozpoznáván hostitelským organismem a použitelně navázán na molekulu nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu. Promotory jsou netranskribované sekvence, které jsou lokalizovány před (tj. na 5' konci) startovním kodónem strukturního genu (obvykle v rozmezí od 100 do 1000 pb) a které řídí transkripci daného strukturního genu. Promotory se běžně dělí do dvou skupin: indukovatelné promotory a konstitutivní promotory. Indukovatelné promotory iniciují zvýšený stupeň transkripce z DNA pod jejich kontrolou, a to jakožto odezvu na určité změny podmínek kultivace, jako je například přítomnost či nepřítomnost nutriční složky nebo změna teploty. Na druhé straně konstitutivní promotory iniciují kontinuální produkci genetického produktu, což znamená, že v tomto případě existuje malá nebo žádná kontrola nad genovou expresí. Je známo velké množství promotorů, které jsou rozpoznávány různými potencionálními hostitelskými buňkami. Vhodný promotor může být použitelně navázán k molekule nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu tak, že se odstraní promotor z DNA pomocí restrikčních endonukleas a následně se sekvence požadovaného promotoru inzeruje do vektoru. Sekvenci promotoru nativního antagonisty receptoru IL-4 muteinu je možné použít k přímé amplifikaci a/nebo expresi molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu. Avšak výhodně se používá heterologní promotor, a to za předpokladu, že jejich použití vede ke zvýšené transkripci a dosažení většího výtěžku exprimovaného proteinu ve srovnání s případem, kdy se používá nativní promotor, a za předpokladu, že je kompatibilní se systémem hostitelské buňky, která byla vybrána pro použití.

··«·

9 ·· ·· 9 9 99 9 99 9

99 9 9 9 9 9 999

999 9 999 9 9

99 9999 99 9

9999 99 99 99 99 999

9999

Skupina promotorů vhodných k použití s prokaryontními hostitelskými buňkami zahrnuje β-laktamasový a laktosový promotorový systém; alkalickou fosfatasu; tryptofanový (trp) promotorový systém; a hybridní promotory, jako je tac promotor. Rovněž vhodné jsou další známé bakteriální promotory. Jejich sekvence byly publikovány, proto mají odborníci možnost ligovat je do požadované DNA sekvence, a to pomocí linkerů nebo adapterů, které se používají podle potřeby za účelem vytvoření vhodných restrikčních míst.

Promotory vhodné k použití ve spojení s kvasinkovými hostiteli jsou rovněž v oboru dobře známé. Spolu s kvasinkovými promotory se výhodně používají kvasinkové enhancery. Vhodné promotory k použití se savčími hostitelskými buňkami jsou dobře známé a jejich skupina zahrnuje, mimo jiné ty, které byly získány z genomů virů, jako je polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (jako Adenovirus 2), bovinní papiloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, virus hepatitidy B a nejvýhodněji Simian Virus 40 (SV40). Skupina dalších vhodných savčích promotorů zahrnuje heterologní savčí promotory, jako je například, heat-shock promotory a aktinový promotor.

Skupina dalších promotorů, které mohou být zajímavé z hlediska regulování exprese genu, zahrnuje, mimo jiné, SV40 region časného promotoru (Bernoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-10); CMV promotor, promotor obsahující na 3' konci dlouhé terminální opakování Rous sarcoma viru (Yamamotot, et al., 1980, Cell 22:787-97); herpes thimidinkinasový promotor (Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 78: 144445); regulační sekvence metalothioninového genu (Brinster et ·· ···· • · · · • · 9 · · · · ··· ··· · · · · · · ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 999 al., 1982, Nátuře 296:39-42); prokaryontní expresní vektory, jako je β-laktamasový promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 75:3727-31); a tac promotor (DeBoer et al, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). Zajímavé jsou rovněž následující zvířecí transkripční regulační regiony, které vykazují tkáňovou specificitu a které se používají u transgenních zvířat: regulační region genu elastasy I, který je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald,

1987, Hepatology 7:425-515); regulační region genu insulinu který je aktivní v pankreatických β-buňkách (Hanahan, 1985,

Nátuře 315:115-22); regulační region genu imunoglobulinu, který je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl et al.,

1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nátuře 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); regulační region myšího tumoru prsu, který je aktivní v testikulárních, prsních, lymfoidních buňkách a v mastocytech (Leder et al.,

1986, Cell 45:485-95); regulační, region genu albuminu, který je aktivní v játrech (Punkery et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); regulační region genu α-fetoproteinu, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); regulační region genu α-1-antitrypsinu, který je aktivní v játrech (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); regulační region genu β-globinu, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315:338-40; Kollias et al., 1986,

Cell 46:89-94); gen základního proteinu myelinu reguluje region, který je aktivní v oligodendrocytových buňkách v mozku (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); regulační region genu lehkého řetězce-2 myosinu, který je aktivní v příčně pruhová·· ···· ·· ····

99 • •99 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 99

9 9 · 9 · 9 9 9 9 9

99 9999 99 9

9999 9· 99 ·9 99 999 ·· 9999 ném svalstvu (Sani, 1985, Nátuře 314:283-86); a regulační region genu hormonu uvolňujícího gonadotropin, který je aktivní v hypotalamu (Mason et al., 1986, Science 234:137278) .

Enhancerová sekvence může být inzerována do vektoru za účelem zvýšení transkripce molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu vyššími eukaryonty. Enhancery jsou cis-působící elementy DNA, dlouhé obvykle 10-300 pb, které působí na promotor za účelem zvýšení transkripce. Enhancery jsou relativně nezávislé na orientaci a pozici. Byly nalezeny v pozicích 5' a 3' vzhledem ke transkripční jednotce. Jsou známy některé enhancerové sekvence, které jsou dostupné ze savčích genů (např. globinu, elastasy, albuminu, α-fetoproteinu a insulinu). Avšak obvykle se používá enhancer virového původu. Enhancer SV40, enhancer cytomegalovirového časného promotoru, polyoma enhancer, a adenovirový enhancer jsou příklady enhancerů sloužících k aktivaci eukaryotních promotorů. Ačkoli enhancer může být napojen na vektor v pozici 5' nebo 3' vzhledem k molekule nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, je nachází se obvykle v pozici 5' od promotoru.

Expresní vektory podle tohoto vynálezu mohou být konstruovány ze startovacího vektoru, jako je například komerčně dostupný vektor. Takové vektory mohou, ale nemusí obsahovat všechny požadované lemovací sekvence. Pokud se v daném vektoru nevyskytuje jedna nebo více ze zde popsaných lemovacích sekvencí, mohou být získány izolovaně a ligovány do vektoru. Způsoby používané pro získávání lemovacích sekvencí jsou odborníkovi dobře známé.

·· ···· ·· ···· ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 999

Výhodnými vektory pro praktické uskutečnění tohoto vynálezu jsou takové vektory, které jsou kompatibilní s bakteriálními, hmyzími a savčími hostitelskými buňkami. Mezi takové vektory patří, mimo jiné, pCRII, pCR3 a pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA, USA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA, USA) , pET15 (Novagen, Madison, WI, USA), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (zveřejněná PCT přihláška číslo WO 90/14363) a pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA).

Skupina dalších vhodných vektorů zahrnuje, mimo jiné, kosmidy, plazmidy nebo modifikované viry, avšak odborníkovi v dané oblasti je zřejmé, že daný vektorový systém musí být kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Mezi takové vektory se řadí, mimo jiné, plazmidy, jako jsou plazmidové deriváty Bluescript® (což je fagemid na bázi vysokého počtu kopií ColEl, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) , PCR klonující plazmidy vytvořené pro klonování Taq-amplifikovaných produktů PCR (např. TOPO® TA Cloning® Kit, PCR 2.1® plazmidové deriváty, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a savčí, kvasinkové a virové vektory jako baculovirový expresní systém (pBacPAK plazmidové deriváty, Clontech, Palo Alto, CA, USA).

Poté co se vytvoří vektor a je do něj na správné místo inzerována molekula nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, může být kompletní vektor inzerován do vhodné hostitelské buňky k další amplifikaci a/nebo expresi polypeptidu. Transformace expresního vektoru podle tohoto vynálezu do vybrané hostitelské buňky může být dosaženo dobře známými metodami, jejichž skupina zahrnuje takové metody, jako je transfekce, • 9 ···· ···· • 9 9 9 • 9 9 · · 9 · 9 9 9 • 99 99 9 99 999

999 9 999 9 9

99 9999 99 9 • 999 99 99 99 99 999 infekce, použití chloridu vápenatého, elektroporace, mikroinjekce, lipofekce, DEAE-dextranová metoda nebo další známé techniky. Výběr metody závisí částečně na typu použité hostitelské buňky. Tyto metody a další metody jsou odborníkům v oboru dobře známé a jsou uvedeny například v publikaci

Sambrook et al., citované výše.

Hostitelskými buňkami mohou být prokaryontní hostitelské buňky (jako je E.coli) nebo eukaryontní hostitelské buňky (jako jsou kvasinkové buňky, hmyzí buňky nebo buňky obratlovců) . Hostitelská buňka, pokud je kultivována za příslušných podmínek, syntetizuje modifikovaného antagonistu receptoru IL-4 muteinu, který může být následně izolován z kultivačního media (pokud jej hostitelská buňka sekretuje do kultivačního media) nebo přímo z hostitelských buněk, které ho produkují (pokud jimi není sekretován). Výběr vhodné hostitelské buňky záleží na různých faktorech, jako je požadovaná míra exprese, modifikace polypeptidů, které jsou žádoucí nebo které je nutné provést pro dosažení požadované aktivity (jako je glykosylace nebo fosforylace) a snadnost svinutí do biologicky aktivní molekuly.

V dané oblasti techniky je známo mnoho vhodných hostitelských buněk a mnohé z nich je možné získat z American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Mezi příklady patří savčí buňky, jako jsou vaječníkové buňky čínského křečka (CHO), buňky CHO DHFR(-) (Urlaub et al., 1980, Proč. Nati.

Acad. Sci. USA. 97:4216-20), ledvinové buňky lidského embrya (HEK) 293 nebo 293T buňky, nebo 3T3 buňky. Postupy při výběru vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifikace, screeningu, produkce produktu a

99

9 9

9 9

9999 99 ** ··♦· ·· *·»· • ♦ · · · ·

9 9 9 9 999

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 999 čištění jsou v oblasti techniky dobře známé. Dalšími vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou opičí COS-1 a COS-7 buněčné linie a CV-1 buněčná linie. Další příklady savčích buněk zahrnují buněčné linie primátů a buněčné linie hlodavců, a to včetně transformovaných buněčných linií. Vhodné jsou rovněž normální diploidní buňky, buněčné kmeny odvozené od in vitro kultury primární tkáně, jakož i primární explantáty. Kandidátní buňky mohou být genotypicky deficientní v selekčním genu, nebo mohou obsahovat dominantně působící selekční gen. Skupina další vhodných linií savčích buněk zahrnuje, mimo jiné, buňky myšího neuroblastomu N2A, HeLa, myší L-929 buňky, 3T3 linie odvozené od Swiss, Balb-c nebo NIH myší, BHK nebo HaK buněčné linie křečků. Každá z těchto buněčných linií je odborníkovi v boru exprese proteinů dobře známá a dostupná.

Podobně užitečné jakožto hostitelské buňky vhodné pro účely tohoto vynálezu jsou bakteriální buňky. Například různé kmeny E.Coli (např.HB101, DH5, DH10 a MC1061) jsou v oblasti biotechnologie dobře známé jakožto hostitelské buňky. Při tomto způsobu se rovněž mohou využít různé kmeny B.subtilis, Pseudomonas spp., další Bacilus spp., Streptomyces spp. apod.

Mnohé z kmenů kvasinkových buněk, jež jsou odborníkovi v dané oblasti techniky známé, jsou rovněž dostupné jakožto hostitelské buňky pro expresi polypeptidů podle tohoto vynálezu. Skupina výhodných kvasinkových buněk zahrnuje například Saccharomyces cerivisae a Pichia pastoris.

Dále je možné při způsobech podle tohoto vynálezu použít v případě potřeby i hmyzí buněčné systémy. Takovéto systémy jsou popsány například v publikacích Kitts et al., 1993, Bio·· »»·· • · ·

• · · « · · • · · • · · · ·· «··· • · · • · · ·· • · ·

9 · ·· ··· technique, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72; a Lucklow et al., 1993, J. Virol., 67:4566-79. Výhodnými hmyzími buňkami pro použití podle tohoto vynálezu jsou Sf-9 a Hi5 (Invitrogen).

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu, jež jsou přítomné v hostitelských buňkách, mohou být izolovány ve formě zbavené ostatních buněčných komponent, jako jsou membránové struktury, proteiny a lipidy. Polynukleotidy mohou být z buněk izolovány za použití standardních technik čištění nukleových kyselin, nebo mohou být syntetizovány za použití amplifikačních technik, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR), nebo za použití automatického syntetizéru. Způsoby izolace polynukleotidů jsou rutinní a jsou v oboru dobře známé. Kterákoliv takováto technika pro získání polynukleotidů může být použita pro získání izolovaných polynukleotidů kódujících antagonisty podle tohoto vynálezu. K izolování polynukleotidů, které kódují antagonisty podle tohoto vynálezu, může být použita například metoda restrikčních enzymů a sond. Ve výhodném provedení se izolované polynukleotidy nacházejí v preparátech, které jsou na alespoň ze 70, 80 nebo 90 % prosté jiných molekul.

Odborníkům v dané oblasti techniky je zřejmé, že molekuly nukleových kyselin a polypeptidu, které jsou popsány v tomto textu, mohou být produkovány rekombinantními a dalšími metodami. Například molekuly cDNA modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu mohou být produkovány standardními molekulárně biologickými technikami, za použití mRNA jakožto templátu. Následně mohou být molekuly cDNA replikovány za pomoci molekulárně biologických technik, ···· • · · ·· ·

• · · 9 · • · • *·· • 9 999·

které jsou v dané oblasti techniky dobře známé a jež jsou popsané v přikladu 1. Příklad 2 popisuje specifickou rekombinantní techniku exprese a čištění, která je použita pro přípravu modifikovaných antagonistu muteinu podle předmětného vynálezu.

(c) Posouzení terapeutického využití lidských antagonistu

Ke stanovení potenciální účinnosti konkrétního antagonisty při terapii alergického astmatu, může být daný antagonista testován in vitro v testech buněčné proliferace, které jsou podrobně popsány v příkladech 5 a 6. Kromě toho, plazmatický poločas modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu může být in vivo měřen pomocí farmakokinetické studie na potkanech podle příkladu 6.

(d) Farmaceutické kompozice

Kterýkoliv z výše popsaných modifikovaných antagonistu receptoru IL-4 muteinu může být použit ve farmaceutické kompozici obsahující farmaceuticky přijatelný nosič. Uvedený farmaceuticky přijatelný nosič je výhodně apyrogenní. Uvedené farmaceutické kompozice mohou být podávány samostatně nebo v kombinaci s alespoň s jedním dalším činidlem, jako je stabilizátor, které může být podáváno v jakémkoli sterilním, biokompatibilním farmaceutickém nosiči, jejichž skupina zahrnuje, mimo jiné, fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrosu a vodu. Může být použito mnoho různých vodných nosičů, jako je například 0,4% solný roztok, 0,3% glycin apod. Tyto roztoky jsou sterilní a obecně neobsahují nerozpuštěné látky. Tyto roztoky mohou být sterilizovány ·* ·« ··♦· • ·· • · · * · · ···· ·· • · · • · · • · · * • · · · • · * · ·· »··« • 9 9 • · 999 « · · • · ·

999 standardními, dobře známými sterilizačními technikami (např. filtrací).

Uvedené farmaceutické kompozice mohou v případě potřeby zahrnovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky. Přijatelné pomocné látky jsou výhodně v dávkách a koncentracích, které se používají, netoxické pro příjemce. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou obsahovat pomocné látky pro modifikaci, udržení nebo uchování např. pH, osmolarity, viskozity, čirosti, zabarvení, isotonicity, vůně, sterility, stability, rychlosti rozpouštění nebo uvolňování, adsorpce nebo penetrace uvedené kompozice. Skupina vhodných materiálů pro formulaci uvedených farmaceutických kompozic zahrnuje, mimo jiné, aminokyseliny (jako je glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin), antimikrobiální činidla, antioxidanty (jako je kyselina askorbová, siřičitan sodný nebo hydrogensiřičitan sodný), pufry (jako jsou boritan, hydrogenuhličitan, Tris-HCl, citráty, fosfáty nebo další organické kyseliny ), objemová činidla (jako je mannitol nebo glycin), chelatační činidla (jako je kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA)), komplexační činidla (jako je kofein, polyvinylpyrrolidon, β-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-p-cyklodextrin), plniva, monosacharidy, disacharidy a další sacharidy (jako je glukosa, manosa nebo dextriny), proteiny (jako je sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny), barvicí činidla, vonné látky nebo ředidla, emulgační činidla, hydrofilní polymery (jako je polyvinylpyrrolidon), polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností, soli tvořící protiionty (jako je sodný ion), konzervační činidla (jako je benzalkoniumchlorid, kyselina benzoová, kyselina salicylová, thimerosal, fenethylalkohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidin, kyselina sorbová nebo peroxid vodíku), ·< ·«*· «· 94 ♦ 9 · ·

• * · • · • · · «

• ·

rozpouštědla (jako je glycerin, propylenglykol nebo polyethylenglykol), cukerné alkoholy (jako je mannitol nebo sorbitol), suspendační činidla, povrchově aktivní látky nebo smáčecí činidla (jako jsou pluronic; PEG; estery sorbitanu; polysorbáty, jako je polysorbát 20 nebo polysorbát 80; triton; tromethamin; lecitin; cholesterol nebo tyloxapal), činidla zvyšující stabilitu (jako je sacharosa nebo sorbitol), činidla zvyšující tonicitu (jako jsou halogenidy alkalických kovů výhodně pak chlorid sodný nebo chlorid draselný - nebo mannitol, sorbitol), transportní vehikula, ředidla, excipienty a/nebo farmaceutické pomocné látky. Viz publikace Remington's Pharmaceutical Science (18. vydání, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company 1990).

Koncentrace antagonisty podle tohoto vynálezu v takovýchto farmaceutických prostředcích se může měnit v širokém rozmezí, např. od méně než 0,5 %, obvykle od alespoň přibližně 1 % do 15 nebo 20 % hmotn., a bude primárně zvolena na základě objemu roztoku, viskozity atd., a to v závislosti na konkrétně zvoleném způsobu podávání. Pokud je to žádoucí, lze do jedné farmaceutické kompozice zahrnout současně více než jeden typ antagonisty, např. antagonisty s odlišnou K_d pro vazbu na receptor IL-4.

Uvedené farmaceutické kompozice mohou být pacientovi podávány samostatně nebo v kombinaci s dalšími činidly, léčivy nebo hormony. Kromě aktivních látek mohou tyto farmaceutické kompozice obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče, zahrnující excipienty a pomocné látky, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin do přípravků, které mohou být farmaceuticky využity.

·*··

* · · ** · • · · · ···· ··

Přijatelné formulační materiály jsou výhodně v používaných dávkách a koncentracích netoxické pro příjemce.

Uvedené farmaceutické kompozice mohou v případě potřeby zahrnovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky. Přijatelné pomocné látky jsou výhodně v používaných dávkách a koncentracích netoxické pro příjemce. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou obsahovat pomocné látky pro modifikaci, udržení nebo uchování např. pH, osmolarity, viskozity, čirosti, zabarvení, isotonicity, vůně, sterility, stability, rychlosti rozpouštění nebo uvolňování, adsorbce nebo penetrace uvedené kompozice. Skupina vhodných materiálů pro formulaci uvedených farmaceutických kompozic zahrnuje, mimo jiné, aminokyseliny (jako je glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin), antimikrobiální činidla, antioxidanty (jako je kyselina askorbová, siřičitan sodný nebo hydrogensiřičitan sodný), pufry (jako jsou boritan, hydrogenuhličitan, Tris-HCl, citráty, fosfáty nebo další organické kyseliny ), objemová činidla (jako je mannitol nebo glycin), chelatační činidla (jako je kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA)), komplexační činidla (jako je kofein, polyvinylpyrrolidon, β-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-p-cyklodextrin), plniva, monosacharidy, disacharidy a další sacharidy (jako je glukosa, manosa nebo dextriny), proteiny (jako je sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny), barvicí činidla, vonné látky nebo ředidla, emulgační činidla, hydrofilní polymery (jako je polyvinylpyrrolidon) , polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností, soli tvořící protiionty (jako je sodný ion), konzervační činidla (jako je benzalkoniumchlorid, kyselina benzoová, kyselina salicylová, thimerosal, fenethylalkohol, methylparaben, ·· ···· ·· ···· • · · · · · · · · · · · · • · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··· propylparaben, chlorhexidin, kyselina sorbová nebo peroxid vodíku), rozpouštědla (jako je glycerin, propylenglykol nebo polyethylenglykol), cukerné alkoholy (jako je mannitol nebo sorbitol), suspendační činidla, povrchově aktivní látky nebo smáčecí činidla (jako jsou pluronic; PEG; estery sorbitanu; polysorbáty, jako je polysorbát 20 nebo polysorbát 80; triton; tromethamin; lecitin; cholesterol nebo tyloxapal), činidla zvyšující stabilitu (jako je sacharosa nebo sorbitol), činidla zvyšující tonicitu (jako jsou halogenidy alkalických kovů výhodně pak chlorid sodný nebo chlorid draselný - nebo mannitol, sorbitol), transportní vehikula, ředidla, excipienty a/nebo farmaceutické pomocné látky. Viz publikace Remington's Pharmaceutical Science (18. vydání, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company 1990).

Optimální farmaceutické kompozice mohou být stanoveny odborníky, a to například v závislosti na zamýšleném způsobu podávání, formátu podávání a požadované dávce. Viz. např. Remington's Pharmaceutical Science, výše. Takovéto farmaceutické kompozice mohou ovlivnit fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost vymizení molekuly nukleové kyseliny nebo modulátoru kostní hustoty tohoto vynálezu in vivo.

Primární vehikulum či nosič ve farmaceutické kompozici může být buď vodné nebo nevodné povahy. Například vhodným vehikulem nebo nosičem pro injekce může být voda, fyziologický roztok nebo syntetický mozkomíšní mok, jež mohou být případně doplněny dalšími látkami, které se běžně používají ve farmaceutických kompozicích určených k parenterálnímu podávání. Dalšími příklady vhodných vehikul jsou neutrální ·* ·· ·· ···· ·· ···· ···· · · · · · · ··· Λ » · · · · · · ····*· · · · · · pufrovaný fyziologický roztok a sůl nebo fyziologický roztok smíchaný se sérovým albuminem. Další příklady farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu zahrnují Tris pufr s pH přibližně 7,0 - 8.5, nebo acetátový pufr s pH přibližně 4,0 5,5, který může dále obsahovat sorbitol nebo vhodný substitut. V jednom provedení vynálezu mohou být farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu připraveny pro skladování, a to tak, že se vybraná kompozice, která má požadovaný stupeň čistoty, smíchá s případnými formulačními činidly (Remington's Pharmaceutical Science, výše) ve formě lyofilizovaného koláče nebo vodného roztoku. Dále může být kompozice podle tohoto vynálezu připravena ve formě lyofilizátu za použití vhodných excipientů, jako je sacharosa.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být určeny k parenterálnímu podávání. Alternativně mohou být uvedené farmaceutické kompozice určeny k inhalaci nebo k aplikaci do gastrointestinálního traktu, např. k perorálnímu podávání. Příprava takových farmaceuticky přijatelných kompozic je ve schopnostech průměrně zkušeného odborníka v dané oblasti techniky.

Složky farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu jsou přítomné v takových koncentracích, které jsou přijatelné pro dané místo aplikace. Tak se například používají pufry, které slouží k udržení pH dané kompozice na fyziologické hodnotě nebo na mírně nižší hodnotě pH, obvykle pak v rozmezí hodnot pH od přibližně 5 do přibližně 8.

Pokud se uvažuje o parenterálním podávání, mohou mít terapeutické kompozice pro použití podle tohoto vynálezu formu • · 9 9 9 9 • · · ·

9« » 9 »9 9 4

I 9 9 ► 9 999 apyrogenního, parenterálně přijatelného vodného roztoku, jenž zahrnuje požadovanou molekulu podle tohoto vynálezu ve farmaceuticky přijatelném vehikulu. Zvlášť vhodným vehikulem pro parenterální injekci je sterilní destilovaná voda, ve které je molekula formulována jakožto sterilní, izotonický roztok, jenž je vhodně konzervován. Jiný typ farmaceutického přípravku může zahrnovat formulaci požadované molekuly spolu s činidlem, jako jsou injekční mikrokuličky, biodegradovatelné částice, polymerní sloučeniny (jako je kyselina polymléčná nebo kyselina polyglykolová), zrnka nebo liposomy, které zajišťují řízené nebo trvalé uvolňování daného produktu, který může být následně aplikován pomocí depotní injekce. Je rovněž možné použít kyselinu hyaluronovou, která má ten účinek, že podporuje prodloužené působení aktivní látky v krevním oběhu. Dalším vhodným prostředkem pro vpravení požadované molekuly do organismu jsou implantovatelné aplikačních lékové formy.

V jednom provedení tohoto vynálezu mohou být farmaceutické kompozice upraveny k inhalační aplikaci. Například, molekula nukleové kyseliny nebo modulátor kostní hustoty podle tohoto vynálezu může být formulován(a) ve formě suchého prášku k inhalační aplikaci. Mohou být rovněž vytvořeny inhalační roztoky s propelanty, které slouží k aerosolové aplikaci.

V dalším provedení tohoto vynálezu mohou být roztoky nebulizovány. Plicní aplikace je více popsána ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 94/20069, která popisuje plicní aplikaci chemicky upravených proteinů.

V dalších provedeních tohoto vynálezu mohou být některé kompozice aplikovány perorálně. V jednom z těchto provedení vynálezu mohou být molekuly nukleových kyselin nebo modulátory • · · · · · • · 9 ·

99·· 99 9 999 • 99 99 · ·····

999 9 ···· 9

99 ···· ·· · «999 99 99 99 99 999 kostní hustoty podle předmětného vynálezu, jež se podávají tímto způsobem, formulovány s nebo bez nosičů, které se obvykle užívají při výrobě pevných dávkových forem, jako jsou tablety a kapsle. Například kapsle může být připravena tak, že uvolňuje aktivní část kompozice v místě gastrointestínálního traktu, kde je maximalizovaná její biologická dostupnost a kde je minimalizována její presystemická degradace. Ve farmaceutických kompozicích podle tohoto vynálezu mohou být obsažena další činidla, která usnadňují absorpci molekuly nebo modulátoru podle tohoto vynálezu. Dále se v uvedených prostředcích mohou používat ředidla, ochucovací činidla, vosky s nízkou teplotou tání, rostlinné oleje, lubrikační činidla, suspendační činidla, činidla pro dezintegraci tablety a pojivá.

Další farmaceutická kompozice může obsahovat účinné množství molekul nukleové kyseliny nebo modulátorů kostní hustoty podle předmětného vynálezu ve směsi s netoxickými excipienty, jež jsou vhodné pro výrobu tablet. Rozpuštěním uvedených tablet ve sterilní vodě nebo v jiném vhodném vehikulu je možné připravit roztoky ve formě jednotkové dávky.

Skupina vhodných excipientů zahrnuje, mimo jiné, inertní ředidla, jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný nebo hydrogenuhličitan sodný, laktosa nebo fosforečnan vápenatý; a pojivá, jako je škrob, želatina nebo arabská guma; a lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý, kyselina stearová nebo mastek.

Složení dalších farmaceutických kompozic je odborníkovi v dané oblasti techniky zřejmé, a to včetně takových formulací, které obsahují molekuly nukleových kyselin nebo modulátorů kostní hustoty podle tohoto vynálezu v prostředcích s trvalým ·· · · ·· ··· · « ·· · · · • · · * · · ···· ·· ·» · · nebo řízeným uvolňováním. Způsoby formulování různých dalších prostředků s trvalým nebo řízeným uvolňováním, jako jsou liposomové nosiče, bioerodibilní mikročástice nebo porézní zrnka a depotní injekce, jsou rovněž odborníkům v oboru dobře známé. Viz. např. PCT/US93/00829, která popisuje řízené uvolňování účinných látek z porézních polymerních mikročástic pro transport farmaceutických kompozic.

Další příklady přípravků s trvalým uvolňováním zahrnují semipermeabilní polymerní matrice ve formě tvarovaných částic, jako jsou například filmy nebo mikrokapsle. Matrice s trvalým uvolňováním mohou zahrnovat polyestery, hydrogely, polylaktidy (viz patent Spojených států amerických číslo US 3,773,919 a evropský patent číslo EP 058481), kopolymery kyseliny L-glutamové a γ-ethyl-L-glutamát (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-56), póly(2-hydroxyethylmethakrylát) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 a Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), ethylenvinylacetát (Langer et al., výše) nebo kyselinu poly-D(-)-3-hydroxymáselnou (evropský patent číslo EP 133988) . Kompozice s trvalým uvolňováním mohou zahrnovat rovněž liposomy, které mohou být připraveny kterýmkoli z několika způsobů, jež jsou v oboru dobře známé.

Viz např. Eppstein et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688-92; a evropské patenty číslo EP 036676, EP 088046 a EP 143949.

Farmaceutické sloučeniny, které mají být použity k in vivo aplikaci musí obecně být sterilní. Toho může být dosaženo filtrací přes sterilní filtrační membrány. Pokud se daná kompozice lyofilizuje, je možno sterilizaci touto metodou provést před nebo po lyofilizaci a rekonstituci. Kompozice • · · · · · • · · · · · * · • · · · k parenterální aplikaci mohou být uchovávány v lyofilizované formě nebo v roztoku. Kromě toho se parenterální kompozice obecně umísťují do zásobníků se sterilní vstupem, jako jsou například vaky na intravenózní roztoky nebo lékovky s uzávěrem, který lze propíchnout podkožní injekční jehlou.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být podávány mnoha cestami popsanými v tomto textu, jejichž skupina zahrnuje, mimo jiné, perorální podávání, intravenózní podávání, intrámuskulární podávání, intraarteriální podávání, intramedulární podávání, intrathekální podávání, intraventrikulární podávání, transdermální podávání, subkutánní podávání, intraperitoneální podávání, intranasální podávání, parenterální podávání, topické podávání, sublingvální podávání a rektální podávání.

Po připravení farmaceutických kompozic mohou být tyto kompozice umístěny do vhodného zásobníku a označeny pro léčbu indikovaného stavu. Takovéto označení obsahuje množství, v jakém se kompozice podává, frekvenci podávání kompozice a způsob jejího podávání.

(d) Způsoby léčby

Předmětný vynález popisuje způsoby zlepšení symptomů poruchy pomocí vazby na α-řetězec receptoru IL-4 a inhibici aktivity zprostředkované IL-4 a IL-13. Mezi takové poruchy patří, mimo jiné, hypersenzitivita dýchacích cest a záněty dýchacích cest, včetně reprodukce a aktivace mastocytů, eozinofilů a lymfocytů související s astmatem a dalšími imunologickými nebo alergickými poruchami.

·· » « ·· ·· ···· ·· ···· • ♦ * • · · · ·

9 ·

9 ·

999

V jednom provedení vynálezu se pacientovi s poruchou, která je charakteristická zvýšenou hladinou IL-4 a IL-13, jako jsou shora popsané poruchy, podává terapeuticky účinná dávka modifikovaného antagonisty receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu a/nebo farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu.

(e) Stanovení účinné terapeutické dávky

Stanovení účinné terapeutické dávky je ve schopnostech odborníka v daném oboru. Terapeuticky účinná dávka odpovídá množství antagonisty, které je třeba použít k účinné léčbě astmatu ve srovnání s účinností, která je zřejmá při absenci terapeuticky účinné dávky.

Účinná terapeutická dávka se nejprve stanoví na zvířecích modelech, obvykle na potkanech, myších, králících, psech, prasatech a primátech. Zvířecí model může být rovněž využit ke stanovení vhodného koncentračního rozmezí a způsobu aplikace. Takové informace se následně využívají při stanovení dávek a způsobu aplikace u lidí.

Terapeutickou účinnost a toxicitu, jako je např. ED50 (což je velikost dávky, která je terapeuticky účinná u 50 % populace) a LD50 (což je velikost dávky, která je letální pro 50 % populace) lidského antagonisty je možné stanovit standardními farmaceutickým postupy na buněčných kulturách nebo pokusných zvířatech. Poměr dávek vykazujících toxický a terapeutický účinek se označuje jako terapeutický index, který může být vyjádřen poměrem LD_5O/ED₅o.

« ·

φφφ

Výhodné jsou takové farmaceutické kompozice, které vykazuji vysoké terapeutické indexy. Data získaná ze studií na zvířatech se využívají při stanovení rozsahu velikosti dávky pro použití u lidí. Dávka, která je obsažená v takovýchto kompozicích, se výhodně pohybuje v takovém rozmezí, aby bylo dosaženo takové koncentrace v krevním oběhu, jež zahrnuje ED₅₀ s nízkým nebo žádným stupněm toxicity. Velikost dávky se mění v závislosti na použité dávkovači formě, citlivosti pacienta a způsobu aplikace dané kompozice.

Přesnou dávku vždy stanovení lékař ve světle faktorů, souvisejících s pacientem, kterému bude léčba aplikována. Dávkování a způsob aplikace se upravují tak, aby byly zajištěny dostatečné hladiny antagonisty nebo aby byl udržen požadovaný účinek. Při stanovení přesné velikosti dávky je třeba vzít v úvahu, mimo jiné, tyto faktory: závažnost onemocnění, celkový zdravotní stav nemocného, věk, hmotnost a pohlaví pacienta, dieta, doba a frekvence podávání, lékové kombinace, citlivost reakce a toleranci/odezvu na terapii. Dlouhodobě působící farmaceutické kompozice mohou být podávány každé 3 až 4 dny, každý týden, nebo jednou za dva týdny, a to podle délky poločasu a rychlosti vylučování dané formulace.

Polynukleotidy kódující modifikované antagonisty receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu mohou být konstruovány a vpravovány do buňky buď ex vivo nebo in vivo,a to pomocí všeobecně známých technik, jejichž skupina zahrnuje, mimo jiné transferin-polykationtem zprostředkovaný přenos DNA, transfekci obnaženou nebo enkapsulovanou nukleovou kyselinou, liposomy zprostředkovanou buněčnou fúzi, nitrobuněčný transport latexových kuliček pokrytých DNA, fúzi protoplastu, ·· 9999 «

9 9 9

9999

9 9«

9999 99 9 9

999 99 9 9

99* 9 9 9 9 9 9 • 99 9999 *9 9

9999 99 99 *9 99 999 virovou infekci, elektroporaci, „genovou pušku a transfekci zprostředkovanou DEAE nebo fosforečnanem draselným.

In vivo účinné dávky antagonisty se pohybují v rozmezí od přibližně 5 pg do přibližně 50 pg/kg, od přibližně 50 pg do přibližně 5 mg/kg, od přibližně 100 pg do přibližně 500 pg/kg tělesné hmotnosti pacienta, a od přibližně 200 do přibližně 250 pg/kg tělesné hmotnosti pacienta. Pro podávání polynukleotidů kódujících antagonisty podle tohoto vynálezu se účinné dávky in vivo pohybují v rozmezí od přibližně 100 ng do přibližně 200 ng, od přibližně 500 ng do přibližně 50 mg, od přibližně 1 pg do přibližně 2 mg, od přibližně 5 pg do přibližně 500 pg a od přibližně 20 pg do přibližně 100 pg DNA.

Způsobem aplikace farmaceutické kompozice obsahující modifikovaného antagonistu receptoru IL-4 muteinu podle tohoto vynálezu může být jakákoli aplikační cesta, která dopraví uvedeného antagonistu do hostitele. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu jsou zvlášť vhodné pro parenterální podávání, tj. pro subkutánní podávání, intramuskulární podávání, intravenózní podávání, intratracheální podávání nebo intranasální podávání a další způsoby podávání do dýchacích cest.

Obsah všech patentů a patentových přihlášek, které jsou citovány v tomto popisu, je zahrnut v tomto textu ve formě odkazu. Výše uvedený popis obecně popisuje předmětný vynález.

Pro podrobnější porozumění podstatě tohoto vynálezu lze odkázat na následující konkrétní příklady provedení vynálezu, které slouží jen pro ilustraci a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

·« ·« 99 9999 99 ···· • 99« 99 9 99«

99 9 9 9 9 9999 *9 999 9 999 9 9

9999 « 9 ·· «9 99 999

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Rekombinantní produkce cysteinových muteinů IL-4-RA a IL-4-RE

Pro rekombinantní expresi IL-4 byl vybrán expresní systém pET Directional TOPO® (Invitrogen). Tento systém používá vysoce účinnou jednostupňovou strategii „TOPO® Cloning pro přímé klonování produktu PCR s tupým koncem a promotor T71ac pro masivní a IPTG-indukovatelnou expresi genu, jenž je předmětem zájmu, v bakteriích E.coli. Mezi další rysy tohoto systému náleží gen láci, jenž slouží k redukci bazální transkripce, a zdroj pBR322 pro replikaci a udržování plazmidu a gen rezistentní vůči ampicilinu, který slouží pro selekci.

IL-4 byl klonován do vektoru pET101/D-TOPO za účelem produkce rekombinantního proteinu IL-4. Oligonukleotidové primery jsou uvedeny v tabulce 4. Dopředný (forward) PCR primer byl navržen s 5'CACC převisem, který usnadňoval řízené klonování, za kterým následoval unikátní region restrikčního enzymu Ndel, jenž sloužil pro subklonování, a základní start kodón ATG. Reverzní PCR primer obsahoval dva stop kodóny, aby bylo zajištěno, že nedojde k začlenění C-koncových oček (tagů), a unikátní region restrikčního enzymu BamHI, jenž sloužil pro subklonování. IL-4 produkt PCR s tupým koncem byl vytvářen s použitím již dříve klonovaného lidského IL-4, jenž sloužil jako templát. Získaný produkt byl přečištěn na gelu a inkubován se solným roztokem a vektorem TOPO® po dobu 5 minut při teplotě místnosti, čímž bylo umožněno jeho řízené naklonování do vektoru pET101/D-TOPO. Uvedený rekombinantní vektor byl přetransformován do chemicky kompetitivní One Shot TOPIO

E.coli. DNA rekombinantního plazmidu byla za účelem potvrzení správnosti sekvence odeslána k provedení DNA sekvenování.

Tabulka 4 Oligonukleotidové primery pro vytváření cysteinových muteinu IL-4RE φφ φφφφ φφ φ··· φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φ φφφφ φ φφφ φ φ φ φφ φφ φφ φφφ

SEQ ID NO	Oligomery pro IL-4RE	Sekvence
17	T28C Fwd	GAAGACTCTGTGCACCGAGTTGTGCGTAACAGACATCTTTGC
18	T28C Rev	GCAAAGATGTCTGTTACGCACAACTCGGTGCACAGAGTCTTC
19	S36C Fwd	GTAACAGACATCTTTGCTGCCTGCAAGAACACAACTGAG
20	S36C Rev	CTCAGTTGTGTTCTTGCAGGCAGCAAAGATGTCTGTTAC
21	K37C Fwd	CCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCTGCAACACAACTGAGAAGG
22	K37C Rev	CCTTCTCAGTTGTGTTGCAGGAGGCAGCAAAGATGTCTGTTACGG
23	N38C Fwd	GACATCTTTGCTGCCTCCAAGTGCACAACTGAGAAGGAAACC
24	N38C Rev	GGTTTCCTTCTCAGTTGTGCACTTGGAGGCAGCAAAGATGTC
25	A104C Fwd	GAATTCCTGTCOTGTGAAGGAATGCAACCAGAGTACGTTGG
26	A104C Rev	CCAACGTACTCTGGTTGCATTCCTTCACAGGACAGGAATTC
27	N105C Fwd	CCTGTGAAGGAAGCCTGCCAGAGTACGTTGGAAAACTTC
28	N105C Rev	GAAGTTTTCCAACGTACTCTGGCAGGCTTCCTTCACAGG
29	Q106C Fwd	CCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACTGCAGTACGTTGGAAAACTTC
30	Q106C Rev	GAAGTTTTCCAACGTACTGCAGTTGGCTTCCTTCACAGGACAGG

IL-4/pETlOl/D-TOPO sloužil jako templát pro produkci IL-4 RE cysteinových muteinů pomocí soupravy QuickChange® SiteDirected Mutagenesis Kit od společnosti Strategene. Každý cysteinový mutein byl připraven s použitím dvou oligonukleotidových primerů, z nichž každý byl komplementární k opačným ···· ♦ · • ··♦ • · ·· «· • · » · · • ·· · ·· ···· ·♦ ·> 999 řetězcům uvedeného vektoru a které obsahovaly kodón TGC nebo GCA za účelem začlenění požadované cysteinové mutace. V tabulce 4 jsou uvedeny primery, které byly použity pro produkci uvedených IL-4 RE muteinu. Mutovaný plazmid obsahující střídavě rozmístěné zářezy byl vytvořen pomocí cyklicky opakujících se parametrů a za podmínek definovaných v předpisu, jenž byl poskytnut výrobcem. Získaný produkt byl na 1 hodinu vystaven působení DpnI endonukleasy při teplotě 37 °C, a to za účelem rozštěpení methylovaného, nemutovaného základního DNA templátu. Uvedená DNA ošetřená DpnI byla přenesena do superkompetitivních buněk XL-lBlue, kde byly opraveny zářezy obsažené v uvedeném mutovaném plazmidu. Mutagenní DNA plazmidu byla za účelem potvrzení správnosti sekvence analyzována pomocí standardních postupů sekvenování.

Příklad 2

Rekombinantní exprese a čištění

Buňky BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen) transformované proteinem obsahujícím plazmidy byly charakterizovány pro optimální expresi, kultivovány při teplotě 37 °C dokud nebylo dosaženo hodnoty ODeoo přibližně 0,4 a indukovány 3 hodiny při teplotě 37 °C lmM IPTG (Invitrogen). Z jednoho litru buněk byla odstřeďováním rychlostí 13 000 otáček za minutu po dobu 10 minut připravena peleta, která byla zvážena a skladována při teplotě -80 °C. Zmrzlá buněčná peleta byla resuspendována v pufru pro disrupci buněk (0,lM fosfátového pufru o pH 7,3, 0,1% Triton X100, 1 mM EDTA), jenž byl použit v množství 8 ml na gram buněk a vzniklá suspenze byla 4x1 minutu sonikována, přičemž mezi jednotlivými sonikacemi byl vždy ponechán lminu·· ···· • 9 · ·

9 9 9

9

9 • ·

tový interval. Získaný buněčný lyzát byl izolován odstředěním při 35 000 g po dobu 10 minut. Buněčné pelety byly následně 2- až 3krát promyty, a to tak, že byly resuspendovány ve 30 ml pufru pro disrupci buněk, vzniklá suspenze byla 1 minutu sonikována a následně odstředěna. Výsledné buněčné pelety, označované jako inkluzní tělíska, byly skladovány při teplotě -20 °C. Inkluzní tělíska byla resuspendována v 5 mililitrech solubilizačního pufru (0,2M Tris pH 9, 7M hydrochlorid guanidinu) na gram buněk. Ke směsi byla přidána činidla pro provedení sulfotolýzy (0,16 gramu siřičitanu sodného, 0,08 gramu tetrathionátu draselného na gram buněk) a inkluzní tělíska byla míchána 2 hodiny při teplotě místnosti. Nerozpustné složky byly odstraněny 20minutovým odstředěním při 35 000 g, čímž byly získány samotná solubilizovaná inkluzní tělíska. Za účelem izolace proteinu byla uvedená inkluzní tělíska nanesena na kolonu Superdex200 pro chromatografické dělení na základě rozdílu velikosti molekul (Akta). Uvedená kolona byla ekvilibrována směsí 6M hydrochlorid guanidinu/PBS pH 7, přičemž byl použit objem této směsi odpovídající 2 objemům kolony (CV) a ekvilibrace byla prováděna při průtoku uvedené směsi 1 ml/min. Uvedený protein byl eluován v 1,5 CV. Byly odebírány jednotlivé frakce (každá o objemu 1,5 ml), které byly podrobeny screeningu pomocí gelové elektroforézy s použitím 12% nebo 4-20% Bis-Tris-SDS. Frakce obsahující protein byly spojeny a za účelem redukce molekul proteinu k nim byl přidán DTT v takovém množství, aby jeho výsledná koncentrace činila 7,5 mM. Po 2hodinové inkubaci při teplotě místnosti byla směs pětinásobně zředěna vodou a podrobena dialýze do 4,5 litru 3mM NaH2PO4, 7mM NaH2PC>4, 2mM KC1, 120mM NaCl. Dialýza probíhala po dobu 3 až 4 dní, přičemž pufr byl alespoň 3krát vyměněn za čerstvý. Dialyzovaný materiál byl následně přefiltrován přes ·· ··*· ·· ·· * * · · * ·· • · · · ·«· · ·· ·· ···· • · ♦ · • · · ··· • » « · « • · · · ·· ·· ···

0,2pm filtr a pH filtrátu bylo upraveno kyselinou octovou na hodnotu 5. Uvedená kolona byla ekvilibrována 10 CV pufru 1 (25mM octan amonný pH 5) s následnou gradientovou elucí kdy po nástřiku směsi na kolonu byla tato během 20 minut postupně vymývána až 100 % pufru B (25mM octan amonný pH 5/1M NaCl). Byly odebírány jednotlivé frakce (každá o objemu 0,5 ml), které byly podrobeny screeningu pomocí gelové elektroforézy s použitím 12% nebo 4-20% Bis-Tris-SDS. Frakce obsahující produkt byly spojeny a přidány do dvojnásobného objemu pufru A (0,1% TFA/voda). Protein byl následně chromatografován na koloně C4 pro HPLC s reverzními fázemi (systém Beckman Gold), při které se používala nástřiková smyčka o objemu 5 ml a průtok 1 ml/min s následujícím programem: 10% pufr A po dobu trvání nástřiku, během 10 minut postupné zvýšení koncentrace pufru B (0,1% TFA/ACN) až na 40 %, během 30 minut postupné zvýšení koncentrace pufru B až na 50 % a během 5 minut postupné zvýšení koncentrace pufru B až na 100 %. Byly odebírány jednotlivé frakce (každá o objemu 0,5 ml), které byly podrobeny screeningu pomocí gelové elektroforézy s použitím 12% nebo 4-20% Bis-Tris-SDS. Frakce obsahující protein byly odpařeny a získaný produkt byl resuspendován za účelem provedení analýz a testů v 0,lM MES pH 6.

Příklad 3

Místně specifická PEGylace cysteinu a čištění

Byl vytvořen protokol pro PEGylaci cystein obsahujících IL-4 RA muteinů přes stabilní thioetherovou vazbu mezi sulfhydrylovou skupinou proteinu a maleinimidovou skupinou lineárního 22kD methoxypolyethylenglykolmaleinimidového ·· ·«·« ·· ···· • « • ···

9

9999 9 ♦ · • ·

9 9 9 9

9 9 9

99 999 derivátu (Nektar Therapeutics). Dvojnásobný molární přebytek mPEG-MAL 22kD reagentu byl přidán k 60 μΜ proteinu rozpuštěným v reakčním pufru, O,1M MES, pH 6. Po 0,5 hodiny při teplotě místnosti byla reakce ukončena přidáním dvojnásobného molárního přebytku cysteinu vzhledem k mPEG-MAL 22 kD (obrázek 1). PEGylovaný protein byl oddělen od nezreagovaného mPEG-MAL 22 kD (který byl rozložen cysteinem) a od nezreagovaného IL-4 RA cysteinového muteinu pomocí katexové chromatografie a chromatografického dělení na základě velikostí molekul. Surové reakční směsi byly naneseny na katexové kolony Vivapure Mini S (Vivascience), které byly ekvilibrovány 0,4 ml O,1M MES, pH 6. Kolony byly dvakrát promyty 0,4 ml O,1M MES, pH 6, přičemž po každém promytí následovalo odstředění při 2000 g. Vzorky byly vymyty odstředěním z kolony s použitím 0,4 ml 0,6 M NaCl/0,lM MES, pH 6. Eluenty o objemu 0,4 ml byly naneseny na HPLC kolonu pro dělení na základě velikostí molekul TSK-GEL G2000SWXL (Tosoh Biosep), a to pomocí HPLC systému Beckman Gold. Vzorky byly děleny pomocí fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS Dulbecco), který sloužil jako mobilní fáze, přičemž kolona byla vymývána 30 minut při průtoku 1 ml/min. Byly odebírány jednotlivé frakce (každá o objemu 0,5 ml), které byly testovány pomocí gelové elektroforézy s použitím 12% nebo 4-20% Bis-Tris-SDS na přítomnost PEGylovaného proteinu. Frakce obsahující požadovaný produkt byly spojeny a zahuštěny pomocí zařízení Ultrafree Biomax-5 (Millipore) na přibližně 60μΜ koncentraci (neboli přibližně 1 mg/ml), přičemž zahušťování bylo provedeno podle postupu předepsaného výrobcem uvedeného zařízení. Zahuštěné vzorky byly dále použity pro analýzu a in vitro testy. Výsledné koncentrace PEGylovaných proteinů byly stanoveny analýzou aminokyselin. Konečné výtěžky produktů jsou uvedeny v tabulce 5 ·· ···· ·· ·♦ ► * » • ·· ·· ···9

9 9

9 999

9 9

9 9

999

Tabulka 5

Výtěžky čištění PEGylovaných IL-4 RA cysteinových muteinů

Mutein	PEGylovaný (mg, výchozí množství)	PEGylovaný (mg, konečné množství)	Výtěžek čištění (%)
IL-4 RA	nestanoveno	nestanoveno	nestanoveno
T28C	0,267	0, 064	24,0
S36C	0,392	0, 057	14,5
K37C	0,264	0,011	4,2
N38C	0,387	0,083	21,4
A104C	0,213	0,010	4,7
N105C	0,289	0, 044	15,2
Q106C	0,125	0,023	18,4
Průměr	0,176	0,042	14,6

Příklad 4

Test vaznosti k receptoru IL-4 BiaCore

Receptor IL-4 byl imobilizován prostřednictvím aminové vazby na senzorovém chipu BIAcore CM5 v kvalitě vyhovující pro výzkumné účely. Povrch senzoru byl aktivován pulzem EDC/NHS. Receptor IL-4 byl rozpuštěn v lOmM acetátovém pufru (pH 5,0) a nastříknut do průtokové kyvety 2 a následně byl proveden puls l,0M hydrochloridem ethanolaminu, který sloužil pro deaktivaci povrchu. Hladina imobilizace uvedeného receptoru činila přibližně 300 RU. Byla rovněž aktivována průtoková kyveta 1, která však neobsahovala ligand a sloužila tedy pro provedení

9999 •9 9999

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 srovnávacího slepého pokusu. Pro provedení analýzy kinetiky byl použit Biacore Wizard. Potenciální antagonisté IL-4 RE byly rozředěni v HBS-EP (provozní pufr) a nastřikováni 3 minuty rychlostí 30 μΐ/minutu, přičemž doba disociace činila 15 minut. Před dalším nastřikováním v dané sérii koncentrací byla za účelem dosažení základních hodnot provedena regenerace čipu, a to dvěma 30sekundovými nástřiky lOmM glycinu pH 2,5 (průtok 100 μΐ/min). Pro každého kandidáta byla na základě kinetiky přímého vázání vypočtena hodnota disociační konstanty (Kd) (tabulka 6). Jak je patrné z uvedených výsledků, konstrukty IL4-RE-A104C, IL4-RE-N105C a IL4-RE-Q106C vykázaly disociační konstantu nižší než 0,6 nM.

Příklad 5

Test proliferace buněk TF-1

Proliferativní odezva buněk TF-1 na IL-4 (0,5 ng/ml,

0,033 nM) nebo IL-13 (5 ng/ml, 0,419 nM) byla použita pro otestování funkčního antagonistického účinku IL-4RE molekul. Při tomto testu byly buňky TF-1 kultivovány 2 až 4 dny v 96jímkových platech (1 x 10⁴/jímku, objem 100 μΐ) v RPMI s přídavkem 10 % séra, a to v přítomnosti nebo v nepřítomnosti molekul IL-4 nebo IL-13 a IL-4RE. Jakožto pozitivní kontrola byla použita úprava GM-CSF. Dvacet čtyři hodin před posledním odečtem bylo do každé jímky přidáno 10 μΐ (10 % obj.) barviva AlamarBlue. Byla stanovena fluorescence při vlnových délkách 530/590 nm, a to pomocí přístroje WALLAC Victor 2. Koncentrace IC50 byla vypočtena na základě titrace dávky kandidátních molekul IL-4RE. Souhrn výsledků uvedeného testu inhibice IL-4 a IL-13, provedeného s buňkami TF-1, je uveden v tabulce 6. Z těchto výsledků je patrné, že IL4-RE-K37C, IL4-RE-N38C a

IL4-RE-A104C vykazovaly srovnatelné hodnoty IC₅₀ jako IL-4-RA v přítomnosti IL-4 nebo IL-13.

···· ···· • ·· · · · · · ··· ·«··«· · · · · · • · · · · · · · · · ···· «· ·· ·· ·♦ ···

Tabulka 6 Test vaznosti PEG-IL4RE BIAcore a test bioaktivity PEGylovaných muteinů oproti IL4RA při test proliferace buněk TF-1

Mutein	Afinita BIAcore (nM)	TF-1/IL-4 IC50, nM	TF-1/IL-13 IC50, nM
BAY 16-9996 IL- 4RA	0,11	0,56 + 0,86 (n=17)	1,17 + 1,77 (n=6)
IL4-RE-T28C	0,89	2,35 + 0,75 (n=2)	2,87 + 0 (n=l)
IL4-RE-S36C	1,15	1,20 + 0,02 (n=2)	1,21 + 0 (n=l)
IL4-RE-K37C	0,74	0,82 + 0,01 (n=2)	1,22 + 0,58 (n=2)
IL4-RE-N38C	0,77	0,70 + 0,18 (n=2)	1,24 + 0,58 (n=2)
IL4-RE-A104C	0,56	0,55 + 0,10 (n=2)	1,34 + 1,21 (n=2)
IL4-RE-N105C	0,59	2,26 + 0,20 (n=2)	2,11 + 0 (n=l)
IL4-RE-Q106C	0,52	2,44 + 0,68 (n=2)	1,95 + 0 (n=l)

9999 • ·

9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 · 999 ·♦··«· · · · · * • · « 9 9 · · · · *

9999 99 99 99 99 999

Příklad 6

Test proliferace primárních buněk

Po předcházejícím ošetření IL-4RE molekulou byla rovněž testována proliferativní odezva lidských primárních buněk (T- a B-buněk) na IL-4. Periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) byly izolovány z periferní krve a některé z nich byly 4 dny vystaveny působení PHA za účelem indukce tvorby T-buněčných blastů. PBMC byly rovněž vystaveny působení anti-CD40 za účelem aktivace účinku B-buněk a okamžitě poté použity. Buňky byly vysety do 96jímkových plat (v množství 10⁵ buněk na každou jímku). Přípravky obsahující PHA T-buněčné blasty a B-buňky byly 3 dny stimulovány IL-4 (10 ng/ml, 0,667 nM) v přítomnosti různých koncentrací molekul IL-4RE. Jakožto indikátor proliferace bylo použito začleňování tritiovaného thymidinu během posledních 20 hodin inkubace. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulce 7. Z těchto výsledků je patrné, že všechny PEGylované konstrukty vykázaly pro oba testy primárních buněk hodnoty IC50 méně než 5krát vyšší v porovnání s IC₅₀ IL-4RA.

···· ···« ···· · · · · · · • ·· · « · · · ··· ······ ·«·· · ··· «··· *· · ·»·· »· ·♦ ·» ·· ···

Tabulka 7

Hodnocený biologické aktivity PEG-IL4RE v testech proliferace B-buněk a T-buněčných blastů

Mutein	B-buňky ZC50, nM	T-buněčné blasty IC50, nM
BAY 16-9996 IL-	0,86 + 0,42	3,22 + 3,26
4RA	(n=10)	(n=16)
IL4-RE-K37C	3,73 + 2,15 (n=2)	13,86 + 12,77 (n=2)
IL4-RE-N38C	3,33 + 2,68 (n=2)	9,94 + 8,99 (n=2)
IL4-RE-A104C	3,29 + 1,46 (n=2)	4,67 + 4,65 (n=2)

Příklad 7

Farmakokinetické studie na potkanech

Při této studii byli použiti dospělí samci potkanů Sprague-Dawley o hmotnosti 250 až 300 gramů. Za účelem odebírání krevních vzorků byl potkanům do krční žíly zaveden katetr. Kromě toho byl potkanům ve skupině, které byla účinná látka podávána intravenózně (IV), zaveden katetr do stehenní žíly, jenž sloužil pro podávání léčiva.

Potkanům byl podáván buď IL-4RA nebo modifikovaný antagonista receptoru IL-4 muteinu, a to v dávkách 1 mg/kg, respektive 0,5 mg/kg. Byl použit jak intravenózní (IV), tak subkutánní (SC) způsob podávání. IV dávka byla podávána injekčně přímo do dlouhodobě zavedeného katetru ve stehenní žíle.

• •99 ·

99

9 9 9 9 9 • 99 9 *

9 9 9 9 9

9 9 9 ·

9999 99 99

9999

9 9 9

9 9 999

9 9 9 9

9 9 9

99 999

SC dávka byla podávána injekčně do oblasti zadní torakální. Každá ze skupin byla tvořena třemi potkany.

Po podání jediného bolu (IV nebo SC) byly v předem stanovených časech po podání dávky odebírány krevní vzorky, a to až do uplynutí 168 hodin od okamžiku podání dávky. Krevní vzorky byly odebrány rovněž před aplikací injekce. Během jedné hodiny po odebrání vzorku krve začalo jeho odstřeďování. Byla izolována plazma, která za účelem skladování při teplotě přibližně -70 °C byla umístěna na suchý led.

Plazmatické koncentrace IL-4RA a modifikovaného muteinu byly kvantifikovány pomocí imunologického testu s vázaným enzymem. Jako potahový a detekční reagent byla použita IL-4 protilátka. Spodní limit kvantifikace v případě tohoto testu byl 0,2 ng/ml. Farmakokinetické parametry byly odvozeny nesrovnávací analýzou pomocí programu WinNonlin (Pharsight, Mountain View, CA, USA). Zvlášť zajímavé je stanovení kinetiky absorpce a eliminace léčiva, distribučních objemů, jakož i absorbovaného množství.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Přečištěný polynukleotid zahrnující

   a) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,

   SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, nebo SEQ ID NO:8; nebo

   b) nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid mající následující sekvenci aminokyselin: SEQ ID NO:10,

   SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13,

   SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, nebo SEQ ID NO:16.
2. 2. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle nároku 1.
3. 3. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 2.
4. 4. Způsob přípravy modifikovaného antagonisty receptoru

   IL-4 muteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto stupně:

   a) kultivaci hostitelských buněk podle nároku 3 za podmínek kdy je exprimován antagonista; a

   b) očištění uvedeného antagonisty od kultury hostitelských buněk.