CZ2007701A3

CZ2007701A3 - Zpusob purifikace proteinu pomocí kationtových surfaktantu

Info

Publication number: CZ2007701A3
Application number: CZ20070701A
Authority: CZ
Inventors: Fischer@Meir; Harosh@Eliyahu
Original assignee: Savient Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2008-04-16
Also published as: RU2426738C2; AU2006339865A8; AU2006339865A1; CA2611249C; NZ562293A; CA2611249A1; AU2006339865B2; TW200722435A; US20240026312A1; US20220073886A1; BRPI0612943A2; CZ305852B6; RU2007141623A; TWI418564B; ZA200708652B

Abstract

Zpusob purifikace cílového proteinu ze smesi obsahující cílový protein a kontaminující protein zahrnující kroky vystavení smesi takovému úcinnému množství kationtového surfaktantu, že je kontaminující protein prednostne precipitován, a opetovné získání cílového proteinu. Proteiny purifikované tímtozpusobem.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti purifikace proteinů surfaktantú.

Dosavadní stav techniky

Produkce biologických makromolekul, zejména proteinů, zahrnuje kroky zlepšující čistotu založené na fyzikálních fyzikálně-chemických vlastnostech.

Obtížnosti provázející takovéto procesní kroky zahrnuj í mimo jiné stanovení které umožňují oddělení rozpustných relativně nízkou výtěžnost požadované nerozpustných molekuly po porno· podmínek, cas

molekul, čistícím kroku, ztrátu biologické aktivity během proteinu k podmínkám procesního kroku, jako je pH.

procesu senzi t ivitu

Surfaktanty byly využívány při zpracovávání makromolekul.

Kationtové surfaktanty jsou odlišitelncu podtřídou

surfaktan	tů	a zahrnují amfipatické	amonné	s1cučeniny.
Amf ipat i c	ké	amonné sloučeniny zahrnuj í	kvartér	P. I. -i T.C· rilxé
sloučeni:;	V	' j F¹ < ’ A· p/vyrr/jp QM⁺ 3 P* '·'	í amonné	·_· ¹ - ·. i, xxj > i ’/
S Ό ci l L l i	O'/\	m řetězcem obecného vzorce rnh·.·’.	. ;ba vor	primárních
		lcuč'-n:r, zahrnu’í amci”-7	, , u. .	₇_. ; · - - - % _τ ; ._r

Anal . 8:145 - 197, uvedený zde jako celek coby odkaz). Kvartérní amonné surfaktanty s dlouhým řetězcem jsou známy svojí interakcí s biologickými makromolekulami. Tyto kvartérní amonné sloučeniny s dlouhým řetězcem mají na dusíku alespoň jeden substituent, který je tvořen lineárním alkylovým řetězcem s 6 až 20 uhlíkovými atomy. Nejlépe známými reprezentanty této třídy jsou benzalkoniové soli (chloridy a bromidy), hexadecylpyridinium-chlorid, dechalinium-acetát, cetyl(dimethyl)amonium-bromid (CTAB) a hexadecylpyridinium-chlorid (CPC1) a benzethonium-chlorid. Kvartérní amonné surfaktanty zahrnují soli, jako jsou cetylpyridiniové soli, např. cetylpyridinium-chlorid (CPC), stearamid(methyl)pyridiniové cetylchinoliniové soli, laurylaminopropionové,

sol i,	laurylpyridiniové	soli,
soli	methylesteru	kyseliny
kovové	soli	kyseliny

lauryl(dimethyl)betain, lauryl(dihydroxyethyl)betain a soli zahrnují stearylalkyl(dimethylbenzyl)amonium-chlorid a laurylaminopropionové, stearyl(dimethyl)betain, benzethoniové soli. Alkylpyridiniové (trimethyl)amoniové soli, dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chlorid.

Známá použití kationtových surfaktantů pro purifikaci biologických makromolekul zahrnují 1) solubilizaci agregátů včetně proteinových agregátů; 2) eluci biologických makromolekul navázaných na chromatografické koloně a

3) precipitaci polyaniontů, jako je kyselina hyaluronová (HA) , nukleové kyseliny a heparin molekul, které koprecipituj í s polyanicnty).

Kat iontové surfaktanty proteinových agregátů.

Otta

Lat inoam.

451 - 457, zde by odkaz) cdavců DOT.

zvýšilo relativní množství proteinu urikasy vzhledem k množství všech proteinů. Jinými slovy nebyla zde žádná selektivní solubilizace proteinu urikasy vzhledem ke všem proteinům a po solubilizaci pomocí kationtového surfaktantu protein urikasy netvořil vyšší procento ze všech proteinů. V tomto procesu evidentně není zvýšena čistota urikasy vzhledem k obsahu všech proteinů jako výsledek solubilizace kvartérním amonným surfaktantem.

w oťijr^i i Tzumscos ( (33*67) locflci 33 * 1 ID 32 uvedený zde jako celek coby odkaz) zkoumal sadu kationtových, aniontových a neutrálních detergentú z hlediska jejich účinnosti na extrakci urátoxidasy (urikasy) z prášku z hovězích ledvin. Zatímco u neutrálních a aniontových detergentú bylo zjištěno, že zvyšují rozpustnou aktivitu urátoxidasy, u kationtových detergentú, např. kvartérních amonných solí, bylo zjištěno snižování celkové enzymatické aktivity se zvyšující se koncentrací. Autoři shrnuli, že kationtové detergenty nebyly vhodné pro purifikaci urátoxidasy z hovězích ledvin.

Solubilizace rekombinantních proteinů, prasečího růstového hormonu, methionylovaného prasečího růstového hormonu, proteinu viru infekční burzitidy, fúzního proteinu s B-galaktosidasou z inkluzních tělísek nebo buněk E. coli pomocí kationtových surfaktantu je popsáno v U.S. Patentu č. 4 797 474, U.S. Patentu č. 4 992 531, U.S. Patentu č. 4 966 963 a U.S. Patentu č.

008 377, všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz. Solubilizace za alkalických podmínek je dokončena pomocí kvartérních amonných sloučenin včetně cetyl(trimethyl)amonium-chloridu, směsi n-alkyldimethylbenzyl)amonium-chloridu, CPC,

N, ΔΓ-dimethyl-iV- [2 - [2- [4- (1,1,3,3 - tetramethylbutyl) fenoxy] ethoxy] ethyl ] benzenmethanarr.cnium- chloridu , tetradecyl (trimethyl)amon ium-bromidu, dodecylítrimethyl}amomum-bromidu, cety 1 (trimethyl · monium-bx omi-1.; . Tyto publikace u”á'.lěj i pozorování naznačuje, že většina nebo všechny proteiny jsou solubilizovány bez ohledu na selektivitu solubilizace cílového proteinu. Čistota vyizolovaných proteinů není uvedena. U.S. Patent č. 5 929 231, uvedený zde jako celek coby odkaz, popisuje desintegraci granulí a agregátů obsahujících škrob pomocí cetylpyridinium-chloridu (CPC). Dřívější použití se týkají použití kat iontových surfaktantů pro obecnou nespecifickou solubilizaci konkrétních, biologických makromolekul. Tyto metody dřívějšího použití nepopisují zvyšování čistoty požadovaného cílového proteinu vzhledem k celkovému proteinu pomocí kationtového surfaktantu.

Kationtové surfaktanty byly také používány pro eluci biologických makromolekul adsorbovaných, na kationtové výměnné pryskyřice nebo adjuvans obsahujících hliník (Antonopoulos, et al. (1961) Biochim. Biophys. Acta 54:213 226; Embery (1976) J. Biol. Buccale 4:229-236 a Rinella, et al. (1998) J. Colloid Interface Sci. 197:48 - 56, všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz) . U.S. Patent č. 4 169 764, uvedený zde jako celek coby odkaz, popisuje eluci urokinasy z karboxymethylcelulosových kolon pomocí širokého spektra roztoků kationtových surfaktantů. Autoři zjistili výhodné použití tetra substituovaných amonných solí, u kterých je jedna alkylová skupina vyšší alkylovou skupinou s až 20 uhlíkovými atomy a ostatní jsou nižší alkylové skupiny s až 6 uhlíkovými atomy. Použití takovýchto kationtových surfaktantů umožňuje uvolnění biologických makromolekul z jejich vazby na pevnou matrix.

Naopak impregnace filtrů, jako jsou ty tvořené nylonem, kationtovými surfaktanty umožňuje imobilizaci pclysacharidů nebo nukleových kyselin (Xaccari a Volpi í2002} Electrcphcresis 2 3:3270 - 3 277; Be nitz, e t a 1 . 2 9 0 > U.S. Paten. č . 4 9 í5 08c; Macfarlane (1991: U.S. Patent č. 5 010 182, všechny j sou zde

Je dobře známo, že amfipatické amonné sloučeniny, které zahrnují kvartérní amonné sloučeniny obecného vzorce QN⁺ a primární amonné sloučeniny s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH₃ ⁺, mohou za definovaných podmínek precipitovat polyanionty (shrnuto v Scott (1955) Biochim. Biophys. Acta 18:428 - 429; Scott (1960) Methods Biochem. Anal. 8:145 - 197; Laurent, et al . , (1960) Biochim. Biophys. Acta 42:476 - 485; Scott (1961) Biochem. J. 81:418 - 424; Pearce a Mathieson (1967) Can. J. Biochemistry 45:1565 - 1576; Lee (1973) Fukushima J. Med. Sci. 19:33 - 39; Balazs, (1979) U.S. Patent Č. 4 141 973; Takemoto, et al. , (1982) U.S. Patent č. 4 312 979; Rosenberg (1981) U.S. Patent č. 4 301 153; Takemoto, et al . , (1984) U.S.

Patent č. 4 425 431; d'Hinterland, et al., (1984) U.S. Patent Č.

460 575; Kozma, et al . (2000) Mol. Cell. Biochem.

203:103 - 112, všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz). Tato precipitace je závislá na precipitačních látkách s vysokou hustotou polyaniontového náboje a vysokou molekulovou hmotností (Saito (1955) Kolloid-Z 143:66, uvedený zde jako celek coby odkaz). Přítomnost solí může s precipitací polyaniontů indukovanou kat iontovými surfaktanty interferovat nebo jí zabránit.

Navíc mohou být polyanionty diferenciálně precipitovány z roztoků obsahuj ících proteinové kontaminace za podmínek alkalického pH. V těchto případech budou proteiny, které nejsou chemicky navázány na polyanionty, zůstávat v roztoku, zatímco polyanionty a další molekuly navázané na polyanionty se budou srážet. Například precipitace polyaniontů, jako jsou polysacharidy a nukleové kyseliny, je doprovázena koprecipitací molekul, jako jsou proteoglykany a proteiny interagující s polyanionty (Blumberg a Ogston (1953) Biochem. J. 68:183 188; Matsumura, et al . , (1963) Biochim. Biophys. Acta 69: Ξ74 - 576; Serafíni-Fracassini, et al . Biochem. J. 105:569 - 575;

(1974) J. Biol. Chem. 249:4232 - 4241, 4242 - 4249

4250 - 4256; Heinegard a Hascall (1974) Arch. Biochem. Biophys. 165:427 - 441 ; Mořeno, et al . (1988) U.S. Patent Č. 4 753 796; Lee, et al. (1992) J. Cell Biol. 116:545 - 557; Varelas, et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 321:21 - 30, všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz).

Izoelektrický bod (neboli pí) proteinu je pH, při kterém má protein stejný počet kladných a záporných nábojů. Za podmínek, kdy má roztok hodnoty pH blízko (speciálně nižší) izoelektrického bodu proteinu, mohou proteiny vytvářet stabilní soli se podmínek, silnými kyselými polyanionty, jako je heparin. Za které podporují precipitaci takovýchto polyaniontů, se proteiny v komplexu s polyanionty srážej í také (LB

Jaques (1943)

Biochem.

J. 37:189 - 195; AS Jones (1953)

Biochim.

Biophys. Acta : 607

JE Scott (1955) Chem a Ind

168 - 169

U.S. Patent

č. 3 931

399 (Bohn, et al . , 1976) a U.S. Patent

297 344 (Schwinn, et al. , 1981), všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz).

U.S. Patent č. 4 421 650, U.S.

Patent č. 5 633

227 a Smith, et al . ((1984) J. Biol. Chem. 259:11 046 - 11 051, všechny jsou zde uvedeny jako celek coby odkaz) popisují purifikaci polyaniontů pomocí postupného působení kationtového surfaktantu a síranu amonného (který umožňuje disociaci komplexů polyamont kationtový surfaktant) a následné oddělení pomocí chromatografie založené na hydrofóbních interakcích. Evropské patentové zveřejnění EP055188, uvedené zde jako celek coby odkaz, popisuje separaci RTX toxinu z 1ipopclysacharidu pomocí kationtového surfaktantu. Není zde však uvedena hmotová bilance v množství lipopci/sacharidu, který je kvantirikcván testy aktivity aktivity endotcxinu pomocí

Byla popsána neutraliz

surfaktantu pravděpodobně důsledkem neutralizace aktivity tvorbou komplexu surfaktant-1ipopolysacharid.

Výše uvedené způsoby vyžadují intermediární polyanionty, pevnou oporu nebo agregáty obsahující proteiny se selektivní rozpustností kat iontovými surfaktanty pro umožnění purifikace rozpustných proteinů pomocí kationtového surfaktantu. Dřívější použití tak neposkytuje způsob purifikace cílového proteinu kontaktem proteinu s kationtovým surfaktantem v množství účinném pro přednostní precipitaci proteinů jiných, než je cílový protein, tj. kontaminujících proteinů, zejména pokud je toto kontaktování prováděno za nepřítomnosti intermediárních polyaniontu, pevné opory nebo agregátů proteinu. Často odborník v oboru používá směsi rozpustných proteinů a nemá jednoduché a účinné postupy pro purifikaci požadovaného proteinu. Nový, zde popsaný způsob purifikace proteinů umožňuje účinnou purifikaci cílových proteinů pomocí kationtových surfaktantu pro přednostní precipitaci proteinů jiných, než je cílový protein. Výhodně je takováto precipitace kontaminujících proteinů přímá a nezávisí na přítomnosti polyaniontu, pevné opory nebo agregátů obsahujících kontaminující proteiny a další molekuly.

Podstata vynálezu

Předmět vynálezu poskytuje způsob purifikace cílového proteinu ze směsi obsahující cílový protein a kontaminující protein zahrnující kroky expozice směsi účinnému množství kationtového surfaktantu tak, že je kontaminující protein preferenčně precipitován, a izolace cílového proteinu.

Krátký popis obrázků

OBR. 1 ukazuje úřinkv koncentrace CPC na a čiscctu

Koncentrace proteinu (A) a enzymatická aktivita (B) savčí urikasy z rozpuštěných inkluzních tělísek E. coli jsou měřeny po uvedeném působení CPC a oddělení centrifugací. Specifická aktivita (C) každého izolátu je vypočítána jako poměr těchto hodnot (aktivita/koncentrace proteinu).

OBR. 2 ukazuje chromatografickou analýzu HPLC s dělením podle velikosti molekul nečištěné savčí urikasy připravené z inkluzních tělísek a po působení 0,075% CPC.

Jsou analyzovány profily HPLC s dělením podle velikosti molekul u A. solubilizovaných inkluzních tělísek E. coli bez působení CPC a B. supernatantu po precipitaci pomocí CPC (0,075%) a filtraci. Plochy každého vrcholu a procento celkové plochy jsou shrnuty v přiložených tabulkách.

OBR. 3 ukazuje SDS-PAGE (15% gel) analýzu urikasy po působení CPC.

Vzorky obsahující urikasu jsou připraveny, jak je popsáno v Příkladu 1. Vzorky z různých kroků procesu jsou naneseny v alikvotech následovně: Sloupec 1 - rozpuštěná IB; Sloupec 2 supernatant po působení CPC; Sloupec 3 - peleta po působení CPC.

OBR. 4 ukazuje chromatografickou analýzu HPLC s dělením podle velikosti molekul nečištěné scFv protilátky po působení 0,02% CPC.

Jsou analyzovány profily HPLC s dělením podle velikosti molekul u A. referenční standardní scFv protilátky BTG-271, B. rozpuštěných inkluzních tělísek a C. supernatantu po opětovném konformačním sbalení a precipitaci pomocí CPC (0,02%) a filtraci. Plochy každého vrcholu a procento celkové plochy i sou shrnuty v přiložených tabulkách.

OBR. 5 ukazuje SDS-PAG-: ·15ί gel) analýzu scFv proti látkv po působení CPC.

Vzorky obsahující scř’7 protilátky z různých kroků ococčsu a « * » *

Sloupec 3 - znovu sbalený protein; Sloupec 4 CPC peleta; Sloupec 5 - supernatant po působení CPC.

OBR. 6 ukazuje HPLC gelovou filtrační chromatografii interferonu beta před a po působení CPC.

A. Před působením CPC

B. Po působení CPC.

Na kolonu bylo naneseno 200 μΐ roztoku 0,1 mg/ml interferonu beta.

Detailní popis vynálezu

Proteiny jsou amfolyty, které mají jak kladné, tak i záporné náboje. Na čistý náboj proteinu mají dopad pH roztoku a nabité molekuly, které interagují s tímto proteinem. Mezi proteiny může docházet k silným interakcím, pokud je čistý náboj proteinu neutrální (izoelektrický bod) . Pokud je pH roztoku nižší, než je izoelektrický bod proteinu, má protein čistý kladný náboj a mezi kationtovými molekulami, včetně dalších proteinů, může docházet k elektrostatickému odpuzování.

Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu purifikace solubi1 izovaného cílového proteinu z roztoku obsahujícího směs cílového proteinu a kontaminujících proteinů zahrnuj ící kontaktování solubi1 i zované směsi s účinným množstvím kat iontového surfaktantu a opětovné získání cílového proteinu.

Kat iontové surfaktanty jsou povrchově aktivní molekuly s pozitivním nábojem. Obecně mají tyto sloučeniny alespoň jednu nepolární alifatickou skupinu. Výhodně má cílový protein izoelektrický bod větší než 7. V konkrétním provedení je pH roztoku přibližně stejné, jako je izoelektrický bod cílového proteinu. Ve výhodném provedení je pH roztoku nižší než izoelektrický bod cílového proteinu, v konkrétním provedení, kdy

-e oH rozteku vvšší než : ~ i-k ~ r i ekv bod cílového oretei o·; ^: 10 vyšší než izoelektrický bod cílového proteinu, je pH roztoku v rozmezí do 1 jednotky pH od izcelektrického bodu cílového proteinu .

V konkrétním provedení jsou kontaminující protein nebo proteiny přednostně precipitovány, což zvyšuje proporci proteinů reprezentovaných cílovým proteinem zůstávajících v roztoku. Pokud vyjdeme například z roztoku cílového proteinu a kontaminujícího proteinu, kde cílový protein tvoří 20 % celkového proteinu v roztoku, lze purifikovat cílový protein pomocí poskytnutých způsobů, aby bylo dosaženo roztoku, kde cílový protein tvoří 30 % nebo více, 40 % nebo více, 50 % nebo více, 60 % nebo více, 70 % nebo více, 80 % nebo více, 90 % nebo více, 95 % nebo více z celkového proteinu zůstávajícího v roztoku.

Jak je zde používáno, termín „přednostně precipitovat znamená, že protein nebo skupina proteinů se sráží větší měrou než další protein nebo skupina proteinů. Například v případě směsi cílového proteinu a kontaminujících proteinů jsou kontaminující proteiny přednostně precipitovány vzhledem k cílovému proteinu, pokud dojde kontaminujících proteinů, zatímco k vysrážení 20 % je vysráženo méně nebo více než 20 % cílového proteinu. Výhodně je vysráženo vysoké procento kontaminujících proteinů, zatímco cílového proteinu je vysráženo nízké procento. Ve výhodných provedeních dojde k %

nebo více kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo méně než 30 % cílového proteinu; dojde k nebo v ..

ce kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo mene ne z cílového proteinu; dojde k vysrážení % nebo vi méně než levého proteinu; dojde k

O '.

. « · kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo cílového proteinu,· dojde k vysrážení 90 kontaminujících proteinů, zatímco je vysráženo cílového proteinu; dojde k vysrážení 95 kontaminujících proteinu, zatímco je vysráženo

méně	než	80 %
0 0	nebo	více
méně	než	90	o ’0
c -o	nebo	více
méně	než	95	c, O

J pouze malého cílového proteinu.

Výhodně dojde k vysrážení procenta cílového proteinu.

Například je vysráženo méně než

0 %, méně než 5 0 %, méně než 4 0 %, méně než 3 0 %, méně než %, méně než 10 %, méně než 5 % nebo méně než 1 % cílového proteinu.

V konkrétním provedení je celkové množství proteinu.

v roztoku (cílový protein plus provedením purifikačního způsobu kontaminující protein) před mg/ml.

vynálezu od 0,1 do 10

V konkrétních provedeních je celkové množství proteinu v roztoku před provedením mg/ml, od 0,3 purifikačního způsobu vynálezu do 2 mg/ml od

0,1 do mg/ml, od 1 do do 2 mg/ml, od 0,5 mg/ml nebo přibližně od

0,5 do mg / ml .

V konkrétních provedeních je přednostní precipitace kontaminujících proteinů přímá a nezávisí nebo v podstatě nezávisí na přítomnosti polyaniontů. V jiném provedení je přednostní precipitace kontaminujících proteinů přímá a nebo v podstatě nezávisí na přítomnosti pevné opory, nezávisí

V j iném provedení přednostní precipitace proteinů nezávisí nebo v podstatě nezávisí na kontaminuj ících přítomnosti agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami.

Přednostní precipitace kontaminujících proteinů ne závisí nebo v podstatě nezávisí na nějaké složce (např. polyaniontech, pevné opoře nebo agregátech kontaminujících proteinů a dalších molekul) , pokud odstranění této složky neovlivní, respektive v podstatě

z.

tanimuj i c i hi; inu ve stejné míře v přítomnosti v nepřítomnosti této složky.

Výhodně j e kontaminuj ících proteinů v podstatě v nepřítomnosti přítomnosti.

V dalším provedení je polyaniontů nebo za polyaniontů.

V dalším nepřítomnosti pevné opory stejné množství vysráženo v nepřítomnosti teto způsob nebo složky, proveden nepřítomnosti provedení je jako při jej i za nepřítomnosti podstatného množství způsob proveden za nebo za nepřítomnosti podstatné pevné opory. V dalším provedení je způsob proveden za nepřítomnosti agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami nebo za nepřítomnosti podstatného množství agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími proveden za nepřítomnosti nebo molekulami. Výhodně je způsob za nepřítomnosti podstatného množství dvou nebo třech členů skupiny sestávající se z polyaniontů, pevné opory a agregátů mezi kontaminujícími proteiny a dalšími molekulami.

Jakmile je způsob tohoto vynálezu jednou popsán, je rutinní záležitostí pro odborníka v oboru vybrat pro použití konkrétní surfaktant podmínky, např. pH, teplotu, obsah solí, koncentraci kat iontového surfaktantu, celkovou koncentraci proteinu, za kterých je tento způsob proveden se zvýšenou účinností purifikace konkrétního cílového proteinu.

Například mohou být porovnány purifikace provedené při různých hodnotách pH a koncentrací surfaktantu, aby byly zj ištěny optimální purifikační podmínky. rříklady tohoto postupu jsou poskytnuty mze v části

Příklady.

V konkrétním dH roztoku vybráno tak, vysoké, nedošlo k codstatnému sní žení množ stv ho cílevého

Sil vyna ie /:

^:i :: i /on

Účinné množství kationtového surfaktantu je množství surfaktantu, které způsobí přednostní precipitaci kontaminuj ících proteinů. V konkrétních provedeních vysráží účinné množství surfaktantu 40 %, 50 %, 60 %, 90 %, % nebo 99 % kontaminujících proteinu.

V provedení vynálezu je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,001 % do 5,0 %, výhodně je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,01 % do 0,5 % a ještě výhodněji je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci od 0,03 % do 0,2 %. V konkrétních provedeních je kationtový surfaktant přidáván v koncentraci 0,01 % až 0,1 %, 0,01 % až

0,075 %, 0,01 % až 0,05 % nebo 0,01 % až 0,03 %.

V provedení vynálezu je výše uvedený způsob proveden tak, že kationtovým surfaktantem je amfipatická amonná sloučenina.

Ve výhodném provedení je solubi1 izovaný cílový protein podroben dalšímu zpracování poté, co byly kontaminující proteiny přednostně odstraněny. Toto další zpracování může zahrnovat další purifikační kroky, testy aktivity nebo koncentrace, dialýzu, chromatografií (např. HPLC, chromatografií s dělením podle velikosti molekul), elektroforézu, dialýzu atd.

zde používáno, amfipatické amonné sloučeniny zahrnují

Jak j e sloučeniny obecného vzorce QN⁺ nebo RNH₃ ⁺ obsahující jak kationtové, tak i nepolární složky. Q znamená, že dusík je kvartérní amonný iont na čtyři organické skupiny, které mohou, ale nemusí, být společně propoj eny

Pokud j sou organické skupiny společně propoj eny vazbami, pak mohou vytvářet cyklické alifatické nebo aromatické sloučeniny v závislosti na konfiguraci elektronů ve vazbách mezi složkami, které tvoří cyklickou strukturu. Pokud má vybraná amfipatická amonná sloučenina obecný vzorec RNH pak je sloučeninou primární amin, kde R je aliiacická skupina.

í i ' odkazují na ty, které obsahují flucridové, chloridové, bromidové a jodidové ionty.

V provedení vynálezu má vybraná amtipatická amonná sloučenina alespoň jeden alifatický řetězec s ti až 20 uhlíkovými atomy, výhodně má amfipatická amonná sloučenina alespoň jeden alifatický řetězec s 8 až 18 uhlíkovými atomy.

V provedení vynálezu je vybraná amfipatická amonná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající se z cetylpyridiniových solí, stearamid(methyl)pyridiniových solí, laurylpyridiniových solí, cetylchinoliniových solí, solí methylesteru kyseliny laurylamínopropionové, kovových solí kyseliny laurylamínopropionové, lauryl(dimethyl)betainu, stearyl(dimethyl)betainu, lauryl(dihydroxyethyl)betainu a benzethoniových solí.

Amfipatické amonné sloučeniny, které mohou být použity, zahrnují mimo jiné hexadecylpyridinium-chlorid, dechalinium-acetát, hexadecylpyridinium-chlorid, cetyl(trimethyl)amonium-chlorid, směs n-alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloridů, cetylpyridinium-chlorid (CPC), N, ΔΤ-dimethyl-N-[2 - [2 - [4 (1,1,3,3,-tetramethylbutyl)-fenoxy]ethoxy]ethyl]benzenmethanamonium-chlorid, alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chlorid a dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chlorid, tetradecyl(trimethyl)amonium-bromid, dodecyl(trimethyl)amonium-bromid, cetyl(trimethyl)amonium-bromid, lauryl(dimethyl)betain, stearyl(dimethyl)betain a lauryl(dihydroxyethyl;betain.

V provedení vynálezu je amfipatickou amonnou sloučeninou cetylpyridiniová sůl, jako je čety lpy ridini um-uhl o r id .

V provedení vynálezu směs obsahující požadovaný protein dále obsahuje buněčné složky, jako jsou buněčné složky odvozené z mikroorganizmů, například baktérii, jako - a -i. soli.

V orcvedení vvnálezu á sou buněčné složkv r.v.'. řenv '.edním nebe

Způsob vynálezu může být použit pro purifikaci řady proteinů.

urikasu,

Tyto proteiny mohou zahrnovat mimo interferon-beta, inhibitor faktoru kyselou deoxyribonukleasu jiné protilátky, pij avice,

II, elastasu, lysozym, papain, ribonukleasu, trypsinogen, trypsin, peroxidasu, pankreatickou cytochrom c, erabutoxin, enterotoxin Cl ze Stafylococcus aureus a monoaminoxidasu A a další proteiny, které jsou kladně nabity za alkalických podmínek.

V provedení vynálezu může být cílovým proteinem protilátka, receptor, enzym, transportní protein, hormon nebo jejich fragment nebo konjugát, např. konjugát s druhým proteinem nebo chemickou sloučeninou nebo toxinem.

Protilátky zahrnují mimo jiné monoklonální, humanizované, chimérické, jednořetězcové, bispecifické, Fab fragmenty, F(ab')2 fragmenty, fragmenty produkované Fab expresní knihovnou, antiidiotypické (anti-Id) protilátky a fragmenty vážící epitop z jakékoliv výše uvedené protilátky, avšak za podmínky, že je při podmínkách purifikace protilátka kladně nabita.

Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoliv technika, která zajišťuje produkci molekul protilátky kontinuální kultivací buněčných linií. Ty zahrnuj í mimo j iné hybridomové techniky podle Kohler a Milstein,

495

97;

a U.S. Pat. č. 4 techniky lidských

B-bunečných hybridomu (Kozbor et al., 1983,

Immunology

Today 4,

72; Cole et al . , 1983, Proč.

Nati. Acad. Sci.

USA Θ0,

2026 - 2030) a techniky EBV-hybridomů pro produkci lidských monoklonálnich et

1985,

Monoclona1

Antibodies And

Cancer

Therapy,

Alan

R.

tilátky být základ oro klonováni a tedv n‘o expresi η ednot11v *

plazmidový vektor; kóduj ící požadovaný těžký nebo lehký řetězec nebo kódující molekulu obsahující požadovanou variaollní doménu těžkého nebo lehkého řetězce mohou být transfekovány do buňky exprimující jiný těžký nebo lehký řetězec protilátky nebo molekulu obsahující těžký nebo lehký řetězec protilátky pro expresi multimerního proteinu. Alternativně mohou být těžké řetězce nebo molekuly obsahující jejich variabilní oblast nebo jejich CDR popřípadě exprimovány a použity bez přítomnosti komplementárního lehkého řetězce nebo variabilní oblasti lehkého řetězce. V dalších provedeních mohou být tyto protilátky a proteiny modifikovány na N- nebo C~ konci, např.

C- koncovou amidací nebo N-koncovou acetylací.

Chimérická ve které jsou části odvozeny protilátka je molekula, z různých živočišných druhů, jako jsou její různé ty, které mají variabilní oblast odvozenou z myší mAb a konstantní oblast z lidského imunoglobulinu. (Viz např. Cabilly et al . , U.S

č. 4 816 567 a Boss et al , , U.S. Pat. č. 5 816 397.) Techniky produkce chimérických protilátek zahrnují štěpení genů myší molekuly protilátky s příslušnou antigenní specifitou spolu s geny lidské molekuly protilátky s vhodnou biologickou aktivitou (viz například Morrison, et al . , 1984, Proč. Nati.

Acad. Sci., 81, 6851 - 6855; Neuberger, et al . , 1984, Nátuře

312, 604 - 608; Takeda, et al,, 1985, Nátuře 314, 452 - 454) .

Humanizované protilátky jsou molekuly protilátek z jiných druhů, než je člověk, které mají jednu nebo více oblastí určujících komplementaritu (CDR) z jiných druhů, než je člověk,

a	nosné	oblasti z lidské	molekuly imunoglcbulinu.	T e c h niky p r o
pr	odukci	human i z ovan ý ch	protilátek jsou popsány	například v
Qu	een, U	. Ξ . Pat . č . ^l: 8 5	G39 a Winter, U.S. Pat.	č. 5 225 539.
Ro	z sáhy	nosných otlas*. í	a CDR byly pžesrě st	anovenv -viz
• t C¹	equ-i-	.s ol Proteins :·;	7> -munc 1 cg i ca 1 Znterest ,	K a c a c , Ξ . e 1
J	.....	~ 1 - * ! * ’ ’ '	- ~ ird Uwar Ί	ς - '

můstku za vzniku jednořetězcového polypeptidu. Techniky pro produkci jednořetězcových protilátek jsou popsány například v U.S. Pat. 4 946 778; Bird, 1988, Science 242, 423 - 426; Huston, et al. , 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879 - 5883 a Ward, et al., 1989, Nátuře 334, 544 - 546).

Bispecifická protilátka je geneticky vytvořená protilátka, která rozpoznává dva typy cílů, např. 1) specifický epitop a 2) „spouštěcí molekulu, např. Fc receptor na myeloidních buňkách. Takovéto bispecifické protilátky mohou být připraveny buď chemickou konjugací, hybridomovými technikami nebo rekombinantními technikami molekulární biologie.

Fragmenty protilátek zahrnují mimo jiné: F(ab')2 fragmenty, které mohou být produkovány štěpením molekuly protilátky pepsinem, a F(ab') fragmenty, které mohou být produkovány redukcí disulfidických můstků v F(ab')2 fragmentech. Alternativně, mohou být vytvořeny Fab expresní knihovny (Huse, et al . , 1989, Science 246, 1275 - 1281) umožňující rychlou a snadnou identifikaci monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specifitou.

V provedení vynálezu je proteinem urikasa.

V dalším provedení vynálezu je urikasou savčí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je savčí urikasou variantní savčí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je savčí urikasou prasečí urikasa.

V dalším provedení vynálezu je variantní prasečí urikasa pojmenovaná jako ΡΚΞΔΝ urikasa.

V	dalším	provedení	vynálezu	J ^e	proteinem protilátka.
v	dalším	provedení	vynález	u j	e protilátkou jednořetězcová
profil	átka .
V	dalším	provedení	vynálezu	je	proteinem mterfercn.
7	dalším	provede:. í	- _r. . _r-. < η	J	interf emnem i nt e r f - ~ η
’ i Uf	y · iCí t“ r' ^_ r.“	·::.·· i?· :			.OO·. V

sc i .

al . , (1 (U. S

78:2848

O) ; Yelverton,

Prcc. Nat

Acad .

Přihlášky zveřejněná 6. května 1981, 321 134, zveřejněná července

1981, 34

307, zveřejněná 26. srpna 1981, a Belgický

Patent č.

837 379, vydaný 1. července 1981, popisuj í různé způsoby produkce interferonu beta využívající techniky rekombinantní

DNA. Postupy pro opětovné získání a purifikaci bakteriálně produkovaných

IFN j sou popsány v

450 103;

315 852; 4

343

735 a

343 736 a v Derynck et al . , Nátuře

197 a

Scandella a Kornberg, Biochemistry,

10:4447 (1971).

V konkrétním provedení je cílovým proteinem faktor Xa z pijavice. Faktor Xa z pijavice může být produkován jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi v oboru, jako je způsob popsaný v U.S. Patentu č. 6 211 341 a Mezinárodním Patentovém Zveřejnění č. WO94/23 735.

V provedení vynálezu je kontaktování provedeno po dobu mezi

přibližně	1	minutou a přibližně	48 1	lodinami, výhodněji	od
přibli žně	10	minut do přibližně 24	hodin	, přibližně 30 minut	s«· az
přibližně	12	hodin, přibližně 30	minut	až přibližně 8 hod	in,
přibli žně	30	minut až přibližně 6	hodin,	přibližně 30 minut	až
přibli žně	4	hodiny, přibližně 30	minut	až přibližně 2 hodí	ny,
přibližně	30	minut až přibližně 1	hodinu nebo přibližně 1	až
přibli žně	2 hodiny.

V provedení vynálezu je kontaktování provedeno při teplotě od přibližně 4 °C do přibližně 36 °C; výhodněji od přibližně 4 °C do přibližně 26 °C.

Předmětem vynálezu je také poskytnuti použití kationtového surfaktantu jako j edi ti-éi ιο agens pro purifikaci proteinu s izoelektrickým beden vyšším než 7 za iikaiických podmínek.

ta « ι < * « a 4

V provedení vynálezu je urikasa získána z bakteriální buňky obsahující DNA kódující urikasu pomocí způsobu zahrnujícího takovou úpravu bakteriální buňky, aby exprimovala tuto DNA a produkovala urikasu, a opětovné získání urikasy.

*

V provedení vynálezu je urikasa získána z precipitátú z bakteriálních buněk. >·

Předmětem vynálezu je také poskytnutí purifikované urikasy pro použití při přípravě konjugátu urikasa-polymer.

Vynález také poskytuje purifikovaný protein s izoelektrickým bodem vyšším než 7, který lze získat způsobem zahrnujícím kontaktování směsi obsahující tento protein s účinným množstvím kationtového surfaktantu za takových podmínek, kdy je protein pozitivně nabitý nebo má plochu, která je pozitivně nabita, a opětovné získání proteinu.

Předmětem vynálezu je také poskytnutí použití cetylpyridiniové soli pro purifikaci proteinu s izoelektrickým bodem vyšším než 7.

V provedeních, kdy je směs kontaktována s účinným množstvím kationtového surfaktantu za takových podmínek, kdy je protein pozitivně nabitý, se bude pH lišit podle typu cílového proteinu. Přesto je pH výhodně mezi 7 a 11, výhodná rozmezí jsou od přibližně pH 7 do pH 10, pH 7 až pH 9, pH 8 až pH 11, pH 8 až pH 10 nebo pH 8 až pH 9.

Příklady provedení vynálezu

Příklady, které následují, jsou zde uvedeny pro usnadnění pochopení vynálezu, ale nejsou zamýšleny a neměly by být jakýmkoliv způsobem spojovány s omezováním jeho rozsahu.

PŘÍKLAD 1.

Použití CPC pro purifikaci rekombinantní savčí urikasy

1.1 Pozadí

Urikasa o farmaceutické čistotě nesmí v podstatě obsahovat jiné proteiny, než je urikasa. Savčí urikasa (izoelektrický bod 8,67) produkovaná v E. coli se hromadí intracelulárně v precipitátech podobných organelám známým jako inkluzní tělíska (IB) , které mohou být snadno izolovány pro další purifikaci. Na rozdíl od obecného názoru, že IB obsahují poškozený/špatně sbalený exprimovaný protein, obsahují tyto elementy podobné IB správně sbalenou urikasu v precipitované podobě. Expozice urikasových elementu podobných IB alkalickému pH, např. pH přibližně 9 až 11, znovu rozpustí tento precipitovaný protein. Obsah urikasy v solubilizovaných elementech podobných IB byl přibližně 40 až 60 % a vyžadoval extenzívní purifikaci, aby byl získán homogenní urikasový přípravek. Zde uvádíme purifikaci urikasy a dalšího proteinu pomocí CPC, které mohou být testovány řadou metod. Například čistota savčí urikasy může být hodnocena stanovením specifické aktivity, počtem proužků, které se objeví po elektroforéze a obarvení SDS-PAGE gelů a počtem a velikostí vrcholků, které se objeví na chromatogramu po HPLC s dělením podle velikosti molekul.

1.2. MATERIÁLY A METODY

1.2.1. 50 mM NaHCO₃ pufr (pH 10,3)

Tento pufr se připraví rozpuštěním NaECO... na konečnou l· (VíIC . pH 3E ’ J. Z ř.-n _ U , z Z. Z -ř . ZAV1.S 1 ”3 roztek CPC

10% CPC se připraví rozpuštěním CPC v destilované vodě na konečnou koncentraci 10 g/100 ml.

1.2.3. Exprese rekombinantní prasečí urikasy

Rekombinantní savčí urikasa (urátoxidasa) se exprimuje v E. coli K-12 kmen W3110 F\ jak je popsáno v Mezinárodním Patentovém Zveřejnění WO 00/08 196 patřícím Duke University a U.S. Patentové prozatímní přihlášce č. 60/095 489, které jsou zde uvedeny jako celky coby odkazy.

1.2.4. Kultivace a sklizeň bakterií produkujících urikasu

Bakterie se kultivují při 37 °C v růstovém médiu obsahujícím kaseinový hydrolyzát, kvasniční extrakt, soli, glukosu a amoniak.

Po kultivaci se bakterie, ve kterých došlo k nahromadění urikasy, sklidí centrifugací a promyjí vodou, aby byl odstraněn zbytek kultivačního média.

1.2.5. Rozrušení buněk a opětovné získání IB

Peleta sklizených buněk se rozsuspenduje v 50 mM Tris pufru, pH 8,0 a 10 mM EDTA a výsledný objem se upraví na přibližně dvacetinásobek suché hmotnosti buněk (DCW). K rozsuspendované peletě se za promíchávání přidá lysozym o koncentraci 2000 až 3000 jednotek/ml a vše se inkubuje 16 až 20 hodin při 4 až 8 ^c'C.

Buněčný lyzát se podrobí intenzivnímu promíchání a následně se sonikuje. Suspenze se zředí seejným objemem Neionizované vody a centrifuguje. Peleta obsahující urikasová inkltsní tělíska se posledního promývacího kroku se uschová pro další zpracovávání a supernatant se vyhodí.

1.2.6. Rozpouštění

Peleta inkluzních tělísek (IB) se rozsuspenduje v 50 mM NaHCO₃ pufru, pH 10,3 + 0,1. Suspense se inkubuje při teplotě ± 2 °C po přibližně 0,5 až 2 hodiny, aby mohlo dojít k solubilizaci urikasy z IB.

1.2.7. Působení CPC

10% roztok CPC se za prudkého míchání přidá v alikvotech k homogenizovaným IB (pH 10,3), aby byla získána požadovaná koncentrace CPC. Vzorek se inkubuje 1 až 24 hodin, jak je uvedeno, během nichž se vytvoří precipitující vločky. Vzorek se centrifuguje 15 minut při 12 000 x g. Peleta a supernatant se oddělí a peleta se rozsuspenduj e v 50 mM NaHCCh pufru (pH 10,3) na původní objem. Stanoví se enzymatická aktivita každé frakce a frakce se zakoncentrují a dialyzují, aby byl odstraněn zbývající CPC.

1.2.8. Stanovení proteinu

Obsah proteinu v alikvotech opůsobených a neopůsobených vzorků IB se stanoví pomocí modifikované Bradfordovy metody (Macart a Gerbaut (1932) Clin Chim Acta 122:93 - 101) -

1.2.9. Testování urikasy

1.2.9.1. Enzymatická aktivita derivatives of s-triazines. J Biol Chem, 240, 2491 - 2494;

modifikovanou přidáním 1 mg/ml BSA) . Enzymatická reakční rychlost se stanoví v duplikátech měřením snížení absorbance při 292 nm, které je výsledkem oxidace kyseliny močové na alantoin. Jedna jednotka aktivity je definována jako množství urikasy potřebné pro oxidaci jednoho gmolu kyseliny močové za minutu při 25°C za specifikovaných podmínek. Účinnost urikasy je vyjádřena v -jednotkách aktivity na mg proteinu (U/mg) .

Extinkční koeficient 1 mM kyseliny močové při 292 nm v 1 cm optické délce je 12,2. Proto oxidací 1 ^molu kyseliny močové v ml reakční směsi dojde ke snížení absorbance z 12,2 mA₂₉₂. Změna absorbance v čase (AA₂₉₂ za minutu) se stanoví z lineární části křivky. Aktivita urikasy se pak spočítá následovně:

ΔΑ_292ητπ (AU/min) x PF x V_RM

Aktivita (U/ml)= v_g x 12,2

Kde: PF = faktor zředění;

V_RM = celkový objem reakční směsi (v μΐ)

V_s = objem zředěného vzorku použitého v reakční směsi (v μΐ)

1.2.9.2. HPLC analýza pomocí Superdex 200

Množství a relativní procento nativního urikasoveho enzymu, stejně jako možné kontaminace, se kvantifikují podle elučního profilu získaného z HPLC za použití ko1ony Ξ uperdex 2 0 0.

Plochy

Každého vrcholu a roztoku byly orocento z vány clo kolony.

ryly vypočítány a srírnuty v přiložen

1.2.10. SDS-PAGE analvza

Proteiny ve vzorcích obsahujících -20 prove íloupec

byly	rozděleny na 15%	SDS- PÁCE	gelech.	Výsledné gely	byly
obarveny pomocí Coomassie	brilliant.	bl ue.
1.3.	VÝSLEDKY
	Účinky působení CPC (	)0,005 až	0,075%)	(po 1 až 24 hodin) na
aktivitu urikasy získanou	ze supernatantu	a její čistota	j sou

uvedeny v Tabulce 1 a na OBR 1. Před působením CPC (při pH 10,3) byla koncentrace proteinu 1,95 mg/ml a specifická enzymatická aktivita byla 3,4 až 4,67 U/mg. Výsledky uvedené na OBR. 1B naznačují, že během každé inkubační doby se se zvýšením koncentrace CPC snížila koncentrace proteinu v supernatantu. Při méně než 0,04% CPC byl pozorován relativně malý účinek na koncentraci proteinu. CPC v koncentracích 0,04% až 0,075% může snižovat koncentraci proteinu na přibližně 50 % původní koncentrace.

Oproti účinkům CPC na celkovou koncentraci proteinu nebyla aktivita rozpuštěné urikasy signifikantně ovlivněna zvyšující se koncentrací CPC a inkubačním časem (OBR. 1A). Během každé inkubační doby se specifická enzymatická aktivita (OBR. 1C) konzistentně zvyšovala jako funkce koncentrace CPC v rozmezí 0,04% až 0,075%. Toto zvýšení bylo výsledkem specifického odstranění jiných proteinů, než je urikasa. Vzhledem k tomu, že specifická enzymatická aktivita výsledného purifikovaného enzymu byla přibližně 9 ^TJ/mg, byla většina kontaminujících proteinů odstraněna precipitací pomocí CPC. Provedené HPLC a SDS-PAGE analýzy pak potvrdily terizo závěr.

TABULKA 1. ÚČINEK VYSTAVENÍ CPC NA

SPECIFICKOU AKTIVITU A ČISTOTU URIKASY

Inkubační \ [C'?C] Akt :vi ta * [ Pr otelí

	(celková hodnota)
1	0, 005	7,1	1,8	3,9
1	0,01	6,63	1,75	3,7
1	0,02	6,63	1,75	3,7
1	0 , 04	6,4	1,47	4,35
1	0,06	5,9	0 , 95	6,2
1	a ň v n	£ 4	Γ) Q	7 1
		-	·- / --
4	0,005	8,61	1,7	5,06
4	0,01	8,36	1,66	5,04
4	0,02	8,36	1,6	5,04
4	0,04	7,38	1,32	5,59
4	0,06	6,4	0,9	7,1
4	0,075	6,9	0,82	8,4
24	0,005	8,8	1,9	4,66
24	0,01	7,9	1,9	4,14
24	0 , 02	7,9	1, 9	4,14
24	0 , 04	7,3	1,5	4,9
24	0 , 06	6,9	0,97	7,1
24	0 , 075	6,6	0,9	7,4
24	0 (celková hodnota)	9,1	1,95	4,67

1.4. Potvrzeni pozitivního vlivu CPC na čistotu urikasy

Izolují se a solubilizují IB obsahující urikasu, jak je popsáno v části 1.3 před působením CPC a

1.4.1. HPLC analýza

0,075¾ CPC

Vzorky rozpuštěného pa filtraci proteinu jiných proteinů, než materiálu se analyzují předpisovaného CPC .

je urikasa, po působení « t

HPLC analýza solubi1 izovaných IB naznačuje, že vrchol urikasy (retenční čas :RT) -25,5 minuty) tvoří přibližně 46 % proteinu v nečištěném vzorku IB (OBR 2A) . Po působení CPC se vrchol urikasy zvýšil na přibližně 92 % proteinu (OBR 2B) a byl doprovázen signifikantním snížením kontaminujících molekul, které jsou eluovány mezi RT 15 až 22 min (OBR 2A) , Plocha pod urikasovým vrcholem je přibližně 70% vzhledem k vrcholu na obr. 2A. Tyto výsledky proto naznačují zdvojnásobení čistoty urikasy, které je výsledkem odstranění jiných proteinů, než je urikasa, po působení CPC.

1.4.2. Účinek 0,075% CPC na enzymatickou aktivitu

Výsledky (uvedené v Tabulce 2) naznačují, že hmotová bilance aktivity urikasy byla během postupu zachována. Bylo zjištěno, že vystavením CPC došlo k precipitaci 60 % všech proteinů v roztoku. Více než 85 % enzymatické aktivity zůstalo v roztoku, proto odstranění ostatních proteinů umožnilo zvýšení specifické aktivity ve vzniklém supernatantu o víc jak 110 %. Jako při většině purifikačních způsobů zůstala část požadované aktivity v peletě. V tomto případě zůstalo v peletě pouze 17,6 % původní aktivity (a byla extrahována pomocí 50 mM hydrogenuhličitanu sodného (7 mSi, pH 10,3) pro analytické účely), což je relativně malá část z původního množství.

TABULKA 2. ÚČINEK PŮSOBENÍ CPC NA AKTIVITU URIKASY

Vzorek	Celková aktivita (U)	Aktivita (U/ml)	[Protein] (mg/ml)	Specifická aktivi ta (U/mg)	Získaná aktivita (%)
	-i 5' C	•7 T	·'·		r

Peleta po působení CPC

86

0,8

17,6

1.4.3. SDS-PAGE analýza po působení 0,075% CPC

Vzorky nečištěné urikasy, před působením CPC, a následné frakce po oddělení rozpustného a nerozpustného materiálu po působení CPC, separaci frakcí centrifugací a rekonstituci pelety získané centrifugací obsahující stejná množství proteinu se analyzují metodikou SDS-PAGE. Výsledky (viz OBR. 3) ukazují přítomnost kontaminujících proteinů před působením CPC. Po působení CPC obsahovala většinu kontaminujících proteinů peleta, zatímco supernatant obsahoval urikasu zobrazenou jako jediný hlavní proteinový proužek.

PŘÍKLAD 2.

Účinek CPC na purifikaci jednořetězcových (scFv) protilátek

2.1. MATERIÁLY A METODY

2.1.1. Pufry

2.1.1.1. Pufr pro rozpuštění inkluzních tělísek

Rozpouštěcí pufr obsahuje 6 M močovinu, 50 mM Tris, 1 mM EDTA a 0,1 M cystein. pH pufru se titruje na 8,5.

2.1.1.2. Pufr pro konformační sbalení ?ufr pro konformační ibsahtje 1 močovinu, zH

2.1.2. Exprese scFv protilátek v bakteriích

ScFv protilátky (pí 8,9) se exprimují v E. coli transformované vektorem kódujícím scFv obsahující na karboxylovém konci cystein-lysin-alanin-lysin, jak je popsáno v PCT Zveřejnění WO 02/059 264, které je zde uvedeno jako celek coby odkaz.

2.1.3. Kultivace a sklizeň bakterií produkujících scFv protilátku

Bakteriální buňky obsahující scFv se kultivují v minimálním médiu doplněném L-argininem, konečná koncentrace 0,5 %, při pH

7,2 pět hodin před indukcí. Exprese scFv se indukuje limitací množství glukosy v médiu. Bakteriální buňky obsahující scFv se sklidí z kultury ultrafiltrací.

2.1.4. Rozrušení buněk a opětovné získání inkluzních tělísek

Sklizená buněčná peleta se rozsuspenduje v 50 mM Tris pufru, pH 8,0 a 10 mM EDTA a výsledný objem se upraví na přibližně dvacetinásobek suché hmotnosti buněk (DCW). K rozsuspendované peletě se za promíchávání přidá lysozym o koncentraci 2000 až 3000 jednotek/ml a vše se inkubuje 16 až 20 hodin při 4 °C.

Buněčný lyzát se podrobí intenzivnímu promíchání a následně se somkuje. Inkluzní tělíska obsahující scFv protilátku se znovu získají centrifugami při 10 000 x g. Peleta se přibližně šestnáctkrát zředí deíonicovanou vodou ihmotnost/hmotnost) a centrifuguje, aby byly dá i e odstraněny nečistoty. Peleta získaná z. tohoto posledního promývacího úroku se uchová pro další raccvání .

2.1.5. Rozpuštění a opětovné tonformacní malení

I 4

I t «

• ·

* t

Peleta obohacená o IB rozpouštění inkluzních tělísek při teplotě místnosti a nechá ví tro v roztoku založeném na « a • « i « «

l « · » «1 «* •*

4·

I I se rozsuspenduje (viz výše) , inkubuje puf ru pro se 5 hodin se opětovně konformačně sbalit in arginu/oxidovaném glutathionu. Po sbalení se protein dialyzuje a koncentruje tangenciální průtočnou filtrací proti pufru obsahujícím močovinu/fosfát.

2.1.6. Působení CPC

10% roztok CPC se přidá ke směsi pro konformační sbalení scFv na výslednou koncentraci 0,02 % a po 1 až 2 hodinách inkubace při teplotě místnosti se precipitát odstraní filtrací. Supernatant obsahuje scFv protilátku.

2.2.VÝSLEDKY

2.2.1. Účinek koncentrace CPC na opětovné získání scFv protilátky

Účinky CPC (při pH 7,5 nebo 10) na čistotu a opětovné získání scFv protilátky jsou uvedeny v Tabulce 3. Před působením CPC bylo výchozí množství proteinu v IB 73 mg a obsahovalo 15,87 mg scFv protilátky, jak bylo stanoveno HPLC analýzou pomocí Superdex 75. Retenční čas (RT) vrcholů obsahujících scFv protilátku byl přibližně 20,6 minut. Výsledky naznačují, že opětovné získání všech proteinů obecně klesá se zvyšující se koncentrací CPC a opětovné získání scFv protilátky zůstalo >80 %, zatímco koncentrace CPC byla <0,03%. Relativně účinnějšího odstranění kontaminujíčího proteinu bylo dosaženo při pH 7,5 vzhledem k pH 10. Puriíikace scFv protilátky tak bylo dosaženo působením 0,01 až 0,03% CPC.

Účinek působení CPC na opětovné získání a čistotu

- C?V OTOt L Lá ^r- kv

Zpracování rozpuštěných IB	Celkový 1 protein (mg)	Celková scFv stanovená HPLC (mg)	Purifikační faktor	% opětovného získání scFv stanovené HPLC
Kontrola (před CPC)	73	15,87		100
0,01% CPC (pH 10)	64	15,66	1,13	98,68
0,01% CPC (pH 7,5)	50,76	14,97	1,36	94,33
0,015% CPC (pH 10)	54	14,49	1,23	91,30
0,015% CPC (pH 7,5)	39,96	14,22	1,64	89,60
0,02% CPC (pH 10)	43	13,35	1,43	84,12
0,02% CPC (pH 7,5)	37,8	13,02	1,58	82,04
0,03% CPC (pH 10)	35	11,12	1,46	70,07
0,03% CPC (pH 7,5)	37,8	12,47	1,52	78,58

2.3. POTVRZENÍ POZITIVNÍHO VLIVU CPC NA ČISTOTU scFv PROTILÁTKY

2.3.1. HPLC analýza opětovného získání scFv po působení CPC d 1 lei _i_'/ z- cl ZnC V\1 Γ. .iíúi.Ui

4B). Chromatogram na OBR 4C naznačuje, že po působení 0,02% CPC obsahoval vrchol obsahující scFv protilátku ze supernatantu přibližně 75,9 % celkového injikovaného proteinu, tj .

3,3-násobnou purifikaci. Působení CPC tak odstranilo proteinové nečistoty z roztoků scFv protilátky.

2.3.2. SDS-PAGE analýza opětovného získání scFv po působení CPC

Výsledky (viz OBR. 5) naznačují, že před působením CPC vzorek obsahoval signifikantní množství velkého počtu proteinů. Obdobně po působení CPC obsahovala peleta velký počet proteinů. Naopak supernatant po působení CPC obsahoval jeden hlavní proteinový proužek, scFv protilátku.

PŘÍKLAD 3

Účinek CPC na purifikaci rekombinantního interferonu-beta

Interferon beta (IFN-beta, pí 8,5 až 8,9) coli známými metodami. Nagola, S.

se exprimuje v E.

Nátuře, 284:316 et

Nátuře,

287:411 (1980);

Yelverton, E.

et al., Nuc.

Acid

Nat' 1 Acad.

Sci.

(U.S.)

Pat . Žádost i

č. 28 033, zveřejněná

6. května

1981; 321 134, zveřejněná 15.

července 1981; 34 307, zveřej něná

6. srpna 1981 a Belgický Patent č. 837 379, vydaný

1. července

1981, popisuj í beta vyu žívající techniky rekombinantní DNA. Způsoby pro opětovné získání a bakteriálně produkovaných

IFN jsou popsány v U.S.

450 103; 4 315 852; 4 343 735 a

343 736 a v Dervnck

Nátuře (1980) 287:193

197

Biochemist ry, : 4447 '1971).

Inkluzní lísca cbsahi.

Výsledný roztok se vystaví působení CPC. Výsledky uvedené na Obrázku 6 naznačují podstatný pokles množství kontaminujících proteinů po působení CPC. Aktuální množství IFM-beta (plocha pod vrcholem) se po působení CPC znatelně nezměnilo.

Tabulka 4 shrnuje účinky působení CPC. Celkový protein (Bradford) poklesl o 40 %, UV absorbance poklesla o přibližně 40, avšak množství IFN-beta se nezměnilo.

TABULKA 4.

Vzorek a zpracování	Protein (mg/ml)	O.D Ago	Obsah IFNb (mg/ml)^a	SEC Profil
Kontrola (po sbalení proteinu, bez CPC, 1049-31)	0,51	1,55	0, 069	Vrchol R.T. 13^b min tvoří 15 % celkové plochy
Test (po sbalení proteinu a působení 0,05% CPC, 1049-31)	0,3	1,0	0,069	Vrchol R.T. 13^b min tvoří 7,34 % celkové plochy _

^a Kvantifikováno Vydac C4 kolonou ^b SEC profil obsahoval několik vrcholů. Vrchol, který se eluuje ve 13 min (R.T. 13 min) , se zmenšil po působení CPC a odpovídá oblasti, kde se eluují proteiny s vysokou molekulární hmotností a jejich varianty.

PŘÍKLAD 4.

Účinek CPC na purifikaci inhibitoru faktoru Xa.

CPC byl použit pro purifikaci inhibitoru faktoru Xa z pijavice. Inhibitor faktoru Xa z pijavice <FXaI, pí 3,4 až 9,1'· může být produkován, jak tylo popsáno v C. .-· . í ccenzu č.

Mil

Po rozpuštění IB pelety se přípravek inkubuje s 10% roztokem CPC. Následně se směs centrifuguje 15 minut při 12 000 x g.

Oddělí se peleta a supernatant. Peleta se rozsuspenduje v 50 mM NaHC0₃ pufru na původní objem. Peleta a supernatant se odděleně zakoncentrují a dialyzují, aby byl odstraněn zbývající CPC. Obsah a aktivita proteinu byly změřeny a bylo zjištěno, že FXal byl převládající složkou supernatantu a v podstatě se nevyskytoval v peletě. Výsledky naznačují, že působení CPC zvýšilo účinnost opětovného získání a zlepšilo čistotu znovu získaného FXal.

PŘÍKLAD 5.

Purifikace karboxypeptidasy B (CPB) pomocí CPC

Identická množství inkluzních tělísek získaných z klonu exprimujícího CPB se solubilizují v 8 M močovině, pH 9,5 (kontrola a test). Produkce CPB je popsána v Mezinárodním patentovém zveřejnění č. WO96/23 064 a v U.S. Patentu č.

948 668. Na testovaný vzorek se nechá působit 0,11% CPC a vzorek se vyčistí filtrací před opětovným konformačním sbalením. Opětovné konformační sbalení kontrolního a testovaného vzorku se provede zředěním roztoků 1:8 pufrem pro opětovné konformační sbalení. Po inkubaci s endoproteinasou přes noc při teplotě místnosti se na DEAE Sepharosovou kolonu nanesou stejná množství kontrolního a testovaného roztoku. Kolona se promyje a aktivní enzym se následně eluuje 60 mM chloridem sodným v 20 mM Tris pufru s pH 8.

	TABULKA	5 .
Krok procesu	Parametr	Zpracování
		Kon t ro 1 a 0 , 11 %: 4 ·:

-I------------;

močovině Po vyčištění	Obsah proteinu (mg) *	490	272
pH	9,5	9,5
Aktivita enzymu (j ednotky)	Inaktivní (**)	Inaktivní (**)
Po chromatografií 26,5 mg opětovně sbaleného proteinu (DEAE MP)	Obsah proteinu (mg) *	5,67	8,41
Aktivita enzymu (j ednotky)	258	4043
Specifická aktivita (j ednotek/mg)	98	481

(*) Stanovení proteinu bylo provedeno metodou podle

Bradforda.

(**) Před opětovným sbalením nebyl protein aktivní.

Výsledky uvedené v Tabulce 5 ukazují, že celková OD v materiálu po působení CPC poklesla o 49,5 % a celkový obsah proteinů se snížil o 44,5 % . Zajímavé je, že celková aktivita enzymu znovu získaného ve vzorcích vystavených působení CPC vzrostla o 79 %, což naznačuje, že CPC odstranil složku, která částečně inhibovala vytvoření aktivního enzymu.

Všechny zde citované odkazy jsou zde začleněny coby odkazv jako celky a pro všechny účely ve stejném rozsahu, jako kdvby <?.žié jednotlivé zve ře^-ηόη.ί nec·- par.ent naho raAentcvá přínláška

Může být provedeno mnoho modifikací a variací předloženého vynálezu bez toho, aby se odchýlily od ducha a předmětu vynálezu, jak bude zřejmé odborníkům v oboru. Zde popsaná specifická provedení jsou předložena pouze jako příklad a vynález má být omezen pouze podmínkami v přičleněných patentových nárocích spolu s celým rozsahem ekvivalentů, ke kterým se tyto nároky vztahují.

textových

Průmyslová využitelnost

Vynález poskytuje způsob purifikace solubilizovaného cílového proteinu z roztoku obsahujícího směs cílového proteinu a kontaminujících proteinů zahrnující kontaktování solubilizované směsi s účinným množstvím kationtového surfaktantu a opětovné získání cílového proteinu.

t i » ♦* * ··

Γ a ** _a « · · ♦ « ·

2CO7704

474

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob purifikace cílového proteinu vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje identifikaci cílového proteinu a kontaktování roztoku obsahujícího rozpuštěný cílový protein a jeden nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinu s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které je účinné pro selektivní precipitaci jednoho nebo více kontaminujících proteinů.

Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná č u j ící se t í m, že dále zahrnuje krok opětovného získání rozpuštěného cílového proteinu.

. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná Sující se tím, že alespoň jeden z jednoho nebo více kationtových surfaktantu je amfipatická amonná sloučenina.

4. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 3 vyzná čující se tím, že amfipatická amonná sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající se z kvartérních amonných sloučenin obecného vzorce QN'; primárních amonných sloučenin s parafínovým řetězcem obecného vzorce RNH;¹' a jejich solí.

5. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 4 vyzná č li j í o £ s e t í m, že amfipatická amonná sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající se z cetylpyridiniových solí, soearamzd •'methyl· ) pyridir.i ovvcn solí, lanrylcyridinicvých solí, čety Lrhi nr 1 .nicvýoh solí, solí stearyl(dimethyl)betainu, lauryl(dihydroxyethyl)betainu a benzethoniových solí.

6. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 5 vyzná čující se tím, že amfipatická amonná sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající se z hexadecylpyridiniumchloridu, dechalinium-acetátu, hexadecylpyridinium-chloridu, cetyl(trimethyl)amonium-chloridu, směsi n-alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloiIdu, cetylpyridinium-chloridu, N,Ndimethyl-N- [2- [2- [4- (1,1,3,3, -tetramethylbutyl)fenoxy] ethoxy]ethyl]benzenmethanamonium-chloridu, alkyl(dimethylbenzyl)amonium-chloridu a dichlorbenzyl(dimethylalkyl)amonium-chloridu, tetradecyl(trimethyl)amonium-bromidu, dodecyl(trimethyl)amonium-bromidu, cetyl(trimethyl)amoniumbromidu, lauryl(dimethyl)betainu, stearyl(dimethyl)betainu a lauryl(dihydroxyethyl)betainu.

7. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 5 vyzná čující se tím, ze amfipatickou amonnou sloučeninou je cetylpyridiniová sůl.

8. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 7 vyzná čující se tím, že cetylpyridiniovou solí je halogenidová sůl.

9. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 8 vyzná čující se tím, že cetylpyridiniovou halogenidovou selí je cetylpyridinium-chlorid.

i 0. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 9 v y z n a čující se t í m, že amfipatická amonná sloučenina má alespoň jeden alifatický řetězec s 6 až 2 0 uhl^: kovvm

11 . Způsob purifikace ačující s uhlíkových atomů. cílového proteinu podle nároku 10 e tím, že alifatický řetězec v v y z n \Ά 8 až 18 12 . Způsob purifikace c íloveho proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že roztok dále obsahuje j ednu nebo více buněčných složek. 13 . Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 12 v y z n a č u j ící se t í m, že jedna nebo více buněčných

složek jsou, odvozeny z mikroorganizmu.

14. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 13 v y z n ačující se tím, že mikroorganizmem je bakterie.

15. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 14 v y z n ačující se tím, že bakterií je E. coli.

. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 12 v y z n ačující se tím, že jednou nebo více buněčnými složkami jsou jeden nebo více proteinů.

17. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že cílovým proteinem je rekcmbinantní protein.

13. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 17 v y z n a č u j í c í se t í m, že rekembinantním proteinem je bt π zvm.

Zcůscb purifikace cílového preteirm reále nárok;.' 17 v y z n > ι ι deoxyribonukleasy II, elastasy, lysozymu, papainu, peroxidasy pankreatické ribonukleasy, trypsinogenu, trypsinu, cytochromu c, erabutoxinu, enterotoxinu Cl ze Stafylococcus aureus, interferonu a monoaminoxidasy A.

20. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 19 v y z n ačující se tím, že cílovým proteinem je urikasa.

21. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 20 v y z n ačující se tím, že urikasou je savčí urikasa.

22. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 21 v y z n ačující se tím, že savčí urikasou je prasečí urikasa.

23. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 17 v y z n t í m, že cílovým proteinem je protilátka.

24. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 23 v y z n ačující se tím, ze protilátkou je jednořetězcová protilátka.

25. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 17 v y z n ačující se tím, že cílovým proteinem je interferon.

26. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 25 v y z n ačující se tím, že interferonem je interferon beta.

svého pr o t e- i nu

28. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 27 v y z n ačující se tím, že jeden nebo více kat iontových surfaktantů jsou přidány v koncentraci od 0,01 % do 0,5 %.

29. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 27 v y z n ačující se tím, že jeden nebo více kationtových surfaktantů jsou přidány v koncentraci od 0,03 % do 0,2 %.

30. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že kontaktování probíhá od 5 minut do 48 hodin.

31. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 30 v y z n ačující se tím, že kontaktování probíhá od 10 minut do 24 hodin.

32 . Způsob purifi kace cílového proteinu podle nároku 1 v y z n a č u j í c í se t í m, že kontaktování probíhá při teplotě od 4 °C do 36 °C. 33 . Způsob purifi kace cílového proteinu podle nároku 3 2 vy z n a č u j í c í se t í m, že kontaktování probíhá při teplotě od 4 °C do 26 °C. 34 . Způsob purifi kace cílového proteinu podle nároku 1 v y z n a č u - i c í se ti m, že roz tok v podstat ě neobsa. huj e polyanionty. - ς Způsob purifi kace cílového ρ rot o mu pod 1 e r.ároku _ '·/ zt n a U LI * C _ £ 1 m, že rez tm. o podsrat e aeoosai zuj e

r t · « > >* t t ·· · • · * • » · · i .· τ » · · ·* ·

36. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že roztok v podstatě neobsahuje agregáty kontaminujících proteinů s dalšími molekulami.

37. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že roztok v podstatě neobsahuje polyanionty, pevnou oporu a agregáty kontaminujících proteinů s dalšími molekulami,

38. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 35, 36 nebo vyznačující se tím, že kat iontovým surfaktantem je cetylpyridiniová sůl.

39. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároků 37, 38 nebo vyznačující se tím, že cetylpyridiniovou solí je cetylpyridinium-chlorid.

40. Způsob purifikace cílového proteinu podle nároku 1 vyzná čující se tím, že cílový protein má izoelektrický bod vyšší než nebo roven 7.

41. Puri f i kovaný v nároku 1. protein připravený podle způsobu uvedeného 42. Purifikovaná urikasa připravená podle způsobu uvedeného

v nároku 1.

43. Urikasa podle nároku 42, kde urikasou je savčí urikasa.

44. Urikasa podle nároku kde savčí urikasou urikasa.

45. Urikasa podle nároku 42, kde urikasa je z bakteriální buňky, kdy bakteriální buňka obsahuje DNA kódující urikasu a DNA je exprimována tuk, že je produkována urikasa.

46. Urikasa podle nároku 45, kde urikasa je opětovně získána z inkluzních tělísek produkovaných bakteriální buňkou.

47. Způsob purifikace cílového proteinu vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky:

a. identifikace cílového proteinu;

b. kontaktování roztoku obsahujícího solubilizovaný cílový protein a jeden nebo více rozpuštěných kontaminujících proteinů s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které účinně selektivně precipituje jeden nebo více kontaminujících proteinů; a

c. opětovné získání cílového proteinu.

48. Způsob zvýšení procenta cílového proteinu v roztoku proteinů vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

a. získání roztoku rnnoha proteinů, kde proteiny v roztoku zahrnují cílový protein a kontaminující proteiny a cílový protein tvoří první hmotnostní procento všech proteinů v roztoku;

b. kontaktování roztoku s jedním nebo více kationtovými surfaktanty v množství, které účinně selektivně precipituje kontaminující proteiny;

kde cílový protein v roztoku z krcku b tvoří druhé procento všech proteinů ·ι druhé procento procento.

Obrázek 1 >1 10 <Λ

TJ

M 3 •H

H un rH 04 Lí) <1 O O o o 0- O «3 O - «· - o 4-> o O o o υ 0 O o

o c o Koncentrace CPC (θ)

2,5

1) - ⁿ —A. .............A ... 1. ί ° 154) τ T 1 _e ·--- i J i > h !

í°,5 T

4->

• H m «—1 OJ -r KO LH t-t _Λ o o o o O r- o o ·- · o x 4J -> o o o O - o 0 o o

c > TJ ' O

X o Koncentrace CPC (¢) ·*

Λ___________