CZ2008355A3 - Zpusob prípravy usporádaných bunecných struktur - Google Patents

Abstract

Zpusob prípravy usporádaných bunecných struktur je charakteristický tím, že se na povrchu diamantu vytvorí pomocí plazmového výboje vodíkem a kyslíkem zakoncené plochy a diamant s takto upraveným povrchem se ponorí do živného roztoku s bunkami. Bunky, které mají schopnost vytváret kostní nebo nervovou tkán, selektivne kolonizují kyslíkem zakoncený (hydrofilní) diamantový povrch. Klícovým parametrem je optimální pocátecní koncentrace bunek a koncentrace hovezího séra v médiu pri jejich nanášení. Diamant muže být navíc i morfologicky strukturován. Diamant lze použít prírodní nebo syntetický na libovolné podložce. Koncentrace prímesí v diamantu není omezena.

Description

FV 200g - 3,55 Způsob přípravy uspořádaných buněčných struktur

Oblast techniky

Vynález sc tvká řízeného uspořádávání buněk do organizovaných struktur na povrchu pevné látky.

Dosavadní stav techniky

Řízené uspořádávání buněk je princip velmi zajímavý nejen obecně pro medicínu nebo farmacii, ale i pro nano-bio-lechnologie a bio-elcktroniku. ktere sc v posledních letech stávají stále významnější. Nanotechnologie často vyžadují řízené strukturování a změny materiálových a chemických vlastností materiálu na rozměrech mikro- a nano-metrú. ioho je využíváno pre výrobu funkčních zařízení, pro selektivní rust a organizaci struktur i pio vytváření heterogenních rozhraní mezi anorganickými a organickými materiály. Při současných požadavcích na miniaturizaci, vyšší výkonnost i nove funkce takováto hybridní zařízení vytvářejí most mezi organickým a anorganickým světem a umožňují spojil výhody obou světů. Připravují se například mikroskopické šablony pro uchycení uhlíkových nanotrubiček. DNA molekul, buněk a buněčných membrán v předem určených místech na elektronických čipech. Různé způsoby uspořádávání buněk sc využívají lake v tkáňovém inženýrství.

Pro orientované uchycování buněk k substrátu se využívá zejména vazby ligandreceptor. Např. sc na nosný povrch (substrát) kovalenlnč naváží RGD peplidy. které obsahují aminokyselinovou sekvenci rozeznatelnou většinou integrinových buněčných recepturu. Na tyto peptidv sc proto buňka uchytí a zformuje lokální adhezi z mnoha proteinu, kterou interaguje s povrchem substrátu. lim dochází k předávaní informaci mezi buňkou a substrátem a buňka reaguje spuštěním různých životních programu (proliferace. diferenciace, smrt. aj.). Pro selektivní adhezi buněk se tyto peplidy např. natisknou v různých vzdálenostech a vzorech. Podobně se využívají i P-selectin. cela kolagenová vlákna, nebo dalších proteiny extracelulární matrix, které jsou komerčně dostupné. Jinou variantou jsou např. samo-uspořádané monovrstvy organických řetězců, ktere jsou kovalentnč terminované skupinami -Cl I₃. -NI b a dalšími.

Pro adhezi buněk je kromě zprostředkujících proteinu klíčový samotný nosný substrát a jeho vlastnosti. Substrát a jeho vlastnosti dávají buňkám impuls, jak se mají buňky v daném prostředí chovat, tedy zda mají adheroval. proliferovat. diferencovat, nebo naopak ncadherovat a odumíral.

Jako substrát pro růst a uspořádávání buněk lze použít různé materiály. Podle typu aplikace mohou být jak ploché s různým stupněm drsnosti, tak mohou byt tvarovaný do složitých trojrozměrných struktur. /. hlediska jejich elektronických vlastností se typicky jedná hlavně kovy (sloučeniny titanu), dielektrika (izolanty) jako např. anorganické oxidy (SiO?. T 1()2)- nebo různé polymery (PS. ΡΜΜΛ). V současnosti se jako perspektivní považuje využiti polovodičů, u nichž lze dobře kontrolovat jejich vodivé vlastnosti, a lak např. vytvářet integrované obvody a biologické struktury na bázi jednoho materiálu. V tomto ohledu je v průmyslu nejrozšířenější křemík a jeho oxidy. Křemík má široké aplikace v mikroelektronice, optoelcktronice. íotovoltaice. xcrogralii. senzorice. aid. Mezi nove polovodičové materiály patří polovodiče se širokým pásem zakázaných energií jako např. diamant nebo karbid křemíku (SiC). Zejména v případě diamantu se jedná o unikátní spojení výborných polovodičových, mechanických, chemických a biologických vlastností. Diamant je polovodič se širokým pásem zakázaných energií (5.5 cV). takže v čistem stavuje velmi dobře elektricky izolující, l.ze ho však i dotovat příměsemi (borem, fosforem. atd.) pro dosažení ptypové nebo n-typové vodivosti. Na vodíkem zakončených površích diamantu lze navíc vygenerovat dvourozměrnou vysoce vodivou vrstvu. Díky šířce zakázaného pasu je diamant opticky transparentní, což je významné pro optickou detekci biologických procesu. Dale je velmi tvrdý, a mechanicky, chemicky i fyzikálně velmi stabilní. Má neobvykle široké elektrochemické okno (>3V), kdy jeho povrch sám chemicky nereaguje, nicméně chemické reakce umožňuje. To jc velkou výhodou pro elektrochemická měřeni, jako např. v elektrických bio-senzorcch hojné využívanou impedanční spektroskopii. Diamant jc také považován za biologicky velmi kompatibilní, neboť se jedná v zásadě o uhlík. Intenzivně se proto studují možnosti aplikace diamantu v protetice a bio-senzorech. Diamant jc možné připravit svntcticky jak objemově tak ve vrstvách na různých substrátech pomocí rozkladu methanu v plazmovém výboji.

Pro biologické aplikace jc tedy Žádoucí mít k dispozici materiál, který snadno, bez složitých postupu a bez vysokých finančních nákladu umožní řízeno uspořádávání buněk, do organizovaných struktur na povrchu, neovlivní biologii adherovaných buněk a následně zajistí správné fungování a používaní připraveného systému. Zásadním parametrem při použití libovolného substrátu je právě jeho bio-kompatibilita. zejména to. jak ovlivňuje adhezi. růst a přežívání buněk. Důležitá jc často i mechanická nebo chemická odolnost materiálu. Využiti speciálních peptidu a proteinu pro selektivní adhezi a orientaci buněk je poměrně složité a nákladné, navíc je opět třeba řešit jejich vazbu a stabilitu na povrchu nosného materiálu.

Podstata v v nálezu

Vvše uvedené nedostatky a požadavky řeší tento vynález, a to tím že jako podkladový materiál pro uspořádávání buněk se použije diamant. Výhodou a unikátní vlastností diamantu je. že / hlediska aplikací vykazuje současně výborné polovodičové, mechanické, chemické i biologických vlastnosti. Jako polovodič má o několik řádu vyšší pohyblivost volných nosičů náboje než křemík. Jedná se o uhlík, který' představuje přirozené rozhraní pro organické materiály. Navíc je chemicky odolný a dobře odolává i tvrdému záření a vysokým teplotám, [’o jsou vše velmi výhodné vlastnosti pro biologické a bio-elcktronické aplikace.

Diamant může být přírodní nebo připraven synteticky za vysokého tlaku a teploty nebo depozicí z chemických par podpořené plazmovým výbojem nebo detonací výbušnin.

Diamant muže být nominálně nedotovaný (intrinsieký) i dotovaný příměsemi, např. borem nebo fosforem. Koncentrace příměsí není omezena.

Současně povrch diamantu múze být zakončen uhlíkem nebo kyslíkem nebo vodíkem nebo dusíkem nebo halogenovými atomy (např. fluorem, chlorem) nebo jejich sloučeninami nebo jejich kombinacemi. Koncentrace atomu zakončujících povrch není omezena.

Způsob přípravy uspořádaných buněčných struktur spočívá ve spontánní adhezi buněk suspendovaných v kultivačním médiu na povrch pevné látky, kterou muže být diamant. Na povrchu této pevné látky se vytvoří hydrofilní plochy oddělené plochami hydroiobními. Pro vytvoření hvdrofobních ploch jc povrch vystaven vodíkovému plazmatu při teplotě alespoň 400°C a pro vytvoření hydrofilních ploch jc povrch vyslaven kyslíkovým radikálům vytvořených plazmovým výbojem nebo ultrafialovým zářením. Pevná látka s takto chemicky strukturovaným povrchem jc ponořena do živného média s buňkami, které mají schopnost vytvářet kostní nebo nervovou lkán. Mohou to hýl například lidské buňky generující kost, mczcnchvmální (kmenové) buňky schopné diferenciace v buňky kostní nebo neurony.

Povrch pevné látkv (diamantu) muže být navíc strukturován morlologicky. Povrchy diamantu mohou mít jednak různou povrchovou drsnost podle zvoleného režimu rustu a současně mohou bvt vytvořeny i trojrozměrné struktury.

Příklad provede n í

Křemíková podložka o tloušťce 520 pm a dolovaná borem na vodivost 0.1 (Qcm)¹ sc očistí ultrazvukem v isopropanolu po dobu 5 minut, pole sc krátce ponoří do deionizované vody a osuší se proudem suchého dusíku. Na očištěnou podložku sc v ultrazvukové lázni nanese ve vodě rozptýlený nanodiamanlovy prášek o nominální velikosti částic 5 nm.

Nanášení trvá 40 min. což vede k vytvoření 5-25 nm tenké a z až 80% spojité vrstvy nanodiamantového prášku.

Na této počáteční vrstvě je nanesena vrstva nanokrystalického diamantu (NCD) v tloušťce řádově stovek nanometru pomocí depozice z chemických par v mikrovlnné plazme. Jako plyn se použije směs 1% metanu \c vodíku. Depoziční podmínky jsou následující: tlak 3000 Pa. průtok 5x10'⁶ nf <. výkon plazmového generátoru 1200 W. teplota podložky 800%'. Výsledná tloušťka NCD vrstvy je přibližně 150 nm.

Po nanesení je vrstva vařena ve směsi kyselin (IPSOq+KNO,, směs 3:1) při teplotě 200^cC po dobu 30 min. pak opláchnuta deionizovanou vodou a osušena proudem suchého dusíku. Pote je vrstva ošetřena kyslíkovou r.f. plazmou s výkonem 300 W po dobu 3 min. Poté je povrch zakončen vodíkem ve vodíkové plazmě při teplotě 800°C po dobu 10 minut, l im je dosaženo čistého a dobře definovaného povrchu diamantu, který je zakončen vodíkem a je výrazně hydrofobní (smáČivy úhel - 90°).

Pro wtvoření mikroskopických vzoru pro uspořádávání buněk jsou na NCD vrstvě vytvořeny mikroskopické vzory pomocí 1 itografické masky (optickou nebo elektronovou litografií). S touto maskou jsou vrstvy vystaveny vysokofrekvenční kyslíkové plazmě (300 W) po dobu 3 minut. Poté je maska smyta z povrchu diamantu pomoci acetonu a vody, případně dalších roztoků. Vrstva je potom vysušena. Tímto je připravena k nasetí buněk.

Před nasazením buněk jsou NCD vrstvy sterilizovány CV zářením nebo alkoholem po dobu 10 minut. Křemíkové podložky s diamantovými vrstvami jsou umístěny na dně kultivačních misek. Buňky jsou nasazeny na diamant z koncentrovaného roztoku v typických koncentracích 1000-10000 buněk/cm2 a jsou pak zality médiem McCoy’s 5A ve kterém se nachází 0-15% Totálního hovězího séra {1^;BS) a antibiotika (penicilín, streptomycin). Buňky jsou pak dále kultivovány za standardních podmínek tkáňových kultur v inkubátoru při tepote 37°C v 5% CO? po dobu dvou dnu.

Výše uvedeným postupem byly například výtvorům 30 až 200 um široké hvdrofilní proužky zakončené kyslíkem, které byly separován} hydrofobnimi oblastmi zakončenými vodíkem. Pro demonstraci uspořádání buněk byly použita buněčná linie transformovaných lidských kostních buněk (oslcoblastu) SaOs-2. Buňky preferenčně adherovaly a množily se uspořádaly na kyslíkem zakončeném povrchu diamantu s ostrými hranicemi na H/O rozhraní. Navíc na tenkých proužcích byly buňky uspořádány do řctizkovitých struktur pode! těchto proužku.

Brums šlová využitelnost

Výše uvedeny způsob výroby uspořádaných buněčných struktur je určen pro aplikace v medicíně, farmacii, biologii i elektronice. Muže být využíván v tkáňovém inženýrství, v optických, elektronických i chemických bio-senzorech. v bio-stimuláiorech růstu a diferenciace buněk, v bio-elcktronických přenašečích signálu, pro technologii tzv. ..microarrays využitelnou v moderní proteomice a gcnomicc atd.

Claims (9)

1. Způsob přípravy uspořádaných buněčných struktur uchycením buněk na povrch pevné látky, vyznačující se tím. že jako pevná látka sc použije diamant, na jehož povrchu sc vytvoří hydrofllní plochv oddělené plochami hydrotobními. a diamant s takto chemicky strukturovaným povrchem je ponořen do živného roztoku s buňkami.

2. Způsob podle nároku 1. vyznačující se tím. že na povrchu diamantu jsou navíc vytvořeny výstupky nebo prohlubně.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2. vyznačující sc tím. že diamant sc připraví nanesením ve vodě rozptýleného diamantového prášku na očištěnou podložku v ultrazvukové lázni.

4. Způsob podle nároku 3. vyznačující se tím. že diamantový prášek je smíchán s polymerem a tento polymerní kompozit se nanáší na předdefinované plochy biografickou technikou fotorezislu nebo lift-off procesem.

5. Způsob podle nároku 3 nebo 4. vyznačující se tím. že na první diamantovou vrstvu se nanese další diamantová vrstva pomocí depozice /.chemických par v mikrovlnném plazmatu.

6. Způsob podle nároku 1 nebo 2 nebo 3 nebo 4. vyznačující sc tím. že diamant je přírodního původu.

7. Způsob podle nároku 5. vyznačující sc tím. Že diamant je dolov aný příměsemi.

8. Zpusob podle nároku 1 nebo 2 nebo 3 nebo 4 nebo 5 nebo 6 nebo 7. vyznačující se tím. že povrch diamantu je pro vytvoření hydrofobních ploch vystaven vodíkovému plazmatu při teplotě alespoň 400'1' a pro vytvoření hydrofilních ploch je povrch vystaven kyslíkovým radikálům vytvořených plazmovým výbojem nebo ultrafialovým zářením.

9. Zpusob podle nároku 1 nebo 2 nebo 3 nebo 4 nebo 5 nebo 6 nebo 7 nebo 8. vyznačující sc tím. že živné roztok obsahuje lidské buňky generující kost, mezenchymální (kmenové) buňky vytvářející kostní tkáň nebo neurony.