CZ2009687A3 - Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B - Google Patents
Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2009687A3 CZ2009687A3 CZ20090687A CZ2009687A CZ2009687A3 CZ 2009687 A3 CZ2009687 A3 CZ 2009687A3 CZ 20090687 A CZ20090687 A CZ 20090687A CZ 2009687 A CZ2009687 A CZ 2009687A CZ 2009687 A3 CZ2009687 A3 CZ 2009687A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- silybin
- mixture
- butanol
- acetylsilybin
- methyl ether
- Prior art date
Links
- SEBFKMXJBCUCAI-UHFFFAOYSA-N NSC 227190 Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2C(OC3=CC=C(C=C3O2)C2C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 SEBFKMXJBCUCAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 107
- SEBFKMXJBCUCAI-HKTJVKLFSA-N silibinin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2[C@H](OC3=CC=C(C=C3O2)[C@@H]2[C@H](C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 SEBFKMXJBCUCAI-HKTJVKLFSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- SEBFKMXJBCUCAI-WAABAYLZSA-N (2r,3r)-3,5,7-trihydroxy-2-[(2s,3s)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC([C@H]2[C@@H](OC3=CC=C(C=C3O2)[C@@H]2[C@H](C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 SEBFKMXJBCUCAI-WAABAYLZSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 108010084311 Novozyme 435 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- FDQAOULAVFHKBX-UHFFFAOYSA-N Isosilybin A Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2C(OC3=CC(=CC=C3O2)C2C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 FDQAOULAVFHKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- VLGROHBNWZUINI-UHFFFAOYSA-N Silybin Natural products COc1cc(ccc1O)C2OC3C=C(C=CC3OC2CO)C4Oc5cc(O)cc(O)c5C(=O)C4O VLGROHBNWZUINI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229940043175 silybin Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 235000014899 silybin Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 claims abstract description 12
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 9
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 1-methoxybutane Chemical compound CCCCOC CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 244000040311 Eucharis candida Species 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010841 Silybum marianum Nutrition 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N Boron trifluoride etherate Chemical compound FB(F)F.CCOCC KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 244000272459 Silybum marianum Species 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 206010067572 Oestrogenic effect Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229960004245 silymarin Drugs 0.000 description 2
- 235000017700 silymarin Nutrition 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N (1S,2S,6R,14R,15R,16R)-5-(cyclopropylmethyl)-16-[(2S)-2-hydroxy-3,3-dimethylpentan-2-yl]-15-methoxy-13-oxa-5-azahexacyclo[13.2.2.12,8.01,6.02,14.012,20]icosa-8(20),9,11-trien-11-ol Chemical compound N1([C@@H]2CC=3C4=C(C(=CC=3)O)O[C@H]3[C@@]5(OC)CC[C@@]2([C@@]43CC1)C[C@@H]5[C@](C)(O)C(C)(C)CC)CC1CC1 HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000320316 Carduus Species 0.000 description 1
- CYGIJEJDYJOUAN-UHFFFAOYSA-N Isosilychristin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2C3C=C(C4C(C3=O)(O)OCC42)C2C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 CYGIJEJDYJOUAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000320380 Silybum Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- OTXQUGSUXRBUTC-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;toluene Chemical compound CCCCO.CC1=CC=CC=C1 OTXQUGSUXRBUTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940124444 chemoprotective agent Drugs 0.000 description 1
- OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N chloroform;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.ClC(Cl)Cl OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl ether Chemical compound CC(C)(C)OC(C)(C)C AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- GVOISEJVFFIGQE-YCZSINBZSA-N n-[(1r,2s,5r)-5-[methyl(propan-2-yl)amino]-2-[(3s)-2-oxo-3-[[6-(trifluoromethyl)quinazolin-4-yl]amino]pyrrolidin-1-yl]cyclohexyl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](N(C)C(C)C)CC[C@@H]1N1C(=O)[C@@H](NC=2C3=CC(=CC=C3N=CN=2)C(F)(F)F)CC1 GVOISEJVFFIGQE-YCZSINBZSA-N 0.000 description 1
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- -1 silybin glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob rozdelení stereomeru silybinu A a B využitím jejich acetylovaných forem. Smesný 23-O-acetylsilybin, který lze získat i chemickou acetylací prírodního silybinu, se výhodne pripraví enzymovou acetylací, pri níž se na silybin pusobí lipasou Novozym 435 v prítomnosti vinylacetátu rozpušteného v terc-butylmethyletheru. Na smesný silybin-O-acetát se pusobí Novozymem 435, lipasou z Candida antarctica imobilizovanou na polyakrylátové pryskyrici, výhodne ve smesi terc-butylmethylether/n-butanol. Pri reakci dochází ke kineticky rízené enzymové alkoholýze pouze jednoho stereomeru, silybin-O-acetátu B, takže vznikne smes volného silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, které lze velmi snadno chromatograficky oddelit. Silybin A se poté uvolní enzymove katalyzovanou alkoholýzou za prídavku vyššího množství Novozymu 435 ve smesi terc-butylmethylether/n-butanol. Pro dosažení vysoké optické cistoty je možné nekteré enzymové separacní kroky opakovat, a to prípadne za upravených podmínek - napr. za použití toluenu jako rozpouštedla.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká enzymové separace diastereomerů silybinu A a B z přírodního silybinu, izolovaného z plodů ostropestřce mariánského (Silybum marianum) pomocí mikrobiální lipasy. Silybin je účinný antioxidant a chemoprotektivní látka, jeho čisté stereomery A a B se podstatně liší v biologických aktivitách. Silybin B má na rozdíl od silybinu A estrogenní účinky a je mnohem účinnější proti nádorům prostaty.
Dosavadní stav techniky
Silybin (Obr. 1) je látka bohatě obsažená v semenech ostropestřce mariánského (Silybum marianum). Spolu se svými izomery sumárního vzorce C25H12OW silydianinem, siiychristinem a isosilybininem je součástí komplexu silymarinu, který se používá k léčbě jatemího poškození a jako hepatoprotektivum (např. v léčivech Legalon, Flavobion aj.). Silybin je v medicíně dlouhodobě využíván pro své významné antioxidační a celkově cytoprotektivni účinky i pro působení vůči volným radikálům. Chemické a farmakologické vlastnosti, jakož i terapeutické využití silymarinu a jeho složek, jsou důkladně popsány v literatuře (viz Morazzoni P., Bombardeli E.: Silybum marianum /Carduus marianusf Fitoterapia, 1995, 3 - 42 a odkazy v této práci uvedené). V nedávné době se silybin začal používat také k léčbě některých nádorových onemocnění, například hyperplasie a nádorů prostaty. Tyto účinky jsou zprostředkovány interakci silybinu s buněčnými a jadernými receptory.
Přírodní silybin je prakticky ekvimoiámí směsí dvou diastereomerů, silybinu A a silybinu B (obr. 1) (D. Y.-W. Lee, Υ. Liu, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1171-1174.; N.-C. Kim, T.
N. Graf a spol., Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 1684-1689). V literatuře je popsáno, že oba diastereomery silybinu máji odlišné farmakologické účinky, konkrétně silybin B má estrogenní účinky, zatímco silybin A tuto aktivitu nevykazuje (M. Plísková a spol., Toxicology 2005, 215, 80-89). Další studie ukázala, že silybin B je značně účinnější při potlačení růstu buněk nádorů prostaty (P. R. Davis-Searles a spol., Cancer Pes. 2005, 65, 4448-4457), což má značný význam pro jeho praktické využití v léčbě těchto nemocí. Pro
-2terapeutické a jiné využití silybinu je tedy potřebné používat tzv. opticky čistý silybin, tj. jeho čistý stereoisomer, který má požadovanou aktivitu. Problémem je však oddělení silybinu A a silybinu B,
Analytická separace těchto dvou látek je dobře popsaná (T.-M. Ding a spol., J. Pharm. Biomed, Anal., 2001, 26,155-161), ovšem preparativní separace je extrémně komplikovaná a výroba v preparativnim měřítku je dosud prakticky nemožná. Jedním z hlavních problémů je velmi nízká rozpustnost silybinu v běžných rozpouštědlech (např. ve vodě přibližně 0,5 g/1, v acetonu přibližně 5 g/1) a dále značná blízkost retenčních časů obou diastereomerů při použití různých chromatografických technik. O separaci obou látek se pokusilo několik autorů, ovšem nepříliš úspěšně, T. N. Graf a spol. (Planta Med. 2007, 73, 1495-1501) popisuje pokus o preparativní separaci silybinu A a silybinu B pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie, HPLC, jde ovšem o pouhé opakování analytické separace ve větším měřítku. Sami autoři přiznávají, že takto je možné připravit gramová množství čistého silybinu A a silybinu B během několika měsíců. Nadto uvedená metoda používá drahé chromatografické materiály (derivatízovaný silikagel C-18) a hořlavá a toxická rozpouštědla (methanol, acetonitril), pro výrobu je tedy zcela nevhodná. Další metoda pro separaci silybinu A a silybinu B byla vyvinuta autory tohoto vynálezu (V. Křen, R. Gažák, K. Purchartová, P. Marhol, D. Biedermann, P. Sedmera: Chemoenzymatic preparative separation of silybin A and B, J. Mol. Catal. B: Enzymat. v tisku (2009), doi:10.1016/j,molcatb.2009.07.013). Tato metoda využívá separace glykosidů silybinu v peracetylované formě. Popsaný způsob sice umožňuje přípravu gramových množství silybinu A a silybinu B, avšak využívá chromatografie na silikagelu za použití značných množství organických rozpouštědel i silikagelu. Je proto vhodný k přípravě nejvýše jednoho gramu sloučeniny. Nadto při této metodě vznikají vedlejší produkty, které lze z finálního preparátu odstranit jen velmi obtížně, anebo vůbec.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody dosavadního stavu techniky odstraňuje způsob podle vynálezu, který spočívá v tom, že se nerozděluje směs A a B stereomerů silybinu, ale směs jejich 23Ό- acetátů. Překvapivě dochází ke kineticky řízené enzymové alkoholýze pouze jednoho stereomerů, 23-O-acetylsÍlybinu B. Obě výsledné sloučeniny, silybin B a 23-O-acetylsilybin
-3A, je možné velmi snadno chromatograficky oddělit. Čistý silybin A se poté získá řízenou enzymovou alkoholýzou odděleného 23-Cbacetylsilybinu A.
Směsný 23-O-acetylsilybin lze připravit chemickou acetylací, například rozpuštěním přírodního silybinu (směsi silybinu A a silybinu B) v tetrahydrofuranu s přídavkem acetanhydridu a etherátu fluoridu boritého (BF3-Et2O) při nízké teplotě. Reakční směs se následně neutralizuje směsí vodného nasyceného roztoku NaHCO3 s ledem, extrahuje ethylacetátem a produkt se přečistí chromatografií na silikagelu. Výhodně lze uvedený acetát silybinu připravit také enzymovou acetylací, při níž se na silybin působí za zvýšené teploty lipasou Novozym 435 v přítomnosti vinylacetátu, rozpuštěného v terobutylmethyletheru nebo acetonu a produkt se získá odfiltrováním enzymu a následným odpařením rozpouštědla. Na takto připravený směsný 23-O-acetylsilybin se působí Novozymem 435 (lipasou z Candida antarctica. mobilizovanou na polyakrylátové pryskyřici; preparát firmy Novo, Dánsko) ve směsi térc-butylmethylether/n-butanol. Při reakci dochází ke kineticky řízené enzymové alkoholýze pouze 23-O-acetylsilybinu B (viz obr. 2), takže vznikne směs volného silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, které lze velmi snadno oddělit chromatograficky. Silybin A se poté uvolní enzymově katalyzovanou alkoholýzou za přídavku vyššího množství Novozymu 435 ve směsi fórc-butylmethylether/n-butanol. Pro dosažení vysoké optické čistoty je možno některé enzymové separačni kroky opakovat případně za upravených podmínek - např. za použití toluenu jako rozpouštědla.
Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B, který zahrnuje následující kroky, v nichž:
a) se přírodní silybin jako směs silybinu A a silybinu B acetyluje na směsný 23-0- acetylsilybin,
b) na roztok vzniklého 23-O-acetylsilybinu o koncentraci 1 g/1 až 50 g/1 ve směsi rozpouštědel s obsahem n~butanoíu se působí Novozymem 435, což je lipasa z kvasinky Candida antarctica imobilizovaná na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 h za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k získání směsi volného silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A,
c) směs silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, získaná v kroku b), se rozdělí chromatografií na silikagelu, a
d) 23-O-acetylsilybin A z kroku c) se za přídavku Novozymu 435, lipasy z kvasinky Candida antarctica mobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a
I · Ϊ ·l « ’ »li»;
‘ * ti · ’ cit 4411 t ii < · “ »i i v množství 75 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, podrobí enzymově katalyzované alkoholýze ve směsi íerc-butyimethylether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, po dobu 20 až 100 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k zisku silybinu A.
Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že acetylace z kroku a) se provádí enzymaticky ve směsi Zerc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, přídavkem Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, přičemž použitý enzym se po skončení reakce odstraní filtrací a zbylý roztok se odpaří ve vakuu.
Dalším význakem tohoto vynálezu je rovněž to, že směs rozpouštědel s obsahem n- butanolu v kroku b) se zvolí se skupiny, sestávající ze soustavy Zerc-butylmethylether/n butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem a soustavy toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem.
Význakem tohoto vynálezu je také to, že v kroku b) se použitý enzym aplikuje v množství 15 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi řerc-butylmethylether/n-butanol nebo 30 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanol a v kroku d) se použitý enzym aplikuje v množství 75 % hmotnostních vůči substrátu.
Význakem předkládaného vynálezu je, že chromatografie na silikagelu z kroku c) se provádí ve směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem.
Význakem předkládaného vynálezu je i skutečnost, že silybin B, získaný v kroku c), se případně acetyiuje ve směsi zerc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, působením Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C; na získaný 23-O-acetylsilybin B se opět působí týmž enzymem o stejné aktivitě a v množství 10 45 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, za totožných reakčních podmínek ke vzniku 23-(?-acetylsilybinu A a silybinu B, přičemž posledně jmenovaný se po odfiltrování enzymu přečistí pomocí
-5chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem, k získání opticky čistého silybinu B.
Význakem tohoto vynálezu je dále skutečnost, že se enzym, použitý pro acetylace, nebo pro alkoholýzu 23-(?-acetylsilybinu B, aplikuje v množství 30 % hmotnostních vůči substrátu.
Význakem předkládaného vynálezu je skutečnost, že směsi rerc-butylmethylether/n• butanol a/nebo íerc-butylmethylether/vinylacetát se výhodně použijí v poměru složek 9:1 (objem/objem) a směs toluen/n-butanol v poměru složek 10:1 (objem/objem).
Dalším význakem předkládaného vynálezu je to, že enzymová reakce za použití Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica imobiiizované na akry tátové pryskyřici, se s výhodou provádí pří teplotě 45 °C.
Význakem předkládaného vynálezu je skutečnost, že meziprodukt 23-O-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě opticky čistých silybinů A a B, se případně recykluje navrácením do výrobního kroku d).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Struktury silybinu A, silybinu B a jejich 23-O-acetátů
Obr. 2: Preparativní metoda pro přípravu silybinu A (sloučeniny la)
MTBE = terc-butylmethylether, n-BuOH = n-butanol, d. e. = diastereomemí nadbytek (excess)
Obr. 3: Preparativní metoda pro přípravu silybinu B (sloučeniny lb)
MTBE = íerc-butylmethylether, n-BuOH - n-butanol, d.e. = diastereomemí nadbytek
Obr. 4: Optimalizovaná metoda pro přípravu silybinu A a silybinu B
MTBE ~ rerc-butylmethylether; VA = vinyl acetát, BuOH = n-butanol,
d.e. = diastereomemí nadbytek
Číselné údaje v prvním rámečku schématu udávají výchozí množství sloučeniny, v dalších rámečcích pak množství získané sloučeniny (výtěžek). Hmotnostní procenta enzymu vůči substrátu jsou uvedena u jednotlivých reakčních kroků.
Obr. 5: Údaje pro 23-O-acetylsilybin (2) z 'H NMR (399,89 MHz, DMSO-dó, 30 °C), uvedeny jsou chemický posun [ppm] a multiplicita signálu a hodnota interakční konstanty [Hz] (kurzivou), Signály obou distereomerů se buď překrývají, nebo jsou odlišeny (v tabulce uvedeno jako dva variantní signály pro jeden atom); v rámci chyby měření nelze jednoznačně přiřadit, který signál patří ke kterému diastereomeru.
Obr. 6: Údaje pro 23-O-acetylsilybin (2) z l3C NMR (100,55 MHz, DMSO-d6, 30 °C), uveden je chemický posun [ppm]. Signály obou distereomerů se buď překrývají, nebo jsou odlišeny (v tabulce uvedeno jako dva variantní signály projeden atom); v rámci chyby měření nelze jednoznačně přiřadit který signál patří ke kterému diastereomeru.
Obr. 7: Údaje pro silybin A (la) a silybin B (lb) z 'H NMR (399,95 MHz, CD3OD, 25 °C), uvedeny jsou chemický posun [ppm] a multiplicita signálu a hodnota interakční konstanty [Hz] (kurzívou).
Obr. 8: Chromatogram stanovení přírodního silybinu A a silybinu B pomoci HPLC = silybin A, 2 = silybin B; na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.
Podmínky: kolona Chromolith SpeedROD (Měrek, DE), RP-18e, 50 χ 4,6 mm, mobilní fáze CH3CN/MeOH/H2O /kys. trifluorooctová (2:37:61:0,l; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. (MeOH = methanol)
Obr. 9: Chromatogram stanovení čistého silybinu A pomocí HPLC
Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách. Podmínky: Chromolith SpeedROD (Měrek, DE), RP-18e, 50 χ 4,6 mm, mobilní fáze CH3CN/MeOH/HiO/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. (MeOH = methanol) • ‘ l I β ' »4 1 · < . 1 t ' 1 ! 1 »i * |
-7’·* ’ · ' * í li'
Obr. 10: Chromatogram stanovení čistého silybinu B pomocí HPLC
Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y Čas v minutách.
Podmínky: Chromolith SpeedROD (Měrek, DE), RP-18e, 50 x 4,6 mm, mobilní fáze CH3CN/MeOH/H2O/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm, (MeOH = methanol)
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Silybin (sloučenina 1, 40 g; 83 mmof) byl rozpuštěn ve směsi terc-
- butylmethylether/vinylacetát (1,6 1, 9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (12 g, celková aktivita 2 mkat) a směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s’1) po dobu 30 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok odpařen ve vakuu, což poskytlo 23-(9-acetylsilybin (2, 43,3 g; 99,5 %) jako bílý amorfní prášek, který byl použít v následných krocích bez nutnosti přečištění. Struktura byla potvrzena pomocí 'H a l3C NMR, viz Obr. 5 a Obr. 6
23-O-Acetylsilybín (2, 43,3 g, 0,083 mol) byl rozpuštěn v 1,6 1 směsi terc-
- butylmethylether/n-butanol (9:1, objem/objem). K roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 6,5 g a o celkové aktivitě 1,1 mkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence 650 s'1) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a směs byla separována pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Objem použité kolony byl 3 1, minimální výška sloupce 30 cm; průběh chromatografie byl sledován přímo (pouhým okem) na základě pohybu barevných pásů dělených látek. Po odpaření frakci, obsahujících podle TLC analýzy s mobilní fází chloroform/aceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 9:2:1 separovanou látku, byl získán silybin B (lb, výtěžek 28,4 g; 71 %, diastereomemí nadbytek /dále jen d.e./ ~ 72 %), který je možné použít pro další obohacení podle příkladu 3, a dále 23O-acetylsilybin A (2a, 10,7 g; 25 %, d.e. = 98 %). Takto připravený 23-O-acetylsilybin A (2a, 10,7 g; 20,4 mmol) byl rozpuštěn v 0,4 1 rozpouštědlové směsi ferc-butylmethylether/n-butanol (9:1, objem/objem) a po přidání Novozymu 435 (8 g, celková aktivita 1,34 mkat) byla směs třepána (frekvence třepání 650 s'1) po dobu 60 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin A byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem), což poskytlo opticky čistý silybin A (la, 6,6 g; 61,7 %, d.e. = 98.5%), [a]23 = + 16,33 (C = 0,3; aceton).
D
Reakce byla monitorována pomocí HPLC za následujících podmínek: kolona Chromolith SpeedROD (Měrek, DE), RP-18e, 50 χ 4,6 mm, mobilní fáze CHíCN/MeOH/EhO/kys. trifluorooctová (2/37/61/0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. Struktura silybinu A a silybinu B byla potvrzena pomocí 'H NMR, viz Obr. 7.
Hodnoty optické otáčivostí [a]o získaných sloučenin byly stanoveny na polarímetru Jasco P-2000 (při teplotě 27 °C, rozpouštědlem byl aceton).
Příklad 2
23-O-Acetylsilybin (2, 12 g; 25 mmol) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-butanol (440 ml, 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 4 g a o celkové aktivitě 0,7 mkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s’1) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen do sucha ve vakuu a směs byla rozdělena pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Objem použité kolony byl 0,75 1, min. výška sloupce 30 cm; průběh chromatografie byl sledován přímo (pouhým okem) na základě pohybu barevných pásů dělených látek. Odpařením frakcí obsahujících čisté složky (na základě TLC analýzy s mobilní fází chloroform/aceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 9:2:1) byl získán silybin B (lb, 3,3 g; 27,5 %, d.e. = 92 %) a 23-0- acetylsilybin A (2a, 8,4 g; 70 %, d.e. = 68 %).
Takto připravený silybin B (lb, 3,3 g; 6,84 mmol, d.e. = 92 %) byl znovu acetylován v poloze C-23 pomocí stejného enzymu Novozym 435 následovně: výše uvedený silybin B (lb,
3,3 g; 6,84 mmol, d.e. = 92 %) byl rozpuštěn ve směsi íerc-butylmethyiether/vinylacetát (132 ml, 9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (1 g, celková aktivita 170 μkat) a směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s1) po dobu 30 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok byl odpařen ve vakuu k získání 23-O-acetylsilybinu B (2b, 3,58 g; 99,5 %, d.e. = 92 %). Takto připravený obohacený 23-ó-acetylsÍlybin B (2b, 3,58 g; 6,82 mmol; d.e. = 92 %) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-
- butanol (150 ml, 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství
1,07 g a o celkové aktivitě 180 pkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s'1) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin B byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštedlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem), což poskytlo opticky čisty silybin B (lb, 1,71 g; 52 %, d.e. = 98,5 %) a jako vedlejší produkt 23-Ó-acetylsilybin B (2b, 1,65 g; 46 %, d.e. = 79 %). Reakce byla monitorována pomocí HPLC za použití následujících podmínek: kolona Chromolith SpeedROD (Měrek, DE), RP-18e, 50 * 4,6 mm, mobilní fáze CH3CN/MeOH/H2O/kys. trifluorooctová (2:37:61:0,1; objem/objem), průtok 0,9 ml/min při 25 °C, detekce při vlnové délce 285 nm. Silybin B byl charakterizován pomocí !H NMR (viz Obr. 7) a pomocí optické rotace: Γα]:ϊ = + 3,96 (C = 0,3; aceton).
Příklad 3
Silybin B (lb, 28,4 g; 59 mmol, d.e. ~ 72 %), získaný jako vedlejší produkt při přípravě silybinu A podle příkladu 1 byl rozpuštěn v 1,14 1 směsi terc-
- butylmethylether/vinylacetát (9:1, objem/objem), k roztoku byl přidán Novozym 435 (8,52 g, celková aktivita 1,45 mkat) a směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s’1) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací a roztok byl odpařen ve vakuu, což poskytlo 23-O-acetylsilybin B (2b, 30,87 g; 59 mmol; 99,5 %, d.e. = 72 %). Takto získaný 23-O-acetylsilybin B (2b, 30,87 g; 59 mmol; d.e. = 72 %) byl rozpuštěn ve směsi toluen/n-butanol (1,32 1, 10:1, objem/objem) a k roztoku byl přidán Novozym 435 v množství 9,26 g a o celkové aktivitě 1,57 mkat. Směs byla intenzivně třepána (frekvence třepání 650 s’1) po dobu 48 hodin při teplotě 45 °C. Po ukončení reakce byl Novozym 435 oddělen filtrací, roztok odpařen ve vakuu a surový silybin B byl přečištěn pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštedlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí (90:10:1, objem/objem). Získán tak byl opticky čistý silybin B (lb, 15,85 g; 56 %, d.e. = 97.5 %) a dále 23-O-acetylsilybin A (2a, 11,02 g; 36 %, d.e. = 68 %), který lze l t ! ’ 4 i
4 λ i * :
výhodně recyklovat a využít k přípravě čistého silybinu A podle přikladu l. Silybin B byl charakterizován pomocí !H NMR (viz Obr. 7 a pomocí optické rotace; j^y3 = + 3,96 (C =
D
0,3; aceton).
Příklad 4
Postup byl stejný jako v příkladu 1 nebo 2 s tím rozdílem, že silybin byl acetylován v poloze C-23 podle následujícího postupu: suchý silybin (1, 10 g, 20,7 mmol) byl rozpuštěn v tetrahydrofuranu (0,5 1) a roztok byl ochlazen na teplotu 0 °C. Poté byl přidán acetanhydrid (15 ml, 0,1596 mol) a BF3-Et2O (10 ml, 50% komerční roztok v diethyletheru, objem, procenta) a reakční směs byla míchána po dobu 1 hodiny při 0 QC. Následně byla reakční směs zředěna 0,5 1 nasyceného vodného roztoku NaHCOj a extrahována ethylacetátem (2 χ 1 1). Organická frakce byla sušena bezvodým Na2SO4 v množství 50 g a po filtraci odpařena ve vakuu. 23-O-Acetylsilybin (2, Obr. 1) byl čištěn chromatografií na silikagelu za použití rozpouštědlové směsi chlorofomfaceton/kyselina mravenčí v objemovém poměru 95:5:1 s výtěžkem 6,54 g, tj. 60 %. Struktura byla potvrzena pomocí ’H a l3C NMR, viz Obr. 5 a Obr. 6.
Příklad 5
Postup byl stejný jako u příkladů 1 až 4 stím, že jednotlivé postupy byly kombinovány podle schématu na Obr. 4. Vedlejší produkt 23-O-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě čistých silybinů A a B, byl recyklován a navracen do výroby, čímž se výtěžnost silybinu A zvýšila o 30 %.
Příklad 6
Postup byl stejný jako v příkladu 2, k roztoku byl ale přidán Novozym 435 v množství 2 g a o celkové aktivitě 0,35 mkat. Důsledkem použití polovičního hmotnostního poměru enzymu vůči substrátu (15 hmotn. %) ve srovnání s příkladem 2 byla velmi nízká konverze 23-O-acetylsilybinu (33 %) a pouze nevýznamné zvýšení čistoty získaného silybinu B o jedno procento (d.e. = 93 %) oproti příkladu 2, které bylo na úkor jeho výtěžku (16 % oproti 27,5 % získaných za podmínek uvedených v příkladu 2).
Příklad 7
Postup včetně množství použitého enzymu (4 g, 0,7 mkat) byl stejný jako v příkladu 2, 23-O-acetylsilybÍn by] ale rozpuštěn v alternativní rozpouštédlové směsi terč* butylmethylether/n-butanol (9:1, objem/objem). Alkoholýza proběhla poměrně neselektivně, tzn. čistota vzniklého silybinu B byla nedostačující (d.e. = 63 %) a 23-O-acetylsilybin A byl sice získán velmi čistý, ale pouze v minimálním množství (10 %, d.e. > 99 % oproti 25 % a d.e. = 98 %, dosaženým za použití polovičního množství, tedy 15 % hm, enzymu vzhledem k substrátu, v téže směsi rozpouštědel, MTBE/n-BuOH - viz příklad 1).
Výsledky příkladů 6 a 7 potvrzuji, že pouze podmínky použité v příkladech 1 až 5 jsou optimální, zaručující nejlepší výsledky separace, tedy jak vysoké konverze substrátů, tak výbornou čistotu obou diastereomerů.
Průmyslová využitelnost
Siiybin je velmi účinný antioxidant a chemoprotektant, využitelný v nutraceutikách, funkčních potravinách. Opticky čisté stereomery silybinu A a B jsou využitelné ve farmaceutickém průmyslu, například pro prevenci a léčbu některých nádorových onemocnění, jako jsou nádory prostaty a rovněž v dermatologických prostředcích.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující kroky, v nichž:a) se přírodní silybin jako směs silybinu A a silybinu B acetyluje na směsný 23-0- acetylsilybin,b) na roztok vzniklého 23-O-acetylsilybinu o koncentraci 1 g/i až 50 g/1 ve směsi rozpouštědel s obsahem n-butanolu se působí Novozymem 435, což je lipasa z kvasinky Candida antarctica imobilizovaná na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 10 až 45 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 h za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k získání směsi silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A,c) směs silybinu B a 23-O-acetylsilybinu A, získaná v kroku b), se rozdělí chromatografii na silikagelu,d) 23-O-acetylsilybin A z kroku c) se za přídavku Novozymu 435, lipasy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 75 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, podrobí enzymově katalyzované alkoholýze ve směsi terc-butylmethylether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, po dobu 20 až 100 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, k zisku silybinu A.
- 2. Způsob výroby podle nároku 1,vyznačující se tím, že acetylace z kroku a) se provádí enzymaticky ve směsi íerc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, přídavkem Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica imobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C, přičemž použitý enzym se po skončení reakce odstraní filtrací a zbylý roztok se odpaří ve vakuu.
- 3. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs rozpouštědel s obsahem n-butanolu v kroku b) se zvolí se skupiny, sestávající ze soustavy terč- butylmethylether/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem a soustavy toluen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem.
- 4. Způsob výroby podle nároku 1, vy z n a č u j í c í se t í m, že v kroku b) se použitý enzym aplikuje v množství 15 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi terč-- 13 butylmethylether/n-butanol nebo 30 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toluen/n-butanoi a v kroku d) se použitý enzym aplikuje v množství 75 % hmotnostních vůči substrátu.
- 5. Způsob výroby podle nároku 1, v y zn a č u j i c í se t í m, že chromatografie na silikagelu z kroku c) se provádí ve směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90; 10:1, objem/objem.
- 6. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že silybin B, získaný v krokuc), se případně acetyluje ve směsi íerc-butylmethylether/vinylacetát v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, působením Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica mobilizované na akrylátové pryskyřici, o aktivitě nejméně 167 pkat/g a v množství 30 až 100 % hmotnostních vůči substrátu, po dobu 10 až 48 hodin za protřepávání při teplotě od 20 do 60 °C; na získaný 23-O-acetylsilybin B se opět působí týmž enzymem o stejné aktivitě a v množství 10 f 45 % hmotnostních vůči substrátu ve směsi toiuen/n-butanol v poměru 4:1 až 12:1, objem/objem, za totožných reakčních podmínek ke vzniku 23-O-acetylsilybinu A a silybinu B, přičemž posledně jmenovaný se po odfiltrování enzymu přečistí pomocí chromatografie na silikagelu v rozpouštědlové směsi chloroform/aceton/kyselina mravenčí v poměru 90:10:1, objem/objem, k získání opticky čistého silybinu B.
- 7. Způsob výroby podle nároku 2 nebo 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že se použitý enzym aplikuje v množství 30 % hmotnostních vůči substrátu.
- 8. Způsob výroby podle nároku 1, 3, nebo 6, vyznačující se t í m, že směsi tercbutylmethylether/n-butanol a/nebo rerc-butylmethylether/vinylacetát se výhodně použijí v poměru složek 9:1 objem/objem a směs toluen/n-butanol se výhodně použije v poměru složek 10:1 objem/objem.
- 9. Způsob výroby podle nároku 1, 2 nebo 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že enzymová reakce za použití Novozymu 435, tedy lipasy z kvasinky Candida antarctica mobilizované na akrylátové pryskyřici, se s výhodou provádí při teplotě 45 °C.
- 10. Způsob výroby podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se t í m, že meziprodukt 23O-acetylsilybin A, vzniklý při výrobě opticky čistých silybinu A a B, se případně recykluje navrácením do výrobního kroku d) podle nároku 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090687A CZ302204B6 (cs) | 2009-10-21 | 2009-10-21 | Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090687A CZ302204B6 (cs) | 2009-10-21 | 2009-10-21 | Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2009687A3 true CZ2009687A3 (cs) | 2010-12-15 |
| CZ302204B6 CZ302204B6 (cs) | 2010-12-15 |
Family
ID=43332467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090687A CZ302204B6 (cs) | 2009-10-21 | 2009-10-21 | Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302204B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104710414A (zh) * | 2013-12-13 | 2015-06-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种制备2,3-顺-水飞蓟宾b的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0939135A1 (en) * | 1992-12-21 | 1999-09-01 | Duphar International Research B.V | Substantially pure hetero-bicyclic alcohol enantiomers |
-
2009
- 2009-10-21 CZ CZ20090687A patent/CZ302204B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302204B6 (cs) | 2010-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sattler et al. | The manumycin-group metabolites | |
| Hisamatsu et al. | Arabidopsides A and B, two new oxylipins from Arabidopsis thaliana | |
| Darsih et al. | Cytotoxic metabolites from the endophytic fungus Penicillium chermesinum: Discovery of a cysteine-targeted Michael acceptor as a pharmacophore for fragment-based drug discovery, bioconjugation and click reactions | |
| Okoye et al. | Two new cytochalasins from an endophytic fungus, KL-1.1 isolated from Psidium guajava leaves | |
| Gažák et al. | Large-scale separation of silybin diastereoisomers using lipases | |
| KR20000076073A (ko) | 스핑고신 유사화합물 | |
| Gažák et al. | Preparative method for isosilybin isolation based on enzymatic kinetic resolution of silymarin mixture | |
| Niedermeyer et al. | Isolation of farnesylhydroquinones from the basidiomycete Ganoderma pfeifferi | |
| EP4441024A1 (en) | Process for the synthesis and purification of cannabinoic acids and acylated derivatives thereof | |
| Salman et al. | Seven drimane-type sesquiterpenoids from an earwig-associated Aspergillus sp. | |
| Nord et al. | Protoilludane sesquiterpenes from the wood decomposing fungus Granulobasidium vellereum (Ellis & Cragin) Jülich | |
| Pyo et al. | Large-scale purification of 13-dehydroxybaccatin III and 10-deacetylpaclitaxel, semi-synthetic precursors of paclitaxel, from cell cultures of Taxus chinensis | |
| CN116120222A (zh) | 一种抗肿瘤抗病毒化合物Talachalasin A-C及其制备方法和应用 | |
| CZ2009687A3 (cs) | Zpusob výroby opticky cistých stereomeru silybinu A a silybinu B | |
| Nakajyo et al. | Arabidopside F, a New Oxyllpin from Arabidopsis thaliana | |
| Al-Lihaibi et al. | Antibacterial sphingolipid and steroids from the black coral Antipathes dichotoma | |
| Wu et al. | Targeted isolation of diketopiperazines from a deep-sea derived fungus with anti-neuroinflammatory effects | |
| KR102672137B1 (ko) | 효소적 합성방법을 통한 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 나린진 화합물의 합성방법 및 합성용 키트 | |
| Shitamoto et al. | Crotalionosides A—C, three new megastigmane glucosides, two new pterocarpan glucosides and a chalcone C-glucoside from the whole plants of Crotalaria zanzibarica | |
| MURAKAMI et al. | Studies on glycolipids. VI. New acyl-distributed glyceroglycolipids from the nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena flos-aquae f. flos-aquae | |
| Cha et al. | Two new amino acid-sesquiterpene lactone conjugates from Ixeris dentata | |
| Caufin et al. | Enzymatic acylation as an efficient tool for an easy access to specific acyl derivatives of the natural antioxidants verbascoside, teupolioside and echinacoside | |
| Maeda et al. | Euscaphinin, a New Ellagitannin Dimer from Euscaphis japonica (T HUNB.) K ANITZ | |
| Sakakura et al. | Isolation, structural elucidation and synthesis of a novel antioxidative pseudo-di-peptide, Hanasanagin, and its biogenetic precursor from the Isaria japonica mushroom | |
| KR102657359B1 (ko) | 항산화 활성 및 항염증 활성을 갖는 신규한 화합물 및 이에 따른 항산화 활성용 및 항염증용 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20181021 |