CZ2009706A3 - Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu - Google Patents

Abstract

Pri zpusobu získání strukturních a funkcních informací o proteinech, na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie, se protein s navázaným fluoroforem podrobí dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescencní mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fluoroforem ozárí laserovým svazkem, jehož svetlo je polarizované pri alespon dvou ruzných polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu, a na základe informace o lokalizaci, intenzitách a polarizaci fluorescence excitované ruznými polarizacemi excitacního laserového svazku se zjistí lokalizace a míra anisotropie absorpce a/nebo lokalizace a míra anisotropie fluorescence, a ta se pak užije ke zjištení strukturních a funkcních a vlastností proteinu. Vhodné zarízení pro získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie obsahuje modulátor (P) pro rychlou modulaci polarizace excitacního svazku (1) pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a rídicí jednotku (R), pricemž cinnost modulátoru (P) a rídicí jednotky (R) je synchronizovaná se skenováním mikroskopu (M) tak, že informace o intenzite fluorescence zaznamenávaná mikroskopem (M) je priraditelná k ruzným polarizacním stavum excitacního svazku (1) na základe znalostí casového profilu použité modulace polarizace excitacního svazku (1) vyvolané modulátorem (P).

Description

Způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie a zařízení k provádění tohoto způsobu

Oblast techniky

Vynález se obecně týká polarizační mikroskopie, konkrétně ve dvoufotonovém a vícefotonovém uspořádání. Předmětem vynálezu je způsob získávání strukturních a funkčních informací o vlastnostech proteinů, výhodně proteinů v buňkách, a zařízení k provádění tohoto způsobu. Způsob a zařízení umožňují pomocí dvoufotonové či vícefotonové polarizační fluorescenční mikroskopie určovat a monitorovat strukturu a funkcí proteinů, například i membránových proteinů, a tak sledovat i fyziologické procesy v živých buňkách.

Dosavadní stav techniky

Ke studiu proteinů v živých buňkách se, po označení studovaného proteinu nějakou opticky pozorovatelnou značkou, využívají optické metody. Často se jako tato opticky aktivní značka používají fluorescentní proteiny. Připojení fluorescentního proteinu pak umožňuje za pomoci fluorescenčního mikroskopu sledovat přítomnost a prostorovou distribuci proteinu v živých buňkách. Samotná přítomnost a lokalizace fluorescence však vesměs neumožňuje sledovat funkční aktivitu studovaného proteinu, tedy např. zda je sledovaný receptorový protein aktivován, iontový kanál otevřen či uzavřen, transportér aktivní v transportu atd.

Současné technické možnosti pozorovat funkční aktivitu proteinů v živých buňkách jsou velice omezené. Dostupné optické metody vesměs spoléhají najeden či více ze tří základních principů: 1) produkci opticky detekovatelné látky prostřednictvím aktivace transkripce, 2) FLIM (fluorescence lifetime imaging), zobrazování doby života fluorescence a 3) FRET (fluorescence resonance energy transfer), resonanční přenos energie fluorescence. Ačkoliv jsou užitečné, všechny tyto metody mají výrazná omezení. Aktivace transkripce trvá minuty až hodiny, což je pro mnoho studovaných systémů

... 2 nevhodné. FLIM vyžaduje nákladné vybavení, je málo citlivý, a neposkytuje informace, které by byly interpretovatelné z hlediska struktury proteinů. FRET vyžaduje použití dvou opticky aktivních molekul (např. fluorescentních proteinů), což často negativně ovlivňuje funkci sledovaného systému. Pozorovaný přenos fluorescenční energie (FRET signál) je pouhou frakcí celkové fluorescence a je tudíž často obtížně pozorovatelný na pozadí fluorescence dvou přítomných fluorescentních látek.

Podstata vynálezu

Nedostatky současných, výše popsaných metod, odstraňuje způsob založený na provádění dvoufotonové (případně vícefotonové) polarizační fluorescenční mikroskopie a zařízení k provádění polarizační fluorescenční mikroskopie, jež umožňují získávat strukturní informace o proteinech, např. výhodně membránových proteinech, a sledovat tak i procesy v těchto proteinech. Obecně, polarizační fluorescenční mikroskopie využívá skutečnosti, že mnoho fluoroforů (včetně fluoroforů fluorescentních proteinů) má anisotropické vlastnosti, takže jak proces absorpce světla tak proces emise fluorescence závisí na orientaci fluoroforů. Výpočty i experimenty, které původce provedl, ukázaly, že pokud je fluorescentní značka (fluorescentní protein) připojena k vhodné podpoře (k membránovému proteinu, k proteinu jenž je součástí cytoskeletu, nebo k jinak i mobilizovanému proteinu, např. uměle imobilizovanému proteinu), omezení volné rotace je často dostatečné k tomu, aby byla anisotropie fluorescence (jak absorpce, tak fluorescentní emise) za vhodného experimentálního uspořádání pozorovatelná i pokud je ímobilizační podpora (např. membrána buňky či cytoskelet) značně nerovná a spojení fluorescentní značky (fluorescentního proteinu) se zkoumaným proteinem ohebné. U fluorescentně značených rozpustných proteinů je sice orientace fluorescentní značky náhodná a anisotropické vlastnosti fluoroforů se při použití různých polarizací excitačního svazku neprojeví na množství celkové fluorescence, ale projeví se na její polarizaci a na směru emise. Anisotropické vlastnosti fluoroforů tak lze pozorovat za mnoha různých okolností a lze je využít ke sledování fyziologických procesů v živých buňkách.

Ačkoliv v principu je možné fluorescenční anisotropii pozorovat s jedno fotonovou excitací, vícefotonová excitace, konkrétně např. dvoufotonová, přináší značné výhody: vyšší citlivost absorpce na orientaci fluoroforu (u dvoufotonové excitace je funkcí čtvrté mocniny kosinu úhlu mezi polarizací excitačního svazku a přechodovým dipólovým momentem fluoroforu, oproti druhé mocnině tohoto kosinu pro jednofotonovou excitaci) a excitaci fluorescence pouze v bezprostřední blízkosti fokální roviny (kde je polarizace excitovaného svazku dobře definovaná), spojenou s dobrým vertikálním rozlišením. Tyto výhody jsou nezbytné pro úspěšné pozorování poměrně malých změn anisotropie spojených s mnoha fyziologickými procesy. Z pozorované anisotropie lze usuzovat na orientaci fluorescentní značky (fluorescentniho proteinu) v pozorovaných buňkách, na omezení volné rotace, na rychlost rotace fluorescentní molekuly (a tím i na její velikost či interakce s jinými molekulami), na změny v době života excitovaného stavu (a tím i na prostředí v blízkosti fluoroforu, včetně blízkosti vhodného akceptoru pro homo- či heteromolekulámí FRET) a další vlastnosti. Změny pozorované anisotropie lze využít ke sledování fyziologických jevů, jako např. aktivace G-proteinů, proteinových kináz, změn intracelulámích koncentrací vápníku, membránového napětí, interakcí cytopklimatických proteinů s membránami a s jinými proteiny atd.

Ve výhodném provedení vynálezu je mikroskopické zobrazení pozorovaných buněk provedeno nejméně se dvěma různými (výhodně navzájem kolmými lineárními) orientacemi polarizace polarizovaného světla, výhodně laserového svazku. Zobrazení se výhodně provádí tak, že mezi akvizicemi jednotlivých obrázků je lineární polarizace laserového svazku (tato může být předem upravena polarizačním „beamsplitterem“) otočena pomocí půlvlnové destičky, polarizátoru, nebo jiného zařízení. Obrázkem se přitom rozumí obraz objektu sledovaného v mikroskopu v digitalizované podobě, např. ve formátu TIFF, který je složen z matrice základních bodů - pixeiů. Každý pixel přitom představuje grafické znázornění naměřené intenzity fluorescence z přesně definované části vzorku během přesně definovaného časového intervalu. Odborník si je vědom toho, že data reprezentující intenzitu fluorescence mohou mít i jinou podobu, např. mohou být ve formě grafu nebo tabulky.

Pro získání informace o relativních změnách intenzit fluorescence korelujících se změnami polarizace excitačního světla se takto získané obrázky navzájem porovnají, výhodné vydělením intenzit pixelů jednoho obrázku intenzitami odpovídajících pixelů v druhém obrázku.

Vzhledem k tomu, že živé buňky se na mikroskopické úrovni pohybují, je nutné k přesnému porovnání obrázků získaných s různými polarizacemi získat kvalitní obrázky v co nejkratším intervalu. Rychlé získávání obrázků s různými polarizacemi také umožňuje sledování rychlých fyziologických procesů, jako jsou změny koncentrace vápníkových iontů nebo změny membránového napětí.

Zařízení k provádění vícefotonové, výhodně dvoufotonové, polarizační fluorescenční a vyšší harmonické mikroskopie, které umožňuje rychlé získávání obrázků s různými polarizacemi a dovoluje tak realizovat výše popsaný způsob, je dalším předmětem vynálezu. Toto zařízení je výhodně ve formě modulu, připojitelného v podstatě k jakémukoliv laserovému skenovacímu mikroskopu umožňujícímu synchronizaci s externími či interními zařízeními, a splňujícímu požadavky kvality a kvantity excitačního laserového záření a zobrazování nutné pro pozorování fluorescence biologických vzorků. Zařízení sestává z modulátoru polarizace excitačního laserového svazku, synchronizovaného pomocí řídící jednotky prostřednictvím časovačích signálů s mikroskopem. Pro potřeby měření polarizace emitované fluorescence lze toto zařízení výhodně doplnit polarizátorem či polarizačním beamsplitterem, vloženým mezi pozorovaný vzorek a detektor fluorescence.

Podstata funkce zařízení podle vynálezu spočívá v tom, že v závislosti na skenování laserového svazku mikroskopem zařízení mění polarizaci svazku tak, že jeden obrázek, tzv. směsný obrázek, získaný mikroskopem obsahuje různé části (výhodně pixely), kde každá z různých částí obrázku byla získána s jednou z nižných polarizací excitačního svazku (ve skutečnosti každá z různých částí obrázku je získána převážně s jednou z různých polarizací excitačního svazku, vzhledem k distorzi polarizace použitými optickými součástmi, a vzhledem k opožděné odpovědi detektorů, což je matematicky korigováno, jak je ukázáno dále). Tento směsný obrázek je pak rozložen na jednotlivé obrázky získané s různými polarizacemi excitačního svazku,

- 5 ' které se dále analyzují a zpracovávají stejným způsobem jako sekvence obrázků získaných postupně s různými polarizacemi.

Způsob rozkládání směsného obrázku je rovněž součástí vynálezu. Způsob rozkládáni směsného obrázku obsahuje dva základní kroky. V kroku 1 je ve směsném obrázku identifikován signál (tj. fluorescence) excitovaný jednotlivými polarizacemi (polarizace č, l, polarizace č. 2,...) excitačního svazku. V kroku 2 je signál excitovaný každou z těchto polarizací excitačního svazku použit k vytvoření samostatného obrázku. Výsledkem tak jsou dva či více obrázků, z nichž každý obsahuje pouze signál excitovaný jednou polarizací excitačního svazku.

Ve výhodném provedení, po sobě následující pixely směsného obrázku obsahují informaci o fluorescenci získanou s různými polarizacemi excitačního svazku. Takže například každý lichý pixel obsahuje informaci o fluorescenci získané s excitačním svazkem polarizovaným horizontálně, a každý sudý pixel obsahuje informaci o fluorescenci získané s excitačním svazkem polarizovaným vertikálně. Krok 1 rozkládání směsného obrázku potom sestává z identifikace lichých, respektive sudých pixelů každého řádku obrázku. V kroku 2 je potom ze všech lichých pixelů řádků směsného obrázku sestaven obrázek obsahující signál vybuzený excitačním laserovým svazkem polarizovaným horizontálně, a ze všech sudých pixelů řádků směsného obrázku sestaven obrázek obsahující signál vybuzený excitačním laserovým svazkem polarizovaným vertikálně. Každý z výsledných obrázků tak obsahuje informaci pouze o fluorescenci získané s jednou polarizací excitačního svazku.

Výhodně, krok 1 způsobu rozkládání obrázku může dále zahrnovat způsoby kompenzující opožděnou reakci detektorů či jiné nežádoucí vlastnosti mikroskopického systému. Krok 2 může výhodně zahrnovat způsoby kompenzující bělení či jiné změny pozorovaného fluoroforu. Zařízení a způsob provádění fluorescenční mikroskopie tak umožňují velmi přesné, téměř současné mikroskopické pozorování fluorescence s dvěma či několika různými polarizacemi excitačního svazku, a analýzu získaných dat pro určování a sledování struktury proteinů, interakcí proteinů (nebo jiných fluorescentních molekul) s dalšími molekulami a s okolním prostředím, a pro sledování íunkce proteinů.

Výhodné provedení zařízení podle vynálezu je popsáno dále podrobněji v příkladu 1.

Způsob podle vynálezu využívající zařízení podle vynálezu byl demonstrován sledováním zeleného fluorescentního proteinu (GFP) modifikovaného tak, aby se při exprimování, např. v buňkách linie HEK293, navázal na jejich buněčnou membránu (příklad 2).

Získání informace o struktuře proteinů bylo demonstrováno na G-proteinu s navázaným kyanovým fluorescentním proteinem (CFP), na proteinu citlivém na koncentraci vápníkových iontů, na proteinu citlivém na membránové napětí, na receptorových proteinech, a na proteinu navázaném na cytoskelet (příklad 3). Příklady ukazuji, že způsob podle vynálezu umožnil z informací o anisotropii absorpce světla fluorescentními proteiny získat kvantitativní popis orientace fluorescentních proteinů.

Způsob podle vynálezu umožňuje i sledování strukturních změn proteinů v důsledku jejich funkce, a tím i sledování funkce proteinů, což je ilustrováno na příkladu G-proteinů a proteinové kinázy C (přiklad 4).

Způsob a zařízení podle vynálezu umožňuji sledovat polarizaci fluorescence jakožto reportér interakcí fluorescentně značeného cytoplajmatického proteinu s jinými molekulami, jak je demonstrováno v příkladu 5 na cytopla$matickém žlutém fluorescentním proteinu (YFP) exprimovaném v buňkách linie HEK293.

Předmětem vynálezu tedy je konkrétně způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinu na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie, kdy se

I) ke sledovanému proteinu naváže fluorofor, kterýžto způsob dále spočívá v tom, že

II) sledovaný protein s navázaným fluoroforem se podrobí dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescenční mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fluoroforem ozáří laserovým svazkem, jehož světlo je polarizované při alespoň dvou různých polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu, III) získá se informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku, IV) informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku se užije ke zjištění lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence, a V) lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence se užije ke zjištění strukturních a funkčních a vlastností sledovaného proteinu.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se informace o lokalizaci a intenzitách fluorescence excitovaných různými polarizacemi excitačního laserového svazku získá ve formě směsného obrázku, který obsahuje v různých svých částech intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku.

Zpracovávání směsného obrázku při výhodném způsobu zahrnuje kroky, kdy

a) pro každou část směsného obrázku se identifikuje signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, a b) pro každou z použitých polarizací excitačního laserového svazku se sestaví samostatný obrázek obsahující signál excitovaný příslušnou polarizací.

Při dalším výhodném provedení různé části směsného obrázku obsahující intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku jsou pixely.

Výhodně se k excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou různých polarizacích.

Ještě výhodněji se k excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou vzájemně kolmých polarizacích.

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje směsný obrázek v lichých pixelech intenzity fluorescence excitované při první ze dvou užitých polarizací a v sudých pixelech obsahuje intenzity fluorescence excitované při druhé ze dvou užitých polarizací.

Výhodně se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanovuje tak, že se vypočte podíl mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.

Ve výhodném provedeni vynálezu je sledovaným proteinem membránový protein.

V jiném výhodném provedení je sledovaným proteinem G-protein.

V dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem protein citlivý na koncentraci vápníkových iontů.

Výhodně může být sledovaným proteinem také protein citlivý na membránové napětí.

V dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem receptorový protein.

V ještě dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem enzym.

V jiném výhodném provedení je sledovaným proteinem cytoplašmatický protein. Výhodně může být sledovaný proteinem také protein připojený k cytoskeletu. Dalším předmětem vynálezu je zařízení, a to ve formě doplňkového zařízení pro fluorescenční mikroskop, pro získání strukturních a funkčních informací o proteinu výše popsaným způsobem, kteréžto zařízení obsahuje modulátor pro rychlou modulaci polarizace excitačního svazku pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a řídící jednotku, přičemž modulátor, řídicí jednotka a mikroskop jsou synchronně propojeny tak, že informace o intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence zaznamenávaná mikroskopem je přiřadítelná k různým polarizačním stavům excitačního svazku na základě časového profilu použité modulace polarizace excitačního svazku vyvolané modulátorem.

Výhodně zařízení podle vynálezu obsahuje polarizátor vložený před detektor fluorescence v mikroskopu.

Ve výhodném provedení modulátor obsahuje Pockelsovu celu řízenou vysokonapěťovým driverem pro modulaci vysokého napětí poskytovaného zdrojem vysokého napětí v závislosti na nízkonapěťových pulsech generovaných generátorem nízkonapěťových pulsů.

Výhodně jsou řídicí jednotka, modulátor polarizace a fluorescenční mikroskop synchronně propojeny prostřednictvím taktovacího signálu akvizičního zařízení mikroskopu.

Ve výhodném provedení je řídicí jednotka ve formě počítače a obsahuje implementovaný program k automatizovanému provádění alespoň jednoho kroku výše popsaného způsobu podle vynálezu.

Ještě výhodněji řídicí jednotka ve formě počítače obsahuje implementovaný program k provádění výhodného způsobu, jak byl popsán výše, kdy se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanovuje výpočtem podílu mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizaci excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.

-9-Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Schematické znázornění principu zařízeni pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie .

Obr. 2. Příklad výhodného provedení zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie

Obr. 3. Ilustrace funkce zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie. Panel a: Experimentální uspořádání je v podstatě stejné jako na obr. 1, avšak pro ilustrační účely byl do laserového svazku vložen polarizační beamsplitter. Panel b: Obrázek homogenně fluorescentního předmětu vytvořený systémem popsaným na panelu a. Každý pixel odpovídá časovému intervalu 0.25 ps.

Obr. 4. Schematické znázornění způsobu rozkládání směsného obrázku.

Obr. 5. Savčí buňka produkující membránový protein označený fluorescentním proteinem se zřejmou fluorescenční anisotropií, zobrazená pomocí zařízení pro rychlou modulaci polarizace pro dvoufotonovou fluorescenční polarizační anisotropií. Panel a: Směsný obrázek, v němž v každém řádku liché pixely odpovídají době, po kterou byl excitační svazek polarizován vertikálně, sudé pixely odpovídají době po kterou byl excitační svazek polarizován horizontálně. Panel b: Směsný obrázek po započtení prodlevy a doznívání odpovědi detektorů. Panel c: Obrázky obsahující signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku. Panel d: Přiklad dalšího zpracování obrázků z panelu 5c.

Obr. 6. Ukázky aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování struktury proteinů. Panel a; Buňka exprimující podjednotku Goti2-YFP bez přítomnosti podjednotek Gpl a Gy2 nevykazuje anisotropií absorpce. Panel b: Buňka exprimující podjednotku Gai2-YFP v přítomnosti podjednotek ϋβΐ a Gy2 vykazuje anisotropií absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu a buněčné membrány. Panel c: Cyanový fluorescentní protein sondy vápníkových iontů lynD3cpV vykazuje anisotropií absorpce ukazující na přibližně kolmou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel d: Žlutý fluorescentní protein sondy vápníkových iontů lynD3cpV nevykazuje pozorovatelnou anisotropii absorpce, což ukazuje na neuspořádanou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel e: Cyanový fluorescenční protein, jenž je součástí fluorescentní sondy membránového napětí VSFP3.1, vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel f: Zelený fluorescentní protein připojený ke glutamátovému receptoru mGluRl vykazuje velmi silnou anisotropii absorpce ukazující na téměř rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel g: Cyanový fluorescentní protein, připojený k a2-adrenergnímu receptoru vykazuje ve srovnání s panelem e slabší anisotropii absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel h: Žlutý fluorescentní protein připojený k a2-adenosinovému receptoru vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně kolmou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel i: Zelený fluorescentní protein připojený k cytoskeletálnímu proteinu tau vykazuje anisotropii ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči orientaci mikrotubulů.

Obr. 7. Ukázka aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování fyziologických procesů (aktivace G-proteinů, aktivace proteinové kinázy C) v živých buňkách. Panel a: Buňka exprimující podjednotky Goti2YFP, G[3 1, Gy2 a adrenergní receptor v klidovém stavu vykazuje fluorescenční anisotropii. Panel b: Buňka v panelu a, po aktivaci G-proteinu nevykazuje žádnou, nebo jen velmi slabou fluorescenční anisotropii. Panel c: Buňka v panelu a, b, po skončení aktivace G-proteinu vykazuje fluorescenční anisotropii. Panel d: Buňky exprimující kinázu PKC-RFP v klidovém stavu vykazují cytoplasmatickou lokalizaci fluorescence a absenci anisotropie absorpce. Panel e: Buňky exprimující kinázu PKC-RFP po aktivaci vykazují membránovou lokalizaci fluorescence a anisotropii absorpce.

Obr. 8. Ukázka aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování interakcí cytoplasmatických proteinů s jinými molekulami. Panel a: Nezpracovaný obrázek buňky exprimující fluorescentní protein lokalizovaný do cytoplasmy. Panel b: zpracovaný obrázek z panelu a, ukazující zvýšenou depolarizaci pozorované fluorescence v blízkosti buněčné membrány.

Příklady provedení vynálezu

Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady provedení vynálezu doprovázené obrázky jsou uvedeny pro ilustraci výhodných provedeni a nikoliv jako omezení rozsahu vynálezu.

Příklad 1

Zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie

Bylo zkonstruováno zařízení k provádění polarizační fluorescenční mikroskopie v principu odpovídající základnímu schématu na obr. 1. Zařízení ve své základní podobě obsahuje jako hlavní části modulátor P polarizace excitačního světelného svazku 1 emitovaného laserem L, synchronizovaný pomocí řídící jednotky R prostřednictvím Časovačích signálů 2, 4 se skenovacím fluorescenčním mikroskopem M.

Zařízení ukázané na obr. 2, je uspořádáno tak, že vytváří excitační laserový svazek 1 s lineami polarizací modulovanou v součinnosti se skenováním mikroskopu M. Této vlastnosti bylo dosaženo použitím modulátoru polarizace P sestávajícího z Pockelsovy cely C (RTP-3-20-AR800-1000, Leysop lne., Velká Británie) pod kontrolou vysokonapěťového driveru D (model B2, BME Bergmann GmbH, SRN). Driver D moduluje vysoké napětí 6 (0 1,2 kV) poskytované zdrojem vysokého napětí Z (model

HV, BME Bergmann GmbH, SRN) v závislosti na nízkonapěťových TTL pulsech 5 generovaných generátorem pulsů G (model SP05, BME Bergmann GmbH, SRN). Synchronizace funkce modulátoru P polarizace s mikroskopem M (laserový skenovací mikroskop iMic, Till Photonics GmbH, SRN, vybavený dvoufotonovým laserem Chameleon Ultra II (Coherent lne., Velká Británie) a fotonásobičovými detektory tluorescence/druhé harmonické emise Hamamatsu) je zabezpečena řídící jednotkou R (založenou na zpožďovací G02, BME Bergmann GmbH, SRN) prostřednictvím časovačích signálů 2, 4. Jako časovači signál je využit 8MHz taktovací signál poskytovaný akvizičním modulem mikroskopu (na bázi akviziční karty PCI-6111,

National Instruments lne., USA). Popisovaný polarizační modul je spouštěn nízkonapěťovým signálem vysílaným mikroskopem M při skenování každé z řádek obrázku. K. nastavení frekvence změn polarizace excitačního svazku 1 je využívaná informace o trvání akvizice jednotlivého pixelu mikroskopem M poskytovaná softwarem ovládajícím mikroskop M. Mikroskopická data 3 obsahující zejména mikroskopické obrázky a doprovodné informace o době trvání akvizice jednotlivých pixelů, době prodlevy mezi jednotlivými řádkami, pozici vzorku a laserového svazku, excitační vlnové délce a intenzitě jsou zpracovávána řídící jednotkou R. V tomto uspořádání Pockelsova cela C mění polarizaci excitačního laserového svazku 1 tak, že po sobě jdoucí pixely zobrazené mikroskopem M obsahují fluorescenci excitovanou různými polarizacemi excitačního svazku L

Funkce popsaného zařízení (obr. 2) k provádění polarizační fluorescenční mikroskopie je ilustrována na obr. 3. Pro znázornění funkce zařízení byl do excitačního svazku 1 po průchodu polarizačním modulátorem P vložen polarizační beamsplitter B, který odráží světlo polarizované horizontálně mimo mikroskop M (obr. 3a). Polarizace excitačního svazku 1 byla střídavě horizontální a vertikální, s periodou 2,5 gs. Doba akvizice jednotlivého pixelu mikroskopem byla 0,25 ps. Obr. 3b představuje zobrazení '!£> · -y! /‘iftt·· homogenně fluorescentního předmětu (destičky z fluorescentně upravené uměJe hmoty) systémem popsaným na obr. 3a. Patrná je synchronizace změn polarizace laserového svazku 1 s frekvencí skenování mikroskopu M. Pokud by byly použity detektory fluorescence bez zpoždění a doznívání odpovědi, obrázek by obsahoval homogenně bílé a černé pruhy. Viditelné odstíny šedé jsou způsobené zpožděním a dozníváním odpovědi detektorů mikroskopu (tj. fluorescence excitovaná vertikálně polarizovaným laserovým svazkem je detektory reportována i během doby, kdy je laserový svazek polarizovaný horizontálně). Zpoždění a doznívání odpovědi detektorů je typické pro citlivé detektory na bázi fotonásobičů, které se často používají jako detektory fluorescence u mikroskopů.

Přiklad 2

Získání strukturních a funkčních informací o modifikovaném proteinu GFP na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie užitím zařízení z příkladu 1

Zařízením podle příkladu 1 se získal obrázek, který obsahuje různé části (pixely) získané s různou polarizací excitačního laserového svazku, tzv. směsný obrázek. Tento směsný obrázek byl pak rozložen na jednotlivé obrázky získané s různými polarizacemi excitačního svazku způsobem, který je schematicky znázorněn na obr. 4. Výsledek je ilustrován na obr. 5. Při rozkládání směsného obrázku byla zohledněna zpožděná odezva detektorů a další faktory. Zohlednění se provádělo tak, že časový profil odezvy detektorů byl předem proměřen a bylo zjištěno, jaká percentuální část signálu (fluorescence) vybuzeného během doby excitace jednou polarizací je detektorem reportována během akvizice daného pixelu, a jaká část je reportována později. Při rozkládání směsného obrázku se potom spočítalo z intenzity prvního pixelu, jaké množství signálu s první polarizací excitace je obsaženo v následujících pixelech. Signál prvního pixelu byl potom o toto množství navýšen, zatímco signál dalších pixelu byl o příslušné množství snížen. Takto se postupovalo pixel po pixelu.

Směsný obrázek je demonstrován na obr. 5a, kde je buňka linie HEK293, do níž byl vložen gen kódující zelený fluorescentní protein (GFP) upravený tak, aby produkovaný protein byl připojen k buněčné membráně v dobře definované orientaci (doubly-lipidated.eGFP, připraven dr. Gero Miesenboeckem, Oxford University, Velká Británie). Tato buňka byla zobrazena dvoufotonovým laserovým skenovacím mikroskopem iMic (Till Photonics GmbH, SRN), který byl vybaven výše popsaným prototypem zařízení podle vynálezu (obr. 2). V každém řádku obrázku byly liché pixely zaznamenány v době, kdy byl laserový excitační svazek polarizován vertikálně, sudé pixely byly zaznamenány v době, kdy byl laserový excitační svazek polarizován horizontálně. Polarizace laserového svazku se měnila s periodou 2,5 ps.

V kroku 1 způsobu rozkládání směsného obrázku byl pro každou část obrázku identifikován signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku. Pokud by byla odezva detektorů fluorescence okamžitá, byl by signál (fluorescence) excitovaný vertikálně polarizovaným laserovým svazkem přítomen pouze v lichých pixelech každého řádku směsného obrázku. Odezva použitých detektorů (fotonásobičů) byla však obecně opožděná a doprovázená dozníváním, takže fluorescence produkovaná laserovým svazkem jedné polarizace produkovala odezvu detektorů i po změně polarizace excitačního svazku. Z měření odezvy detektorů

V použitých v tomto příkladu vyplynulo, že přibližně 3 L% fluorescence excitované během akvizice jednoho pixelu bylo detektory reportováno během akvizice následujícího pixelu mikroskopem.

Pro identifikování signálu (fluorescence) excitované jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku se postupovalo pro každý řádek směsného obrázku φ* následovně. Hodnota intenzity prvního pixelu (např. 1000) byla zvýšena o 31;% (tj. o 310, na 1310). Hodnota druhého pixelu (např. 900) byla o tuto hodnotu snížena (na 590). Hodnota druhého pixelu byla následně zvýšena o 31.% (tj. o 183, na 773). Hodnota třetího pixelu (např. 1050) byla o tuto hodnotu snížena (tj. na 867), načež byla o 31.% zvýšena (tj. o 269, na 1136). Takto se postupovalo pixel po pixelu pro celý řádek směsného obrázku, a pro všechny řádky. Výsledkem je obrázek (viz obr. 5b), ve kterém v každém řádku liché pixely obsahují signál excitovaný vertikálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem, a sudé pixely obsahují signál excitovaný horizontálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem. Tímto způsobem byl identifikován (tj. kvantifikován a prostorově lokalizován) signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, což je obsahem kroku 1 způsobu rozkládání směsného obrázku.

V kroku 2 způsobu rozkládání směsného obrázku byl pro každou ze dvou použitých polarizací (vertikální a horizontální) excitačního laserového svazku vytvořen ze signálu excitovaného příslušnou polarizací excitačního svazku samostatný obrázek (obr. 5c), a to tak, že obrázek příslušející vertikální polarizaci excitačního svazku (obr. 5c, napravo) byl sestaven z lichých pixelů (obsahujících signál excitovaný vertikálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem), a obrázek příslušející horizontální polarizaci excitačního svazku (obr. 5c, nalevo) byl sestaven ze sudých pixelů (obsahujících signál excitovaný horizontálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem).

Obrázky takto získané byly využity k měření či sledování anisotropie pozorované fluorescence. Byl vypočten podíl mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku. Tento výpočet byl proveden tak, že pro každou pozici pozorovaného vzorku, intenzita fluorescence excitované s vertikální polarizaci laserového svazku byla vydělena intenzitou fluorescence excitovanou s horizontální polarizací laserového svazku, a hodnoty logaritmu tohoto podílu byly prezentovány ve formě obrázku, kde odstín šedé vyjadřuje velikost tohoto logaritmu (obr. 5d). Převaha světlých odstínů v částech obrysu buňky orientovaných horizontálně a převaha tmavých odstínů v částech buňky orientovaných vertikálně (nebo naopak) znamenají přítomnost anisotropie v absorpci fluoroforů. Přítomnost a velikost této anisotropie pak vypovídá o orientaci fluoroforů vůči buněčným strukturám, jako je např. buněčná membrána, a lze ji využít ke sledování biologických procesů.

Výhodně lze zobrazeni také provádět tak, že pro každou pozici pozorovaného vzorku je logaritmus podílu intenzit fluorescence excitovaných jednotlivými polarizacemi laserového svazku prezentován ve formě obrázku, kde velikost tohoto logaritmu určuje barvu na barevné škále (např. červená-žlutá-zelená) a celková intenzita naměřené fluorescence určuje jas. Převaha jedné barvy v horizontálně orientovaných částech obrysu buňky a převaha druhé barvy ve vertikálně orientovaných částech obrysu buňky pak znamenají přítomnost anisotropie v absorpci íluoroforem.

Přiklad 3

Sledování a určování struktury proteinů

Způsob dvoufotonové polarizační mikroskopie a zařízení podle vynálezu byly využity pro určování a sledování struktury G-proteinů, struktury proteinu citlivého na koncentraci vápníkových iontů, proteinu citlivého na membránové napětí, receptorových proteinů a proteinu navázaném na cytoskelet (Obr. 6).

·

Příklad 3a - struktura G-proteinů

G-proteiny typicky sestávají ze tří podjednotek, Ga, G[3. a Gy, které spolu v živých buňkách mohou interagovat. Funkcí G-proteinů je přenos a zesílení signálů z různých receptorových proteinů. Schopnost opticky přímo sledovat aktivaci G-proteinů způsobenou aktivací daného receptorového proteinu je využitelná pro lepší porozumění mechanismům buněčné signalizace, ale také pro objevování farmakologicky aktivních látek působících na G-proteiny nebo na receptorové proteiny s nimi spřažené.

Pozorování na podjednotkách Gai2-CFP, Οβί a Gy2G ukázala, že kyanový fluorescentní protein (CFP) připojený kpodjednotce Gai2 nevykazuje pozorovatelnou fluorescenční anisotropii, pokud je tato podjednotka exprimována v savčích buňkách bez exprimace obou zbývajících podjednotek, Gpl a Gy2 (obr. 6a). Nejpravděpodobnějším vysvětlením nepřítomnosti anisotropie je neuspořádaná orientace přítomných molekul CFP. Tato může být způsobena neuspořádanou orientací samotné Ga podjednotky.

Pokud jsou však všechny tri podjednotky (Gai2-CFP, Οβί a Gy2) exprimovány v jedné buňce současně, fluorescence CFP vykazuje pozorovatelnou anisotropii (obr. 6b), která se v obrázcích zpracovaných obdobně jako obr. 5 projevila jako převaha tmavých odstínů ve vertikálně orientovaných částech obrysu buňky a převaha světlých odstínů v horizontálně orientovaných částech obrysu buňky. Tato převaha fluorescence excitované horizontálně polarizovaným světlem oproti fluorescenci excitované vertikálně polarizovaným světlem ve vertikálně orientovaných částech obrysu buňky (a naopak) ukazuje, že dipolový moment excitace fluoroforu (přibližné shodný s dlouhou osou fluoroforu) je v živých buňkách orientován přibližně rovnoběžně s buněčnou membránou.

Popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie tedy bylo zjištěno, že v nepřítomnosti podjednotek όβ a Gy je orientace fluorescentního proteinu připojeného k Gai2 pravděpodobné neuspořádaná. V přítomnosti podjednotek Οβί a Gy2 je orientace fluorescentního proteinu naopak do značné míry uspořádaná, a to tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžná s buněčnou membránou. Způsob podle vynálezu tak umožnil pozorovat interakci mezi Gai2-CFP, ϋβΐ a Gy2, a dedukovat informace o struktuře proteinů v živých buňkách. Popsaným způsobem lze také monitorovat exprimování podjednotek G[31 a Gy2, které nejsou fluorescentně značené, ale jejichž současná přítomnost se projeví pozorovatelnou anisotropií fluorescence CFP konstruktu Gai2-CFP. Popsaným způsobem lze i sledovat změny ve struktuře a interakcích mezi jednotlivými podjednotkami, které jsou způsobeny aktivací/inaktivací, tj. funkcí sledovaného G-proteinu (viz příklad 4).

Příklad 3b - struktura proteinu citlivého na vápníkové ionty *

Cytoplasmatická koncentrace vápníkových iontů je jednou z nejdůležitějších známek aktivace různých buněčných signálních kaskád. Ke sledování koncentrace vápníkových iontů bylo vyvinuto množství sond na bázi fluorescentních proteinů. Jednou z nich je i lynD3cpV. Tato sonda funguje na základě FRET mezi cyanovým fluorescentním proteinem, jenž je připojen k buněčné membráně, a žlutým fluorescentním proteinem (‘circularly permuted Venus‘, cpV). Oba fluorescentní proteiny jsou navzájem spojeny doménou citlivou na koncentraci vápníkových iontů. Při změně koncentrace vápníkových iontů dochází ke strukturním změnám v této doméně, jež se projeví změnami vzájemné orientace fluorescentních protienů, a tím i ve změnách FRET.

Způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu bylo zjištěno, že cyanový fluorescentní protein je v klidovém stavu připojen k buněčné membráně tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžná s membránou (obr. 6c). Žlutý fluorescentní protein nejeví pozorovatelnou anisotropickou absorpci (obr. 6d), a je tudíž v klidovém stavu pravděpodobně v neuspořádané orientaci. Změny koncentrací vápníkových iontů se projeví změnami orientací těchto fluorescentních proteinů, které jsou pozorovatelné popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie.

-- 18 Příklad 3c - struktura proteinu citlivého na membránové napětí

Vzruchy jsou v nervových buňkách přenášeny prostřednictvím změn elektrického napětí na buněčné membráně. K optickému sledování změn napětí bylo vyvinuto několik různých sond na bázi fluorescentních proteinů. Jedním z nich je i konstrukt VSFP3.1 vyvinutý T. Knopfelem (RIKEN Institut, Japonsko). VSFP3.1 obsahuje cyanový fluorescentní protein, jehož orientace se při změně membránového napětí změní. Popsaným způsobem dvoufotonové fluorescenční mikroskopie bylo zjištěno, že fluorescentní protein v konstruktu VSFP3.I je v klidovém stavu v buňkách orientován tak, že dlouhá osa fluoroforu je orientována přibližně rovnoběžně s buněčnou membránou (obr. 6e). Změny membránového napětí se projeví změnami struktury VSFP3.1, které jsou pozorovatelné způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu.

Příklad 3d - struktura receptorových proteinů

Vlastnosti extracelulámího prostředí, včetně přítomnosti molekulárních signálů vysílaných jinými buňkami, jsou v buňce detekovány prostřednictvím membránových receptorových proteinů. Tyto proteiny reagují na přítomnost příslušné látky ve vnějším T prostředí konformační změnou, která se projeví na vnitřní straně cytoplajlmatické membrány. Existuje velké množství konstruktů skládajících se z receptorového proteinu označeného fluorescentním proteinem, např metabotropní glutamátový receptor mGluRl-GFP, ct2-adrenergní receptor-CFP, a2-adenosinový receptor-YFP. Popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie bylo zjištěno (obr. 6ft6h), že fluorofor GFP v mGluRl-GFP je orientován téměř rovnoběžně s buněčnou membránou; fluorofor CFP v a2-adrenergním receptoru-CFP je také přibližné rovnoběžný s buněčnou membránou, ale ne do takové míry jako GFP v mGluRl-GFP. Fluorofor v a2-adenosinovém receptoru-YFP je přibližně kolmý k buněčné membráně. Aktivace těchto, ale i dalších receptorových proteinů se projeví konformačními změnami, které jsou, při změnách orientace fluorescentních proteinů, pozorovatelné způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu.

Příklad 3e - struktura cytoskeletálnich proteinů

Sledování strukturních vlastností proteinů způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu není omezeno jen na membránové proteiny, ale lze je provádět i u proteinů navázaných na jinou podporu, např. na cytoskeleton. Pozorování provedené popsaným způsobem na zeleném fluorescentním proteinu připojeném prostřednictvím peptidového linkeru k proteinu tau, jenž je přirozenou součástí mikrotubulů, ukázalo (obr,6i), že dlouhá osa fluoroforu tohoto zeleného fluorescentního proteinu je orientována přibližně rovnoběžně k orientaci mikrotubulů.

Příklad 4

Sledování funkce proteinů prostřednictvím sledování změn anisotropie.

Funkce proteinů v živých buňkách je často doprovázena změnami ve struktuře proteinů, v interakcích s jinými proteiny, či změnami v buněčné lokalizaci proteinů. Všechny tyto druhy změn se mohou projevit změnami pozorovatelných anisotropických vlastností fluorescentních značek, jimiž jsou tyto proteiny označeny. Tudíž popsaný způsob získávání strukturních informací pomocí polarizační fluorescenční mikroskopie lze využít i ke sledování funkce proteinů. Toto je ukázáno na přikladu sledování funkce G-proteinů a funkce proteinové kinázy C (PKC).

Příklad 4a - sledování funkce G-proteinu během aktivace noradrenalinem

Dle současného stavu poznání existují v buňce v klidovém stavu G-proteiny typicky jako komplexy sestávající ze tří podjednotek (Ga, Gp a Gy). Po aktivaci receptoru, který s G-proteiny interaguje, agonistou dochází k disociaci či reorientaci podjednotek G-proteinů. Po ukončeni aktivace dochází k opětovné formaci trimemího komplexu podjednotek. S tím souhlasí výsledky v příkladu 3a, kdy bylo popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie zjištěno, že v nepřítomnosti interakcí s podjednotkami Gp a Gy je orientace fluorescentního proteinu připojeného k Gai2 pravděpodobně neuspořádaná. V přítomnosti interakcí s podjednotkami Gpl a Gy2 je orientace tohoto fluorescentního proteinu připojeného k podjednotce Gai2 naopak do značné míry uspořádaná, a to tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžná s buněčnou membránou.

Velikost pozorované anisotropie absorpce tedy vypovídá o interakci podjednotky Gai2 s podjednotkami Gpl a Gy2, a tím i o funkci těchto G-proteinů. Na obr. 7 je ilustrována schopnost způsobu podle vynálezu vizualizovat existenci trimemího komplexu Gai2-CFP, Gpl a Gy2 před aktivaci přítomných receptorů (obr. 7a), disociaci či reorganizaci tohoto komplexu způsobenou aktivaci přítomných adrenergních receptorů noradrenalinem (obr. 7b), a opětovnou formaci tohoto komplexu po vymytí noradrenalinu (obr. 7c), tj. změny funkčního stavu pozorovaného G-proteinu.

Příklad 4b - sledování aktivace enzymu

Enzymy v buňkách katalyzují chemické reakce. Příkladem enzymů jsou tzv. kinázy. jež v buňce katalyzují fosforylačni reakce. Zástupcem kináz je proteinová kináza C (PKC). Tato kináza jev klidovém stavu přítomna v cytoplasmě buňky. Po aktivaci prostřednictvím různých signálních kaskád dochází k přesunu PKC k buněčné membráně a její aktivaci. Schopnost popsaného způsobu dvoufotonové polarizační mikroskopie pozorovat aktivaci konstruktu PKC označeného červeným fluorescentním proteinem (RFP) je ilustrována na obr. 7. V klidovém stavu je PKC lokalizována převážně v cytoplasmě, orientace jejích molekul je náhodná, a anisotropie dvoufotonové absorpce není pozorovatelná (obr 7d). Po aktivaci zvýšením teploty dochází k přesunu PKC k buněčné membráně, a tím i k omezení přítomných orientací RFP a k projevení anisotropie (obr 7e). V aktivovaném stavu PKC-RFP je dlouhá osa fluoroforu orientována přibližně kolmo k buněčné membráně. Způsob dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu tak umožňuje sledování funkce PKC.

Příklad 5

Sledování anisotropie fluorescence jako reportéru interakcí íluorescentně značeného cytoplašmatického proteinu s jinými molekulami

Způsob polarizační mikroskopie a zařízení podle vynálezu byly použity ke sledování anisotropie emitované fluorescence cytoplašmatického žlutého fluorescentního proteinu (YFP) exprimovaného v buněčné linii HEK293 (obr. 8). Experimentální uspořádání bylo jako na obr. 2, avšak před detektor fluorescence byl vložen polarizátor, orientovaný horizontálně. Polarizace excitačního svazku byla mezi akvizicí po sobě jdoucích pixelů alternována mezi horizontální a vertikální, což vedlo k přítomnosti alternujících světlejších a tmavších sloupců ve směsném obrázku získaném mikroskopem (obr 8a). Tento směsný obrázek byl pak zpracován obdobně jako v příkladech 2 a 3, a výsledek zobrazen tak, že tmavé odstíny odpovídají nižšímu stupni polarizace detekované fluorescence a světlé odstíny odpovídají vyššímu stupni polarizace detekované fluorescence (obr 8b). Stupeň polarizace emitované fluorescence závisí na době života excitovaného stavu fluoroforu (a tím i na prostředí v blízkosti fluoroforu), na rychlosti rotace fluorescentní molekuly (a tím i na její velikosti či interakcích s jinými molekulami) a na dalších jevech jako je homomolekulámí FRET či omezení volné rotace. Pozorovaný nižší stupeň polarizace (tj. vyšší depolarizace) detekované fluorescence v blízkosti buněčné membrány ukazuje na odlišné prostředí v blízkosti buněčné membrány a na přítomnost interakcí fluorescentního proteinu s molekulami nacházejícími se v buněčné membráně nebo v její bezprostřední blízkosti.

Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým provedením vynálezu, která jsou zde popsána. I tyto ekvivalenty spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinu na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie, kdy se í) ke sledovanému proteinu naváže fluorofor. vyznačující se tím, že lí) sledovaný protein s navázaným fluoroforem se podrobí dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescenční mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fluoroforem ozáří laserovým svazkem, jehož světlo je polarizované při alespoň dvou různých polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu,

   III) získá se informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku,

   IV) informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku se užije ke zjištění lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence, a

   V) lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence se užije ke zjištění strukturních a funkčních a vlastností sledovaného proteinu.
2. 2. Způsob podle nároku l _f vyznačující se tím, že informace o lokalizaci a intenzitách fluorescence excitovaných různými polarizacemi excitačního laserového svazku se získá ve formě směsného obrázku, který obsahuje v různých svých Částech intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku.
3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím. že zpracovávání směsného obrázku zahrnuje kroky, kdy

   a) pro každou část směsného obrázku se identifikuje signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, a

   b) pro každou z použitých polarizací excitačního laserového svazku se sestaví samostatný obrázek obsahující signál excitovaný příslušnou polarizací.

   PV 2009-706: pozměněné nároky 15.3.2010
4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3 vyznačující se tím, že různé části směsného obrázku obsahující intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku jsou pixely.
5. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že se k excitaci použije laserový svazek., jehož světlo je polarizované při dvou různých polarizacích.
6. 6. Způsob podle nároku 5 .vyznačující se tím, že se k excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou vzájemně kolmých polarizacích.
7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6 vyznačující se tím, že směsný obrázek obsahuje v lichých t

   pixefech intenzity fluorescence excitované při první ze dvou užitých polarizací a v sudých pixelech obsahuje intenzity fluorescence excitované při druhé ze dvou užitých polarizací.
8. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 vyznačující se tím, že se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanoví tak, že se vypočte podíl mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.
9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že sledovaný protein je membránový protein.
10. 10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že sledovaný protein je G-protein.
11. 11. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein citlivý na koncentraci vápníkových iontů.
12. 12. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein citlivý na membránové napětí.

    PV 2009-706: pozměněné nároky 15.3.2010
13. 13. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že sledovaný protein je receptorový protein.
14. 14. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že sledovaný protein je enzym.
15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8. vyznačující se tím, že sledovaný protein je cytoplasmatický protein.
16. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein připojený k cytoskeletu.
17. 17. Zařízení_zve formě doplňkového zařízení pro fluorescenční mikroskop (M)_zpro získání strukturních a funkčních informací o proteinu způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16. vyznačující se tím, že obsahuje modulátor (P) pro rychlou modulaci polarizace excitačního svazku (1) pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a řídící jednotku (R), přičemž modulátor (P), řídicí jednotka (R) a mikroskop (M) jsou synchronně propojeny tak, že informace o intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence zaznamenávaná mikroskopem (M) je přiřaditelná k různým polarizačním stavům excitačního svazku (1) na základě časového profilu použité modulace polarizace excitačního svazku (1) vyvolané modulátorem (P).
18. 18. Zařízení podle nároku 17 vyznačující se tím, že obsahuje polarizátor vložený před detektor fluorescence v mikroskopu (Μ), γ
19. 19. Zařízení podle nároku 17 nebo 18 vyznačující se tím. že modulátor (P) obsahuje Pockelsovu celu (C) řízenou vysokonapěťovým driverem (D) pro modulaci vysokého napětí (6) poskytovaného zdrojem (Z) vysokého napětí v závislosti na nízkonapěťových pulsech (5) generovaných generátorem (G) nízkonapěťových pulsů.

    PV 2009-706: pozměněné nároky 15.3.2010
20. 20. Zařízení podle nároku 17 až 19 vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R), modulátor (P) polarizace a fluorescenční mikroskop (M) jsou synchronně propojeny prostřednictvím taktovacího signálu (2) akvizičního zařízení mikroskopu (M).
21. 21. Zařízení podle nároku 20 vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R) je ve formě počítače a obsahuje implementovaný program k automatizovanému provádění alespoň jednoho kroku způsobu podle kteréhokoliv z nároků l až 16.
22. 22. Zařízení podle nároku 21 /vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R) ve formě počítače obsahuje implementovaný program k provádění způsobu podle nároku 8.