CZ2011843A3 - Vektor pro expresi proteinu v rostlinách a jeho pouzití - Google Patents
Vektor pro expresi proteinu v rostlinách a jeho pouzití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2011843A3 CZ2011843A3 CZ20110843A CZ2011843A CZ2011843A3 CZ 2011843 A3 CZ2011843 A3 CZ 2011843A3 CZ 20110843 A CZ20110843 A CZ 20110843A CZ 2011843 A CZ2011843 A CZ 2011843A CZ 2011843 A3 CZ2011843 A3 CZ 2011843A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- plant
- production
- vector
- plants
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 63
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 86
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 claims description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 15
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 claims description 8
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 2
- 241000710007 Potexvirus Species 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 3
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 claims 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 abstract description 8
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 235000002567 Capsicum annuum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108700012133 Lycopersicon Pto Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101900259239 Potato virus X Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000001511 capsicum annuum Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Vektor pro expresi proteinu v rostlinách, který zahrnuje dve komponenty: a) produkcní rostlinný virus, v jehoz genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro protein nebo peptid, který bude v rostline exprimován a b) pomocný rostlinný virus, který není príbuzný s produkcním rostlinným virem, a v jehoz genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro obalový protein produkcního viru. Zpusob pouzití tohoto vektoru pro získávání proteinu v rostlinách expresí, pricemz nejprve se infikuje první rostlina produkcním a pomocným rostlinným virem a potom se z první rostliny extrahují chimerní virové cástice a pouzijí se k mechanické inokulaci druhé, produkcní rostliny.
Description
Předložený vynález se týká vektoru pro biologicky bezpečnou expresi rekombinantních proteinů v rostlinách, který zahrnuje dvě komponenty: a) produkční rostlinný virus, v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro protein nebo peptid, který bude v rostlině exprimován, a b) pomocný rostlinný virus, který není příbuzný s produkčním rostlinným virem, a v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro obalový protein produkčního viru. Dále se předložený vynález týká způsobu použití tohoto vektoru pro získávání proteinu v rostlinách expresí, přičemž nejprve se infikuje první rostlina produkčním a pomocným rostlinným virem a potom se z první rostliny extrahují chimérické virové částice a použijí se k mechanické inokulaci druhé, produkční rostliny.
Dosavadní stav techniky
Expresní vektory založené na rostlinných virech se dnes velmi často používají pro expresi rekombinantních proteinů s vysokou přidanou hodnotou v rostlinách, a to jak v laboratorním měřítku tak stále častěji i v poloprovozním či komerčním měřítku. Současné metody však mají řadu nedostatků. Mezi ně patří například nutnost infikovat rostlinu buď pomocí A. tumefaciens nebo kompletním rekombinantním rostlinným virem.
Výhodou použití A. tumefaciens k iniciaci virové infekce je to, že lze snadno použít i viry zbavené genu pro vlastní obalový protein. Takové viry se v rostlině šíří pouze jako volná RNA a nejsou tudíž snadno přenosné ani mechanicky ani přirozeným vektorem. To je vhodné pro biologickou bezpečnost. Avšak použití agrobakteria má i mnohé nevýhody.
Pokud má být výsledný produkt použit farmaceuticky, jsou nevýhodou velká množství zbytků bakteriálních buněk (endotoxin), která je nutné komplikovaně a nákladně odstraňovat. Další nevýhodou je relativní náročnost a nákladnost vakuové infiltrace ve velkém měřítku (tisíce až miliony jednotlivých rostlin), i když samotná příprava • ♦ · · • · · inokula ve formě bakteriální suspenze je laciná. Další nevýhodou použití agrobakteria je skutečnost, že účinná agroinfiltrace probíhá pouze v některých rostlinných druzích, zejména v N. benthamiana, zatímco agroinfiltrace jiných rostlinných druhů je buď velmi neefektivní, nebo zcela nemožná.
Naproti tomu celý technologický postup mechanické inokulace rostlinným virem je jednoduchý a laciný a ověřeným způsobem známým ze stavu techniky jej lze provést běžným zemědělským zařízením pro postřik rostlin. Nevýhodou použití kompletního rostlinného viru, do jehož genomu byl navíc vložen gen pro farmaceutický protein, je, že genom má většinou jen velmi malou a omezenou kapacitu pro velikost vkládaného genu. Je proto snadné vložením dalšího genu tuto kapacitu překročit, což vede ke genetické nestabilitě nebo dokonce k nefunkčnosti viru. U stabilních virů pak hrozí i jejich nekontrolované šíření - virus se v rostlině pohybuje a akumuluje ve formě kompletních virových částic, jejichž genom navíc kóduje i rekombinantní protein. Tyto částice jsou pak většinou mechanicky (nebo dokonce i přirozeným vektorem například hmyzem) přenosné stejně, jako původní virus.
Proto existuje potřeba získat rostlinný virový vektor, který umožní jednoduchou a ekonomickou inokulaci libovolného druhu rostliny ve velkém měřítku bez použití A. tumefaciens a to tak, aby se rekombinantní virus nemohl z inokulovaných rostlin dále nekontrolované šířit.
Předmět vynálezu
Vynález popisuje vektor pro biologicky bezpečnou expresi rekombinantních proteinů v rostlinách zahrnující dvě komponenty: a) produkční rostlinný virus, v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro protein nebo peptid, který bude v rostlině exprimován, a b) pomocný rostlinný virus, který není příbuzný s produkčním rostlinným virem, a v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro obalový protein produkčního viru.
Produkční virus podle vynálezu je rostlinný virus s pozitivním ssRNA genomem. Ve výhodném provedení vynálezu je produkční rostlinný virus odvozen od Tobamoviru a v ještě výhodnějším provedení vynálezu je produkční rostlinný virus odvozen od Viru ·*· ·*· • ·· · • · · ·
4«· ·· ·· · ···· tabákové mozaiky (TMV). Genomová RNA produkčního viru obsahuje gen pro replikázu, enkapsidační signál (Hwang, D. J., Roberts, I. M. & Wilson, T. M. (1994). Expression of tobacco mosaic virus coat protein and assembly of pseudovirus particles in Escherichia coli. Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States ofAmerica 91, 9067-9071.), který je rozeznáván příslušným obalovým proteinem a gen kódující protein nebo peptid, který má být exprimován v rostlině, ale neobsahuje žádný gen pro obalový protein. Ve výhodném provedení vynálezu je exprese genu kódujícího protein nebo peptid, který má být exprimován v rostlině, kontrolována subgenomovým promotorem obalového proteinu. V ještě výhodnějším provedení je jeho exprese kontrolována subgenomovým promotorem obalového proteinu Viru tabákové mozaiky.
Pomocný virus podle vynálezu je libovolný rostlinný virus, který není příbuzný s produkčním virem a v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen obalovým proteinem Tobamoviru, který rozeznává enkapsidační signál nacházející se v genomu produkčního viru. Ve výhodném provedení je pomocným virem Potexvirus a v ještě výhodnějším provedení jde o X virus bramboru (PVX). Ve výhodném provedení je obalovým proteinem Tobamoviru obalový protein Viru tabákové mozaiky.
Vynález dále popisuje cDNA kopii genomu produkčního a/nebo pomocného viru. Ve výhodném provedení vynálezu je tato cDNA kopie vložena do plasmidu pod kontrolou vhodných regulačních sekvencí, jako je například CaMV35S promotor a NOS terminátor tak, aby mohla být použita pro iniciaci virové infekce rostlin. Ve výhodném provedení je cDNA kopie genomu produkčního viru a/nebo pomocného viru vložena do binárního plasmidu, který je schopný replikace nejenom v běžném laboratorním hostiteli, jako je například Escherichia coli, ale i v bakteriích schopných transformovat rostliny, jako je například Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes.
Vynález dále popisuje způsob exprese heterologního proteinu nebo peptidu v rostlinách, během které se nejprve současně infikuje první rostlina produkčním a pomocným rostlinným virem a poté se z ní extrahují chimérické virové částice, které se použijí se k mechanické inokulaci produkční rostliny nebo rostlin. Ve výhodném • · provedení je první rostlina hostitelem obou použitých rostlinných virů. Produkční rostlinou je pak jakákoliv transgenní či netransgenní rostlina, která podporuje replikaci produkčního viru.
Ve způsobu použití podle vynálezu je první rostlina infikována libovolným známým způsobem například, ale nejenom, in-vitro transkribovanou RNA, mechanicky pomocí plasmidové DNA nebo virových částic, biolisticky nebo agroinfiltrací. Ve výhodném provedení vynálezu je první rostlina infikována agroinfiltrací. Pokud je použita agroinfiltrace, je výhodné vybrat takové rostliny, ve kterých je dosahováno vysoké účinnosti agroinfiltrace, například rostliny Nicotiana benthamiana.
Pro mechanickou inokulaci produkčních rostlin podle vynálezu se použije například hrubý extrakt z první rostliny, nebo purifikované virové částice zbavené zbytků bakteriálních endotoxinů. Pro mechanickou inokulaci produkčních rostlin lze použít libovolný způsob známý ze stavu techniky.
V produkčních rostlinách dochází k replikaci pouze produkčního virového genomu, ve kterém není žádný gen pro obalový protein. Virus tudíž není schopen se v těchto rostlinách systémově šířit a je rovněž zabráněno jeho přenosu mechanicky nebo přirozeným vektorem například hmyzem.
Vynález využívá skutečnosti, že pokud nejsou rostlinné viry blízce příbuzné, jsou schopné nezávislé replikace v jediné rostlinné buňce. Je tak možné, že pokud se současně v rostlinné buňce produkuje virová RNA obsahující enkapsidační signál a obalový protein rozeznávající tento enkapsidační signál, budou s určitou pravděpodobností vznikat i virové částice sestávající z enkapsidované RNA. Je však velmi překvapivé, že tyto částice vznikají s tak vysokou účinností, že téměř veškerý produkovaný obalový protein je vázán v těchto infekčních částicích. Znamená to, že produkce RNA a proteinu probíhá v časové i prostorové koordinaci podobné infekci jediným virem, i když k ní dochází v nezávislých replikačních tělískách. Vzhledem ktomu, že pomocný virus nemá vlastní obalový protein ani enkapsidační signál rozeznávaný obalovým proteinem Tobamoviru, nemůže se genomová RNA pomocného viru obalovat do virionů a při extrakci virionů dochází kjejí degradaci.
• · · · · · · · · · • · · · · · ··· ·« ······· ··· ···
Vzniklé chimérické virové částice mají infektivitu srovnatelnou s přirozeným virem a obsahují pouze genomovou RNA produkčního viru.
Předmětem vynálezu je dvoustupňový systém, kombinující výhody obou popsaných postupů. Nejprve se v první rostlinně v malém měřítku zkompletuje virová částice ze dvou nezávislých a nepříbuzných rostlinných virů, z nichž jeden produkuje genomovou RNA s vloženým genem pro rekombinantní protein a s vhodným enkapsidačním signálem a druhý (pomocný virus) produkuje obalový protein, který tento enkapsidační signál rozezná. Při současné replikaci obou virů v jedné rostlinné buňce dochází k vytváření funkčních a infekčních virových částic. Ty jsou snadno izolovány a zbaveny všech podstatných nečistot a použity jako inokulum pro produkční rostliny.
Produkční rostliny jsou infikovány mechanicky virovými částicemi snadno i ve velkém měřítku za pomoci běžné zemědělské mechanizace. Produkční rostliny jsou ale infikovány již pouze jedinou RNA, která není schopen vytvářet vlastní obalový protein a tudíž ani částice. Nemůže tedy snadno dojít k jeho šíření mimo určené rostliny. Zpracování výsledného produktu je snazší, protože není nutno překonat masivní kontaminaci agrobakteriem. Nosná kapacita vektoru se rovněž zvýší odstraněním genu pro vlastní obalový protein, který se nachází pouze v genomu pomocného viru. Jedinečnou výhodou vynálezu je, že v produkčních rostlinách se rekombinantní virový vektor šíří pouze ve formě RNA, tj. nedochází k tvorbě virionů a není tudíž dále přenosný ani mechanicky ani pomocí hmyzích vektorů. Vzniká tak zcela bezpečný systém pro expresi heterologních proteinů, ve kterém je zabráněno nechtěnému šíření rekombinantního vektoru mimo určené rostliny. To má význam jak z hlediska určení rizik biologické bezpečnosti, tak z hlediska dalšího snížení výrobních nákladů v případech, kdy bude jediná produkční jednotka (skleník, pole) využita k produkci několika různých rekombinantních proteinů.
Další výhodou exprese proteinů vektorem podle vynálezu je, že výběr rostliny pro produkční fázi exprese není omezen pouze na druhy rostlin, které jsou citlivé k agroinfiltraci, jako je například N.benthamiana, ale lze použít jakoukoliv rostlinu, která je známým hostitelem pro produkční virus. Hostitelský okruh se tak rozšiřuje o • · · · · · · • ···· · ·· · · • · · · · · ··· ·« ······· ··· ··· rostliny, ve kterých agroinfiltrace probíhá s malou účinností (Nicotiana tabacum, Capsicum annuum, Arabidopsis. thaliana) nebo vůbec ne.
Popis obrázků
Obrázek 1: Na obrázku je schematicky znázorněna T-DNA produkčního rostlinného viru odvozeného od viru tabákové mozaiky. Pod kontrolou silného konstitutivního promotoru CaMV35S se nachází cDNA viru TMV, na 3‘-konci je znázorněn subgenomový promotor obalového proteinu a jako gen určený pro expresi v rostlinách je vložena sekvence kódující GFP.
Obrázek 2. Na obrázku je schematicky znázorněna T-DNA pomocného rostlinného viru odvozeného od X viru bramboru. Pod kontrolou silného konstitutivního promotoru CaMV35S se nachází cDNA viru PVX, na jejím 3‘-konci je znázorněn subgenomový promotor obalového proteinu, který reguluje expresi obalového proteinu Tobamoviru TMV-U1.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 : Příprava produkčního virového vektoru
Produkční virový vektor se připraví za pomocí postupů rekombinantní DNA, které jsou zručným odborníkům dobře známy z oblasti techniky. Vektor má podobu plasmidu obsahujícího infekční cDNA kopii rostlinného viru, v níž byl gen pro obalový protein nahrazen genem, který chceme v rostlině exprimovat. Ve výhodném provedení obsahuje produkční plasmid cDNA kopii Tobamoviru (jako je například mimo jiné Virus mozaiky tabáku) nebo Potexviru (jako je například mimo jiné X virus bramboru). Ve výhodném provedení vynálezu je tento plasmid schopen replikace jak v bakteriích E.coli, tak i v bakteriích A. tumefaciens nebo A. rhizogenes. Dále takový plasmid může obsahovat geny usnadňující selekci v bakteriích a/nebo v rostlinném hostiteli, jako jsou například geny pro rezistenci na antibiotika, herbicidy a další odborníkům známé geny. Infekční cDNA kopie genomu rostlinného viru je ohraničená vhodnými, odborníkům dobře známými, regulačními sekvencemi, jako jsou například promotory T7, CaMV35S, promotor aktinu atd. a terminátory • · • · transkripce jako jsou T7 terminátor, NOS terminátor a podobně. Ve výhodném provedení může být délka transkriptu kontrolována ribozymem způsobem známým ze stavu techniky.
V tomto příkladu byl jako výchozí vektor použit plasmid pGR-TMV-dCP-SnaBI (Holt, C. A., Hodgson, R. A., Coker, F. A., Beachy, R. N. & Nelson, R. S. (1990). Characterization of the masked strain of tobacco mosaic virus: identification of the region responsible for symptom attenuation by analysis of an infectious cDNA cloně. Mol Plant Microbe Interact3, 417-423. 1990; Moravec, T., Berg, H., Beachy, R. N. & Woodford-Thomas, T. (2005). Tobacco mosaic virus particle as a platform to display epitopes of immunological importace. In PBVA 2005-Plant based Vaccines and antibodies. Prague. June 8-10). V tomto plasmidu je vložena infekční cDNA kopie TMV pod kontrolou CaMV35S promotoru a na 3’ konci virové cDNA se nachází ribozym a transkripční terminátor NOS. Celá tato kazeta je umístěna na T-DNA, pro selekci v bakteriích lze použít antibiotikum kanamycin. Cílenou mutagenezí byl z virové cDNA odstraněn gen pro virový obalový protein a nahrazen cílovým místem pro restrikční endonukleázu SnaBI (Holt, C. A., Hodgson, R. A., Coker, F. A., Beachy, R. N. & Nelson, R. S. (1990). Characterization of the masked strain of tobacco mosaic virus: identification of the region responsible for symptom attenuation by analysis of an infectious cDNA cloně. Mol Plant Microbe Interact 3, 417-423). Pro konstrukci produkčního vektoru určeného k expresi modelového proteinu GFP se pg plasmidové DNA rozštěpí 10 U enzymu SnaBI (NEB), reakční směs se inkubuje při 37°C 16 hodin. K reakční směsi se poté přidá 10 U fosfatázy (Fermentas) a směs se inkubuje další hodinu při 37°C. Fosfatáza se poté deaktivuje inkubací při 70°C po dobu 15 minut. Rozštěpená a defosforylovaná plasmidová DNA se poté přečistí vyříznutím z agarozového gelu některým způsobem známým ze stavu techniky. Pomocí PCR a vhodných primerů se amplifikuje gen určený pro expresi v rostlinách, PCR produkt se poté fosforyluje T-4 polynukleotid kinázou (NEB) dle protokolu výrobce. Gen pro GFP se připraví pomocí PCR reakce s primery eGFP-S: AGATGAGTAAAGGAGAAGAACTT a eGFP-AS:
TTATTTGTATAGTTCATCCATGCC a plasmidem pCAMBIA1304 jakožto templátem.
Fosforylovaný PCR produkt o velikosti 719 bp kódující zelený fluoreskující protein (GFP) se poté pomocí T-DNA ligázy vloží do defosforylovaného výchozího plazmidu a transformuje do kompetentních E.coli kmene Top10 (Invitrogen). Z kanamycinu • * 9 · · ·· • ···· · · · ·· • · · · ·· ··· ·· ··· ···· ······ rezistentních kolonií se izoluje plasmidová DNA a správnost rekombinatního konstruktu se ověří restrikčním štěpěním. Odborník v oboru dokáže sestrojit další podobné produkční viry určené pro expresi jiných proteinů než je GFP.
Příklad 2: Příprava pomocného virového vektoru - PVX dCP- U1CP
Pro přípravu pomocného virového vektoru se použijí obdobné postupy a principy jako pro přípravu produkčního vektoru. Je důležité, aby byl jako základ vybrán genom jiného rostlinného viru, než na kterém je založen produkční vektor. V tomto příkladu jsme použili jako výchozí plasmid pGR-106 (Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Beán, S. & Mullineaux, P. M. (2000). pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant molecular biology 42, 819-832, Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Baulcombe, D. C. & Staskawicz, B. J. (1995). Use of a gene expression systém based on potato virus X to rapidly identity and characterize a tomato Pto homolog that controls fenthion sensitivity. The Plant cell 7, 249-257), který obsahuje infekční cDNA kopii X viru bramboru (PVX) pod transkripční kontrolou promotoru CaMV35S a NOS terminátoru. Vektor obsahuje zdvojený subgenomový promotor obalového proteinu a krátký polylinker, do kterého lze vložit libovolnou cizí DNA. Pomocí primerů CP-S-Cla: AAAAAATCGATAAATATGTCTTATAGTATCACTACTCC a CP-AS-Not CTCGACGCGGCCGCACACAATCCGTTATTTATTATGCA a vektoru pBS-TMV-U1 (Holt, C. A., Hodgson, R. A., Coker, F. A., Beachy, R. N. & Nelson, R. S. (1990). Characterization of the masked strain of tobacco mosaic virus: identification of the region responsible for symptom attenuation by analysis of an infectious cDNA cloně. Mol Plant Microbe Interact 3, 417-423) byl PCR reakcí amplifikován gen pro obalový protein viru TMV kmene U1. Amplifikovaná DNA byla naštěpena enzymy Clal a Notl (NEB) a vložena do vektoru pGR106 štěpeného stejnými enzymy. Rekombinantní DNA byla izolována z transformovaných E.coli a její správnost ověřena restrikčním štěpením. V druhé fázi byl z plazmidu vyštěpen Xhol -Sall fragment, který obsahuje gen pro obalový protein PVX. Takto byl připraven rekombinatní virový vektor pGRPVX- dCP-U1CP založený na genomu viru PVX v němž byl gen pro obalový protein nahrazen obalovým proteinem viru TMV.
Příklad 3: Produkce chimérických virových částic v rostlinách
Ověřenými rekombinatními plasmidy podle Příkladů 1 a 2 se transformují kompetentní buňky A. tumefaciens kmene GV3101 způsobem podle Hofgena a Willimitzera (Hofgen, R. & Willmitzer, L, (1988). Storage of competent celíš for Agrobacterium transformation. Nucleic acids research 16, 9877).
Z izolovaných kanamycin-rezistentních kolonií se připraví zásobní glycerolové kultury, které se uchovávají při -78°C. 5 ml LB media se selekčním antibiotikem se naočkuje A. tumefaciens nesoucí produkční plasmid a současně se další 5 ml alikvot LB média naočkuje A. tumefaciens s pomocným plasmidem. Kultury se inkubují na třepačce při 28°C po dobu 36 hodin. Poté se použité médium odstraní centrifugací 10 minut při 5000x g a bakteriální peleta se resuspenduje v infiltračním médiu (10 mM MgCI2; 10 mM MES a 100 μΜ acetosyringon, (viz Bazzini, A. A., Mongelli, V. C., Hopp, Η. E., del Vas, M. & Asurmendi, S. (2007), A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants. Electronic Joumal of Biotechnology 10, 179-190) tak, aby byla výsledná optická hustota OD60o=0,1. Bakteriální suspenze se ponechají další 2 až 4 hodiny při pokojové teplotě. Vlastní infiltrace se provádí aplikací bakteriální suspenze pomocí injekční stříkačky bez jehly na spodní stranu listů. Průběh infekce lze sledovat in planta pozorováním šíření GFP v infikovaných rostlinách. Množství produkovaného rekombinatního proteinu lze měřit nějakým vhodným způsobem známým odborníkům v oboru ze stavu techniky, například testem ELISA, imunoblotem nebo v případě GFP přímým měřením fluorescence na fluorometru. V tabulce 1 jsou uvedeny výsledky experimentu, při kterém byly rostliny inokulovány nejprve každým z virových vektorů samostatně a poté i jejich kombinací. Pouze v případě, kdy se v rostlině současně replikuje produkční a pomocný virus dochází k systémovému šíření viru a vzniku infekčních částic, které lze použít k mechanické inokulaci produkčních rostlin.
Tabulka 1
| Použitý vektor | Fluorescence inokulovaných listů | Fluorescence horních neinokulovaných listů | Infektivita extraktu |
| 1. PVXdCP-U1CP | Ne | Ne | Ne |
| 2. PVX-dCP | Ne | Ne | Ne |
| 3.TMV-dCP-GFP | Ano | Ne | Ne |
| 4. TMV-dCP-GFP + PVX-dCP | Ano | Ne | Ne |
| 5. TMV-dCP-GFP + PVX-dCP-U1CP | Ano | Ano | Ano |
Příklad 4 : Purifikace chimérických virových částic
Z infikované první rostliny lze některým způsobem, který je dobře známý odborníkům ze stavu techniky, purifikovat infekční částice sestávající z rekombinantní virové RNA a obalového proteinu. Lze použít například způsob podle Scally a dalších (Scalla, R., Romaine, P., Asselin, A., Rigaud, J. & Zaitlin, M. (1978). An in vivo study of a nonstructural polypeptide synthesized upon TMV infection and its identification with a polypeptide synthesized in vitro from TMV RNA. Virology 91, 182-193.), přičemž je tento způsob modifikován tak, že se virové částice z hrubého rostlinného extraktu srážejí přídavkem PEG6000 do finální koncentrace 5% a chloridu sodného do finální koncentrace 2%. Po resuspendování v 20 mM fosfátovém pufru se virové částice zkoncentrují centrifugací přes 30 % sacharózový polštář při 90.000 x g po dobu 2 hodin. Takto přečištěné virové částice lze resuspendovat například 20 mM fosfátovém pufru pH 7,2 nebo v libovolném jiném pufru vhodném pro skladování viru a inokulaci rostlin. Měřením absorbance při vlnových délkách 220-300 nm se ověří čistota viru a určí jeho koncentrace. Při tomto způsobu purifikace jsou běžně dosahovány výtěžky, které jsou srovnatelné s výtěžky nemodifikovaného wt viru PVX (0,2-0,4 mg viru na g listí). Titr viru lze ověřit limitním ředěním a přenosem na hostitelskou rostlinu s genem hypersensitivní rezistence k viru TMV (například tabák genotypu NN).
Příklad 5: Inokulace produkčních rostlin
Pro produkční fázi exprese vektorem podle vynálezu lze použít jakékoliv rostliny, které jsou známými hostiteli pro produkční virus. K inokulaci lze použít jak přečištěné virové částice, tak i hrubý extrakt z prvních rostlin ve vhodném pufru. Purifikované částice jsou výhodné zejména v případě, že ve výsledném rekombinantím proteinu není žádoucí přítomnost stopových zbytků Agrobacteria. V tomto příkladu je použit extrakt rostlin inokulovaných podle Příkladu 3. 100 g zmraženého listí se v kuchyňském mixéru homogenizuje s 300 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,5. Homogenát se přefiltruje přes plátno a přidá se k němu destilovaná voda do konečného objemu 1,5 I a konečné molarity 20 mM. K inokulu se přidá 1,5 gramu karborundového prášku. Inokulum se aplikuje stříkací pistolí při tlaku přibližně 4 barů a množství přibližně 2 až 4 ml na jednu rostlinu N. benthamiana. Množství inokula a pracovní tlak lze měnit podle druhu a stáří rostliny tak, aby bylo dosaženo 90 až 100% účinnosti přenosu. Tento postup lze snadno modifikovat pro mnohonásobně větší objemy inokula a množství produkčních rostlin. Produkční rostliny se sklízejí jeden až dva týdny po inokulaci. V případě rostlin N. benthamiana inokulovaných virovým vektorem odvozeným od viru TMV se ve výhodném provedení provádí sklizeň 10 až 12 dní po inokulaci. Rekombinantní virový vektor se z produkčních rostlin nemůže dále šířit, protože se v rostlinách vyskytuje pouze ve formě RNA.
Claims (5)
- Patentové nároky1. Vektor pro expresi proteinů v rostlinách, vyznačující se tím, že zahrnuje dvě komponentya) produkční rostlinný virus, v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro protein nebo peptid, který se v rostlině exprimuje, ab) pomocný rostlinný virus, který není příbuzný s produkčním rostlinným virem, a v jehož genomu byl gen pro obalový protein nahrazen genem pro obalový protein produkčního viru.
- 2. Způsob použití vektoru podle nároku 1 pro získávání proteinu v rostlinách expresí, přičemža) nejprve se infikuje první rostlina produkčním a pomocným rostlinným virem podle nároku 1 ab) z první rostliny se extrahují chimérické virové částice a použijí se k mechanické inokulaci produkční rostliny.
- 3. Použití podle nároku 2, v němž v chimérické virové částicia) její proteinová složka sestává z obalového proteinu Tobamoviru,b) její nukleotidová složka je odvozena od pozitivního ssRNA genomu rostlinného viru, a obsahuje enkapsidační signál rozeznávaný obalovým proteinem Tobamoviru,c) nukleotidová složka neobsahuje žádný gen pro obalový protein ad) nukleotidová složka zahrnuje gen pro heterologní protein regulovaný subgenomovým promotorem.
- 4. Vektor podle nároku 1, v němž produkční virus je Tobamovirus.
- 5. Vektor podle nároku 1, v němž produkční virus je virus tabákové mozaiky.Vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 a 4 až 5, v němž pomocný virus je Potexvirus.Vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 a 4 až 5, v němž pomocný virus je X virus bramboru.Vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 a 4 až 7, kterým je plasmid schopný replikace v bakteriích Agrobacterium sp., který obsahuje cDNA kopii genomu produkčního viru podle nároku 1.Vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 a 4 až 7, kterým je plasmid schopný replikace v bakteriích Agrobacterium sp., který obsahuje cDNA kopii genomu pomocného viru podle nároku 1.
Obrázek 1 //2_ 15 • * »« * · • · « · ·· · · · · · · • · · · · · · 4 ···· 4 · · 4 · • 4 · · ·* CaMV35S K .......................:..........:..................:......:.................. ..... Replikáza ....... : ....................'........ ' '' ' ·: · Ί TMVdCP-GFP r - NOS :: :: , Obrázek 2 ζ/Λ 16 7Í/ 9 9· * 4· * • ♦ 4 · · · 4 444 4 · 4 · · • · · 4 4 TGB1-3 NOS CaMV35S . . | Term --........................ Rqjlikáza > I I V U1CP : ; J Ί’ !
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110843A CZ2011843A3 (cs) | 2011-12-19 | 2011-12-19 | Vektor pro expresi proteinu v rostlinách a jeho pouzití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110843A CZ2011843A3 (cs) | 2011-12-19 | 2011-12-19 | Vektor pro expresi proteinu v rostlinách a jeho pouzití |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2011843A3 true CZ2011843A3 (cs) | 2013-06-26 |
Family
ID=48653057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20110843A CZ2011843A3 (cs) | 2011-12-19 | 2011-12-19 | Vektor pro expresi proteinu v rostlinách a jeho pouzití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2011843A3 (cs) |
-
2011
- 2011-12-19 CZ CZ20110843A patent/CZ2011843A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abrahamian et al. | Plant virus–derived vectors: applications in agricultural and medical biotechnology | |
| Pasin et al. | Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses | |
| Peyret et al. | When plant virology met Agrobacterium: the rise of the deconstructed clones | |
| Peyret et al. | The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants | |
| Maclean et al. | Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization | |
| CN103031310B (zh) | 在植物中表达蛋白质 | |
| Saxena et al. | Improved foreign gene expression in plants using a virus‐encoded suppressor of RNA silencing modified to be developmentally harmless | |
| JP6850041B2 (ja) | 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用 | |
| Yusibov et al. | Hybrid viral vectors for vaccine and antibody production in plants | |
| Ambrós et al. | Agroinoculation of Citrus tristeza virus causes systemic infection and symptoms in the presumed nonhost Nicotiana benthamiana | |
| Wang et al. | Development of new potato virus X-based vectors for gene over-expression and gene silencing assay | |
| JP7491517B2 (ja) | 植物から目的タンパク質を大量生産する方法 | |
| Shamekova et al. | Tombusvirus-based vector systems to permit over-expression of genes or that serve as sensors of antiviral RNA silencing in plants | |
| Zheng et al. | Development of an agroinoculation system for full-length and GFP-tagged cDNA clones of cucumber green mottle mosaic virus | |
| Nosaki et al. | Transient expression of recombinant proteins in plants | |
| KR101103705B1 (ko) | 고감염성 고추모틀바이러스 핵산분자 및 이로부터 유래된 식물 바이러스 벡터 | |
| CN110734928B (zh) | 使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达 | |
| Shen et al. | A versatile complementation assay for cell-to-cell and long distance movements by cucumber mosaic virus based agro-infiltration | |
| Abrahamian et al. | Development and optimization of a pepino mosaic virus-based vector for rapid expression of heterologous proteins in plants | |
| CN101092634B (zh) | 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法 | |
| CN107208072A (zh) | 在植物中产生轮状病毒样颗粒 | |
| Yoon et al. | Agrobacterium-mediated infection of whole plants by yellow dwarf viruses | |
| KR20250167005A (ko) | 식물에서 고효율 이종성 유전자 발현을 위한 트랜스-상보성 벡터 시스템 | |
| Bhat et al. | Development of infectious clone of virus | |
| JP2024542353A (ja) | キュウリモザイクウイルス基盤改良型組換えベクター |