CZ20131048A3 - Použití antigenů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pro sérologické odlišení infikovaných a vakcinovaných prasat - Google Patents
Použití antigenů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pro sérologické odlišení infikovaných a vakcinovaných prasat Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20131048A3 CZ20131048A3 CZ2013-1048A CZ20131048A CZ20131048A3 CZ 20131048 A3 CZ20131048 A3 CZ 20131048A3 CZ 20131048 A CZ20131048 A CZ 20131048A CZ 20131048 A3 CZ20131048 A3 CZ 20131048A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- animals
- infected
- pigs
- enterica
- salmonella
- Prior art date
Links
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 title claims abstract description 47
- 241000282887 Suidae Species 0.000 title claims abstract description 42
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 36
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims abstract 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 16
- 101710149447 Protein SseB Proteins 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 abstract description 7
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 101150049752 ompD gene Proteins 0.000 description 3
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení popisuje způsob sérologického odlišení prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium, při kterém se ve vzorku séra stanoví metodu ELISA nebo westernblot hladina protilátek proti alespoň jednomu nativnímu nebo rekombinantnímu proteinu vybranému ze skupiny SseB, Gene ID: 1252916; SipB, Gene ID: 1254408 a SipD, Gene ID: 1254406 a alespoň jednomu nativnímu nebo rekombinantnímu proteinu vybranému ze skupiny FliC, Gene ID: 1253480 a YfgL, Gene ID: 1254042. Infikovaná zvířata se identifikují tak, že mají oproti zvířatům vakcinovaným vyšší hladinu protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD a zároveň mají nižší hladinu protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL, naproti tomu zvířata vakcinovaná se identifikují tak, že mají oproti zvířatům infikovaným vyšší hladinu protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL a zároveň mají nižší hladinu protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD. Sérologické odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných je nutné pro uplatnění ozdravných postupů, jejichž cílem je snížení procenta Salmonella pozitivních jatečných prasat. Dalším důvodem nutnosti odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných je vyloučení falešné pozitivity vakcinovaných prasat při odhadu promořenosti chovů prasat Salmonella ssp. pomocí již zavedených sérologických metod v některých zemích západní Evropy.
Description
Vynález se týká sérologické diagnostiky a imunoprofylaxe salmonelových infekcí prasat. Sérologické odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných je nutné pro uplatnění ozdravných postupů, jejichž cílem je snížení procenta Salmonella pozitivních jatečných prasat. Dalším důvodem nutnosti odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných je vyloučení falešné pozitivity vakcinovaných prasat při odhadu promořenosti chovů prasat Salmonella ssp. pomocí již zavedených sérologických metod v některých zemích západní Evropy. Vynález umožňuje sérologické odlišení prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium.
Dosavadní stav techniky
Nejčastějšími původci salmonelových infekcí prasat v České republice i většiny zemí Evropské unie jsou netyfoidní sérovary Salmonella enterica ssp. enterica, zejména pak sérovary Typhimurium a Derby, které se vyskytují v přibližně 65% případů kultivačního záchytu salmonel. Dalších 25^o případů kultivačního záchytu salmonel u prasat představují sérovary Enteritidis a Agona (EFS A 2008). Jednou z metod tlumení výskytu netyfoidních salmonelových infekcí prasat může být vakcinace prasat proti původcům infekcí, ale jediná dosud registrovaná vakcína (v Německu a Polsku) je na bázi živého vakcinačního kmene a je zatím jen málo používaná. Autoři vynálezu experimentálně ověřili účinnost vakcinace prasnic vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium na snížení množství salmonel v orgánech sajících selat (Matiašovic a kol. 2013) a potvrdili tak účinnost vakcinace prasat inaktivovanou vakcínou Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pozorovanou dříve na úrovni stáda (Roesler a kol. 2006).
Pro úspěšné zavedení jakékoli vakcíny proti netyfoidním sérovarům Salmonella enterica ssp. enterica je nutné odlišení zvířat vakcinovaných od zvířat infikovaných. Zavedené sérologické metody detekce protilátek proti netyfoidním sérovarům Salmonella enterica ssp.
' 2 ' < — T ; ;
ν j 4 < ' Ϊ í t * t< * * ' ‘ * enterica u prasat jsou založeny na detekci protilátek proti O-antigenům těchto sérovarů. Po přirozené infekci prasat netyfoidními sérovary Salmonella enterica ssp. enterica i po vakcinaci prasat jakoukoli vakcínou obsahující O-antigeny Salmonella enterica ssp. enterica dochází k produkci IgG protilátek proti těmto antigenům. Dosavadní sérologické metody tak identifikují prasata vakcinovaná stejně jako prasata infikovaná.
Možností jak sérologicky odlišit infikovaná prasata od prasat vakcinovaných je vývoj vakcín na bázi vakcinačních kmenů postrádajících O-antigeny (Leyman a kol. 2011). Cílené nebo náhodné genetické modifikace vakcinačních kmenů komplikují vývoj vakcíny a případné použití geneticky modifikovaných kmenů znesnadňuje registraci vakcíny.
Živá atenunovaná vakcína registrovaná v Německu a Polsku (IDT Biologica GmbH, Německo) je dále vyvíjená za účelem odlišení postinfekčních a postvakcinačních protilátek. Vakcína indukuje tvorbu protilátek proti O-antigenům. Autoři volili metodu delečního mutanta, kdy vakcinační kmen postrádá protein ompD a tudíž se vůči němu nevytváří po vakcinaci protilátky, na rozdíl od divokého kmene, který stimuluje imunitní systém prasete k produkci protilátek proti ompD proteinu. Odlišení vakcinovaných zvířat od infikovaných tak spočívá v sérologické detekci protilátek proti ompD proteinu. Problém takto upravené živé vakcíny je snížená protektivita oproti původnímu vakcinačnímu kmeni (Selke a kol. 2007).
Vakcína založená na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium (Matiašovic a kol. 2013) je vyvíjena do komerční podoby týmy obou přihlašovatelů. Vakcína indukuje tvorbu protilátek proti O-antigenům. Jiná vakcína založená na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium nebo inaktivované kultuře jiných sérovarů Salmonella enterica ssp. enterica není komerčně dostupná.
Je známo, že po infekci lidí nebo zvířat živým kmenem Salmonella enterica ssp. enterica dochází k tvorbě protilátek proti různým antigenům tohoto patogena, mimo jiné i proti většině proteinů, které jsou předmětem přihlášky vynálezu (SseB - Lee a kol. 2012, SipBDurand a kol. 2013, SipD - Desin a kol. 2010 , FliC - Bergman a kol. 2005). Předložený vynález umožňuje porovnáním hladin protilátek proti některým proteinům Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium odlišení prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře divokého kmene Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium bez nutnosti modifikace vakcinačního kmene.
w·
Literatura k Dosavadnímu stavu techniky
1. The EFSA Joumal, 2008, 135: 1-111.
2. Matiasovic, J., Kudláčková, H., Babickova, K., Stepanova, H., Volf, J., Rychlík, I., Babak, V., Faldyna, M. Impact of matemally-derived antibodies against Salmonella enterica serovar Typhimurium on the bacterial load in suckling piglets. Veterinary Joumal. 2013, 196: 114-115.
3. Roesler, U., Heller, P., Waldmann, K.H., Truyen, U., Hensel, A. Immunization of sows in an integrated pig-breeding herd using a homologous inactivated Salmonella vaccine decreases the prevalence of Salmonella typhimurium infection in the offspring. Joumal of Veterinary Medicine B, 2006,53,224-228.
4. Leyman, B., Boyen, E, Van Parys, A., Verbrugghe, E., Haesebrouck, E, Pasmans, F. Salmonella Typhimurium LPS mutations for use in vaccines allowing differentiation of infected and vaccinated pigs. Vaccine, 2011, 29: 3679-3685.
5. Selke, M., Meens, J., Springer, S., Frank, R., Gerlach, G.F. Immunization of pigs to prevent disease in humans: construction and protective efficacy of a Salmonella enterica serovar Typhimurium live negative-marker vaccine. Infection and Immunity, 2007, 75:2476-2483.
6. Lee, S.J., Liang, L., Juarez, S., Nanton, M.R., Gondwe, E.N., Msefula, C.L., Kayala, M.A., Necchi, E, Heath, J.N., Hart, P., Tsolis, R.M., Heyderman, R.S., MacLennan, C.A., Felgner, P.L., Davies, D.H., McSorley, S.J. Identification of a common immune signatuře in murine and human systemic Salmonellosis. Proč Nati Acad Sci USA, 2012, 109: 4998-5003.
7. Durand, D., Ochoa, T.J., Bellomo, S.M., Contreras, C.A., Bustamante, V.H., Ruiz, J., Cleary, T.G Detection of secretory immunoglobulin A in human colostrum as mucosal immune response against proteins of the type III secretion systém of Salmonella, Shigella and enteropathogenic Escherichia coli. Pediatr Infect Dis J, 2013,32:1122-1126.
8. Desin, T.S., Mickael, C.S., Lam, P.K., Potter, A.A., Koster, W. Protection of epithelial cells from Salmonella enterica serovar Enteritidis invasion by antibodies against the SPI-1 type III secretion systém. Can J Microbiol, 2010, 56: 522-526.
9. Bergman, M.A., Cummings, L.A., Alaniz, R.C., Mayeda, L., Fellnerova, I., Cookson, B.T. CD4+-T-cell responses generated during murine Salmonella enterica serovar Typhimurium infection are directed towards multiple epitopes within the natural antigen FliC. Infection and Immunity, 2005, 73: 7226-7235.
Podstata vynálezu
Dosud nebyl znám způsob jak odlišit zvířata infikovaná Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře divokého kmene Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium. Podstatou vynálezu je zjištění, že po vakcinaci prasat vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium dochází k tvorbě protilátek proti proteinům Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium kvalitativně jiným způsobem než po infekci a že tento rozdíl je použitelný k odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných.
Podstata vynálezu tak spočívá v použití dvou skupin proteinů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium jako antigenů pro detekci protilátek v séru, kolostru a masové šťávě prasat. Tyto dvě skupiny proteinů rozdílným způsobem indukují tvorbu protilátek po infekci prasat Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium a po vakcinaci prasat vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium.
Proti proteinům SseB, Gene ID: 1252916; SipB, Gene ID: 1254408, SipD, Gene ID: 1254406 se po přirozené infekci prasat vytváří vysoké hladiny protilátek, zatímco po vakcinaci prasat vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium se protilátky proti těmto proteinům netvoří vůbec, nebo jen ve velmi malé míře. To umožňuje detekovat zvířata infikovaná Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium.
Proti proteinům FliC, Gene ID: 1253480; YfgL, Gene ID: 1254042 se po přirozené infekci prasat protilátky netvoří vůbec, nebo jen v malé míře, zatímco po vakcinaci prasat vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium se proti těmto proteinům vytváří vysoké hladiny protilátek. To umožňuje detekovat zvířata vakcinovaná vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium.
Vyhodnocení hladin protilátek proti proteinům SseB, SipB, SipD a proti proteinům FliCx a YfgL tak umožňuje odlišit zvířata infikovaná od zvířat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium. Vysoká hladina protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD a zároveň nízká hladina protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL identifikuje zvířata infikovaná Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium nebo i jiným sérovarem Salmonella enterica ssp. enterica, v závislosti na antigenní příbuznosti uvedených proteinů. Vysoká hladina protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL a zároveň nízká hladina protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD identifikuje zvířata vakcinovaná vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp.
' .,,,,, =
4. * * , < í f τ t 6 ř * * kultuře- Salmonella-entericassp·. enterica sérovar Typhimurium. Vysoké hladiny protilátek proti oběma skupinám proteinů identifikuje zvířata infikovaná i vakcinovaná. Nízké nebo žádné hladiny protilátek proti oběma skupinám proteinů identifikuje zvířata, která buď nebyla infikována ani vakcinována nebo zvířata u nichž nedošlo k tvorbě protilátek po infekci nebo vakcinaci.
Příklady provedení
Sérologické odlišení zvířat infikovaných od zvířat vakcinovaných za použití antigenů podle vynálezu je možné například pomocí ELISA testu nebo westemblotu.
ELISA test
Při použití izolovaného proteinu SseB (GeneID: 1252916) jako antigenů v ELISA testu, je naměřená absorbance ve směsném vzorku séra prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium minimálně 2x vyšší než ve směsném vzorku séra prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium a než ve směsném vzorku séra kontrolních neinfikovaných prasat.
Při použití izolovaného proteinu FliC (GeneID: 1253480) jako antigenů v ELISA testu, je naměřená absorbance ve směsném vzorku séra prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium minimálně 3x vyšší než ve směsném vzorku séra prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium a než ve směsném vzorku séra kontrolních neinfikovaných prasat.
Výše uvedené ELISA testy se připraví potažením jamek jedné mikrotitrační desky rekombinantním proteinem SseB a druhé mikrotitrační desky rekombinantním proteinem FliC, oba v pracovním ředění 1 pg/ml v karbonát-bikarbonátovém pufru (0^05 M, pH 9,6) v objemu 100 μΐ na jamku (inkubace 16 hodin, 4°C). Následně se desky třikrát promyjí PBS s obsahem 0,05% Tween 20 (PBS-T, pH 7,2). Vyšetřované vzorky prasečího séra nebo plazmy se ředí lOOx v PBS-T s přídavkem 0,5 % kaseinového hydrolyzátu a v objemu 100 μΐ se aplikují do jamek mikrotitrační desky. Po inkubaci (l;h, 37j°C, vlhká komůrka) se desky třikrát promyjí roztokem PBS-T a do jamek se přidá 100 μΐ konjugátu značeného křenovou peroxidázou (Goat anti-pig IgG conjugate, Bethyl Laboratories, Montgomery, USA) v příslušném pracovním ředění. Po inkubaci (60 min, 37,°C, vlhká komůrka) se desky opět třikrát promyjí a do jamek se přidá 100 μΐ roztoku substrátu s chromogenem TMB Complete (Test-line, Brno, Česká republika). Enzymatická reakce se zastaví po 10 minutách 50 μΐ 2M kyseliny sírové. Výsledná absorbance se odečítá pomocí multikanálového spektrofotometru při vlnové délce 450 nm, v našem případě pomocí Synergy H1 (Biotek, USA).
Westemblot
Při použití izolovaného proteinu SipB (Gene ID: 1254408) nebo SipD (Gene ID: 1254406) jako antigenu ve westemblot testu je intenzita proužku po inkubaci se směsným vzorkem séra prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium minimálně 3x vyšší než po inkubaci se směsným vzorkem séra prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium a než se směsným vzorkem séra kontrolních neinfikovaných prasat.
Při použití izolovaného proteinu YfgL (Gene ID: 1254042) jako antigenu ve westemblot testu je intenzita proužku po inkubaci se směsným vzorkem séra prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium minimálně 2x vyšší než po inkubaci se směsným vzorkem séra prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium a než se směsným vzorkem séra kontrolních neinfikovaných prasat.
Výše uvedené westembloty se připraví rozdělením antigenu (rekombinantní protein SipB nebo YfgL) na 7 cm SDS-PAGE gelu o koncentraci akrylamidu lO^ó, za použití aparatury MiniPROTEAN® II Electrophoresis Cell (Bio-Rad, USA) (20 min při konstantním napětí 80jV, poté cca lhod při konst. napětí 11(W). Proteiny z gelu se pomocí aparatury pro polosuchý westemblot (Omni-Bio, Česká republika) přenesou (75 min při konstantním proudu 340 mA) na PVDF membránu (Amersham Hybond-P, GE Healthcare, Velká Británie). PVDF membrána se blokuje v 0,5% kaseinovém hydrolyzátu v PBS s obsahem 0,05% Tween 20 (PBS-T, pH 7,2) 16 hod při 4j°C. Membrána je poté lh inkubována s vyšetřovanými vzorky prasečích sér ve lOOnásobném ť'*· z4-* ředění ve stejném roztoku - PBS-T/kaseinový hydrolyzát za současného třepání při laboratorní teplotě. Poté se membrána pětkrát promyje roztokem PBS-T a l|i inkubuje při laboratorní teplotě s konjugátem značeným křenovou peroxidázou (Goat anti-pig IgG conjugate, Bethyl Laboratories, Montgomery, USA, lOOOx ředěný v PBS-T/kaseinový hydrolyzát) a následně se opět 5x promyje (PBS-T). Pro vizualizaci antigenu je použit chromogenní substrát diaminobenzidin (13 mg ve 40 ml PBS, po přidání 40 μΐ peroxidu vodíku). Reakce se zastaví přidáním nadbytku vody. Intenzita zbarvení proužků se měří například na přístroji GelLogic 2200 PRO (Carestream Health, USA). Vyhodnocení intenzity zbarvení proužků lze provést i vizuálně.
Sil» . 7 <
» » « *
Vyhodnocení
Vysoká hladina protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD a zároveň nízká hladina protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL identifikuje zvířata infikovaná Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium nebo i jiným sérovarem Salmonella enterica ssp. enterica, v závislosti na antigenní příbuznosti uvedených proteinů. Vysoká hladina protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL a zároveň nízká hladina protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD identifikuje zvířata vakcinovaná vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium. Vysoké hladiny protilátek proti oběma skupinám proteinů identifikuje zvířata infikovaná i vakcinovaná. Nízké nebo žádné hladiny protilátek proti oběma skupinám proteinů identifikuje zvířata, která buď nebyla infikována ani vakcinována nebo zvířata, u nichž nedošlo k tvorbě protilátek po infekci nebo vakcinaci.
Průmyslová využitelnost
Tvorba detekčních systémů (například ELISA, westemblot) umožňujících sérologické odlišení prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium.
JméneHH-spol. Bioveta,a.s.
Jméno: Ing. Libor Bittner, CSc.
Funkce: předseda představenstva
-----------J ménemr Výzkumného ústavirveterinámí ho lékařství, v.v. i. ,
Jméno: RNDr. Miroslav Machala, CSc. Funkce: osoba pověřená řízením
Jméno: MVDr. Vladimír Vrzal, CSc. Funkce: člen představenstva
PV io+v- 40 ' I i/-, ff8 v • : : ; ’ · ; t
Claims (1)
- Způsob sérologického odlišení prasat infikovaných Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium od prasat vakcinovaných vakcínou založenou na inaktivované kultuře Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium vyznačující se tím, že se ve vzorku séra stanoví hladina protilátek metodou ELISA nebo westernblot proti alespoň jednomu nativnímu nebo rekombinantnímu proteinu vybranému ze skupiny SseB, Gene ID: 1252916; SipB, Gene ID: 1254408 a SipD, Gene ID: 1254406 a alespoň jednomu nativnímu nebo rekombinantnímu proteinu vybranému ze skupiny FliC, Gene ID: 1253480 a YfgL, Gene ID: 1254042, kdy infikovaná zvířata se identifikují tak, že mají oproti zvířatům vakcinovaným vyšší hladinu protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD a zároveň mají nižší hladinu protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL, naproti tomu zvířata vakcinovaná se identifikují tak, že mají oproti zvířatům infikovaným vyšší hladinu protilátek proti proteinu FliC nebo YfgL a zároveň mají nižší hladinu protilátek proti proteinu SseB nebo SipB nebo SipD.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-1048A CZ20131048A3 (cs) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Použití antigenů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pro sérologické odlišení infikovaných a vakcinovaných prasat |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-1048A CZ20131048A3 (cs) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Použití antigenů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pro sérologické odlišení infikovaných a vakcinovaných prasat |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ305077B6 CZ305077B6 (cs) | 2015-04-22 |
| CZ20131048A3 true CZ20131048A3 (cs) | 2015-04-22 |
Family
ID=52963639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-1048A CZ20131048A3 (cs) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Použití antigenů Salmonella enterica ssp. enterica sérovar Typhimurium pro sérologické odlišení infikovaných a vakcinovaných prasat |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ20131048A3 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119119303B (zh) * | 2024-10-14 | 2026-01-27 | 华中农业大学 | 沙门菌多表位蛋白、编码基因及其在制备沙门菌亚单位疫苗中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0621490A2 (pt) * | 2006-03-20 | 2011-12-13 | Univ Bruxelles | cepa mutante atenuada de uma bactéria infectante de espécies veterinárias, vacina para imunização de espécies veterinárias contra uma infecção bacteriana, método para imunizar uma espécie veterinária contra uma infecção bacteriana, uso de uma cepa mutante atenuada e método para distinção sorológica entre animais vacinados e animais infectados por uma cepa alelo-selvagem |
| EP2189164A1 (en) * | 2008-11-20 | 2010-05-26 | CREATOGEN Laboratories GmbH | Salmonella marker vaccine |
-
2013
- 2013-12-20 CZ CZ2013-1048A patent/CZ20131048A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ305077B6 (cs) | 2015-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de la Maza et al. | Chlamydia trachomatis vaccines for genital infections: where are we and how far is there to go? | |
| Bøje et al. | A multi‐subunit Chlamydia vaccine inducing neutralizing antibodies and strong IFN‐γ+ CMI responses protects against a genital infection in minipigs | |
| Lynne et al. | Recombinant Iss as a potential vaccine for avian colibacillosis | |
| Simborio et al. | Evaluation of the combined use of the recombinant Brucella abortus Omp10, Omp19 and Omp28 proteins for the clinical diagnosis of bovine brucellosis | |
| Deneke et al. | Evaluation of recombinant LigB antigen-based indirect ELISA and latex agglutination test for the serodiagnosis of bovine leptospirosis in India | |
| Sedaghat et al. | Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice | |
| Qureshi et al. | Estimation of titers of antibody against Pasteurella multocida in cattle vaccinated with haemorrhagic septicemia alum precipitated vaccine | |
| Clow et al. | PilVax, a novel Lactococcus lactis‐based mucosal vaccine platform, stimulates systemic and mucosal immune responses to Staphylococcus aureus | |
| Lalsiamthara et al. | Engineering of a rough auxotrophic mutant Salmonella Typhimurium for effective delivery | |
| Kim et al. | Shigella outer membrane protein PSSP-1 is broadly protective against Shigella infection | |
| Im et al. | Evaluation of Th1/Th2-related immune response against recombinant proteins of Brucella abortus infection in mice | |
| Verdiguel-Fernández et al. | Omp31 plays an important role on outer membrane properties and intracellular survival of Brucella melitensis in murine macrophages and HeLa cells | |
| Im et al. | Comparative analysis of immune responses to outer membrane antigens OMP10, OMP19, and OMP28 of Brucella abortus | |
| Pollak et al. | Immunization with Brucella VirB proteins reduces organ colonization in mice through a Th1-type immune response and elicits a similar immune response in dogs | |
| Sharma et al. | Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB | |
| Feng et al. | Immunogenicity and protective capacity of EF-Tu and FtsZ of Streptococcus suis serotype 2 against lethal infection | |
| Zhou et al. | MOMP and MIP DNA-loaded bacterial ghosts reduce the severity of lung lesions in mice after Chlamydia psittaci respiratory tract infection | |
| Zhu et al. | Mucosal IgA and IFN-γ+ CD8 T cell immunity are important in the efficacy of live Salmonella enteria serovar Choleraesuis vaccines | |
| Truong et al. | Booster vaccination with safe, modified, live-attenuated mutants of Brucella abortus strain RB51 vaccine confers protective immunity against virulent strains of B. abortus and Brucella canis in BALB/c mice | |
| Chaudhari et al. | Construction of an attenuated Salmonella delivery system harboring genes encoding various virulence factors of avian pathogenic Escherichia coli and its potential as a candidate vaccine for chicken colibacillosis | |
| Zhang et al. | Display of porcine epidemic diarrhea virus spike protein B-cell linear epitope on Lactobacillus mucosae G01 S-layer surface induce a robust immunogenicity in mice | |
| Moustafa et al. | Immunization of mice with gamma-irradiated Brucella neotomae and its recombinant strains induces protection against virulent B. abortus, B. melitensis, and B. suis challenge | |
| Wang et al. | The 16MΔvjbR as an ideal live attenuated vaccine candidate for differentiation between Brucella vaccination and infection | |
| Rainard et al. | Cellular and humoral immune response to recombinant Escherichia coli OmpA in cows | |
| Mahboob et al. | Development of ELISA-based diagnostic methods for the detection of haemorrhagic septicaemia in animals |