CZ2013124A3 - Kombinovaná farmaceutická kompozice a zpusoby lécby diabetu a metabolických chorob - Google Patents

Abstract

Predlozená prihláska vynálezu poskytuje farmaceutickou kompozici urcenou k podávání pacientovi s diabetes mellitus a dalsími metabolickými chorobami, kde uvedená kompozice obsahuje a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu.

Description

Kombinovaná farmaceutická kompozice a způsoby léčby diabetů a metabolických chorob

OBLAST TECHNIKY

Předložený vynález je z oblasti lékařství a může být využitý k léčbě a prevenci diabetů a dalších metabolických chorob.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Diabetes mellitus je chronický stav charakterizovaný hyperglykémií (vysokými hladinami cukru v krvi). Trvalé přírůstky hladin glukosy v krvi zvyšují riziko komplikací spojených s diabetem, jako je poškození ledvin, ztráta zraku, onemocnění srdce a vředy na nohou.

Existují dva hlavní typy diabetů: diabetes typu 1 a diabetes typu 2. U diabetů typu 1 dochází k vývoji hyperglykémie v důsledku toho, že pankreas není schopný produkovat insulin. Tento typ diabetů se obvykle vyskytne v dětském věku nebo v časné dospělosti. U diabetů typu 2 je sice pankreas schopný produkovat insulin, ale nedochází k adekvátní odezvě na potřeby organizmu. Problém je v tom, že organizmus neodpovídá na insulin přiměřeně, což vede k menšímu množství glukosy absorbované buňkami a v důsledku toho k abnormálně zvýšeným hladinám glukosy v krvi. Po řadě let může následkem přetížení pankreas případně selhat a dojít k vyčerpání jeho schopnosti produkovat insulin, což je okamžik, kdy i pacient s diabetem typu 2 může potřebovat terapii insulinem.

Insulin je přirozený hormon produkovaný pankreatem, který převádí glukosu z krevního řečiště dovnitř buněk. Hlavní úlohou insulinu je tedy regulovat transport glukosy do buněk a tím snižovat hladinu glukosy v krvi.

Účinky insulinu jsou řízené aktivací heterotetramerního receptoru nacházejícího se v plasmové membráně. Insulinový receptor je glykoprotein složený ze dvou extracelulárních alfa-podjednotek a dvou transmembránových beta-podjednotek vzájemně spojených disulfidickými vazbami. Ullrich a sp.₍ Nature, 313:756-61, 1985. Uvedené alfa-podjednotky tvoří vazebnou doménu pro insulin, a intracelulární podíl beta-podjednotky obsahuje insulinem regulovanou tyrosinproteinkinasu (enzym, který katalyzuje přenos vysoce-energetické skupiny z donoru (obvykle ATP) na akceptor.

Když se molekula insulinu uvolní prostřednictvím beta buněk pankreatu a dostane se k buňce, váže se na insulinový receptor na povrchu většiny buněk. Jakmile se insulin naváže, aktivuje se vlastní fosfotransferasová funkce beta-podjednotky insulinového receptoru což vede k fosforylaci tyrosinu řady intracelulárních proteinů. Jakmile dojde k aktivaci insulinového receptoru, v důsledku fosforylace dochází ke zvýšení množství zásobní glukosy a následně ke snížení hladin glukosy v krvi.

Účinné řízení hladiny glukosy se v rámci delších období obtížné dosahuje a to dokonce i u nejpreciznějších způsobů insulinové terapie u vysoce motivovaných pacientů. Proto stále pokračuje potřeba nových léčiv s požadovanou terapeutickou účinnosti pro léčbu těchto chorob a metabolických chorob.

Oxid dusnatý (NO) je plynná molekula s prokázaným účinkem v signalizaci různých biologických procesů. Endoteliální NO je klíčovou molekulou v regulaci vaskulárního tonu a jeho spojení s vaskulárními onemocněními je již dlouho známé. NO inhibuje mnoho procesů, o kterých je známé, že se účastní tvorby aterosklerotického plaku, zahrnujícími adhezi monocytů, agregaci krevních destiček a proliferaci vaskulárních buněk hladkého svalstva. Další důležitou úlohou endoteliálního NO je ochrana vaskulární stěny před oxidačním stresem indukovaným jejími vlastními metabolickými produkty a oxidačními produkty lipidů a lipoproteinů. Endoteliální dysfunkce se objevuje ve velmi časných stádiích aterosklerózy. Proto je možné, že deficience lokální dostupnosti NO by mohla znamenat konečnou společnou cestu urychlující aterogenesi u lidí. Kromě úlohy NO ve vaskulárním endotelu byla také prokázaná role jeho dostupnosti v modulaci metabolismu lipoproteinů. Je popsaná negativní korelace mezi koncentracemi produktů metabolismu NO v plasmě a hladinami celkového cholesterolu a cholesterolu ve formě nízkodenzitního lipoproteinů (LDL), zatímco vysokodenzitní lipoprotein (HDL) zlepšuje u subjektů s hypercholesterolémií vaskulární funkce. Úbytek NO má významný vliv na vývoj onemocnění. Diabetes mellitus je spojený se zvýšenou mírou morbidity a mortality vyvolanými především zrychleným vývojem aterosklerózy. Kromě toho se uvádí, že diabetici mají zhoršené funkce plic. V literatuře se uvádí, že rezistence na insulin vede k zánětu dýchacích cest. Habib a sp., Nitric oxid Measurement From Blood To Lungs, Is There A Link? Pak. J.Physiol. 2007; 3(1).

Oxid dusnatý je syntetizovaný v endotelu z L-argininu (oxid dusnatý)synthasou (NOsynthasa). NO-synthasa se vyskytuje v různých isoformách zahrnujících konstituční formu (cNOS) a indukovatelnou formu (iNOS). Konstituční forma je přítomná v normálních endoteliálních buňkách, neuronech a v některých dalších tkáních.

Autor předložené patentové přihlášky Dr. Oleg I. Epshtein objevil, že extrémně zředěná (nebo ultra-nízká) forma protilátek potencovaná homeopatickou technologií má terapeutický účinek. V U.S. patentu č. 7,582,294 je popsané léčivo pro léčbu benigní hyperplazie prostaty nebo prostatitidy spočívající v podávání homeopaticky aktivované formy protilátek na prostatický specifický antigen (PSA). V U.S. patentu č. 7,700,096 je uvedená homeopaticky potencovaná forma protilátek na endoteliální NO-synthasu. Homeopaticky potencovaná forma protilátek na endoteliální NOsynthasu se prodává v Ruské federaci a dalších zemích pod obchodním názvem Impaza®.

PODSTATA VYNÁLEZU

Podle jednoho aspektu vynález poskytuje farmaceutickou kompozici pro podání pacientovi trpícímu diabetem a dalšími metabolickými chorobami, kde uvedená kompozice obsahuje a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu.

Podle jednoho aspektu vynález poskytuje farmaceutickou kompozici pro podání pacientovi trpícímu diabetem a dalšími metabolickými chorobami, kde uvedená kompozice obsahuje a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptorů a b) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu.

V jedné variantě uvedená farmaceutická kompozice tohoto aspektu vynálezu obsahuje a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu, kde molekula inzulínového receptorů obsahuje nejméně jednu alfa-podjednotku a nejméně jednu beta-podjednotku.

V jedné variantě uvedená farmaceutická kompozice podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje aktivovanou-potencovanou formu protilátky na C-terminální fragment betapodjednotky lidského insulinového receptorů nebo aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor ve formě směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200 naimpregnovaných na pevný nosič. Aktivovaná-potencovaná forma protilátky na endoteliální NO-synthasu ve formě směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200 může být následně naimpregnovaná na uvedený pevný nosič.

V další variantě uvedená farmaceutická kompozice podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu která je ve formě směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200 naimpregnovaných na pevný nosič. Aktivovaná-potencovaná forma protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptorů nebo aktivovaná-potencovaná forma protilátky na lidský insulinový receptor která je ve formě směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200 může být následně naimpregnovaná na uvedený pevný nosič.

Výhodně je aktivovaná-potencovaná forma protilátky na C-terminální fragment betapodjednotky lidského insulinového receptorů nebo aktivovaná-potencovaná forma protilátky na lidský insulinový receptor monoklonální, polyklonální nebo přirozená protilátka, výhodněji je to polyklonální protilátka. V jedné variantě tohoto aspektu vynálezu se aktivovaná-potencovaná forma protilátky na C-terminální fragment betapodjednotky lidského insulinového receptorů nebo aktivovaná-potencovaná forma protilátky na lidský insulinový receptor připraví postupnými centesimálními ředěními spojenými s protřepáváním při každém ředění.

Výhodně je aktivovaná-potencovaná forma protilátky na endoteliální NO-synthasu monoklonální, polyklonální nebo přirozená protilátka, výhodněji je to polyklonální protilátka. V jedné variantě tohoto aspektu vynálezu se aktivovaná-potencovaná forma protilátky na endoteliální NO-synthasu připraví postupnými centesimálními ředěními spojenými s protřepáváním při každém ředění.

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje způsob léčení pacienta trpícího diabetem typu I, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanépotencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému pacientovi.

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje způsob léčení pacienta trpícího diabetem typu I, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru a b) aktivované-potencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému pacientovi.

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje způsob léčení pacienta trpícího diabetem typu II, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanépotencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému pacientovi.

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje způsob léčení pacienta trpícího diabetem typu II, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru a b) aktivované-potencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému pacientovi.

Podle dalšího aspektu, vynález poskytuje způsob snížení hladiny glukosy v krvi savce, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivované potencované formy protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanépotencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému savci.

Podle dalšího aspektu, vynález poskytuje způsob snížení hladiny glukosy v krvi savce, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru a b) aktivované-potencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému savci.

Podle dalšího aspektu, vynález poskytuje způsob léčení rezistence na insulin u savce, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanépotencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému savci.

Podle dalšího aspektu, vynález poskytuje způsob léčení rezistence na insulin u savce, kde uvedený způsob zahrnuje podávání kombinace a) aktivovanépotencované formy protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru a b) aktivované-potencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu danému savci.

Podle jedné varianty tohoto aspektu vynálezu se podává od jedné do dvou jednotkových dávek přípravku obsahujícího aktivovanou-potencovanou formu protilátky na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru nebo aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a od jedné do dvou jednotkových dávek přípravku obsahujícího aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu, kde každý přípravek se podává jednou až čtyřikrát denně. Výhodně se jedna až dvě jednotkové dávky každé z aktivovanýchpotencovaných forem protilátek podávají dvakrát denně.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. 1 znázorňuje účinek testovaných přípravků na hladinu glukosy v krevní plasmě potkanů s diabetes mellitus indukovaným streptozotocinem.

Obr. 2 znázorňuje účinek testovaných přípravků po jejich 14 denním injektování na hodnoty plochy pod křivkou koncentrace-čas (AUC) v glukosovém tolerančním testu na potkanech s diabetes mellitus indukovaným streptozotocinem.

Obr. 3 znázorňuje účinek testovaných přípravků na hladinu glukosy v krevní plasmě potkanů se spontánním insulin nondependentním diabetes mellitus.

Obr. 4 znázorňuje účinek testovaných přípravků po 28 denním injektování na hodnoty plochy pod křivkou koncentrace-čas (AUC) v glukosovém tolerančním testu na potkanech se spontánním insulin nondependentním diabetes mellitus.

Obr. 5 znázorňuje dynamiku hladin glukosy a glykosylovaného hemoglobinu u pacientů s diabetes mellitus typu 1 po podávání přípravku IR Ab + NOS AB proti výchozím hodnotám.

Obr. 6 znázorňuje dynamiku hladin glukosy a glykosylovaného hemoglobinu u pacientů s diabetes mellitus typu 2 po podávání přípravku IR Ab + NOS AB proti výchozím hodnotám.

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU

Předložený vynález je definovaný prostřednictvím připojených patentových nároků. Význam výrazů použitých v patentových nárocích je uvedený níže.

Výraz protilátka použitý v tomto textu znamená imunoglobulin, který se specificky váže na určité prostorové a polární uspořádání další molekuly, čímž je k tomuto místu molekuly komplementární. Protilátky uvedené v patentových nárocích mohou zahrnovat kompletní imunoglobulin nebo jeho fragment, mohou být přirozeného původu, polyklonální nebo monoklonální, a mohou zahrnovat různé třídy a isotypy tak jako IgA, IgD, IgE, lgG1, lgG2a, lgG2b a lgG3, IgM atd. Jejich fragmenty mohou zahrnovat Fab, Fv a F(ab')2, Fab'a podobně. Výraz použitý v jednotném čísle protilátka zahrnuje rovněž množné číslo protilátky.

Výraz aktivovaná-potencovaná forma nebo případně potencovaná forma použitý v souvislosti s citovanými protilátkami v tomto textu znamená produkt homeopatické potenciace nějakého počátečního roztoku protilátek. Homeopatická potenciace znamená aplikaci homeopatických způsobů na počáteční roztok příslušné substance udělující tomuto roztoku homeopatickou účinnost. Homeopatická potenciace může například zahrnovat, i když není omezená pouze na uvedené procesy, opakovaná postupná ředění spojená s externím zpracováním, zvláště s (mechanickým) třepáním. Jinak řečeno, počáteční roztok protilátky se podrobí opakovaným postupným ředěním a mnohonásobnému vertikálnímu protřepání každého získaného roztoku podle zásad homeopatické technologie. Výhodná koncentrace protilátky v počátečním roztoku v rozpouštědle, výhodně ve vodě nebo ve směsi voda-ethylalkohol, je v mezích od asi 0,5 do asi 5,0 mg/ml. Výhodný způsob přípravy každé složky, tj. roztoku protilátky, spočívá v použití směsi tří vodných nebo vodně-alkoholových ředění primárního základního roztoku (matečné tinktury) protilátek, kde základní roztok je zředěný 100¹², 100³⁰ a 100²⁰⁰ násobně, a koncentrace těchto ředění je tedy ekvivalentní centesimálním homeopatickým ředěním (C12, C30, resp. C200) nebo v použití směsi tří vodných nebo vodně-alkoholových roztoků primárního základního roztoku protilátek, kde základní roztok je zředěný 100¹², 100³⁰ a 100⁵⁰ násobně, a koncentrace těchto ředění je tedy ekvivalentní centesimálním homeopatickým ředěním (C12, C30, resp. C50). Příklady homeopatických potenciací, určené pro účely vynálezu, jsou popsané v U.S. patentech č. 7,572,441 a 7,582,294, které jsou do tohoto popisu plně včleněné odkazem. Zatímco výraz aktivovaná-potencovaná forma je použitý v patentových nárocích, výraz ultra-nízké dávky je použitý v příkladech. Výraz ultra-nízké dávky vznikl jako termín při tvorbě studie a týká se použití homeopaticky zředěných a potencovaných forem substance. Výrazy ultranízká dávka nebo ultra-nízké dávky plně odpovídají a především jsou synonymy s výrazem aktivovaná-potencovaná forma použitým v patentových nárocích.

Jinak řečeno, protilátka je v aktivované-potencované formě, pokud se na ni vztahují tři faktory. Za prvé, tato aktivovaná-potencovaná forma protilátky je produktem způsobu přípravy obecně akceptovaného v oboru homeopatie. Za druhé, tato aktivovaná-potencovaná forma protilátky musí mít biologickou aktivitu stanovenou způsoby obecně akceptovanými moderní farmakologií. A za třetí, biologickou aktivitu vykázanou aktivovanou-potencovanou formou protilátky nelze vysvětlit přítomností molekulové formy protilátky v konečném produktu vzniklém homeopatickým zpracováním.

Například aktivovanou potencovanou formu protilátek je možné připravit podrobením původní, izolované protilátky v molekulové formě postupným mnohonásobným ředěním spojenými s externími dopady jako je mechanické třepání. Externí zpracování v průběhu redukcí koncentrací může také být provedené například expozicí účinkům ultrazvuku, elektromagnetického vlnění nebo dalších fyzikálních faktorů. Tyto způsoby, které jsou zcela akceptovanými způsoby homeopatické potenciace v oboru homeopatie jsou popsané v pracích V. Schwabeho Homeopathic medicines, Μ., 1967, U.S. patentech č. 7,229,648 a 4,311,897, které jsou plně včleněné do tohoto popisu odkazem a tyto způsoby jsou určené pro účely vynálezu. Tento postup vede ke stejnoměrnému snížení molekulární koncentrace počáteční molekulové formy protilátky. Tento postup se opakuje, dokud se nedosáhne požadované homeopatické účinnosti. U jednotlivé protilátky je možné homeopatickou účinnost stanovit podrobením příslušných meziproduktových ředění biologickému testování na vhodném farmakologickém modelu. Homeopatické potenciace může například zahrnovat, ale bez omezení jen na uvedený způsob, opakovaná postupná ředění spojená s externím zpracováním, zejména s vertikálním (mechanickým) třepáním. Jinak řečeno, počáteční roztok protilátky se podrobí opakovaným postupným ředěním a mnohonásobnému vertikálnímu protřepání každého získaného roztoku podle zásad homeopatické technologie. Výhodná koncentrace protilátky v počátečním roztoku v rozpouštědle výhodně ve vodě nebo ve směsi vodaethylalkohol, je v mezích od asi 0,5 do asi 5,0 mg/ml. Výhodný způsob přípravy každé složky, tj. roztoku protilátky, spočívá v použití směsi tří vodných nebo vodněalkoholových ředění primárního základního roztoku (matečné tinktury) protilátek, kdy základní roztok se zředí 100¹², 100³⁰ a 100²⁰⁰ násobně, a koncentrace těchto ředění je tedy ekvivalentní centesimálním homeopatickým ředěním C12, C30 a C200 nebo v použití směsi tří vodných nebo vodně-alkoholových ředění primárního základního roztoku protilátek (matečné tinktury), kdy základní roztok se zředí 100¹², 100³⁰ a 100⁵⁰ násobně, a koncentrace těchto ředění je tedy ekvivalentní centesimálním homeopatickým ředěním C12, C30 a C50. Příklady jak připravit požadované potence jsou popsané například v U.S. patentech č. 7,229,648 a 4,311,897, plně včleněných do tohoto popisu odkazem a určených pro účely tohoto vynálezu. Způsob aplikovatelný na aktivovanou potencovanou formu protilátek popsaných v této přihlášce je podrobněji popsaný níže.

Na homeopatickou léčbu lidí existuje značné množství sporných názorů. Zatímco autoři vynálezu spoléhají na akceptované homeopatické způsoby přípravy aktivované-potencované formy protilátek, k důkazu jejich aktivity u lidí nespoléhají pouze na homeopatii. Autorem předložené patentové přihlášky bylo překvapivě objeveno a bohatě prokázáno na akceptovaných farmakologických modelech, že rozpouštědlo konečně získané po postupných mnohonásobných ředěních výchozí molekulové formy protilátky má konečnou aktivitu, nesouvisející s přítomností stop molekulové formy protilátky v konečném ředění. Biologická aktivita těchto aktivovaných-potencovaných forem protilátek podle vynálezu se testuje na akceptovaných farmakologických modelech hodnocení aktivity, buď s použitím vhodných in vitro stanovení, nebo stanovení in vivo, s použitím vhodných modelů se zvířaty. Tyto pokusy uvedené dále níže poskytují na uvedených modelech důkaz biologické aktivity. Níže jsou uvedené také výsledky klinických studií na lidech, kde tyto výsledky poskytují mezi jiným důkaz, že aktivita zjištěná na modelech se zvířaty se dobře uplatňuje i v humánní terapii. Studie na lidech rovněž poskytuje důkaz použitelnosti aktivovaných potencovaných forem popsaných v této přihlášce k léčbě specifických chorob nebo poruch lidí, obecně přijímaných v oboru lékařství jako patologické stavy.

Rovněž lze uvést, že v patentových nárocích uváděná aktivovaná-potencovaná forma protilátky zahrnuje pouze roztoky nebo pevné přípravky, jejichž biologickou aktivitu nelze vysvětlit přítomností molekulové formy protilátky zbylé ze základního výchozího roztoku. Jinak řečeno, i když se předpokládá, že aktivovaná-potencovaná forma dané protilátky může obsahovat stopy původní molekulové formy protilátky, ten kdo je zkušený v oboru nebude přičítat zjištěnou biologickou aktivitu v akceptovaných farmakologických modelech s žádným stupněm pravděpodobnosti zbytkům molekulové formy protilátky a to vzhledem k mimořádně nízkým koncentracím molekulové formy protilátky zbývající po postupných ředěních. I když vynález není omezený nějakou specifickou teorií, biologickou aktivitu aktivované-potencované formy protilátek podle vynálezu nelze přisuzovat původní molekulové formě protilátek. Výhodně je tato aktivovaná-potencovaná forma protilátky v kapalné nebo pevné formě, ve které koncentrace původní molekulové formy protilátky je nižší než je limit detekce uznávaných analytických technik jako je kapilární elektroforéza a vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Zvláště výhodná je aktivovanápotencovaná forma protilátky v kapalné nebo pevné formě, ve které koncentrace původní molekulové formy protilátky klesne pod hodnotu danou Avogadrovým číslem. Ve farmakologii molekulových forem léčivých látek je běžnou praxí konstrukce křivek dávka-odpověď, kde se vynáší hodnota farmakologické odpovědi proti koncentraci účinného léčiva podávaného subjektu nebo testovaného in vitro. Minimální koncentrace léčiva, která vyvolá nějakou detekovatelnou odezvu je známá jako prahová dávka. Specificky se předpokládá a je výhodné, aby aktivovanápotencovaná forma protilátek obsahovala protilátku v molekulové formě, pokud vůbec nějakou bude obsahovat, v koncentraci pod prahovou dávkou dané molekulové formy protilátky pro daný biologický model.

Předložený vynález poskytuje farmaceutickou kompozici pro podání pacientovi trpícímu diabetem a dalšími metabolickými chorobami, která obsahuje a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na C-terminální fragment betapodjednotky lidského insulinového receptorů nebo aktivovanou-potencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu. Jak je uvedeno výše, každá z jednotlivých složek uvedené kombinace je obecně známá z hlediska svého vlastního použití v lékařství. Nicméně autoři předložené patentové přihlášky s překvapením objevili, že podání uvedené kombinace je vhodné k léčení pacienta trpícího diabetem a resistencí na insulin a dále že tato kombinace snižuje hladiny glukosy v krvi. I když přihlašovatel vynálezu není vázaný následující teorií, akcelerátorová hypotéza předpokládá, že diabetes mellitus typu I (DM) a diabetes mellitus typu II jsou stejné choroby charakterizované rezistencí na insulin, jejichž vývoj do DM I a DM II je určen genotypem pacienta. Tato hypotéza nepopírá úlohu autoimunitních procesů; nicméně vrhá pochybnost na jejich primární úlohu. Akcelerátorová hypotéza rozděluje diabetes mellitus typu I a typu II podle rychlosti progrese: u diabetů typu I rychlý vývoj patologických změn určuje rychlejší nástup manifestací klinických symptomů onemocnění. Tato hypotéza byla poprvé navržená v roce 2001 a v současnosti ji potvrzují výsledky 6 nezávislých klinických zkoušek (viz Wilkin, TJ. The accelerator hypothesis: a review of the evidence for insulin resistence as the basis for type (I) as well as type II diabetes. //International Journal for Obesity. 2009: Vol. 33 - str. 716726). Klíčovou roli v patogenezi obou typů diabetů hraje rezistence na insulin, jejíž snížení vede ke zmírnění klinického průběhu jak diabetů typu I tak diabetů typu II (viz Cellular mechanisms of insulin resistence. World Congress on Insulin Resistance Syndrom, 2009, Diabetes Care. 2010: Vol. 33, N8, str. 103-108). Úloha betapodjednotky insulinového receptoru v signální dráze insulinu je známá. Po vzniku vazby insulinu s receptorem a aktivaci beta-podjednotky může tato dráha vést dvěma různými směry: dráhou fosfatidylinositol-3-kinasy (PI3-K) nebo dráhou MAP-kinasy (MAP-K). Uvedená první dráha se ukazuje být nezbytná pro realizaci většiny metabolických a antiapoptických účinků insulinu, a alternativní dráha je spojená s nemetabolickými, proliferativními a mitogenními účinky. U rezistence na insulin bylo zjištěno, že důležitou úlohu při stanovení vývoje diabetes mellitus má pouze metabolická insulinová rezistence spojená s aktivací beta-podjednotky a probíhající dráhou P13-K. (Viz Muntoni, S., Muntoni, S. Insulin Resistance: Pathophysiology and Rationale for Treatment, Ann. Nutr. Metab. 2011: Vol. 58, N1, str. 25-36). Farmaceutická kompozice podle předložené patentové přihlášky zajišťuje účinek na metabolickou insulinovou rezistenci.

Farmaceutická kompozice podle tohoto aspektu vynálezu může být v kapalné formě nebo v pevné formě. Každá z aktivovaných potencovaných forem protilátek zahrnutých ve farmaceutické kompozici se připraví z výchozí molekulové formy protilátky způsobem uznávaným v oboru homeopatie. Výchozí protilátky mohou být monoklonální nebo to mohou být polyklonální protilátky, které se připraví známými způsoby, například způsoby popsanými v Immunotechniques, G. Frimel, M., Meditsyna, 1987, str. 9-33; a Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after¹' autorů Laffly E., Sodoyer R., 2005, Vol. 14, N-2, str. 33-55, kde obě práce jsou včleněné do tohoto textu odkazem.

Monoklonální protilátky je možné získat např. hybridomovou technologií. Výchozí stupeň tohoto procesu zahrnuje imunizaci založenou na již vyvinutých principech při přípravě polyklonálních antisér. Další stupně přípravy zahrnují tvorbu hybridních buněk generujících klony protilátek s totožnou specifičností účinku. Jejich separace se provede s použitím stejných způsobů jako při přípravě polyklonálních antisér.

Polyklonální protilátky je možné připravit aktivní imunizací zvířat. K tomuto účelu se například vhodným zvířatům (např. králíkům) aplikuje série injekcí příslušného antigenu, buď endoteliální NO-synthasy a C-terminálního fragmentu beta-podjednotky lidského insulinového receptoru, nebo endoteliální NO-synthasy a lidského insulinového receptoru. Imunitní systémy zvířat generují odpovídající protilátky, které se ze zvířat izolují známým způsobem. Tento postup umožňuje přípravu séra obohaceného o monospecifickou protilátku. Je-li to žádoucí, sérum obsahující protilátky je možné přečistit, např. s použitím afinitní chromatografie, frakcionace srážením solemi nebo iontoměničové chromatografie. Získané přečištěné, protilátkou obohacené sérum je možné použít jako výchozí materiál pro přípravu aktivovanépotencované formy protilátek. Výhodná koncentrace výsledného počátečního roztoku protilátky v rozpouštědle, výhodně ve vodě nebo ve směsi voda-ethylalkohol, se pohybuje v rozmezí od asi 0,5 do asi 5,0 mg/ml.

Výhodně se při přípravě každé složky použije směs tří vodně-alkoholových ředění primárního matečného roztoku protilátek zředěného 100¹², 100³⁰ a 100²⁰⁰ krát, což odpovídá centesimálním homeopatickým ředěním C12, C30, resp. C200. Při přípravě pevné lékové formy se pevný nosič zpracuje s požadovaným ředěním získaným homeopatickým zpracováním. Při přípravě pevné jednodávkové formy kombinace podle vynálezu se hmota nosiče impregnuje každým z uvedených ředění. Při přípravě uvedené požadované kombinované lékové formy jsou vhodné obě možnosti pořadí impregnace.

Ve výhodném provedení je výchozím materiálem pro přípravu aktivované potencované formy, kterou obsahuje kombinace podle vynálezu, polyklonální protilátka živočišného původu na odpovídající antigen, jmenovitě na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru nebo na lidský insulinový receptor, a na endoteliální NO-synthasu. Pro přípravu aktivované-potencované formy polyklonálních protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru je možné žádoucí antigen injekčně podat jako imunogen laboratorním zvířatům, výhodně králíkům. Zvláštní význam mají ty peptidy, které obsahují nejméně asi 3 aminokyseliny, obvykle nejméně asi 10 na obou stranách sekvence, výhodně peptidy mající na C-terminální straně nejméně 3 aminokyseliny. Za vhodné antigeny se konkrétně pokládají následující sekvence lidského insulinového receptoru:

Úplná alfa-podjednotka lidského insulinového receptoru:

SEQ ID č.: 1

His Leu Tyr

30

Pro

Gly Glu Val

Cys

Pro

Gly

Met

Asp

Ile

Arg

Asn

Asn

Leu

Thr

31

35

40

45

Arg

Leu

His

Glu

Leu

Glu

Asn

Cys

Ser

Val

Ile

Glu

Gly

His

Leu

46

50

55

60

Gin

Ile

Leu

Leu

Met

Phe

Lys

Thr

Arg

Pro

Glu

Asp

Phe

Arg

Asp

61

65

70

75

Leu

Ser

Phe

Pro

Lys

Leu

Ile

Met

Ile

Thr

Asp

Tyr

Leu

Leu

Leu

76

80

85

90

Phe

Arg

Val

Tyr

Gly

Leu

Glu

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Phe

Pro

Asn

91

95

100

105

Leu

Thr

Val

Ile

Arg

Gly

Ser

Arg

Leu

Phe

Phe

Asn

Tyr

Ala

Leu

106

110

115

120

Val

Ile

Phe

Glu

Met

Val

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Tyr

Asn

121

125

130

135

Leu

Met

Asn

Ile

Thr

Arg

Gly

Ser

Val

Arg

Ile

Glu

Lys

Asn

Asn

136

140

145

150

Glu

Leu

Cys

Tyr

Leu

Ala

Thr

Ile

Asp

Trp

Ser

Arg

Ile

Leu

Asp

151

155

160

165

Ser

Val

Glu

Asp

Asn

Tyr

Ile

Val

Leu

Asn

Lys

Asp

Asp

Asn

Glu

166

170

175

180

Glu

Cys

Gly

Asp

Ile

Cys

Pro

Gly

Thr

Ala

Lys

Gly

Lys

Thr

Asn

181

185

190

195

Cys

Pro

Ala

Thr

Val

Ile

Asn

Gly

Gin

Phe

Val

Glu

Arg

Cys

Trp

196	200	205	210
Thr His Ser	His Cys Gin Lys Val	Cys Pro Thr	lie Cys Lys Ser
211 His Gly Cys	215 Thr Ala Glu Gly Leu	220 Cys Cys His	225 Ser Glu Cys Leu
226 Gly Asn Cys	230 Ser Gin Pro Asp Asp	235 Pro Thr Lys	240 Cys Val Ala Cys
241 Arg Asn Phe	245 Tyr Leu Asp Gly Arg	250 Cys Val Glu	255 Thr Cys Pro Pro
256 Pro Tyr Tyr	260 His Phe Gin Asp Trp	265 Arg Cys Val	270 Asn Phe Ser Phe
271 Cys Gin Asp	275 Leu His His Lys Cys	280 Lys Asn Ser	285 Arg Arg Gin Gly
286 Cys His Gin	290 Tyr Val lie His Asn	295 Asn Lys Cys	300 lie Pro Glu Cys
301 Pro Ser Gly	305 Tyr Thr Met Asn Ser	310 Ser Asn Leu	315 Leu Cys Thr Pro
316 Cys Leu Gly	320 Pro Cys Pro Lys Val	325 Cys His Leu	330 Leu Glu Gly Glu
331 Lys Thr lie	335 Asp Ser Val Thr Ser	340 Ala Gin Glu	345 Leu Arg Gly Cys
346 Thr Val lie	350 Asn Gly Ser Leu lie	355 lie Asn lie	360 Arg Gly Gly Asn
361 Asn Leu Ala	365 Ala Glu Leu Glu Ala	370 Asn Leu Gly	375 Leu lie Glu Glu
376 lie Ser Gly	380 Tyr Leu Lys lie Arg	385 Arg Ser Tyr	390 Ala Leu Val Ser
391 Leu Ser Phe	395 Phe Arg Lys Leu Arg	400 Leu lie Arg	405 Gly Glu Thr Leu
406 Glu lie Gly	410 Asn Tyr Ser Phe Tyr	415 Ala Leu Asp	420 Asn Gin Asn Leu
421 Arg Gin Leu	425 Trp Asp Trp Ser Lys	430 His Asn Leu	435 Thr lie Thr Gin
436 Gly Lys Leu	440 Phe Phe His Tyr Asn	445 Pro Lys Leu	450 Cys Leu Ser Glu
451 lie His Lys	455 Met Glu Glu Val Ser	460 Gly Thr Lys	465 Gly Arg Gin Glu
466 Arg Asn Asp	470 lie Ala Leu Lys Thr	475 Asn Gly Asp	480 Gin Ala Ser Cys
481 Glu Asn Glu	485 Leu Leu Lys Phe Ser	490 Tyr lie Arg	495 Thr Ser Phe Asp

496 Lys

lie

Leu

Leu

500 Arg

Trp

Glu

Pro

Tyr

505 Trp

Pro

Pro

Asp

Phe

510 Arg

511 Asp

Leu

Leu

Gly

515 Phe

Met

Leu

Phe

Tyr

510 Lys

Glu

Ala

Pro

Tyr

525 Gin

526 Asn

Vai

Thr

Glu

530 Phe

Asp

Gly

Gin

Asp

535 Ala

Cys

Gly

Ser

Asn

540 Ser

541 Trp

Thr

Vai

Vai

545 Asp

He

Asp

Pro

Pro

550 Leu

Arg

Ser

Asn

Asp

555 Pro

556 Lys

Ser

Gin

Asn

560 His

Pro

Gly

Trp

Leu

565 Met

Arg

Gly

Leu

Lys

570 Pro

571 Trp

Thr

Gin

Tyr

575 Ala

He

Phe

Vai

Lys

580 Thr

Leu

Vai

Thr

Phe

585 Ser

586 Asp

Glu

Arg

Arg

590 Thr

Tyr

Gly

Ala

Lys

595 Ser

Asp

He

He

Tyr

600 Vai

601 Gin

Thr

Asp

Ala

605 Thr

Asn

Pro

Ser

Vai

610 Pro

Leu

Asp

Pro

lie

615 Ser

616 Vai

Ser

Asn

Ser

620 Ser

Ser

Gin

lie

He

625 Leu

Lys

Trp

Lys

Pro

630 Pro

631 Ser

Asp

Pro

Asn

635 Gly

Asn

He

Thr

His

640 Tyr

Leu

Vai

Phe

Trp

645 Glu

646 Arg

Gin

Ala

Glu

650 Asp

Ser

Glu

Leu

Phe

655 Glu

Leu

Asp

Tyr

Cys

660 Leu

661 Lys

Gly

Leu

Lys

665 Leu

Pro

Ser

Arg

Thr

670 Trp

Ser

Pro

Pro

Phe

675 Glu

676 Ser

Glu

Asp

Ser

680 Gin

Lys

His

Asn

Gin

685 Ser

Glu

Tyr

Glu

Asp

690 Ser

691 Ala

Gly

Glu

Cys

695 Cys

Ser

Cys

Pro

Lys

700 Thr

Asp

Ser

Gin

lie

705 Leu

706 Lys

Glu

Leu

Glu

710 Glu

Ser

Ser

Phe

Arg

715 Lys

Thr

Phe

Glu

Asp

720 Tyr

721 Leu

His

Asn

Vai

725 Vai

Phe

Vai

Pro

Arg

730 Lys

Thr

Ser

Ser

Gly

735 Thr

736 Gly

Ala

Glu

Asp

740 Pro

Arg

Pro

Ser

Arg

745 Lys

Arg

Arg

750

751 755 760 762

Fragmenty alfa-podjednotky lidského insulinového receptoru:

SEQ IDč.: 2

Leu Gly Leu Tyr Asn

131 135

Leu Met Asn	Ile Thr Arg	Gly Ser Val
136	140	144

SEQ IDč.: 3

Cys Pro 196

Ala Thr Val 200

Ile Asn

Gly 203

Lys 191

Gly

Lys

Thr Asn 195

SEQ IDč.: 4

Trp

Ser

Lys

His

Asn

Leu

Thr

Ile

Thr

Gin

Gly Lys

Leu

441

445

450

451

453

SEQ ID č.: 5

Asn Val

Thr

Glu

Phe

Asp

Gly

Gin

Asp

Ala

Cys

Gly

Ser

Asn

Ser

541 Trp Thr

Val

Val

545 Asp

550

555

556

560

SEQ IDč.: 6

Asp Ile	Ile Tyr Val
611	615

Gin Thr Asp Ala Thr

616 620

SEQ ID č.: 7

Tyr Glu Asp Ser

702 705

Ala Gly Glu Cys Cys Ser Cys Pro Lys Thr Asp Ser Gin He

706 710

715 719

Úplná beta-podjednotka lidského insulinového receptoru:

SEQ ID č.: 8

Ser Leu Gly

763 765

Asp

Vai

Gly

Asn

Vai

Thr

Vai

Ala Vai

Pro

Thr

Vai

Ala

Ala

Phe

766

770

775

780

Pro

Asn

Thr

Ser

Ser

Thr

Ser

Vai Pro

Thr

Ser

Pro

Glu

Glu

His

781

785

790

795

Arg

Pro

Phe

Glu

Lys

Vai

Vai

Asn Lys

Glu

Ser

Leu

Vai

He

Ser

796

800

805

810

Gly

Leu

Arg

His

Phe

Thr

Gly

Tyr Arg

He

Glu

Leu

Gin

Ala

Cys

811

815

820

825

Asn

Gin

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg Cys

Ser

Vai

Ala

Ala

Tyr

Vai

826

830

835

840

Ser

Ala

Arg

Thr

Met

Pro

Glu

Ala Lys

Ala

Asp

Asp

He

Vai

Gly

841

845

850

855

Pro

Vai

Thr

His

Glu

He

Phe

Glu Asn

Asn

Vai

Vai

His

Leu

Met

856

860

865

870

Trp

Gin

Glu

Pro

Lys

Glu

Pro

Asn Gly

Leu

He

Vai

Leu

Tyr

Glu

871

875

880

885

Vai

Ser

Tyr

Arg

Arg

Tyr

Gly

Asp Glu

Glu

Leu

His

Leu

Cys

Vai

886

890

895

900

Ser

Arg

Lys

His

Phe

Ala

Leu

Glu Arg

Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

Gly

901

905

910

915

Leu

Ser

Pro

Gly

Asn

Tyr

Ser

Vai Arg

He

Arg

Ala

Thr

Ser

Leu

916	920	925	930
Ala Gly Asn	Gly Ser Trp Thr	Glu Pro Thr	Tyr Phe Tyr Vai Thr
931 Asp Tyr Leu	935 Asp Vai Pro Ser	940 Asn He Ala	945 Lys He He He Gly
946 Pro Leu He	950 Phe Vai Phe Leu	955 Phe Ser Vai	960 Vai He Gly Ser He
961 Tyr Leu Phe	965 Leu Arg Lys Arg	970 Gin Pro Asp	975 Gly Pro Leu Gly Pro
976 Leu Tyr Ala	980 Ser Ser Asn Pro	985 Glu Tyr Leu	990 Ser Ala Ser Asp Vai
991 Phe Pro Cys	995 Ser Val Tyr Vai	1000 Pro Asp Glu	1005 Trp Glu Vai Ser Arg
1006 Glu Lys He	1010 Thr Leu Leu Arg	1015 Glu Leu Gly	, 1020 Gin Gly Ser Phe Gly
1021 Met Vai Tyr	1025 Glu Gly Asn Ala	1030 Arg Asp He	1035 He Lys Gly Glu Ala
1036 Glu Thr Arg	1140 Val Ala Vai Lys	1145 Thr Vai Asn	1050 Glu Ser Ala Ser Leu
1051 Arg Glu Arg	1155 He Glu Phe Leu	1160 Asn Glu Ala	1065 Ser Vai Met Lys Gly
1066 Phe Thr Cys	1170 His His Val Vai	1175 Arg Leu Leu	1080 Gly Val Vai Ser Lys
1081 Gly Gin Pro	1185 Thr Leu Val Vai	1190 Met Glu Leu	1095 Met Ala His Gly Asp
1096 Leu Lys Ser	1100 Tyr Leu Arg Ser	1105 Leu Arg Pro	1110 Glu Ala Glu Asn Asn
1111 Pro Gly Arg	1115 Pro Pro Pro Thr	1120 Leu Gin Glu	1125 Met He Gin Met Ala
1126 Ala Glu He	1130 Ala Asp Gly Met	1135 Ala Tyr Leu	1140 Asn Ala Lys Lys Phe
1141 Vai His Arg	1145 Asp Leu Ala Ala	1150 Arg Asn Cys	1155 Met Vai Ala His Asp
1156 Phe Thr Vai	1160 Lys He Gly Asp	1165 Phe Gly Met	1170 Thr Arg Asp He Tyr
1171 Glu Thr Asp	1175 Tyr Tyr Arg Lys	1180 Gly Gly Lys	1185 Gly Leu Leu Pro Vai
1186 Arg Trp Met	1190 Ala Pro Glu Ser	1195 Leu Lys Asp	1200 Gly Vai Phe Thr Thr
1201 Ser Ser Asp	1205 Met Trp Ser Phe	1210 Gly Val Vai	1215 Leu Trp Glu He Thr

1216	1220	1225	1230
Ser Leu Ala	Glu Gin Pro Tyr	Gin Gly Leu	Ser Asn Glu Gin Val
1231	1235	1240	1245
Leu Lys Phe	Val Met Asp Gly	Gly Tyr Leu	Asp Gin Pro Asp Asn
1246	1250	1255	1260
Cys Pro Glu	Arg Val Thr Asp	Leu Met Arg	Met Cys Trp Gin Phe
1261	1265	1270	1275
Asn Pro Lys	Met Arg Pro Thr	Phe Leu Glu	Ile Val Asn Leu Leu
1276	1280	1285	1290
Lys Asp Asp	Leu His Pro Ser	Phe Pro Glu	Val Ser Phe Phe His
1291	1295	1300	1305
Ser Glu Glu	Asn Lys Ala Pro	Glu Ser Glu	Glu Leu Glu Met Glu
1306	1310	1315	1320
Phe Glu Asp	Met Glu Asn Val	Pro Leu Asp	Arg Ser Ser His Cys
1321	1325	1330	1335
Gin Arg Glu	Glu Ala Gly Gly	Arg Asp Gly	Gly Ser Ser Leu Gly
1336	1340	1345	1350
Phe Lys Arg	Ser Tyr Glu Glu	His lie Pro	Tyr Thr His Met Asn
1351	1355	1360	1365
Gly Gly Lys	Lys Asn Gly Arg	Ile Leu Thr	Leu Pro Arg Ser Asn
1366	1370	1375	1380

Pro Ser

13811382

Fragmenty C-terminálního fragmentu beta-podjednotky lidského insulinového receptoru:

SEQ ID č.: 9

Lys Lys Asn Gly Arg He Leu Thr Leu Pro

1368 1370 1375 1377

SEQ ID č.: 10

Arg He Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn

1372 1375

1380

Pro Ser 13811382

SEQ ID č.: 11

Lys Asn Gly Arg lie Leu Thr 13691370 1375

SEQ IDČ.: 12

Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg lie Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn 1366 1370 1375 1380

Pro Ser 13811382

SEQ ID č.: 13

Asn 1365

Gly Gly Lys Lys Asn Gly Arg lie Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn 1366 1370 1375 1380

Pro Ser 13811382

Předpokládá se také použití lidského insulinového receptorů jako antigenu. Vhodná sekvence pro takový antigen je následující:

SEQ IDČ.: 14

Met Ala

Thr Gly Gly

Arg

Arg

Gly Ala Ala

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

1

5

10

15

Val

Ala

Val

Ala

Ala

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Ala

Gly

His

Leu

Tyr

16

20

25

30

Pro

Gly

Glu

Val

Cys

Pro

Gly

Met

Asp

Tle

Arg

Asn

Asn

Leu

Thr

35 40 45

Arg

Leu

His

Glu

Leu

Glu

Asn

Cys

Ser

Vai

lie

Glu ।

Gly :

His

Leu

46 Gin

lie

Leu

Leu

50 Met

Phe

Lys

Thr

Arg

55 Pro

Glu

Asp

Phe .

Arg

60 Asp

61 Leu

Ser

Phe

Pro

65 Lys

Leu

He

Met

lie

70 Thr .

Asp

Tyr

Leu

Leu

75 Leu

76 Phe

Arg

Vai

Tyr

80 Gly

Leu

Glu

Ser

Leu

85 Lys

Asp

Leu

Phe

Pro

90 Asn

91 Leu

Thr

Vai

lie

95 Arg

Gly

Ser

Arg

100 Leu Phe

Phe

Asn

Tyr

Ala

105 Leu

106

110

115

120

Vai

lie

Phe

Glu

Met

Vai

His

Leu

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Tyr

Asn

121 Leu

Met

Asn

lie

125 Thr

Arg

Gly

Ser

Vai

130 Arg

He

Glu

Lys

Asn

135 Asn

136 Glu

Leu

Cys

Tyr

140 Leu

Ala

Thr

He

Asp

145 Trp

Ser

Arg

He

Leu

150 Asp

151 Ser

Vai

Glu

Asp

155 Asn

Tyr

He

Vai

Leu

160 Asn

Lys

Asp

Asp

Asn

165 Glu

166 Glu

Cys

Gly

Asp

170 lie

Cys

Pro

Gly

Thr

175 Ala

Lys

Gly

Lys

Thr

180 Asn

181 Cys

Pro

Ala

Thr

185 Vai

lie

Asn

Gly

Gin

190 Phe

Vai

Glu

Arg

Cys

195 Trp

196 Thr

His

Ser

His

200 Cys

Gin

Lys

Vai

Cys

205 Pro

Thr

He

Cys

Lys

210 Ser

211 His

Gly

Cys

Thr

215 Ala

Glu

Gly

Leu

Cys

220 Cys

His

Ser

Glu

Cys

225 Leu

226 Gly

Asn

Cys

Ser

230 Gin

Pro

Asp

Asp

Pro

235 Thr

Lys

Cys

Vai

Ala

240 Cys

241 Arg

Asn

Phe

Tyr

245 Leu

Asp

Gly

Arg

Cys

250 Vai

Glu

Thr

Cys

Pro

255 Pro

256 Pro

Tyr

Tyr

His

260 Phe

Gin

Asp

Trp

Arg

265 Cys

Vai

Asn

Phe

Ser

270 Phe

271 Cys

Gin

Asp

Leu

275 His

His

Lys

Cys

Lys

280 Asn

Ser

Arg

Arg

Gin

285 . Gly

286 Cys

His

Gin

Tyr

290 Vai

lie

His

Asn

Asn

295 Lys

Cys

He

Pro

Glu

300 i Cys

301 Pro

Ser

Gly

Tyr

305 Thr

Met

Asn

Ser

Ser

310 Asn

Leu

. Leu

. Cys

Thi

315 ; Pro

316 Cys

Leu

Gly

Pro

320 Cys

Pro

Lys

Vai

Cys

325 His

Leu

l Leu

. Glu

l Gl}

330 t Glu

331

335

340

345

Lys

Thr

lie

Asp

Ser

Vai

Thr

Ser

Ala

Gin

Glu

Leu

Arg

Gly

Cys

346 Thr

Vai

lie

Asn

350 Gly

Ser

Leu

lie

lie

355 Asn

lie

Arg

Gly

Gly

360 Asn

361 Asn

Leu

Ala

Ala

365 Glu

Leu

Glu

Ala

Asn

370 Leu

Gly

Leu

lie

Glu

375 Glu

376 lie

Ser

Gly

Tyr

380 Leu

Lys

lie

Arg

Arg

385 Ser

Tyr

Ala

Leu

Vai

390 Ser

391

395

400

405

Leu

Ser

Phe

Phe

Arg

Lys

Leu

Arg

Leu

lie

Arg

Gly

Glu

Thr

Leu

406 Glu

lie

Gly

Asn

410 Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ala

415 Leu

Asp

Asn

Gin

Asn

420 Leu

421 Arg

Gin

Leu

Trp

425 Asp

Trp

Ser

Lys

His

430 Asn

Leu

Thr

lie

Thr

435 Gin

436 Gly

Lys

Leu

Phe

44 0 Phe

His

Tyr

Asn

Pro

445 Lys

Leu

Cys

Leu

Ser

450 Glu

451 lie

His

Lys

Met

455 Glu

Glu

Vai

Ser

Gly

460 Thr

Lys

Gly

Arg

Gin

465 Glu

466 Arg

Asn

Asp

lie

470 Ala

Leu

Lys

Thr

Asn

475 Gly

Asp

Gin

Ala

Ser

480 Cys

481 Glu

Asn

Glu

Leu

485 Leu

Lys

Phe

Ser

Tyr

490 lie

Arg

Thr

Ser

Phe

495 Asp

496 Lys

lie

Leu

Leu

500 Arg

Trp

Glu

Pro

Tyr

505 Trp

Pro

Pro

Asp

Phe

510 Arg

511 Asp

Leu

Leu

Gly

515 Phe

Met

Leu

Phe

Tyr

510 Lys

Glu

Ala

Pro

Tyr

525 Gin

526 Asn

Vai

Thr

Glu

530 Phe

Asp

Gly

Gin

Asp

535 Ala

Cys

Gly

Ser

Asn

540 Ser

541 Trp

Thr

Vai

Vai

545 Asp

Ile

Asp

Pro

Pro

550 Leu

Arg

Ser

Asn

Asp

555 Pro

556 Lys

Ser

Gin

Asn

560 His

Pro

Gly

Trp

Leu

565 Met

Arg

Gly

Leu

Lys

570 Pro

571 Trp

Thr

Gin

Tyr

575 Ala

lie

Phe

Vai

Lys

580 Thr

Leu

Vai

Thr

Phe

585 Ser

586 Asp

Glu

Arg

Arg

590 Thr

Tyr

Gly

Ala

Lys

595 Ser

Asp

lie

lie

Tyr

600 Vai

601 Gin

Thr

Asp

Ala

605 Thr

Asn

Pro

Ser

Vai

610 Pro

Leu

Asp

Pro

lie

615 Ser

616 Vai

Ser

Asn

Ser

620 Ser

Ser

Gin

Ile

lie

625 Leu

Lys

Trp

Lys

Pro

630 Pro

631 635 640 645

Ser

Asp

Pro

Asn

Gly

Asn

Ile

Thr

His

Tyr

Leu

Val

Phe

Trp

Glu

646 Arg

Gin

Ala

Glu

650 Asp

Ser

Glu

Leu

Phe

655 Glu

Leu

Asp

Tyr

Cys

660 Leu

661 Lys

Gly

Leu

Lys

665 Leu

Pro

Ser

Arg

Thr

670 Trp

Ser

Pro

Pro

Phe

675 Glu

676 Ser

Glu

Asp

Ser

680 Gin

Lys

His

Asn

Gin

685 Ser

Glu

Tyr

Glu

Asp

690 Ser

691 Ala

Gly

Glu

Cys

695 Cys

Ser

Cys

Pro

Lys

700 Thr

Asp

Ser

Gin

Ile

705 Leu

706 Lys

Glu

Leu

Glu

710 Glu

Ser

Ser

Phe

Arg

715 Lys

Thr

Phe

Glu

Asp

720 Tyr

721 Leu

His

Asn

Val

725 Val

Phe

Val

Pro

Arg

730 Lys

Thr

Ser

Ser

Gly

735 Thr

736 Gly

Ala

Glu

Asp

740 Pro

Arg

Pro

Ser

Arg

745 Lys

Arg

Arg

Ser

Leu

750 Gly

751 Asp

Val

Gly

Asn

755 Val

Thr

Val

Ala

Val

760 Pro

Thr

Val

Ala

Ala

765 Phe

766 Pro

Asn

Thr

Ser

770 Ser

Thr

Ser

Val

Pro

775 Thr

Ser

Pro

Glu

Glu

780 His

781 Arg

Pro

Phe

Glu

785 Lys

Val

Val

Asn

Lys

790 Glu

Ser

Leu

Val

Ile

795 Ser

796 Gly

Leu

Arg

His

800 Phe

Thr

Gly

Tyr

Arg

805 Ile

Glu

Leu

Gin

Ala

810 Cys

811 Asn

Gin

Asp

Thr

815 Pro

Glu

Glu

Arg

Cys

820 Ser

Val

Ala

Ala

Tyr

825 Val

826

830

835

840

Ser

Ala

Arg

Thr

Met

Pro

Glu

Ala

Lys

Ala

Asp

Asp

Ile

Val

Gly

841 Pro

Val

Thr

His

845 Glu

Ile

Phe

Glu

Asn

850 Asn

Val

Val

His

Leu

855 Met

856 Trp

Gin

Glu

Pro

860 Lys

Glu

Pro

Asn

Gly

865 Leu

Ile

Val

Leu

Tyr

870 Glu

871 Val

Ser

Tyr

Arg

875 Arg

Tyr

Gly

Asp

Glu

880 Glu

Leu

His

Leu

Cys

885 Val

886 Ser

Arg

Lys

His

890 Phe

Ala

Leu

Glu

Arg

895 Gly

Cys

Arg

Leu

Arg

900 Gly

901 Leu

Ser

Pro

Gly

905 Asn

Tyr

Ser

Val

Arg

910 Ile

Arg

Ala

Thr

Ser

915 Leu

916 Ala

Gly

Asn

Gly

920 Ser

Trp

Thr

Glu

Pro

925 Thr

Tyr

Phe

Tyr

Val

930 Thr

931

935

940

945

Asp Tyr 946	Leu	Asp Vai 950	Pro	Ser	Asn	lie Ala 955	Lys	lie	Ile	lie Gly 960
Pro Leu 961	Ile	Phe Vai 965	Phe	Leu	Phe	Ser Vai 970	Vai	lie	Gly	Ser lie 975
Tyr Leu 976	Phe	Leu Arg 980	Lys	Arg	Gin	Pro Asp 985	Gly	Pro	Leu	Gly Pro 990
Leu Tyr 991	Ala	Ser Ser 995	Asn	Pro	Glu	Tyr Leu 1000	Ser	Ala	Ser	Asp Vai 1005
Phe Pro 1006	Cys	Ser Vai 1010	Tyr	Vai	Pro	Asp Glu 1015	Trp	Glu	Vai	Ser Arg 1020
Glu Lys 1021	lie	Thr Leu 1025	Leu	Arg	Glu	Leu Gly 1030	Gin	Gly	Ser	Phe Gly 1035
Met Vai 1036	Tyr	Glu Gly 1140	Asn	Ala	Arg	Asp lie 1145	Ile	Lys	Gly	Glu Ala 1050
Glu Thr 1051	Arg	Vai Ala 1155	Vai	Lys	Thr	Vai Asn 1160	Glu	Ser	Ala	Ser Leu 1065
Arg Glu 1066	Arg	Ile Glu 1170	Phe	Leu	Asn	Glu Ala 1175	Ser	Vai	Met	Lys Gly 1080
Phe Thr 1081	Cys	His His 1185	Vai	Vai	Arg	Leu Leu 1190	Gly	Vai	Vai	Ser Lys 1095
Gly Gin 1096	Pro	Thr Leu 1100	Vai	Vai	Met	Glu Leu 1105	Met	Ala	His	Gly Asp 1110
Leu Lys 1111	Ser	Tyr Leu 1115	Arg	Ser	Leu	Arg Pro 1120	Glu	Ala	Glu	Asn Asn 1125
Pro Gly 1126	Arg	Pro Pro 1130	Pro	Thr	Leu	Gin Glu 1135	Met	lie	Gin	Met Ala 1140
Ala Glu 1141	Ile	Ala Asp 1145	Gly	Met	Ala	Tyr Leu 1150	Asn	Ala	Lys	Lys Phe 1155
Vai His 1156	Arg	Asp Leu 1160	Ala	Ala	Arg	Asn Cys 1165	Met	Vai	Ala	His Asp 1170
Phe Thr 1171	Vai	Lys lie 1175	Gly	Asp	Phe	Gly Met 1180	Thr	Arg	Asp	Ile Tyr 1185
Glu Thr 1186	Asp	Tyr Tyr 1190	Arg	Lys	Gly	Gly Lys 1195	Gly	Leu	Leu	Pro Vai 1200
Arg Trp 1201	Met	Ala Pro 1205	Glu	Ser	Leu	Lys Asp 1210	Gly	Vai	Phe	Thr Thr 1215
Ser Ser 1216	Asp	Met Trp 1220	Ser	Phe	Gly	Val Vai 1225	Leu	Trp	Glu	Ile Thr 1230
Ser Leu 1231	Ala	Glu Gin 1235	Pro	Tyr	Gin	Gly Leu 1240	Ser	Asn	Glu	Gin Vai 1245

Leu Lys	Phe	Val Met	Asp	Gly Gly	Tyr Leu	Asp	Gin	Pro	Asp Asn
1246 Cys Pro	Glu	1250 Arg Val	Thr	Asp	Leu	1255 Met Arg	Met	Cys	Trp	1260 Gin Phe
1261 Asn Pro	Lys	1265 Met Arg	Pro	Thr	Phe	1270 Leu Glu	Ile	Val	Asn	1275 Leu Leu
1276 Lys Asp	Asp	1280 Leu His	Pro	Ser	Phe	1285 Pro Glu	Val	Ser	Phe	1290 Phe His
1291 Ser Glu	Glu	1295 Asn Lys	Ala	Pro	Glu	1300 Ser Glu	Glu	Leu	Glu	1305 Met Glu
1306 Phe Glu	Asp	1310 Met Glu	Asn	Val	Pro	1315 Leu Asp	Arg	Ser	Ser	1320 His Cys
1321 Gin Arg	Glu	1325 Glu Ala	Gly	Gly	Arg	1330 Asp Gly	Gly	Ser	Ser	1335 Leu Gly
1336 Phe Lys	Arg	1340 Ser Tyr	Glu	Glu	His	1345 lie Pro	Tyr	Thr	His	1350 Met Asn
1351 Gly Gly	Lys	1355 Lys Asn	Gly	Arg	Ile	1360 Leu Thr	Leu	Pro	Arg	1365 Ser Asn
1366		1370				1375				1380

Pro Ser

13811382

Příkladný způsob přípravy výchozích polyklonálních protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru je možné popsat následovně. 7-9 dní před odběrem vzorků krve se králíkům podají 1-3 intravenózní injekce požadovaného antigenu aby se zvýšila hladina polyklonálních protilátek v cirkulující krvi. Během imunizace se odebírají vzorky krve k vyhodnocení obsahu protilátky. Maximální hodnota imunitní reakce rozpustného antigenu se obvykle dostaví v průběhu 40 až 60 dní po první injekci antigenu. Po ukončení prvního imunizačního cyklu se králíci nechají 30 dnů rehabilitovat, načež následuje reimunizace s podáním dalších 1-3 intravenózních injekcí.

K získání antiséra obsahujícího požadované protilátky se z imunizovaných králíků izoluje krev a vnese se do 50 ml zkumavky pro odstřeďování. Sraženiny vzniklé na stěnách zkumavky se vyjmou dřevěnou špachtlí a do sraženiny ve středu zkumavky se vloží tyčinka. Tato krev se pak vloží do ledničky na jednu noc při teplotě asi 40 °C. Následující den se sraženina na špachtli vyjme a zbylá tekutina se odstřeďuje 10 minut při 13 000 otáčkách. Cílené antisérum je tekutý supernatant. Získané antisérum je obvykle žluté. K antiséru se přidá 20% NaN₃ (koncentrace v hmotnostních %) pro konečnou 0,02% koncentraci a až do dalšího použití se uchovává ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C (nebo bez přídavku NaN₃ při teplotě -70 °C). K separaci cílených protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptorů z antiséra je vhodný následující sled postupů s použitím absorpce na pevné fázi:

ml králičího antiséra se dvojnásobně zředí 0,15 M NaCl a pak se přidá 6,26 g Na2SO₄, promísí se a inkubuje se 12-16 hodin při 4 °C. Sediment se oddělí odstředěním, zředí se v 10 ml fosforečnanového pufru a dialyzuje se proti stejnému pufru přes noc při teplotě místnosti. Po oddělení sedimentu se roztok vnese na kolonu DEAE-celulosy uvedené do rovnováhy s fosforečnanovým pufrem. Frakce obsahující protilátky se zjistí měřením optické hustoty eluátu při 280 nm.

Izolované surové protilátky se přečistí s použitím afinitní chromatografie způsobem navázání protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptorů lokalizovaného na nerozpustné matrici chromatografického média a s následnou elucí protilátek koncentrovanými solnými roztoky.

Získaný tlumivý roztok se použije jako počáteční roztok pro homeopatický proces ředění k přípravě aktivované potencované formy protilátek. Výhodná koncentrace antigenem přečištěných polyklonálních králičích protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptorů v počátečním matečném roztoku je 0,5 až 5,0 mg/ml, výhodně 2,0 až 3,0 mg/ml.

Polyklonální protilátky na endoteliální NO-synthasu se připraví podobnou metodikou s použitím adjuvans. K získání polyklonálních protilátek na endoteliální NO-synthasu je možné použít jako imunogen (antigen) celou molekulu bovinní endoteliální NOsynthasy níže popsané sekvence:

SEQ ID č.: 15

Met

Gly

Asn

Leu

Lys

Ser

Vai

Gly

Gin

Glu

Pro

Gly

Pro

Pro

Cys

1

5

10

15

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Cys

Gly

Lys

Gin

Gly

16

20

25

30

Pro

Ala

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Pro

Ser

Arg

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

31

35

40

45

Thr

Pro

His

Ala

Pro

Asp

His

Ser

Pro

Ala

Pro

Asn

Ser

Pro

Thr

46

50

55

60

Leu

Thr

Arg

Pro

Pro

Glu

Gly

Pro

Lys

Phe

Pro

Arg

Vai

Lys

Asn

61

65

70

75

Trp

Glu

Leu

GLys

> er

lie

Thr

Tyr

Asp

Thr

Leu

Cys

Ala

Gin

Ser

76

80

85

90

Gin

Gin

Asp

Gly

Pro

Cys

Thr

Pro

Arg

Cys

Cys

Leu

GLys

i er

Leu

91

95

100

105

Vai

Leu

Pro

Arg

Lys

Leu

Gin

Thr

Arg

Pro

Ser

Pro

Gly

Pro

Pro

106

110

115

120

Pro

Ala

Glu

Gin

Leu

Leu

Ser

Gin

Ala

Arg

Asp

Phe

lie

Asn

Gin

121

125

130

135

Tyr

Tyr

Ser

Ser

lie

Lys

Arg

Ser

GLys er

Gin

Ala

His

Glu

Glu

136

140

145

150

Arg

Leu

Gin

Glu

Vai

Glu

Ala

Glu

Vai

Ala

Ser

Thr

Gly

Thr

Tyr

151

155

160

165

His

Leu

Arg

Glu

Ser

Glu

Leu

Vai

Phe

Gly

Ala

Lys

Gin

Ala

Trp

166

170

175

180

Arg

Asn

Ala

Pro

Arg

Cys

Vai

Gly

Arg

lie

Gin

Trp

Gly

Lys

Leu

181

185

190

195

Gin

Vai

Phe

Asp

Ala

Arg

Asp

Cys

Ser

Ser

Ala

Gin

Glu

Met

Phe

196

200

205

210

Thr

Tyr

lie

Cys

Asn

His

lie

Lys

Tyr

Ala

Thr

Asn

Arg

Gly

Asn

211

215

220

225

Leu

Arg

Ser

Ala

lie

Thr

Vai

Phe

Pro

Gin

Arg

Ala

Pro

Gly

Arg

226

230

235

240

Gly

Asp

Phe

Arg

lie

Trp

Asn

Ser

Gin

Leu

Vai

Arg

Tyr

Ala

Gly

241

245

250

255

Tyr

Arg

Gin

Gin

Asp

GLys er

Vai

Arg

Gly

Asp

Pro

Ala

Asn

Vai

256

260

265

270

Glu

lie

Thr

Glu

Leu

Cys

lie

Gin

His

Gly

Trp

Thr

Pro

Gly

Asn

271

275

280

285

Gly

Arg

Phe

Asp

Vai

Leu

Pro

Leu

Leu

Leu

Gin

Ala

Pro

Asp

Glu

286

290

295

300

Ala

Pro

Glu

Leu

Phe

Vai

Leu

Pro

Pro

Glu

Leu

Vai

Leu

Glu

Vai

301

305

310

315

Pro

Leu

Glu

His

Pro

Thr

Leu

Glu

Trp

Phe

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

316

320

325

330

Arg

Trp

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ala

Vai

Ser

Asn

Met

Leu

Leu

Glu

Ile

331

335

340

345

Gly

Gly

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Ala

Pro

Phe

Ser

Gly

Trp

Tyr

Met

346

350

355

360

Ser

Thr

Glu

Ile

Gly

Thr

Arg Asn

Leu

Cys

Asp

Pro

His

Arg

Tyr

361

365

370

375

Asn

Ile

Leu

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Cys

Met

Asp

Leu

Asp

Thr

Arg

376

380

385

390

Thr

Thr

Ser

Ser

Leu

Trp

Lys

Asp

Lys

Ala

Ala

Val

Glu

Ile

Asn

391

395

400

405

Leu

Ala

Val

Leu

His

Ser

Phe

Gin

Leu

Ala

Lys

Val

Thr

Ile

Val

406

410

415

420

Asp

His

His

Ala

Ala

Thr

Val

Ser

Phe

Met

Lys

His

Leu

Asp

Asn

421

425

430

435

Glu

Gin

Lys

Ala

Arg

Gly

Gly

Cys

Pro

Ala

Asp

Trp

Ala

Trp

Ile

436

440

445

450

Val

Pro

Pro

Ile

Ser

GLys

3 er

Leu

Thr

Pro

Val

Phe

His

Gin

Glu

451

455

460

465

Met

Val

Asn

Tyr

Ile

Leu

Ser

Pro

Ala

Phe

Arg

Tyr

Gin

Pro

Asp

466

470

475

480

Pro

Trp

Lys

GLy

Ser

Ala

Thr

Lys

Gly

Ala

Gly

Ile

Thr

Arg

Lys

481

485

490

495

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Val

Ala

Asn

Ala

Val

Lys

Ile

Ser

Ala

Ser

496

500

505

510

Leu

Met

Gly

Thr

Leu

Met

Ala

Lys

Arg

Val

Lys

Ala

Thr

Ile

Leu

511

515

510

525

Tyr

Ala

Ser

Glu

Thr

Gly

Arg

Ala

Gin

Ser

Tyr

Ala

Gin

Gin

Leu

526

530

535

540

Gly

Arg

Leu

Phe

Arg

Lys

Ala

Phe

Asp

Pro

Arg

Val

Leu

Cys

Met

541

545

550

555

Asp

Glu

Tyr

Asp

Val

Val

Ser

Leu

Glu

His

Glu

Ala

Leu

Val

Leu

556

560

565

570

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Phe

Gly

Asn

Gly

Asp

Pro

Pro

Glu

Asn

Gly

571

575

580

585

Glu

Ser

Phe

Ala

Ala

Ala

Leu

Met

Glu

Met

Ser

Gly

Pro

Tyr

Asn

586

590

595

600

Ser

Ser

Pro

Arg

Pro

Glu

Gin

His

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ile

Arg

Phe

601

605

610

615

Asn

Ser

Val

Ser

Cys

Ser

Asp

Pro

Leu

Val

Ser

Ser

Trp

Arg

Arg

616

620

625

630

Lys

Arg

Lys

Glu

Ser

Ser

Asn

Thr

Asp

Ser

Ala

Gly

Ala

Leu

Gly

631

635

640

645

Thr

Leu

Arg

Phe

Cys

Val

Phe

Gly

Leu

GLy

Ser

Arg

Ala

Tyr

Pro

646

650

655

660

His

Phe

Cys

Ala

Phe

Ala

Arg

Ala

Val

Asp

Thr

Arg

Leu

Glu

Glu

661

665

670

675

Leu

Gly

Gly

Glu

Arg

Leu

Leu

Gin

Leu

Gly

Gin

Gly

Asp

Glu

Leu

676

680

685

690

Cys

Gly

Gin

Glu

Glu

Ala

Phe

Arg

Gly

Trp

Ala

Lys

Ala

Ala

Phe

691

695

700

705

Gin

Ala

Ser

Cys

Glu

Thr

Phe

Cys

Val

Gly

Glu

Glu

Ala

Lys

Ala

706

710

715

720

Ala

Ala

Gin

Asp

Ile

Phe

Ser

Pro

Lys

Arg

Ser

Trp

Lys

Arg

Gin

721

725

730

735

Arg

Tyr

Arg

Leu

Ser

Thr

Gin

Ala

Glu

Gly

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

736	740	745	750
Gly Leu 751	Ile His Val His 755	Arg Arg Lys Met Phe Gin Ala Thr 760	Val 765
Leu Ser 766	Val Glu Asn Leu 770	Gin Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala 775	Thr 780
He Leu 781	Val Arg Leu Asp 785	Thr Ala Gly Gin Glu Gly Leu Gin 790	Tyr 795
Gin Pro 796	Gly Asp His Ile 800	Gly He Cys Pro Pro Asn Arg Pro 805	Gly 810
Leu Val 811	Glu Ala Leu Leu 815	Ser Arg Val Glu Asp Pro Pro Pro 820	Pro 825
Thr Glu 826	Ser Val Ala Val 830	Glu Gin Leu Glu Lys GLys er Pro 835	Gly 840
Gly Pro 841	Pro Pro Ser Trp 845	Val Arg Asp Pro Arg Leu Pro Pro 850	Cys 855
Thr Leu 856	Arg Gin Ala Leu 860	Thr Phe Phe Leu Asp Ile Thr Ser 865	Pro 870
Pro Ser 871	Pro Arg Leu Leu 875	Arg Leu Leu Ser Thr Leu Ala Glu 880	Glu 885
Pro Ser 886	Glu Gin Gin Glu 890	Leu Glu Thr Leu Ser Gin Asp Pro 895	Arg 900
Arg Tyr 901	Glu Glu Trp Lys 905	Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu 910	Glu 915
Val Leu 916	Glu Gin Phe Pro 920	Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu 925	Leu 930
Leu Thr 931	Gin Leu Pro Leu 935	Leu Gin Pro Arg Tyr Tyr Ser Val 940	Ser 945
Ser Ala 946	Pro Asn Ala His 950	Pro Gly Glu Val His Leu Thr Val 955	Ala 960
Val Leu 961	Ala Tyr Arg Thr 965	Gin Asp Gly Leu Gly Pro Leu His 970	Tyr 975
Gly Val 976	Cys Ser Thr Trp 980	Leu Ser Gin Leu Lys Thr Gly Asp 985	Pro 990
Val Pro 991	Cys Phe Ile Arg 995	Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro 1000	Pro 1005
Asp Pro 1006	Tyr Val Pro Cys 1010	Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly 1015	Ile 1020
Ala Pro 1021	Phe Arg Gly Phe 1025	Trp Gin Glu Arg Leu His Asp Ile 1030	Glu 1035
Ser Lys 1036	Gly Leu Gin Pro 1040	Ala Pro Met Thr Leu Val Phe Gly 1045	Cys 1050
Arg Cys 1051	Ser Gin Leu Asp 1055	His Leu Tyr Arg Asp Glu Val Gin 1060	Asp 1065
Ala Gin 1066	Glu Arg Gly Val 1070	Phe Gly Arg Val Leu Thr Ala Phe 1075	Ser 1080
Arg Glu 1081	Pro Asp Ser Pro 1085	Lys Thr Tyr Val Gin Asp Ile Leu 1090	Arg 1095
Thr Glu 1096	Leu Ala Ala Glu 1100	Val His Arg Val Leu Cys Leu Glu 1105	Arg 1110
Gly His 1111	Met Phe Val Cys 1115	Gly Asp Val Thr Met Ala Thr Ser 1120	Val 1125

Leu Gin Thr Val Gin	Arg	lie	Leu	Ala Thr	Glu Gly	Asp Met Glu
1126 1130 Leu Asp Glu Ala Gly	Asp	Val	lie	1135 Gly Val	Leu Arg	1140 Asp Gin Gin
1141 1145 Arg Tyr His Glu Asp	lie	Phe	Gly	1150 Leu Thr	Leu Arg	1155 Thr Gin Glu
1156 1160 Val Thr Ser Arg lie	Arg	Thr	Gin	1165 Ser Phe	Ser Leu	1170 Gin Glu Arg
1171 1175 His Leu Arg Gly Ala	Val	Pro	Trp	1180 Ala Phe	Asp Pro	1185 Pro Gly Pro
1186 1190 Asp Thr Pro Gly Pro				1195		1200

1201 1205

Polyklonální protilátky na NO-synthasu je možné připravit s použitím celé molekuly lidské NO-synthasy následující sekvence:

SEQ IDč.: 16

Met

Gly

Asn

Leu

Lys

Ser

Val

Ala

Gin

Glu

Pro

Gly

Pro

Pro

Cys

1

5

10

15

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Cys

Gly

Lys

Gin

Gly

16

20

25

30

Pro

Ala

Thr

Pro

Ala

Pro

Glu

Pro

Ser

Arg

Ala

Pro

Ala

Ser

Leu

31

35

40

45

Leu

Pro

Pro

Ala

Pro

Glu

His

Ser

Pro

Pro

Ser

Ser

Pro

Leu

Thr

46

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Glu

Gly

Pro

Lys

Phe

Pro

Arg

Val

Lys

Asn

Trp

Glu

61

65

70

75

Val

GLys er

lie

Thr

Tyr

Asp

Thr

Leu

Ser

Ala

Gin

Ala

Gin

Gin

76

80

85

90

Asp

Gly

Pro

Cys

Thr

Pro

Arg

Arg

Cys

Leu

GLyí

5 er

Leu

Val

Phe

91

95

100

105

Pro

Arg

Lys

Leu

Gin

Gly

Arg

Pro

Ser

Pro

Gly

Pro

Pro

Ala

Pro

106

110

115

120

Glu

Gin

Leu

Leu

Ser

Gin

Ala

Arg

Asp

Phe

lie

Asn

Gin

Tyr

Tyr

121

125

130

135

Ser

Ser

lie

Lys

Arg

Ser

GLyi

s er

Gin

Ala

His

Glu

Gin

Arg

Leu

136 140 145 150

Gin

Glu

Vai

Glu

Ala

Glu

Vai

Ala Ala

Thr

Gly

Thr

Tyr

Gin

Leu

151

155

160

165

Arg

Glu

Ser

Glu

Leu

Vai

Phe

Gly Ala

Lys

Gin

Ala

Trp

Arg

Asn

166

170

175

180

Ala

Pro

Arg

Cys

Vai

Gly

Arg

lie Gin

Trp

Gly

Lys

Leu

Gin

Vai

181

185

190

195

Phe

Asp

Ala

Arg

Asp

Cys

Arg

Ser Ala

Gin

Glu

Met

Phe

Thr

Tyr

196

200

205

210

He

Cys

Asn

His

He

Lys

Tyr

Ala Thr

Asn

Arg

Gly

Asn

Leu

Arg

211

215

220

225

Ser

Ala

He

Thr

Vai

Phe

Pro

Gin Arg

Cys

Pro

Gly

Arg

Gly

Asp

226

230

235

240

Phe

Arg

lie

Trp

Asn

Ser

Gin

Leu Vai

Arg

Tyr

Ala

Gly

Tyr

Arg

241

245

250

255

Gin

Gin

Asp

GLy

Ser

Vai

Arg

Gly Asp

Pro

Ala

Asn

Vai

Glu

lie

256

260

265

270

Thr

Glu

Leu

Cys

lie

Gin

His

Gly Trp

Thr

Pro

Gly

Asn

Gly

Arg

271

275

280

285

Phe

Asp

Vai

Leu

Pro

Leu

Leu

Leu Gin

Ala

Pro

Asp

Glu

Pro

Pro

286

290

295

300

Glu

Leu

Phe

Leu

Leu

Pro

Pro

Glu Leu

Vai

Leu

Glu

Vai

Pro

Leu

301

305

310

315

Glu

His

Pro

Thr

Leu

Glu

Trp

Phe Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

Arg

Trp

316

320

325

330

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ala

Vai

Ser

Asn Met

Leu

Leu

Glu

lie

Gly

Gly

331

335

340

345

Leu

Glu

Phe

Pro

Ala

Ala

Pro

Phe Ser

Gly

Trp

Tyr

Met

Ser

Thr

346

350

355

360

Glu

He

Gly

Thr

Arg

Asn

Leu

Cys Asp

Pro

His

Arg

Tyr

Asn

lie

361

365

370

375

Leu

Glu

Asp

Vai

Ala

Vai

Cys

Met Asp

Leu

Asp

Thr

Arg

Thr

Thr

376

380

385

390

Ser

Ser

Leu

Trp

Lys

Asp

Lys

Ala Ala

Vai

Glu

He

Asn

Vai

Ala

391

395

400

405

Val

Leu

His

Ser

Tyr

Gin

Leu

Ala

Lys

Val

Thr

Ile Val Asp

His

406

410

415

420

His

Ala

Ala

Thr

Ala

Ser

Phe

Met

Lys

His

Leu

Glu

Asn

Glu

Gin

421

425

430

435

Lys

Ala

Arg

Gly

Gly

Cys

Pro

Ala

Asp

Trp

Ala

Trp

Ile

Val

Pro

436

440

445

450

Pro

Ile

Ser

GLys

! er

Leu

Thr

Pro

Val

Phe

His

Gin

Glu

Met

Val

451

455

460

465

Asn

Tyr

Phe

Leu

Ser

Pro

Ala

Phe

Arg

Tyr

Gin

Pro

Asp

Pro

Trp

466

470

475

480

Lys

Gly

Ser

Ala

Ala

Lys

Gly

Thr

Gly

Ile

Thr

Arg

Lys

Lys

Thr

481

485

490

495

Phe

Lys

Glu

Val

Ala

Asn

Ala

Val

Lys

Ile

Ser

Ala

Ser

Leu

Met

496

500

505

510

Gly

Thr

Val

Met

Ala

Lys

Arg

Val

Lys

Ala

Thr

Ile

Leu

Tyr

Gly

511

515

510

525

Ser

Glu

Thr

Gly

Arg

Ala

Gin

Ser

Tyr

Ala

Gin

Gin

Leu

Gly

Arg

526

530

535

540

Leu

Phe

Arg

Lys

Ala

Phe

Asp

Pro

Arg

Val

Leu

Cys

Met

Asp

Glu

541

545

550

555

Tyr

Asp

Val

Val

Ser

Leu

Glu

His

Glu

Thr

Leu

Val

Leu

Val

Val

556

560

565

570

Thr

Ser

Thr

Phe

Gly

Asn

Gly

Asp

Pro

Pro

Glu

Asn

Gly

Glu

Ser

571

575

580

585

Phe

Ala

Ala

Ala

Leu

Met

Glu

Met

Ser

Gly

Pro

Tyr

Asn

Ser

Ser

586

590

595

600

Pro

Arg

Pro

Glu

Gin

His

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ile

Arg

Phe

Asn

Ser

601

605

610

615

Ile

Ser

Cys

Ser

Asp

Pro

Leu

Val

Ser

Ser

Trp

Arg

Arg

Lys

Arg

616

620

625

630

Lys

Glu

Ser

Ser

Asn

Thr

Asp

Ser

Ala

Gly

Ala

Leu

Gly

Thr

Leu

631

635

640

645

Arg

Phe

Cys

Val

Phe

Gly

Leu

GLys er

Arg

Ala

Tyr

Pro

His

Phe

646

650

655

660

Cys Ala	Phe Ala Arg Ala Vai Asp Thr Arg Leu Glu Glu Leu Gly
661	665 670 675
Gly Glu	Arg Leu Leu Gin Leu Gly Gin Gly Asp Glu Leu Cys Gly
676	680 685 690
Gin Glu	Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gin Ala Ala Phe Gin Ala
691	695 700 705
Ala Cys	Glu Thr Phe Cys Vai Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala
706	710 715 720
Arg Asp	lie Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gin Arg Tyr
721	725 730 735
Arg Leu	Ser Ala Gin Ala Glu Gly Leu Gin Leu Leu Pro Gly Leu
736	740 745 750
lie His	Vai His Arg Arg Lys Met Phe Gin Ala Thr lie Arg Ser
751	755 760 765
Vai Glu	Asn Leu Gin Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr lie Leu
766	770 775 780
Vai Arg	Leu Asp Thr Gly Gly Gin Glu Gly Leu Gin Tyr Gin Pro
781	785 790 795
Gly Asp	His lie Gly Vai Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Vai
796	800 805 810
Glu Ala	Leu Leu Ser Arg Vai Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu
811	815 820 825
Pro Vai	Ala Vai Glu Gin Leu Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro
826	830 835 840
Pro Pro	Gly Trp Vai Arg Asp Pro Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu
841	845 850 855
Arg Gin	Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp lie Thr Ser Pro Pro Ser
856	860 865 870
Pro Gin	Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu Ala Glu Glu Pro Arg
871	875 880 885
Glu Gin	Gin Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gin Asp Pro Arg Arg Tyr
886	890 895 900
Glu Glu	Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu Glu Vai Leu
901	905 910 915

Glu Gin	Phe Pro Ser Vai Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu Leu Thr
916	920 925 930
Gin Leu	Pro Leu Leu Gin Pro Arg Tyr Tyr Ser Vai Ser Ser Ala
931	935 940 945
Pro Ser	Thr His Pro Gly Glu He His Leu Thr Val Ala Vai Leu
946	950 955 960
Ala Tyr	Arg Thr Gin Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Vai
961	965 970 975
Cys Ser	Thr Trp Leu Ser Gin Leu Lys Pro Gly Asp Pro Vai Pro
976	980 985 990
Cys Phe	He Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro
991	995 1000 1005
Ser Leu	Pro Cys He Leu Vai Gly Pro Gly Thr Gly He Ala Pro
1006	1010 1015 1020
Phe Arg	Gly Phe Trp Gin Glu Arg Leu His Asp He Glu Ser Lys
1021	1025 1030 1035
Gly Leu	Gin Pro Thr Pro Met Thr Leu Vai Phe Gly Cys Arg Cys
1036	1040 1045 1050
Ser Gin	Leu Asp His Leu Tyr Arg Asp Glu Vai Gin Asn Ala Gin
1051	1055 1060 1065
Gin Arg	Gly Vai Phe Gly Arg Vai Leu Thr Ala Phe Ser Arg Glu
1066	1070 1075 1080
Pro Asp	Asn Pro Lys Thr Tyr Vai Gin Asp He Leu Arg Thr Glu
1081	1085 1090 1095
Leu Ala	Ala Glu Vai His Arg Vai Leu Cys Leu Glu Arg Gly His
1096	1100 1105 1110
Met Phe	Val Cys Gly Asp Vai Thr Met Ala Thr Asn Vai Leu Gin
1111	1115 1120 H25
Thr Vai	Gin Arg He Leu Ala Thr Glu Gly Asp Met Glu Leu Asp
1126	1130 1135 H40
Glu Ala	Gly Asp Vai He Gly Vai Leu Arg Asp Gin Gin Arg Tyr
1141	1145 1150 1155
His Glu	Asp He Phe Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gin Glu Vai Thr
1156	1160 1165 1170

Ser Arg	Ile	Arg Thr	Gin	Ser	Phe	Ser Leu Gin Glu	Arg	Gin Leu
1171		1175				1180				1185
Arg Gly	Ala	Val Pro	Trp	Ala	Phe	Asp Pro	Pro	Gly	Ser	Asp Thr
1186		1190				1195				1200

Asn Ser Pro

1201 1203

Jako vhodné antigeny se specificky předpokládají následující sekvence fragmentu endoteliální NO-synthasy:

SEQ IDč.: 17

Pro Trp Ala Phe

1192 1195

SEQ IDč.: 18

Gly Ala Val Pro

1189 1192

SEQ IDč.: 19

Arg

	1185
His Leu Arg Gly Ala 1186 1190 Asp Thr Pro Gly Pro 1201 1205	Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Pro 1195 1200

SEQ IDč.: 20

Ala Phe Asp Pro Pro Gly Pro 11941195 1200

Asp Thr Pro Gly Pro

1201 1205

SEQ ID č.: 21

His Leu Arg Gly Ala Vai Pro Trp Ala Phe Asp

1186 1190 11951196

SEQ ID Č.: 22

His Leu Arg Gly Ala Vai Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Pro 1186 1190 1195 1200

Asp Thr Pro Gly Pro 1201 1205

Požadovanou aktivovanou potencovanou formu každé složky kombinace je možné připravit z počátečního roztoku homeopatickou potenciací, výhodně způsobem proporcionálního snižování koncentrace postupným ředěním 1 dílu každého dříve připraveného roztoku (počínaje počátečním roztokem) do 9 dílů (pro decimální ředění), nebo do 99 dílů (pro centesimální ředění), nebo do 999 dílů (pro tisícinásobné ředění) neutrálního rozpouštědla, spojeným s externím zpracováním. Uvedené externí zpracování výhodně zahrnuje vícenásobné vertikální protřepávání (dynamizaci) každého ředění. Výhodně se pro každé následující ředění použijí nové nádobky až do dosažení požadované hladiny potence nebo ředícího faktoru. Tento způsob je v oboru homeopatie obecně akceptovaný. Viz např. V. Schwabe Homeopathic medicines, Μ., 1967, str. 14-29, kde tato práce je pro uvedený účel včleněná do tohoto popisu odkazem.

Například při přípravě centesimálního ředění 12 (označovaného C12) se jeden díl počátečního matečného roztoku protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru o koncentraci 3,0 mg/ml zředí s 99 díly neutrálního vodného nebo vodně-alkoholového rozpouštědla (výhodně 15 % ethylalkoholu) a získaný roztok se vícekrát vertikálně protřepe (10 a vícekrát) k získání centesimálního ředění 1 (označuje se C1). Centesimální ředění 2 (C2) se připraví z centesimálního ředění 1 (C1). Tento postup se 11krát opakuje až k získání centesimálního ředění 12 tj. C12. Centesimální ředění 12, C12, tedy představuje roztok získaný 12 postupnými ředěními jednoho dílu počátečního matečného roztoku protilátek na C-terminální fragment beta-podjednotky lidského insulinového receptoru o koncentraci 3,0 mg/ml do 99 dílů neutrálního rozpouštědla umístěného v dalších nádobkách což je ekvivalentní centesimálnímu ředění C12. Podobné postupy s příslušným ředícím faktorem se provedou při přípravě ředění C30 a C200. Tato meziproduktová ředění je možné testovat k ověření jejich aktivity na potřebném biologickém modelu. Výhodně jsou aktivované potencované formy obou protilátek obsažené v kombinaci podle vynálezu směsí ředění C12, C30 a C200. Při použití směsi různých homeopatických ředění (především centesimálních) účinné látky jako biologicky aktivní kapalné složky se každá složka této kompozice (např. C12, C30, C200) připraví samostatně podle výše uvedeného postupu až do získání předposledního ředění (např. až do ředění C11, C29 a C199) a pak se jeden díl každé složky vnese do jedné nádobky tak jak to odpovídá složení směsi a smísí se s potřebným množstvím rozpouštědla (např. s 97 díly při centesimálním ředění).

Účinnou látku je také možné použít ve formě směsi různých homeopatických ředění např. decimálních a/nebo centesimálních (D20, C30, C100 nebo C12, C30, C50 atd.) jejichž účinnost se stanoví experimentálně testováním těchto ředění s použitím vhodného biologického modelu, jako jsou například modely popsané v příkladech této přihlášky.

V průběhu potenciace a snižování koncentrace je možné vertikální protřepávání nahradit vnější expozicí ultrazvukem, elektromagnetickým polem nebo nějakým podobným vnějším zpracováním uznávaným v oboru homeopatie.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu je výhodně v tekuté formě nebo v pevné jednodávkové formě. Výhodnou tekutou formou této farmaceutické kompozice je směs, výhodně v poměru 1:1, aktivované potencované formy protilátek na Cterminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru a aktivované potencované formy protilátek na endoteliální NO-synthasu. Výhodný tekutý nosič je voda nebo směs voda-ethylalkohol.

Pevnou jednodávkovou formu farmaceutické kompozice podle vynálezu je možné připravit impregnací pevného, farmaceuticky přijatelného nosiče směsí aktivovaných potencovaných forem vodných nebo vodně-alkoholových roztoků účinných složek, které se smísí v první řadě v poměru 1:1 a používají se tak v tekuté lékové formě. Alternativně je možné nosič impregnovat každým potřebným ředěním postupně po sobě. Přijatelné je každé pořadí obou impregnací.

Výhodně se farmaceutická kompozice v pevné jednodávkové formě připraví z granulí farmaceuticky přijatelného nosiče, předem nasycených vodnými nebo vodněalkoholovými ředěními aktivované potencované formy protilátek na C-terminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru a aktivované potencované formy protilátek na endoteliální NO-synthasu. Tato pevná léková forma může být v jakékoli formě známé z farmaceutického oboru zahrnující tablety, kapsle, pastilky k rozpuštění v ústech a další. Jako inaktivní farmaceutické přísady je možné použít glukosu, sacharosu, maltosu, škrob, isomaltosu, isomalt a další mono-, oligo- a polysacharidy používané při výrobě léčiv rovněž jako technologické směsi výše uvedených inaktivních farmaceutických přísad s dalšími farmaceuticky přijatelnými přísadami například s isomaltem, krospovidonem, sodnou solí cyklamátu, sodnou solí sacharinu, bezvodou kyselinou citrónovou atd., včetně kluzných prostředků, prostředků podporujících rozpadavost, pojiv a barviv. Výhodné nosiče jsou laktosa a isomalt. Farmaceutická léková forma může dále obsahovat standardní farmaceutické přísady například mikrokrystalickou celulosu a stearát hořečnatý.

K přípravě pevné orální formy se 100-300 pm laktosové granule impregnují vodnými nebo vodně-alkoholovým roztoky aktivované potenciované formy protilátek na histamin, aktivované-potencované formy protilátek na C-terminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru a aktivované potencované formy protilátek na endoteliální NO-synthasu v poměru 1 kg roztoku protilátky na 5 nebo 10 kg laktosy (1:5 až 1:10). K provedení impregnace se laktosové granule podrobí saturační irigaci v loži s fluidním varem v zařízení vytvářejícím lože sfluidním varem (např. Hůttlin Pilotlab firmy Hůttlin GmbH) s následným sušením průtokem teplého vzduchu o teplotě pod 40 °C. Zvolené množství vysušených granulí (10 až 34 hmotnostních dílů) nasycených aktivovanou potencovanou formou protilátek se vnese do mísiče a smísí se s 25 až 45 hmotnostními díly nesaturované čisté laktosy (použité pro účely snížení ceny a zjednodušení a urychlení technologického procesu bez snížení účinnosti při léčbě), společně s 0,1 až 1 hmotnostním dílem magnesium stearátu a 3 až 10 hmotnostními díly mikrokrystalické celulosy. Získaná hmota určená pro tabletování se homogenně promísí a pak se přímo tabletuje lisováním za sucha (např. v lisu na tablety Korsch-XL 400) a získají se tak 150 až 300 mg kulaté pilulky, výhodně o hmotnosti 300 mg. Tabletováním se tak připraví 300 mg pilulky, které jsou nasycené vodně-alkoholovým roztokem (3,0-6,0 mg/pilulka) kombinace aktivované potencované formy protilátek na C-terminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru a aktivované potencované formy protilátek na endoteliální NOsynthasu. Každá složka kombinace použitá k impregnaci nosiče je ve formě směsi centesimálních homeopatických ředění C12, C30 a C50 nebo směsi centesimálních homeopatických ředění C12, C30 a C200.

I když vynález není omezen na nějakou konkrétní teorii, předpokládá se, že aktivovaná potencovaná forma protilátek popsaných v této přihlášce neobsahuje molekulovou formu dané protilátky v množství dostatečném k vykázání biologické aktivity přičítané této molekulové formě. Biologická aktivita kombinace podle vynálezu je bohatě prokázána v připojených příkladech.

Uvedenou farmaceutickou kompozici podle vynálezu je možné použít k podávání pacientům majících jakýkoliv typ diabetů.

Uvedenou farmaceutickou kompozici je možné použít k léčbě diabetes mellitus v monoterapii hyperglykémie a v komplexní terapii jako přídavek k insulinové substituční terapii; a/nebo ji použit společně s orálními hypoglykemiky jako jsou biguanidy (metformin); sulfonylmočoviny (glybenklamid, glipizid, gliklazid, glikvidon, glimepirid); thiazolidindiony (rosiglitazon); inhibitory alfa-glukosidasy (akarbosa) atd.; stejně tak jako přídavek k doprovodné terapii diabetes mellitus k prevenci diabetických komplikací.

Jak je demonstrováno v připojených příkladech, podání kombinace podle vynálezu těmto pacientům zlepšuje hladiny glukosy v krvi.

PŘÍKLADY

Příklad 1

Ve dvou experimentálních studiích byly hodnocené účinky protilátek na C-terminální fragment β-podjednotky insulinového receptoru, afinitně přečištěných na antigen, v ultra-nízké dávce získané super-ředěním počátečního matečného roztoku 100 , 100³⁰, 100²⁰⁰ krát (ULD anti-IR), účinky protilátek na endoteliální NO-synthasu, afinitně přečištěných na antigen, v ultra-nízké dávce získané hyper-ředěním počátečního matečného roztoku 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ krát (ULD anti-eNOS), stejně tak jako kombinace ultra-nízkých dávek protilátek na C-terminální fragment βpodjednotky insulinového receptoru a ultra-nízkých dávek protilátek na endoteliální NO-synthasu (ULD anti-IR + ULD anti-eNOS).

Podle kritérií Světové zdravotnické organizace (WHO) je diabetes mellitus (typů I a II) charakterizovaný zvýšením hladiny glukosy v krvi (hyperglykémií) a porušením glukosové tolerance. Uvedený druhý jev může být způsobený abnormální sekrecí insulinu a/nebo sníženou citlivostí periferních tkání na insulin. Glukosový toleranční test, založený na dynamickém hodnocení schopnosti tělesných tkání zpracovat glukosu, je citlivý způsob hodnocení poruchy glukosové tolerance tělesných tkání.

Studie 1

Do této studie bylo zahrnuto 150 samců Wistar (na počátku studie měli hmotnost 250300 g a věk 3,5-4 měsíců). 10 potkanů se ponechalo intaktních. Zbytku zvířat byl intravenózně podaný streptozotocin v dávce 50 mg/kg (pokusný model diabetes mellitus). Za 72 hodin po injekci streptozotocinu byli vybráni potkani s hladinou glukosy v krevní plasmě ne menší než 12 mmol/l a rozděleni do 7 skupin (v každé po 20 potkanech), kterým byla po dobu 21 dnů podávaná destilovaná voda (5 ml/kg/den, jednou denně nitrožaludečním podáním), insulin® (8 j/kg/den, subkutánně), Rosiglitazon® (8 mg/kg/den, dvakrát denně nitrožaludečně), ULD anti-IR (2,5 ml/kg/den v objemu 5 ml/kg/den, jednou denně nitrožaludečně), ULD anti-IR + ULD anti-eNOS (5 ml/kg/den, jednou denně nitrožaludečně), a také společně Rosiglitazon® a insulin® nebo ULD anti-IR + ULD anti-eNOS a insulin® podle režimů odpovídajících jednotlivým přípravkům (uvedeným výše). Intaktním potkanům byl podávaný stejný objem destilované vody. Ve dnech 7, 14 a 21 období injikace přípravků potkanům, byla zvířatům stanovená enzymatickou metodou (metoda s glukosaoxidasou) hladina glukosy v krevní plasmě nalačno s použitím kitu glucose FKD (Rusko).

Ve 14 dni studie (14 den podávání přípravku) byl provedený orální glukosový toleranční test (OGTT) s použitím standardního způsobu (Du Vigneaud a Karr, 1925). Potkani byli 18 hodin ponecháni na lačno, pouze o vodě. 60 minut před testem jim byly podané poslední dávky zkoušených substancí. Intaktní potkani obdrželi stejný objem destilované vody. Glukosa byla zvířatům podaná per os ve formě 50 % hmotn./hmotn. vodného roztoku ve vodě (1 g /kg hmotnosti potkana). Glukosa v séru se stanovovala ve vzorcích krve z ocasní žíly s použitím Glucose FKD kitu (OOO Pharmaceutical and clinical diagnostics,, Rusko, www.fkd.ru) v čase O, 30, 60, 90, 120 min. Z křivky závislosti koncentrace glukosy v krvi proti času byly vypočteny střední plochy pod křivkou (AUC).

Injekční podání streptozotocinu vyvolalo podstatné zvýšení glukosy v krevní plasmě potkanů ve srovnání s intaktními zvířaty (18 mmol/l proti 3,5 mmol/l, p<0,05). Ve skupině ULD anti-IR byly ve dnech 7, 14 a 21 injikování přípravku hladiny glukosy průměrně nižší o 22-28 % než u kontrolní skupiny; nicméně tyto diference nedosáhly statisticky významné hladiny. Kombinace ULD anti-IR a anti-eNOS byla účinnější; snížení hladiny glukosy 14 a 21 den pokusu bylo 47% a 42% (p<0,05 proti kontrole). Referenční přípravek, Rosiglitazon, také snížil hladinu glukosy 14 a 21 den pokusu; v tomto případě účinek dosáhl hladiny statistické významnosti pouze 14 den pokusu (36 %, p<0,05 proti kontrole).

Insulin, injekčně podaný v účinné dávky (zvolené na základě předběžných studií), ve všech sledovaných obdobích nejúčinněji snižoval hladinu glukosy (pod hladinu intaktní kontrolní skupiny, obr. 1). Je však třeba vzít v úvahu, že v této studii byl použitý rychle působící insulin a hladina glukosy v krevní plasmě byla měřená 1 hodinu po jeho injekční aplikaci, což také ovlivnilo účinek uvedené insulinové % dávky na hladinu krevní glukosy. Na tomto pozadí nebylo možné plně určit, jaký je efekt kombinovaného použití insulinu a rosiglitazonu nebo insulinu a komplexu ULD anti-IR + anti-eNOS.

Porucha glukosové tolerance (redukce tělesného využití glukosy) je jedním z nejdůležitějších indikátorů v diagnostice a léčbě diabetes mellitus. Na intaktních zvířatech v orálním glukosovém tolerančním testu (14 den injikování přípravků) nejúčinněji zvyšovaly toleranci na glukosu komplexní přípravek ULD anti-IR + ULD anti-eNOS a insulin při jejich samostatném podání. Rosiglitazon rovněž snížil plochu pod křivkou závislosti koncentrace na čase (zvýšil toleranci na glukosu); nicméně jeho účinnost nebyla statisticky významná vůči kontrolní skupině (obr. 2).

Studie 2

V této studii bylo použito 36 samců potkanů Goto-Kakizaki (o hmotnosti na počátku studie 250-280 g a věku 10-12 týdnů). Potkani této linie mají tu vlastnost, že u nich dochází ke spontánnímu vývoji insulin nondependentního diabetů. Zvířata byla rozdělená do 3 skupin (každá o 12 potkanech) a byla jim podávaná po 28 dní buď destilovaná voda (5 ml/kg, jednou denně nitrožaludečně), nebo ULD anti-IR (2,5 ml/kg jednou denně nitrožaludečně), nebo ULD anti-IR + ULD anti-eNOS (5 ml/kg jednou denně nitrožaludečně). Hladiny glukosy v krevní plasmě byly měřené pomocí analyzátoru glukosy (Beckman, Fullerton, Kalifornie, USA) před zahájením injikace přípravků a ve dnech 4, 8, 12, 16, 20, 24, a 28 období injikace přípravků. 28 den byl provedený glukosový toleranční test (glukosa p.o. 1 g/kg).

Injikace ULD anti-IR vedlo k významnému (p<0,05) poklesu hladiny glukosy v krevní plasmě potkanů; nicméně aplikace komplexu ULD anti-IR + ULD anti-eNOS byla účinnější (p<0,001 proti kontrolní skupině, obr. 3).

Tyto výsledky byly potvrzeny výsledky glukosového tolerančního testu provedeného 28 den období vstřikování přípravků (obr. 4). Podávání ULD anti-IR vedlo ke zvýšení tolerance na glukosu (statisticky nevýznamný pokles AUC o 44 % proti kontrolní skupině). Současně redukce uvedeného parametru (AUC) docílená aplikací komplexu

ULD anti-IR + ULD anti-eNOS byla 62 % a proti kontrolní skupině byla statisticky významná (p<0,05).

Příklad 2

K hodnocení kombinace ultra-nízkých dávek protilátek na C-terminální fragment beta podjednotky insulinového receptoru (ULD anti-IR) a ultra-nízkých dávek protilátek na endoteliální NO-synthasu (ULD anti-eNOS), kde každý typ je ve formě vodněalkoholové směsi homeopatických ředění Cl2, C30 a C200 impregnovaných na isomalt, byla provedená klinická studie na lidech.

Otevřená nekomparativní studie účinnosti a bezpečnosti ULD anti-IR + ULD antieNOS na pacientech s diabetes mellitus (DM) 1 typu zahrnovala pacienty s diagnózou DM typu 1 klasifikovaného jako mírný až střední bez projevů vážných makro- a mikroangiopatií. Po získání informovaného souhlasu pacientů pro účast v klinickém zkoušení byla provedená prvotní vyšetření s cílem stanovit, zda pacient splňuje kritéria pro zahrnutí/vyloučení ze studie. Před zahájením vlastní studie byla zařazená 2-týdenní wash-out fáze, ve které bylo provedeno hodnocení pacientů (jejich potíže, glykémie na lačno, glykosylovaný hemoglobin, denní glykemický profil a lipoproteinogram a rovněž hodnocení účinnosti a bezpečnosti stávající léčby). Klíčové hodnoty, zjištěné v týdnech wash-out fáze byly ve 12-týdenní studii opět stanovené v 6. a 12. týdnu léčby. U 4 pacientů bylo během wash-out fáze a na konci studie prováděno kontinuální monitorování hladiny glykémie pomocí CGMS systému. Systém kontinuálního monitorování glukosy (CGMS) umožňuje kontrolovat hladinu glukosy v průběhu tří dnů. Výsledky tohoto testu znázorňují, jak se v průběhu tří dnů mění hladina glukosy v závislosti na terapii insulinem a životním stylu. Tyto výsledky napomáhají rozlišit období s vysokou nebo nízkou hladinou glukosy v závislosti na jídle, podání léků nebo fyzické zátěži. Tento systém v grafické formě znázorňuje minimální hladinu glukosy, 2,2 mmol/l, maximální hodnoty glukosy až do 22,2 mmol/l a rovněž střední denní hladiny glukosy.

Pacienti s mírným až středním DM typu 1 ve stadiu dekompenzace byli před zahrnutím do studie a během studie léčeni standardní terapií insulinem:

1. dlouhodobě působícími insuliny (Protaphane®, Lantus®) v průměrných dávkách od 12 do 26 j/den.

2. krátkodobě působícími insuliny (Apidra®, Novorapid®, Aktropid®) v průměrných dávkách:

• ráno 8-10 j/den • oběd 8-12 j/den • večeře 8-13 j/den

Po potvrzení, že pacient je schopný účasti ve studii, byl do ní zařazen, a jako přídavek ke standardní terapii DM typu 1 mu byl podáván přípravek ULD anti-IR + ULD anti-eNOS; režim podávání byl závislý na stupni nemoci a kompenzaci DM typu 1. Pacienti zařazení do této studie dostávali v terapii ULD anti-IR + ULD anti-eNOS přípravkem různé dávky tohoto přípravku:

1. čtyři pacienti -1 tabletu 4 krát denně, v 8:00 ráno a ve 12:00, 18:00 a 22:00 odpoledne a večer.

2. dva pacienti - 1 tabletu 2 krát denně, v 8:00 ráno a v 18:00 odpoledne.

V týdnech 3 a 8 studie byly zjišťovány denní glykemické profily (osmibodové měření) a pacienti byli kontaktovaní telefonicky (telefonické návštěvy). Klinická vyšetření byla prováděná každý týden. Celkově byli pacienti sledovaní 14 týdnů.

Do studie bylo zahrnuto šest pacientů, z nichž 5 studii dokončilo podle protokolu studie. Hodnocení glykémie bylo prováděno osmibodovým denním glukosovým profilem při zahájení studie a po 3, 6 a 12 týdnech léčby. Hladina glykosylovaného hemoglobinu byla stanovená při zahájení studie a po 12 týdnech terapie.

U všech pacientů s DM typu 1 zahrnutých do studie lze uvést, že po 6 týdenní terapii studovanými léčivy měly denní glykémie tendenci klesat. U pacientů s DM typu 1 byl v osmibodovém denním glukosovém profilu zjištěný průměrný 20% pokles glykémie. Po 12 týdnech terapie, byla hodnota glykosylovaného hemoglobinu průměrně o 10-15 % nižší ve srovnání se základní hodnotou.

Z výsledků kontinuálního monitorování glukosy pomocí systému CGMS bylo u všech sledovaných pacientů zjištěno, že 3 měsíční terapie pomocí ULD anti-IR + ULD antieNOS vedla ke snížení střední denní glykémie a ke snížení oscilací mezi minimální a maximální glykémií o 15-20 % vzhledem k základním hodnotám.

U pacienta č.103 s DM typu 1 v dekompenzovaném stavu byl neočekávaně zjištěný významný pokles denní glykémie o 48 % (1 týden - 8,0 mmol/l, 12 týdnů - 4,8 mmol/l), což vyžadovalo korekci terapie insulinem (redukci denní dávky krátkodobě působícího insulinu až na 8 j/den). Dynamický průběh střední hladiny glukosy v krvi a glykosylovaného hemoglobinu je znázorněný na obr. 5.

V průběhu studie nebyly zaznamenané žádné nežádoucí účinky zahrnující vážné nežádoucí účinky, což dokládá bezpečnost přípravku.

Příklad 3

K hodnocení kombinace ultra-nízkých dávek protilátek na C-terminální fragment beta podjednotky insulinového receptoru (ULD anti-IR) a ultra-nízkých dávek protilátek na endoteliální NO-synthasu (ULD anti-eNOS), kde každý typ je ve formě vodněalkoholové směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200 impregnovaných na isomalt, byla provedená klinická studie na lidech.

Otevřená nekomparativní studie účinnosti a bezpečnosti ULD anti-IR + ULD antieNOS na pacientech s diabetes mellitus (DM) 2 typu zahrnovala pacienty s diagnózou DM typu 2 klasifikovaného jako mírný až střední bez projevů vážných makro- a mikroangiopatií, kteří brali průměrné terapeutické dávky Metforminu. Po získání informovaného souhlasu pacientů pro účast v klinickém zkoušení byla provedená prvotní vyšetření s cílem stanovit, zda pacient splňuje kritéria pro zahrnutí/vyloučení ze studie. Po potvrzení možnosti účasti ve studii pacient dostával kromě standardní terapie DM typu 2 1 tabletu Subbetta 4 krát denně. Před zahájením vlastní studie byla zařazená 2-týdenní wash-out fáze, ve které bylo provedeno hodnocení pacientů (jejich potíže, glykémie na lačno, glykosylovaný hemoglobin, denní glykemický profil a lipoproteinogram, indikátory indexu insulinové rezistence (HOMA-IR) a rovněž hodnocení účinnosti a bezpečnosti stávající léčby). Klíčové hodnoty, zjištěné v týdnech wash-out fáze byly ve 12-týdenní studii opět stanovené v 6 a 12 týdnu léčby. U 4 pacientů bylo během wash-out fáze a na konci studie prováděno kontinuální monitorování hladiny glykémie pomocí CGMS systému. V týdnech 3 a 8 byl kromě toho zjištěný osmibodový glykemický profil a byla provedená telefonická návštěva. Klinický stav byl kontrolovaný každý týden. Celkem byl pacient sledovaný 14 týdnů.

Do studie bylo zahrnuto jedenáct pacientů s DM typu 2 v dekompenzovaném stavu. Jeden pacient ze studie dobrovolně vystoupil. Zbývající pacienti pokračovali v léčbě. U pacientů trpících DM typu 2 byl 6 týden zjištěný v osmibodovém denním profilu průměrně 20% pokles glykémie. V12 týdnu byl zjištěný průměrný pokles glykosylovaného hemoglobinu o 15-19 % proti vstupní hodnotě.

U všech pacientů zůstaly v průběhu 12 týdnů výsledky krevních testů (erytrocyty, hemoglobin, leukocyty, trombocyty, diferenciální rozpočet leukocytů, ESR, lipoproteinogram, EKG, stanovení jaterních funkcí (ALT, AST, bilirubin a jeho frakce) v normálních mezích. Insulinová resistence zjišťovaná testem HOMA-IR, klesla v průměru o 17-19 % vzhledem ke vstupní hodnotě.

V 12 týdenním průběhu studie nebyly zaznamenané žádné nežádoucí účinky včetně vážných nežádoucích účinků, což dokládá bezpečnost přípravku. Také nebyly zjištěné žádné abnormality funkce jater.

Dynamický vývoj střední hladiny glukosy a glykosylovaného hemoglobinu v krvi jsou znázorněné na obr. 6.

Příklad 4

Pacient X. (muž, 74 let) s diagnózou diabetů typu 2, dostával Maninil (glibenklamid, Berlin-Chemie) v dávce 2 krát denně 5 mg. Před třemi lety, přestože již byl léčený, se mu objevil hluboký nekrotický vřed na noze na patní kosti. Pacient byl dvakrát hospitalizovaný na chirurgickém oddělení; nicméně léčba nevedla k významnému zlepšení. K terapii Maninilem byla přidaná léčba farmaceutickou kompozicí podle vynálezu ve formě tablet 250 mg, obsahujících aktivovanou potencovanou formu (ultra-nízké dávky) protilátek na C-terminální konec beta podjednotky insulinového receptoru (Ab Rl) a na endoteliální NO-synthasu (Ab NOS) impregnovaných na isomalt ve formě vodně-ethanolových směsí homeopatických ředění C12, C30, C200 (Ab Rl + Ab NOS). Výsledkem jednoměsíční léčby bylo snížení dávky Maninilu® na 5 mg denně (na jednu tabletu před spaním). Hladina glukosy v krvi klesla na normální hodnoty (z 8-10 mmol/l na 5-6 mmol/l. Následkem aplikace výše uvedené terapie došlo k obratu ve vývoji vředu na noze. Vřed se vyčistil od nekrotické tkáně a došlo k vytvoření kůže na ráně. Při vyšetření byla v oblasti patní kosti zjištěná kruhovitá, bílá plocha (o průměru 3,5 cm) odlupující se kůže.

Claims (39)

PATENTOVÉ NÁROKY

1 . Farmaceutická kompozice, vyznačující se, že obsahuje a) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu.

2 . Farmaceutická kompozice, vyznačující se, že obsahuje a) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na C-terminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu.

3 . Farmaceutická kompozice, vyznačující se, že obsahuje a) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivovanoupotencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu, kde molekula insulinového receptoru sestává z jedné alfa podjednotky a z jedné beta podjednotky.

4 . Farmaceutická kompozice, vyznačující se, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a a) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na Cterminální fragment beta podjednotky lidského insulinového receptoru ve formě směsi homeopatických ředění C12, C30 a C200, impregnované na uvedený pevný nosič, a b) aktivovanou-potencovanou formu protilátky na endoteliální NO-synthasu která je ve formě směsi C12, C30 a C200 homeopatických ředění impregnované na uvedený pevný nosič.

5 . Farmaceutická kompozice podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že uvedená protilátka na lidský insulinový receptor je monoklonální, polyklonální nebo přirozená protilátka.

6 . Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená protilátka na lidský insulinový receptor je polyklonální protilátka.

7 . Farmaceutická kompozice podle nároku 6, vyznačující se tím, že aktivovanápotencovaná forma protilátky na lidský insulinový receptor je připravena postupnými centesimálními ředěními spojenými s protřepáváním každého ředění.

8 . Farmaceutická kompozice podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že uvedená protilátka na endoteliální NO-synthasu je monoklonální, polyklonální nebo přirozená protilátka.

9 . Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená protilátka na endoteliální NO-synthasu je polyklonální protilátka.

10 . Farmaceutická kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že aktivovanápotencovaná forma protilátky na endoteliální NO-synthasu je připravena postupnými centesimálními ředěními spojenými s protřepáváním každého ředění.

11 . Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený lidský insulinový receptor sestává ze sekvence zvolené ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 7, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č. 9, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 11, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 14.

12 . Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená endoteliální NO-synthasa sestává ze sekvence znázorněné v SEQ ID č.: 15, SEQ ID č.: 16, SEQ ID č.: 17, SEQ ID č.: 18, SEQ ID č.: 19, SEQ ID č.: 20, SEQ ID č.: 21, SEQ ID č.: 22.

13 .Způsob léčení diabetů typu I u člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické kompozice podle nároku 1, 2, 3 nebo 4 danému pacientovi.

14 .Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedená farmaceutická kompozice se pacientovi podává v jedné pevné lékové formě při každém podání.

15 .Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedená léková forma je tableta.

16 .Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená tableta je získána přímým lisováním.

17 .Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená tableta se podává jednou denně až čtyřikrát denně.

18 .Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená tableta se podává dvakrát denně.

19 .Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená tableta se podává čtyřikrát denně.

20 .Způsob léčení diabetů typu II u člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické kompozice podle nároku 1, 2, 3 nebo 4 danému pacientovi.

21 .Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedená farmaceutická kompozice se pacientovi podává v jedné pevné lékové formě při každém podání.

22 .Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedená léková forma je tableta.

23 .Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedená tableta je připravena přímým lisováním.

24 .Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedená tableta se podává jednou denně až čtyřikrát denně.

25 .Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená tableta se podává čtyřikrát denně.

26 .Způsob snižování hladiny glukosy v krvi savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické kompozice podle nároku 1, 2, 3 nebo 4 danému savci.

27 .Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedeným savcem je člověk.

28 .Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená farmaceutická kompozice se pacientovi podává v jedné nebo ve dvou jednodávkových formách.

29 .Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že uvedená dávková forma (formy) se podává/podávají jednou denně až čtyřikrát denně.

30 .Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedená dávková forma (formy) se podává/podávají třikrát denně.

31 .Způsob léčení insulinové resistence, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické kompozice podle nároku 1,2, 3 nebo 4 danému savci.

32 .Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že uvedeným savcem je člověk.

33 .Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedená farmaceutická kompozice se pacientovi podává v jedné nebo ve dvou jednodávkových formách.

34 .Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedená dávková forma (formy) se podává/podávají jednou denně až čtyřikrát denně.

35 .Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že uvedená dávková forma (formy) se podává/podávají třikrát denně.

36 .Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že dále zahrnuje podávání insulinu nebo dalších přídavných léčivých prostředků vhodných pro léčení diabetů typu I.

37 .Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje podávání dalších léčivých prostředků vhodných pro léčení diabetů typu II.

38 . Farmaceutická kompozice pro použití k léčení pacienta trpícího diabetem nebo jinou metabolickou chorobou, vyznačující se tím, že je získána přípravou a) aktivované-potencované formy protilátky na lidský insulinový receptor a b) aktivované-potencované formy protilátky na endoteliální NO-synthasu, kde každá z uvedených forem je připravena postupným opakovaným ředěním a vícenásobným protřepáváním každého připraveného roztoku s použitím homeopatické technologie, a potom se následně buď potencované roztoky spojí a promísí, nebo alternativně se nosič impregnuje uvedeným spojeným roztokem nebo odděleně jednotlivými roztoky.

39 .Farmaceutická kompozice podle nároku 38, vyznačující se tím, že uvedená aktivovaná-potencovaná forma protilátky na lidský insulinový receptor je aktivovaná-potencovaná forma protilátky na C-terminální fragment lidského insulinového receptoru.