CZ2013539A3 - Kmen bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952 a jeho využití v lidské výživě - Google Patents

Abstract

Průmyslový kmen bakterie Bifidobacterium longum uložený v České sbírce mikroorganismů, Tvrdého 14, .BETA.rno pod číslem CCM 7952 a prostředek obsahující tento kmen pro modulaci imunitní odpovědi. Prostředek může obsahovat i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky a může být ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Výhodně je kmen obsažen v koncentraci vyšší než 10.sup.6.n.KTJ/g. Prostředek lze použít pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity a pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí alergické odpovědi na pyl.

Description

Kmen bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952 a jeho využití v lidské výživě

Oblast techniky

Vynález se týká živých buněk kmene bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952, který je zároveň prostředkem pro využití k přípravě protizánětlivých preparátů pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity. Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí allergické odpovědí na pyl.

Kmen Bifidobacterium longum CCM 7952 byl vyselektován ze souboru osmdesáti bifídobakteriálních izolátů ze stolice zdravých kojených dětí na základě příznivých imunomodulačních vlastností.

Dosavadní stav techniky

Je známa řada kmenů bakterií s probiotickými účinky používaná pro účely lidské výživy. Dostupné probiotické kmeny nebyly zpravidla testovány z hlediska schopnosti snižovat alergickou odpověď na různé druhy pylu. V klinické studii Ouwehand a kol.(2009) Ouwehand AC¹, Nermes M, Collado MC, Rautonen N, Salminen S, Isolauri E. (2009) Specific probiotics alleviate allergic rhinitis during the birch pollen season. World J Gastroenterol. 15(26):3261-8. zjistili, že denní podávání dvou probiotických kmenů v určitém poměru (Lactobacillus acidophilus ATCC 700396 a Bifidobacterium lactis ATCC SD5219) snižuje zánětlivou odpověď nosní sliznice na březový pyl a zmírňuje příznaky jako je rýma a ucpaný nos zhruba o 20 %. Jelikož z řady studií je známo, že probiotické vlastnosti jsou kmenově specifické je účelem vynálezu získání kmene lidského původu schopného příznivě ovlivňovat immunitní odpověď organismu.

»» « »· ···· * * ♦ · ♦ · w «··« ···· · * · ·· · • ······ · · · ····· • · · ♦ · ··

I _{κ t} » · · ··· > · ·»

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje kmen bakterie Bifidobacterium longum CCM 7952, který byl vyselektován ze souboru osmdesáti bifidobakteriálních izolátů ze stolice zdravých kojených dětí na základě příznivých imunomodulačních vlastností a je uložený v České sbírce mikroorganismů, Tvrdého 14, Brno pod číslem CCM 7952 .

V jiném provedení vynálezu je kmen obsažen v prostředku, který může obsahovat i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být dodán ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Kmen je obsažen v koncentraci vyšší než 10⁶ KTJ/g. Vynález poskytuje kmen louhující kiiruií Bifidobacterium longum a jeho složky pro využití při přípravě protizánětlivých prostředků pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity.

Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, pro modulaci imunitní odpovědi.

Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí al/ergické odpovědí na pyl.

Objasnění výkresů

Vynález a jeho použití bude blíže osvětleno pomocí výkresů, kde na obr. 1 je identifikace bakteriálního kmene CCM 7952 metodou amplifikované ribozomální DNA restrikční analýzy (ARDRA). Dendrogram znázorňuje výsledky shlukové analýzy (UPGMA, unweighted pair method using arithmetic average) fragmentů DNA vzniklých štěpením PCR produktu (rodově specifická PCR podle Roy D, Sirois S. (2000) Molecular differentiation of Bifidobacterium species with amplified ribosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene FEMS Microbiol Lett. 191:17-24) restrikčními enzymy TEw/Hl, Ncil, SaulAI, Taq^a\ (Šrůtková a kol., 2011| Efficiency of PCR-based methods in discriminating Bifidobacterium longum ssp. longum and Bifidobacterium longum ssp. infantis strains of human origin. J Microbiol Methods. 87(1): 10-β). Obr. 2 představuje vliv bakterie B. longum ssp. longum CC0M 7952, kdy byl sledován v modelu akutního zánětu střev indukovaném ·* ···· ·· *

9 9 · · · ···

9 · · 9 9 9 9 99

999*99 φ · 9 999 99

9 9 9 9 99

9 99 9 9999 podáváním 2,5% dextransulfátu sodného u myší BALB/c. Bakterie CCM 7952 (skupina 2) nebo PBS (kontrolní skupina 1) byly podávány intragastricky po dobu 10 dnů. Následně byl vyvolán zánět střeva podáváním 2,5% dextransulfátu sodného (DSS) v pitné vodě po dobu 7 dnů. Poté byl pokus ukončen a byly sledovány níže popsané parametry zánětu střeva. Na obr.B je znázorněn účinek kmene CCM 7952 na vývoj experimentálního zánětu střeva 'Τ' 'Τ' indukovaného u myší podáváním 2,5 % roztoku dextran) sulfátu sodného. Skupina myší,

VÍZ kterým byly aplikovány bakterie kmene CCM 7952, vykazovala v porovnání s kontrolní skupinou bez bakteriálního přídavku, signifikantně nižší váhový úbytek (parametr vývoje střevního zánětu). Obr. 4 představuje histologický snímek sliznice tlustého střeva (coIon descendens), barveno metodou hematoxilin-eosin. A- histologický snímek tlustého střeva zdravé myši, B - tlusté střevo kontrolní myši, které nebyla podávána bakterie CCM 7952, a u které byly vyvolány zánětlivé změny na sliznici podáváním DSS. C - tlusté střevo myši, která byla ochráněna podáváním bakterie CCM 7952 před zánětlivými změnami na sliznici způsobenými DSS. Obr. 5 je schéma situace k ochraně myší proti střevnímu zánětu podáváním bakterií kmene CCM 7952, kdy vzrůstá koncentrace ochranných protilátek IgA, které také přispívají ke snížení prozánětlivých hladin cytokinů TNF-alfa a IFN-gama v mezenteriálních lymfatických uzlinách. Obr. 6 představuje navození tolerance k březovému pylu bakterií B. longum CCM 7952 na úrovni specifických protilátek. Systémová senzibilizace hlavní složkou březového pylu Bet v 1 u myší, které byly neonatálně kolonizovány B. longum CCM 7952 a bezmikrobních kontrol. Osmitýdenní bezmikrobní myši a myši kolonizované od narození přirozeným přenosem z matky na mládě bakterií CCM

7952 byly senzibilizovány (3 x s.c.) hlavní složkou březového pylu Bet v 1. Po skončení pokusu byly stanoveny protilátky charakterizující navození alergické senzibilizace (IgE, IgG2a, IgGl, IgA) v sérech a střevních výplaších myší metodou ELIS A. Výsledky byly vyjádřeny jako průměry ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01. Bylo potvrzeno, že neonatální kolonizace bakterií CCM 7952 ochránila myši před alergickou senzibilizací. Obr. 7 je navození tolerance k březovému pylu bakterií B. longum CCM 7952 na úrovni cytokinové odpovědi. Na konci pokusu byly slezinné buňky jak kontrolních bezmikrobních myší, tak myší neonatálně kolonizovaných bakterií CCM 7952 kultivovány (60 hod) s hlavní složkou březového pylu Bet v 1 a v supematantech pak byly stanoveny hladiny cytokinů IL-13 (A),

IL-5 (B), IL-4 (C), IL-10 (D), IFN-γ (E), IL-17 (F) a TNF-α (G) metodou ELISA. Výsledky byly vyjádřeny jako průměry ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01. Bylo potvrzeno, že neonatální kolonizace bakterií CCM 7952 ochránila myši před alergickou senzibilizací.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

V jednom provedení vynálezu je kmen ve formě biologicky čisté kultury.

Příklad 2

V jiném provedení vynálezu je kmen obsažen v prostředku, který obsahuje i další probiotické kmeny, případně různá prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky. Kmen může být dodán ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje. Kmen je obsažen v koncentraci vyšší než 10⁶ KTJ/g.

Příklad 3

Vynález poskytuje kmen nebo prostředky obsahující kmen Bifidobacterium longum a jeho složky pro využití při přípravě protizánětlivých prostředků pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity.

Příklad 4

Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro modulaci imunitní odpovědi.

Příklad 5

Vynález poskytuje kmen ve formě živých buněk, jako prostředek pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí alergické odpovědí na pyl.

Pracovní postup:

1) Odběr vzorků

Jeden gram stolice kojených dětí byl rozmíchán v 9 ml PBS a desítkově ředěn na TPY agar s mupirocinem (100 mg/1) a kyselinou octovou (1 ml/1) a anaerobně kultivovány při 37 °C po dobu 72 hodin. Kolonie typického morfologického vzhledu byly odpíchnuty, přečištěny na

TPY agaru a následně kultivovány v TPY bujónu. Narostlé izoláty byly uloženy v TPY(MRS) bujónu s 20 % glycerolu a skladovány při -70 °C.

2) Identifikace a typizace kmene

Příslušnost kmene krodu Bifidobacterium byla zjištěna reakcí enzymu fruktoso-6-fosfát ketolázy(Orban JI, Patterson JA (2000) Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J Microbiol Methods. 40:221-4), molámím poměrem vzniklé kyseliny mléčné a octové zjištěným pomocí kapilární isotachoforézy (ZKL 01, Slovensko) a metodou FISH se sondou specifickou pro rod Bifidobacterium (Ribo technologies, Holandsko). Všechny tři testy potvrdily příslušnost kmene k rodu Bifidobacterium (positivní test F6FK, molámí poměr octové a kys.|nléčné 1,96).

Γ'

Test API 50CH (bioMérieux, Francie) byl použit pro druhovou identifikaci na základě fermentačních profilů sacharidů a cukerných alkoholů s následujícími výsledky:

0 0 0 + + +:0.0 0 + + + + 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 +.+(+) + + + + +’: 0 +·......+ 009 +...... + 0 0 0 0: 0 0 0 o o

Pro stanovení enzymatických aktivit byl použit test APIZYM (bioMérieux, Francie) s pozitivním výsledkem na aktivitu leucinarylamidázy, cystinarylamidázy, kyselé fosfatázy, naftol-AS-BI-fosfohydrolázy, alfa a beta galaktosidázy, alfa a beta glukosidázy, N-acetyl— beta-glukosaminidázy a alfa-mannosidázy.

Identifikace molekulárně biologickými metodami (rodově a druhově specifická PCR, rep- PCR, ARDRA) (obrj).

Λ

3) Možnost využít bakterii jako probiotikum je podmíněná jejím přežitím v prostředí gastrointestinálního traktu. Byla detekována schopnost přežití kyselého prostředí žaludku (pH 3) a žlučových kyselin.

Stanovení odolnosti vůči působení solí žlučových kyselin bylo prováděno na miskách s polotuhými médii obsahujícími různé koncentrace solí žlučových kyselin (0,3; 0,7 a 1^0 %, OXOID L55). Dosažené počty kolonie tvořících jednotek (cfu, colony forming units) na jednotlivých médiích se solemi žlučových kyselin byly porovnávány s počty na kontrolním

. _ ··· ······ · · £ · · · ·· · · · · ···· ·· ♦ ··· • ······ · · · · ···· • · · · · · · ·· · · · · ··· · X agaru (kultivace 72/96 hodin za stejných podmínek). Za výše uvedených podmínek přežilo 27|0, 1j2 a Op % buněk při koncentraci 0_f3, 0₍7 a l₍0 % solí žlučových kyselin.

Stanovení odolnosti vůči působení nízkého pH bylo prováděno následujícím estovaný kmen byl kultivován do stacionární fáze růstu při 37 °C v MRSC bujónu s Oj 05 % (m/v) L-cystein hydrochloridu. Následně byly buňky odděleny odstředěním při 4000 g po dobu 15 minut. Supematant byl oddělen dekantací a buňky zality MRS bujónem s 0_f05 °/o (m/v) L-cystein hydrochloridu a pH upraveným HC1 na hodnotu pH 3,0. Po rozmíchání byl vzorek naočkován pomocí desítkového ředění fyziologickým roztokem na MRS57 agar a stanoven počáteční počet cfu. Po inkubaci MRS pH 3 po dobu 3 hodin při teplotě 3^°C byly opět stanoveny počty cfu stejným způsobem. Procento přežívajících buněk bylo stanoveno dělením počtu cfu na MRS agaru v čase 3 a 0 hodin. Za výše uvedených podmínek přežilo Oj 2 % buněk.

4) Možnost využití bakterie jako probiotika také závisí na jeho schopnosti adherence na střevní stěnu.

4.1. Adherence kmenů bakterií mléčného kvašení

Na narostlou vrstvu eukaryontních buněk byla přidána suspenze zkoumaných probiotických prokaryontních buněk v podmínkách in vitro. Po aplikační době byly buňky opláchnuty a zhotoveny preparáty jednak pro optickou mikroskopii, jednak pro elektronovou mikroskopii. Všechny laboratorní úkony byly prováděny ve standardním řízeném režimu, pracoviště vlastní certifikáty norem ISO 2001.

4.2. Užité buňky λ/

Modelo^vé buňky eukaryontního charakteru byly vybrány jako héíFoploidní buněčné linie epiteloidního charakteru a to zejména HeLa a Caco2.

4.3. Kultivační média

Eukaryontní buňky byly kultivovány v mediu MEM s obvyklými doplňky fetálního bovinního sera, antibiotiky a neesenciálními aminokyselinami. Kokultivace byla prováděna v MEM médiu doplněném fetálním bovinním sérem a L-glutaminem. Prokaryontní buňky byly kultivovány v LB, nebo MRSC médiu.

4.4. Podmínky kultivace

Kultivace eukaryontních buněk byla standardní v atmosféře 5% CO₂ při teplotě 37 °C. Pasážování bylo prováděno pomocí trypsinu. Buňky byly pravidelně kontrolovány mikroskopicky ve fázovém kontrastu. Kultivace prokaryontních buněk byla opět standardní a to ve zkumavkách při teplotě 37 °C. Pro aplikaci na vrstvu eukaryontů byla kultura v exponenciální fázi růstu.

4.5. Aplikace bakterií mléčného kvašení

Kmeny bakterií mléčného kvašení byly přidávány ke kultuře eukaryontních buněk a tato směs byla kultivována při 37 °C po dobu 24 hodin. Poté byla buněčná vrstva opláchnuta PBS, fixována a připravena k další preparaci.

4.6. Preparace k mikroskopii

Krycí skla s buněčnou vrstvou byla fixována, a to pro optickou mikroskopii v alkohol-octové fixáži a následně barvena v May-Griinwald / Giemza. Po vyschnutí byla skla preparována do kanadského balzámu a připravena pro vyhodnocení. Pro elektronovou mikroskopii byla buněčná vrstva na krycím skle fixována v glutaraldehydu a po odvodnění připravena na preparaci pro rastrovací elektronovou mikroskopii.

Adherence na eukaryontní linii Caco2 byla 26,4 %.

5) Bezpečnost bakterie pro hostitele byla ověřena na modelu kolonizace bezmikrobních myší. Stabilita kolonizace (1O^{7 * * 10} CFU/ g stolice) byla potvrzena i u následných generací myší.

6) Imunomodulační účinky bakterií kmene CCM 7952 byly testovány v podmínkách in vitro systému. Bakterie kmene CCM 7952 byly kultivovány s imunitními buňkami (slezinnými, dendritickými a liniovými makrofágy) a byla sledována schopnost kmene CCM 7952 stimulovat tvorbu protizánětlivých a zánětlivých cytokinů. Testováním na imunitních buňkách bylo zjištěno, že přídavek bakterií kmene CCM 7952 stimuluje produkci protizánětlivého cytokinů IL-10.

7) V následném kroku byl sledován účinek kmene CCM 7952 na vývoj experimentálního zánětu střeva indukovaného u myší podáváním roztoku dextran (sulfátu sodného. Zánětlivé parametry (pokles tělesné váhy, zkrácení délky tlustého střeva, krvácení z rekta, rektální prolapsy, změna konzistence stolice, změna morfologie střeva, produkce zánětlivých • · · · · · · • · · · · · · ·· · cytokinů) byly u zvířat, kterým byly podávány preventivně bakterie kmene CCM 7952 před vyvoláním experimentálního zánětu, výrazně nižší v porovnání s kontrolní skupinou.

8) Nejvýraznější probiotický protektivní účinek kmene CCM 7952 byl prokázán v modelu alergie k březovému pylu. Bylo prokázáno, že bezmikrobní myši osazené neonatálně matkou bakteriemi kmene CCM 7952 byly ochráněny před vývojem alergické senzibilizace k hlavní složce březového pylu Bet v 1. Zatímco u bezmikrobních kontrol byla vyvolána alergická senzibilizace na úrovni tvorby protilátek (IgE, IgGl) a proalergických cytokinů (IL-4, IL-5, IL-13, IL-17), myši osazené bakteriemi kmene CCM 7952 byly bez příznaků alergické reakce a hladiny sledovaných parametrů byly výrazně snížené. Bylo zjištěno, že tato bakteriální kolonizace dokonce indukuje tvorbu regulačních Fox P3-pozitivních buněk.

Základní výsledky studie

Identifikace bakterií	Bakterialnj krflenl kjspjřója	IFN-gamma	IL-S	TNF-alpha	IL-10
smína	SWJrw »· zánětem	Rpotrsini	SkHPlIW se mesem	Xwtrpini skupina	SWU»se íáieWTO	KPWSlOi skupina	zán.ěwm
b.	CCDM 218	1864 8 ±421 9'1	1541 0 ± 900.9-	650.2 ±62.8“	952.6 ± 198.7	934 8 ± 197.9“	2098 6 ±596.8“	187.4 ±13.5“	160 8 ±17 9
CCDM 366	55 2 ± 24 1	240 0 ±221 5	229 D ± 13.0	613 0 ± 228.7	200 2 ±21.7	330 4 ±108.0	268 2 ±13 7“	280 6 ±41 9
δ. longum	CCDM 219	185.2 ±59.3	172 2 ± 103.2	511.6 ±79.9*	419.4 ± 160.7	181.8 ± 18.3	122.6 ±24.3	173.8 ±17.9*	78.2 ±11.3
CCM7952	172.8+79.7	66.6 ±27.1	452.3 ±35.1	279.8 ± 77.0	138.0 ±12.4	114.4 ±17.4	270.2 ±24.5“	98.0 ±18.7
CCDM 372	743.6 ± 183 □	1150.6 ±403 2	637 6 ±80 1”	1030.2 ± 70.9-	451 0 ±37 4	612 8 ±22.1	531.8 ±38 6“	371 8 ±76.5“
B. infanti»	CCDM 369	108 0 ± 58.9	260.0 ±126.3	492.8 ± 116.9	832.4 ± 105 3	384 3 ±55.5“	477 6 ±77.5	542.3 ±85.0“	357.4 ±81.4*
B. -'Μ»!®	CCDM 368	153 5 ±90 9	33 8 ±17.2	334 5 ±51.5	191.0 ± 133 4	188 8 ± 16 5	162 5 ±93.0	92.0 ±4.2	123.0 ± 102.7
CCDM 370	668 8 ±151.2 *	269 3 ±86.16	923 3 ± 114 3”	704 8 ± 98.8	357 2 ± 35 9“	404.0 ±65.2	243.2 ±16 1“	193.3 ±53.0
CCDM 371	145.0 ±65.3	264.0 ± 109.25	675.0 ±69.9“	639.5 ±87.5	290.4 ±8.1'	363.0 ±37.5	605.8 ±52.2“	318.5 ±37.4
CCDM 373	1819.3 ±275.2“	1261.8 ±349.23	987.0 ±87.0“	725.8 ±245.2	494.5 ±59.7“	497.8 ±171.8	186.0 ± 14.2*	164.3 ±58.2
Mimi*	medium	11.8±107	737.5 ±S8.5	130±4.1	114 5 + 70.8	6.3 + 26	74.5 ±438	7.3 ±0.6	28.3 ± 18.2
LPS	508.3 ±164.1	552.6 ±377.5	397 3 ±47 6	581 2 ±320 3	166 0 ± 14 3	157 0 ±64.4	177.0 ±29 Γ	131 0 ±39 9

tnb. 1

Tab. 1 Stanovení imunomodulačních vlastností deseti vybraných kmenů rodu

Bifidobacterium (včetně kmene CCM 7952) v podmínkách in vitro. Bakterie vybraných kmenů byly inaktivovány 1% formaldehydem a poté kultivovány se slezinnými buňkami izolovanými ze zdravých (neovlivněných) myší a se slezinnými buňkami skupiny myší, u kterých bylo indukováno zánětlivé onemocnění tlustého střeva podáváním roztoku 2,5]% dextransulfátu sodného v pití po 48 hodinové kultivaci v kultivačních mediu při 37^C, ve vlhké atmosféře obohacené o 5% CO₂. Poměr bakterií k imunitní buňce byl 10: 1.

(Amrouche a kol., 2006).

V supematantu po kultivaci buněk byly metodou ELISA stanoveny hladiny cytokinů. Kmen CCM 7952 výrazně stimuloval tvorbu protizánětlivého cytokinů IL-10, zatímco produkce prozánětlivých cytokinů INF-γ, IL-6 a TNF-α slezinnými buňkami byla u kmene CCM 7952 výrazně nižší u obou skupin myší v porovnání s ostatními bakteriálními kmeny a pozitivní kontrolou (LPS ljjlg/ml). Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM, statistické z-x vyhodnocení jednotlivých hladin cytokinů bylo provedeno testem ANOVA v porovnání s cytokinovou produkcí nestimulovaných buněk (v tabulce uvedeno jako medium) *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 .

- viz obr. 2 a obr. 3

Experimentální skupina Index stupně závažnosti oneinotněni Délka tlustého střeva

Stupeň poškozeni slizniee (cm) (Cooper a spol. 1993)

CCM ”9? 2

Kontrola (PBS) l,24±0.29 ¹

2,8” ±0,18 ”,86 ±0.12 ' 0-1 ”,39 ±0.18 3-4

Obě skupiny myší pily po dobu 1 týdne 2,5]% roztok DSS. První skupina myší dostávala 10 dní před pitím roztoku a během sedmidenního pití DSS roztoku denně dávku 2x10⁸ CFU v 0,2 ml pufrovaného fyziologického roztoku. Kontrolní myší dostávaly tento roztok bez přídavku bakterií.

Index stupně závažnosti onemocnění: pokles tělesné váhy myši (0 = žádný pokles váhy, 1 =

X >A,<

1-5% úbytek váhy, 2 = 5r 10% úbytek, 3 body 10|20% úbytek), konzistence stolice (0 - pevná stolice, 2 = ztráta stolice v dolní části tlustého střeva, 4 = průj movitá stolice), krvácení z rekta a tlustého střeva (0 = bez krvácení z rekta a tlustého střeva, 2 = pozitivní reakce - hemokult, 4 = silné krvácení). Součet skóre jednotlivých parametrů u každé myši je podělen číslem 3 (počet sledovaných parametrů) a vytváří tak skóre závažnosti onemocnění

A od 0 (zdravá myš) do 4 (maximální stupeň závažnosti onemocnění) (Cooper a spol., 1993)

Clinicopathologic study of dextran sulfáte sodium experimental murine colitis, Lab Invest.

69(2):238-49.. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny Studentovým t-testem.

Claims (7)

1. Průmyslový kmen bakterie Bifidobacterium longum RB25-P uložený v České sbírce mikroorganismů, Tvrdého 14, Brno pod číslem CCM 7952 .

2. Prostředek pro modulaci imunitní odpovědi, vyznačující se tím, že obsahuje kmen bakterie podle nároku 1.

3. Prostředek podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že je ve formě kapsle, tablety nebo prášku nebo potraviny jako jsou mléčné výrobky, dresinky nebo nápoje.

4. Prostředek podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že kmen je obsažen v koncentraci vyšší než 10⁶ KTJ/g.

5. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje i další probiotické kmeny, případně prebiotika, bílkoviny, vitamíny nebo minerální látky.

6. Prostředek podle nároku 2 pro snížení hladiny prozánětlivých cytokinů při prevenci a/nebo ošetření nežádoucí prozánětlivé aktivity.

7. Prostředek podle nároku 2 pro prevenci a/nebo ošetření nežádoucí alergické odpovědí na pyl.