CZ201361A3 - Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR - Google Patents
Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR Download PDFInfo
- Publication number
- CZ201361A3 CZ201361A3 CZ2013-61A CZ201361A CZ201361A3 CZ 201361 A3 CZ201361 A3 CZ 201361A3 CZ 201361 A CZ201361 A CZ 201361A CZ 201361 A3 CZ201361 A3 CZ 201361A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pcr
- reaction mixture
- plrv
- mixture
- probe
- Prior art date
Links
- 241000709769 Potato leafroll virus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 21
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims abstract description 16
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 8
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká reakční směsi L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR, která je charakterizována tím, že obsahuje 1 .mi.l vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCl.sub.2.n., sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 .mi.l a primery o specifické nukleotidové sekvenci L-499F: AAG AAG TAT CCC TCA AAG CCT, L-675R: TTA GCG CGC CCT TGT AAA TCA AGC, amplifikující fragment o velikosti 176 bp, a sondu L-567S: TG GAC GCT TGC GAG GTT GAT GAC TTT, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivem 6 – carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášeč je použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).
Description
Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR
Oblast techniky
Řešení se týká reakční směsi L1 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR, který je závažným karanténím viroidním onemocněním bramboru, pomocí molekulární detekce viroidní RNA molekulární metodou reverzní transkripce - polymerázová řetězová reakce v reálném čase (dále QRT-PCR)
Dosavadní stav techniky
Virová svinutka bramboru patří mezi závažná virová onemocnění bramboru způsobující snížení výnosu až o 80 %. Virus svinutky je přenášen pouze savým hmyzem a sadbou (Rasocha et al., 2007). Virus svinutky (PLRV) způsobuje kornoutovité stáčení listů, nejdříve ve spodním patru, později i ve vyšších patrech rostlin. Listy jsou kožovitě tuhé, při dotyku šustí, při zmáčknutí praskají. Rostliny jsou světlejší, chlorózní, obvykle nižšího vzrůstu se zkrácenými internodiemi. Hlízy jsou většinou drobnější. Přítomnost viru svinutky bramboru se převážně zjišťuje laboratorními metodami, nejdéle a nejčastěji imunoenzymatickou metodou ELISA (Clark a Adams, 1977).
Druhým postupem je použití specifických molekulárních sond. Tento test je založen na hybridizaci uměle připravené sondy DNA (pomocí metod genetického inženýrství) komplementární k RNA viroidu. PLRV se váže na pevnou podložku (nitrocelulosa, nylon) a je detekován hybrid DNA - RNA. Protože PLRV cDNA je klonována, lze ji získat bez větších nákladů v dostatečném množství. Tato metoda je velmi citlivá, není třeba inokulovat mezihostitele a při přípravě vzorků zdlouhavě purifikovat RNA. Použití pouze částečně přečištěné šťávy z rostlin bramborů zjednodušuje, urychluje a zlevňuje přípravu vzorků. Diagnostické sondy DNA lze značit radioaktivně (32p) nebo neradioaktivně (biotin, digoxigenin). Hybridizační techniky detekce jsou nyní v mnoha obměnách užívány nejen pro detekci PLRV, ale i pro další viry.
Třetí možností jsou postupy využívající technik RT-PCR a RT-PCR v reálném čase. Metoda kvantitativní PCR je založena na stanovování fluorescence produktu PCR v jednotlivých vzorcích po každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních sond a stanovování počtu cyklů potřebných pro dosažení prahové fluorescence. Stanovování se provádí na základě měřených změn fluorescence fluorescenční sondy. Používají se jednak nespecifická sonda využívající SybrGreen I, nebo fluorchromem značené sondy specifické pro amplifikovaný úsek dané nukleové kyseliny. Existuje více typů specifických sond, avšak nejčastěji používané sondy pro kvantifikaci jsou lineární hydrolyzační sondy tzv. TaqMan sondy (Ptáček a Dědič, 2009).
Metody a postupy založené na detekci virové nukleové kyseliny pomocí specifických primerů pro reverzní transkripci - polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) jsou řádově citlivější než metoda ELISA nebo hybridizační postupy a jsou v současnosti více používány. Metoda kvantitativní RT-PCR je jednou z nejcitlivějších používaných diagnostických metod a nachází uplatnění v detekci širokého spektra patogenů bramboru. Metoda pro specifickou detekci PLRV pomocí kvantitativní RT-PCR nebyla do současnosti v ČR navržena.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňuje reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí reverzní transkripce — polymerázová řetězová reakce v reálném čase (QRT-PCR), podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid horečnatý MgCI2, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ a primery o specifické nukleotidové sekvenci
L-499F: AAG AAG TAT CCC TCA AAG CCT
L-675R: TTA GCG CGC CCT TGT AAA TCA AGC, amplifikující fragment o velikosti 176 bp, a sondu
L-567S: TG GAC GCT TGC GAG GTT GAT GAC TTT, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 - carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášečje použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).
Primery a sondy pro detekci PLRV pomocí QRT-PCR (Ptáček a Dědič, 2009) byly navrženy na základě sekvence izolátu PLRV (Plchová et al, 2009), čísla v názvu značí umístění primerů a sondy v genomu PLRV).
Reakční směs L1 podle vynálezu se připravuje v mikrozkumavce a obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, jakékoli komerční činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs oligonukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCI2, např. Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix, dále sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ.
Vlastní QRT-PCR probíhá v real-time termocykleru v 0,2 ml PCR zkumavkách (stripech, destičkách) 30 min při 48 °C, následuje desetiminutová denaturace při 95 °C a 40 cyklů, obsahujících 2 kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.
Reakční směs L1 podle vynálezu umožňuje exaktní stanovení viru svinutky bramboru (PLRV), což má velký význam při produkci sadbových brambor na území České republiky.
Následující příklady provedení reakční směs L1 podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.
Příklady provedení
Příklad 1
U 55 sbírkových izolátů tohoto viru byly ověřeny možnosti jeho detekce v postupech RT-PCR a QRT-PCR. Pro vlastní zkoušení byly používány jak metody izolace celkové nukleové kyseliny (NA), tak imunovazebné techniky (IC). U RT-PCR byly získány optimální výsledky pomocí primerů dle Solimana, kterými byly detekovány všechny zkoušené izoláty. Pro detekci PLRV metodou QRT-PCR byly na základě sekvenční analýzy českého izolátu (Plchová et al, 2009) navrženy sady primerů a sondy TaqMan. Kvizualizaci amplifikátů virové NA v postupech dvoukrokové QRT-PCR bylo používáno jak nespecifické značení pomocí SYBR Green, tak za použití vlastní specifické TaqMan sondy. Detekce PLRV pomocí QRT-PCR byla možná a spolehlivá při obou postupech značení DNA. Dosažené výsledky byly z hlediska citlivosti a spolehlivosti porovnány s metodou ELISA.
Pro vlastní experimenty byly používány izoláty jednotlivých virů ze sbírkové kolekce mikroorganizmů (http://www.vurv.cz/collections/) udržované ve VÚB Havlíčkův Brod, CZ, v podmínkách in vitro. Celkově bylo testováno 59 vzorků, z toho 4 negativní kontroly.
Pro izolaci celkové RNA lze použít mnoho různých postupů, z hlediska časové náročnosti, kvality získané RNA a reprodukovatelnosti izolačního procesu je optimální použít některý z široké škály komerčních souprav (Invitek, Roche, atd.). Původci doporučují postup extrakce RNA pomocí RNeasy Plant Total RNA Kit (QIAGEN).
QRT-PCR probíhala v 0,2 ml PCR zkumavkách (destičkách, stripech), nejdříve 30 min při 48 °C, poté 10 min úvodní denaturace 95 °C, 40 cyklů (15 s 95°C, 60 s 60°C v real-time termocykleru, Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step, 600809 Stratagene, objem reakce 25 μΙ, 12,5 μΙ 2x master mix, 1,0 μΙ RT/RNase block enzyme (směs reverzní transkriptázy a RNasin), 0,1 μΙ primer L-499F 100 μΜ, 0,1 μΙ primer L-675R 100 μΜ, 1 μΙ sonda 30 μΜ, 9,3 μΙ voda, 1 μΙ RNA.
Výsledek QRT-PCR byl analyzován pomocí měření fluorescence dR, jak je zobrazeno na Obr. 1, kde je QRT-PCR - ukázka amplifikačních křivek — detekce PLRV.
Průmyslová využitelnost
Reakční směs L1 pro diagnostiku viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR je možno dodávat laboratořím zabývajícím se detekcí rostlinných patogenů jako detekční soupravu k jednoduchému okamžitému použití, kdy na uživateli je pouze přidat svůj vzorek testované RNA a provést QRT-PCR reakci dle přesně stanovených podmínek.
Seznam publikací původců
PTÁČEK, J. - DĚDIČ, P. Detekce a identifikace izolátů viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí molekulárních technik RT-PCR a QRT-PCR, Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 2009, 17, 25-35.
Použitá literatura
PEIMAN, M. - XIE, C. (2006): Sensitive detection of potato viruses, PVX, PLRV, and PVS in potato leaf and tuber. Australasian Plant Diseases Notes 1(1): 41-46
PLCHOVÁ, H. - ČEŘOVSKÁ, N. - MORAVEC, T. - DĚDIČ P. (2009): Molecular analysis of Potato leafroll virus isolates from the Czech Republic. VIRUS GENES 39, 1, 153-155.
RASOCHA, V. - HAUSVATER, E. - DOLEŽAL, P. Mšice - významní přenašeči virových chorob brambor, jejich výskyt, škodlivost a možnosti ochrany, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. 2007
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí metodyRT-PCR kvantitativní (QRT-PCR), vyznačující se t í m, že obsahuje 1 μΙ vzorku testované RNA, dále činidlo obsahující směs enzymů reverzní transkriptázy a DNA polymerázy, směs nukleotidů, pufr obsahující chlorid hořečnatý MgCI2, sterilní destilovanou vodu doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΙ a primery o specifické nukleotidové sekvenciL-499F: AAG AAG TAT CCC TCA AAG CCTL-675R: TTA GCG CGC OCT TGT AAA TCA AGC, amplifikující fragment o velikosti 176 bp, a sonduL-567S: TG GAC GCT TGC GAG GTT GAT GAC TTT, přičemž sonda je značena fluorescenčním barvivém 6 - carboxyfluorescein (FAM) a jako zhášeč je použit tetra-metylkarboxyrhodamin (TAMRA).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-61A CZ201361A3 (cs) | 2013-01-30 | 2013-01-30 | Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-61A CZ201361A3 (cs) | 2013-01-30 | 2013-01-30 | Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ201361A3 true CZ201361A3 (cs) | 2014-08-06 |
Family
ID=51257815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-61A CZ201361A3 (cs) | 2013-01-30 | 2013-01-30 | Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ201361A3 (cs) |
-
2013
- 2013-01-30 CZ CZ2013-61A patent/CZ201361A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mohamed et al. | A sensitive and quantitative single-tube real-time reverse transcriptase-PCR for detection of enteroviral RNA | |
| TWI451086B (zh) | 檢測魚類病原之引子組、方法及套組 | |
| CN105648115B (zh) | 用于检测多种呼吸道病原体的pcr引物组、探针组及试剂盒 | |
| Suzuki et al. | Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay as a simple detection method of Chrysanthemum stem necrosis virus in chrysanthemum and tomato | |
| Park et al. | Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd) | |
| CN117529560A (zh) | 检测微小rna的方法和试剂盒 | |
| CN114032337A (zh) | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN105018488B (zh) | 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用 | |
| CN114891928A (zh) | 一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒 | |
| Wacharapluesadee et al. | Development of a TaqMan real-time RT-PCR assay for the detection of rabies virus | |
| CN103725798A (zh) | 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法 | |
| Osman et al. | Comparative procedures for sample processing and quantitative PCR detection of grapevine viruses | |
| CN114214455A (zh) | 乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统 | |
| Xia et al. | Rapid detection of Banna virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) | |
| WO2016179509A1 (en) | Improved compositions and methods for detection of viruses | |
| CN111690777B (zh) | 柑橘叶斑驳病毒rt-rpa检测的特异引物、试剂盒和方法 | |
| CN114262759A (zh) | 一种联合检测多种呼吸道病毒的pcr引物组及试剂盒 | |
| CN102816870A (zh) | 柯萨奇病毒a6型rt-lamp核酸检测引物及试剂盒 | |
| CZ201369A3 (cs) | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
| CZ201361A3 (cs) | Reakční směs L1 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| CN1904069B (zh) | 一种麻疹病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CZ201366A3 (cs) | Reakční směs L2 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
| CZ25101U1 (cs) | Reakční směs Ll pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
| RU2795016C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 |