CZ2014524A3 - Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu - Google Patents
Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2014524A3 CZ2014524A3 CZ2014-524A CZ2014524A CZ2014524A3 CZ 2014524 A3 CZ2014524 A3 CZ 2014524A3 CZ 2014524 A CZ2014524 A CZ 2014524A CZ 2014524 A3 CZ2014524 A3 CZ 2014524A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- support
- peptides
- solution
- binding
- anchor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 70
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 64
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 64
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 49
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 40
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 28
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 27
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims abstract description 19
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910000314 transition metal oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 25
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 25
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 24
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 14
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 11
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 11
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 8
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 claims description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- SOQBVABWOPYFQZ-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);titanium(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[Ti+4] SOQBVABWOPYFQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910020599 Co 3 O 4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910006404 SnO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N thiosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1S NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 claims description 3
- IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N cobalt(II) oxide Inorganic materials [Co]=O IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N nickel(II) oxide Inorganic materials [Ni]=O GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 106
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 30
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 22
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 7
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 6
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 4
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 4
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001009547 Homo sapiens Prosaposin receptor GPR37 Proteins 0.000 description 2
- 101000881168 Homo sapiens SPARC Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 108010076986 Phytochelatins Proteins 0.000 description 2
- 101000621511 Potato virus M (strain German) RNA silencing suppressor Proteins 0.000 description 2
- 102100030284 Prosaposin receptor GPR37 Human genes 0.000 description 2
- 102100037599 SPARC Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000000231 atomic layer deposition Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007146 photocatalysis Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031680 Beta-catenin-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101000844746 Drosophila melanogaster Drosomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000993469 Homo sapiens Beta-catenin-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001374849 Liparis atlanticus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000006295 S-nitrosylation Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000003302 ferromagnetic material Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910052735 hafnium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCNNJGDEJXIUCC-UHFFFAOYSA-L hydroxy(oxo)iron;iron Chemical compound [Fe].O[Fe]=O.O[Fe]=O UCNNJGDEJXIUCC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013335 mesoporous material Substances 0.000 description 1
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- -1 phospho groups Chemical group 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3861—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography using an external stimulus
- B01D15/388—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography using an external stimulus modifying the pH
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3861—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography using an external stimulus
- B01D15/3885—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography using an external stimulus using electrical or magnetic means
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/422—Displacement mode
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
- B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28009—Magnetic properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3234—Inorganic material layers
- B01J20/3236—Inorganic material layers containing metal, other than zeolites, e.g. oxides, hydroxides, sulphides or salts
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
- B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
- H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
- H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
- H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
- H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2239/00—Aspects relating to filtering material for liquid or gaseous fluids
- B01D2239/02—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials
- B01D2239/0258—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials comprising nanoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
- G01N30/56—Packing methods or coating methods
- G01N2030/567—Packing methods or coating methods coating
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Způsob separace biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny mono- a multifosforylované peptidy, rekombinantní peptidy/proteiny s polyhistidinovou kotvou, His-tag, či jinou chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidy/proteiny obsahující cystein, nukleové kyseliny, u kterého se biopolymerní molekula ve vazebném roztoku naváže na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, a poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí nespecificky navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují biopolymerní molekuly. Nosič pro využití při tomto způsobu.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu separace biopolymerních biomolekul.
Vynález se dále týká také nosiče pro využití při tomto způsobu separace.
Dosavadní stav techniky
V současné době se pro separaci biopolymerních molekul, jako např.
1,CT mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyselin, rutinně používají různé způsoby a různé nosiče, které však, kromě nesporných užitných hodnot, vykazují také řadu limitujících vlastností - viz níže.
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů
Funkce fosforylace proteinů a jejich dynamické změny za fyziologických podmínek byly již podrobně popsány. Jak se však během posledních 20ti> let ukázalo, jsou změny ve fosforylaci proteinů vztahující se k určitým patologickým 20 stavům v lidském organismu též diagnosticky i prognosticky velice významné. Aparáty pro strukturní analýzu těchto diagnosticky významných molekul včetně míry a lokalizace fosforylace jsou v současné době velice vyhledávané.
Vzhledem ktomu, že mono- a multifosforylované peptidy/proteiny se v buňkách nacházejí ve velmi nízkých koncentracích, jejich zastoupení se v 25 čase výrazně mění a jejich stabilita v průběhu preanalytické fáze není ideální, je nezbytné pro jejich separaci použít účinnou obohacovací techniku, která výrazně zvyšuje jejich poměrné zastoupení ve směsi.
Po dlouhou dobu se pro obohacování mono- a multifosforylovaných peptidů/proteinů z biologických materiálů využívala separační technika 30 založená na chromatografií na imobilizovaných kovových iontech (IMAC) s Fe3+ nebo Ga3+ (Zr4+, Ti4+ atd.) - viz např. článek Anderson L, Porath J.: „Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe+3) affinity chromatogramy“, Analytical Biochemistry. 1986, vol. 154,'p. 250-254, a článek Zhou H.: „Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of
PS3973GZ phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis.“ Journal of Proteome Research, 2006; vol. 5, p. 2431-2437. Jejím principem je interakce negativně nabité fosfátové skupiny s pozitivně nabitými ionty kovů. Ty přitom mohou být vázány pomocí iminodioctové kyseliny (IDA), nitrilotrioctové kyseliny (NTA) nebo tris(karboxymethyl)ethylendiaminu. Při separaci fosfopeptidů touto technikou (IMAC s Fe3+ nebo Ga3+) se však separují i peptidy obsahující kyselinu asparagovou nebo glutamovou nebo řetězce obsahující ve vyšší hustotě histidin - viz např. článek Schilling M. & Knapp D.R.: „Enrichment of Phosphopeptides Using Biphasic Immobilized Metal Affinity-Reversed Phase Microcolumns“, Journal of Proteome Research, 2008, vol. 7, p. 4164-4172. Tato nespecifická vazba přitom zvyšuje nežádoucí kontaminaci vzorku určeného pro hmotností analýzu.
V článku Haydon C.E. et al. „Identification of Novel Phosphorylation Sites on Xenopus laevis Aurora A and Analysis of Phosphopeptide Enrichment by Immobilized Metal-affinity Chromatography“, Molecular & Cellular Proteomics, 2003, vol. 2, p. 1055-1067, je pak popsaná redukce této nespecifické vazby methylesterifikací karboxylových skupin.
Jinou možností redukce této nespecifické vazby je dle článku Seeley, E. H., et. al.: „Reduction of non-specific binding in Ga(lll) immobilized metal affinity chromatography for phosphopeptides by using endoproteinase glu-C as the digestive enzyme“, Journal of Chromatography B, 2005, vol. 817, p. 81-88 naštěpení vzorku peptidů/proteinů před separací, vedle trypsinu, i jiným typem proteázy, např. enzymem Glu-C, který štěpí peptidy/proteiny za asparagovou a glutamovou kyselinou, čímž se získají peptidy s kyselou aminokyselinou na Ckonci. Tyto metody jsou však značně pracné a ne vždy dostatečně účinné, přičemž esterifikace zbytku kyseliny asparagové a glutamové navíc ztěžuje interpretovatelnost spekter. Nevýhodou použití proteázy Glu-C je tvorba příliš dlouhých peptidových řetězců.
Podobných interakcí jako nosič s Fe3+ ionty využívá také nosič na bázi čistého Fe3O4 - viz např. článek Aera, L„ et. al.: „Enrichment of phosphopeptides using bare magnetic particles“, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008; vol. 22, p. 2561-2564.
Další, méně používanou alternativou je využití afinitní chromatografie na AI(OH)3 - viz např. článek Wolschin, F.: „Enrichment of phosphorylated proteins
PS3973CZ ^3and peptides from complex mixtures using metal oxide/hydroxide affinity chromatography (MOAC)“, Proteomics, 2005, vol. 5, p. 4389-4397, při které je však nutné použít rozdílné podmínky vazby jako u oxidů kovů.
V současné době se pak pro specifické obohacování monofosforylovaných případně difosforylovaných peptidů používají zejména oxidy kovů. Nejčastěji se jedná o porézní mikročástice TiO2, jejichž velikost se pohybuje v jednotkách mikrometrů - viz např. článek Jiang Z. T., et. al.: „Synthesis of Porous Titania Microspheres for HPLC Packings by Polymerization-Induced Colloid Aggregation (PICA)“, Analytical Chemistry, 10 2001, vol. 73, p. 686-688. Tyto mikročástice přitom mohou být s výhodou superparamagnetické, což přináší řadu výhod, jako např. rychlou separaci částic od kapalné fáze pomocí silného magnetu, nulovou ztrátu nosiče nebo vzorku, vsádkové mimokolonové uspořádání nebo separaci probíhající v koloně v tzv. dynamickém fluidním loži. Nevýhodou tohoto postupu je, že u 15 multifosforylovaných peptidů dochází k výrazným ztrátám, které jsou způsobeny velmi silnou interakcí fosfátových skupin s mikročásticemi TiO2, kdy je eluce multifosforylovaných forem peptidů velice nízká nebo neprobíhá vůbec - viz např. článek Tingholm T. E., et al. „SIMAC (Sequential Elution from IMAC), a Phosphoproteomics Strategy for the Rapid Separation of Monophosphorylated 20 from Multiply Phosphorylated Peptides“, Molecular & Cellular Proteomics 7, 661-671, 2008. Další nevýhodou tohoto postupu je že mikročástice TiO2 (nebo jiného přechodového kovu a SiO2) nelze používat opakovaně, neboť jejich vazebná kapacita se při každém dalším použití výrazně snižuje. Navíc, již před prvním použitím mají malý měrný povrch, který je zodpovědný za nízkou 25 startovní vazebnou kapacitu nosiče.
Určitou výjimkou jsou magneticky aktivní nanočástice TiO2 o velikosti 100 až 200 nm s obchodním názvem MagPrep TiO2 známé např. z WO 2009/115176, které obsahují magnetické jádro tvořené Fe3O4, které je pokryté slupkou z TiO2.
39' V článku Chen, C.-T. & Chen, Y.-C.: „Fe3O4/TiO2 Core/Shell Nanoparticles as Affinity Probes for the Analysis of Phosphopeptides Using TiO2 Surface-Assisted Laser Desorption/lonization Mass Spectrometry“, Analytical Chemistry 77 (2005), 5912-5919, bylo dále popsáno využití laboratorně připravených TiO2 nanočástic s magneticky aktivním jádrem
PS397-3CZ
- 4 tvořeným Fe3O4 pro obohacení fosfopeptidů a následnou SALDI-MS (hmotnostní spektrometrie s ionizací laserem za účasti povrchu).
Nevýhodou těchto nanočástic je, že na svém povrchu obsahují pouze TiO2, díky čemuž je značně oslaben efekt jejich magnetické části a nejsou také zachovány specifické vazebné interakce mezi TiO2 a magnetickým oxidem.
Separace rekombinantních peptidů/proteinů značených polyhistidinovou kotvou (His-tag)
Řada významných bioaktivních látek, podávaných injekčně do lidského organismu jako biologické terapeutikum, jako např. inzulín, erytropoetin, interferony, subjednotkové vakcíny, apod. se v současné době připravuje rekombinantní cestou - tj. způsobem, kdy se do genomu produkčního organismu (např. bakterií, kvasinek, živočišných buněk) uměle začlení vektor s genem kódujícím požadovaný protein, díky čemuž se tento protein v dané buňce exprimuje společně s vlastními proteiny buňky. Přitom se rekombinantní protein bud hromadí v cytosolu buňky nebo se uvolňuje do extracelulárního prostoru nebo se za určitých podmínek uzavírá do tzv. inkluzních tělísek. Výsledkem je v každém případě z chemického hlediska vysoce komplexní směs heterogenních látek. Vzhledem ktomu, že i jen minimální kontaminace rekombinantních proteinů nefunkčními fragmenty, či jinými látkami proteinové povahy může u pacientů vyvolat značné zdravotní komplikace, jsou nároky na čistotu těchto proteinů pro in vivo použití v medicíně extrémně vysoké. Proto je pro jejich separaci nutné použít účinnou a vysoce selektivní separační metodu, která umožňuje spolehlivě oddělit daný rekombinantní protein od ostatních abundantních proteinů a jiných látek chemické povahy pocházejících z produkčního organismu.
Postupně bylo popsáno a do praxe zavedeno mnoho různých modifikací rekombinantních proteinů, které mají usnadnit jejich separaci a purifikaci. Nejpoužívanější je modifikace polyhistidinovou kotvou (His-tag), která se skládá nejčastěji ze 6 až 8 po sobě jdoucích histidinů na C- nebo N-konci polypeptidového řetězce. Pomocí této kotvy a její biospecifické interakce s ligandem na nosiči je možné rekombinantní protein ze směsi mnoha dalších proteinů snadno separovat v poměrně čisté formě. K separaci těchto proteinů se v současné době v drtivé většině aplikací používá technika IMAC, tj.
PS3973Gá
- 5 chromatografie na imobilizovaných kovových iontech nosiče (viz výše) s dvojmocnými ionty kovů, z nichž nejpoužívanějším iontem je Ni2+, méně často Co2+; alternativně lze použít i například Cu2+ či Zn2+ nebo další ionty. Nevýhodou těchto nosičů je, že jsou často připravovány na bázi zesíťovaných 5 gelů nebo jiných polymerních materiálů, které mají nízkou mechanickou a chemickou odolnost. Časté je také nežádoucí uvolňování iontů z nosiče, například v kyselém prostředí. Asi nejvýznamnějším limitem použití techniky IMAC pro separaci rekombinantních proteinů je fakt, že vedle polyhistidinu mají k použitému nosiči afinitu i jiné aminokyseliny (Glu, Asp, Arg, Lys, Tyr, Cys a 10 Met) a též N-koncová aminoskupina proteinu, takže pro vysokou čistotu separovaného proteinu je nutno vhodně nastavit ekvilibrační, promývací a eluční podmínky, což vyžaduje značně zkušenou obsluhu a ne vždy je možné dosáhnout požadované čistoty izolovaného proteinu.
1ď Separace nukleových kyselin
Separace nukleových kyselin je nezbytným krokem při studiu genetické informace mnoha organismů. Molekulární diagnostika infekcí, genetická analýza nebo profilování, též genová terapie, to jsou některé příklady, kdy je nutné nukleové kyseliny nejprve před vlastní analýzou šetrně z buněk separovat 2ď a oddělit je též od jiných kontaminujících látek přítomných v buněčném lyzátu.
V dnešní době je hojně používaným způsobem separace nukleových kyselin pomocí fenolu a chloroformu - viz např. článek Albariňo C.G., Romanowski V.: „Phenol extraction revisited: a rapid method for the isolation and preservation of human genomic DNA from whole blood“, Molecular and 25 Cellular Probes 8 (1994). 423—427, a článek Manoj C. et al.: „A method for the extraction of high-quality RNA and protein from single small samples of arteries and veins preserved in RNAIater“, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, Volume 47, Issue 2, March-April 2002, 87-92. Jedná se o vícekrokový postup, který umožňuje separovat nukleové kyseliny ve velké čistotě a 30 s dostatečnou účinností, neboť fenolem se vysráží prakticky všechny proteiny, které se pak snadno odstraní. Úpravou hodnoty pH reakčního prostředí přitom lze současně provádět specifické separace určitého typu nukleových kyselin, když se např. pro separaci ribonukleových kyselin použije kyselý fenol, pro separaci deoxyribonukleových kyselin se použije fenol o hodnotě pH 7,5 až 8 a
PS3973GZ
- 6 kontaminující ribonukleové kyselin se degradují RNázami, apod. Po separaci a po všech purifikačních krocích je často nutné pro další experimenty nukleové kyseliny zakoncentrovat.
Jiným způsobem separace nukleových kyselin je jejich vychytávání na 5' skleněnou matrici za přítomnosti vysokých koncentrací chaotropních solí, s následnou elucí nukleových kyselin roztokem o nízké koncentraci chaotropní soli - viz např. článek Hóss M. and Páábo S.: „DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purification method“, Nucleic Acids Research 21 (1993) 3913-3914. Na tomto principu je založena většina komerčních souprav pro 10 separaci nukleových kyselin - např. DNeasy Blood&Tissue Kit od firmy QIAGEN, kde je základním materiálem pro separaci silikagelová membrána. Podobně fungují i magnetické nosiče a to např. MagPrep Silica Particles (EMD Milipore). Nevýhodou těchto souprav je jejich vyšší cena a často také nižší výtěžnost.
Ve výhodné variantě lze také použít magnetické nanočástice pokryté SiO2, které mohou být navíc modifikovány například amino skupinou - viz např. článek Bai Y. et al.“ A rapid method for the detection of foodborne pathogens by extraction of a trace amount of DNA from raw milk based on amino-modified silica-coated magnetic nanoparticles and polymerase chain reaction“, Analytica 2Ó Chimica Acta 787 (2013); 93-101.
Jiným způsobem separace nukleových kyselin je využití iontově výměnné kapalinové chromatografie, kdy se nukleová kyselina vychytává na kladně nabité částice nosiče a následně eluuje zvyšující se koncentrací solí, kdy dochází k postupnému uvolňování nejen molekul nukleové kyseliny, ale i 25 jiných negativně nabitých molekul. Takto lze od sebe oddělit látky lišící se množstvím i hustotou negativních nábojů na svém povrchu. Nevýhodou této metody je její nízká výtěžnost a specifita, přičemž výsledný produkt je vždy kontaminován vysokou koncentrací solí.
Z článku Amano T., et. al.: „Preparation of DNA-adsorbed TiO2 particles 3θ Augmentation of performance for environmental purification by increasing DNA adsorption by external pH regulation“ Science of the Total Environment 408 (2010),480-485 je pak známý způsob separace nukleových kyselin na bázi TiO2, který je založen na afinitě fosfátové skupiny nukleových kyselin k TiO2 materiálům.
PS397363
- 7 Z KR 20070062940 je dále známý způsob separace deoxyribonukleové kyseliny pro analytické využití prostřednictvím nemagnetických mezoporézních materiálů vyrobených z TiO2.
Mezi nejdůležitější hlediska při výběru způsobu separace Λ deoxyribonukleové kyseliny přitom patří kompatibilita zvolené metody s následnou PCR (polymerázová řetězová reakce) technikou. Vlastní polymerizace nukleové kyseliny probíhá v rozmezí pH 8,3 až 8,8 vTris-HCI 10 mM s přídavkem MgCI2 a KCI. Lze však využít i jiné pufrovací systémy, ale je nutné, aby byla za takových podmínek zachována funkční aktivita příslušné 10 polymerázy (např. Taq polymeráza má pH optimum pH 7,8 až 9,0).
Většina výše uvedených technik prováděných na pevné fázi využívá principu nespecifické, na fyzikálně-chemických principech založené, sorpci nukleových kyselin.
1Ó Separace peptidů/proteinů obsahujících cystein
V článku Tambor V., et al.: „CysTRAQ — A combination of iTRAQ and enrichment of cysteinyl peptides for uncovering and quantifying hidden proteomes“, Journal of Proteomics 75 (2012),857 - 867, bylo experimentálně potvrzeno, že až 15 % peptidů v rozmezí 800 «*3000 Da vzniklých po naštěpení 20 všech lidských proteinů trypsinem by obsahovalo alespoň jeden cystein. Domény proteinů, které jsou bohaté na cysteiny, se totiž významně uplatňují v mnoha buněčných procesech, jsou součástí mnoha enzymů, receptorů a signálních molekul. Jejich selektivní separace je jednou ze strategií umožňující studium primární a sekundární struktury proteinů.
Peptidy/proteiny obsahující thioly, jako je glutathion nebo fytochelatiny hrají důležitou roli při obraně organismu před intoxikací těžkými kovy, zajišťují rovnováhu mezi oxidací a deoxidací. Glutathion je tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu nacházející se v buňkách živočichů, rostlin i bakterií a chrání organismus před oxidačním stresem.
3Ó Fytochelatiny jsou post-translačně syntetizované peptidy, které se vyskytují především v rostlinách a efektivně vyvažují ionty těžkých kovů, čímž rostlinu chrání před jejich toxickým působením. Cysteiny také často podléhají posttranslačním modifikacím jako je S-nitrosylace a následná oxidace, což má za následek špatnou konformaci proteinů, což může vést k vzniku agregátů např. u
PS3973G3
-- 8 neurodegenerativních onemocnění - viz např. článek P. J. Muchowski: „Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones”, Nature Reviews Neuroscience 6 (2005), 11-22.
Také jedovatí pavouci, hadi, škorpióni nebo mořští šneci produkují velkou škálu bioaktivních peptidů bohatých na cysteiny, které se podílí na stabilizaci jejich struktury množstvím disulfidických vazeb. Jinou významnou skupinou látek bohatých na cysteiny jsou hydrofobiny jako primární metabolity mikroskopických vláknitých hub způsobující nemalé škody v pivovarnictví a sladovnictví především díky tomu, že způsobují přepěňování piva - viz např.
článek Linder, Μ. B., et. al.: „Hydrophobins: the protein-amphiphiles of filamentous fungi“, FEMS Microbiology Reviews 29 (2005), 877-896. Příkladem klinicky významné funkce peptidů bohatých na cystein je asociace s Parkinsonovou chorobou, kdy se GPR37 doména bohatá na cysteiny výrazně podílí na cytotoxických efektech uvnitř buňky jako je stres endopla^matického 15 retikula, což vede k apoptóze buňky - viz např. článek Jorge Gandía et al,“ The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain“, Journal of Neurochemistry 125 (2013), 362-372.
Do dnešního dne bylo vyvinuto několik způsobů pro specifickou separaci peptidů/proteinů obsahujících cystein, jako např. kovalentní chromatografie založená na specifické separaci peptidů/proteinů s volnou sulfanylovou skupinou pomocí nosiče obsahujícího reaktivní 2-pyridyldisulfid. 2-pyridyldisulfid přitom reaguje s -SH skupinou peptidu, při čemž dochází ke vzniku stabilní disulfidické vazby mezi bílkovinou a nosičem a k uvolnění 1,2-dihydro-225 pyridinthionu. Keluci kovalentně vázané molekuly se používá redukující βmerkaptoethanol nebo dithiothreitol - viz např. článek Brandt J. et al., Journal of Solid-Phase Biochemistry 2 (1977) 105-109, a článek Liu T. et al.: „Improved proteome coverage by using high efficiency cysteinyl peptide enrichment: the human mammary epithelial cell proteome“, Proteomics 5 (2005), 1263-1273.
Mezi komerční výrobky, které se používají k separaci proteinů bohatých na cystein nebo peptidů obsahujících cystein se nejčastěji používá Thiopropyl Sepharose 6B nebo 4B (GE Healthcare), nosič obsahující 2-pyridyldisulfid o velikosti 45 až 165 pm.
PS3973CZ*- 9
Na podobném principu pak fungují i další metody, které slouží k specifickému označení—SH skupiny cysteinu, kdy dojde ke snížení komplexity výchozího materiálu určeného k analýze, přičemž takto označená molekula umožní též kvantifikaci látky.
Z článku Spahr C. S., et. al.: „Simplification of complex peptide mixtures for proteomic analysis: reversible biotinylation of cysteinyl peptides“, Electrophoresis 21 (2000), 1635-1650 je známá technika reverzibilní biotinylace cysteinových peptidu, z článku Giron P, et. al.: „Cysteine-reactive covalent capture tags for enrichment of cysteine-containing peptides”, Rapid 10 Communications in Mass Spectrometry 23 (2009), 3377-3386 značení cystein'reaktivními značkami pro kovalentní záchyt, z článku Gygi S. P., et al.: „Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags“, Nature Biotechnology 17 (1999), 994-999, přístup zvaný ICAT, a z článku Tambor V., et al.: CysTRAQ—a combination of iTRAQ and enrichment 15 of cysteinyl peptides for uncovering and quantifying hidden proteomes“, Journal of Proteomics 75 (2012), 857 - 867 cystein reaktivní značky pro tandemovou hmotnostní spektrometrii a CysTRAQ.
Cílem vynálezu je odstranit nevýhody stavu techniky a navrhnout způsob 20^ pro účinnou separaci a purifikaci biopolymerních molekul, který by byl vhodný pro většinu významných biopolymerních molekul a vybrané biotechnologické a biomedicinské aplikace.
Kromě toho je cílem vynálezu navrhnout nosič pro použití při tomto způsobu.
Podstata vynálezu
Cíle vynálezu se dosáhne způsobem separace biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny mono- a multifosforylované peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či 39 jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyseliny, jehož podstata spočívá v tom, že biopolymerní molekula se ve vazebném roztoku naváže specifickou vazbou na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na
PS397362·
- 10 jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky 5' navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují požadované biopolymerní molekuly. Tímto způsobem se dosáhne vysoké čistoty separované biopolymerní molekuly.
Vazebný roztok pro navázání mono- a multifosforylovaných peptidů na nosič s výhodou obsahuje 35 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % IQ karboxylové kyseliny. Promývací roztok s výhodou obsahuje 5 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny. Pro redukci nespecifické vazby může vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahovat 0,5 až 3 M jiné karboxylové kyseliny. Mono- a/nebo multifosforylovaný peptid se pak z nosiče eluuje elučním roztokem s pH vyšším než 9, nebo kompetitivní 15 elucí roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání rekombinantního peptidu/proteinu s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou na nosič s výhodou obsahuje libovolný pufr a 0 až 300 mM imidazolu, přičemž jeho pH je v rozmezí 3 až 8,7. Také promývací roztok obsahuje 20 libovolný pufr a 0 až 300 mM imidazolu, přičemž jeho složení je s výhodou stejné jako složení vazebného roztoku. Pro redukci nespecifické vazby pak může vazebný a/nebo promývací roztok obsahovat až 0,5 M soli/solí. Rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se pak z nosiče eluuje změnou pH 25 na 9,5 až 12. Rekombinantní protein se z nosiče výhodou eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů nebo přídavkem imidazolu do celkového množství imidazolu 10 mM až 1 M, rekombinační peptid pak zvýšením pH v rozmezí 9,5 až 12 nebo elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání peptidů/proteinů obsahující cystein na nosič obsahuje libovolný pufr a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného, přičemž jeho pH je 6 až 8. Také promývací roztok obsahuje libovolný pufr a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného, s pH 6 až 8, přičemž jeho složení je s výhodou stejné jako složení vazebného roztoku. Pro redukci nespecifické vazby pak může * ’ PS3973C3
- 11 vazebný a/nebo promývací roztok obsahovat 10 až 50 mM dithiotreitolu, merkaptoethanolu nebo kyseliny merkaptobenzoové. Peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje změnou pH na hodnotu 10 až 12, např. přídavkem fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání deoxyribonukleové kyseliny na nosič je tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5. Také promývací roztok je v tomto případě tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5, přičemž ve výhodné variantě provedení je jeho složení stejné jako složení vazebného roztoku.
Vazebný roztok pro navázání ribonukleové kyseliny na nosič je tvořen W pufrem s pH 3,8 až 4,5. Také promývací roztok je v tomto případě tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5, přičemž ve výhodné variantě provedení je jeho složení stejné jako složení vazebného roztoku.
Deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se pak z nosiče eluuje zvýšením pH na hodnotu 8 až 11, nebo elučním roztokem obsahujícím 15 alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
Ve všech variantách separace biopolymerních molekul podle vynálezu je výhodné, pokud se použije nosič, který obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4.
Po ukončení separace je pak dále výhodné použitý nosič regenerovat, 20 resp. dekontaminovat a sterilizovat, a to např. fotokatalýzou iniciovanou UV zářením o vlnové délce 200 až 400 nm, s intenzitou alespoň 1 mW/cm2 plochy nosiče.
Kromě způsobu separace se cíle vynálezu dosáhne také nosičem pro separaci biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny 25 mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahující cystein, a nukleových kyseliny jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikroa/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu 30 a/nebo oxidu křemíku, přičemž alespoň na části povrchu jádra je uložená vrstva a/nebo jsou uloženy nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře. Přitom je výhodné, pokud alespoň část alespoň některých částic zasahuje do povrchu jádra nebo z něj vystupuje.
’ PS3973CZ τ12 Jádro takového nosiče je pak s výhodou tvořené oxidem křemíku a/nebo oxidem přechodového kovu ze skupiny TiO2, ZrO2, AI2O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2Os, MoO2, MoO3, ZnO, V2Os, Fe2O3, Fe3O4, nebo směsí alespoň dvou z nich, přičemž magnetický oxid kovu jsou s výhodou oxid kovu ze skupiny 5 FexOy, NiO, CoO, Co3O4, ferit na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, nebo směs alespoň dvou z nich.
V nejvýhodnější variantě provedení obsahuje nosič podle vynálezu jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4.
Objasnění výkresů
Na obr. 1 přiloženého výkresu je 100 OOO^rát zvětšená fotografie nosiče vyvinutého pro separaci biopolymerních molekul podle vynálezu v jedné z variant provedení, na obr. 2 čtyři bloková schémata způsobu izolace čtyř 15 různých polymerních biomolekul podle vynálezu, na obr. 3 tři MS spektra srovnávající čistý standard - fosvitin naštěpený trypsinem, výsledek obohacení fosvitinu s využitím komerčního nosiče známého ze stavu techniky, a výsledek obohacení fosvitinu s využitím nosiče podle vynálezu na obr. 1, na obr. 4 dvě MS spektra srovnávající standard - komerční ubikvitin s His-tag naštěpený 2Ó trypsinem, a výsledek separace ubikvitinu s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, a na obr. 5 dvě MS spektra srovnávající standard - hovězí sérový albumin naštěpený trypsinem, a výsledek separace peptidů z hovězího sérového albuminu s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1.
Příklady uskutečnění vynálezu
Způsob separace biopolymerních molekul (zejména mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyselin) podle 30 vynálezu je založen na využití kompozitního nosiče tvořeného jádrem z materiálu na bázi oxidu přechodového kovu/ů (např. Ti, AI, Zr, Ta, Hf, W, Nb, Sn, V, Fe) nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu a/nebo v jehož vnitřní struktuře je uložen magnetický oxid kovu/ů (např. Fe, Co a Ni).
ť »
PS3973CZ/ -13 Jádro tohoto nosiče je přitom tvořeno v podstatě libovolným útvarem, např. kulovou nebo v podstatě kulovou částicí, trubicí (dutým podélným útvarem, který má výrazně větší délku než průměr), vláknem (plným podélným útvarem, který má výrazně větší délku než průměr), či v podstatě libovolným 5 jiným útvarem/částicí (pravidelným nebo nepravidelným, např. krychlí, kvádrem, hranolem, jehlanem, apod.), s rozměry v nano-, submikro- nebo mikroměřítku. Jeho materiálem je přitom oxid přechodového kovu (s výhodu např. TiO2, ZrO2, AI2O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2O5, MoO2, MoO3, ZnO, V2O5, Fe2O3, Fe3O4, nebo směs alespoň dvou z nich v libovolném poměru, nebo směs 10 stechiometrických i nestechiometrických forem alespoň jednoho z nich v libovolném poměru), oxid křemíku (SiO2 - v libovolném poměru stechiometrických a nestechiometrických forem), nebo směs alespoň jednoho oxidu přechodového kovu a SiO2 v libovolném poměru. S výhodou lze jako materiál jádra nosiče použít zejména TiO2, který je ze všech uvedených oxidů 15 nejvíce biokompatibilní.
Na povrchu tohoto jádra a/nebo v jeho vnitřní struktuře je pak uložen magnetický oxidu kovu, s výhodou zejména libovolné stechiometrické nebo nestechiometrické varianty FexOy, NiO, CoO, Co3O4, feritu na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, případně směs alespoň dvou z nich. Výhodné je 20 přitom použití magnetitu a/nebo maghemitu, které nejsou pro lidský organismus toxické a které vykazují, pokud jsou ve formě částic menších než 12 nm, superparamagnetické vlastnosti. Tento materiál přitom může být uložen na povrchu jádra ve formě souvislých nebo nesouvislých vrstev a/nebo nahodile dispergovaných nanočástic, a/nebo je ve formě nanočástic uložen v jeho vnitřní 25 struktuře, ideálně tak, aby alespoň část alespoň některých nanočástic vystupovala na povrch. V první variantě jsou nanočástice magnetického oxidu kovu/ů na povrchu jádra s výhodou zakotveny kovalentními, nebo jinými fyzikálně-chemickými interakcemi, které jim zajišťují maximální ochranu vůči externím, zejména fyzikálním vlivům (vymyti, uvolnění, apod.), a zajišťují tak 30 dlouhodobou hybnost daného nosiče v magnetickém poli.
Hlavní předností nosiče podle vynálezu je, že dosahuje specifické povrchové interakce oxidu přechodového kovu s biopolymerními molekulami, které se mají separovat, přičemž je však současně zachován i příspěvek jeho magnetického materiálu, který umožňuje efektivní odstranění nosiče ze vzorku
PŠ3973CZ
- 14 ~ působením magnetického pole; navíc má tento nosič obrovský specifický povrch. Další předností nosiče podle vynálezu je jeho velká chemická, fyzikální a mechanická kompatibilita - v různých variantách se jedná se o principiálně velmi podobné materiály, které je možné vzájemně zaměnit a/nebo kombinovat.
Nejvýhodnější variantou nosiče je přitom varianta, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicí TiO2, na jejímž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4 (obr. 1), neboť tyto materiály nevykazují toxicitu pro lidský organismus, jsou biokompatibilní, a současně je lze opakovaně použít, neboť si zachovávají vysokou vazebnou schopnost a selektivitu.
Nosič podle vynálezu přitom lze s využitím fotokatalýzy účinně dekontaminovat a sterilizovat účinkem UV záření.
Při výrobě nosiče podle vynálezu se magnetický oxid kovu/ů s výhodou nanáší na předem připravená jádra, např. přímou chemickou cestou, použitím metody naprašování (sputtering), metody ukládání atomární vrstvy (ALD 15' - Atomic Layer Deposition).
Takto připravený nosič vykazuje dostatečnou mechanickou i chemickou odolnost, takže ho lze použít pro účinnou separaci biopolymerních molekul, při které se separované biopolymerní molekuly na tento nosič specificky naváží, načež se odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty pocházející 20 z daného vzorku, a v závěru se separované biopolymerní molekuly eluují změnou pH nebo vhodným roztokem. Tímto způsobem separované biopolymerní molekuly díky tomu dosahují vysoké čistoty.
Magnetické vlastnosti kompozitního nosiče podle vynálezu umožní jeho variabilní použití - ať již vsádkové nebo kolonové uspořádání ve formě 25 magneticky stabilizovaného fluidního lože (Magnetically Stabilized Fluidized Bed - MSFB). Kulovité varianty umožňují použití v klasickém kolonovém uspořádání, naopak vlákenné útvary je možné využít například pro výrobu filtrů, které budou specificky izolovat požadované látky. Ve všech případech se ke stabilizaci separačního lože a/nebo k účinnému oddělení nosičů s navázanými 30 biopolymerními molekulami z reakční směsi použije silné magnetické pole.
Magnetický materiál uložený na povrchu jádra nosiče a/nebo v jeho vnitřní struktuře má s výhodou superparamagnetické vlastnosti, díky kterým nosič po odstranění magnetického pole nevykazuje zbytkový magnetismus
PS3973G2 (který by vykazovaly materiály ferromagnetické), takže s ním lze pracovat střídavě v režimu homogenně rozptýlené suspenze nebo v oddělených fázích.
V jiné variantě separace biopolymerních molekul se výše popsaný nosič zakomponuje do separačních kanálků mikrofluidních systémů (tzv. pTAS), čímž 5' se znásobí pozitivní efekt miniaturizace reakčního objemu při průkazu či separaci dané biopolymerní molekuly, avšak stále s vysokým specifickým povrchem daným povahou náplně separačního mikrokanálku systému.
Další variantou provádění separace biopolymerních molekul je uchycení kompaktního bloku nosičů, jejichž jádro je tvořeno oboustranně průchozími 1,0 nanotrubicemi (jejich spodní uzavřená část vznikající při výrobě je odstraněna), v membránovém držáku, přičemž směsný roztok látek protéká dutinami nanotrubic podobně, jako je tomu u procesu membránových filtrací.
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, buněčném kultivačním médiu, apod. se nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší peptidové řetězce. Takto získané mono- a multifosforylované peptidy se pak naváží specifickou interakcí mezi jejich fosfátovou skupinou a oxidem kovu/kovů jádra na nosič podle vynálezu. Samotná vazba peptidů na 20 nosič přitom probíhá ve vazebném roztoku, který obsahuje 35 až 90 % organické fáze (s výhodou acetonitril (ACN), metónol, etanol nebo jiné organické rozpouštědlo) a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny (s výhodou kyseliny trifluoroctové (TFA), kyseliny mravenčí, apod.), přičemž nízké pH tohoto roztoku slouží k potlačení nespecifické vazby. Kromě toho však lze pro redukci g5 nespecifické vazby použít jinou karboxylovou kyselinu, např. kyselinu mléčnou (s výhodou v koncentraci 0,5 až 2 M), kyselinu glykolovou, kyselinu salicylovou, kyselinu fialovou, kyselinu 2,5-dihydroxybenzoovou (s výhodou v koncentraci 0,5 až 3 M), apod.
Po vazbě se z nosiče alespoň jednou promývacím roztokem, který 30 obsahuje 5 až 90 % organické fáze (s výhodou ACN, metanol, etanol nebo jiné organické rozpouštědlo) a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny (s výhodou TFA, kyseliny mravenčí, apod.), nebo vazebným roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty.
·
PS3973GZ
-~16 Poté se z něj elučním roztokem s pH vyšším než 9 (např. 1 % vodný roztok amoniaku) uvolní specificky navázané mono- a/nebo multifosforylované peptidy. V jiné variantě lze tuto eluci provést kompetitivně, s použitím roztoku obsahujícího fosfát/fosfáty (minimálně 20 mM).
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
Separované mono- a multifosforylované peptidy lze dále využít, např. pro následnou (MS) analýzu.
Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů je naznačena na obr. 2 prvním blokovým schématem zleva.
Příklad 1 mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % acetonitrilu (ACN) a 0,1 % kyseliny trifluoroctové (TFA), se při působení magnetického pole promylo 500 pl promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN a 0,1 % TFA, a poté 500 pl vazebného a promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN, 5 % TFA a 1 M kyseliny mléčné (LA). Přebytečný roztok se odstranil a k nosiči se přidalo 200 pl roztoku obsahujícího 60 pmol proteolyticky naštěpeného fosvitinu - modelového hyperfosforylovaného proteinu, rozpuštěného ve vazebném a promývacím roztoku výše popsaného složení. Nosič s naneseným naštěpeným fosvitinem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se z reakční směsi odstranil vazebný a promývací roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 2/x 500 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN, 5 % TFA a 1 M LA a 2/x 500 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN a 0,1 % TFA. K takto promytému nosiči se poté přidalo 50 μί elučního roztoku (1 /,.% vodného roztoku amoniaku), přičemž eluce probíhala po dobu 15 min za otáčení.
Poté se eluční roztok nad nosičem odebral, okyselil se TFA a analyzoval se pomocí hmotnostní spektrometrie (MS).
Na obr. 3 jsou znázorněna 3 MS spektra - nejvýše je MS spektrum čistého standardu - fosvitinu, uprostřed je MS spektrum fosvitinu separovaného s použitím nejpoužívanějšího nosiče - konkrétně Titansphere™ TiO Bulk
PS3973GZI
Material, 10 pm výrobce GL Sciences Inc. , a nejníže MS spektrum fosvitinu separovaného s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubcemi z TiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Z porovnání těchto spekter jasně vyplývá, že poměr mezi 5' multifosforylovanými peptidy - píky 1620 a 1149, a monofosforylovanými peptidy - píky 1540 a 1069, je při použití nosiče podle vynálezu více posunut směrem k multifosforylovaným peptidům. Píky 1540 a 1620 i 1149 a 1069 se přitom liší pouze množstvím fosfoskupin a mají stejnou aminokyselinovou sekvenci, což znamená, že nosič podle vynálezu separuje multifosforylované 10 peptidy lépe než nosič Titansphere™ TiO. Přitom se při stejných podmínkách získá čistší vzorek a MS spektrum má při použití nosiče podle vynálezu o jeden řád vyšší intenzitu, což značí vysokou účinnost záchytu spojenou s vysokou selektivitou.
Vzhledem k tomu, že separace podle vynálezu je založena na specifické 15 interakci mezi fosfátovou skupinou mono- nebo multifosforylovaného peptidu a oxidem kovu/kovů jádra nosiče podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní mono- a multifosforylované peptidy se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně jako výše uvedený fosvitin.
Separace peptidů/proteinů obsahujících His-tag
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, buněčném kultivačním médiu, apod. se pro separaci na peptidové úrovni nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší polypeptidové řetězce. Pro separaci na proteinové úrovni se proteiny separují v intaktní formě.
V obou případech se přitom použije nosič podle vynálezu, přičemž separace peptidů/proteinů je založena na specifické interakci pozitivně nabitých skupin kolem atomu N ve struktuře histidinu s oxidem kovu/kovů jádra nosiče.
Vazba peptidů na nosič přitom s výhodou probíhá ve vazebném roztoku obsahujícím 10 mM imidazolu ve 100 mM glycin-HCI pufru s pH 3,2, přičemž 30 stejný roztok se pak s výhodou použije i pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent.
V případě proteinů se pro jejich vazbu na nosič a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent z nosiče s výhodou použije roztok tvořený 50 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5.
PS3973CZ
- 18 Obecně je možné použít vazebný a/nebo promývací roztok, který obsahuje pufr o libovolném složení s pH v rozmezí 3 až 8,7, s přídavkem 0 až 300 mM imidazolu. Všeobecně lze použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Roztoky lze pro 5 potlačení nespecifické vazby dále doplnit i o soli, například NaCl, a to až do koncentrace 0,5 M.
Peptidy se z nosiče eluují změnou pH v rozmezí 9,5 až 12 nebo elučním roztokem/roztoky obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů (například fosforečnan disodný nebo fosfátový pufr). Proteiny se z nosiče eluují přídavkem 10 imidazolu nebo zvýšením jeho koncentrace oproti vazebnému a promývacímu roztoku (na 10 mM až 1 M) nebo také elučním roztokem/roztoky obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů (například fosforečnan disodný nebo fosfátový pufr).
Pokud je z nějakého důvodu žádoucí peptidy pouze odstranit z roztoku, 15 lze je ponechat navázané na nosiči, a po té je zlikvidovat při jeho regeneraci.
Tento postup je využitelný např. pro odstranění odštěpených polyhistidinových kotev.
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace peptidů/proteinů obsahujících His-tag je naznačena na obr. 2 druhým blokovým schématem zleva.
Příklad 2 - Separace peptidů obsahující His-tag
1 mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promylo 2.x 500 pl promývacího roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCI pufru s pH
3,2. K promytému nosiči se poté přidalo 60 pmolů proteolyticky naštěpeného ubikvitinu s His-tag rozpuštěného v 200 μΙ vazebného roztoku tvořeného 0,1 M 30 glycin-HCI pufru s pH 3,2. Nosič s naneseným ubikvitinem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 2 x 300 μΙ promývacího roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCI pufru s pH 3,2, 2x 300 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 0,1 M
PS3973GZ
-19 glycin-HCI pufru s pH 3,2 a 150 mM imidazolu, a poté 300 pl promývacího roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCI pufru s pH 3,2.
K takto promytému nosiči se přidalo 100 μΙ elučního roztoku (1!% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 minut a za otáčení probíhala 5 eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem, tento se okyselil TFA a analyzoval pomocí MALDI-MS.
Na obr. 4 jsou znázorněna 2 MS spektra - horní je MS spektrum komerčního ubikvitinu s His-tag naštěpeného trypsinem, spodní je MS spektrum ubikvitinu separovaného s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr.
1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicemi z TiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Z porovnání obou spekter je zřejmé, že při separaci se získal téměř čistý ubikvitin s His-tag (pík 1768,840) s aminokyselinovou sekvencí GSSHHHHHHSSGLVPR. To potvrzuje vysokou afinitu nosiče podle vynálezu k rekombinantním proteinům značeným 15 polyhistidinovou kotvou.
Příklad 3 - Separace proteinů značených His-tag mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole 20 promylo 2/x 500 μΙ promývacího roztoků tvořeného 50 mM Tris-HCI pufru s pH
7,5. K promytému nosiči se poté přidalo 200 μΙ vazebného roztoku tvořeného 50 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5, který obsahoval rekombinantní protein s Histag. Nosič s nanesenými proteiny se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 5.x 500 μΙ promývacího roztoku tvořeného 50 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 2fx 100 μΙ elučního roztoku obsahujícího 50 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 a 150 mM imidazolu, přičemž po / i dobu 2,x 15 minut a za otáčení probíhala eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem a eluční i promývací roztok se analyzovaly pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy v prostředí dodecylsulfátu sodného?, přičemž se zjistilo, že elektroforeogram eluční frakce, na rozdíl od původního vzorku, obsahuje čistý rekombinantní protein s minimem příměsí.
pssozsca' — 20 —
Vzhledem k tomu, že separace podle vynálezu je založena na specifické interakci mezi pozitivně nabitou skupinou kolem atomu N ve struktuře histidinu s oxidem kovu/kovů jádra nosiče a magnetického oxidu kovu podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní peptidy/proteiny s His-tag nebo jinou chemicky podobnou 3 biospecifickou kotvou, se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně.
Separace peptidů/proteinů obsahující cystein
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, 10 buněčném kultivačním médiu, apod. se pro separaci na peptidové úrovni nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší polypeptidové řetězce. Pro separaci na proteinové úrovni se proteiny separují v intaktní formě. Peptidy nebo proteiny s cysteiny se poté separují s použitím nosiče podle vynálezu na základě specifické interakce -SH skupiny cysteinu s oxidem 15 kovu/kovů jádra nosiče. Volná -SH skupina, pokud již není přítomna, se přitom získá předchozí redukcí -S-S- vazeb pomocí dithiotreitolu (minimálně 10 mM).
Obdobně lze peptidy/proteiny obsahující cystein izolovat pomocí specifické interakce -SO3H skupiny s oxidem kovu/kovů nosiče. Volná -SO3H skupina se přitom získá předchozí oxidací -SH skupiny nebo přímo z -S-S20 vazeb pomocí kyseliny permravenčí (minimálně 2 %).
Vazba peptidů/proteinů na nosič pak probíhá ve vazebném roztoku obsahujícím 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). Obecně je možné použít vazebný roztok, který obsahuje pufr o libovolném složení s pH v rozmezí 6 až 8 s přídavkem 0 až 2 % 25 SDS. Všeobecně lze použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Stejný roztok se pak použije i jako promývací roztok k odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent z nosiče. Vazebný a promývací roztok lze pro potlačení nespecifické vazby dále obohatit o 10 až 50 mM dithiotreitolu, 30 merkaptoethanolu nebo kyseliny merkaptobenzoové.
Poté se zvýšením pH na hodnotu 10 až 12 nebo elučním roztokem obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů provádí eluce.
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
PS3973GS . 21 Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace peptidů/proteinů obsahující cystein je naznačena na obr. 2 druhým blokovým schématem zprava.
Příklad 4
Pomocí nosiče podle vynálezu se provedla separace peptidů obsahující cystein/y s volnou -SH skupinou z modelového vzorku - hovězího sérového albuminu naštěpeného trypsinem. 0,5 mg tohoto nosiče, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA se při působení 10 magnetického pole promylo 2/x 500 pl promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). K promytému nosiči se poté přidal vazebný roztok s 60 pmoly modelového vzorku v 200 pl 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5, s přídavkem 1 % SDS. Nosič s naneseným vzorkem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 6('x 300 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 a 1 % SDS.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 100 μΙ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 min a za otáčení probíhala 20 eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem a eluční i promývací roztok se analyzovaly pomocí hmotnostní spektrometrie (MS).
Na obr. 5 jsou znázorněna 2 MS spektra - horní je MS spektrum standardu, spodní je MS spektrum peptidů separovaných s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicemi z 25 TiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Peptidy obsahující cysteiny jsou přitom označeny šipkami, přičemž např. pík s nevyšší intenzitou ve spodním MS spektru (1052,450) s aminokyselinovou sekvencí CCTKPESER je v horním spektru zcela neviditelný. To značí selektivitu nosiče podle vynálezu přednostně pro peptidy obsahující cysteiny.
Příklad 5 mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA se při působení magnetického pole promyl 2 x 500 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 ’ PS3973C3'
- 22 s přídavkem 1 % SDS. K promytému nosiči se přidala směs proteinů (60 pmolů každého) obsahující hovězí sérový albumin, u kterého se pomocí 20 mM dithiotreitolu redukovaly -S-S- vazby (disulfidické můstky).
Tato směs se k nosiči přidala v 200 pl vazebného roztoku obsahujícího
100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 s přídavkem 1 % SDS. Nosič s nanesenými proteiny se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 6.;x 300 pl promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCI pufru s pH 7,5 s přídavkem 1 % SDS.
K takto promytému nosiči se přidalo 100 μΙ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 min za otáčení probíhala eluce.
Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem, a tento roztok se okyselil (na pH 8). Poté následovalo štěpení separovaných proteinů trypsinem na peptidové fragmenty a analýza elučního a promývacího roztoku pomocí hmotnostní spektrometrie (MS), přičemž velučním roztoku byly nalezeny téměř výhradně peptidy pocházející z hovězího sérového albuminu.
Vzhledem k tomu, že separace proteinů/peptidů s cysteinem/cysteiny podle vynálezu je založena na specifické interakci -SH skupiny nebo -SO3H skupiny cysteinu s oxidem kovu/kovů nosiče podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní peptidy/proteiny obsahující cystein/y, se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně.
Separace nukleových kyselin
Řetězce deoxyribonukleové kyseliny (DNK) se separují s použitím nosiče podle vynálezu na základě interakce fosfátových skupin, které jsou součástí nukleových kyselin, s oxidem kovu/ů nosiče. Vazba DNK na nosič přitom probíhá v pufru na bázi kyseliny 2-[N-morpholino]ethaněsulfonové (MES) s pH
4,5 až 6,5. Pro separaci ribonukleové kyseliny (RNK) se pak použije octanový pufr s pH 3,8 až 4,5. Všeobecně lze v obou případech použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Promývací roztoky pro odstranění nežádoucích a nespecificky navázaných komponent jsou v obou případech s výhodou shodné s vazebnými roztoky, ve kterých probíhá vazba na nosič.
PS3973CZ
- 23 Eluce se přitom v obou případech provádí zvýšením pH na hodnotu 8 až 11, nebo elučním roztokem obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů, např. fosforečnanu disodného nebo fosfátového pufru.
Analýza elučního a promývacího roztoku poté probíhá např. pomocí 5 elektroforézy (agarózové nebo polyakrylamidové) nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).
Separace nukleových kyselin je naznačena na obr. 2 prvním blokovým schématem zprava.
Příklade mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promyl 2.x 500 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM MES pufru s pH
5,5. K promytému nosiči se poté přidal vazebný roztok obsahující 10 pg roztoku 15 modelové deoxyribonukleové kyseliny - oligonukleotidu ve 100 μΙ 100 mM MES pufru s pH 5,0. Nosič s naneseným vazebným roztokem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 5/Jx 200 μΙ promývacího roztoku obsahujícího 100 20 mM MES pufru s pH 5,5.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 100 μΙ elučního roztoku Na2HPO3, přičemž po dobu 15 minut a za otáčení probíhala eluce. Poté jejím ukončení se eluční i promývací roztok odebraly a podrobily se analýze gelovou elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s fluorescenční detekcí, při které se 25 zjistilo, že oligonukleotidy lze na nosič podle vynálezu nejen vázat, ale také je z něj snadno uvolňovat.
Regenerace nosiče
Pro regeneraci nosiče podle vynálezu s cílem jeho opětovného využití je 30 nutné tento nosič zbavit všech zbytků biologických látek. V případě nosiče, který obsahuje jádro z TiO2 lze k tomuto účelu s výhodou využít ozáření nosiče UV zářením ve vodném prostředí. TiO2 totiž v takovém případě vytváří na svém povrchu velmi reaktivní hydroxylové radikály, které mají značnou schopnost štěpit organické molekuly na elementární oxid uhličitý a vodu, díky čemuž se
PS3973CZ _ 24 nosič podle vynálezu zcela očistí od jakýchkoliv nežádoucích organických zbytků. Přitom však nedochází k degradaci vrstev nebo nanočástic magnetického oxidu kovu/ů (např. Fe3O4), takže nejsou dotčeny magnetické vlastnosti nosiče.
Tato forma regenerace je možná také u jiných typů nosičů podle vynálezu s jádry z jiných přechodových kovů.
Aby se dosáhlo maximálního efektu UV záření, je výhodné nosič dispergovat ve vodném roztoku kolujícím v uzavřeném průtočném systému přes křemennou trubici, před níž je umístěn zdroj UV záření o vhodné vlnové délce. Průtok v systému musí s ohledem na průměr křemenné trubice a délku průtočného systému zvolen tak, aby byl nosič exponován záření min. 25 % celkového času.
V jiné variantě je možné využít i systém vsádkový, např. vhodnou nádobu s nosičem ve vodném roztoku. V takovém případě je nutno využít mechanické míchaní, např. vrtulové míchání nebo otáčení na rotátoru, a nepoužívat magnetické míchadlo, které by způsobilo shluknutí nosiče v místě působení magnetických sil.
Po dokončení fotokatalytického rozkladu je pak možné nosič z vodného prostředí separovat magnetickým polem.
Pro fotokatalytický rozklad zbytků biologických látek ses výhodou použije UV záření o vlnové délce 200 až 400 nm, s výhodou 260 do 340 nm. Intenzita UV záření přitom musí být alespoň 1 mW/cm2 ozařované plochy nosiče, přičemž intenzita 60 mW/cm2 ozařované plochy nosiče umožní kompletní rozklad organických molekul do 60 minut, intenzita 300 mW/cm2 ozařované plochy nosiče pak do 12 minut.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob separace biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních5 peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, nukleových kyselin, vyznačující se tím, že biopolymerní molekula ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, 10 peptidu/proteinu obsahujících cystein, nukleových kyselin, se ve vazebném roztoku naváže specifickou vazbou na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu 15 kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, a poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují biopolymerní molekuly.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání mono- a20 multifosforylovaných peptidů na nosič obsahuje vazebný roztok 35 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok 5 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že vazebný a/nebo 25 promývací roztok dále obsahuje 0,5 až 3 M jiné karboxylové kyseliny pro redukci nespecifické vazby.
- 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že mono- a/nebo multifosforylovaný peptid se z nosiče eluuje elučním roztokem s pH vyšším nežJ^Způsob podle libovolného z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že 30 niono- a/nebo multifosforylovaný peptid se z nosiče eluuje kompetitivní elucí roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání rekombinantního peptidu/proteinu s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou na nosič obsahuje vazebný roztok pufr s pH 3PV 2014-5241.8.2014 * -'> » 9PS3973CZ_225.8,2015.26 až 8,7 a 0 až 300 mM imidazolu a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok pufr s pH 3 až 8,7 a 0 až 300 mM imidazolu.7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že vazebný a/nebo 5 promývací roztok dále obsahuje až 0,5 M soli/solí pro redukci nespecifické vazby.8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje změnou pH v rozmezí 9,5 až 12.: o 9. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20mM fosfátu/fosfátů.10. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že 15 rekombinantní protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje přídavkem imidazolu, přičemž celkové množství imidazolu dosahuje 10 mM až 1 M.11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání peptidů/proteinů obsahujících cystein na nosič obsahuje vazebný roztok pufr s20 pH 6 až 8 a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok pufr s pH 6 až 8 a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného.12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahuje 10 až 50 mM dithiotreitolu, merkaptoethanolu25 nebo kyseliny merkaptobenzoové pro redukci nespecifické vazby.13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje změnou pH na hodnotu 10 až 12.14. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že 30 peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20mM fosfátu/fosfátů.15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání deoxyribonukleové kyseliny na nosič je vazebný roztok tvořen pufrem s pH 4,5PS3Stf3CX225.8.2015PV 2014-5241.8.2014* .- 27 až 6,5 a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent je promývací roztok tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5.16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání ribonukleové kyseliny na nosič je vazebný roztok tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5
- 5 a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent je promývací roztok tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5.17. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se z nosiče eluuje zvýšením pH na hodnotu 8 až 11.ΐσ 18. Způsob podle libovolného z nároků 15 nebo 16, vyznačující se tím, že deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.19. Způsob podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nosič obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu15 jsou uloženy a/nebo do jejichž povrchu zasahují a/nebo z jejichž povrchu vystupují nanočástice Fe3O4.20. Způsob podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nosič se po separaci biopolymerních molekul regeneruje UV zářením o vlnové délce 200 až 400 nm, s intenzitou alespoň 1 mW/cm2 plochy nosiče.21. Nosič pro separaci biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantní peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahující cystein, nukleových kyselin, vyznačující se tím, že obsahuje jádro s rozměry v nano-25 a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, přičemž alespoň na části povrchu jádra je uložena vrstva a/nebo jsou uloženy nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře.22. Nosič podle nároku 21, vyznačující se tím, že jádro nosiče je 30 tvořené oxidem křemíku a/nebo oxidem přechodového kovu ze skupiny TiO2,ZrO2, AI2O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2O5, Mo02, Mo03, ZnO, V2O5, Fe2O3, Fe3O4, nebo směsí alespoň dvou z nich.PV 2014-5241.8.2014PS3yf£3UZ-225.8.2015- 28 '23. Nosíc podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že magnetický oxid kovu je magnetický oxid kovu ze skupiny FexOy, NiO, CoO, Co304, ferit na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, nebo směs alespoň dvou z nich.24. Nosič podle libovolného z nároků 21 až 23, vyznačující se tím, že 5 obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy a/nebo do jejichž povrchu zasahují a/nebo z jejichž povrchu vystupují nanočástice Fe3O4.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-524A CZ2014524A3 (cs) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu |
| US15/501,020 US20170226153A1 (en) | 2014-08-01 | 2015-07-27 | Method for Separation of Biopolymer Molecules and a Carrier for Application of this Method |
| PCT/CZ2015/000081 WO2016015690A1 (en) | 2014-08-01 | 2015-07-27 | Method for separation of biopolymer molecules and a carrier for application of this method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-524A CZ2014524A3 (cs) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ305599B6 CZ305599B6 (cs) | 2015-12-30 |
| CZ2014524A3 true CZ2014524A3 (cs) | 2015-12-30 |
Family
ID=53969042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014-524A CZ2014524A3 (cs) | 2014-08-01 | 2014-08-01 | Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20170226153A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2014524A3 (cs) |
| WO (1) | WO2016015690A1 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111042B (zh) * | 2019-06-21 | 2024-04-05 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种生物磁性微球及其制备方法和使用方法 |
| CN114901671B (zh) * | 2020-01-20 | 2024-02-20 | 上海药明生物技术有限公司 | 用于亲和层析的新的清洗缓冲溶液 |
| CN112226481B (zh) * | 2020-10-28 | 2023-01-31 | 北京化工大学 | 一种利用葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法 |
| CN113176329B (zh) * | 2021-04-23 | 2024-07-05 | 厦门大学 | 四氧化三钴作为基质在maldi-tof ms检测小分子中的应用 |
| CN115703816B (zh) * | 2021-08-12 | 2025-12-16 | 北京科技大学 | 分离纯化带有至少两个组氨酸标签的蛋白质的方法 |
| CN118719016B (zh) * | 2024-06-25 | 2025-03-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种亲水化磁性纳米材料及其制备方法和在磷酸化蛋白/肽段富集中的应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2979414B2 (ja) * | 1989-09-29 | 1999-11-15 | 富士レビオ株式会社 | 磁性粒子およびそれを用いた免疫測定法 |
| DE4307262A1 (de) * | 1993-03-02 | 1994-09-08 | Christian Bergemann | Magnetisches polymeres Siliciumdioxid |
| DE19912799B4 (de) * | 1998-03-12 | 2004-12-30 | AGOWA Gesellschaft für molekularbiologische Technologie mbH | Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial und seine Verwendung |
| US8735176B2 (en) * | 2007-05-29 | 2014-05-27 | National Chiao Tung University | Metal oxide nano-composite magnetic material, fabrication method, and method for linkage, enrichment, and isolation of phosphorylated species |
| DE102008015365A1 (de) * | 2008-03-20 | 2009-09-24 | Merck Patent Gmbh | Magnetische Nanopartikel und Verfahren zu deren Herstellung |
| CN101891146B (zh) * | 2010-07-01 | 2012-11-21 | 淮阴工学院 | 一种磁性掺杂二氧化钛纳米管的制备方法 |
| CN101922036A (zh) * | 2010-09-11 | 2010-12-22 | 天津大学 | 一种在二氧化钛纳米管中掺杂四氧化三铁磁性颗粒的方法 |
| CN102151527B (zh) * | 2010-11-23 | 2013-05-15 | 苏州照康生物技术有限公司 | 用于核酸纯化、蛋白分离的单分散氧化硅磁性微球的制备方法 |
| CN102179216B (zh) * | 2011-01-20 | 2013-08-21 | 青岛科技大学 | 一种仿生型α-Fe2O3/TiO2纳米复合材料的制备方法 |
| CN102773111B (zh) * | 2012-07-06 | 2014-06-11 | 上海应用技术学院 | 一种磁性固体超强酸纳米管催化剂及其制备方法 |
-
2014
- 2014-08-01 CZ CZ2014-524A patent/CZ2014524A3/cs unknown
-
2015
- 2015-07-27 WO PCT/CZ2015/000081 patent/WO2016015690A1/en not_active Ceased
- 2015-07-27 US US15/501,020 patent/US20170226153A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170226153A1 (en) | 2017-08-10 |
| WO2016015690A1 (en) | 2016-02-04 |
| CZ305599B6 (cs) | 2015-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20170226153A1 (en) | Method for Separation of Biopolymer Molecules and a Carrier for Application of this Method | |
| Minten et al. | Controlled encapsulation of multiple proteins in virus capsids | |
| KR102243415B1 (ko) | 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도 | |
| Costa et al. | Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system | |
| EP2749646B1 (en) | IgG-BINDING PEPTIDE AND METHOD FOR DETECTING AND PURIFYING IgG USING SAME | |
| DK2687539T3 (en) | ANNEXIN V VARIANT AND ITS MANUFACTURING AND USING THEREOF | |
| JP5271354B2 (ja) | 水性二相系中での組換えタンパク質の分離方法 | |
| JP2020530780A (ja) | 疎水性相互作用を利用した細胞外小胞体の分離方法 | |
| Kupcik et al. | New interface for purification of proteins: one-dimensional TiO2 nanotubes decorated by Fe3O4 nanoparticles | |
| JP6498274B2 (ja) | エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 | |
| US20200392193A1 (en) | Fusion protein | |
| US10906939B2 (en) | Co-assembly peptides, nanostructures, and methods of making and using the same | |
| He et al. | Nickel (II)-immobilized sulfhydryl cotton fiber for selective binding and rapid separation of histidine-tagged proteins | |
| Saraji et al. | Plasmid DNA purification by zirconia magnetic nanocomposite | |
| Xu et al. | Boronic acid modified polyoxometalate-alginate hybrid for the isolation of glycoproteins at neutral environment | |
| Haas et al. | Purification of a hydrophobic elastin-like protein toward scale-suitable production of biomaterials | |
| Chen et al. | An effective strategy based on electrostatic interaction for the simultaneous sequential purification and isolation of exosomes | |
| CN101363045A (zh) | 一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法 | |
| Melo-Braga et al. | Comprehensive protocol to simultaneously study protein phosphorylation, acetylation, and N-linked sialylated glycosylation | |
| WO2013154731A1 (en) | Protein scaffolds for selective enrichment of metal ions | |
| KR102161280B1 (ko) | 반건식 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 | |
| JP2011036128A (ja) | 抗体製造方法 | |
| Muruaga et al. | Adaptation of the binding domain of Lactobacillus acidophilus S-layer protein as a molecular tag for affinity chromatography development | |
| Acet | Investigation of BSA adsorption performances of metal ion attached mineral particles embedded cryogel discs | |
| CA2569821A1 (en) | Process for protein isolation |