CZ2015585A3 - Transportér nukleotidových struktur - Google Patents
Transportér nukleotidových struktur Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015585A3 CZ2015585A3 CZ2015-585A CZ2015585A CZ2015585A3 CZ 2015585 A3 CZ2015585 A3 CZ 2015585A3 CZ 2015585 A CZ2015585 A CZ 2015585A CZ 2015585 A3 CZ2015585 A3 CZ 2015585A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- transporter
- mmol
- rna
- dna
- guanidine
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 abstract description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 45
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 31
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- -1 quaternary ammonium salt cations Chemical class 0.000 description 21
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 18
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 15
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 15
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 14
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 12
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-n-methylthiophene-2-sulfonamide Chemical compound CNS(=O)(=O)C1=CC=C(Br)S1 JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000013149 parallel artificial membrane permeability assay Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N sulfanylidenemercury Chemical compound [Hg]=S QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 5
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 5
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- CSOJECDGWHHWRS-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylcarbamothioyl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(=S)NC(=O)OC(C)(C)C CSOJECDGWHHWRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- DLYVTEULDNMQAR-SRNOMOOLSA-N Cholic Acid Methyl Ester Chemical group C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CCC(=O)OC)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 DLYVTEULDNMQAR-SRNOMOOLSA-N 0.000 description 3
- ZHUOOEGSSFNTNP-JMKDMENQSA-N Deoxycholic acid methyl ester Chemical group C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CCC(=O)OC)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 ZHUOOEGSSFNTNP-JMKDMENQSA-N 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 3
- 229940083094 guanine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 2
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 2
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical class C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N Lithocholsaeure Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical class C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- ZHUXMBYIONRQQX-UHFFFAOYSA-N hydroxidodioxidocarbon(.) Chemical group [O]C(O)=O ZHUXMBYIONRQQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N lithocholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 108010082406 peptide permease Proteins 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920005646 polycarboxylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- GCMMHBRAPKXXJF-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-carbamothioyl-n-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N(C(N)=S)C(=O)OC(C)(C)C GCMMHBRAPKXXJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Transportér nukleotidových struktur sestavený z guanidinem substituovaných žlučových kyselin použitelný především jako nosič či transportní systém řetězců či fragmentů RNA a DNA přes syntetické či biologické membrány.
Description
Transportér nukleotidových struktur Oblast techniky
Vynález představuje jednoduchou syntézu guanidinových substituovaných žlučových kyselin. Syntetizovány byly sloučeniny guanidinových derivátů kyseliny cholové, chenodeoxycholové, deoxycholové a lithocholové. Vytvořené guanidinové deriváty se ukázaly být vysoce efektivními transportéry jak RNA, tak DNA do buněk, jak bylo prokázáno in vitro experimenty pomocí PAMPA (paralelní analýza perbeability umělou membránou). ι<χάηί (Stav techniky RNA interference (RNAi) je nově vznikající technologie, která revolučně mění řadu strategických přístupů k biochemické analýze, vývoji nových léčiv a v terapii (Leung KM, Whittaker PA (2005) RNA interference: From gene silencing to genespecific Therapeutics. Pharmacol Ther 107:222-239: Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL (2010) RNAi and smáli interfering RNAs in human disease therapeutic applications. Trends Biotechnol 28:570-579: Pecot CV, Calin GA, Coleman RL, Lopez-Berestein G, Sood AK (2011) RNA interference in the clinic: Challenges and future directions. Nat Rev Cancer 11:59-67: Castanotto D, Rossi JJ (2009) The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nátuře 457:426-433: Davidson BL, McCray PB (2011) Current prospects for RNA interference-based therapies. Nat Rev Genet 12:329-340: Aagaard L, Rossi JJ (2007) RNAi therapeutics: Principles, prospects, and challenges. Adv Drug Deliv Rev 59:75-86). RNAi je mechanismus umožňující endogenní tlumení genů na základě selektivního rozpoznání sekvencí, který je znám z řady organismů. (Hannon GJ. RNA interference. Nátuře 2002; 418:244-51: Sharp PA. RNA interference— 2001.Genes Dev 2001; 15:485-90: Zámoře PD. RNA interference: Listening to the sound of silence. Nat Struct Biol 2001; 8:746-50.) V rámci RNAi dráhy, malé interferující RNA (siRNA) indukují posttranskripční, sekvenčně specifické tlumení aktivity genu s využitím endogenního intracelulámího mechanismu, který by selektivně potlačoval genovou expresi, a tím snížil syntézu cílového proteinu (Elbashir SM, et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nátuře 411:494-498). Výsledný efekt je ekvivalentní inhibicí proteinu bez použití nízkomolekulámích inhibitorů. Specifičnost RNAi také umožňuje syntetizovat inhibitory proti původně neléčitelným onemocněním. Všudypřítomnost RNAi drah uvnitř těla a snadnost s jakou siRNA mohou být použity k potlačení konkrétních genů učinily z siRNA slibnou třídu molekul pro léčbu rakoviny, virových infekcí, očních a genetických chorob. I když se tyto molekuly jeví jako silný nástroj pro ovlivnění toho, zda se příslušný tělu škodlivý gen bude projevovat či nikoli, mají značná omezení pro reálnou aplikaci. Neexistují uspokojivé mechanismy dopravy siRNA do buněk, mají vedlejší účinky v důsledku tlumení genů, narušují fyziologické funkce buněčného systému zapojeného do umlčení genu a indukují vrozenou imunitní odpověd. (E.Miele, G. P. Spinelli, E. D. Fabrizio, E. Ferretti, S. Tomao, and A. Gulino, (2012) “Nanoparticle-based delivery of smáli interfering RNA: challenges for cancer therapy,” International Journal of Nanomedicine, vol. 7, pp. 3637-3657). Pro aktivní distribuci léku, jeho vložení do nosiče a cílení léku v nosiči je třeba vyvinout spolehlivé transportní systémy. V poslední době se zvyšuje potřeba nových menších transportních systémů, které splňují požadovaný specifický design (R. K. Upadhyay(2014) “Drug Delivery Systems, CNS Protection, and the Blood Brain Barrier“,Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, vol.,. Art. ID 869269, pp.37).
Schopnost léčiva nebo sondy překročit biologické bariéry byla historicky považována za funkci jeho fyzikálních vlastností. Tento pohled z velké části omezuje návrh struktur a typů léčiv na výběr aktivních látek v úzkém rozmezí. Molekulární transportní systémy nabízejí strategii, jak tato omezení obejít. V případě guanidiniových transportérů (GRTs), typicky ve vodě vysoce rozpustných konjugátů, bylo zjištěno, že snadno prochází nepolární membránou buňky a některé i tkáňovými bariérami. Látky, které vykazují špatnou biologickou dostupnost jsou metabolizovány atp. Právě proto jsou právě hledány vhodné transportní systémy, které by tyto účinné látky donesly skrz buněčné membrány. Pro mnoho aplikací, se připravuje pro-léčivo, kdy konjugátem je transportér-léčivo s linkerem, který je chemicky nebo biochemicky odštěpen po průchodu přes překážku, což umožňuje uvolňování volného léčiva v cílových buňkách nebo tkáních. Guanidiniové skupiny jsou vhodné pro vazbu na buněčné povrchy s centry záporně nabitých funkčních skupin. Vytvořené komplexy by umožnily uvolnění léčiva po vstupu do vnitřního buněčného prostoru. Guanidiniové transportéry disponují více mechanismy prostupu do buněk, např. endocytózou. Také byly provedeny experimenty studující uvolňování léčiva endosomální inhibicí (Wender, P. A.; Galliher, W. C.; Goun, E. A.; Jones, L. R.; Pillow, T. H. (2008)The design of guanidinium-rich transportére and their intemalization mechanisms. Adv. Drug Delivery Rev., 60,452-472). Pro tkáňové selektivní vazby je schopnost GRTs vstoupit do tkáně kritickým parametrem. Podobné studie ukázaly, že pro zlepšení vstupu GRTs do tkáně tenkého nebo tlustého střeva myší, byly injekčně podány roztoky biotinylovaného oligoargininu ( L.R. Wright, J.B. Rothbard, P.A. Wender, (2003) Guanidinium rich peptide transportére and drug delivery, Curr. Protein Pept. Sci. 4 105-124). GRTs ukázaly, že pronikají do mnoha typů tkání, otázkou však je, s jakou selektivitou. Jedna strategie pro dosažení selektivity je použití lokální distribuce. To má potenciálně široké uplatnění podávání léku do plicíchř, do očí nebo do kůže.yGRTs vykazují vychytávání v plicních tkáních při vdechnutí a při průniku do epidermálních a dermálních vrstev při topické aplikaci. Kromě místního podání, může být použit i cílený transportní systém. Tento přístup byl demonstrován na strategii s pro-léčivem, ve kterém je přechodně transportéru vypnuta intramolekulární interakce s polykarboxylátem připojeným k transportéru prostřednictvím peptidu. Peptid je vybrán jako substrát pro extracelulámí proteázy, který je lokalizován v cílové tkáni.
Tyto guanidinem bohaté molekulární transportní systémy mohou zlepšit prostupnost různých látek přes biologické bariéry, kterými jsou například buněčné membrány. ( Wender PA, Cooley CB, Geihe EG (2012) Beyond cell penetrating peptides: Designed molecular transportére. Drug Discov Today Technol 9:e49-e55: Wender PA, Galliher WC, Goun EA, Jones LR, Pillow TH (2008) The design of guanidinium- rich transportére and their intemalization mechanisms. Adv Drug Delivery Rev 60:452-472).
Byly hledány účinné transportéry pro RNA a DNA. Nejdříve byly testovány guanidiniové transportéry, u kterých se funkčnost transportu do buněk očekávala. Z polyaniontu DNA a RNA byla tvorbou komplexu s molekulami guanidinu vytvořena elektroneutrální molekula, která však přes buněčnou membránu neprocházela. Transport RNA fragmentu do buněk je velmi neefektivní díky náboji a hydrofilicitě. Samotná nábojová neutralizace např. kationty typu kvartémí amoniové soli nestačí tento trend zvrátit. Proto bylo nutné hledat jiné systémy, které by byly schopné sloužit jako nosiče DNA a RNA molekul přes buněčné membrány.
Podstata vynálezu
Našli jsme struktury, které jsou schopné s nukleotidovými řetězci, tedy ribonukleovými a deoxyribonukleovými kyselinami tvořit stabilní komplex, který po průchodu přes membránu do vnitřního prostoru buněk molekuly RNA či DNA nebo jejich fragmenty opět uvolní. Tyto struktury sestávají z guanidinových derivátů žlučových kyselin. Tento komplex má lipofilní povahu, snadno prochází přes lipidovou dvoj vrstvu buněčných membrán a jeho guanidinový zbytek se váže na fosfodiesterovou vazbu DNA a RNA, proto nezáleží na tom jaké je řetezec délky, ani které dusíkaté báze obsahuje.
Zjistili jsme, že sloučenina, která efektivně vytváří komplex fosfodiester - gaunidin v kombinaci s lipofilním substituentem, nejlépe steroidem, představuje díky této unikátní kombinaci velmi efektivní a laditelný systém transportu RNA a DNA do buněk.
Tyto transportéry velice účinně přenášejí RNA a DNA přes buněčné membrány. Nově jsme syntetizovali guanidinem substituovanou kyselinu cholovou, chenodeoxycholovou, deoxycholovou a lithocholovou a připravili tak velmi efektivní transportér pro RNA a DNA molekuly. Jejich vlastnosti jsme testovali na syntetických buněčných membránách. Byly stanoveny koncentrace RNA a DNA, které jsou transportéry schopné přes membránu dopravit. Také byly stanoveny konstanty stability kvantifikující sílu vazby molekuly v komplexu a jejich vyvázání po průchodu membránou.
Mechanismus transportu probíhá tak, že transportér je k molekule DNA či RNA vázán přes guanidinový zbytek na fosfodiesterovou vazbu a steroidní část struktury transportéru dále interaguje šroubovici DNA či RNA. Takto molekuly transportéru v podstatě obalí molekulu RNA čí DNA a díky lipofilitě a biologickému charakteru steroidních struktur tento komplex snadno prochází membránou, tudíž ani nezávisí na její velikost. Je tedy možný transport jak fragmentů RNA či DNA, tak celých molekul.
Také bylo zjištěno, že velmi záleží na molámím poměru mezi transportérem a transportovanou RNA či DNA. Rostoucí desetinásobný a vyšší přebytek transportéru nemá pozitivní vliv na účinnost trasportu do buněk, naopak má negativní dopad na transportovatelnost vzniklého komplexu.
Naše nově navržené sloučeniny mají obecný vzorec:
R-,= H, CH3, NH(CH2)2NH2,NH(CH2)2N=C(NH2)2 R2= H, OH, NH2, N=C(NH2)2
Struktura obsahuje skupinu Rl, která je připojena ke kyslíku karboxylu. Skupina R2 je napojena v poloze C-3, C-7 a C-12. Struktura je tvořena sedmnácti uhlíkovými atomy spojenými čtyřmi kruhy. Tři kruhy se skládají z šesti atomů uhlíku a jeden je z pěti uhlíkatého kruhu.
Kde skupina Ri je H, CH3, NH(CH2)2NH2 a NH(CH2)2N=C(NH2)2 a skupina R2 je H, OH, NH2 a N=C(NH2)2. Studovali jsme dopravu RNA a DNA pomocí PAMPA testu s guanidinem substituovanými žlučovými kyselinami, RNA a DNA od krmných kvasnic a fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS). Dosáhli jsme velmi dobrých výsledků pro naše sloučeniny, které působí jako dobré transportéry.
Obr. 1: Výsledky PAMPA testu pro transport RNA dle příkladu 7
Obr. 2: Graf zobrazující efektivnost transportu RNA jednotlivých transportérů; SG-1, 2, 4, 5 a 6, číselné označení je označení příkladu, dle kterého byly připraveny
Obr. 3: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA jednotlivých transportérů při koncentraci 1 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.
Obr. 4: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA jednotlivých transportérů při koncentraci 10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.
Obr. 5: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA transportéru dle příkladu 6 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.
Obr. 6: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA transportéru dle příkladu 4 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.
Obr. 7: Výsledky PAMPA testu pro transport DNA dle příkladu 8.
Obr. 8: Graf zobrazující efektivnost transportu DNA jednotlivých transportérů; SG-1,2, 4, 5 a 6, číselné označení je označení příkladu, dle kterého byly připraveny.
Obr. 9: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA jednotlivých transportérů při koncentraci 1 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.
Obr. 10: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA jednotlivých transportérů při koncentraci 10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.
Obr. 11: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA transportéru dle příkladu 6 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.
Obr. 12: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA transportéru dle příkladu 4 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.
Obr. 13: Graf závislosti absorbance na vlnové délce při rozdílných koncentracích RNA a transportéru pro stanovení konstanty stability transportéru dle příkladu 6.
Obr. 14: Graf závislosti absorbance na vlnové délce při rozdílných koncentracích RNA a transportéru pro stanovení konstanty stability transportéru dle příkladu 4. Příklad 1 prekurzor
0,3 g (0,77 mmol) 3-amino methyl lithocholátu bylo zpracováno ve 30 ml dichlormethanu (dále DCM) při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,23 g (0,85 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di (terc-butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,21 g (0,77 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,33 ml (2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 2 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml ethylacetátu (dále EtOAc) a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM.MeOH v poměru 95:5.
Byl získán methyl lithocholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bíle látky o výtěžku 83 % a strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDC13, 500 MHz): 0.65(s, 3H, CH3-18), 0,91 (d, J=10f5 Hz, 3H, CH3-21), 0,99 (s, 3H, CH3-19), l,50(s, 18H, Boc), 3,66 (s, 3H),4.54 (s, 1H, CH-3); 8.9(s, 1H, BocNH), 1 l,48(s, 1H, BocNH). 13C NMR Q26 MHz; CDC13) : 12.04, 18.27, 21.06, 24.16, 24.96, 26.22, 26,76, 28,08, 28.09, 28,32, 30.67, 31,04, 31.24, 35,05, 35^35, 35.68, 37,86, 39,90, 40.10, 42,.75, 51,43, 55.93, 56.43, 153.28, 157.07, 174.73. LCMS, (m/z):633 [M+1J+ derivát 0,3 g (0,47 mmol) Boc-chráněný guanidinu substituovaný na C-3 methyl lithocholátu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak směs byla neutralizována přebytkem roztoku amoniaku a extrahována chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl lithocholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bíle látky o výtěžku 67 % a strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDCI3, 500 MHz): 0,i69(s, 3H, CH3-18), 0f92 (d, >5,0 Hz, 3H, CH3-21), lr02 (s, 3H, CH3-19), 3,65 (s, 3H),3,83 (s, 1H, CH-3). ,3C NMR (126 MHz; MeOD) : 12?44, 18,71, 22,12, 24,32, 25,20, 25.75, 27f26, 27,72, 29,19, 31,56, 31,85, 32.20, 36,06, 36,68, 37,01, 38,56, 41.14, 41,41, 43,90, 48.Ϊ99, 49,62, 52,00, 57?41, 57.79, 157,77, 176,43. HRMS calcd. for C26H45N3O2: 431,3512. Found: 432,3586 (M+H) Příklad 2 prekurzor 0,3 g (0,74 mmol) 3-amino methyl deoxycholátu bylo zpracováno ve 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,22 g (0,81 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di -(teřq-butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,2 g (0,74 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,32 ml (2,3 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 95:5. Byl získán methyl deoxycholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 80 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDCI3, 500 MHz): 0*68(s, 3H, CH3-18), 0.97 (m, 6H, CH3-19, CH3-21), 1.50(s, 18H, Boc), 3f66 (s, 3H), 3,98(s,lH, CÍ-12), 4.49 (br s, lH,řCH-3); 8,9(s, 1H, BocNH), llJl8(s, 1H, BocNH),13C NMR (126 MHz; CDCI3): 12,74, 17,34, 23,59, Í3,86, 24.88, 25,91, 26,67, 27.40, 28,08, 28,29, 28,97, 30,62, 30.91, 31,06', 33,12, 34.60', 35,8^, 37,.85, 46,51, 47,36, 48.24, 51.47, 73,13, 152,63, 156.96, 174,67.LCMS, (m/z):649 [Μ+Π+ , - derivát 0,3 g (0,46 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 methyl deoxycholátu se nechal reagovat s 15 ml 50j% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak směs byla neutralizována roztokem amoniaku a extrahována chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl deoxycholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 70 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (MeOD, 500 MHz): 0,74(s, 3H, CH3-18), 1,01 (s, 3H, CH3-19), 1.02 (d, J-5.0 Hz, 3H, CH3-21), 3.67 (s, 3H), 3,84(s,lH, C-12), 3.99 (br s, 1H, CH-3).13C NMR (126 MHz; MeOD) :11,73, 16,12, 22,62, 23,.39, 24.19, 25.67, 26.31, 27.22, 28,59, 30,09, 30.16, 30.46, 30,79, 32,72, 34.25, 35,31, 35,76, 37.21, 46.20, 46,51, 46,68, 47.50, 50.58, 72,58, 156,36, 175,07.HRMS calcd. for C26H45N3O3: 447.3461. Found: 448,3528 (M+H) Příklad 3 prekurzor 0,3 g (0,71 mmol) 3-amino methyl cholátu bylo zpracováno ve 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloride rtuťnatého, což odpovídalo 0,21 g (0,78 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di (ťeťl>butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,197 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,3 ml (2,2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 5 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán methyl cholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 76 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDCI3, 500 MHz): 0,70(s, 3H, CH3-18), 0j99 (m, 6H, CH3-19, CH3-21), 1,49 (d, J=4Hz, 18H, Boc), 3,66 (s, 3H), 3^6 (s, 1H, C-12), 3,98(br s,lH, C-7) 4,41 (br s, 1H, CH-3); 8;89(s, 1H, BocNH), 11.48(s, 1H, BocNH),13C NMR (126 MHz; CDC13) : 13,09, 17,83, 23.62, 23,70, 25,23, 26.62, 27.84, 28.50, 28,71, 29,09, 31,27, 31,43, 33,97, 34,62, 35,49, 37,66, 39.87, 42,31, 46.80, 47.42, 51.68, 68.33, 72.91, 152.65, 157.74, 173.87.LCMS, (m/z): 665[M+1]+ derivát 0,3 g (0,45 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 methyl cholátu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl cholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 65 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance:1H NMR (MeOD, 500 MHz): 0,69(s, 3H, CH3-18), 0,96 (s, 3H, CH3-19), 0.97-0,98 (d, J=5$ Hz, 3H, CH3-21), 3,66 (s, 3H),3.86 (s, 1H, C-12), 3.98Í(bs,lH, C-7) 4,41 (br s, 1H, CH-3).13C NMR (126 MHz; MeOD) :11,73, 16,12, 22,62, 23,39, 24,19, 25,67, 26,31, 27,22, 28,59, 30^09, 3(),16, 30,46, 30,79, 32,72, 34,25, 35,31, 35,76, 37,21,46Í20, 46,51,47.50, 50,58,68,32, 72,58,156,36, 175,07. Příklad 4 prekurzor 0,3 g (0,72 mmol) 26-amino lithocholyl ethyl amidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,21 g (0,79 mmol), 1,0 ekvivalentuN,N-di (terqtbutoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,198 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,31 ml (2,2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 4 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán ethylamid lithocholát substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 82 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (500 MHz; CDCI3) ): 0 62(s, 3H, CH3-18), 0,91 (br s, 6H, CH3-19, CH3-21), l,.50(s, 18H,Boc) 3,42 (m, 2H, NH2CH2), 3.61 (m, 3H, <NHCH2, CH-3), 7.29(s, 1H, CH2-NH), 8,76(s, 1H, Boc-NH), ll,43(s, 1H, Boc-NH). 13C NMR (126 MHz; CDCI3): 12,04, 18.40, 20.83' 23,38, 24,22, 26.43, 27,21, 28 03, 28;25, 30,56, 31,71, 33.56, 34.59, 35.36, 35,56, 35,87, 36,49, 40.19, 40,44, 40,88, 42,12, 42.74, 56,14, 56J6, 71.86, 84.21, 152.88, 157,06 174,03. calcd. for C37H64N406Na+: 683.47181. Found: 683.4717 (M+Na) derivát 0,3 g (0,45 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 lithocholyl ethylamidu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanuza intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán lithocholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 65 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 5H (500 MHz; CDCI3)); 0,7l(s, 3H, CH3-18), 0 96 (br s, 3H, CH3-19), l,02(d,^5t0, 3H,CH3-21), 3 l(t, 2H,NH2CH2), 3,2 (t, 2H, NHCH2), 4 45 (m, CH-3).UC NMŘ (126 MHz; MeOD) :11,06, 17,44, 20.53, 22.51, 23,85, 26.24, 26.94, 27.88, 28.65, 29,77, 31,87, 32 66, 34,26, 35,06, 35.46, 35.83, 35f95, 38f55, 40Π2, 40;48, 42ll 2,42,51, 56,01, 5653, 70,99, 175.30, 175779.LCMS, (m/z): 4ř62[M+H]+ ' Příklad 5 0,3 g (0,69 mmol) 26-amino deoxycholyl ethylamidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,206 g (0,76 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N’-di (tercybutoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,191 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,32 ml (2,1 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 6 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán deoxycholyl ethylamid substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 78 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: *H NMR (500 MHz; CDCI3) ): 0,66(s, 3H, CH3-18), 0,90 (s, 3H, CH3-19), 0,98(d, .7=6.0 3H, CH3-21), lf50(s, 18H,Boc) 3?42 (řn, 2H, NH2CH2), 3.63(m, 3H, NHCH2, CH-12), 3.95-3,97(m, 1H, C-3 ), 7.41(s, 1H, CH2-NH), 8?84(s, 1H, Boc-NH), 11 42(s, 1H, Boc-NH).13C NMR (126 MHz; CDCI3): 12,73, 17,45, 23,12,23,65,26,12,27.12,27?48,28,00,28,21, 28, 55, 30,46, 31,571,33,45,33,62,34.12, 35,26, 36 02, 36,42, 40.71,' 42.08, 46.52, 47,33, 48,21, 71,79, 73,15, 84,16, 152.75, 156.96, 174,12.calcd. for QtHmN^O?: 677.48478. Found: 677,4860(M+H)' / * ' derivát 0,3 g (0,45 mmol) deoxycholyl ethylamidu substituovaného na C-26 Boc-chráněném guanidinem se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán deoxycholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 63 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 5H (500 MHz; CDCI3)): 0,7 l(s, 3H, CH3-18), 0,96 (s, 3H, CH3-19), 0,98 (d, J=5.Q 3H, CH3-21), 3.02(m, 4H, NH2CH2), 3.56(m, 1H, C-12); 4.97(m, 1H, C-3 ).I3C I^MR (126 MHz; MeOD) :llf06, 17,43, 20,52, 22,22, 23,83, 25,72, 26,06, 27,88, 29,77, 31,35, 31,72, 32>53, 34,26, 35,05, 35,83, 37'99, 29,91, 40,48, 41,80, 42,-11,42,49,56,301, 56,53,70.98,79.34,157.51,176,41. LCMS, (m/z): 478[M+H]+ ' Příklad 6 0,3 g (0,66 mmol) 26-amino cholyl ethyl amidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloride rtuťnatého, což odpovídalo 0,198 g (0,73 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di (terčybutoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,184 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,3 ml (2,0 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 8 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na2S04 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán cholyl ethylamid substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 77 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (500 MHz; CDCI3) ): 0,65(s, 3H, CH3-18), 0 87 (s, 3H, CH3-19), 0,98(d, 5,0 3H, CH3-21), l,50(s, 18H,Boc) 3,38 (m, 3H, NH2CH2, CH-12), 3,53 (m, 2H, N^CH2,), 3,82(br s, 1H, C-7),' 3,95 (m, 1H, C-3 ), 7/8(5, 1H, CH2-NH), 8,59(š, 1H, Boc-NH), ll,42(s, 1H, Boc-NH).l3C NMR (126 MHz; CDCI3): 12,88, 17,78, 22.05, 23,65, 26,12, 27,12, 27,48, 28?00, 28,21, 28, 85, 30,46, 29,14, 29;81, 33,22, 34,72, 35,77, 40.19.02, 41,16, 41(.63, 46,38, 46,52, 47,33, 48,21, 68,41, 71,79, 73,03, 79.45, 83.46, 152.98, 15#7.24, 174,43.calcd. for C26H45N3O3: 447/461. Found: 448.3528 (M+H) derivát 0,3 g (0,45 mmol) cholyl ethylamidu substituovaného na C-26 Boc-chráněném guanidinem se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyla nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2S04 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán cholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 60 % o strukturním vzorci,
který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: δΗ (500 MHz; CDCI3)): 0,64(s, 3H, CH3-18), 0.85 (s, 3H, CH3-19), 0,91(d, ./=6.5 3H, CH3-21), 3.33 (m, 3H, NH2CH2, CH-12), 3 53 (m, 2H, NHCH2,), 3f82(br s, 1H, C-7),' 4 97(m, 1H, C-3 ).13C NMR (126 MHz; MeOD) :I2 58, 18,07, 23,09, 24f22, 26,35, 26,89, 27,59; 28,22, 31,35, 31,00, 32,54, 32,86, 33,67, 34,94, 35,59, 35, 80, 39,39, 42.08, 42 84, 43.32, 46.39, 50,87, 72,14, 80f12, 82,82, 158,93, 177,47. LČMS, (m/z): 494[M+H]+ ' ' 1 Příklad 7
Test účinnosti transportéru lithocholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 4 pro RNA V této studii byla použita PAMPA metoda (= parallel artificial membrane permeability assay). Tato in vitro metoda určuje propustnost látek prostřednictvím fosfolipidové vrstvy. Skládá se z několika jamek, které tvoří donorové a akceptorové mikrotitrační desky. Celá sestava se běžně označuje jako sendvič. Na začátku testu je látka přidána do donorové části. Do níž se vloží akceptorová destička s fosfolipidovou membránou na dně. Během inkubace dochází k transportu RNA pomocí transportérů RNA do akceptorové části. Po ukončení inkubace je proměřena koncentrace RNA v akceptorové i donorové destičce. Čímž se kvantifikuje množství transportované RNA.
Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (1PVH, 125 pm tlustý filtr 0,45 pm pórů). Zásobní roztoky nosiče vzorků byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve 0.1* byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10^50 pM a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (objem / objem) a poté byl roztok pipetován do jamek. Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného nosiče o třech koncentracích (Ccarrier = 0,1/1/10 mmol/1) + RNA (RNA, C = 0,05 mmol/1). Přičemž koncentrace RNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufru.Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části,. Takto propojené destičky fodofolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5 h bez míchání. Po uplynutí doby se sendvičové desky oddělily. Množství koncentrací RNA v jamkách donorových a akceptorových destiček byly měřeny na základě porovnání ctz* experimentálního spektra s UV spektrem (220*400 nm) získaným z referenčních standardů. Příklad 8
Test účinnosti transportéru cholyl ethylamidu substituovaný na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 6 pro DNA
Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (IPVH, 125 pm tlustý filtr 0,45 pm pórů). Zásobní roztoky nosiče vzorků byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve ΛΖ" byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10*50 pM a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (objem / objem) a poté byl roztok pipetován do jamek.
Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného nosiče o třech koncentracích (Ccarrier = 0,1/1/10 mmol/1) + DNA (DNA, C = 0,05 mmol/1). Přičemž koncentrace DNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufru.Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky
fodofolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5,5 O hodiny bez míchání. Po té se sendvičové desky oddělily. Množství DNA v jamkách donorových ^ azv a akceptorových destiček bylo měřeno pomocí UV (220*400 nm) spektrofotometrie, koncentrace byla odečítána z naměřené absorbance. Příklad 9
Test účinnosti transportéru lithocholyl ethylamidu substituovaného na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 4 pro siRNA
Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (IPVH, 125 pm tlustý filtr 0,45 pm pórů). Zásobní roztoky vzorků nosiče byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve
o.V byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10*-50 μΜ a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (objem / objem) a poté byl roztok pipetován do jamek. Donorová destička byla naplněna 300 μΐ zředěného transportéru o třech koncentracích (Ctransportér - 0,1/1/10 mmol/1) + siRNA (siRNA, C = 0,05 mmol/1). Byla použita siRNA o 21 nukleotidech, přičemž koncentrace siRNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 μΐ roztoku pufru. Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky fodofolipidovou membránou byly inkubovány Λ při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5,5 hodiny bez míchání. Pofté se sendvičové desky oddělily. Množství siRNA v jamkách donorových a akceptorových destiček bylo měřeno pomocí az* UV (220*400 nm) spektrofotometrie, koncentrace byla odečítána z naměřené absorbance. Průmyslová využitelnost
Ve farmaceutickém průmyslu jako nosiče RNA a DNA a jejich fragmentů.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Transportér nukleotidových struktur obecného vzorce&težent)kde R, je ze skupiny H, CH3, NH(CH2)2 ,NH(CH2)2N=C(NH2)2 a R2 je ze skupiny H, OH, NH2, N-C(NH2)2.
- 2. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 3. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 4. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 5. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 6. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 7. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
- 8. Použití transportéru nukleotidů podle nároku 1 jako nosičů řetezců či fragmentů RNA a DNA přes syntetické či biologické membrány.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-585A CZ2015585A3 (cs) | 2015-08-30 | 2015-08-30 | Transportér nukleotidových struktur |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-585A CZ2015585A3 (cs) | 2015-08-30 | 2015-08-30 | Transportér nukleotidových struktur |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ306254B6 CZ306254B6 (cs) | 2016-11-02 |
| CZ2015585A3 true CZ2015585A3 (cs) | 2016-11-02 |
Family
ID=57205898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-585A CZ2015585A3 (cs) | 2015-08-30 | 2015-08-30 | Transportér nukleotidových struktur |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2015585A3 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114716499A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-07-08 | 浙江工商大学 | 新型生物甾醇胍基化修饰的胆酸螯合剂及制备方法和应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308447B6 (cs) * | 2018-07-04 | 2020-08-26 | Vysoká škola chemicko-technologická v Praze | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100699279B1 (ko) * | 2005-04-28 | 2007-03-23 | 학교법인 포항공과대학교 | 당 또는 당 유사체를 골격으로 하는 분자 수송체 및 그의제조방법 |
-
2015
- 2015-08-30 CZ CZ2015-585A patent/CZ2015585A3/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114716499A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-07-08 | 浙江工商大学 | 新型生物甾醇胍基化修饰的胆酸螯合剂及制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ306254B6 (cs) | 2016-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2756569C1 (ru) | Соединения и способы трансмембранной доставки молекул | |
| EP2844662B1 (en) | Tetragalnac and peptide containing conjugates and methods for delivery of oligonucleotides | |
| Singh et al. | Recent developments in oligonucleotide conjugation | |
| AU2004305111B2 (en) | Cell transfecting formulations of small interfering RNA, related compositions and methods of making and use | |
| EP2555777B1 (en) | Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides | |
| JP5352462B2 (ja) | 二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、ｒｎａ干渉による遺伝子サイレンシング方法、および医薬品組成物 | |
| JP5885833B2 (ja) | アミノ脂質、それらの合成及び使用 | |
| JP5635512B2 (ja) | 遺伝子調節化合物の改良された送達のための化学的に修飾された細胞透過性ペプチド | |
| EP3992291A1 (en) | Novel compound and application thereof | |
| JP2021523720A (ja) | オフターゲット効果が低下した修飾ｒｎａ剤 | |
| Taskova et al. | Synthetic nucleic acid analogues in gene therapy: an update for peptide–oligonucleotide conjugates | |
| CN114885604B (zh) | 用于靶向递送核酸的肽对接载体 | |
| Honcharenko et al. | New alkyne and amine linkers for versatile multiple conjugation of oligonucleotides | |
| Gandioso et al. | Efficient siRNA–peptide conjugation for specific targeted delivery into tumor cells | |
| Patil et al. | An efficient approach for the design and synthesis of antimicrobial peptide-peptide nucleic acid conjugates | |
| Wang et al. | Advanced aqueous-phase phosphoramidation reactions for effectively synthesizing peptide–oligonucleotide conjugates trafficked into a human cell line | |
| WO2011115555A1 (en) | System for improved delivery of gene modulating compounds | |
| Benigno et al. | Aptamer-Drug conjugates for a targeted and synergistic anticancer Response: Exploiting T30923-5-fluoro-2′-deoxyuridine (INT-FdU) derivatives | |
| CZ2015585A3 (cs) | Transportér nukleotidových struktur | |
| CA3125289A1 (en) | Targeted delivery of therapeutic molecules | |
| Das et al. | Synthesis of Self Permeable Antisense PMO Using C5-Guanidino-Functionalized Pyrimidines at the 5′-End Enables Sox2 Downregulation in Triple Negative Breast Cancer Cells | |
| Ganbold et al. | Efficient in vivo siRNA delivery by stabilized d-peptide-based lipid nanoparticles | |
| CN114716518A (zh) | 一种能够抑制pcsk9表达的分子构造及药物组合物 | |
| CZ308447B6 (cs) | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii | |
| KR101694220B1 (ko) | 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190830 |