CZ201643A3 - Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy - Google Patents

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy Download PDF

Info

Publication number
CZ201643A3
CZ201643A3 CZ2016-43A CZ201643A CZ201643A3 CZ 201643 A3 CZ201643 A3 CZ 201643A3 CZ 201643 A CZ201643 A CZ 201643A CZ 201643 A3 CZ201643 A3 CZ 201643A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tyrosinase
plasmid
gene encoding
prepared
carried out
Prior art date
Application number
CZ2016-43A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308223B6 (cs
Inventor
Eva Marková
Michael KotĂ­k
Ludmila Martínková
Original Assignee
Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I. filed Critical Mikrobiologický Ústav Av Čr V.V.I.
Priority to CZ2016-43A priority Critical patent/CZ308223B6/cs
Publication of CZ201643A3 publication Critical patent/CZ201643A3/cs
Publication of CZ308223B6 publication Critical patent/CZ308223B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy, při kterém se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterie Escherichia coli BL21 (DE3). Star, se provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7. Plasmid pET28ParcP se připraví ligací genu kódujícího protein dbj|BAD51402| pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidy pET 28a (+), a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL. Kontransformace se po kultivaci bakterie projeví expresí genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální His.sub.6.n.-tag sekvencí v heterologním systému a protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu in vitro.

Description

Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti genového inženýrství, konkrétně způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy využitelné v různých oblastech biotechnologií.
Dosavadní stav techniky
Tyrosinasy, enzymy patřící do klasifikační skupiny EC 1.14.18.1, jsou nehemové oxidasy přítomné v širokém spektru různých organismů. V aktivním centru obsahují dva atomy mědi a katalyzují monooxygenaci fenolů a oxidaci katecholů. Meziprodukty těchto reakcí jsou intermediáty syntézy melaninu a podobných pigmentů důležitých pro obranu a rezistenci buněk. Možná biotechnologická využití tyrosinas zahrnují např. přípravu L-3,4-dihydroxy-L fenylalaninu (L-DOPA) ztyrosinu, zlepšování konzistence potravin, imobilizaci enzymů, bioremediaci neboli degradaci fenolických polutantů a použití tyrosinas jako eukaryotních modelů pro studium jejich inhibice.
Nejběžnějším zdrojem tyrosinasy pro potenciální biotechnologická využití je v současné době izolace enzymu z žampionu dvouvýtrusého (Agar/cus bisporus). Tato tyrosinasa se připravuje extrakcí z plodnic této houby, jak popisují ve své práci např. Zynek a sp. (J. Mol. Catal. B Enzym 2010, 66, 172). Nevýhodou je proměnlivé složení takto připraveného preparátu, který může obsahovat několik izoenzymů i další enzymové aktivity a kontaminující nízkomolekutární látky. Jiné houby jsou k izolaci tyrosinas použity zřídka, a to zejména plodnice houby Pholiota microspora a mycelia hub Neurospora crassa a Pycnoporus sanguineus (pro přehled viz: Martínková a sp., Chemosphere 2016, http://dx.doi.Org/10.1016/j.chemosphere.2016.01.022).
Geny kódující tyrosinasy se vyskytují také u mnoha dalších vláknitých hub, jak lze soudit z analýzy sekvencí uložených v databázích genů, avšak jen málo z příslušných proteinů bylo připraveno expresí genů v rekombinantních organismech a následně charakterizováno. Jedná se o tři enzymy z bazidiomycet: A. bisporus, P. microspora a P. sanguineus - a dva enzymy z askomycet: Aspergillus oryzae a Trichoderma reesei. Některé z těchto enzymů byly exprimovány v eukaryotních hostitelích (Aspergillus niger, Pichia pastoris, T. reseí). Tyrosinasa se tvoří v těchto hostitelích v aktivované formě, tedy ve formě, kdy je C-terminální doména proteolyticky odštěpena, což může být nevýhodou, protože aktivovaná tyrosinasa může působit v buňce hostitele toxicky v důsledku modifikace tyrosinových zbytků proteinů • ·
hostitele. Alternativním způsobem přípravy tyrosinasy je její produkce v neaktivní formě jako protyrosinasa obsahující C-terminální doménu, která zřejmě chrání aktivní centrum, a následná aktivace protyrosinasy na tyrosinasu in vitro. Tento způsob byl použit pro přípravu dvou tyrosinas (z P. microspora a A. oryzae), které byly získány expresí příslušných genů v Escherichia coli a poté aktivovány in vitro částečným proteolytickým štěpením. Ani v jednom případě nebyl nicméně stanoven výtěžek enzymu (pro přehled: Martínková a sp., viz výše). Gen kódující protein dbj|BAD51402| byl sekvenován a následně byla studována jeho transkripce v nativním organismu - Polyporus arcularius (Kanda a sp., 2007), ale proteinový produkt transkripce genu nebyl zatím připraven v heterologním hostiteli a následně charakterizován (Kanda a sp., J Appl Microbiol 2007, 98, 332).
Množství sledovaného enzymu v roztoku lze určit kvantitativně prostřednictvím jeho katalytické aktivity. Aktivita enzymu se měří při jeho optimální hodnotě pH a při saturační koncentraci substrátu. Standardní jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 pmol substrátu za minutu při 25 °C a pH optimu. Označuje se U (z anglického unit). Koncentrace enzymu se pak vyjadřuje v jednotkách vztažených na jednotku objemu - UmL'1. Mírou čistoty enzymového preparátu je tzv. specifická aktivita enzymu vyjádřená v jednotkách aktivity vztažených na množství bílkovin v roztoku - Umg‘1.
Úkolem vynálezu je vytvoření způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy, který by odstraňoval výše uvedené nedostatky a který by poskytoval velké množství rekombinantní tyrosinasy transformované v heterologním hostiteli o velké enzymové specifické aktivitě.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu. Při způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterie Escherichia co//BL21 (DE3) Star.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že se způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7. Plasmid pET28ParcP se připraví ligací genu kódujícího protein dbj|BAD51402| pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidu pET 28a (+) a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL. Chaperon groES-groEL má vliv na skládání proteinů do správného prostorového uspořádání. Kotransformace se po kultivaci bakterie projeví vysokou hladinou exprese genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální • ·
His6-tag sekvencí v heterologním systému. Protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu in vitro.
Ve výhodném provedení se kultivace transformovaných buněk provádí při 37 °C, po přidání induktoru se provádí při 20 °C. Jako induktor se s výhodou využívá isopropyl-β-Ο-Ι thiogalaktopyranosid (IPTG) a L-arabinosa.
Ve výhodném provedení se kultivace při 37 °C provádí po dobu 3 hodin v tekutém živném LB médiu, které se připraví z 1 % hm. peptonu, z 0,5 % hm. kvasničného extraktu a z 0,5 % hm. NaCI, s přidaným 1 % hm. glukosy a 0,2 mM CuSO4 a kultivace při 20 °C se s výhodou provádí podobu 24 hodin s přidaným 0,02 mM IPTG a 11,3 mM arabinosy. Tyto speciální kultivační podmínky vedou k vysoké hladině exprese fúzního proteinu, a to protyrosinasy s N-terminální His6-tag sekvencí.
Izolace a purifikace protyrosinasy se s výhodou provádí lyží buněk působením enzymu lysozymu v kombinaci se sonikací za vzniku extraktu, a následnou afinitní chromatografií na koloně s náplní Ni Sepharose.
Ve výhodném provedení se aktivace tyrosinasy provádí inkubací s trypsinem nebo hovězím pankreatickým α-chymotrypsinem. Trypsin nebo hovězí pankreatický α-chymotrypsin se s výhodou používá v 100 mM Tris/HCI pufru s upraveným pH na 7,5 a 10 mM CaCI2 při 30 °C. Aplikace těchto látek způsobuje štěpení C-koncové domény a sekvence His6-tag z protyrosinasy a vzniku tyrosinasy.
Purifikace tyrosinasy se s výhodou provádí gelovou filtrací na koloně Superdex 200.
Předmětem vynálezu je i rekombinantní tyrosinasa, která vykazuje specifickou aktivitu vztaženou na objem kultury o minimální hodnotě 3 000 UL'1 pro substrát L-DOPA s molekulovou hmotností 43 kDa se specifickou aktivitou vztaženou na hmotnost proteinu o minimální hodnotě 100 Umg'1 pro substrát L-DOPA.
Výhody způsobu přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu spočívají zejména ve vysokém výtěžku rekombinantní tyrosinasy transformované v heterologním hostiteli o velké enzymové specifické aktivitě.
• 9
Příklad uskutečnění vynálezu
Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní případy uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoliv jako omezení vynálezu na uvedené příklady. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zajistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.
Příprava protyrosinasy
Synteticky připravený gen pro tyrosinasu izolovaný z bazidiomycety Polyporus arcularius kódující protein dbj|BAD51402| je ligován do plasmidu pET 28a (+), čímž se připraví plasmid pET28ParcP, kterým jsou transformovány kompetentní buňky expresního kmene E. coli BL21 (DE3) Star. Kmen E. coli BL21 (DE3) Star je zároveň transformován plasmidem pGro7 obsahujícím gen pro chaperon groES-groEL.
Ke kultivaci buněk je použito 100 ml media LB s 0,2 mM CuSO4, 50 pg kanamycinu ml’1 a 20 pg chloramfenikolu ml’1. Inkubace probíhá v500-mL Erlenmeyerových baňkách po dobu hodin při 37 °C a třepání 220 ot./min. Indukce je provedena přidáním 11,3 mM arabinosy a 0,02 mM IPTG a teplota je poté snížena na 20 °C. Inkubace pokračuje dalších 24 hodin při 20 °C a třepání 220 ot./min. Buňky jsou poté odděleny centrifugací po dobu 30 min, při 4 °C a skladovány při -80 °C.
Purifikace protyrosinasy
Biomasa získaná výše popsaným postupem z 800 ml media je resuspendována ve 17,5 ml 20 mM fosfátového pufru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCI a 20 mM imidazol, následně enzymaticky lyžována pomocí 0,2 mg lysozymu ml’1, 20 pg DNAsy ml·1, 1 mM MgCI2 a 1 mM fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) při 4 °C a poté mechanicky sonikací 15 x 1 min purifikována. Zbytky buněk jsou odstraněny centrifugací při 4°C po dobu 30 min. Po lyži a centrifugací je supernatant nanesen na Ni Sepharose™ 6 Fast Flow kolonu (HisTrap FF crude, GE Healthcare Life Sciences) ekvilibrovanou 20 mM fosfátovým pufrem s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCI a 20 mM imidazolu. Kolona je poté promyta tímto pufrem a navázaný protein je eluován 500 mM imidazolem ve 20 mM fosfátovém pufru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCI s gradientem po dobu 30 min s průtokem ml/min, kde jsou frakce eluátu odebírány po cca 15 ml. Aktivní frakce jsou následně spojeny a zakoncentrovány.
Aktivace tyrosinasy
Aktivace tyrosinasy je provedena v elučním pufru s upraveným pH 7,4 pomocí 500 mM NaCI a 500 mM imidazolu obsahujícím 1 mg protyrosinasy mL'1 a 0,1 mg trypsinu (Sigma) mL ’1. Reakce probíhá při 25 °C a třepání 800 ot./min a následně je ukončena po 15 min přidáním 2 mM PMSF. Vzorek je přečištěn gelovou filtrací na koloně Superdex 200 10/300 GL, kde eluce probíhá pomoci 50 mM Tris/HCI pufr s upraveným pH 7,2, pomocí 150 mM NaCI s průtokem 0,4 ml/min, kde jsou frakce eluátu odebírány po 2 ml. Aktivní frakce jsou následně spojeny a zakoncentrovány.
Aktivita takto získané tyrosinasy je stanovena spektrofotometricky pro substráty L-tyrosin, LDOPA, tert-butylcatechol a p-kresol a pomocí HPLC (kolona Chromolith Speedrod RP18 (Měrek) s mobilní fází 20 % acetonitril s0,1 % H3PO4 o průtoku 2 mL min'1 pro substráty fenol a p-kresol. Získaný enzym vykazuje tyto relativní aktivity: TBC 100 % (303 U mg'1 proteinu), L-DOPA 42 %, p-kresol 37 %, fenol 4 %, L-tyrosin 1 %. Hodnoty Km and pro LDOPA byly cca 1,0 mM a 237 s'1. Enzym je aktivní mezi pH 4 a 9 a vykazuje maximum aktivity při pH 5,5. Teplotní optimum enzymu je 50 °C a 65 % aktivity je zachováno při 70 °C. Enzym vykazuje molekulovou hmotnost podjednotky 43 kDa podle SDS-PAGE a nativní molekulovou hmotnost 79 kDa podle gelové filtrace.
Průmyslová využitelnost
Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy podle tohoto vynálezu lze využít jako biokatalyzátor pro různé oblasti biotechnologických aplikací, jako je biokatalýza, enzymové modifikace proteinů s potravinářským a medicínským využitím či jako model pro studium látek pro léčeni poruch pigmentace.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob -přípravy rekombinantní tyrosinasy, při kterém se transformují kompetentní buňky expresního kmene bakterie Escherichia coli BL21 (DE3) Star, vyznačující se tím, že se provádí kotransformací plasmidem pET28ParcP a zároveň plasmidem pGro7, kde plasmid pET28ParcP se připraví ligaci genu kódujícího protein dbj|BAD51402j pro latentní formu tyrosinasy izolovaného z bazidiomycety Polyporus arcularius do plasmidu pET 28a (+), a plasmid pGro7 obsahuje gen kódující chaperon groES-groEL, přičemž kotransformace se po kultivaci bakterie projeví expresí genu kódujícího fúzní protein protyrosinasu s N-terminální His6-tag sekvencí v heterologním systému a protyrosinasa se následně izoluje, purifikuje a aktivuje v tyrosinasu in vitro.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kultivace transformovaných buněk se provádí při 37 °C, po přidání induktoru se provádí při 20 °C.
  3. 3. Způsob, podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako induktor se využívá isopropyl-β- D-1 thiogalaktopyranosid (IPTG) a L-arabinosa.
  4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že kultivace při 37 °C se provádí po dobu 3 hodin v LB médiu, které se připraví z 1 % hm. peptonu, 0,5 % hm. kvasničného extraktu a 0,5 % hm. NaCI, s přidaným 1 % hm. glukosy a 0,2 mM CUSO4.
  5. 5. Způsob podle některého z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že kultivace při 20 °C se provádí po dobu 24 hodin s přidaným 0,02 mM IPTG a 11,3 mM arabinosy.
  6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že izolace a purifikace protyrosinasy se provádí lyží buněk působením enzymu lysozymu v kombinaci se sonikací za vzniku extraktu, a afinitní chromatografií.
  7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že aktivace tyrosinasy se provádí inkubací s trypsinem nebo hovězím pankreatickým achymotrypsinem.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že trypsin nebo hovězí pankreatický α-chymotrypsin se používá v 100 mM Tris/HCI pufru s upraveným pH na 7,5 a 10 mM CaCI2 při 30 °C.
  9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že purifikace tyrosinasy se provádí gelovou filtrací.
  10. 10. Rekombínantní tyrosinasa připravená způsobem podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že vykazuje specifickou aktivitu vztaženou na objem kultury o minimální hodnotě 3 000 UL'1 pro substrát L-DOPA.
  11. 11. Rekombínantní tyrosinasa připravená způsobem podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost 43 kDa a vykazuje specifickou aktivitu vztaženou na hmotnost proteinu o minimální hodnotě 100 Umg'1 pro substrát L-DOPA.
CZ2016-43A 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy CZ308223B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ201643A3 true CZ201643A3 (cs) 2017-08-09
CZ308223B6 CZ308223B6 (cs) 2020-03-11

Family

ID=59519989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-43A CZ308223B6 (cs) 2016-01-28 2016-01-28 Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ308223B6 (cs)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3344618B2 (ja) * 1997-06-20 2002-11-11 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 シャペロン発現プラスミド
JP2004016147A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Rengo Co Ltd 有機溶媒耐性チロシナーゼ、その遺伝子およびその製造方法
CN102505023A (zh) * 2011-11-18 2012-06-20 华东理工大学 一种dahp合酶的异源可溶性表达方法及其重组载体和基因工程菌
CN106414747A (zh) * 2014-05-22 2017-02-15 美国陶氏益农公司 细胞分裂素合酶、构建体和相关方法

Also Published As

Publication number Publication date
CZ308223B6 (cs) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Strillinger et al. Production of halophilic proteins using Haloferax volcanii H1895 in a stirred-tank bioreactor
US20120107875A1 (en) Expression Cassette, Recombinant Host Cell and Process for Producing a Target Protein
CN112513263B (zh) 产生折叶苔醇化合物的方法
Guterl et al. Uneven twins: Comparison of two enantiocomplementary hydroxynitrile lyases with α/β-hydrolase fold
Wang et al. A novel nitrilase from Rhodobacter sphaeroides LHS-305: cloning, heterologous expression and biochemical characterization
Isobe et al. Characterization of a novel hydroxynitrile lyase from Nandina domestica Thunb
Wang et al. Improving stress tolerance and cell integrity of Rhodococcus ruber by overexpressing small-shock-protein Hsp16 of Rhodococcus
Kong et al. Functional identification of glutamate cysteine ligase and glutathione synthetase in the marine yeast Rhodosporidium diobovatum
Lezzi et al. Production of recombinant Agaricus bisporus tyrosinase in Saccharomyces cerevisiae cells
JP5919192B2 (ja) βアミノ酸の調製
Itoh et al. Construction and characterization of a functional chimeric laccase from metagenomes suitable as a biocatalyst
US20220348974A1 (en) Biotin synthases for efficient production of biotin
CN108285895A (zh) 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用
Guo et al. Soluble and functional expression of a recombinant enantioselective amidase from Klebsiella oxytoca KCTC 1686 in Escherichia coli and its biochemical characterization
US8304223B2 (en) Isoforms of pig liver esterase
US11939583B2 (en) Method of producing autotrophic organisms with altered photorespiration and improved CO2 fixation
CZ201643A3 (cs) Způsob přípravy rekombinantní tyrosinasy
Lu et al. The N-terminal α-helix domain of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase is required for its soluble expression in Escherichia coli but not for catalysis
Dachuri et al. Organic Solvent-Tolerant Esterase from Sphingomonas glacialisBased on Amino Acid CompositionAnalysis: Cloning and Characterization of EstSP2
Ye et al. Characterization of novel gliotoxin biosynthesis-related genes from deep-sea-derived fungus Geosmithia pallida FS140
US20240043824A1 (en) Multimeric proteins of the peroxiredoxin family as scaffold proteins
Dadashipour et al. Comparative expression of wild-type and highly soluble mutant His103Leu of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta in prokaryotic and eukaryotic expression systems
Hadi et al. An efficient approach for overproduction of DNA polymerase from Pyrococcus furiosus using an optimized autoinduction system in Escherichia coli
Kumar et al. Cloning, expression, purification and three-dimensional structure prediction of haloalkane dehalogenase from a recently isolated Ancylobacter aquaticus strain UV5
Wardenga et al. Functional expression of porcine aminoacylase 1 in E. coli using a codon optimized synthetic gene and molecular chaperones

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210128