CZ2016644A3 - Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby - Google Patents
Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2016644A3 CZ2016644A3 CZ2016-644A CZ2016644A CZ2016644A3 CZ 2016644 A3 CZ2016644 A3 CZ 2016644A3 CZ 2016644 A CZ2016644 A CZ 2016644A CZ 2016644 A3 CZ2016644 A3 CZ 2016644A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- stem cells
- trehalose
- treatment
- composition
- injury
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 67
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 54
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 6
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 claims description 6
- 150000003625 trehaloses Chemical class 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 claims 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 claims 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000004453 corneal transparency Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- -1 glucose disaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 108010013480 succinylated gelatin Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 208000030767 Autoimmune encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 206010034944 Photokeratitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004991 placental stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení zánětlivých onemocnění, konkrétně k léčení posttraumatické zánětlivé reakce po poškození nebo úrazu. Použití trehalózy pro výrobu specifických léčiv. Podstata vynálezu spočívá v použití kmenových buněk, zejména mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně nebo z tukové tkáně nebo limbálních kmenových buněk, upravených trehalózou. Podstatou vynálezu je dále použití trehalózy pro podpůrné léčení zánětlivých onemocnění a posttraumatických reakcí při současném léčení některého z těchto onemocnění pomocí prostředku obsahujícího mezenchymální kmenové buňky. Trehalóza může sloužit také ve formě roztoku, prášku či tablety k podpůrnému léčení zánětlivých onemocnění při léčení těchto onemocnění podáváním kmenových buněk. Prostředek se vyrábí způsobem, který zahrnuje separací kmenových buněk z biologického materiálu a kultivací kmenových buněk v kultivačním médiu.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká prostředku, který obsahuje kmenové buňky, k léčeni zánětlivých onemocněni, konkrétně k léčeni posttraumatické zánětlivé reakce po poškozeni nebo úrazu. Vynález se týká dále také způsobu výroby prostředku k léčeni posttraumatické zánětlivé reakce po poškození nebo úrazu.
Dosavadní stav techniky
Kmenové buňky, například mezenchymální kmenové buňky (MSCs mezenchymal stem cells), mají výrazné imunomodulačni, protizánětlivé a antioxidační vlastnosti. Pro tyto vlastnosti jsou využívány v moderní medicíně k léčení různých onemocněni, včetně degenerativních.
Pro některá terapeutická využití jsou vhodné také limbálni kmenové buňky (LSCs, limbal stem cells), které zajišťují za fyziologických podmínek nepřetržitou obnovu rohovkového epitelu.
Například předmětem ochrany patentem EP 2 120 977 Bl jsou kmenové buňky CD10+, CD34-, CD105+ a CD200+ pro léčeni zánětlivých střevních onemocnění.
Z čínské patentové přihlášky CN 104 758 923 je znám přípravek pro ošetření poranění nervu přípravkem na bázi mezenchymálních kmenových buněk suspendovaných v roztoku trehalózy.
Z dokumentu WC^016^069173 je znám způsob přípravy suspenze kmenových buněk, která k potlačení nežádoucího shlukování buněk obsahuje trehalózu.
Patent EP 1 727 892 B1 chrání mezenchymální kmenové buňky pro použití k léčení autoimunitní encefalitidy, sklerózy multiplex nebo zánětlivých onemocnění střeva.
Patent EP některých v y y
2^298|863Β1 chrání mezenchymální kmenové buňky k léčení zánětlivých fibróz.
Trehalóza, disacharid glukózy, která je syntetizována nižšími organizmy v případech, kdy jsou vystaveny stresu, je známa jako protistresový faktor.
Je hojně využívána v humánní medicíně, například pro zabránění úbytku vody v buňkách (dehydrataci) , proti vystavení buněk nadměrnému teplu, chladu nebo oxyradikálům, proti hypoxii až anoxii a proti hypoxicko-reoxygenačnímu poškození.
přihlášky
EP 2 848
683 Al je známo při podávání suspenze kmenových buněk skrze cévní řečiště přidávat do této suspenze trehalózu za účelem prevence pulmonární embolie shluklými kmenovými buňkami.
přihlášky
WO 2010/021714 A2 je známo, že viabilitu placentálních kmenových buněk během zmrazení a opětovného rozmražení je možné zvýšit pomocí některých polysacharidů, mj .
dextranu v kombinaci s trehalózou.
• ·
V článku Di Guohu, Wang Jiexi, Liu Minxia, Wu Chu-Tse, Han Ying a Duan Haifeng: Development and evaluation of a trehaló^econtained solution formula to preserve HUC-MSCs at 4^C; J Cell Physiol; 2012 Mar; 227(3):879-84, je uvedeno, že 'přítomnost trehalózy v roztoku pro uchovávání mezenchymálních kmenových buněk výrazně zvyšuje jejich viabilitu při skladování při teplotě 4 °C, přičemž nej lepších výsledků bylo dosaženo s koncentrací mM<5Í3a trehalózy.
Podstata vynálezu
Původci vynálezu zjistili, že při úpravě kmenových buněk přidáním trehalózy dochází k výraznému zlepšení léčebného účinku kmenových buněk při hojení různých poranění, zánětlivých onemocnění a degenerativních onemocnění. Úprava kmenových buněk trehalózou způsobuje nejen^ že jsou kmenové buňky životaschopnější, ale také, že produkují více kvalitních protizánětlivých cytokinů potlačujících nadměrný zánět, produkují více antioxidačních enzymů omezujících oxidační stres, produkují více parakrynních faktorů umožňujících hojení poškozených tkání (například omezením
které často také více napomáhají odbourávání škodlivých proteinů, vedou k zániku nervových vláken při degenerativních onemocněních.
Podstata vynálezu tedy spočívá v použití kmenových buněk, zejména mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně nebo z tukové tkáně nebo limbálních kmenových buněk, upravených trehalózou, k léčení zánětlivých onemocnění včetně posttraumatické zánětlivé reakce po poškození nebo úrazu. Trehalóza je podle vynálezu obsažena ve farmaceutickém roztoku β ♦ v koncentraci 1 až 15 % hmotn.,
s výhodou 3 až 10 % hmotn., trehalózy.
Prostředek podle vynálezu, určený k léčení zánětlivých onemocnění, zejména k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí po poškození nebo úrazu, obsahuje kmenové buňky vždy v kombinaci s trehalózou. Trehalóza je podle vynálezu obsažena ve farmaceutickém roztoku v koncentraci 1 až 15 % hmotn., s výhodou 3 až 10 % hmotn., trehalózy. Kmenové buňky jsou přítomny ve formě suspenze ve farmaceutickém roztoku s obsahem trehalózy, přičemž alespoň část z obsažených kmenových buněk je zachycena na nosiči z netkané textilie z nanovláken.
Prostředek podle vynálezu se vyrábí způsobem, který zahrnuje separaci kmenových buněk z biologického materiálu a kultivaci kmenových buněk v kultivačním médiu. Kultivace buněk se provádí obvyklým způsobem při teplotě kolem 37 °C. V průběhu kultivace buněk se zpravidla provádí pasážování, tedy enzymatické odloučení buněk, výměna kultivačního roztoku a přenesení buněk na větší kultivační plochu. Kmenové buňky se rozmíchají v roztoku pufru a odstředí se. Podle vynálezu se získané kmenové buňky suspendují v médiu pro uchovávání a transport kmenových buněk, které obsahuje 1 až 15 % hmotn., s výhodou 3 až 10 % hmotn. trehalózy. Kultivace kmenových buněk se alespoň v části doby kultivace v kultivačním médiu s obsahem trehalózy provádí v přítomnosti nosiče z nanovláken.
Léčebné použití trehalózy v kombinaci s kmenovými buňkami vykazuje při zánětlivých onemocnění, zejména posttraumatických reakcí, vyšší účinky^ než jaké bylo možno • · očekávat na základě znalosti samostatně.
cislcu.tec.fi<žf}í
Příklady provadoaj vynálezu
Přiklad 1
účinků obou složek používaných dřeně byla provedena odběrového setu gentamicinem. Po
Aspirace kostní která je součástí roztok s heparinem a prostor pro sterilní zpracování smíchán s infuzním roztokem Gelofusinu odpovídalo 25 % aa!
sedimentovala 10 -X 30 minut a trepanobioptickou jehlou, obsahujícího fyziologický transportu kostní dřeně do biologického materiálu byl vzorek Gelofusinu. Množství přidaného objemu kostní dřeně. Směs vrstva prstence mononukleárních buněk byla odebrána. V odebrané vrstvě buněk byla analyzována buněčnost směsi hematologickým analyzátorem. Do každé z připravených kultivačních lahví o ploše 75 cm2 bylo přidáno 10 ml kompletního kultivačního media (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5% lidský destičkový lyzát a gentamicin) a definované množství suspenze izolovaných buněk (10 mil WBC) pro nasazení primokultury. Kultivace buněk probíhala při teplotě 37 ± 2 °C. V průběhu kultivace buněk probíhala průběžná výměna kompletního kultivačního média s případným oplachem buněk pomocí 10 ml pufru PBS na jednu kultivační láhev. Dle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování bylo nutné odsátí kultivačního media, oplach kultury 10 ml pufru PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu TrypLE Select CTS. Kultivační lahve • ·
byly cca 4 minuty inkubovány při 37 ± 2 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve přidán 1 ml infuzního roztoku 20% HSA (Lidský sérový albumin) a 6 ml pufru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifugační zkumavky a centrifugována (230 g, 5 minut). Peleta /
buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním mediu a suspenze buněk rozdělena na požadované množství kultivačních lahví. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk. Ta byla navíc ještě jednou promyta pufrem PBS a centrifugována (230 g, 5 minut).Pro vytvoření přípravku podle k jednoho provedení vynálezu byla peleta získaná výše uvedeným postupem resuspendována v roztoku pufru PBS obsahuj ícim trehalozu.
Obsah kmenových buněk je zpravidla 5 x 105 až 1 x 107 MSCs/ml. Při intravenozní aplikaci se může podávat například 1 x 106 MSCs/kg hmotnosti pokusného zvířete.
Příklad 2
Z komerčně dostupného polymeru kyseliny mléčné (PLA, polylaktid) byla připravena nanovlákna ve formě netkané textilie. Z této netkané textilie byly vyříznuty vzorky ve formě čtverců o rozměrech přibližně 15 x 15 mm, které byly přeneseny na kultivační desky s kulturami mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně králíka. Inkubace mezenchymálních kmenových buněk v přítomnosti trehalózy ve styku s netkanou textilií z nanovláken byla prováděna po dobu 24 hodin, aby kmenové buňky mohly ulpět na struktuře nanovláken jakožto nosiči. Kultivační roztok pro pokusy podle vynálezu obsahoval 3 % hmotn.
trehalózy, př ítomnosti pro srovnávací pokusy byla trehalózy.
inkubace prováděna bez byly poleptány INVhydroxidu
Králičí oči r yrK sodného NaOH aplikovaného pomocí filtračního papírku nasátého hydroxidem, načež byly oči propláchnuty proudem vody. U každého králíka bylo poškozeno pouze pravé oko. Oči zcela zdravých králíků (mimo pokus) sloužily pro srovnání.
V první skupině byly na poškozené oči přeneseny nosiče z nanovláken s králičími mezenchymálními dřeňovými buňkami, podle vynálezu inkubovanými v přítomnosti trehalózy, (buňkami dolů k povrchu poškozeného oka), nosiče byly pomocí čtyř stehů přichyceny ke spojivce, oči zavřeny a víčka sešita k sobě pomocí tři stehů. Po čtyřech dnech víčka rozešita, nosiče z nanovláken odstraněny a oko ponecháno bez dalšího léčení až do 15. dne, kdy byla pokusná zvířata utracena a oči vyšetřeny morfologicky, imunohistochemicky, biochemicky a pachymetricky. Veškeré pokusy na zvířatech byly prováděny tak, aby zvíře netrpělo, za použití celkové anestezie.
Ve druhé skupině bylo stejně postupováno jako v první, s tím rozdílem, že nanovlákna byla napuštěna fyziologickým roztokem se 3 % hmotn. trehalózy, bez kmenových buněk.
Ve třetí skupině bylo postupováno stejně jako v první, s tím rozdílem, že nanovlákna nesla kmenové buňky bez trehalózy.
Ve čtvrté skupině bylo postupováno stejně, jako v první skupině, ale nanovlákna byla samotná (bez kmenových buněk a bez trehalózy).
V páté skupině byly oči stejně poškozené jako v první skupině, ale neléčeny.
V 15. den pokusu byly oči vyšetřeny pomocí imunohistochemie a biochemie pro-zánětlivých cytokinů. Regenerace epitelu byla hodnocena morfologicky a imunohistochemií epiteliálních buněk. Neovaskularizace byla posuzována prostřednictvím kvantifikace cév v jednotlivých sektorech rohovky. Transparence rohovky byla hodnocena makroskopicky (fotograficky) a pachymetricky, kvantifikací hodnot středových tlouštěk rohovek.
Byly zjištěny následující výsledky:
V očích poškozených a neléčených byl rozvinutý zánět, rohovka bez epitelu, transparence ztracena, rohovka vaskularizována. Podobný obraz byl po aplikaci samotného nosiče z nanovláken, pouze rohovka byla částečně reepitelizována.
Po aplikaci nosiče z nanovláken se samotnou trehalózou byla rohovka pokryta nepravidelným epitelem, zánět byl částečně redukován. Neovaskularizace rohovky byla snížena. Stejný obraz byl zjištěn po aplikaci nosiče z nanovláken se samotnými kmenovými buňkami.
Po aplikaci kombinace mezenchymálních kmenových buněk s trehalózou byla rohovka regenerována pravidelným epitelem, transparence rohovky byla obnovena z 90 %, neovaskularizace rohovky byla signifikantně potlačena.
Popsaný experiment prokázal zvýšený léčebný účinek mezenchymálních kmenových buněk kombinovaných s trehalózou.
Pro ověřeni zvýšeného léčebného účinku kmenových buněk v kombinační s trehalózou byly, obdobně jako je výše popsáno na přikladu králičích dřeňových buněk, inkubovány v přítomnosti kultivačního roztoku obsahujícího 3 % hmotn. trehalózy lidské mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně, nebo lidské tukové kmenové buňky, nebo lidské limbální kmenové buňky. Také s těmito lidskými kmenovými buňkami se při pokusu na poleptaném králičím oku rohovka zhojila pomocí kmenových buněk kombinovaných s trehalózou lépe než pomocí samotných kmenových buněk. Výsledky makroskopické, morfologické, imunohistochemické a biochemické byly shodné jako po aplikaci králičích mezenchymálních buněk.
Příklad 3
Pro ověření zvýšeného účinku mezenchymálních kmenových buněk v kombinaci s trehalózou, obdobně jako je výše popsáno na přikladu králičích dřeňových buněk, byly inkubovány v přítomnosti kultivačního roztoku obsahujícího 3 % hmotn. trehalózy lidské mezenchymální kmenové buňky z kostní dřeně, nebo lidské tukové kmenové buňky, nebo lidské limbální kmenové buňky. Také s těmito lidskými kmenovými buňkami se v pokusu na poleptaném králičím oku (postupováno jako v příkladu 2) rohovka zhojila pomocí kmenových buněk kombinovaných s trehalózou lépe než pomocí samotných kmenových buněk. Výsledky makroskopické, morfologické, imunohistochemické, biochemické a fyzikální byly shodné jako po aplikaci králičích mezenchymálních buněk (s trehalózou).
Příklad 4
Zvýšeného léčebného účinku mezenchymálních kmenových buněk (nebo tukových mezenchymálních kmenových buněk, nebo limbálních kmenových buněk), inkubovaných na nanovlákenném nosiči (bez trehalózy) bylo též dosaženo po nakapání 3% roztoku trehalózy na kmenové buňky na nosiči a po aplikování nosiče na poleptané oko (jako v příkladu 2) .
Příklad 5
Zvýšeného léčebného účinku mezenchymálních kmenových buněk (nebo tukových mezenchymálních kmenových buněk, nebo limbálních kmenových buněk), inkubovaných na nanovlákenném nosiči (bez trehalózy) bylo též dosaženo po našití nanovlákenného nosiče s kmenovými buňkami na poleptané oko (jako v příkladu 2) a nakapání 3% roztoku trehalózy na rubovou stranu našitého nosiče (10 kapek po dobu 1 min) před sešitím víček.
Příklad 6 (provedení odchylné od vynálezu, bez použití nosiče)
U poleptaného oka bylo dosaženo zvýšeného léčebného účinku mezenchymálních kmenových buněk (nebo tukových mezenchymálních kmenových buněk, nebo limbálních kmenových buněk) po přidání 3% roztoku trehalózy a po intravenózní aplikaci králíkovi s poleptaným okem jako v příkladu 2.
Příklad 7
Zvýšené léčebné účinky mezenchymálních kmenových buněk (dřeňových, nebo tukových), nebo limbálních kmenových buněk po adici 3% roztoku trehalózy ke kmenovým buňkám byly pozorovány také po jejich subkonjunktivální aplikaci do oka s poškozenou rohovkou louhem sodným jako v příkladu 2. Pro urychlení hojení se trehalo^za může s výhodou kombinovat s antiflogistiky (steroidními nebo nesteroidními), nebo s antibiotiky, nebo s jinými látkami, např. s antioxidačními enzymy.
« 9 •9 «· • ·· •· • ·
Přiklad 8
Ozařováni králičích očí UVB paprsky po dobu 5 dnů (denní dávka záření 1.01 J/cm2) způsobila fotokeratitidu, zvýšenou hydrataci rohovky a ztenčení rohovkového epitelu. Transparence rohovky byla ztracena. 15. den po ozařování byly neléčené rohovky ulcerovány, nebo se hojily neprůhlednou jizvou. Rohovky byly vaskularizovány. Jestliže byly na rohovky aplikovány okamžitě po posledním ozáření mezenchymální kmenové buňky (dřeňové nebo tukové) v roztoku obsahujícím 3 % hmotn. trehalózy, rohovky se zhojily s 90% návratem transparence. Vředy se nevytvořily v žádné léčené rohovce. Za použití metodiky obdobné jako v příkladu 2 bylo zjištěno, že aplikace kmenových buněk v kombinaci s trehalózou přinesla lepší výsledky než aplikace samotné trehalózy. Při užití samotné trehalózy nebo samotných kmenových buněk byly některé rohovky ulcerovány a vaskularizovány. Při lokální aplikaci kmenových buněk s trehalózou na ozářené oko byla trehalóza s výhodou kombinována s kyselinou hyaluronovou. Kapáním nebo subkonjunktivální injekcí byla podávána suspenze obsahující 2 x 10*^MSCs/0,5 ml v roztoku obsahujícím 3 % hmotn. trehalózy a
vyšetření prokázalo, že oxidační poškození, způsobené UVB zářením, je signifikantně inhibováno aplikací kmenových buněk s trehalózou. Kmenové buňky měly zvýšený antioxidační účinek.
Claims (7)
1. Prostředek k léčeni posttraumatických zánětlivých reakcí po poškození nebo úrazu, vyznačující se tím, že obsahuje kmenové buňky na nosiči z netkané textilie z nanovláken a farmaceutický roztok obsahující 1 až 15 % hmotn. trehalózy.
2.
Prostředek podle nároku 1, přičemž kmenové buňky jsou kmenové buňky inkubované v kultivačním roztoku s obsahem trehalózy.
3.
Prostředek podle některého z nároků
1 nebo
2, přičemž kmenové buňky zahrnují kmenové buňky inkubované v kultivačním roztoku s obsahem trehalózy na nosiči z netkané textilie z nanovláken.
4. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, určený k léčení poranění epitelových tkání, přičemž kmenové buňky jsou mezenchymální kmenové buňky.
5. Prostředek podle nároku 4, přičemž farmaceutický roztok obsahuje 3 až 10 % hmotn., trehalózy.
6. Prostředek podle některého z nároků 1 až 3, určený k léčení poranění oční rohovky, přičemž kmenové buňky jsou limbální kmenové buňky.
7. Prostředek podle nároku 6, přičemž farmaceutický roztok obsahuje 3 až 10 % hmotn., trehalózy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-644A CZ307325B6 (cs) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-644A CZ307325B6 (cs) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2016644A3 true CZ2016644A3 (cs) | 2018-06-06 |
| CZ307325B6 CZ307325B6 (cs) | 2018-06-06 |
Family
ID=62240881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2016-644A CZ307325B6 (cs) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307325B6 (cs) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2005279934A1 (en) * | 2004-08-30 | 2006-03-09 | Theregen, Inc. | Compositions and methods of promoting hair growth |
| JP5341059B2 (ja) * | 2010-11-09 | 2013-11-13 | 株式会社大塚製薬工場 | 幹細胞懸濁液 |
| CN104758923A (zh) * | 2015-03-11 | 2015-07-08 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法 |
-
2016
- 2016-10-14 CZ CZ2016-644A patent/CZ307325B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ307325B6 (cs) | 2018-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108671224B (zh) | 血小板裂解物的组合物、用途和制备 | |
| CN103298926B (zh) | 干细胞悬浮液 | |
| US20160051722A1 (en) | Mesenchymal Stem Cell-Hydrogel-Biodegradable or Mesenchymal Stem Cell-Hydrogel-Undegradable Support Composition for Skin Regeneration or Wound Healing | |
| CN108653327B (zh) | 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法 | |
| KR20050109941A (ko) | 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 | |
| JP2017507114A (ja) | 血管新生を誘導する方法 | |
| JP2020191861A (ja) | 臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用 | |
| US20240335479A1 (en) | Biological material impregnated with a solution comprising exosomes | |
| CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
| CN104830759A (zh) | 一种大鼠心肌细胞的分离培养方法 | |
| CZ2016644A3 (cs) | Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby | |
| CN106176747B (zh) | 他克林在制备治疗包虫病药物中的应用 | |
| Nasr et al. | Comparative Histological and Immunohistochemical Study on the Effect of Platelet-Rich Plasma, Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells, and Mesenchymal Stem Cells Derived Exosomes in Experimentally Induced Corneal Alkali Burn in Albino Rats | |
| CN110199985A (zh) | 一种神经元冻存液的制备方法 | |
| CN112494494B (zh) | Bml-28-4的药物新用途 | |
| CN107468708A (zh) | 一种干细胞活性因子凝胶的制备方法及在难愈合伤口治疗中的应用 | |
| JP2024515581A (ja) | 多層羊膜組織移植片及びその使用 | |
| CN106474157A (zh) | 一种肝干细胞注射液及其制备方法 | |
| CN112516146B (zh) | Az191的药物新用途 | |
| CN112603914B (zh) | 盐酸去氧肾上腺素的药物新用途 | |
| CN113234670B (zh) | 一种成年小鼠心房肌细胞的分离与培养方法 | |
| CN114642668B (zh) | 拉坦前列素的药物新用途 | |
| CN114652717B (zh) | 盐酸萘甲唑啉的药物用途 | |
| CN121041320A (zh) | 母乳源性干细胞联合脐带间充质干细胞在制备治疗卵巢早衰药物中的应用 | |
| RU2553342C1 (ru) | Способ лечения инфекционного перитонита в эксперименте |