CZ2018116A3 - Způsob uchování živočišných buněk - Google Patents
Způsob uchování živočišných buněk Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2018116A3 CZ2018116A3 CZ2018-116A CZ2018116A CZ2018116A3 CZ 2018116 A3 CZ2018116 A3 CZ 2018116A3 CZ 2018116 A CZ2018116 A CZ 2018116A CZ 2018116 A3 CZ2018116 A3 CZ 2018116A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- molecular hydrogen
- solution
- hydrogen
- stem cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 45
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000003186 pharmaceutical solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 17
- UFHFLCQGNIYNRP-VVKOMZTBSA-N Dideuterium Chemical compound [2H][2H] UFHFLCQGNIYNRP-VVKOMZTBSA-N 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 23
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 17
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 17
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 27
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 10
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 9
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- -1 NajHPCL Chemical compound 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700042768 University of Wisconsin-lactobionate solution Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000010953 base metal Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 1
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 229940099584 lactobionate Drugs 0.000 description 1
- JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N lactobionic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- BIRNWOIQDVFTSP-WWNCWODVSA-M potassium (2R,3R,4R,5R)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanoate Chemical compound [K+].OC[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O BIRNWOIQDVFTSP-WWNCWODVSA-M 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Popisuje se způsob uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, za účelem jejich skladování nebo transportu, při kterém se připraví zvolený farmaceutický roztok, zavádí se do něho plynný molekulární vodík Hdo dosažení koncentrace alespoň 0,3 mg/l, v takto upraveném roztoku obsahujícím molekulární vodík Hse suspendují kmenové buňky, takto připravená suspenze se převede do nádoby nepropustné pro molekulární vodík H, a nádoby obsahující kmenové buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík Hse uchovají při chladničkové teplotě, zejména při teplotě v rozmezí +2 až +8 °C.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, při chladničkové teplotě, zejména při teplotě v rozmezí +2 až +8 °C, za účelem jejich skladování nebo transportu.
Dosavadní stav techniky
Kmenové buňky, zejména mezenchymální kmenové buňky (MSCs, Mesenchymal Stem Cells) jsou využívány v moderní medicíně k léčení různých onemocnění. Při léčbě je využíváno jejich imunomodulačních, protizánětlivých, antioxidačních, sekrečních, chemotaktických a diferenciačních vlastností. MSCs jsou rovněž využívány ve vědecké sféře k různým in vitro a in vivo pokusům a k preklinickým studiím na modelových zvířatech.
Před aplikací MSCs určených k terapeutickým účelům v humánní medicíně je třeba jejich důkladná charakterizace a testování. Je nutné potvrdit jejich bezpečnost (testy sterility, přítomnost endotoxinů a mykoplazmat), jejich identitu (povrchové znaky) a fúnkčnost. MSCs je dále třeba transportovat z místa výroby do místa podání buněk pacientovi nebo do místa jejich dalšího využití (testování, vědecké účely, preklinické testy). Všechny tyto procedury prodlužují dobu uskladnění buněčného přípravku a zvyšují nároky na prodlouženou životnost buněk. Jak uvádí Sohn a kolektiv
- 1 CZ2018 -116 A3 (Cytotherapy, 2013), viabilita MSCs uchovaných v solném roztoku klesá již po dvou hodinách.
Pro uchování buněk se využívá většinou modifikovaných roztoků primárně vyvinutých pro transport orgánů (US 7951590, US 6045990, WO 2010064054 AI).
Použití různých roztoků pro dlouhodobé uchování mezenchymálních kmenových buněk je popsáno také v následujících publikacích.
Ginis a kolektiv (Tissue Eng Part C Methods, 2012) testovali uchování adherentních mezenchymálních kmenových buněk v roztoku Hypothermosol® FRS (roztok obsahující kationty Na+, K+, Ca2+, Mg2+ a anionty Cl, H2PO4·, HCOs' a laktobionát, sacharózu, mannitol, glukózu, dextran-40, adenosin, glutathion, HEPES, Trolox) při 4 °C. Viabilita takto uchovaných buněk se pohybovala mezi 70-80 % po 2-4 denním skladování.
Chen a kolektiv (Cell Transplant, 2013) testovali uchování buněk v roztoku Plasmalyte (roztok obsahující kationty Na+, K+, Mg2+ a anionty Cl, CThCOO a CřHuO?) a 5 % dextrózy po dobu šesti hodin a zjistili pokles viability o 17-20 %.
Další komerčně dostupná média a roztoky HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Hanksův pufrovaný solný roztok obsahující KC1, KH2PO4, NaCl, NaHCOs, NaíHPCfi a D-glukózu) a ViaSpan® (roztok obsahující KH2PO4, MgSO4, laktobionát draselný, raffinózu, adenosin, glutathion, allopurinol, hydroxyethylškrob) testovali autoři Corwin a kolektiv (Cryobiology, 2014). Viabilita MSCs po 48-hodinovém uložení při 4 °C byla 45 %.
-2CZ2018 -116 A3
Z patentu CZ 306800 je znám prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk tvořený pufřovaným vodným roztokem trehalózy (KH2PO4, NajHPCL, CaCh, MgSCL, trehalóza a H2O). MSCs uchované v tomto prostředku po dobu 72 hodin si zachovaly 84-90% životnost.
Podstata vynálezu
Vynález je založen na myšlence použít pro chladové uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, při takzvané chladničkové teplotě, zejména při teplotě +2 až +8 °C, jako složku roztoku molekulární vodík H2. Molekulární vodík díky své malé velikosti snadno difunduje do cytoplazmy, mitochondrií, případně i jader buněk, kde působí antioxidačně, antiapoptoticky, protizánětlivě a cytoprotektivně.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že molekulárním vodíkem je obohacován, v množství alespoň 0,3 mg/1, vhodný roztok, s výhodou farmaceutický roztok, ve kterém jsou buňky uchovávány a zároveň podávány pacientovi. Jako vhodný farmaceutický roztok lze využít např. infuzní roztoky (např. Ringerův roztok, Hartmannův roztok, fyziologický roztok, Plasmalyte), případně PBS (phosphate buffered šalině - fyziologický roztok s fosfátovým pufirem), HBSS, EBSS (Earfs balanced salt solution - Earlův balancovaný solný roztok) nebo pufřovaný vodný roztok trehalózy (patent CZ 306800). Roztok po saturaci vodíkem by měl mít hodnotu pH v rozmezí 6,3 - 7,8; ideálně 6,9 - 7,4; hodnotu celkové osmolarity v rozmezí 270 - 350 mOsm/1; ideálně 290 310 mOsm/1.
Roztoky lze sytit molekulárním vodíkem buď komerčně dostupnými prostředky uvolňujícími vodík, jako jsou chemické patrony (Dr.
-3 CZ2018 -116 A3
H. Hayashfs originál HydrogenRich Water Stick™), tyčinky (Doctor SUISOSUI®, Friendear, Tokyo, Japan) nebo tablety na bázi hořčíku (US 20160113865 AI), přídavkem obecného kovu s jedlou organickou kyselinou (US 20150258136 AI) nebo probubláváním vodných roztoků plynným vodíkem.
Výhodně se do zvoleného roztoku zavádí molekulární vodík probubláváním plynným vodíkem z tlakové lahve.
Roztok může být obohacován vodíkem na libovolný obsah vodíku, který poskytuje pozorovatelný účinek, s výhodou však až do jeho saturace za daných podmínek. Roztok by měl obsahovat 0,3 až 1,6 mg/1 molekulárního vodíku; ideálně 0,5 až 1,5 mg/L
Způsob uchování za využití molekulárního vodíku je určen pro chladové uchování bez nutnosti zamrazení suspenzí různých typů buněk, zejména živočišných, například buněčných linií, například fibroblastů z pojivové tkáně, zejména však mezenchymálních kmenových buněk získaných například z kostní dřeně, tukové tkáně, periferní krve, zubní pulpy, z extraembryonálních tkání (placenta, pupečník, pupečníková krev), ale i embryonálních, nervových, indukovaných nebo limbálních kmenových buněk savců včetně člověka. Může sloužit také k uchování kmenových buněk uchycených na biologickém nosiči nebo zabudovaných uvnitř nosiče.
Kmenové buňky uchované způsobem podle vynálezu mohou být aplikovány přímo pacientovi bez nutnosti další manipulace, a to zejména intravenózně, intraarteriálně, intramuskulámě, subkutánně, subkunjunktiviálně nebo intratekálně, a to buď samostatně, nebo v kombinaci, např. s nosičem.
-4CZ2018 -116 A3
Nosičem kmenových buněk mohou být funkční biomateriály. Může se jednat o syntetické biokompatibilní polymery (kyselina polylaktidová PLA, kyselina polyglykolová PGA, polyethylenglykol PEG, polykaprolakton PCL, polyhydroxybutyrát PHB a další), přírodní polymery a polysacharidy (kolagen typu I, hyaluronová kyselina, fibrin, chitosan, celulóza, škrob a další) nebo extracelulámí matrice (ECM) ve formě hydrogelu, nanovláken nebo mikrovláken. Nosičem může být biodegradabilní i nedegradabilní materiál.
Alternativně se pro aplikace, které počítají s nosičem, mohou kultivace kmenových buněk provádět v přítomnosti těchto nosičů a společně uchovávat způsobem podle vynálezu.
Alternativně se mohou kmenové buňky uchovávat způsobem podle vynálezu a před aplikací pacientovi smíchat s biokompatibilními nosiči a podávat pacientovi společně.
Přehled obrázků
Na připojených vyobrazeních jsou mikrofotografie adherovaných mezenchymálních kmenových buněk z pupečníkové tkáně vysazených na kultivační plast po 6-denním skladování v chladových podmínkách způsobem podle vynálezu za využití molekulárního vodíku.
Obrázky ilustrují:
obr. lAAdherované MSCs, které byly 6 dní uchovávány v chladových podmínkách v roztoku PBS a poté vysazeny na kultivační plast, po 24-hodinové kultivaci v kompletním médiu,
-5 CZ2018 -116 A3 obr. 1B Adherované MSCs, které byly 6 dní uchovávány v chladových podmínkách v roztoku PBS s koncentrací molekulárního vodíku 0,68 mg/L a poté vysazeny na kultivační plast, po 24hodinové kultivaci v kompletním médiu
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Způsob izolace pupečníkových MSCs
Lidský pupečník byl získán od zdravých novorozenců ihned po porodu. Pupečníkové arterie a véna byly odstraněny a pupečníková tkáň byla nakrájena na malé kousky (asi 1-2 mm3). MSCs z umbilikální tkáně byly izolovány explantátovou metodou, kdy byly kousky tkáně vysazeny do kultivační lahve o ploše 25 cm2. Kultivace probíhala ve 4 ml kompletního kultivačního média (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5 % obj. lidského destičkového lyzátu a gentamicin). Po 10 dnech byly kousky tkáně odmyty a buňky, které vycestovaly z pupečníkové tkáně a přisedly na plast, byly dále kultivovány v kompletním kultivačním mediu při teplotě 37 °C s 5 % CO2. V průběhu kultivace buněk probíhala 3x týdně výměna média. Dle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80-90% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování bylo nutné odsátí kultivačního média, oplach kultury 4 ml pufřu PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu Trypsin/EDTA. Kultivační lahve byly cca 4 minuty inkubovány při 37 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve
-6CZ2018 -116 A3 přidán 1 ml fetálního bovinního séra a 2 ml pufru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifůgační zkumavky a centrifůgována (230 g, 5 minut). Peleta buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním médiu a suspenze buněk znovu vysazena do nových kultivačních lahví o ploše 75 cm2 v poměru 4000 buněk/1 cm2 plochy. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk.
Příklad 2: Způsob sycení roztoků molekulárním vodíkem
Roztoky zvolené pro příklady sycení vodíkem byly fosfátový pufir PBS o složení NaCl, KC1, NajHPCL, KH2PO4 a H2O a pufirovaný vodný roztok s trehalózou podle patentu CZ 306800 o složení KH2PO4, Na2HPO4, CaCL, MgSCk, trehalóza a H2O. Sycení roztoků vodíkem bylo prováděno probubláváním roztoků vodíkem z tlakové láhve (průtok 1 1/min, 10 min, za stálého míchání), pomocí komerčně dostupné patrony Dr. H. Hayashfs originál HydrogenRich Water Stick™ nebo rozpuštěním tablety pro produkci molekulárního vodíku Active H2, Purative. Koncentrace rozpuštěného molekulárního vodíku v roztoku byla měřena pomocí přístroje Trustlex ENH-1000 a dosahovala hodnot 0,5 - 1,5 mg/L
Lze použít také systém MiZ Co., Ltd. Japan. Tento systém používá vak z hliníkové fólie, do kterého se umístí tableta (agens uvolňující H2) a pro H2 propustný vak z polyethylénu nebo polystyrénu, obsahující pufir s uchovávanými buňkami. Po přidání vody se hliníkový vak zavaří. Vyvíjející se H2 proniká do pufiru v polyethylénovém nebo polystyrénovém vaku. Kromě H2 žádná jiná látka do vaku s pufirem a buňkami neproniká.
-7 CZ2018 -116 A3
Příklad 3: Způsob uchování kmenových buněk v roztocích obohacených molekulárním vodíkem
Suspenze kmenových buněk, jejichž získávání je popsáno v příkladu 1, vždy v množství 5-10 mil/ml byla resuspendována v roztoku obohaceném o molekulární vodík podle příkladu 2 a uzavřena v nádobkách z borosilikátového skla hydrolytické třídy 1 se šroubovacím magnetickým uzávěrem s těsněním ze silikonu a teflonu schopných zadržet molekulární vodík po dobu skladování. Nádobky se suspenzí buněk byly skladovány při teplotě cca 4 °C po dobu 6 dnů. Po 3 dnech byla odebrána poměrná část nádobek pro zjištění průběhu příkladu.
Alternativně lze uchovávat buňky ve vacích prostupných pro H2 v zatavených hliníkových vacích s agens produkujícím kontinuálně molekulární vodík.
Příklad 3 a: Srovnávací příklad k příkladu 3
Jako srovnávací příklad k příkladu 3 bylo stejné množství pupečníkových MSCs (5-10 mil/ml) uchováno ve stejném typu nádobek jako v příkladu 3 a ve stejných roztocích jako v příkladu 2, ale bez sycení molekulárním vodíkem a skladováno při teplotě cca 4 °C po dobu 6 dnů. Po 3 dnech byla odebrána poměrná část nádobek pro zjištění průběhu příkladu.
Příklad 4: Viabilita pupečníkových MSCs po 3 a 6-denním skladování
Byla hodnocena viabilita MSCs izolovaných z pupečníkové tkáně uchovaných po dobu 3 resp. 6 dní při teplotě okolo 4 °C. MSCs z lidské pupečníkové tkáně byly vyrobeny podle příkladu 1 a
-8CZ2018 -116 A3 uskladněny podle příkladu 3 a 3a. Po 3 resp. 6 dnech byla stanovena viabilita buněk na základě dvou nezávislých metod.
Nejprve byla suspenze buněk obarvena roztokem trypanové modři a počítán poměr živých a mrtvých buněk pomocí Bíirkerovy počítací komůrky. Živé a mrtvé buňky je možno rozlišit barvením. U buněk s narušenou plazmatickou membránou dochází k průniku barviva a tím k obarvení buňky, nepoškozené živé buňky zůstávají neobarvené. Viabilita stanovená barvením trypanovou modří odráží životnost jednotlivých buněk v suspenzi.
Viabilita pupečníkových MSCs byla dále hodnocena pomocí Amalar blue® testu, který vypovídá o metabolické aktivitě kultivovaných buněk. Aktivní složka Amalar blue® testu je sloučenina resazurin, která proniká do všech buněk. Životaschopné, metabolicky aktivní buňky jsou schopny tuto modrou sloučeninu přeměnit na jasně červené fluorescenční barvivo resofůrin. Množství fluorescence je přímo úměrné počtu živých buněk a koresponduje s metabolickou aktivitu buněk. Pro tento účel bylo vysazeno stejné objemové množství buněk odpovídající počtu 100 000 buněk v čerstvém stavu na 24 jamkovou kultivační destičku a buňky byly kultivovány po dobu 24 hodin. Následně byl přidán objemově 10% roztok Alamar blue® v kompletním kultivačním médiu a MSCs byly inkubovány další 4 hodiny při teplotě 37 °C. Intenzita fluorescence byla hodnocena při vlnové délce excitace 535 nm a vlnové délce emise 550 nm na spektrofotometru (Tecan). Metabolická aktivita buněk byla prezentována jako poměr mezi intenzitou fluorescence MSCs po 3 a 6 dnech skladování v chladovém prostředí podle příkladu 3 a buněk ze stejné skupiny před uskladněním (po sklizni v čase 0). Výsledky byly porovnány s výsledky ze srovnávacího příkladu 3 a (buňky uchované ve stejném typu nádobek v pufrovacích roztocích nesycených
-9CZ2018 -116 A3 molekulárním vodíkem a skladované při teplotě asi 4 °C po dobu 3 a 6 dnů).
V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty vždy z několika měření, zjištěné s koncentracemi vodíku v rozmezí 0,3 až 1,6 mg/1 (koncentrace vodíku na začátku pokusu).
Tabulka 1
| Viabilita; barvení trypanovou modří; % živých (negativních) buněk | Metabolická aktivita adherovaných buněk; barvení pomocí Alamar blue®; vyjádřeno v %; vztaženo k času 0 hodin | |||
| 3 dny | 6 dní | 3 dny | 6 dní | |
| PBS | 75,71 ±3,8 | 55,46 ±2,8 | 82,3 ± 3,6 | 63,4 ±2,5 |
| TR-200 | 87,5 ± 5,7 | 79,4 ± 4,8 | 88,2 ±2,7 | 73,5 ±2,4 |
| PBS + H2 | 89,51 ±2,3 | 80,7 ±3,6 | 91,8 ±5,2 | 72,9 ± 3,7 |
| TR-200 + H2 | 90,35 ±4,1 | 82,14 ±3,1 | 92,1 ±4,2 | 77,1 ±5,7 |
PBS - fyziologický roztok s fosfátovým pufrem
TR-200 - pufrovaný vodný roztok s trehalózou obsahující 200mM trehalózu;
PBS + H2 - vodíkem sycený fyziologický roztok s fosfátovým pufrem TR-200 + H2 - vodíkem sycený pufrovaný vodný roztok s trehalózou obsahující 200mM trehalózu
Z tabulky č. 1 vyplývá, že sycení roztoku vodíkem zlepšuje životnost a přežitelnost buněk v chladových podmínkách podle způsobu provedení vynálezu. Přídavkem trehalózy, která je známa svými antioxidačními účinky a zvýšením odolnosti vůči nízkým teplotám, se účinek vodíku na životnost buněk ještě zvyšuje.
Kromě toho byla životnost pupečníkových MSCs po chladovém skladování posouzena pomocí hodnocení jejich adheze na kultivační plast během kultivace po dobu 24 hodin v kompletním médiu (podle příkladu 1). Adheze na kultivační plast je jedním ze základních znaků kmenových buněk. Adheze odráží životnost buněk, protože adherovat mohou pouze živé, chladové skladování přeživší buňky. Pro posouzení buněčné adheze byly pořízeny mikroskopické fotografie pupečníkových MSCs adherovaných na
- 10CZ2018 -116 A3 kultivační plast po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu provedení vynálezu (obr. 1). Z obr. 1 je patrné, že buňky uchované v roztocích sycených vodíkem vykazují výrazně lepší adhezi.
Byla provedena řada pokusů v roztocích s obsahem vodíku v rozmezí 0,3 až 1,6 mg/1. Obsah vodíku v celém tomto rozmezí poskytoval pozorovatelné zlepšení. Nejvýraznější zlepšení viability kmenových buněk po 6-denním skladování při teplotě 4 °C bylo pozorováno při obsahu vodíku 0,5 až 1,5 mg/L
Hodnoty pH roztoků ve všech pokusech byly 6,9 až 7,4, přijatelné však jsou hodnoty pH v širším rozmezí pH 6,3 až 7,8. Celková osmolarita byla ve všech případech v rozmezí 290 až 310 mOsm/1, při použití jiných vhodných farmaceutických roztoků však může celková osmolarita nabývat nižších hodnot než 290 mOsm/1 i vyšších hodnot než 310 mOsm/1, může tedy být v rozmezí 270 až 350 mOsm/1.
Příklad 5: Uchování lidských dermálních fibroblastů v roztocích obohacených molekulárním vodíkem
Pro ověření možnosti uchování jiných buněk než kmenových buněk byly provedeny pokusy s uchováním fibroblastů v roztoku PBS, ve kterém byla koncentrace molekulárního vodíku na začátku pokusu 0,68 mg/L Viabilita fibroblastů po šesti dnech byla posuzována kvalitativně. Byla vždy zřetelně vyšší než u kontrolních vzorků bez vodíku.
Příklad 6: Zachování fenotypu pupečníkových MSCs po 6-denním chladovém uchování podle způsobu vynálezu - analýza povrchových znaků
- 11 CZ2018 -116 A3
Dalším znakem charakterizujícím MSCs je kromě adheze k plastu exprese povrchových CD markérů. Pupečníkové MSCs značené protilátkami konjugovanými s fluorescenční značkou byly po 6-denním uchování v chladových podmínkách v roztoku PBS syceného molekulárním vodíkem způsobem podle vynálezu analyzovány na průtokovém cytometru za použití excitačních laserů o vlnové délce 405 nm, 488 nm a 633 nm. Byly testovány znaky CD105, CD90, CD73, CD45, CD34, CD 14, CD 19 a HLA-DR. Analýza prokázala pozitivitu znaků (>90% buněk) CD105, CD90 a CD73, zatímco negativitu znaků (< 10 % buněk) HLA-DR, CD45, CD34, CD14 a CD 19. Tyto výsledky odpovídají správnému fenotypu mezenchymálních kmenových buněk a splňují minimální kritéria pro jejich identifikaci podle ISCT (Mezinárodní společnost pro buněčnou terapii).
Příklad 7: Zachování diferenciačního potenciálu pupečníkových MSCs po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu vynálezu
Pupečníkové MSCs, které byly skladovány po dobu 6 dnů způsobem podle vynálezu v roztoku PBS syceném molekulárním vodíkem při cca 4 °C, si zachovaly svou schopnost diferencovat do buněk adipocytů, osteocytů a chondrocytů. Schopnost diferenciace do těchto tří typů buněk je dalším z minimálních kritérií, které musí podle ISCT mezenchymální kmenové buňky splňovat. Buňky získané podle příkladu 1 byly po 6-denním skladování v chladových podmínkách podle příkladu 2 v roztoku PBS syceným molekulárním vodíkem podle příkladu 3 vysazeny na kultivační plast a kultivovány s vhodnými diferenciačními médii. Po 21 dnech byly buňky zafixovány 4% paraformaldehydem v PBS a obarveny olejovou červení, alciánovou modří a alizarinovou červení pro důkaz adipogenní, chondrogenní a osteogenní diferenciace.
- 12CZ2018 -116 A3
Příklad 8: Životnost pupečníkových MSCs uchycených na biologickém nosiči po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu vynálezu
Pupečníkové MSCs byly vysazeny na biologický nosič na bázi PCL nanovláken v hustotě 150 000 buněk/cm2. Po dvoudenní kultivaci byl biologický nosič s buňkami vyjmut z kultivační nádoby, opláchnut roztokem PBS a uložen v prostředku podle příkladu 3 a 3a při teplotě okolo 4 °C. Počet uchycených buněk na biologickém nosiči bylo stanoveno na základě fluorescenčního barvení mikrofilament pomocí phaloidinu a buněčných jader pomocí DAPI. Mikroskopické vyhodnocení obarvených preparátů prokázalo, že po 6-denním skladování v roztoku PBS syceným molekulárním vodíkem bylo na nosiči uchycen o cca 28 % vyšší počet buněk než u nosiče s buňkami skladovaného pouze v roztoku PBS. Předpokládáme, že mrtvé buňky, které ztrácejí schopnost adheze a mění svůj tvar z protáhlého na kulovitý, byly z materiálu vyplaveny během barvicího procesu.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (9)
1. Způsob uchování a transportu živočišných buněk, vyznačující se tím, že se připraví zvolený farmaceutický roztok, zavádí se do něho plynný molekulární vodík H2 do dosažení koncentrace alespoň 0,3 mg/1, v takto upraveném roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se suspendují buňky, takto připravená suspenze se převede do nádoby nepropustné pro molekulární vodík H2, a nádoby obsahující buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se uchovají v chladu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buňky jsou kmenové buňky.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se plynný molekulární vodík H2 zavádí do roztoku do dosažení koncentrace 0,3 až 1,6 mg/L
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se plynný molekulární vodík H2 zavádí do roztoku do dosažení koncentrace 0,5 až 1,5 mg/L
5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že prostřednictvím volby farmaceutického roztoku a volby metody zavádění plynného molekulárního vodíku H2 se nastavuje pH roztoku obsahujícího molekulární vodík H2 v rozmezí 6,3 až 7,8 a celková osmolarita v rozmezí 270 až 350 mOsm/L
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se nastavuje pH roztoku obsahujícího molekulární vodík H2
- 13 CZ2018 -116 A3 v rozmezí 6,9 až 7,4 a celková osmolarita v rozmezí 290 až 310 mOsm/1.
7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádoby obsahující kmenové buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se uchovají při teplotě 2 až 5 8 °C po dobu až 6 dnů.
8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se suspendují kmenové buňky získané z pupečníkové tkáně v množství 5 000 000 až 10 000 000 buněk na mililitr roztoku.
o
9. Způsob podle některého z nároků 2 až 8, vyznačující se tím, že kmenové buňky se uchovají v chladu v roztoku obsahujícím molekulární vodík v přítomnosti nosiče.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-116A CZ2018116A3 (cs) | 2018-03-09 | 2018-03-09 | Způsob uchování živočišných buněk |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-116A CZ2018116A3 (cs) | 2018-03-09 | 2018-03-09 | Způsob uchování živočišných buněk |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2018116A3 true CZ2018116A3 (cs) | 2019-09-18 |
Family
ID=67903492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-116A CZ2018116A3 (cs) | 2018-03-09 | 2018-03-09 | Způsob uchování živočišných buněk |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2018116A3 (cs) |
-
2018
- 2018-03-09 CZ CZ2018-116A patent/CZ2018116A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2663793C2 (ru) | Содержащий трегалозу и декстран раствор для трансплантации клеток млекопитающих | |
| ES2373551T3 (es) | Métodos para usar células derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de afecciones cardiovasculares. | |
| US10104881B2 (en) | Composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids, and plant protein hydrolysates as active ingredients for cryopreservation of stem cells or primary cells | |
| EP2968672B1 (en) | Use of microparticles and endothelial cells with decellularized organs and tissues | |
| US20230247981A1 (en) | Method for obtaining an enriched population of functional mesenchymal stem cells, cells obtained thereof compositions comprising the same | |
| US20120039857A1 (en) | Systems and methods for cardiac tissue repair | |
| JP7686370B2 (ja) | バイオロジカルスキャフォールド、バイオロジカルスキャフォールドを含む製品、及び、その使用方法 | |
| KR101321144B1 (ko) | 줄기세포 초자화 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 초자화 동결보존방법 | |
| ES2807897T3 (es) | Terapia con células madre basada en células madre procedentes de tejido adiposo | |
| JP2018531269A6 (ja) | 脂肪由来幹細胞に基づく幹細胞治療 | |
| KR20190087611A (ko) | 포유동물 세포 동결 보존액 | |
| TWI837281B (zh) | 細胞冷凍保存液及細胞的漸凍方法 | |
| KR20100084620A (ko) | 조직 재생을 위한 세포 조성물 | |
| ES2998510T3 (en) | Solution for the preservation, transport and application of stem cells | |
| CZ2018116A3 (cs) | Způsob uchování živočišných buněk | |
| RU2586952C1 (ru) | Способ лечения печеночной недостаточности | |
| CZ2017396A3 (cs) | Prostředek pro uchování lidských nebo zvířecích buněk při velmi nízkých teplotách a jeho použití | |
| Schwarzkopf et al. | Autospecies and Post–Myocardial Infarction Sera Enhance the Viability, Proliferation, and Maturation of 3D Cardiac Cell Culture | |
| US20190357524A1 (en) | Preservative solution for human stem cells, human stem cell suspension, and method for preserving human stem cells | |
| RU2303631C1 (ru) | Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием | |
| CZ31206U1 (cs) | Prostředek pro uchování lidských nebo zvířecích buněk při velmi nízkých teplotách | |
| Lynes | Implementation of Methods for Cell Therapy Research and Assessment of the Impact of Cryopreservation | |
| Amorim et al. | 32 Tips and Tricks | |
| Bahadori et al. | Cryopreservation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells by two conventional and open-pulled straw vitrification methods | |
| Awan | Cryopreservation of Hydrogel Encapsulated Spheroids |