CZ202030A3 - Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny - Google Patents
Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ202030A3 CZ202030A3 CZ202030A CZ202030A CZ202030A3 CZ 202030 A3 CZ202030 A3 CZ 202030A3 CZ 202030 A CZ202030 A CZ 202030A CZ 202030 A CZ202030 A CZ 202030A CZ 202030 A3 CZ202030 A3 CZ 202030A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- molecule
- acid molecule
- host cell
- transferred
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 112
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 101
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 98
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims description 24
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims description 24
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 9
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 8
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 claims description 4
- 101100278588 Ramazzottius varieornatus Dsup gene Proteins 0.000 claims description 3
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 48
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 28
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 23
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 5
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 3
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 3
- 101100026178 Caenorhabditis elegans egl-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- -1 RNA-DNA hybrids Chemical class 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010005622 beta-lactamase KPC-2 Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710082494 DNA protection during starvation protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101710187252 Damage suppressor protein Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091006975 Iron transporters Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Předložený vynález se týká zejména způsobu úpravy molekuly nukleové kyseliny pro její efektivní přenos do prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Molekula nukleové kyseliny (NK) upravená podle vynálezu představuje nereplikativní element obsahující kódující či nekódující molekulu NK. Způsob úpravy molekuly NK spočívá v tom, že se k jedné straně molekuly NK připojí vlásenková struktura a k druhé straně se připojí transportní molekula, která snadno proniká biologickými bariérami. Dále se vynález týká upravené molekuly NK, tedy molekuly NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, upravené způsobem podle vynálezu. Předložený vynález se také týká způsobu přenosu požadované molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky, kdy se požadovaná molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, upraví způsobem podle vynálezu a takto upravené molekula se uvede do kontaktu s buňkou, do které má být požadovaná molekula nukleové kyseliny přenesena. Předložený vynález poskytuje vysoce efektivní prostředky pro oblast genového inženýrství. Velmi jednoduchým a ekonomicky výhodným řešením je možné vnášet molekuly NK do buněk.
Description
Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny
Oblast techniky
Předkládaný vynález poskytuje velice účinný prostředek pro genový přenos. Tato skutečnost je dána způsobem úpravy molekuly nukleové kyseliny (transgenu) pro její efektivní přenos do prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Molekula nukleové kyseliny (NK) upravená podle vynálezu představuje nereplikativní element obsahující kódující či nekódující molekulu NK. Po přenosu takto modifikované NK do buňky může dojít k efektivnímu přímému ovlivnění funkcí buňky zásahem do její fýziologie. V oblasti prokaryotických buněk může být systém využit k inhibici růstu mikrobů in vivo, omezení virulence inhibicí příslušných genů, inhibici exprese genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům případně odstranění plazmidů nesoucích geny virulence nebo rezistence (terapeutické využití). U eukaryotických buněk může systém ovlivnit fúnkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina-protein. Tato vlastnost může být využita v oblasti inhibice růstu nádorových buněk, k ovlivnění produkce signálních proteinů, protilátek a k dalšímu ovlivnění buněk imunitního systému. Další možností je využití se systémy editace genomu (např. CRISPR/Cas9). Tyto vlastnosti mohou být rovněž využity v laboratorních podmínkách in vitro a pro terapeutické účely in vivo. U obou typů buněk mohou být na základě předloženého vynálezu vytvořeny další aplikace.
Dosavadní stav techniky
Přijetí exogenní genetické informace buňkou je jedním ze základních kroků biotechnologie a genového inženýrství. Exogenní genetická informace je do eukaryotické nebo prokaryotické buňky vnesena procesem zvaným transfekce (eukaryotické buňky), resp. horizontálním přenosem genetické informace (prokaryotické buňky). V případě prokaryotických buněk horizontální přenos genetické informace zahrnuje vnesení nukleové kyseliny metodou transformace (vnesení extracelulámí neupravené nukleové kyseliny), transdukce (vnesení nukleové kyseliny bakteriofágem), konjugace (přenos mobilních genetických elementů mezi donorovou a recipientní bakteriální buňkou). V laboratorních podmínkách se pro vnesení nukleové kyseliny do prokaryotické buňky nej častěji používá systém transformace, při němž je exogenní genetická informace vpravena do kompetentních buněk. Z terminologického hlediska nebývá u eukaryotických buněk proces označován jako transformace, neboť tím je myšlena přeměna normálních buněk v buňky nádorové. V dalším textuje pro vnesení genetické informace do obou typů buňky (prokaryotické i eukaryotické) používán obecný termín transformace. Efektivita prostupu nukleových kyselin do buňky může být zvýšena chemickými látkami nebo fyzikálními metodami. Mezi ně může patřit prostup nukleové kyseliny přes póry nebo permeabilizací buněčné membrány.
Pro zajištění transformace eukaryotických buněk a v některých případech i prokaryot v podmínkách in vivo jsou používány metody vnesení genetické informace viry nebo způsoby nevirových přenašečů (Sung Y.K., Kim S.W. Recent advances in the development of gene delivery systems, Biomater. Res., 2019, 12; 23:8). V případě virových vektorů se obvykle jedná o defektní partikule, neschopné samostatné replikace a tím i nekontrolovatelné replikace vnášené genetické informace. Především jsou využívány retro viry, adenoviry a herpes simplex viry u eukaryot a bakteriofágy u prokaryot. Skupina nevirových vektorů zahrnuje metody fýzikální a chemické. Jako příklad fyzikálních metod lze jmenovat injektáž NK pomocí jehly, při níž je nukleová kyselina vnesena přímo do buňky jehlou, balistickou metodu, která využívá vnesení NK obvykle na zlatých nanočásticích, sonoporaci, vnesení nukleových kyselin pomocí ultrazvuku, výše zmíněnou elektroporaci, fotoporaci prostřednictvím laseru, magnetickou poraci při níž je nukleová kyselina vázána na magnetické částice, nebo hydroporaci. K efektivnímu průniku do buněk je dále využíváno spojení nukleové kyseliny a chemického nosiče (molekula/polymer), který umožní
- 1 CZ 2020 - 30 A3 efektivní prostup přes cytoplazmatickou membránu. Mezi chemické nosiče patří anorganické částice (křemík, zlato, měď, stříbro, železo apod.), biologicky odbouratelné částice (kationtové lipidy, peptidové vektory) a polymery (polyetylenimin, polymetakrylát apod.) a další. Současný intenzivní výzkum chemických nosičů je zaměřen například na molekuly s kladným nábojem (např. zmíněné polymery), které umožní prostup záporně nabité nukleové kyselině. Spojení s kladně nabitými polysacharidy, případně krátkými peptidy, které jsou používány především pro transformaci prokaryot (Sung Y.K., Kim S.W. Recent advances in the development of gene delivery Systems, Biomater. Res., 2019, 23:8; Ferrer-Miralles N., Vázquez E., Villaverde A. Membrane-active peptides for non-viral gene therapy: Making the safest easier. Trends Biotechnol. 2008, 26(5): 267-275). Krátké molekuly nukleových kyselin nebo jejich analogů mohou být do buňky vneseny i pomocí některých esenciálních látek, např. kobalaminu nebo železa (Rownicky M., Wojciechowska M., Wierzba A.J., Czamecki J., Bartošík D., Gryko D., Trylska J. Vitamin B12 as a carrier of peptide nucleic acid (PNA) into bacterial cells. Scientific Reports., 2017, 7(1): 7644; Giedyk M., Jackowska A., Rownicky M., Kolanowska M., Trylska J., Gryko D. Vitamin B12 transports modified RNA into E. coli and S. Typhimurium cells. Chemical Communications. 2018, 55(6): 763-766.).
Dosud známé techniky neposkytují dostatečnou efektivitu transformace buněk. Tyto systémy v běžných podmínkách obtížně odolávají prostředí s nukleázami a proteázami a také nesnadno pronikají bariérami, případně mohou vést k nežádoucí imunitní odpovědi (např. virové částice). Pokud není na nukleovou kyselinu vázána transportní molekula, je prostup přes membrány u většiny buněk zanedbatelný a nelze proto neupravenou nukleovou kyselinu využít ke genovému přenosu do cílových buněk.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález eliminuje výše uvedené nedostatky známých metod tak, aby byla zvýšena účinnost a bezpečnost genového přenosu. Jedná se zejména o úpravy molekuly NK, která má být použita k transformaci hostitelské buňky (tj. vnesena do buňky), kdy se k jedné straně molekuly NK připojí vlásenková struktura a k druhé straně se připojí transportní molekula, která snadno proniká biologickými bariérami a dle volby transportní molekuly má neimunogenní vlastnosti. Připojení vlásenkové struktury nukleové kyseliny na jednu stranu přenášené molekuly NK a vazba transportní molekuly na 5‘, případně 3‘ konec NK na druhé straně molekuly zajišťuje stabilitu popsaného komplexu. Volný 3‘ nebo 5‘ konec může být rovněž modifikován. Tím je zajištěna rezistence proti běžným nukleázám a využitelnost v podmínkách in vivo.
Nukleová kyselina, která má být přenesena do hostitelské buňky, transportní molekula a vlásenková struktura nukleové kyseliny tvoří základní komponenty upravené molekuly NK, tj. molekuly NK upravené pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky.
Výhodnou vlastností výše uvedené upravené molekuly nukleové kyseliny je, že se nejedná o replikativní element, tzn. nedojde k integraci NK do genomu buňky a následnému přenosu do dalších generací. Tím je u předkládaného vynálezu omezeno riziko nepredikovatelných zásahů do genomu a tím zvýšená bezpečnost technologie.
Účinnost může být regulována koncentrací upravených molekul nukleové kyseliny v kompartmentu účinku, případně specifickou transportní molekulovou umožňující selektivní přenos do konkrétních buněk.
Systém transformace podle vynálezu může být využit u prokaryotických buněk k inhibici růstu mikrobů invivo, omezení virulence inhibici příslušných genů, inhibici exprese genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům, případně odstranění plazmidů nesoucích geny virulence nebo rezistence. U eukaryotických buněk může systém ovlivnit funkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina- protein. Tato vlastnost může být
- 2 CZ 2020 - 30 A3 využita k inhibici růstu nádorových buněk a k ovlivnění produkce signálních proteinů, imunoglobulinů apod. U obou typů buněk mohou být na základě znalosti předloženého vynálezu a znalostí odborníků v příslušném oboru vytvořeny další aplikace.
Předkládaný vynález je vysoce efektivním prostředkem v oblasti genového inženýrství. Velmi jednoduchým a ekonomicky výhodným řešením je možné vnášet molekuly nukleových kyselin (NK) do buněk. Molekula NK, která má být přenesena do buněk, jev tomto vynálezu označována také jako transgen.
Předmětem předkládaného vynálezu je zejména způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny (NK), která má být přenesena do buňky, aby tam byla exprimována, transkribována, překládána nebo interagovala s RNA, DNA či proteiny. Nukleovou kyselinou se zde rozumí deoxyribonukleová kyselina (DNA) nebo ribonukleová kyselina (RNA). Nukleovou kyselinou se rozumí i modifikovaná DNA nebo RNA, které zahrnují různé typy nukleových kyselin, včetně RNA-DNA hybridů, PNA (peptidová nukleová kyselina / peptide nucleic acid), LNA (uzamčená nukleová kyselina / locked nucleic acid), morfblino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených. Nukleové kyseliny uvažované v rámci tohoto dokumentu mohou být složeny ze zcela nativních nukleotidů nebo mohou obsahovat nepřírodní báze či nukleotidy (např. syntetické či upravené), které mohou být spárovány s nativními nukleotidy nebo s chemicky shodnou nebo jinou nepřírodní bází (nukleotidem). Jakákoliv z výše uvedených molekul, tvořící dvouřetězcový (double-strand, ds) fragment NK tedy může být transgenem (přenášenou molekulou), bez ohledu na to, zda se j edná nebo nej edná o „gen“ v klasické definici (DNA kóduj ící protein). DvouřetězcováNK zahrnuje i částečně dvouřetězcovouNK, tedy fragment NK sestávající ze dvou řetězců, které hybridizují jen v části své délky. V případě, že je požadován přenos molekuly primárně jednořetězcové NK (např. různé typy RNA, jako mRNA), tato molekula se snadno převede na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou NK postupy, které jsou odborníkovi známé.
Způsob podle vynálezu spočívá v tom, že se transgen modifikuje tak, že se k jednomu konci molekuly transgenu připojí vlásenková struktura a na 5’ nebo 3’ konec druhé strany se vhodným procesem připojí transportní molekula, tj. molekula, která umožňuje vstup upravené molekuly NK do buňky. Volný konec (3‘ nebo 5‘ konec) druhé strany může být rovněž modifikován, například nukleotidem modifikovaným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou, invertovaným nukleotidem apod. Vlásenková struktura zajišťuje stabilitu celé upravené molekuly nukleové kyseliny vůči nukleázám. Zároveň zajišťuje linearizaci fragmentu nukleové kyseliny vstupujícího do buňky. Lineární řetězec nukleové kyseliny snáze penetruje buněčnou stěnou a zvyšuje efektivitu vstupu transgenu v porovnání s dvouvláknovou NK. Upravená molekula NK ve svém výhodném uspořádání rovněž vykazuje vyšší odolnost oproti jednovláknové (nekomplementámí) nukleové kyselině. Tím je zvýšena efektivita transformace buněk. Molekula NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, upravená způsobem podle vynálezu, vytváří upravenou molekulu NK kyseliny uzpůsobenou pro efektivní vstup přenášené nukleové kyseliny do hostitelské buňky.
Jako transportní molekulu lze s výhodou použít jakýkoliv vhodný transportér, na příklad kobalamin (vitamin B12), železné nanočástice, stříbrné nanočástice, zlaté nanočástice, krátké transportní peptidy, transportní polymery, siderofory zajišťující transport pomocí transportérů železa a podobně, jak je známo ze stavu techniky. Transportní molekula se připojí kjedné straně přenášené nukleové kyseliny, jak bylo uvedeno výše.
Připojení vlásenkové struktury je důležité z hlediska jistého průniku jednovláknové nukleové kyseliny. Při absenci vlásenkové struktury proniká u většiny buněk do cytoplazmy pouze jedno vlákno (s přítomností transportní molekuly) z dvouvláknové NK. Tím není v buňce k dispozici genetická struktura, která by umožňovala transkripci. Tato struktura je z pravidla poměrně rychle degradována. Další výhodou připojené vlásenkové struktury je zvýšení odolnosti vůči ribonukleázám/deoxyribonukleázám, ať již na úrovni extracelulámího prostoru, nebo cytoplazmy.
- 3 CZ 2020 - 30 A3
Vlásenková struktura obsahuje dvě části - krček a smyčku, kdy krček je tvořen dvěma inverzně komplementárními úseky (invertované repetice) na koncích (lineární) molekuly a smyčka je tvořena úsekem mezi invertovanými repeticemi. Velikost smyčky vlásenkové struktury může být variabilní o velikosti minimálně 3 nukleotidů (bází) a nejvýše 25 nukleotidů (bází), neboťje známé, že vlásenková struktura o velikosti vyšší než 25 bází snižuje stabilitu celé struktury vůči vnějším fýzikálně-chemickým vlivům. Výhodně je úsek krčku velikosti 2 až 10 párů nukleotidů (párů bází, bp) a úsek smyčky 4 až 25 bází (nukleotidů). Vlásenková struktura může být tvořena, např. opakujícím se adeninem nebo thyminem, dobře známými stabilními sekvencemi, např. TTCG, TACG, TTTG, GCTT, nebo dalšími sekvencemi vykazujícími stabilitu.
Strana, na které je přítomen volný 5 ‘ a 3 ‘ konec (tj. strana, kde není navázána vlásenková struktura) molekuly transgenu (5’ a 3‘), může být modifikována. S výhodou se na 5‘ nebo 3‘ konec naváže transportní molekula vybraná z molekul uvedených výše. Druhý konec (3‘ nebo 5‘) lze zakončit modifikovaným nukleotidem. Například modifikace fosfátu či připojení aminoskupiny zajišťuje lepší stabilitu vůči exonukleázám, případně lze tento konec ponechat nemodifikovaný. Celý řetězec může být zcela komplementární, případně v oblasti obou konců mohou být obsaženy nekomplementámí sekvence. Uspořádání s částečnou nekomplementámí sekvencí může být využito především pro RNA a analogy nukleových kyselin. V tomto případě je transportní molekula vázána na různě dlouhé lineární vlákno, které pokračuje vlásenkovou strukturou v klasickém uspořádání (krček se dvěma inverzně komplementárními úseky a vlastní smyčka).
Efektivitu denaturace dvouvláknové nukleové kyseliny (tj. linearizace upravené molekuly transgenu - rozpojení vazeb mezi komplementárními nukleotidy vlásenky a připojené NK) lze zvýšit navázáním helikázy na molekulu NK (in vivo i in vitró), která má být přenesena do buňky. Helikáza může být navázána na strukturu zajištující transport transgenu (in vitro). Helikáza se může aktivovat až v blízkosti cílové buňky a zajistí tak denaturaci čili linearizaci před vstupem do buňky. Tím dochází k dalšímu zvýšení efektivity celého prostupu oproti dosud známým řešením.
Pro zvýšení stability vůči vnějším vlivům (fyzikálně-chemické vlivy) nebo endonukleázám lze molekulu transgenu ochránit navázáním vhodných proteinů. Např. SspC (smáli acid-soluble spore protein C). Tyto proteiny mohou být připraveny rekombinantně ze sporulujících bakterií, například Bacillus subtilis. Dalším příkladem jsou proteiny Dsup (damage- suppressor protein), které zajišťují vyšší odolnost NK vůči radiaci, DNA protection during starvation protein chránící NK před oxidační zátěží.
Nukleová kyselina, která se přenese do buňky využitím způsobu úpravy podle vynálezu, slouží k ovlivnění fýziologie buňky různými způsoby. K tomu mohou být využity různé mechanizmy, jako například regulace exprese na základě komplementarity sekvence. Dále může ve výhodném provedení docházet k transkripci do mRNA, která může být kódující či nekódující. Kódující RNA může být buňkou použita k translaci a vzniku žádaného peptidu/proteinu. Nekódující RNA může být s výhodou navržena a syntetizována tak, aby například aktivovala komplex RISC (z angl. RNAinduced silencing complex), který poté degraduje mRNA vzniklou při transkripci. Jinou možností je vnesení specifické molekuly, která je endoribonukleázou Dicer rozštěpena na malé fragmenty RNA. V dalším možném provedení lze využít vnesenou NK k zajištění specifické interakce s molekulami obsaženými v buňce, například peptidy/proteiny. Kromě kódujících sekvencí a promotoru lze do přenášené molekuly NK zařadit i další krátké sekvence, které mohou sloužit k regulaci exprese případně k lepšímu nasednutí a funkci DNA-dependentní RNA polymerázy. Další možností je zařazení oddělovací sekvence mezi transportní molekulu atransgen. Tato oddělovací sekvence může sloužit k lepšímu nasednutí DNA polymerázy na sekvenci promotoru. Případně se může jednat o specifickou sekvenci, kteráje štěpena intracelulámími endonukleázami. Tím v buňce dojde k oddělení transgenu od transportní molekuly. Tato vlastnost může být například použita ke zvýšení průniku transgenu do jádra eukaryotické buňky.
Při intemalizaci upravené molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu dojde primárně k prostupu transportní molekuly do cytoplazmy buňky s následnou intemalizaci nukleové kyseliny. Ta proniká
- 4 CZ 2020 - 30 A3 ve formě jednovláknové NK s možnou následnou hybridizací komplementárních částí a vytvoření dvouvláknové NK se schopností transkripce genetické informace (pokud je transgenem DNA obsahující otevřený čtecí rámec, kterému předchází promotor, popřípadě zesilovač) nebo může sama hybridizovat s cílovou strukturou (molekula DNA, mRNA, proteinu apod.). V případě některých transportních molekul, které neprochází membránou přes specifické póry (např. nanočástice některých kovů), může docházet k prostupu NK bez nutnosti rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi (denaturace). V případě, že transgenem je molekula kódující RNA, tj. mRNA, tato může být přímo buňkou použita k translaci a vzniku žádaného peptidu/proteinu. Pokud je transgenem jedno vláknová nekódující RNA, po vstupu do buňky je vyhledána komplementární RNA sekvence, se kterou je vytvořen dimer. Poté dochází k degradaci mRNA systémem RISC (z angl. RNA-induced silencing complex).
Upravená molekula NK podle vynálezu, tj. molekula NK upravená výše naznačeným způsobem, může být vnesena do eukaryotických i prokaryotických buněk (např. HeUa, CHO, BGM nebo, např. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus). Do buňky může být jakožto transgen vnesena jakákoliv informace kódující či nekódující. Informace kódující geny peptidů/proteinů, která je následně v buňce exprimována, a může tím ovlivňovat různé funkce v buňce. Transgen může také kódovat antisense RNA, tedy RNA, která není překládána do peptidu/proteinu, ale která působí například jako transkripční inhibitor systémem RISC. Výhodou předmětné struktury NK je skutečnost, že nedochází k její replikaci, tzn. nedochází k přenosu na dceřiné buňky a tím k nepredikovatelnému zásahu do genetické informace. Jako příklad ovlivnění prokaryotické buňky lze jmenovat toxický efekt na buňku, inhibice exprese genů zodpovědných za virulenci, inhibice genů zodpovědných za rezistenci k antibiotikům, odstranění plazmidů inhibicí jejich replikačního systému. U eukaryotických buněk může transgen ovlivnit funkci buňky regulací exprese případně dalšími interakcemi v buňce, např. interakcí nukleová kyselina-protein. Tato vlastnost může být využita k inhibici růstu nádorových buněk, k ovlivnění produkce signálních proteinů, imunoglobulinů a k dalšímu ovlivnění buněk imunitního systému. Další možností je i využití transgenu k editaci genomu eukaryotické buňky, například spojením se systémem CRISPR/Cas9. Další aplikace jsou známé expertům v daném oboru s cílem potlačení patologického působení mikrobů a ovlivnění patologických buněčných procesů.
Předložený vynález se zejména týká způsobu úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy na molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo je na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, se na jednu stranu na 3 ’a 5 ’ konec naváže vlásenková struktura nukleové kyseliny, a na druhou stranu molekuly nukleové kyseliny se na 5 ’ nebo 3 ‘ konec řetězce nukleové kyseliny naváže transportní molekula. Přitom molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly funkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.
Vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů. Transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.
Výhodně může být mezi požadovanou molekulu nukleové kyseliny a transportní molekulu vložena oddělovací sekvence, která může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. Výhodně se 3‘ nebo 5’ volný konec bez transportní molekuly modifikuje pro ochranu proti účinkům nukleáz nukleotidem modifikovaným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou nebo invertovaným nukleotidem či jinou strukturou zabraňující působení nukleáz.
- 5 CZ 2020 - 30 A3
Hostitelskou buňkou je buňka prokaryotická nebo eukaryotická.
Předložený vynález se také týká upravené molekuly nukleové kyseliny, tj. molekuly nukleové kyseliny upravené pro usnadnění jejího přenosu do hostitelské buňky, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo byla na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, vlásenkovou strukturu nukleové kyseliny, navázanou na jednu stranu přenášené molekuly nukleové kyseliny, a transportní molekulu navázanou na druhou stranu přenášené molekuly na 5' nebo 3‘ konec nukleotidového řetězce. Molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, j ej ich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly funkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami. Vlásenková struktura nukleové kyseliny ve výše popsané upravené molekule nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů. Transportní molekulou v uvedené upravené molekule nukleové kyseliny je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.
Výhodně upravená molekula nukleové kyseliny dále obsahuje navázanou helikázu. V jiném provedení výhodně obsahuje alespoň jeden protein vybraný ze Ssp a Dsup navázaný na molekulu nukleové kyseliny.
Předložený vynález se také týká způsobu přenosu molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky, kdy se molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, upraví výše popsaným způsobem a takto upravená molekula se uvede do kontaktu s buňkou, do které má být požadovaná molekula nukleové kyseliny přenesena.
Objasnění výkresů
Obrázek č. 1: Schematické znázornění molekuly NK (transgenu), která má být přenesena do hostitelské buňky, s připojenou transportní molekulou (TM), vlásenkovou strukturou a modifikovaným volným koncem (M) například aminoskupinou.
Obrázek č. 2: Kombinace upravené molekuly NK (transgenu s připojenou transportní molekulou (TM) a vlásenkovou strukturou) s helikázou pro usnadnění vstupu do buňky prostřednictvím převedení na jedno vláknovou NK. Transgenem je v tomto případě dvouřetězcová DNA obsahující otevřený čtecí rámec, kterému předchází regulační sekvence a promotor, případně se zesilovačem. Transgen může být dále doplněn vícečetným klonovacím místem (multiple cloning sítě). Mezi promotorem/zesilovačem a transportní molekulou je umístěna oddělovací sekvence.
Obrázek č. 3: Molekula NK, která má být přenesena do hostitelské buňky, s připojenou transportní molekulou (TM) a vlásenkovou strukturou a navázanými proteiny za účelem ochrany NK před fýzikálními, chemickými, fýzikálně-chemickými, biologickými vlivy včetně účinků ribonukleáz/deoxyribonukleáz.
Obrázek č. 4: Příklady upravené molekuly NK podle vynálezu obsahující expresní systém dvoušroubovice NK, transportní molekulu (TM) a vlásenkovou strukturu. Expresní systém obsahuje otevřený čtecí rámec, regulační sekvenci a promotor, případně se zesilovačem. Dále může být doplněn vícečetným klonovacím místem. Obsahuje také oddělovací sekvenci mezi promotorem/zesilovačem a transportní molekulou. Expresní systém může být umístěn v komplexu NK podle vynálezu ve dvou orientacích.
-6CZ 2020 - 30 A3
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou vitaminu B12 do buněk Escherichia coli
Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (bla^c-i) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č. GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém 5‘ konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. (invertované repetice vytvářející krček jsou podtrženy). Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.
Vitamín B12 byl rozpuštěn v 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním 0,lN roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifugován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru 1:1 s roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.
Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 pl DNA o koncentraci 25 ng/|pl rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitamin B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 h při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifůgačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.
Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.
Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^cbyla prokázána.
Příklad 2
Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou nanočástice železa do Escherichia coli
Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (bla^c-i) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č.
- 7 CZ 2020 - 30 A3
GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém 5‘ konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.
Komerčně dostupné 5nm částice oxidu žele žitého fimkcionalizované N-hydroxysukcinimid esterem (NHS ester) byly použity k navázání na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou inkubací 12 hodin při pokojové teplotě v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5.
Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.
Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^cbyla prokázána.
Příklad 3
Vnesení genu beta-laktamázy typu KPC-2 s vlásenkovou strukturou a transportní molekulou nanočástice zlata do Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa
Gen pro beta-laktamázu KPC-2 (bla^c-i) s vlastním promotorem byl amplifikován z templátu č. GenBank MF497781.1 pomocí oligonukleotidů 5‘-TCAGGGGTAAAGTGGGTCAG-3‘ (oligonukleotid Ol) a 5‘-GTGGTTGGTAATCCATGCCG-3‘ (oligonukleotid 02). Oligonukleotid 1 byl na svém konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 2 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170 bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.
Komerčně dostupné 5nm částice zlata fimkcionalizované N-hydroxysukcinimid esterem (NHS ester) byly použity k navázání na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou inkubací 12 hodin při pokojové teplotě v 50mM kyselině 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES).
Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|ml) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury (AODeoonm = 0,2) Escherichia coli TOP 10 nebo Klebsiella pneumoniae nebo Pseudomonas aeruginosa s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.
Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů ATCTGACAACAGGCATGACG (oligonukleotid RT1) a GCGCGGCGATGAGGTAT (oligonukleotid RT2). Možnost kontaminace DNA byla ověřena
-8CZ 2020 - 30 A3 pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT1 a RT2 s negativním výsledkem. Exprese genu bla^c-2 byla prokázána.
Příklad 4
Vnesení syntetického genu kódujícího bradykinin do prokaryotických buněk
DNA kódující bradykinin spolu s promotorem inserční sekvence ISEcpl (sekvence č. CP046445.1, GenBank) byla syntetizována komerčně dostupnou službou ve struktuře oligonukleotidů:
03: 5 ‘-GCAGTCTAAATTCTTCGTGAAATAGTGATTTTTGAAGCTAATAAAAAACAC
ACGTGGAATTTAGGTTTCATTCTGGCGACGTCCGTATTTGCCTTTCGGAAGCATAA
AATCGGACGCGTTGTGGCTCGCTTCAGGTAAAATATTGACTATTCATGTTGTTGTT
ATTTCGTCTCTTCCAGAATAAGGAATCCC-3ý
04: 5 - ATGCGTCCTCCTGGTTTTTCTCCTTTTCGTTA A ATGTCTCTAAAA ACA A A A A
AAAACGTTGTTGTTGTTGAGAGACATTTAACGAAAAGGAGAAAAACCAGGAGGA
CGCATGGGATTCCTTATTCTGGAAGAGACGAAATAA-34,
05: 5 ‘-CAACAACATGAATAGTCAATATTTTACCTGAAGCGAGCCACAACGCGTCC
GATTTTATGCTTCCGAAAGGCAAATACGGACGTCGCCAGAATGAAACCTAAATTC
CACGTGTGTTTTTTATTAGCTTCAAAAATCACTATTTCACGAAGAATTTAGACTGC -3‘. Konec 5‘ oligonukleotidů 03 byl modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), konec 5‘ oligonukleotidů 04 a 05 byl modifikován vazbou fosfátu. V reakční směsi bylo smícháno 10 μΐ vodného roztoku každého oligonukleotidů o koncentraci 0,1 mmol/1 spolu s T4 DNA ligázou a inkubováno při 8 °C po dobu 12 h.
Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘-ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.
Jako transportní molekula byl užit vitamín B12. Vitamín B12 byl rozpuštěn v 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním O,1N roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifůgován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru 1:1 s roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.
Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 μΐ DNA o koncentraci 25 ng/|pl rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitaminu B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 hodiny při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifugačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.
-9CZ 2020 - 30 A3
Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 pl o koncentraci DNA 25 ng/|ml) byla přidána ke 100 μΐ rostoucí kultury Escherichia coli TOP 10 (AODeoonm = 0,2) s následnou kultivací 2 hodiny. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fyziologického roztoku. DNA byla izolována komerčním kitem.
Přítomnost nukleové kyseliny v buňce byla ověřena pomocí PCR v reálném čase s barvou SYBR green za použití oligonukleotidů TTCGTGAAATAGTGATTTTTGAAGC (oligonukleotid RT3) a AGAAAAACCAGGAGGACGCA (oligonukleotid RT4). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT3 a RT4 s negativním výsledkem. Přítomnost genu kódujícího bradykinin v buňkách E. coli byla prokázána.
Příklad 5
Vnesení genu GFP (Green Fluorescent Protein) do eukaryotických buněk
Pro amplifikaci cílové sekvence byl použit plazmid pcDNA3-EGFP (plasmid #13031, Addgene) s genem proteinu EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) a promotorem CMV. Molekula DNA byla amplifikována pomocí oligonukleotidů 5‘-CTTGTGTGTTGGAGGTCGCT-3‘ (oligonukleotid 06) a 5‘-AACAACAGATGGCTGGCAAC-3‘ (oligonukleotid 07). Oligonukleotid 06 byl na svém konci modifikován aminoskupinou (C6 amino-modifier), oligonukleotid 07 byl na svém 5‘ konci modifikován molekulou fosfátu. PCR produkt o velikosti 1170bp byl přečištěn (zbavení PCR reakční směsi a oligonukleotidů) a vizualizován pomocí gelové elektroforézy. Následně byla provedena ligace pomocí DNA ligázy vlásenkové struktury k přečištěnému PCR produktu o sekvenci 5‘ATGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGACAT-3‘. Vlásenková struktura byla na 5’ konci modifikována molekulou fosfátu.
Vitamín B12 byl rozpuštěn v 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové a inkubován při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin. Tímto postupem je zajištěna parciální hydrolýza vitaminu B12 za vzniku karboxylových skupin na postranních řetězcích molekuly. Následně byl roztok neutralizován přidáním 0,lN roztoku hydroxidu sodného s výsledným pH 7,5. Vitamin B12 s vytvořenými karboxylovými skupinami byl purifikován pomocí extrakce fenolem s následným odstraněním fenolu pomocí chloroformu a etheru. Neutralizovaný roztok byl smíchán s vodou nasycenou fenolem v poměru 1:1. Roztok byl důkladně protřepán a centrifůgován k oddělení fází. Vodná fáze byla smíchána v poměru 1:1 s roztokem acetonu s etherem (1:3). Vodná fáze byla následně 2x promyta roztokem acetonu s etherem. Následně byla vodná fáze s modifikovaným vitaminem B12 lyofilizována. V další možné variantě byla purifikace provedena pomocí sorbentu Amberllte XAD.
Vazba na PCR produkt s ligovanou vlásenkovou strukturou byla provedena ligací prostřednictvím EDC (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid) tak, že k 20 μΐ DNA o koncentraci 25 ng/|pl rozpuštěné ve vodě bylo přidáno 20 μΐ modifikovaného vitamin B12 o koncentraci 0,5 mmol/1 rozpuštěného v pufiru kyseliny 2-(N-morfolino)-ethansulfonové (MES) o koncentraci 50 mmol/1, pH 4,5. Směs byla následně přidána k 7 mg EDC a ponechána inkubovat 4 hodiny při pokojové teplotě. Poté byl nenavázaný vitamin B12 a EDC odstraněn pomocí promytí na centrifugačních filtračních kolonkách schopných zachytit látky o relativní molekulové hmotnosti > 10 000.
Struktura s navázanou transportní molekulou (125 ng; 5 μΐ o koncentraci DNA 25 ng/|pl) byla přidána ke 200 μΐ kultury BGM Cell Line (buněčná linie opičích ledvin, Sigma-Aldrich. kat. č. 90092601) v kultivačním médiu (EMEM (Minimum Essential Medium Eagle) + 2mM L-Glutamin + 1% NEAA (Non-essential Amino Acid Solution) + 10% FBS / FCS (Fetal Bovine Sérum)) s následnou inkubací 8 hodin. Buňky byly následně promyty 3x 1 ml fýziologického roztoku. RNA byla izolována komerčním kitem s obsaženým krokem odstranění RNA pomocí RNázy.
Exprese byla ověřena pomocí reverzní transkripce s následnou PCR v reálném čase s barvou SYBR
- 10 CZ 2020 - 30 A3 green za použití oligonukleotidů 5‘-CACAAGTTCAGCGTGTCCG-3‘ (oligonukleotid RT5) a 5‘TTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3 ‘ (oligonukleotid RT6). Možnost kontaminace DNA byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů RT5 aRT6 s negativním výsledkem. Exprese genu EGFP v buňkách BGM byla prokázána.
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadnění jejího přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy na molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě neboje na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, se na jednu stranu na 3’ a 5’ konec naváže vlásenková struktura nukleové kyseliny, a na druhou stranu molekuly nukleové kyseliny se na 5 ’ nebo 3 ‘ konec řetězce nukleové kyseliny naváže transportní molekula.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, j ej ich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly fúnkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že mezi molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, a transportní molekulu se vloží oddělovací sekvence, která může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová.
- 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že 3‘ nebo 5’ volný konec bez transportní molekuly se modifikuje pro ochranu proti účinkům nukleáz nukleotidem modifíkovným 2'-O-methoxyethylem, fosforothioátovou vazbou, nukleotidem modifikovaným aminoskupinou nebo invertovaným nukleotidem či jinou strukturou zabraňující působení nukleáz.
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka prokaryotická nebo eukaryotická.
- 8. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky a která je ve dvouřetězcové formě nebo částečně dvouřetězcové formě nebo byla na dvouřetězcovou nebo částečně dvouřetězcovou formu převedena, vlásenkovou strukturu nukleové kyseliny, navázanou na jednu stranu přenášené molekuly nukleové kyseliny, a transportní molekulu navázanou na druhou stranu přenášené molekuly na 5’ nebo 3‘ konec nukleotidového řetězce.
- 9. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle nároku 8, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, je DNA nebo RNA včetně RNA-DNA hybridů, peptidová nukleová kyselina, uzamčená nukleová kyselina, morfolino a další hybridy, analogy, jejich deriváty a kombinace kterékoli z výše uvedených a jiné molekuly funkčně shodné s přirozeně se vyskytujícími nukleovými kyselinami.- 12 CZ 2020 - 30 A3
- 10. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že vlásenková struktura nukleové kyseliny je tvořena smyčkou a krčkem, kde smyčka má velikost 3 až 25 nukleotidů a krček má velikost 2 až 10 párů nukleotidů.
- 11. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že transportní molekulou je vitamin B12, železná nanočástice, stříbrná nanočástice, zlatá nanočástice, krátký transportní peptid, siderofor, polymer, polysacharid či jiná molekula, která zvyšuje účinnost průniku nukleové kyseliny intracelulámě.
- 12. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje navázanou helikázu.
- 13. Molekula nukleové kyseliny upravená pro usnadnění přenosu do hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden protein vybraný ze Ssp a Dsup navázaný na molekulu nukleové kyseliny.
- 14. Způsob invitro přenosu molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny, která má být přenesena do hostitelské buňky, se upraví způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 a takto upravená molekula se uvede do kontaktu s hostitelskou buňkou, do které má být molekula nukleové kyseliny přenesena.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ202030A CZ202030A3 (cs) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny |
| PCT/CZ2021/050006 WO2021148063A1 (en) | 2020-01-20 | 2021-01-18 | Method of modifying a nucleic acid molecule to facilitate its transfer into host cells and the modified nucleic acid molecule |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ202030A CZ202030A3 (cs) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ308738B6 CZ308738B6 (cs) | 2021-04-14 |
| CZ202030A3 true CZ202030A3 (cs) | 2021-04-14 |
Family
ID=74858165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ202030A CZ202030A3 (cs) | 2020-01-20 | 2020-01-20 | Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ202030A3 (cs) |
| WO (1) | WO2021148063A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3854419A1 (en) * | 2020-01-24 | 2021-07-28 | Univerzita Karlova, Lekarska fakulta v Plzni | Dna conjugate and method of transformation of genes into cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9803099D0 (sv) * | 1998-09-13 | 1998-09-13 | Karolinska Innovations Ab | Nucleic acid transfer |
| WO2005062854A2 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-14 | University Of Cincinnati | Polyamides for nucleic acid delivery |
| CA3104113A1 (en) * | 2018-06-22 | 2019-12-26 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Vectors for gene delivery that persist within cells |
-
2020
- 2020-01-20 CZ CZ202030A patent/CZ202030A3/cs not_active IP Right Cessation
-
2021
- 2021-01-18 WO PCT/CZ2021/050006 patent/WO2021148063A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021148063A1 (en) | 2021-07-29 |
| CZ308738B6 (cs) | 2021-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8877726B2 (en) | Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene | |
| CN107709555A (zh) | 用于Cas9介导的基因编辑的合成的单向导RNA | |
| CZ308738B6 (cs) | Způsob úpravy molekuly nukleové kyseliny pro usnadění jejího přenosu do hostitelských buněk a upravená molekula nukleové kyseliny | |
| US20080161236A1 (en) | Therapeutic nucleic acid-3'-conjugates | |
| AU2017276342A1 (en) | Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene | |
| HK1160487B (en) | Oligoribonucucleotide for inhibiting the expression of a predefined gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20230120 |