CZ2021389A3 - Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění - Google Patents

Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění Download PDF

Info

Publication number
CZ2021389A3
CZ2021389A3 CZ2021-389A CZ2021389A CZ2021389A3 CZ 2021389 A3 CZ2021389 A3 CZ 2021389A3 CZ 2021389 A CZ2021389 A CZ 2021389A CZ 2021389 A3 CZ2021389 A3 CZ 2021389A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mrna
infectious disease
saa1
severity
disease
Prior art date
Application number
CZ2021-389A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309154B6 (cs
Inventor
Kmoch Stanislav
CSc. Stanislav Kmoch prof. Ing.
Lenka Piherová
Piherová Lenka Ing., Ph.D.
Hana Hartmannová
Hartmannová Hana RNDr., Ph.D.
Michal Pohludka
Ph.D. MBA LL.M. Pohludka Michal Ing.
Martin Radina
Martin RNDr. Radina
Original Assignee
GeneSpector Innovations s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GeneSpector Innovations s.r.o. filed Critical GeneSpector Innovations s.r.o.
Priority to CZ2021389A priority Critical patent/CZ309154B6/cs
Priority to PCT/CZ2021/050159 priority patent/WO2023020638A1/en
Priority to AU2021460811A priority patent/AU2021460811A1/en
Priority to CN202180102902.4A priority patent/CN118215746A/zh
Priority to JP2024510464A priority patent/JP2024531418A/ja
Priority to EP21854868.3A priority patent/EP4388135A1/en
Priority to CA3229590A priority patent/CA3229590A1/en
Priority to US18/684,929 priority patent/US20240360507A1/en
Publication of CZ2021389A3 publication Critical patent/CZ2021389A3/cs
Publication of CZ309154B6 publication Critical patent/CZ309154B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění za použití metody RT‑qPCR, kdy tento způsob se provádí na vzorku výtěru z nosohltanu a zjišťuje se množství mRNA sérového amyloidu A, kterým je výhodně SAA1, přičemž množství mRNA sérového amyloidu A se normalizuje dle množství mRNA konstitutivně exprimovaného genu, kterým je výhodně UBC. Na základě zjištěné normalizované hodnoty množství mRNA SAA1 ve vzorku se predikuje závažnost průběhu infekčního onemocnění, které může být virového, bakteriálního či mykotického původu, a dále se monitoruje účinnost terapie daného onemocnění.

Description

Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění
Oblast techniky
Vynález spadá do oblasti analýzy nukleových kyselin pomocí molekulárně biologických metod, specificky kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR), dále do oblasti testování spojeného s mikroorganismy, specificky viry, bakteriemi a plísněmi, a do oblasti zkoumání biologických materiálů.
Dosavadní stav techniky
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR, Quantitative Polymerase Chain Reaction) je laboratorní metoda sloužící k odhadu počtu kopií vybraných úseků nukleových kyselin ve zkoumaném materiálu pomocí sledování efektivity množení vybraných úseků DNA, jejíž široké využití zahrnuje příkladně studium nukleových kyselin, genovou analýzu a diagnostiku, sekvenování genetické informace či diagnostiku infekčních chorob. Princip PCR spočívá v tepelné denaturaci DNA obsažené ve vzorku následované vazbou specifických primerů na uvolněná vlákna DNA a syntézou nových vláken s pomocí enzymu polymerázy. Tyto kroky se v cyklech pravidelně opakují a s každým cyklem dojde ke zdvojení množství DNA obsaženého ve vzorku. Varianta qPCR spojená s reverzní transkripcí (RT-qPCR, Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction) umožňuje stanovení přítomnosti specifické RNA, kterou enzym reverzní transkriptáza přítomný v reakční směsi před samotnou amplifikací přepíše do komplementární DNA. RT-qPCR našla v posledních letech uplatnění mimo jiné jako diagnostická metoda infekčních onemocnění způsobených RNA viry vynikající vysokou citlivostí i specificitou.
Během pandemic infekce viru SARS-CoV-2 a jím způsobeného onemocnění Covid-19 došlo k výraznému navýšení analytických kapacit státních i veřejných laboratoří a RT-qPCR se stala běžnou diagnostickou metodou, přičemž primárním zdrojem vzorků je neinvazivní výtěr z nosohltanu. Metoda RT-qPCR umožňuje velmi přesně určit přítomnost a počet molekul virové RNA (virovou nálož) v organismu diagnostikovaného pacienta. Tento parametr je vyjadřován hodnotou Ct (Cycle Threshold, prahový cyklus). Hodnota Ct má však pouze diagnostický význam. Vzhledem ke specifickému charakteru onemocnění Covid-19 nedokáže hodnota Ct určit či předpovědět jeho další klinický průběh. Nízká virová nálož (demonstrovaná vyšší hodnotou Ct) může být zjištěna u pacientů s následně závažným průběhem onemocnění, a naopak v řadě případů je vysoká virová nálož (demonstrovaná nízkými hodnotami Ct) zjištěna u jedinců, kteří nemají ani se u nich v budoucnu nerozvinou žádné klinické příznaky respiračního onemocnění.
Průběh infekce SARS-CoV-2 doposud nelze spolehlivě predikovat. Také pro přechod do vleklého průběhu nemoci (takzvaný post-COVID syndrom) nejsou známy spolehlivé prediktivní biomarkery. Z klinických rizikových faktorů jsou významné pro závažný průběh zejména starší věk, některé chronické nemoci a ve středním věku mužské pohlaví, obezita, diabetes a hypertenze. Velice pravděpodobně však záleží i na jiných faktorech hostitele, zejména těch, které jsou geneticky dány a podílí se na vrozené i získané imunitní odpovědi organismu proti infekci SARSCoV-2. Významným patogenetickým mechanismem rozvoje systémového postižení jev případě infekčních onemocnění, a tedy i nemoci Covid-19, cytokinová bouře. Za tohoto stavu postupně dochází k nekontrolovatelnému uvolňování prozánětlivých cytokinů, aktivaci proteinů akutní fáze a abnormální mobilizaci imunitního systému, v jejichž důsledku dochází k poškození plic, akutnímu poškození jater a selhání ledvin. Včasné rozpoznání rozvíjející se cytokinové bouře vytváří prostor pro její modulaci a tím i pro prevenci rozvoje závažných klinických stavů.
-1 CZ 2021 - 389 A3
Ideálním prediktivním biomarkerem jsou obecně molekuly, které jsou hojně zastoupeny v primárním diagnostickém materiálu, které jsou snadno měřitelné, a jejichž hladiny se v závislosti na klinickém stavu zkoumané osoby rychle a významně mění.
Z literatury (příkladně Chen etal.,Am. J. Transl. Res. 2020,12 (8), 4569-4575) je známa metoda predikce závažnosti průběhu onemocnění Covid-19 sledováním hladin zánětlivých indikátorů, specificky C-reaktivního proteinu (CRP), sérového amyloidu A (SAA), prokalcitoninu (PCT) a interleukinu-6, v krevním séru. Tyto takzvané proteiny akutní fáze jsou syntetizovány téměř výhradně v hepatocytech. Jejich produkce je stimulována během infekcí nebo v průběhu zánětlivých stavů širokým spektrem prozánětlivých cytokinů, zejména interleukinu-6 (IL-6), interleukinu-ΐβ (IL-Ιβ), tumor nekrotizujícího faktoru a (TNF-a, Tumor Necrosis Factor a), interferonu-γ (IFN-γ), transformujícího růstového faktoru (TGF-β, Transforming Growth Factor) a pravděpodobně i interleukinu-8 (IL-8), a řadou transkripčních faktorů (NFkB, C/EBP, YY1, AP2, SAF a Spi), které regulují produkci cytokinů. Podobná metoda je taktéž diskutována v dokumentu Pieri M., et al., Int. Immunopharmacol. 2021, 95, 107512. Popisované metody mají ovšem řadu nedostatků, především je to nutnost invazivního odběru vzorku, při kterém dochází k narušení tkáně, složité analýzy hladin jednotlivých indikátorů a komplikované vyhodnocení vzájemných vztahů těchto hodnot, a jsou tedy nevhodné pro masové nasazení v diagnostice.
Dokument Ziegler et al, Cell 2021 popisuje cytologickou analýzu výtěru z nosohltanu Covid-19-pozitivních pacientů zaměřenou na tvorbu širokého komplexu látek spojených se signálními dráhami cytokinů a interferonů. Je zde diskutována i možnost predikce závažného průběhu onemocnění, jelikož na rozdíl od pacientů s lehkým a středním průběhem, u kterých bylo pozorování zvýšení exprese tohoto souboru signálních látek, u pacientů s vážným průběhem byly hodnoty nízké a srovnatelné s kontrolní skupinou Covid-19-negativních jedinců. Nevýhodou této metody je, stejně jako v předchozím případě, nutnost charakterizace a stanovení obsáhlé množiny indikátorů s komplikovanými vzájemnými vztahy a s ní spojená analytická náročnost, která metodu činí nevhodnou pro diagnostické použití. Nelineární charakter závislosti koncentrace indikátorů na průběhu onemocnění dále z principu neumožňuje tuto metodu využít ke sledování účinnosti nasazené terapie v kontextu ústupu onemocnění.
Dokument diskutovaný v předchozím odstavci mimo jiné popisuje i stanovení SAA ve vzorcích od Covid-19-pozitivních pacientů, přičemž bylo pozorováno, že v rámci jednoho vzorkuje tvorba SAA1 a SAA2 snížena v buňkách přímo zasažených virem SARS-CoV-2, a naopak zvýšena v sousedních buňkách virem nezasažených. Tato nekonzistentnost a skutečnost, že dle informací dostupných v expresních knihovnách nebyla exprese kteréhokoli z rodiny SAA genů a s ní spojená přítomnost mediátorové RNA (mRNA, messenger RNA) dosud pozorována ve sliznici nosohltanu, specificky byla pozorována pouze v prsní tkáni, výstelce trávicí soustavy, slinivce, prostatě, plicích, kůži amozku (příkladně dokument Urieli-Shoval S. etal., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46(12), 1377-1384), povede odborníka v dané oblasti k závěru, že sérový amyloid A není vhodným indikátorem k predikci závažnosti průběhu onemocnění Covid-19.
Mimo krevní oběh a fyziologicky nejblíže nosohltanu byla přítomnost proteinu SAA pozorována příkladně v prasečích slinách (dokument Soler L. et al., Res. Vet. Sci., 2012, 93, 1266-1270). Jak bylo uvedeno výše, protein SAA samotný je široce studovanou složkou imunitní odpovědi, přičemž jeho hladiny není možné korelovat s hladinami mRNA SAA.
Úkolem předkládaného vynálezu je vyvinout metodu predikce závažnosti průběhu onemocnění Covid-19 a dalších infekčních onemocnění v primárním diagnosticky používaném klinickém materiálu - výtěru z nosohltanu - která nevyžaduje paralelní nebo následný invazivní odběr jiného typu klinického vzorku (například krve nebo bronchoalveolámí laváže), je jednoduchá v kontextu analytického provedení a je založena na stanovení jednoho konkrétního indikátoru, jehož zvýšení hladiny je možné pozorovat ještě před nástupem symptomů a jehož hodnota je přímo úměrná závažnosti průběhu onemocnění, což dále umožňuje sledování průběhu nasazené terapie.
- 2 CZ 2021 - 389 A3
Podstata vynálezu
Vynález je založen na stanovení množství mRNA sérového amyloidu A, výhodně SAA1, metodou RT-qPCR ve vzorku získaném výtěrem z nosohltanu, čímž odstraňuje všechny nedostatky dosavadního stavu techniky. Sledování hladin mRNA SAA1 ve výtěru z nosohltanu splňuje všechna kritéria ideálního prediktivního biomarkeru. Experimenty prokázaly, že mRNA SAA1 je za fýziologického stavu ve výtěru z nosohltanu přítomna a její hladina je metodou RT-qPCR snadno měřitelná. Hladiny mRNA SAA1 rostou bezprostředně po infekci a jejich výše se v závislosti na míře a rozsahu zánětu mění v rozsahu 3 řádů (>1000).
SAA1 je apolipoprotein kódovaný genem SAA1 charakterizovaným následující nukleotidovou sekvencí:
AGGCTCAGTATAAATAGCAGCCACCGCTCCCTGGCAGGCAGGGACCCGCA GCTCAGCTACAGCACAGATCAGGTGAGGAGCACACCAAGGAGTGATTTTT AAAACTTACTCTGTTTTCTCTTTCCCAACAAGATTATCATTTCCTTTAAA AAAAATAGTTATCCTGGGGCATACAGCCATACCATTCTGAAGGTGTCTTA TCTCCTCTGATCTAGAGAGCACCATGAAGCTTCTCACGGGCCTGGTTTTC TGCTCCTTGGTCCTGGGTGTCAGCAGCCGAAGCTTCTTTTCGTTCCTTGG CGAGGCTTTTGATGGGGCTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCTGACATGA GAGAAGCCAATTACATCGGCTCAGACAAATACTTCCATGCTCGGGGGAAC TATGATGCTGCCAAAAGGGGACCTGGGGGTGCCTGGGCTGCAGAAGTGAT CAGCGATGCCAGAGAGAATATCCAGAGATTCTTTGGCCATGGTGCGGAGG ACTCGCTGGCTGATCAGGCTGCCAATGAATGGGGCAGGAGTGGCAAAGAC CCCAATCACTTCCGACCTGCTGGCCTGCCTGAGAAATACTGAGCTTCCTC TTCACTCTGCTCTCAGGAGATCTGGCTGTGAGGCCCTCAGGGCAGGGATA CAAAGCGGGGAGAGGGTACACAATGGGTATCTAATAAATACTTAAGAGGT GGAATTTGTGGAAAAAAAAAAAAAAA
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrll:18287772-18291523
Tento protein je primárně syntetizován v játrech a je uvolňován do krevního oběhu v reakci na zánětlivé podněty způsobené infekcí, traumatem, autoimunitním onemocněním či rakovinou. Ve velmi malém množství byla mRNA SAA1 nalezena i v jiných tkáních, například tukové tkáni, cévní stěně, střevě, plicích a slezině.
RT-qPCR analýza výtěru z nosohltanu je standardem, který je neinvazivní, rychlý, jednoduchý na provedení a umožňuje snadnou automatizaci. Tento postup se běžně používá nejen pro diagnostiku infekce SARS-CoV-2 a onemocnění Covid-19, ale i pro diagnostiku jiných infekčních onemocnění stanovením přítomnosti a kvantifikací množství pro virus či mikroorganismus specifických nukleových kyselin ve vzorku. Jelikož je možné díky citlivosti metody jeden vzorek otestovat na přítomnost více než jedné cílové nukleové kyseliny, je možné získat zavedeným a prověřeným postupem nejen informaci o tom, zda je jedinec pozitivní na dané virové či jiné infekční onemocnění, ale díky paralelnímu stanovení mRNA SAA1 i o tom, jak závažný bude mít onemocnění průběh. Vzhledem k tomu, že sérový amyloid A je univerzálním indikátorem zánětlivé fáze, je zároveň možné v případě negativního výsledku virologické analýzy a zvýšených hodnot mRNA SAA1 získat indicii o jiné závažně probíhající infekci, která může být i bakteriálního či mykotického původu.
Roztok mRNA purifikované výhodně s použitím magnetických nanočástic se analyzuje pomocí jednokrokové RT-qPCR reakce probíhající v přítomnosti reverzní transkriptázy, DNA polymerázy, jednotlivých primerů a sond v zařízení udržujícím ideální teplotní podmínky pro jednotlivé kroky, které se cyklicky opakují. Po ukončení každého kroku se vždy měří fluorescence směsi, přičemž cyklus se obvykle opakuje celkem 40 až 45-krát a po ukončení programu se odečtou hodnoty Ct
-3CZ 2021 - 389 A3 v jednotlivých kanálech, které odpovídají původnímu počtu molekul sledovaných nukleových kyselin ve výtěru v nosohltanu.
Aby bylo možné výsledek analýzy mRNA SAA1 kvantifikovat a zároveň se zamezilo zkreslení výsledku danému odběrem rozdílných množství a složení vzorku během výtěru z nosohltanu, je paralelně stanoveno množství mRNA vybraného konstitutivně exprimovaného genu, ke kterému je množství mRNA SAA1 vztaženo a normalizováno. Konstitutivně exprimované geny jsou geny zajišťující základní fyziologické funkce buňky, a jsou tedy aktivní a exprimované v konstantním množství bez ohledu na stav a typ buňky. Počet molekul vybraného konstitutivně exprimovaného genu tak vyjadřuje počet buněk přítomných v odebraném materiálu. Příkladem takového genu je UBC, tedy gen kódující bílkovinu ubiquitin C. Normalizace probíhá odečtem hodnoty Ct získané RT-qPCR analýzou mRNA UBC ve vzorku výtěru z nosohltanu od hodnoty Ct získané RT-qPCR analýzou mRNA SAA1 v témže vzorku.
Dle experimentálně získaných dat je mRNA SAA1 přítomna ve vzorcích získaných výtěrem z nosohltanu u všech pacientů, včetně těch bez probíhajícího zánětu způsobeného infekcí, přičemž její hladina je zvýšena v případě probíhajícího zánětu a zároveň je přímo úměrná závažnosti jeho průběhu. V případě závažných symptomů vyžadujících hospitalizaci je zvýšení hladiny mRNA SAA1 pozorovatelné až několik dnů před jejich nástupem. Tím je potvrzena i prediktivní fúnkce tohoto indikátoru.
Na statisticky významném množství vzorků výtěru z nosohltanu bylo experimentálně zjištěno, že:
1) normalizované hodnoty množství mRNA SAA1 menší než nula jsou spojeny s absencí probíhajícího zánětu spojeného s infekčním onemocněním; a
2) normalizované hodnoty množství mRNA SAA1 vyšší než nula jsou spojeny s probíhajícím či rozvíjejícím se zánětem spojeným s infekčním onemocněním, přičemž hodnoty menší než jedna jsou zpravidla spojeny s mírným průběhem zánětu a s ním spojeného onemocnění a hodnoty vyšší než 2,5 jsou spojeny s vysokou pravděpodobností (95 %) rozvíjejícího se zánětu s vážným průběhem spojeném s budoucí nutností hospitalizace.
Metoda dle vynálezu je zároveň vhodná k monitorování účinnosti terapie nasazené při léčbě daného infekčního onemocnění. Bylo pozorováno, že po nasazení vhodné léčby dochází k následnému snížení již aktuálně zvýšené hladiny mRNA SAA1, a to ještě před propuknutím predikovaných závažných symptomů. Tento způsob je výrazně přesnější než prosté sledování příznaků onemocnění, jelikož příkladně u onemocnění Covid-19 mohou symptomy respiračního onemocnění jako rýma či kašel přetrvávat i týdny po odeznění infekce SARS-CoV-2 a s ní spojeného zánětu.
Objasnění výkresů
Obrázek č. 1 zobrazuje graf hladin SAA1 normalizovaných na konstitutivně exprimovaný gen UBC u pacientů rozdělených do skupin dle následujícího klíče:
• Skupina 1 - Zdraví jedinci a SARS-CoV-2-pozitivní jedinci s bezpříznakovým průběhem onemocnění • Skupina 2 - Jedinci s mírným až středně těžkým průběhem infekčního onemocnění bez nutnosti hospitalizace • Skupina 3 - Hospitalizovaní jedinci s těžkým průběhem infekčního onemocnění
-4CZ 2021 - 389 A3 • Skupina 4 - Jedinci s život ohrožujícím průběhem infekčního onemocnění hospitalizovaní na jednotce intenzivní péče
V grafu je patrná průměrná hodnota (bod), medián (linie) a interval spolehlivosti Cl 95 % (obdélník).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příklad popisuje nukleotidové sekvence primerů a sondy použité na stanovení přítomnosti mRNA genu SAAl a dále sekvence primerů a sondy použité na stanovení přítomnosti mRNA genu UBC (konstitutivně exprimovaný gen kódující bílkovinu ubiquitin C).
Primery a sonda použité na stanovení přítomnosti mRNA genu SAAl:
SAA1 upper 5 TCGGGGGAACTATGATGCT‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrll:18290818-18290836
SAA l lower 5 GCACCATGGCCAAAGAATC‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrll:18291287-18291305
SAA 1 sonda: 5 ΉΕΧ ATCAGCGATGCCAGAGAGAATATCCA BHQ1 ‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrl 1:18291261-18291284
Primery a sonda použité na detekci přítomnosti mRNA genu UBO.
UBCupper 5 ’ GATCGCTGTGATCGTCACTTG‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrl2:125399133-125399153
UBClower 5 ’ GTTTTCCAGCAAAGATCAGCCT‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrl2:125398173-125398194
UBC sonda: 5 ’ Cy5 TCGTGAAGACTCTGACTGGTAAGACC BHQ2 ‘ 3
Lokalizace: (GRCh/hgl9) chrl2:125398282-125398307
Příklad 2
Příklad popisuje provedení RT-qPCR analýzy stanovující množství mRNA SAA1 ve vzorku výtěru z nosohltanu normalizované na paralelně stanovené množství mRNA konstitutivně exprimovaného genu UBC.
Izolace mRNA probíhá v roztoku za přítomnosti vyšší koncentrace chaotropních solí, která způsobí nekovalentní vazbu na hydroxy-silanem potažené magnetické částice. mRNA navázaná na magnetické částice se promyje roztoky obsahujícími ethanol nebo isopropanol a uvolní do roztoku neobsahujícího žádný alkohol ani chaotropní soli. Získaná mRNA se rovnou použije do jednokrokové RT-qPCR reakce. Tato reakce probíhá v přítomnosti MMLV reverzní transkriptázy, dNTPs, hořečnatých solí, BSA, hot-start polymerázy, 1,6 μΜ jednotlivých primerů a 0,2 μΜ sond uvedených v příkladu 1. Reverzní transkripce probíhá 10 minut při 50 °C, ihned následuje 10ti minutová denaturace při 95 °C, kdy se deaktivuje MMLV reverzní transkriptáza a zároveň aktivuje hot-start polymeráza. Následuje polymerázová řetězové reakce probíhající za následujících podmínek: denaturace při 95 °C po dobu 10 s a annealing a extenze při 58 °C po dobu 30 s. Po ukončení tohoto kroku se vždy měří fluorescence v kanálech HEX a Cy5. Tento cyklus se opakuje celkem 45-krát. Po ukončení programu se odečtou hodnoty Ct v jednotlivých signálech. V rámci jednoho vzorku se získá hodnota Ct v kanálu HEX (SAAl) a v kanálu Cy5 (UBC). Tyto hodnoty odpovídají expresi jednotlivých proteinů ve výtěru z nosohltanu. Normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se získá odečtením hodnoty Ct mRNA UBC od hodnoty Ct mRNA SAA1.
-5CZ 2021 - 389 A3
Příklad 3
Příklad demonstruje realizovanou predikci závažnosti průběhu onemocnění u SARS-CoV-2pozitivního pacienta s využitím mRNA SAA1 jako markéru.
Vzorek získaný výtěrem z nosohltanu jedince, který vykazuje symptomy počínajícího respiračního onemocnění, se otestuje metodou RT-qPCR jednak na přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 a jednak na přítomnost mRNA SAA1 dle postupu popsaného v příkladu č. 2. Získaná hodnota Ct (hraniční počet cyklů) RNA SARS-CoV-2 se rovná 20,46 a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná 3,48. Po sedmi dnech u jedince nastává hospitalizace nejprve na infekčním oddělení nemocnice a následující den dochází k přeložení na anesteziologicko-resuscitační oddělení.
Příklad 4
Příklad demonstruje realizované potvrzení účinnosti terapie onemocnění u SARS-CoV-2pozitivního pacienta s využitím mRNA SAA1 jako markéru.
Vzorek získaný výtěrem z nosohltanu jedince, který vykazuje symptomy počínajícího respiračního onemocnění, se otestuje metodou RT-qPCR jednak na přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 a jednak na přítomnost mRNA SAA1 dle postupu popsaného v příkladu č. 2. Získaná hodnota Ct RNA SARS-CoV-2 se rovná 21,79 a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná 2,1. Na základě tohoto zjištění se následně sledovanému jedinci injekčně podá terapeutická dávka neutralizačních protilátek proti viru SARS-CoV-2 a po třech dnech se zopakuje RT-qPCR test jednak na přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 a jednak na přítomnost mRNA SAA1 dle postupu popsaného v příkladu 2. Získaná hodnota Ct RNA SARS-CoV-2 se rovná 29,00 a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná -2,21, tedy hodnotě menší než nula. Po dalších čtyřech dnech se sadatestů ještě jednou zopakuje, přičemž získaná hodnota Ct RNA SARS-CoV2 se rovná 39,64 a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná -1,5, tedy hodnotě menší než nula. Během sledování nedochází u pacienta k rozvoji závažných příznaků Covid-19. Symptomy respiračního onemocnění v podobě rýmy a kašle však u něho přetrvávají po celou dobu sledování a ještě po několik dalších týdnů.
Příklad 5
Příklad demonstruje realizovanou predikci závažnosti průběhu infekčního onemocnění neznámé etiologie u SARS-CoV-2-negativního pacienta s využitím mRNA SAA1 jako markéru.
Vzorek získaný výtěrem z nosohltanu jedince, který vykazuje symptomy počínajícího respiračního onemocnění, se otestuje metodou RT-qPCR jednak na přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 a jednak na přítomnost mRNA SAA1 dle postupu popsaného v příkladu č. 2. Přítomnost RNA SARSCoV-2 není potvrzena a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná 3,58. Vyšetření jedince na základě klinických symptomů odpovídajících infekčnímu onemocnění v podobě zimnice, únavy a bolesti v krku následně odhalí diagnózu v podobě vážného případu bakteriální angíny.
Příklad 6
Příklad demonstruje realizovanou predikci závažnosti průběhu infekčního onemocnění neznámé etiologie u SARS-CoV-2-negativního pacienta s využitím mRNA SAA1 jako markéru.
Vzorek získaný výtěrem z nosohltanu jedince, který vykazuje symptomy počínajícího infekčního onemocnění, se otestuje metodou RT-qPCR jednak na přítomnost virové RNA SARS-CoV-2 a jednak na přítomnost mRNA SAA1 dle postupu popsaného v příkladu 2. Přítomnost RNA SARSCoV-2 není potvrzena a získaná normalizovaná hodnota mRNA SAA1 se rovná 4,23. Vyšetření
-6CZ 2021 - 389 A3 jedince na základě klinických symptomů odpovídajících infekčnímu onemocnění v podobě průjmu, zvracení a zvýšené teploty následně odhalí diagnózu v podobě mykózy způsobené kvasinkou Candida albicans, tedy plísňového onemocnění.
Průmyslová využitelnost
Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění jsou průmyslově využitelné v ίο diagnostice infekčních onemocnění v rámci laboratorní analýzy odebraných vzorků klinického materiálu.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění metodou RT-qPCR vyznačující se tím, že se provádí na vzorku výtěru z nosohltanu a zjišťuje se množství mRNA sérového amyloidu A.
  2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že sérovým amyloidem A je SAA1.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že množství mRNA sérového amyloidu A se normalizuje dle množství mRNA konstitutivně exprimovaného genu.
  4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že konstitutivně exprimovaným genem je UBC.
  5. 5. Použití mRNA sérového amyloidu A jako biomarkeru při predikci závažnosti průběhu infekčního onemocnění.
  6. 6. Použití mRNA sérového amyloidu A jako biomarkeru při monitoringu terapie infekčního onemocnění.
CZ2021389A 2021-08-20 2021-08-20 Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění CZ309154B6 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021389A CZ309154B6 (cs) 2021-08-20 2021-08-20 Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění
PCT/CZ2021/050159 WO2023020638A1 (en) 2021-08-20 2021-12-30 Method for predicting a severity of an infectious disease and biomarker for use in carrying out the method and monitoring a therapy of an infectious disease
AU2021460811A AU2021460811A1 (en) 2021-08-20 2021-12-30 Method for predicting a severity of an infectious disease and biomarker for use in carrying out the method and monitoring a therapy of an infectious disease
CN202180102902.4A CN118215746A (zh) 2021-08-20 2021-12-30 预测传染病严重程度的方法和用于实施该方法并监测传染病治疗的生物标志物
JP2024510464A JP2024531418A (ja) 2021-08-20 2021-12-30 感染症の重症度を予測する方法、ならびにその方法の実施および感染症の治療の観察に使用するバイオマーカー
EP21854868.3A EP4388135A1 (en) 2021-08-20 2021-12-30 Method for predicting a severity of an infectious disease and biomarker for use in carrying out the method and monitoring a therapy of an infectious disease
CA3229590A CA3229590A1 (en) 2021-08-20 2021-12-30 Method for predicting a severity of an infectious disease and biomarker for use in carrying out the method and monitoring a therapy of an infectious disease
US18/684,929 US20240360507A1 (en) 2021-08-20 2021-12-30 Method for predicting a severity of an infectious disease and biomarker for use in carrying out the method and monitoring a therapy of an infectious

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021389A CZ309154B6 (cs) 2021-08-20 2021-08-20 Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2021389A3 true CZ2021389A3 (cs) 2022-03-16
CZ309154B6 CZ309154B6 (cs) 2022-03-16

Family

ID=80445574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021389A CZ309154B6 (cs) 2021-08-20 2021-08-20 Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240360507A1 (cs)
EP (1) EP4388135A1 (cs)
JP (1) JP2024531418A (cs)
CN (1) CN118215746A (cs)
AU (1) AU2021460811A1 (cs)
CA (1) CA3229590A1 (cs)
CZ (1) CZ309154B6 (cs)
WO (1) WO2023020638A1 (cs)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI398261B (zh) * 2003-12-17 2013-06-11 Alcon Inc 血清類澱粉ａ基因於診斷及治療青光眼及鑑定抗青光眼劑上之用途
US20090280108A1 (en) * 2004-12-10 2009-11-12 Da-Wei Gong Serum amyloid a protein in inflammation and obesity
CN103314117B (zh) * 2010-05-05 2016-08-17 德国癌症研究中心 在不同的宫颈病变中的hr-hpv的诊断转录物和剪接模式
WO2013155460A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Somalogic, Inc. Tuberculosis biomarkers and uses thereof
CN113176411B (zh) * 2021-03-10 2023-12-26 北京大学口腔医学院 利用唾液检测新型冠状病毒感染的生物标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024531418A (ja) 2024-08-29
WO2023020638A1 (en) 2023-02-23
CN118215746A (zh) 2024-06-18
AU2021460811A1 (en) 2024-04-04
CA3229590A1 (en) 2023-02-23
EP4388135A1 (en) 2024-06-26
US20240360507A1 (en) 2024-10-31
CZ309154B6 (cs) 2022-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3350345B1 (en) Biomarkers for heart failure
US12110556B2 (en) Kit for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (SIRS)
JP2006506069A (ja) バイオマーカープロフィールを用いた敗血症またはｓｉｒｓの診断
US10859573B2 (en) Nourin molecular biomarkers diagnose angina patients with negative troponin
JP2018511339A (ja) ニューモシスチス肺炎を診断、予測又はモニタリングするための手段
CN104736724A (zh) 尿液外泌小体mRNA和使用其检测糖尿病型肾病的方法
RU2525707C2 (ru) Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома
US20230003719A1 (en) Materials and methods for inflammatory molecular markers
US20230014092A1 (en) Materials and methods for monitoring inflammation
US11613782B2 (en) Method for predicting progression to active tuberculosis disease
US20210371927A1 (en) Biomarkers for diabetes therapy
CN118406751B (zh) 用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用
CZ2021389A3 (cs) Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění
CN113403390B (zh) lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用
CN114959005B (zh) 基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用
HK40106775A (zh) 预测传染病严重程度的方法和用於实施该方法并监测传染病治疗的生物标志物
RU2780525C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка
CN111440859A (zh) 一种人呼吸道合胞病毒感染的生物标志物及应用
RU2780505C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка на основе генетического анализа
RU2786314C1 (ru) Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни у женщин по генетическим данным
RU2779085C1 (ru) Способ выявления предрасположенности к развитию метаболического синдрома в виде ожирения у школьников 7-10 лет
EP4230749A1 (en) In vitro method for predicting a risk of post-chikungunya chronic inflammatory joint disease
CN108504736A (zh) 检测orm1基因表达量的系统在诊断结核病中的应用
US20250298015A1 (en) Diagnostic method of detecting inflammation biomarker(s)
Hedley et al. First trimester maternal serum microRNA expression profile differentiates between uncomplicated pregnancies, and pregnancies which develop pre-eclampsia