CZ202249A3 - Způsob přípravy materiálu na bázi aminové membrány a materiály na bázi amniové membrány - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení poskytuje způsob zpracování amniové membrány na materiál pro rekonstrukci, ochranu a podporu hojení poškozených tkání, přičemž tento způsob vychází z placenty a zahrnuje kroky: a) oddělení amniové membrány od chorionu; b) očištění amniové membrány ve fyziologickém roztoku a mechanické očištění amniové membrány, c) antibiotickou laváž, d) přiložení amniové membrány choriovou stranou na podložku (1) z lékařského silikonu, která je po okrajích opatřena upínacím systémem pro upnutí amniové membrány, uhlazení a vypnutí amniové membrány na podložce (1), e) lyofilizaci materiálu získaného v kroku e), f) sejmutí amniové membrány z podložky (1), g) popřípadě fragmentaci amniové membrány na cirkulární tvar, h) vložení lyofilizované amniové membrány do sterilního obalu. Dále předkládané řešení poskytuje materiál sestávající z lyofilizované amniové membrány připravitelný tímto způsobem, a rovněž podložku pro provádění tohoto způsobu.

Description

Způsob přípravy materiálu na bázi aminové membrány a materiály na bázi amniové membrány

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy materiálu na bázi amniové membrány, přípravku pro provádění tohoto způsobu, a materiálů na bázi amniové membrány připravitelné tímto způsobem.

Dosavadní stav techniky

Amniové membrány se používají pro výrobu materiálů pro rekonstrukci, ochranu a podporu hojení poraněných tkání. Typicky se tyto materiály vyrábějí tak, že se amniová membrána oddělí od placenty, chorionu, popřípadě se odstraní epitelová vrstva, amniová membrána se položí na nosič, a následně se lyofilizuje nebo mrazí. Výsledným produktem je tedy amniová membrána na nosiči.

Nosičem je nejčastěji síťový textilní nosič nebo nitrocelulózový nosič (např. PV 2018-846).

Nevýhodou nitrocelulózového nosiče je fakt, že před aplikací je nutné amniovou membránu i s nosičem hydratovat, opatrně snést z nosiče a následně aplikovat. Hydratovaná amniová membrána se ovšem ihned po jejím odloučení od nosiče sroluje a je následně velice obtížné určit jak její stranovou orientaci, která je stěžejní pro správnou funkci štěpu, tak s ní následně jakkoliv manipulovat.

Na síťový textilní nosič sice amniová membrána téměř nepřiléhá a dá se odloučit, často se ovšem stává, že se odloučí úplně a lékař pak opět nemůže určit správnou stranovou orientaci. Zároveň se na histologických řezech ukázalo, že amniová membrána nanesená na síťový textilní nosič není lyofilizovaná v přiměřeném tahu a v rámci histologické struktury dochází během mrznutí ke vzniku kondenzačních jader a tím k narušení přirozené struktury amniové membrány a tzv. potrhání. Tato 3D struktura je klíčovým parametrem pro podporu hojení defektů a slouží jako přirozený scaffold pro reepitelizaci léčeného defektu.

Předkládaný vynález si klade za cíl odstranit výše uvedené problémy.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob zpracování amniové membrány na materiál pro rekonstrukci, ochranu a podporu hojení poškozených tkání, přičemž tento způsob vychází z placenty a zahrnuje kroky:

a) oddělení amniové membrány od chorionu;

b) očištění amniové membrány ve fyziologickém roztoku a mechanické očištění amniové membrány,

c) antibiotické laváže,

d) přiložení amniové membrány choriovou stranou na podložku z lékařského silikonu, která je po okrajích opatřena upínacím systémem pro upnutí amniové membrány, uhlazení a vypnutí amniové membrány na podložce,

e) lyofilizace materiálu získaného v kroku e),

- 1 CZ 2022 - 49 A3

f) sejmutí amniové membrány z podložky,

g) popřípadě fragmentace amniové membrány na cirkulární tvar,

h) vložení lyofilizované amniové membrány do sterilního obalu.

Silikonová podložka je s výhodou válcovitá. Kruhový tvar podstavy nejlépe pomáhá zajistit rovnoměrný tah lyofilizované tkáně ve všech směrech. Výška válce je podstatně menší než průměr podstavy.

Silikon je neadhezivní materiál, který splňuje parametry pro snadnou práci při rozprostření amniové membrány, a i sejmutí lyofilizované tkáně bez porušení struktury.

Upínací systém zahrnuje boční vybrání v plášti válcové podložky, tedy v boční stěně podložky; a upínací lištu pro vložení do bočního vybrání. Vybrání je provedeno po celé délce obvodu válcové podložky. Upínací lišta je opatřená fixačními výstupky pro lepší upevnění amniové membrány a pro zabránění jejího smršťování a posouvání po podložce v průběhu lyofilizace. Upínací lišta dále zahrnuje upevňovací prostředky, například přítažný šroub.

Fixační výstupky upínací lišty mohou být například výstupky upevněné na straně lišty, nebo prolisy na liště, nebo výřezy v liště, které jsou vyhnuty do strany. S výhodou jsou fixační výstupky uspořádány tak, aby vyvíjely na membránu sílu směrem od středu ke kraji, například jsou špičaté, se špičkou směrovanou ke kruhové podstavě, na kterou se nepřikládá amniová membrána.

Takto konstruovaný upínací systém dovoluje dobré vyhlazení a vypnutí membrány. Díky kruhovému tvaru a díky vybrání a upínací liště je vypnutí amniové membrány rovnoměrné, a působení sil ve všech oblastech membrány odpovídající. Zároveň se zabraňuje posunutí aminové membrány v průběhu lyofilizace. Dotažením upevňovacích prostředků lze do určité míry regulovat vypnutí amniové membrány. Takto konstrukčně vytvořený upínací systém zajišťuje přiměřený tah lyofilizované tkáně ve všech směrech působení, a zároveň zachovává plnou lyofilizační plochu pro efektivní průběh lyofilizace.

Ve výhodném provedení je silikonová podložka na povrchu kruhové podstavy, na kterou se přikládá membrána, opatřena reliéfními vystupujícími znaky (embosováním), které se při uhlazení, vypnutí a lyofilizaci amniové membrány otisknou do jejího povrchu sousedícího s podložkou. Tyto reliéfní znaky pak zůstanou viditelné na výsledném materiálu. Lze takto například označit chorionovou stranu amniové membrány, takže při použití lyofilizované membrány nedojde k nesprávné aplikaci.

S výhodou může být silikonová válcová podložka dále opatřena otvory (průduchy) pro odvod vlhkosti a pro prostup vzduchu, a to zejména na kruhové podstavě, na kterou se přikládá membrána, a/nebo na plášti válce.

Ve způsobu podle vynálezu, krok oddělení amnionu od chorionu (krok a)) se typicky provádí manuálně tupou preparací, a to tak, že se začne od místa incize plodového vaku, a dále se pokračuje směrem k pupečníku po celém povrchu placenty. Na místě, kde amnion přechází do pupeční šňůry, se toto spojení přeruší sekcí, např. pomocí nůžek nebo skalpelu.

Krok čištění amniové membrány (krok b)) ve fyziologickém roztoku se typicky provádí vložením amniové membrány do fyziologického roztoku, lze jej při tom jemně propírat. Mechanické očištění je typicky prováděno při umístění amnionu epiteliální vrstvou na pracovní plochu a odstraňováním reziduí z povrchu tkáně jemným pohybem palce a ukazováčku. Proces čištění amniové membrány ve fyziologickém roztoku a jejího mechanického čištění lze podle potřeby opakovat, s výhodou 2x

- 2 CZ 2022 - 49 A3 nebo 3x. Finálně očištění amnion musí být čistý bez krevních koagul nebo jiných reziduí a musí být transparentní. To lze ověřit například vizuální kontrolou.

Antibiotická laváž, tedy očištění amniové membrány ve fyziologickém roztoku s přídavkem antibiotika, (v kroku c)) se s výhodou provádí v lázni obsahující poměr antibiotika k fyziologickému roztoku 1:100 až 1:10, výhodněji 1:60 až 1:40, nejvýhodněji 1:50. Antibiotikem je s výhodou gentamicin. S výhodou se amniová membrána ponechá v této lázni po dobu alespoň 25 minut, výhodněji alespoň 30 minut.

Přiložení, vyhlazení a vypnutí amniové membrány (v kroku d)) se provede přiložením choriové strany aminové membrány na kruhovou podstavu silikonové podložky, manuálním uhlazením amniové membrány po povrchu kruhové podstavy silikonové podložky, přehnutím aminové membrány přes okraj podstavy až přes vybrání, a fixováním amniové membrány pomocí upínací lišty vložené přes membránu do vybrání, která se upevní pomocí upevňovacích prostředků.

Lyofilizace materiálu (krok e)) se provádí za běžných podmínek, tedy za sníženého tlaku, např. 100až 500 mTorr (13,3 až 67 Pa), a za snížené teploty, například -20 až -65 °C. Po lyofilizaci se materiál zabalí do sterilního obalu, s výhodou se obal následně zataví.

Obvykle je vhodné či potřebné amniovou membránu po lyofilizaci fragmentovat (volitelný krok f)). To se provádí, stejně jako celý postup, asepticky. S výhodou se fragmentace provádí v laminárním boxu. Nejčastějšími tvary fragmentů jsou cirkulární tvary, ale lze fragmentovat i na jiné tvary. Velikost fragmentů je dána požadavky na budoucí použití, může tedy být značně variabilní.

Vložení do obalu (krok g)) zahrnuje obvykle vložení materiálu do primárního obalu, zatavení primárního obalu, vložení primárního obalu s materiálem do sekundárního obalu, a zatavení sekundárního obalu.

S výhodou se vždy zpracovává v jedné šarži placenta jedné dárkyně.

Předmětem předkládaného vynálezu je i materiál na bázi amniové membrány připravitelný způsobem podle vynálezu. Tento materiál sestává z lyofilizované amniové membrány s v podstatě nepoškozenou strukturou, která má s výhodou kruhový tvar, a/nebo má vytlačené reliéfní znaky na jedné straně povrchu.

Objasnění výkresů

Obr. 1 ukazuje histologický řez lyofilizovanou amniovou membránou připravenou způsobem podle vynálezu.

Obr. 2 ukazuje histologický řez srovnávací lyofilizovanou amniovou membránou připravenou obdobným způsobem, ale s lyofilizací prováděnou na síťovém textilním nosiči a bez vypnutí membrány upínacím systémem.

Obr. 3 až 5 znázorňují podložku. Obr. 3 je axonometrický pohled na silikonový válec s vybráním, Obr. 4 znázorňuje axonometrický pohled na silikonový válec s připevněnou upínací lištou a upevňovacími prostředky (zde přítažný šroub). Obr. 5 znázorňuje detail vnitřní strany upínací lišty s fixačními výstupky.

Obr. 6 je pohled na kruhovou podstavu válcovité podložky, opatřenou embosováním.

Obr. 7 je pohled na kruhovou podstavu válcovité podložky, opatřenou embosováním a otvory pro průchod vzduchu a odvod vlhkosti.

- 3 CZ 2022 - 49 A3

Příklady uskutečnění vynálezu

Před odběrem tkáně na smluvním odběrovém zařízení se vyplní potřebná záznamová dokumentace, informovaný souhlas matky s darováním tkáně, a provede se posouzení zdravotní způsobilosti matky k darování placenty, jejíž součástí je amniová mebrána. Placentu odebírá proškolený personál aseptickou technikou při porodu císařským řezem. Bezprostředně před odběrem se odeberou vzorky krve matky na serologické vyšetření. Tkáň se uloží a následně uzavře do primárního obalu Cover bag a do sekundárního skladovacího kontejneru. Takto odebraná a zabalená tkáň se ihned uloží do chladničky v rozmezí teplot 4 °C až 8 °C. Transport tkáně do tkáňového zařízení probíhá také při chladničkové teplotě.

V tkáňovém zařízení pověřený pracovník zkontroluje úplnost a správnost údajů a kompletnost dokumentace. Po obdržení negativních výsledků serologického vyšetření je tkáň propuštěna pověřeným pracovníkem ke zpracování. Zpracování musí být započato nejpozději do 24 hodin po odběru tkáně.

Tkáň je vždy zpracovávána pouze od jedné dárkyně z důvodu zamezení potenciální křížové kontaminace. Zpracování probíhá v laminárním boxu tř. čistoty A. Po aseptickém vybalení tkáně v laminárním boxu se provede kontrolní stěr tkáně na mikrobiologické vyšetření. V průběhu zpracování pracovník vizuálně hodnotí tkáň - hodnotí barvu a strukturu tkáně. Jsou-li při zpracování nalezeny změny barvy nebo změny ve struktuře, je nutné posoudit jejich vzhled, rozsah a charakter. V případě nálezu defektů v menším rozsahu se tkáň upraví a defekty se odstraní. V případě nevyhovující kvality tkáně ve větším rozsahu a rozsáhlých defektů se tkáň po zhodnocení pracovníkem zlikviduje. Mezi změny zabarvení, které vedou k likvidaci, patří jasně viditelná zelená, žlutá nebo hnědozelená barva tkáně.

Oddělení amniové membrány od chorionu (krok a)

Pracovník manuálně identifikuje místo incize plodového vaku (po celém obvodu incize), v tomto místě zahájí separaci amnionu od chorionu. Jemně odseparuje tyto 2 blány od sebe a pokračuje v preparaci v uvedeném místě směrem k pupečníku po celém povrchu placenty.

Technika preparace: tupá preparace.

Po odpreparování amnionu po celém povrchu zůstává amnion fixován na místě, kde přechází do pupeční šňůry, toto spojení přeruší sekcí pomocí nůžek nebo skalpelu.

Odpreparovaná amniová membrána se vloží do nádoby s připraveným fyziologickým roztokem.

Čištění amniové membrány (krok b)

Pracovník lehce a jemně propere amnion v připravené dóze s fyziologickým roztokem. Dále pak amnion umístí epiteliální vrstvou na pracovní plochu a manuálně po celé ploše očistí kontaktní stranu amnionu (s choriovou blánou). Membrána se v průběhu zpracování kontinuálně hydratuje fyziologickým roztokem a nenafragmentované části tkáně pracovník odkládá do čisté misky s fyziologickým roztokem, aby zamezil ztrátě vlhkosti tkáně. Postup čištění se opakuje 2x až 3x. Finálně očištěný amnion musí být čistý bez krevních koagul nebo jiných reziduí, musí být transparentní.

Antibiotická laváž (krok c)

Připraví se lázeň z fyziologického roztoku a gentamicinu v poměru 50:1. Poté se vloží do připravené lázně membrána a ponechá se v ní 30 minut.

- 4 CZ 2022 - 49 A3

Vypnutí amniové membrány na lyofilizační podložku (krok d)

Celý amnion pracovník resekuje pomocí nůžek či skalpelu na několik větších fragmentů (například cca 15x15 cm). Každý jednotlivý fragment položí choriovou stranou na lyofilizační podložku z lékařského silikonu. Amniová membrána se následně manuálně uhladí po povrchu podložky, tkáň se přehne přes okraje podložky a fixuje upínací lištou. Upínací lišta je z vnitřní strany opatřena fixačními výstupky. Před finálním dotažením upínací lišty pracovník zkontroluje, zde je celý povrch amniové membrány přilnut na lyofilizační podložku. Pokud se vyskytují pod amniovou memránou bubliny, lehce je vytlačí prstem do krajů podložky. Dále zkontroluje přilnutí v místě reliéfních znaků. Následně upínací lištu dotáhne pomocí upevňovacích prostředků.

Lyofilizace (krok e)

Amniová membrána vypnutá na lyofilizačních podložkách se vloží do lyofilizátoru. Lyofilizace probíhá podle následujícího lyofilizačního receptu.

Počáteční teplota lyofilizačního cyklu je 20 °C. Postupným zamražováním dochází k postupnému poklesu teploty na -45 °C. Na této teplotě se cyklus drží 320 minut. Po ukončení první fáze lyofilizačního cyklu dochází k primárnímu sušení při tlaku 400 mTorr (53 Pa) s následným dosušením při tlaku 450 mTorr (60 Pa) a postupným vzestupem teploty na 10°C. Následně se lyofilizace ukončí.

Fragmentace (krok f)

Po lyofilizaci se lyofilizační podložky s amniovou membránou umístí do ochranného obalu a přemístí do laminárního boxu s třídou čistoty A. V laminárním boxu se amniová membrána sejme z lyofilizační podložky a trepanem nafragmentuje na cirkulární štěpy o různých průměrech dle velikosti zvoleného trepanu. Jednotlivé fragmenty se vkládají do primárního obalu, tento se svaří pulzní svářečkou a následně vloží do sekundárního obalu. Sekundární obal se uzavřen také svarem. Celý proces probíhá za aseptických kautel. Reprezentativní vzorek amniové membrány se zašle do certifikované laboratoře ke zhodnocení sterility finálního produktu. Další reprezentativní vzorek se odebere pro zhodnocení zbytkové vlhkosti finálního produktu, která nesmí být vyšší než 6 %.

Obr. 1 ukazuje histologický řez lyofilizovanou amniovou membránou připravenou výše popsaným způsobem, tj. podle vynálezu. Obr. 2 ukazuje histologický řez srovnávací lyofilizovanou amniovou membránou připravenou obdobným způsobem, lišícím se v tom, že místo lyofilizace na silikonové podložce opatřené upínacím systémem byla amniová membrána lyofilizována na síťovém textilním nosiči; řez byl proveden po sejmutí membrány z tohoto nosiče.

Histologické řezy byly provedeny na Ústavu patologie FN Brno, a jsou zobrazeny světelnou mikroskopií, zvětšení 200x, po obarvení hematoxylinem a eosinem.

Na obr. 1 je viditelná dobře zachovaná kompaktní struktura amniové membrány. Naproti tomu na obr. 2 je viditelné výrazné potrhání a vytažení struktury amniové membrány.

Příklad lyofilizační podložky:

Lyofilizační podložka je znázorněna na obr. 3 až 5. Podložka 1 je z lékařského silikonu, a má tvar válce s dvěma kruhovými podstavami a pláštěm. Výška válce je podstatně menší než průměr podstav. V plášti je vytvořeno vybrání 2 po celém obvodu, které je určeno pro vložení upínací lišty 3. Upínací lišta je opatřena fixačními výstupky 4, které jsou v tomto případě tvořeny výřezy v liště vyhnutými do strany (směrem dovnitř při upnutí do vybrání podložky). Upínací lišta je dále opatřena upevňovacími prostředky 5, v tomto případě se jedná o přítažný šroub.

- 5 CZ 2022 - 49 A3

Podložka může být opatřena embosováním, tedy reliéfními vystupujícími znaky 6, jak znázorňuje provedení na obr. 6. Na obr. 7 je znázorněno další možné provedení podložky, které je na kruhové podstavě opatřeno otvory 7 pro odvod vlhkosti a pro prostup vzduchu.

Claims (10)

1. Způsob zpracování amniové membrány na materiál pro rekonstrukci, ochranu a podporu hojení poškozených tkání, přičemž tento způsob vychází z placenty a vyznačuje se tím, že zahrnuje kroky:

a) oddělení amniové membrány od chorionu;

b) očištění amniové membrány ve fyziologickém roztoku a mechanické očištění amniové membrány,

c) antibiotické laváže,

d) přiložení amniové membrány choriovou stranou na podložku (1) z lékařského silikonu, která je po okrajích opatřena upínacím systémem pro upnutí amniové membrány, uhlazení a vypnutí amniové membrány na podložce (1),

e) lyofilizace materiálu získaného v kroku e),

f) sejmutí amniové membrány z podložky (1),

g) popřípadě fragmentace amniové membrány na cirkulární tvar, h) vložení lyofilizované amniové membrány do sterilního obalu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že podložka (1) je válcovitá.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že upínací systém zahrnuje boční vybrání (2) po obvodu pláště válcové podložky (1); a upínací lištu (3) pro vložení do bočního vybrání (2), přičemž upínací lišta (3) je opatřena fixačními výstupky (4) pro upevnění amniové membrány a pro zabránění jejího smršťování a posouvání po podložce v průběhu lyofilizace, a upínací lišta (3) dále zahrnuje upevňovací prostředky (5).

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 2 až 3, vyznačující se tím, že silikonová podložka (1) je na povrchu kruhové podstavy, na kterou se přikládá membrána, opatřena reliéfními vystupujícími znaky (6).

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 2 až 3, vyznačující se tím, že silikonová podložka (1) je opatřena otvory pro odvod vlhkosti a pro prostup vzduchu, a to zejména na kruhové podstavě, na kterou se přikládá membrána, a/nebo na plášti válce.

6. Válcovitá podložka (1) z lékařského silikonu pro provádění způsobu podle nároku 1, vyznačující se tím, že je po okrajích opatřena upínacím systémem pro upnutí amniové membrány, přičemž upínací systém zahrnuje boční vybrání (2) po obvodu pláště válcové podložky (1); a upínací lištu (3) pro vložení do bočního vybrání (2), přičemž upínací lišta (3) je opatřena fixačními výstupky (4) pro upevnění amniové membrány a pro zabránění jejího smršťování a posouvání po podložce v průběhu lyofilizace, a upínací lišta (3) dále zahrnuje upevňovací prostředky (5).

7. Podložka podle nároku 6, vyznačující se tím, že je na povrchu kruhové podstavy, na kterou se přikládá membrána, opatřena reliéfními vystupujícími znaky (6).

8. Podložka podle kteréhokoliv z nároků 6 až 7, vyznačující se tím, že je opatřena otvory (7) pro odvod vlhkosti a pro prostup vzduchu, a to zejména na kruhové podstavě, na kterou se přikládá membrána, a/nebo na plášti válce.

9. Materiál sestávající z lyofilizované amniové membrány připravitelný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.

10. Materiál podle nároku 9, vyznačující se tím, že má vytlačené reliéfní znaky na jedné straně povrchu.