CZ2023221A3 - Způsob osvětlení vzorku při laserové skenovací mikroskopii a zařízení k provádění tohoto způsobu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká laserové skenovací mikroskopie, konkrétně se týká způsobu dosažení optimální časové efektivity získávání informací o optických vlastnostech pozorovaného vzorku. Způsob a zařízení k jeho provádění umožňují provádět mikroskopická pozorování dynamických molekulárních procesů bez časových prodlev za minimálního světelného poškození pozorovaného vzorku. Způsob podle předloženého vynálezu odstraňuje omezení rychlosti laserových skenovacích mikroskopů v důsledku nekonstantní úhlové rychlosti galvo‑skenerů tím, že využívá modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek tak, že různé části pozorovaného vzorku jsou vystaveny stejnému množství světelné energie i při nekonstantní rychlosti skenování. Tento způsob umožňuje provádět měření optických vlastností zkoumaného vzorku po celou dobu pracovního cyklu galvo-skeneru, a významně tak zvyšuje rychlost získávání výsledného obrazu technikami laserové skenovací mikroskopie. Vynález se týká též i zařízení pro osvětlení vzorku laserovým svazkem pro skenovací mikroskopii.

Description

Způsob osvětlení vzorku při laserové skenovací mikroskopii a zařízení k provádění tohoto způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká laserové skenovací mikroskopie. Cílem vynálezu je dosažení optimální časové efektivity získávání informací o optických vlastnostech pozorovaného vzorku. Způsob a zařízení k jeho provádění umožňují provádět mikroskopická pozorování dynamických molekulárních procesů bez časových prodlev za minimálního světelného poškození pozorovaného vzorku.

Dosavadní stav techniky

Ke zjišťování optických, fyzikálních a chemických vlastností vzorků s vysokým prostorovým rozlišením jsou často využívány různé techniky laserové skenovací (alternativně též rastrovací, řádkovací) mikroskopie. Tyto techniky zahrnuji např. konfokální laserovou skenovací mikroskopii, dvou- a vícefotonovou laserovou skenovací mikroskopii, mikroskopii druhé a vyšších harmonických frekvencí, mikroskopii stimulovaného potlačení emise (STED) či skenovací ramanovskou mikroskopii. Společné všem technikám laserové skenovací mikroskopie je, že zkoumaný vzorek je osvětlován tvarovaným svazkem světla generovaným laserem, přičemž oblast ozáření (nejčastěji ve tvaru bodu nebo čáry, případně toroidu či jiného tvaru) je vzorkem skenována tak, aby byla postupně ozářena celá zobrazovaná část vzorku. Svazek světla generovaný (emitovaný) laserem je v tomto textu označován též jako laserový svazek. Světlo emitované nebo odražené od ozářené oblasti vzorku je po průchodu vhodnými optickými prvky detekováno detektorem mikroskopu (např. kamerou, fotonásobičem nebo fotodiodou). Signál detektoru je počítačem zkombinován s informacemi o pozici a tvaru ozářené oblasti tak, aby po proskenování celé zobrazované části vzorku vznikl obraz (případně série obrazů) celé zobrazované části vzorku. Skenování osvětlené oblasti zobrazovanou částí vzorku je možné dosáhnout různými způsoby, např. posouváním (softwarově ovládaným) objektivu nebo stolku se vzorkem. Nejčastěji je však skenování realizováno pohybem laserového svazku vzorkem (tzv. rozmítáním), za pomoci skenovacího mechanismu, který

- 1 CZ 2023 - 221 A3 obsahuje elektricky ovládané, periodicky se natáčející zrcátko, tzv. galvanometrický skener (obvykle zkráceně označovaný jako galvo-skener), případně více takovýchto zrcátek. Rychlost skenování světelným svazkem je limitujícím faktorem pro rychlost získávání obrazů technikami laserové skenovací mikroskopie.

Samotné zvyšování rychlosti galvo-skenerů však v důsledku mechanismu jejich funkce vede pouze k omezenému zvýšení rychlosti akvizice obrazů technikami laserové skenovací mikroskopie. Úhlová rychlost galvo-skenerů je po většinu jejich pracovního cyklu přibližně konstantní, takže světelný výkon laserového svazku dopadající na různé části zkoumaného vzorku bývá taktéž přibližně konstantní. Výjimkou jsou časová období, během kterých se galvo-skener nachází v blízkosti maximálního úhlového vychýlení, kdy dochází k postupnému snižování úhlové rychlosti až do zastavení pohybu, a následně k postupnému zvyšování úhlové rychlosti v opačném směru, až do opětného dosažení přibližně konstantní úhlové rychlosti. Během těchto okrajových časových období je úhlová rychlost galvo-skeneru nižší než během většiny času, a pohyb laserového svazku zkoumaným vzorkem je tudíž v těchto časových obdobích pomalejší. Aby bylo předejito zkresleným výsledkům detekce optických vlastností vzorku způsobeným nekonstantní rychlostí skenování v těchto okrajových časových obdobích, nebývá detekce v těchto obdobích prováděna, případně výsledky detekce nebývají používány k vytvoření obrazu. Aby bylo omezeno poškození zkoumaného vzorku laserovým světlem, bývá někdy laserové osvětlení v těchto časových obdobích vypínáno či blokováno. Čím vyšší je rychlost použitých galvo-skenerů, tím percentuálně větší část pracovního cyklu představuje časové období, během nějž úhlová rychlost skeneru není konstantní. Zvyšování rychlosti galvo-skenerů tudíž vede pouze k omezenému zvýšení rychlosti laserových skenovacích mikroskopů.

Podstata vynálezu

Omezení rychlosti laserových skenovacích mikroskopů v důsledku nekonstantní úhlové rychlosti galvo-skenerů odstraňuje způsob podle předloženého vynálezu využívající modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek tak, že různé části pozorovaného vzorku jsou vystaveny stejnému množství světelné energie i při nekonstantní rychlosti skenování. Tento způsob umožňuje provádět měření optických vlastností zkoumaného vzorku po celou dobu

- 2 CZ 2023 - 221 A3 pracovního cyklu galvo-skeneru, a významně tak zvyšuje rychlost získávání výsledného obrazu technikami laserové skenovací mikroskopie.

Modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek je v jednom uskutečnění vynálezu výhodně prováděna analogově, tj. průběžně, inkrementálně. Analogové modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek může být výhodně dosaženo přiložením vhodného elektrického napětí na vstupní port laseru určený pro analogovou modulaci optického výkonu laseru. Analogové modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek může být výhodně dosaženo též přiložením vhodného elektrického napětí na analogově ovládaný regulátor intenzity laserového svazku, kterým může být např. akusto-optický modulátor nebo elektro-optický modulátor.

Elektrické napětí použité pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek má výhodně časový průběh zvolený tak, že množství světelné energie dopadající během skenování na různé části vzorku zůstává konstantní (čímž se pro potřeby vynálezu rozumí v rozmezí 50 % až 150 % průměrné hodnoty, výhodně 75 % až 125 % průměrné hodnoty, výhodněji 90 % až 110 % průměrné hodnoty). Elektrické napětí použité pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek má výhodně časový průběh nepřímo úměrný množství světelné energie, která by dopadala na různé části pozorovaného vzorku při konstantní intenzitě světla dopadajícího na vzorek Výhodně, velikost elektrického napětí použitého pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek je přímo úměrná momentální rychlosti pohybu laserového svazku vzorkem. Taktéž výhodně, velikost elektrického napětí použitého pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek je přímo úměrná momentální úhlové rychlosti pohybu galvo-skeneru. Pro galvo-skenery se sinusoidálním časovým průběhem úhlového vychýlení (tj. kosinusoidálním časovým průběhem úhlové rychlosti) je časový průběh elektrického napětí použitého pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek výhodně ve tvaru absolutní hodnoty funkce kosinus o stejné fázi a periodě jako funkce sinus popisující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru. Elektrické napětí použité pro analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek je výhodně generováno generátorem elektrických signálů nebo mikrokontrolérem.

Modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek je v jiném uskutečnění vynálezu výhodně prováděna digitálně, tj. skokově, střídavým zapínáním a vypínáním laseru, tak aby množství světelné energie dopadající během skenování na různé části vzorku bylo konstantní. Digitální

- 3 CZ 2023 - 221 A3 modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek může být výhodně dosaženo přiložením vhodného elektrického napětí na vstupní port laseru určený pro digitální modulaci optického výkonu laseru či pro vypínání a zapínání laseru. Této modulace může být výhodně dosaženo též přiložením vhodného elektrického napětí na digitálně ovládaný regulátor intenzity laserového svazku, kterým může být např. akusto-optický modulátor nebo elektro-optický modulátor.

Elektrické napětí použité pro digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek má výhodně časový průběh zvolený tak, že množství světelné energie dopadající během skenování na různé části vzorku zůstává konstantní (čímž se pro potřeby vynálezu rozumí v rozmezí 50 % až 150 % průměrné hodnoty, výhodně 75 % až 125 % průměrné hodnoty, výhodněji 90 % až 110 % průměrné hodnoty). Výhodně, časový průběh elektrického napětí použitého pro digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek (tj. pro zapínání a vypínání laserového svazku) je zvolen tak, že časová frakce, po kterou laserové světlo dopadá na vzorek, je přímo úměrná momentální rychlosti pohybu laserového svazku vzorkem. Taktéž výhodně, časový průběh elektrického napětí použitého pro digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek je zvolen tak, že časová frakce, po kterou laserové světlo dopadá na vzorek, zůstává přímo úměrná momentální úhlové rychlosti pohybu galvo-skeneru. Pro galvo-skenery se sinusoidálním časovým průběhem úhlového vychýlení (tj. kosinusoidálním časovým průběhem úhlové rychlosti) je časový průběh elektrického napětí použitého pro digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek výhodně zvolen tak, že časová frakce, po kterou laserové světlo dopadá na vzorek, je přímo úměrná absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fází a periodě jako funkce sinus popisující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru. Elektrické napětí použité pro digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek je výhodně generováno mikrokontrolérem.

Ve výhodném provedení vynálezu je pohyb galvo-skeneru ovládán (tak jako ve stavu techniky) generátorem elektrických signálů generujícímu elektrické napětí se sinusovým časovým průběhem tak, že úhlová rychlost pohybu zrcátka připojeného ke galvo-skeneru má kosinusoidální časový průběh. Odlišně od stavu techniky jsou však tyto signály též přiváděny do elektronické řídící jednotky, která generuje modulační analogové elektrické napětí s časovým průběhem ve tvaru absolutní hodnoty funkce kosinus, o stejné fázi a frekvenci jako

- 4 CZ 2023 - 221 A3 napětí užívané k ovládání galvo-skeneru. Toto modulační elektrické napětí je přivedeno na vstupní port laseru určený pro analogovou modulaci optického výkonu laseru. Laserový svazek s takto analogově modulovaným optickým výkonem je skenován pozorovaným vzorkem, za současného měření intenzity fluorescence emitované tímto vzorkem.

V dalším výhodném provedení vynálezu je pohyb galvo-skeneru (tak jako ve stavu techniky) ovládán generátorem elektrických signálů generujícímu elektrické napětí se sinusovým časovým průběhem tak, že úhlová rychlost pohybu zrcátka připojeného ke galvo-skeneru má kosinusoidální časový průběh. Odlišně od stavu techniky však jsou tyto signály též přiváděny do elektronické řídící jednotky, která obsahuje mikrokontrolér naprogramovaný tak, že v závislosti na elektrickém napětí na svém vstupním portu vyšle na výstupní port předem naprogramovanou sérii digitálních pulzů napětí. Tato série digitálních pulzů je zvolena tak, že prostřednictvím modulace šířky pulzů (tzv. pulse-width modulation; PWM) vytvoří digitální signál, jehož časová frakce stavu ,zapnuto‘ je průběžně přímo úměrná absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fází a periodě jako funkce sinus popisující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru. Tato série digitálních pulzů je přivedena na vstupní port laseru určený pro digitální modulaci optického výkonu laseru. Laserový svazek s takto digitálně modulovaným optickým výkonem je skenován pozorovaným vzorkem, za současného měření intenzity fluorescence emitované tímto vzorkem.

Modulace intenzity světla dopadajícího na vzorek se výhodně dosáhne přímo modulací laseru samotného, jak bylo výše popsáno, ale intenzita světla dopadajícího na vzorek může být alternativně modulována prostřednictvím modulace optických prvků umístěných mezi laserem a natáčecím zrcátkem, popřípadě prostřednictvím modulace optických prvků umístěných mezi natáčecím zrcátkem a mikroskopem, resp. detektorem mikroskopu.

Předložený vynález se konkrétně týká způsobu osvětlení vzorku světelným svazkem emitovaným laserem při pozorování vzorku laserovým skenovacím mikroskopem, kdy je světelný svazek skenován vzorkem pomocí alespoň jednoho galvo-skeneru, přičemž intenzita světla dopadajícího na vzorek je modulována v závislosti na rychlosti galvo-skeneru tak, že množství světelné energie dodané různým částem pozorovaného vzorku je konstantní.

- 5 CZ 2023 - 221 A3

V jednom výhodném uskutečnění způsobu podle vynálezu je intenzita světla dopadajícího na vzorek modulována pomocí analogových elektrických signálů.

V jiném výhodném uskutečnění je intenzita světla dopadajícího na vzorek modulována pomocí digitálních elektrických signálů.

Při výhodném způsobu podle vynálezu je časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru definován funkcí sinus a časový průběh intenzity světla dopadajícího na vzorek odpovídá absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fázi a periodě jako funkce sinus definující úhlového vychýlení galvo-skeneru.

Dále se předložený vynález týká zařízení pro osvětlení vzorku světelným svazkem emitovaným laserem při laserové skenovací mikroskopii obsahující optický mikroskop, kameru, laser pro generování světelného svazku, optické prvky upravující směr a tvar světelného svazku, alespoň jeden galvo-skener pro rozmítání tohoto světelného svazku a elektronickou řídicí jednotku, kde laser je modulovatelný laser, přičemž optický výkon laseru je regulovatelný prostřednictvím elektrických napěťových signálů; elektronická řídicí jednotka je elektricky propojena s galvoskenerem a laserem, obsahuje generátor elektrických signálů a je uzpůsobena pro generování elektrických signálů pro řízení pohybu galvo-skeneru a současně elektrických signálů synchronizovaných s činností galvo-skeneru pro modulaci laseru o časovém a intenzitním průběhu, při kterém množství světelné energie dopadající po průchodu optickým mikroskopem na různé části pozorovaného vzorku je konstantní i při nekonstantní rychlosti skenování galvo-skenerem.

Ve výhodném uskutečnění zařízení je elektronická řídicí jednotka uzpůsobena pro předávání modulovatelnému laseru, popřípadě prvním optickým prvkům či druhým optickým prvkům, analogových signálů modulujících intenzitu světla dopadajícího na vzorek.

V jiném výhodném uskutečnění je elektronická řídicí jednotka uzpůsobena pro předávání modulovatelnému laseru, popřípadě prvním optickým prvkům či druhým optickým prvkům, digitálních signálů modulujících intenzitu světla dopadajícího na vzorek.

V zařízení podle vynálezu výhodně řídicí jednotka dále obsahuje programovatelný mikrokontrolér elektricky propojený s generátorem elektrických signálů a laserem, kde

- 6 CZ 2023 - 221 A3 mikrokontrolér je uzpůsoben pro převádění napěťových signálů z generátoru elektrických signálů na digitální signály.

Ve výhodném uskutečnění zařízení časový průběh napěťových signálů z generátoru elektrických signálů předávaných modulovatelnému laseru odpovídá absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fázi a periodě jako funkce sinus definující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru.

V jiném výhodném uskutečnění je mikrokontrolér uzpůsoben pro přijímání elektrických signálů shodných se signály pro řízení pohybu galvo-skeneru a pro vytváření digitálního signálu, jehož časová frakce stavu ,zapnuto‘ je průběžně přímo úměrná absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fází a periodě jako funkce sinus definující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru, přičemž tento digitální signál je použit k ovládání intenzity světla dopadajícího na vzorek.

Znaky výhodných uskutečnění vynálezu lze libovolně kombinovat. Předložený vynález je dále podrobněji vysvětlen v příkladech uskutečnění za pomoci připojených výkresů.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Ilustrace časového průběhu veličin klíčových pro funkci vynálezu. A) Sinusoidální časový průběh úhlové výchylky zrcátka typického galvo-skeneru. B) Kosinusoidální časový průběh úhlové rychlosti zrcátka typického galvo-skeneru. C) Výhodný časový průběh intenzity světla dopadajícího na vzorek při analogové modulaci této intenzity dle vynálezu. D) Výhodný časový průběh frakce laserového osvětlení vzorku při digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek laseru dle vynálezu.

Obr. 2: Schematické znázornění vynálezu. Světlo generované laserem po průchodu prvními optickými prvky dopadá na zrcátko, jehož natočení je ovládané galvo-skenerem. Po odrazu od zrcátka galvo-skeneru prochází laserový svazek druhými optickými prvky a mikroskopem tak, že laserové světlo je skenováno pozorovaným vzorkem. Během skenování řídící jednotka, na základě elektrických signálů nesoucích informaci o rychlosti a/nebo pozici galvo-skeneru, reguluje intenzitu světla dopadajícího na vzorek tak, že množství světelné energie dopadající

- 7 CZ 2023 - 221 A3 na různé části zkoumaného vzorku je konstantní i při nekonstantní rychlosti natáčení zrcátka galvoskeneru. Fluorescence je po průchodu mikroskopem a druhými optickými prvky směrována galvoskenerem a optickými prvky 1 do kamery, kterou je detekována.

Obr. 3. A) Schéma řídící jednotky popsané v Příkladu 1. Řídící jednotka obsahuje generátor elektrických signálů, jehož analogové signály kontrolují jak funkci galvo-skeneru, tak intenzitu světla dopadajícího na vzorek. B) Schéma řídící jednotky popsané v Příkladu 2. Řídící jednotka obsahuje generátor elektrických signálů, jehož signály kontrolují funkci galvo-skeneru, ale též vstupují do mikrokontroléru, který na jejich základě generuje digitální signály regulující intenzitu světla dopadajícího na vzorek.

Obr. 4: Ilustrace funkce zařízení dle Příkladu 1 provedení vynálezu. A) Nahoře: obrázek homogenního fluorescentního vzorku získaný bez regulace intenzity světla dopadajícího na vzorek dle vynálezu. Okraje osvětlené oblasti obrázku vykazují vyšší množství fluorescence v důsledku pomalejší rychlosti pohybu skenovacího zrcátka. Dole: Graf ukazující množství detekované fluorescence pro různé části obrázku nahoře. B) Stejné jako v A), avšak za použití zařízení dle Příkladu 1. Je patrné, že různé osvětlené části vzorku emitují podobná množství fluorescence, což odpovídá složení vzorku.

Obr. 5: Ilustrace funkce zařízení dle Příkladu 2 provedení vynálezu. A) Nahoře: obrázek homogenního fluorescentního vzorku získaný bez regulace intenzity světla dopadajícího na vzorek dle vynálezu. Okraje osvětlené oblasti obrázku vykazují vyšší množství fluorescence v důsledku pomalejší rychlosti pohybu skenovacího zrcátka. Dole: Graf ukazující množství detekované fluorescence pro různé části obrázku nahoře. B) Stejné jako v A), avšak za použití zařízení dle Příkladu 2. Je patrné, že různé osvětlené části vzorku emitují podobná množství fluorescence, což odpovídá složení vzorku.

Příklady uskutečnění vynálezu

Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu doprovázené obrázky jsou uvedeny pro ilustraci výhodných uskutečnění, a nikoliv jako omezení rozsahu vynálezu.

- 8 CZ 2023 - 221 A3

Na Obr. 1 jsou znázorněny časové průběhy veličin klíčových pro funkci vynálezu, vztahující se k oběma příkladům uskutečnění vynálezu uvedeným dále. Obr. 1A ukazuje sinusoidální časový průběh úhlové výchylky zrcátka typického galvo-skeneru. Obr. 1B ukazuje kosinusoidální časový průběh úhlové rychlosti zrcátka typického galvo-skeneru. Obr. 1C demonstruje výhodný časový průběh intenzity světla dopadajícího na vzorek při analogové modulaci této intenzity (dále v Příkladu 1) a Obr. 1D demonstruje výhodný časový průběh frakce laserového osvětlení vzorku při digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek (dále v Příkladu 2).

Příklad 1

Zařízení pro osvětlení vzorku pro konfokální laserovou skenovací fluorescenční mikroskopii využívající analogovou modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek

Zařízení schematicky znázorněné na OBR. 2 ve spojení s optickým mikroskopem M (Olympus IX70) uzpůsobeným pro umístění zkoumaného vzorku a kamerou C (Andor iXon Ultra 888) pro snímání světla emitovaného vzorkem nebo odraženého od vzorku představuje sestavu laserového skenovacího mikroskopu. Zařízení obsahuje analogově modulovatelný laser L (Cobolt 06-MLD, 488 nm), první optické prvky OE1 a druhé optické prvky OE2 upravující směr a tvar laserového svazku a pozorované fluorescence, galvo-skener GS (GSI-Lumonics Z2283) uzpůsobený pro skenování laserového svazku generovaného laserem L vzorkem a pro směrování pozorované fluorescence ke kameře C a elektronickou řídicí jednotku CU. Optické prvky OE1 obsahují optické čočky, filtry a zrcátka, včetně dichroického zrcátka separujícího detekovanou fluorescenci a laserovou iluminaci. Optické prvky OE2 obsahují optické čočky a zrcátka. Optické prvky OE1 a OE2 jsou běžného provedení, jak jsou odborníkovi známy. Elektronická řídicí jednotka CU (Obr. 3A) obsahuje generátor EG elektrických signálů (Joy-it JT-JDS6600), který generuje signály pro ovládání galvo-skeneru GS a současně signály pro modulaci výkonu laseru L a je elektricky propojen s galvo-skenerem GS pro předávání napěťových signálů pro ovládání galvo-skeneru GS a s modulovatelným laserem L pro předávání analogových signálů pro modulaci optického výkonu laseru L. V alternativním provedení je možné místo generátoru EG elektrických signálů využít mikrokontrolér MC.

- 9 CZ 2023 - 221 A3

Zařízení fokusuje laserový svazek generovaný modulovatelným laserem L do tvaru čáry, kterou je galvo-skenerem GS po průchodu mikroskopem M skenováno vzorkem. Fluorescence emitovaná vzorkem je po průchodu mikroskopem M a optickými prvky OE1 a OE2 detekována kamerou C. Jako kontrolní vzorek pro ověření funkce zařízení je zde užit homogenní roztok zeleného fluorescentního proteinu umístěný mezi podložní a krycí sklíčko. Elektronická řídící jednotka CU obsahuje generátor EG elektrických signálů naprogramovaný tak, že generuje současně sinusoidální napěťové signály ovládající pohyb galvo-skeneru GS a signály ve tvaru absolutní hodnoty kosinu, které jsou přivedeny na port laseru L určený pro analogovou modulaci optického výkonu laseru L. Svazek světla vycházející z laseru L po průchodu prvními optickými prvky OE1 dopadá na zrcátko galvo-skeneru GS, který toto světlo směruje skrze druhé optické prvky OE2 a mikroskop M do různých částí pozorovaného homogenně fluorescentního vzorku. Na Obr. 4A je patrné, že při absenci modulace optického výkonu laseru, tj. intenzity světla dopadajícího na vzorek, mikroskop detekuje výrazně (deseti- až dvacetinásobně) více fluorescence v krajních oblastech skenování (tj. v časových obdobích, kdy je pohyb galvo-skeneru GS pomalejší a nerovnoměrný), než v centrální oblasti (kdy je pohyb galvo-skeneru GS rychlý a přibližně rovnoměrný). Použitelné pro měření intenzity fluorescence jsou tak pouze časové intervaly, během nichž je pohyb galvo-skeneru GS rychlý a rovnoměrný. Při modulaci optického výkonu laseru L elektronickou řídící jednotkou CU v součinnosti s pohybem galvo-skeneru GS dle vynálezu (Obr. 4B) je intenzita fluorescence detekovaná mikroskopem M, resp. kamerou C ve všech částech skenované oblasti téměř identická, což demonstruje, že zařízení dle příkladu 1 umožňuje využít pro měření intenzity fluorescence celý pracovní cyklus galvo-skeneru GS.

Příklad 2

Zařízení pro osvětlení vzorku pro konfokální laserovou skenovací fluorescenční mikroskopii využívající digitální modulaci intenzity světla dopadajícího na vzorek

Zařízení obsahuje v podstatě stejné komponenty jako v příkladu 1 (schematicky znázorněné na OBR. 2) s tím, že modulovatelný laser L (Cobolt 06-MLD, 488 nm) je modulovaný digitálně. Elektronická řídicí jednotka CU (Obr. 3B) obsahuje generátor EG elektrických signálů (Joy-it JT- 10 CZ 2023 - 221 A3

JDS6600) a programovatelný mikrokontrolér MC (PJRC Teensy 4.1). Generátor EG generuje signály pro ovládání galvo-skeneru GS a je elektricky propojen s galvo-skenerem GS pro předávání napěťových signálů pro ovládání galvo-skeneru GS a s mikrokontrolérem MC pro předávání signálů na vstupní port mikrokontroléru MC. Mikrokontrolér MC je svým výstupním portem propojen se vstupním portem laseru L pro předávání digitálních signálů pro modulaci optického výkonu laseru L. Mikrokontrolér MC je uzpůsoben pro přijímání analogových signálů a jejich převod na digitální signály podle předem definovaného schématu.

Zařízení fokusuje laserový svazek generovaný laserem L do tvaru čáry, kterou je galvo-skenerem GS po průchodu mikroskopem M skenováno vzorkem. Fluorescence emitovaná vzorkem je po průchodu mikroskopem M a optickými prvky OE1 a OE2 detekována kamerou C. Kamera C je v tomto uspořádání, stejně jako v Příkladu 1, připojena k prvním optickým prvkům OE1, ale v alternativním uspořádání může být kamera připojena ke druhým optickým prvkům OE2 nebo přímo k mikroskopu M. Jako kontrolní vzorek pro ověření funkce zařízení je zde (tak jako v příkladu 1) užit homogenní roztok zeleného fluorescentního proteinu umístěný mezi podložní a krycí sklíčko. Elektronická řídící jednotka CU obsahuje generátor EG elektrických signálů a programovatelný mikrokontrolér MC. Generátor EG elektrických signálů generuje sinusoidální napěťové signály ovládající pohyb galvo-skeneru GS. Tyto signály jsou zároveň přiváděny na vstupní port mikrokontroléru MC. Mikrokontrolér MC je naprogramován tak, že při změně napětí na svém vstupním portu vyšle na výstupní port předem naprogramovanou sérii digitálních pulsů napětí. Tato série digitálních pulzů je zvolena tak, že prostřednictvím modulace šířky pulzů (tzv. pulse-width modulation; PWM) vytvoří digitální signál, jehož časová frakce stavu ,zapnuto‘ je průběžně přímo úměrná absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fází a periodě jako funkce sinus popisující časový průběh úhlového vychýlení galvo-skeneru GS. Tento digitální signál (tj. výstup z mikrokontroléru MC) je přiveden na vstupní port laseru L určený pro digitální modulaci optického výkonu laseru L. Na Obr. 5A je patrné, že při absenci modulace optického výkonu laseru, tj. intenzity světla dopadajícího na vzorek, mikroskop M, resp. kamera C detekuje výrazně (desetiaž dvacetinásobně) více fluorescence v krajních oblastech skenování, v časových obdobích, kdy je pohyb galvo-skeneru GS pomalejší a nerovnoměrný, než v centrální oblasti, kdy je pohyb galvoskeneru GS rychlý a přibližně rovnoměrný. Použitelné pro měření intenzity fluorescence jsou tak pouze časové intervaly, během nichž je pohyb galvo-skeneru GS rychlý a rovnoměrný.

- 11 CZ 2023 - 221 A3

Při modulaci optického výkonu laseru L v součinnosti s pohybem galvo-skeneru GS (Obr. 5B) je intenzita fluorescence detekovaná mikroskopem M, resp. kamerou C ve všech částech skenované oblasti téměř identická, což demonstruje, že zařízení dle příkladu 2 umožňuje využít pro měření intenzity fluorescence časový interval celého pracovního cyklu galvo-skeneru GS.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob osvětlení vzorku světelným svazkem emitovaným laserem (L) při pozorování vzorku laserovým skenovacím mikroskopem, kdy je světelný svazek skenován vzorkem pomocí alespoň jednoho galvo-skeneru (GS), vyznačující se tím, že intenzita světla dopadajícího na vzorek je modulována v závislosti na rychlosti galvo-skeneru (GS) tak, že množství světelné energie dodané různým částem pozorovaného vzorku je konstantní.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že intenzita světla dopadajícího na vzorek je modulována pomocí analogových elektrických signálů.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že intenzita světla dopadajícího na vzorek je modulována pomocí digitálních elektrických signálů.
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že časový průběh úhlového vychýlení galvoskeneru (GS) je definován funkcí sinus a časový průběh intenzity světla dopadajícího na vzorek odpovídá absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fázi a periodě jako funkce sinus definující úhlového vychýlení galvoskeneru (GS).
5. 5. Zařízení pro osvětlení vzorku světelným svazkem emitovaným laserem (L) při laserové skenovací mikroskopii obsahující optický mikroskop (M), kameru (C), laser (L) pro generování světelného svazku, optické prvky (OE1, OE2) upravující směr a tvar světelného svazku, alespoň jeden galvo-skener (GS) pro rozmítání tohoto laserového svazku a elektronickou řídicí jednotku (CU), vyznačující se tím, že laser (L) je modulovatelný laser, kde optický výkon laseru L je regulovatelný prostřednictvím elektrických napěťových signálů;

   elektronická řídicí jednotka (CU) je elektricky propojena s galvo-skenerem (GS) a laserem (L), obsahuje generátor (EG) elektrických signálů a je uzpůsobena pro generování elektrických signálů pro řízení pohybu galvoskeneru (GS) a současně elektrických signálů synchronizovaných s činností galvoskeneru (GS) pro modulaci laseru (L) o časovém a intenzitním průběhu, při kterém množství světelné energie dopadající po průchodu optickým mikroskopem (M) na různé části pozorovaného vzorku je konstantní i při nekonstantní rychlosti skenování galvo-skenerem (GS).
6. 6. Zařízení podle nároku 5, vyznačující se tím, že elektronická řídicí jednotka (CU) je uzpůsobena pro předávání modulovatelnému laseru (L), popřípadě prvním optickým prvkům (OE1) či druhým optickým prvkům (OE2), analogových signálů modulujících intenzitu světla dopadajícího na vzorek.
7. 7. Zařízení podle nároku 5, vyznačující se tím, že elektronická řídicí jednotka (CU) je uzpůsobena pro předávání modulovatelnému laseru (L), popřípadě prvním optickým prvkům (OE1) či druhým optickým prvkům (OE2), digitálních signálů modulujících intenzitu světla dopadajícího na vzorek.
8. 8. Zařízení podle nároku 7, vyznačující se tím, že řídicí jednotka (CU) dále obsahuje programovatelný mikrokontrolér (MC) elektricky propojený s generátorem (EG) elektrických signálů a laserem (L), kde mikrokontrolér (MC) je uzpůsoben pro převádění napěťových signálů z generátoru (EG) elektrických signálů na digitální signály.
9. 9. Zařízení podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že časový průběh napěťových signálů z generátoru (EG) elektrických signálů předávaných modulovatelnému laseru (L) odpovídá absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fázi a periodě jako funkce sinus definující časový průběh úhlového vychýlení galvoskeneru (GS).
10. 10. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, že mikrokontrolér (MC) je uzpůsoben pro přijímání elektrických signálů shodných se signály pro řízení pohybu galvo-skeneru (GS) a pro vytváření digitálního signálu, jehož časová frakce stavu ,zapnuto‘ je průběžně přímo úměrná absolutní hodnotě funkce kosinus o stejné fází a periodě jako funkce sinus definující časový

    - 13 CZ 2023 - 221 A3 průběh úhlového vychýlení galvoskeneru (GS), přičemž tento digitální signál je použit k ovládání intenzity světla dopadajícího na vzorek.