CZ202448A3 - Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií - Google Patents

Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií

Info

Publication number
CZ202448A3
CZ202448A3 CZ2024-48A CZ202448A CZ202448A3 CZ 202448 A3 CZ202448 A3 CZ 202448A3 CZ 202448 A CZ202448 A CZ 202448A CZ 202448 A3 CZ202448 A3 CZ 202448A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
acid
polysaccharides
minutes
mixture
carried out
Prior art date
Application number
CZ2024-48A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ310520B6 (cs
Inventor
Jaroslav Hrabák
Hrabák Jaroslav prof. Ing., Ph.D.
Lucia Ďaďovská
MSc. Ďaďovská Lucia Mgr.
Original Assignee
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Karlova filed Critical Univerzita Karlova
Priority to CZ2024-48A priority Critical patent/CZ310520B6/cs
Priority to PCT/CZ2025/050014 priority patent/WO2025171832A1/en
Publication of CZ202448A3 publication Critical patent/CZ202448A3/cs
Publication of CZ310520B6 publication Critical patent/CZ310520B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Předkládané řešení poskytuje způsob detekce a/nebo identifikace mikrobiálních polysacharidů pomocí hmotnostní spektrometrie, při němž se polysacharidy rozštěpí enzymaticky nebo kyselou hydrolýzou na redukující monosacharidy a/nebo oligosacharidy, poté se reakcí aldehydové skupiny redukujících monosacharidů a/nebo oligosacharidů a NH2 skupiny ligandu obecného vzorce I, připraví konjugát(y), který(é) se následně podrobí ionizaci a měření hmotnostní spektrometrií.

Description

Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce a identifikace polysacharidů bakterií a mikromycet hmotnostní spektrometrií, zejména vhodného pro detekci polysacharidů buněčné stěny pro subtypizaci mikrobů a jejich identifikaci z klinického vzorku.
Dosavadní stav techniky
Zavedení MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) hmotnostní spektrometrie (MS) do laboratorní diagnostiky přineslo významnou změnu v taxonomické identifikaci mikrobů. Tato technologie umožnila výrazné zkrácení doby potřebné pro dosažení taxonomické identifikace bakterií a mikromycet, stejně jako rychlou identifikaci mikrobů z hemokultur a dalších klinických vzorků, např. moči. Podobně byly vyvinuty a ověřeny aplikace pro stanovení antibiotické rezistence pro použití v klinické diagnostice. Z nich se rutinně používá stanovení aktivity beta-laktamázy detekcí změn molekulové hmotnosti indikátoru, betalaktamového antibiotika, nebo detekce polymyxinové rezistence pomocí analýzy lipidu A lipopolysacharidů.
V souvislosti s výskytem infekcí spojených se zdravotní péčí však konvenční druhová identifikace mikrobů, zejména bakterií, neposkytuje dostatečné údaje ani pro vhodnou počáteční antibiotickou terapii, ani pro epidemiologické studie sledující šíření a identifikaci zdrojů infekčních agens, případně pro účely ověření účinnosti vakcín.
Přestože MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie poskytuje účinnou a rychlou identifikaci na úroveň druhu, využití této metody pro epidemiologické typování přímo ze získaných spekter je obtížné a dosud nebyla nalezena spolehlivá metoda nebo algoritmus, umožňující hlubší srovnávání identifikovaných druhů (subtypizaci).
Navzdory použití metod umělé inteligence pro analýzu proteinových spekter získaných pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie chybí v signálu informace o látkách, které se obtížně ionizují, případně jsou přítomny ve vzorku ve velmi malé koncentraci. Tento fakt je způsoben skutečností, že pro rutinní použití MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie je nejčastěji používán celobuněčný extrakt, sestávající především z proteinů a peptidů v oblasti molekulových hmotností 2000 až 20 000 g/mol.
Další vyvinuté metody pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii využívají analýzu lipidů buněčné stěny, a to nejen pro detekci rezistence k polymyxinovým antibiotikům, ale také pro přímou identifikaci a typizaci některých bakterií s buněčnou stěnou bohatou na lipidy, např. Mycobacterium spp. Podobně lze analyzovat i proteiny periplasmového prostoru, např. betalaktamázy, které je nutné specificky izolovat a stabilizovat s následnou detekcí pomocí MALDITOF hmotnostní spektrometrie.
Zmíněné povrchové struktury mikrobiální buněčné stěny (např. lipidy, proteiny) hrají důležitou roli v antibiotické rezistenci, typizaci bakterií pro epidemiologické účely a pro vývoj nových vakcín, protože většina z nich je společným cílem imunitní odpovědi na infekci. Nej důležitější z těchto povrchových struktur jsou lipopolysacharidy (především u bakterií z řádu Enterobacterales včetně Escherichia coli. Salmonella spp., Schigella spp., nebo bakterií rodu Pseudomonas spp.), polysacharidy (například u bakterií Haemophilus influenzae. Neisseria meningitidis. Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), případně membránové proteiny (například u bakterií Escherichia coli, Neisseria meningitidis, nebo Streptococcus pyogenes). U mikromycet jsou důležité polysacharidy buněčné stěny, jako například galaktomanan u druhu
- 1 CZ 2024 - 48 A3
Aspergillus spp. nebo glukan u kvasinek (např. Candida spp.). Tyto oligosacharidy a poly sacharidy lze využít i pro detekci mikrobů z klinického vzorku.
Analýza sacharidů/oligosacharidů/polysacharidů pomocí hmotnostní spektrometrie je komplikovaná kvůli špatné ionizační schopnosti a velikosti analyzovaných polysacharidů. Oproti analýze peptidů, proteinů a lipidů, kde jek dispozici řada různých technik, v oblasti detekce polysacharidů je potřeba tyto struktury specificky štěpit a derivatizovat.
Obecně platí, že polysacharidy mají velkou variaci ve složení jednotlivých monosacharidů a velkou diverzitu ve vazbě a větvení. Vzhledem k jejich poměrně složité struktuře dosud neexistuje pro analýzu hmotnostní spektrometrií žádný postup, který by umožňoval specifické štěpení polysacharidů (např. univerzální enzym, chemická hydrolýza). Rovněž, aby se dosáhlo ionizace požadované pro detekci MS, musí být odštěpené glykanové jednotky derivatizovány (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32770134/). Tento přístup může využívat značení aldehydové skupiny na redukujícím konci glykanu, typicky prostřednictvím redukční aminace, při níž primární amin reaguje za vzniku iminu nebo Schiffovy báze. Ve druhém kroku je sloučenina redukována na sekundární amin. V této oblasti se široce používají molekuly jako 2aminobenzamid, 2-aminobenzoová kyselina, 2-aminopyridin, 2-aminonaftalentrisulfonová kyselina a l-aminopyren-3,6,8-trisulfonová kyselina (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29553244/). Dalšími alternativami pro redukční aminaci jsou hydrazidová činidla, jako je (karboxymethyl)trimethylamoniumchlorid hydrazid (Girardovo činidlo T) (https ://pubmed .nebi .nim ,nih, gov/305 98139/) nebo fenyl-3-methyl-5-pyrazolon (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2817366/).
Extrakce polysacharidů z bakteriální buňky je obvykle prováděna laboratorně náročnými technikami, jako je například extrakce pomocí horkého fenolu (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22688346/). Obdobně byly publikovány metody, které k extrakci lipopolysacharidu vyžadují vystavení vzorku bakterií různým enzymům s následnou extrakcí butanolem a lyofilizací (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19490391/). Tyto metody jsou časově i laboratorně náročné a v diagnostické praxi rutinní laboratoře nepoužitelné.
Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout méně laboratorně náročný způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů, použitelný i pro přímou detekci mikrobů z klinického vzorku, což je v současnosti nesmírně důležité.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob detekce a/nebo identifikace mikrobiálních polysacharidů pomocí hmotnostní spektrometrie, jehož podstata spočívá v tom, že se polysacharidy rozštěpí enzymaticky nebo kyselou hydrolýzou na redukující monosacharidy nebo oligosacharidy, reakcí jejichž aldehydové skupiny aNH2 skupiny ligandu obecného vzorce I
-2CZ 2024 - 48 A3 kde L je vybrané ze skupiny zahrnující , kde n je od 1 do 3, o o
...............C........, , kde m je 1 nebo 2, a , přičemž v obecném vzorci I je methoxyfenolová skupina vázána k uhlíkovému atomu spojky L,
V
--δ—OH kde R1, R2 a R4 jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom vodíku a O kde R3 je vybrán ze skupiny zahrnující atom vodíku a methyl, se připraví konjugát, který se následně podrobí ionizaci a měření hmotnostní spektrometrií.
V jednom provedení je L vybrané ze skupiny sestávající z
V jednom provedení mají ligandy obecného vzorce I strukturu obecného vzorce la:
kde je 2-methoxyfenol-4-yl vázán k uhlíkovému atomu spojky L, přičemž spojka L je definována výše. —
V některých provedeních je L v obecném vzorci I skupina ' '~
V některých provedeních má ligand obecného vzorce la strukturu vzorce II:
HiK JitiX
XXX J(XX
V X(ii)
V některých provedeních je L v obecném vzorci I skupina —“NH —“C
V některých provedeních má ligand obecného vzorce la strukturu vzorce III:
- 3 CZ 2024 - 48 A3
V některých provedeních je L v obecném vzorci I skupina
V některých provedeních má ligand obecného vzorce la strukturu vzorce IV:
V některých provedeních se před rozštěpením mikrobiální polysacharidy izolují ze vzorku obsahujícího mikrobiální buňky a/nebo mikrobiální polysacharidy extrakcí. Vzorkem obsahujícím mikrobiální buňky může být například bakteriální kultura nebo kultura mikromycety (vláknité houby nebo kvasinky), nebo klinický vzorek odebraný od pacienta.
V jiných provedeních mohou být mikrobiální polysacharidy štěpeny přímo z buněk bakterií nebo mikromycet, případně přímo ve vzorku odebraného od pacienta, bez předchozí izolace.
Extrakce polysacharidů se s výhodou provádí tak, že se bakterie pomnožené na médiu určeném pro kultivaci bakterií nebo mikromycet, např. vybraném z agaru Mueller-Hintonové (MH bujónu), krevního agaru, čokoládového agaru, agaru připraveného z média BHI (brain-heart infusion, infuze mozkové a srdeční tkáně) a Sabourad agaru s dextrózou, přenesou bakteriologickou kličkou do lyzačního pufru a resuspendují. Lyzační pufr obsahuje detergent, který umožní uvolnění póly sacharidových struktur z buněčné stěny, ve výhodném provedení je lyzačním pufrem pufr octanu sodného s obsahem chloridu sodného a detergentu, kterým je např. lauroyl sarkosinát a/nebo dodecylsulfát sodný. Směs se inkubuje při teplotě 20 až 50 °C, s výhodou při teplotě 50 °C, výhodně s třepáním, aby došlo k efektivnímu uvolnění polysacharidových struktur. Inkubace obvykle probíhá po dobu 10 až 60 minut, s výhodou po dobu 30 minut. Směs se centrifuguje a supernatant prostý buněk se použije do dalšího kroku štěpení polysacharidů.
Štěpení polysacharidů lze s výhodou provést kyselou hydrolýzou tak, že se k supematantu získanému podle předchozího postupu přidá kyselina, s výhodou kyselina vinná, kyselina chlorovodíková, a/nebo kyselina glyoxalová v koncentraci alespoň 1M a směs se inkubuje alespoň 20 minut při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C. Směs je výhodné pro zvýšení výtěžku štěpných produktů během inkubace třepat. Směs štěpených monosacharidů a
-4CZ 2024 - 48 A3 oligosacharidů se použije dále.
Dalším možným provedením je štěpení polysacharidů enzymaticky. Enzymatické štěpení se provádí s pomocí enzymu vybraného ze skupiny a-amyláza, β-amyláza, lysozym, endopeptidáza. K supematantu získanému podle předchozího postupu se přidá enzym v pufru. Pufr je volen takový, aby byl vhodný pro aktivitu a pH enzymu, lze vybírat například z pufrů HEPES (pufr na bázi A-2-hydroxyethylpiperazin-A'-2-ethansulfonové kyseliny) nebo MES (pufr na bázi kyseliny 2-(A-morfblino)-ethansulfonové). Štěpení se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 20 minut, s výhodou 20 až 60 minut. Směs je vhodné pro zvýšení výtěžku štěpných produktů během inkubace třepat. Směs štěpených monosacharidů a oligosacharidů se použije dále.
V dalším provedení lze štěpení polysacharidů provést přímo z mikrobiální kultury, bez předchozího kroku izolace polysacharidů, a to tak, že se směs mikrobů resuspenduje v roztoku kyseliny, s výhodou kyseliny vinné, kyseliny glyoxalové a/nebo kyseliny chlorovodíkové, v koncentraci alespoň 1M a inkubuje se alespoň 10 minut, s výhodou 30 minut při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C. Po inkubaci se provede centrifugace a supernatant obsahující štěpené sacharidy a oligosacharidy je použit dále.
Dalším možným provedením kroku štěpení polysacharidů je štěpení polysacharidů pomocí enzymu vybraného ze skupiny zahrnující a-amylázu, β-amylázu, lysozym a/nebo endopeptidázu, přímo na mikrobiální kultuře, bez předchozí izolace polysacharidů. Lysozym nebo endopeptidáza se přidávají tehdy, pokud má být ve vzorku pomocí MALDI-TOF MS detekována složka buněčné stěny mikrobů, například peptidoglykan. Mikrobiální kultura se resuspenduje v pufru. Pufr je volen takový, aby byl vhodný pro aktivitu a pH enzymu, lze vybírat například z pufrů HEPES nebo MES. Ke směsi se následně přidá enzym (a-amyláza, β-amyláza, lysozym a/nebo endopeptidáza). Štěpení se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 10 minut, s výhodou 20 až 60 minut. Směs je vhodné pro zvýšení výtěžku štěpných produktů během inkubace třepat. Směs štěpených monosacharidů a oligosacharidů se použije dále.
Ještě dalším možným provedením kroku štěpení polysacharidů je kyselé štěpení polysacharidů přímo ze vzorku odebraného od pacienta, bez předchozí izolace polysacharidů. Takovým vzorkem je klinický vzorek, např. moč, mozkomíšní mok a/nebo výpotek. Ke vzorku se přidá kyselina, s výhodou kyselina vinná a/nebo kyselina chlorovodíková, v koncentraci alespoň 1M. Směs se inkubuje po dobu alespoň 10 minut, s výhodou 20 až 60 minut, při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C. Je-li ve vzorku očekáván mikrob ve formě celé buňky, lze pro zvýšení sensitivity vzorek centrifugovat a kyselinu přidat k peletě. Směs štěpených monosacharidů a oligosacharidů se použije dále.
Dalším možným provedením kroku štěpení polysacharidů je enzymatické štěpení polysacharidů přímo ze vzorku odebraného od pacienta, bez předchozí izolace polysacharidů. Enzym pro štěpení je vybraný ze skupiny a-amyláza, β-amyláza, lysozym a endopeptidáza, a přidá se ke vzorku v pufru. Lysozym nebo endopeptidáza se přidávají tehdy, má-li být ve vzorku detekována složka buněčné stěny mikrobů, například peptidoglykan. Pufr je volen takový, aby byl vhodný pro aktivitu a pH enzymu, lze vybírat například z pufrů HEPES a/nebo MES. Štěpení polysacharidů se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 10 minut, s výhodou 20 až 60 minut. Směs je vhodné pro zvýšení výtěžku štěpných produktů během inkubace třepat. Je-li ve vzorku očekáván mikrob ve formě celé buňky, lze pro zvýšení sensitivity vzorek centrifugovat a enzym přidat k peletě. Směs štěpených monosacharidů a oligosacharidů se použije dále.
Ligand umožňující vazbu na detekované sacharidy a následnou ionizaci je připraven tak, že se molekula fuchsinu rozpustí ve vhodném rozpouštědle, například ethanolu v kyselém prostředí, s výhodou prostředí kyseliny chlorovodíkové, kyseliny vinné, kyseliny trifluoroctové, kyseliny mravenčí a/nebo kyseliny sírové o koncentraci alespoň 1 mM, s výhodou 1 až 10 mM. Ke směsi
- 5 CZ 2024 - 48 A3 se přidá látka umožňující ionizaci ligandu, s výhodou vanilin, 3-(4-hydroxyfenyl)akrylaldehyd, a/nebo aldehyd kyseliny 4-hydroxy-3-methoxyskořicové ve shodné molámí koncentraci. Směs se inkubuje 10 až 30 minut, a následně se provede odpaření, např. pomocí lyofilizace, tak, aby teplota nepřekročila 70 °C. Směs získaných produktů je purifikována, např. pomocí nosiče C18, tak, aby byl získán ligand pouze s jedinou navázanou molekulou umožňující ionizaci ligandu, tj. molekulou vanilinu, molekulou 3-(4-hydroxyfenyl)akrylaldehydu nebo molekulou aldehydu kyseliny 4-hydroxy-3 -methoxyskořicové.
V dalším možném provedení je ligand umožňující vazbu na detekované sacharidy a následnou ionizaci připraven pomocí vazebného činidla, například l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyljkarbodiimidu a/nebo W-dicyklohcxylkarbodiimidu tak, že se molekula fuchsinu rozpuštěná v rozpouštědle, například ethanolu, nebo ve fosfátovém pufiru (pH 6 až 8) smíchá s molámě ekvivalentní koncentrací kyseliny vanilinové, kyseliny ferulové, kyseliny pkumarové a/nebo kyseliny 4-hydroxy-3-methoxyskořicové. Směs se inkubuje při teplotě 4 až 40 °C, po dobu alespoň 20 minut, s výhodou po dobu 60 minut při teplotě 35 °C. Následně se provede odpaření, např. pomocí lyofilizace, tak, aby teplota nepřekročila 70 °C.
Směs získaných produktů je purifikována, např. pomocí nosiče C18 tak, aby byl získán ligand pouze sjedinou navázanou molekulou umožňující ionizaci ligandu, tj. molekulou kyseliny vanilinové, molekulou kyseliny ferulové, molekulou kyseliny p-kumarové nebo molekulou kyseliny 4-hydroxy-3 -methoxyskořicové.
Ligand obecného vzorce I se ke směsi štěpených monosacharidů a oligosacharidů přidá v pufiru při pH v rozmezí 2 až 6, s výhodou při pH 3. Zejména výhodným pufrem je octanový pufr s přídavkem 25 mM síranu, přičemž síranem může být například síran lithný, síran měďnatý a/nebo síran sodný. Směs se inkubuje po dobu alespoň 10 minut, s výhodou 30 minut, při teplotě 20 až 70 °C, s výhodou při zhruba 50 °C. Při teplotách nad 70 °C se ligand obecného vzorce I rozpadá. Redukující monosacharidy a oligosacharidy se svou aldehydovou skupinou naváží na primární amin ligandu obecného vzorce I za vzniku konjugátu.
Příklad konjugátu ligandu vzorce II s molekulou glukózy je uveden jako vzorec V:
Obdobně tvoří konjugáty i další monosacharidy a oligosacharidy.
Ligand obecného vzorce I se sám o sobě velmi dobře ionizuje, čímž také zajišťuje ionizaci na něj navázaných monosacharidů a oligosacharidů pro hmotnostní spektrometrii. Ligand sám o sobě tedy slouží k ionizaci molekuly konjugátu a není nutné přidávat matrici.
Směs monosacharidů a oligosacharidů s navázaným ligandem se s výhodou analyzuje pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie.
Ve výhodném provedení se pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie vzorek
-6CZ 2024 - 48 A3 přečistí pomocí C18 nosiče, například pomocí technologie ZipTip (Merck), a to tak, že se nosič nejprve hydratuje acetonitrilem s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí, následně 0,1% obj. vodným roztokem kyseliny mravenčí, poté se na nosič nanese vzorek a promyje se 0,1% obj. vodným roztokem kyseliny mravenčí. Přečištěné produkty se eluují roztokem s 80 % obj. acetonitrilu s vodným roztokem s 0,1 % obj. kyseliny mravenčí přímo na MALDI destičku. Po zaschnutí se provede měření.
S výhodou je také možné analyzovat směs monosacharidů a oligosacharidů s navázaným ligandem obecného vzorce I pomocí hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizací kombinované s vysokotlakou kapalinovou chromatografií (LC/MS).
Identifikace mikrobů se s výhodou provádí srovnáním naměřených spekter hmotnostní spektrometrie s referenčními spektry sacharidových profilů získanými od známých mikrobů (např. bakterie nebo mikromycety). Známé mikroby pro naměření referenčních spekter mohou být například charakterizované pomocí serotypizace nebo celogenomového sekvenování. Případně lze srovnávat spektra hmotnostní spektroskopie neznámých vzorků se spektry póly sacharidů o známých strukturách.
Pro měření referenčních spekter je vhodné používat vzorky, kde se provede před štěpením polysacharidů krok přečištění polysacharidů extrakcí.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Spektrum nepurifikováného ligandu vzorce II.
Obrázek 2. Spektrum demonstrující vazbu glukózy (a) (m/z 586) a laktózy (b) (m/z 748) na ligand vzorce II s následným zobrazením pomocí hmotnostní spektrometrie.
Obrázek 3. Spektrum sacharidů lipopolysacharidu získaného z kmenů Escherichia coli sérotypů 026 (a) a 055 (b) a Salmonella enterica serovar Enteritidis (c).
Obrázek 4. Spektrum získané z lipidu A Escherichia coli (a) a lipoteichoové kyseliny Staphylococcus aureus (b).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava ligandu vzorce II
Bazický fuchsin v koncentraci 20 mM byl rozpuštěn v absolutním ethanolu s kyselinou chlorovodíkovou v koncentraci 0,15 M. Ve směsi byl za stálého třepání rozpuštěn vanilin v koncentraci 20 mM. Směs byla inkubována 12 hodin při teplotě 20 °C. Následně byla ke směsi přidána destilovaná voda do finální koncentrace směsi 50 % obj. Směs byla vysušena lyofilizací. Lyofilizovaná směs byla následně rozpuštěna v roztoku 20mM hydroxidu sodného obsahujícího 20mM kyanoborohydrid sodný. Po inkubaci 4 hodiny byla směs obsahující bazický fuchsin s navázaným vanilinem na jednom, dvou nebo třech vazebných místech obsahujících primární amin opět vysušena lyofilizací (MALDI-TOF MS spektrum směsi je zobrazeno na obrázku 1 spektrum obsahuje bazický fuchsin [m/z 288], bazický fuchsin s navázaným vanilinem [m/z 424], bazický fuchsin s navázanými dvěma molekulami vanilinu \m z 558] a bazický fuchsin s navázanými třemi molekulami vanilinu \m z 696]). Spektrum demonstruje nepurifikovaný ligand obsahující vazby na všech pozicích obsahujících primární amin. Směs byla rozpuštěna ve vodném roztoku 5 % obj. acetonitrilu obsahujícím 0,1 % obj. kyseliny trifluoroctové a purifikována na koloně obsahující Cl8 nosič gradientem vodného roztoku acetonitrilu 5 až 50 %
-7 CZ 2024 - 48 A3 obj. s 0,1% obj. kyselinou trifluoroctovou. Frakce obsahující ligand vzorce II (m/z 424) byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie a vysušeny lyofilizací.
Příklad 2: Vazba glukózy nebo laktózy na ligand vzorce II
Glukóza nebo laktóza v koncentraci 5 mM rozpuštěná v 25mM octanu sodném s obsahem 5mM síranu lithného o objemu 25 μΐ byla smí sena s ekvivalentním množstvím 5 mM ligandu vzorce II rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. 25 μΐ směsi bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1% obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu s vodným roztokem 0,1% obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Získaná spektra jsou uvedena na obrázku 2. Část A obrázku 2 demonstruje vazbu ligandu vzorce II s glukózou. Molekulová hmotnost výsledné molekuly je prostým součtem molekulových hmotností ligandu vzorce II a glukózy za odštěpení molekuly vody (m/z 586). Část B demonstruje vazbu ligandu vzorce II a laktózy při odštěpení molekuly vody s tím, že výsledná molekula je zobrazena jako signál o m/z 748. Shodným postupem byly testovány ligandy vzorce III a IV. V tomto případě byla detekována glukóza s navázaným ligandem vzorce III při m/z 600 a glukóza s navázaným ligandem vzorce IV při m/z 626. Laktóza s navázaným ligandem vzorce III byla detekována při m/z 762 a laktóza s navázaným ligandem vzorce IV při m/z 788.
Příklad 3: Analýza známých molekul lipopolysacharidu
Lipopolysacharidy izolované z kmene Escherichia coli - serovar 026 (získané od Sigma Aldrich- Merck) byly naředěny do koncentrace 1 mg/ml, k 25 μΐ suspenze bylo přidáno 25 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C. K 25 μΐ směsi bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1% obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku opakovaně přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a
-8CZ 2024 - 48 A3 vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu s vodným roztokem 0,1% obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV.
Shodným způsobem byl detekován lipopolysacharid i jednotlivých ostatních bakterií, tj. Escherichia coli - serovar 055 a serovar Olli, Salmonella enterica serovar Enteritidis a serovar Minnesota, Klebsiella pneumoniae (získané od Sigma Aldrich - Merck).
Získaná spektra jsou uvedena na obrázku 3. Spektra demonstrují rozdíly u různých bakteriálních druhů na základě odlišné struktury lipopolysacharidových molekul, které byly naštěpeny zmíněným způsobem. Ve všech případech se jedná o modifikované sacharidové zbytky, na něž byl navázán ligand vzorce II.
Příklad 4: Analýza známé molekuly lipidu A lipopolysacharidu
Lipid A lipopolysacharidu izolovaný z kmene Escherichia coli (získaný od Sigma Aldrich Merck) byl naředěn do koncentrace 1 mg/ml, k 25 μΐ suspenze bylo přidáno 25 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C. K 25 μΐ směsi bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifůgována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu s vodným roztokem kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Získaná spektra jsou uvedena na obrázku 4 (a). Jsou zde patrná specifická spektra odpovídající štěpené molekule lipidu A lipopolysacharidu. Při srovnání s ostatními spektry je patrné, že se jedná o unikátní profil.
Příklad 5: Analýza známé molekuly lipoteichoové kyseliny izolované ze Staphylococcus aureus
Lipoteichoová kyselina izolovaná z kmene Staphylococcus aureus (získaná od Sigma Aldrich Merck) byla naředěna do koncentrace 1 mg/ml, k 25 μΐ suspenze bylo přidáno 25 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C. K 25 μΐ směsi bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II
-9CZ 2024 - 48 A3 v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 pl supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu ve vodě s0,l % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Získaná spektra jsou uvedena na obrázku 4 (b). Jsou zde patrná specifická spektra odpovídající štěpené molekule lipoteichoové kyseliny Staphylococcus aureus. Při srovnání s ostatními spektry je patrné, že se jedná o unikátní profil.
Příklad 6: Analýza bakteriálních izolátů
Plná bakteriologická klička o objemu 1 μΐ bakteriální kultury kmene Escherichia co li 026 (získané od České národní sbírky typových kultur, Státní zdravotní ústav), narostlé po dobu 18 hodin při 37 °C na krevním agaru, byla re suspendována v 50 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C a centrifugována. K 25 μΐ supematantu bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu ve vodě s 0,1 % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV.
Obdobně byly analyzovány i bakteriální kultury Escherichia coli 055 a Salmonella enterica
- 10 CZ 2024 - 48 A3 serovar Enteritidis.
Získaná spektra byla unikátní, shodná se spektry purifikovaného lipopolysacharidu odpovídajícího bakteriálního druhu. Výsledky dokládají možnost odlišení mezi jednotlivými bakteriálními taxony.
Příklad 7: Analýza kvasinkových izolátů
Plná bakteriologická klička o objemu 1 μΐ bakteriální kultury kmene Candida albicans, narostlé 24 hodin při 37 °C na krevním agaru, byla resuspendována v 50 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C a centrifugována. K 25 μΐ supematantu bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu ve vodě s 0,1 % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Byla získána unikátní spektra, která odpovídala polysacharidům obsaženým v buněčné stěně pouze druhu Candida albicans. Spektra byla srovnána s ostatními dříve naměřenými spektry bakterií a mikromycet. Shodně s bakteriemi, nebyla nalezena shoda u odlišných taxonů. Na základě analýzy spekter lze předpokládat, že změřený signál odpovídá b-glukanu buněčné stěny.
Příklad 8: analýza vláknitých hub
Mycelium kultury Aspergillus fumigatus odpovídající objemu cca 1 mm3, narostlé 24 hodin při 37 °C na krevním agaru, bylo resuspendována v 50 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C a centrifugována. K 25 μΐ supematantu bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a
- 11 CZ 2024 - 48 A3 vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu ve vodě s0,l % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Byla získána unikátní spektra, která odpovídala pouze druhu Aspergillus fumigatus. Spektra byla srovnána s ostatními dříve naměřenými spektry bakterií a mikromycet. Shodně s bakteriemi, nebyla nalezena shoda u odlišných taxonů. Na základě analýzy spekter lze předpokládat, že změřený signál odpovídá galaktomananu buněčné stěny.
Příklad 9: analýza vzorku moči obsahující Escherichia coli
K25 μΐ vzorku lidské moči obsahující kmen Escherichia coli 0111 v kvantitě 105 CFU (colony forming units)/ml bylo přidáno 25 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C a centrifugována. K 25 μΐ supematantu bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C natřepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí Cl8 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj. acetonitrilu ve vodě s0,l % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí vzorku bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Byla získána unikátní spektra, která odpovídala spektrům kmene Escherichia coli 0111, které byly naměřeny z izolovaného lipopolysacharidu a spektra získaná z čisté bakteriální kultury.
Příklad 10: analýza vzorku moči obsahující C-polysacharid Streptococcus pneumoniae
K 25 μΐ vzorku lidské moči obsahující C-polysacharid Streptococcus pneumoniae v koncentraci 1 mg/ml bylo přidáno 25 μΐ roztoku kyseliny vinné o koncentraci 2 M. Směs byla inkubována 30 minut při 100 °C. Po inkubaci byla směs zchlazena na 50 °C a centrifugována. K 25 μΐ směsi bylo přidáno 50 μΐ roztoku ligandu vzorce II v koncentraci 5 mM rozpuštěného v 25mM octanu sodném s 5mM síranem lithným. Směs byla zahřívána 10 minut při 50 °C na třepacím termobloku při 500 ot./min. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl použit pro spektrometrické měření. 25 μΐ supematantu bylo naneseno do zkumavky pro kapalinovou
- 12 CZ 2024 - 48 A3 chromatografii a vzorek byl změřen pomocí spektrometru timsTOF Pro (LC/MS).
Vzorek pro měření pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byl přečištěn pomocí C18 nosiče (ZipTip with 0,6 μΐ Cis resin, Merck) a to tak, že nosič byl nejprve hydratován 5 acetonitrilem (10 μΐ) s obsahem 0,1 % obj. kyseliny mravenčí desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku. Následně byl nosič ekvilibrován desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Vzorek byl nanesen tak, že ze zkumavky s obsahem 25 μΐ vzorku bylo desetkrát pipetováno a vypuštěno 10 μΐ vzorku přes nosič ve špičce. Nosič byl následně promyt desetinásobným nasátím a vypuštěním 10 μΐ roztoku ίο 0,1 % obj. kyseliny mravenčí ve vodě. Přečištěný vzorek byl eluován roztokem 80% obj.
acetonitrilu ve vodě s0,l % obj. kyseliny mravenčí v objemu 1 μΐ na MALDI destičku. Po zaschnutí bylo provedeno měření.
Měření bylo provedeno v pozitivním i negativním lineárním módu za použití MALDI-TOF 15 hmotnostního spektrometru rapiFlex (Bruker Daltonics) vybaveného UV laserem o vlnové délce 355 nm. Parametry byly nastaveny tak, aby měření probíhalo v oblasti 200 až 2000 m/z, extrakce iontů pulzem 20 ns, napětí na zdroji 20 kV. Bylo získáno unikátní spektrum, které odpovídalo spektru C-polysacharidu Streptococcus pneumoniae změřeného z bakteriální kultury S. pneumoniae.

Claims (10)

1. Způsob detekce a/nebo identifikace mikrobiálních polysacharidů pomocí hmotnostní spektrometrie, vyznačující se tím, že se mikrobiální polysacharidy rozštěpí enzymaticky nebo kyselou hydrolýzou na redukující monosacharidy a/nebo oligosacharidy, poté se provede reakce aldehydové skupiny redukujících monosacharidů a/nebo oligosacharidů a NH2 skupiny alespoň jednoho ligandu obecného vzorce I
kde L je vybrané ze skupiny zahrnující , kde n je od 1 do
3, , , kde m je 1 nebo 2, a přičemž v obecném vzoreci I je methoxyfenolová skupina vázána k uhlíkovému atomu spojky L, kde R1, R2 a R4 jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom vodíku a v kde R3 je vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku a methyl, za přípravy konjugátu(ů), který(é) se následně podrobí ionizaci a měření hmotnostní spektrometrií.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se před rozštěpením mikrobiální polysacharidy izolují ze vzorku obsahujícího mikrobiální buňky a/nebo mikrobiální polysacharidy extrakcí, s výhodou extrakcí do lyzačního pufru, a centrifůgací, přičemž do dalšího postupu se použije supernatant.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů kyselou hydrolýzou se provádí přidáním kyseliny k supematantu, s výhodou kyselina vinná, kyselina chlorovodíková a/nebo kyselina glyoxalová, v koncentraci alespoň 1M, a směs se inkubuje alespoň 20 minut při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C, přičemž s výhodou inkubace probíhá zatřepání.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů enzymaticky se provádí s pomocí enzymu vybraného ze skupiny a-amyláza, β-amyláza, lysozym, endopeptidáza, přidáním enzymu v pufru odpovídajícím pH optimu aktivity použitého enzymu k supematantu, a štěpení se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 20 minut, s výhodou 20 až 60 minut, přičemž s výhodou inkubace probíhá zatřepání.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů kyselou hydrolýzou se provádí z mikrobiální kultury resuspendováním mikrobiální kultury v roztoku kyseliny, s výhodou kyseliny vinné, kyseliny glyoxalové a/nebo kyseliny chlorovodíkové, v koncentraci alespoň 1M, a
- 14CZ 2024 - 48 A3 směs se inkubuje alespoň 20 minut při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C, přičemž s výhodou inkubace probíhá zatřepání.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů enzymaticky se provádí z mikrobiální kultury s pomocí enzymu vybraného ze skupiny a-amyláza, β-amyláza, lysozym, endopeptidáza, resuspendováním mikrobiální kultury v pufru odpovídajícím pH optimu aktivity použitého enzymu a přidáním enzymu, a štěpení se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 20 minut, s výhodou 20 až 60 minut, přičemž s výhodou inkubace probíhá za třepání.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů kyselou hydrolýzou se provádí z klinického vzorku přidáním kyseliny ke klinickému vzorku, s výhodou kyselina vinná a/nebo kyselina chlorovodíková, v koncentraci alespoň 1M, a směs se inkubuje alespoň 20 minut při teplotě alespoň 60 °C, s výhodou 60 až 100 °C, přičemž s výhodou inkubace probíhá zatřepání.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že štěpení polysacharidů enzymaticky se provádí z klinického vzorku s pomocí enzymu vybraného ze skupiny a-amyláza, β-amyláza, lysozym, endopeptidáza, přidáním enzymu v pufru odpovídajícím pH optimu aktivity použitého enzymu ke klinickému vzorku, a štěpení se provádí při teplotním optimu aktivity použitého enzymu alespoň 20 minut, s výhodou 20 až 60 minut, přičemž s výhodou inkubace probíhá za třepání.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že ligand obecného vzorce I se ke směsi štěpených monosacharidů a oligosacharidů přidá v pufru při pH v rozmezí 2 až 6, s výhodou při pH 3, a směs se inkubuje po dobu alespoň 10 minut při teplotě do 70 °C, s výhodou 20 až 70 °C.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že konjugát(y) monosacharidů a/nebo oligosacharidů s ligandem obecného vzorce I se podrobí měření hmotnostní spektrometrií metodou MALDI-TOF nebo metodou hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizací kombinované s vysokotlakou kapalinovou chromatografň.
CZ2024-48A 2024-02-12 2024-02-12 Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií CZ310520B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2024-48A CZ310520B6 (cs) 2024-02-12 2024-02-12 Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií
PCT/CZ2025/050014 WO2025171832A1 (en) 2024-02-12 2025-02-09 Method for detection and identification of saccharides by mass spectrometry

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2024-48A CZ310520B6 (cs) 2024-02-12 2024-02-12 Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ202448A3 true CZ202448A3 (cs) 2025-10-01
CZ310520B6 CZ310520B6 (cs) 2025-10-01

Family

ID=94734139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2024-48A CZ310520B6 (cs) 2024-02-12 2024-02-12 Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ310520B6 (cs)
WO (1) WO2025171832A1 (cs)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE432471T1 (de) * 2005-02-11 2009-06-15 Merck Patent Gmbh Festphasenoligosaccharid-tagging: eine technik zur manipulation immobilisierter kohlenhydrate
HUE028559T2 (en) * 2012-06-26 2016-12-28 Centre Hospitalier Regional Univ Lille In vitro diagnostic method for invasive fungal infection caused by a pathogenic fungal microorganism
CN116893089A (zh) * 2023-06-27 2023-10-17 南京师范大学 一种鉴定材料中多糖成分的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2025171832A1 (en) 2025-08-21
CZ310520B6 (cs) 2025-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Frei et al. Ligand-based receptor identification on living cells and tissues using TRICEPS
US5976820A (en) Detection of antibodies to bacterial antigens by flourescence polarization
Solntceva et al. Detection of species-specific lipids by routine MALDI TOF mass spectrometry to unlock the challenges of microbial identification and antimicrobial susceptibility testing
AU2007226582A1 (en) Substrates and internal standards for mass spectroscopy detection
Wu et al. Employment of teicoplanin-coated magnetic particles for quantifying gram-positive bacteria via catalase-catalyzed hydrolysis reaction of H2O2
Li et al. Application of capillary electrophoresis mass spectrometry to the characterization of bacterial lipopolysaccharides
Kitov et al. A quantitative, high-throughput method identifies protein–glycan interactions via mass spectrometry
AU2023241355B2 (en) Compounds and methods relating to testing for lysosomal storage disorders
AU2014353835A2 (en) Detection, isolation and identification of microorganisms
JP5139085B2 (ja) 固相のオリゴ糖タグ付け：固定化糖質の操作技術
AU2018258251A1 (en) Sialic acid binding polypeptide
CZ202448A3 (cs) Způsob detekce a identifikace mikrobiálních polysacharidů hmotnostní spektrometrií
Benito-Alifonso et al. Imidazolium-tagged glycan probes for non-covalent labeling of live cells
JP2016522677A5 (cs)
CN116626208B (zh) 一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用
WO2011115212A1 (ja) 質量分析による糖鎖の分析方法
Justo et al. Biotin/avidin-free sandwich aptamer-based lateral flow assay (ALFA) for the diagnosis of Trichomonas vaginalis
Lin et al. A new naphthimidazole derivative for saccharide labeling with enhanced sensitivity in mass spectrometry detection
Kondakova et al. Application of electrospray ionization with Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry for structural screening of core oligosaccharides from lipopolysaccharides of the bacteria Proteus
Chen et al. An aptamer biosensing platform for simultaneous quantification of Vibrio alginolyticus and probiotic Bacillus subtilis in shrimp aquaculture
Schweda et al. Structural profiling of short-chain lipopolysaccharides from Haemophilus influenzae
Dadovska et al. Mass spectrometric profiling of microbial polysaccharides using laser desorption/ionization–time-of-flight (LDI-TOF) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS): a novel method for structural fingerprinting and derivatization
JP2688773B2 (ja) エンドトキシンの不活化方法
WO2021211714A1 (en) Fusion protein and method of detecting bacteria having pseudaminic acid
Thibault et al. Applications of Combined Capillary Electrophoresis-Electrospray Mass Spectrometry in the Characterization of Short-Chain Lipopolysaccharides: Haemophilus influenzae