CZ202474A3

CZ202474A3 - Probiotická krmná kompozice, určená zejména pro vodní živočichy, a způsob její přípravy

Info

Publication number: CZ202474A3
Application number: CZ2024-74A
Authority: CZ
Inventors: Aleš FRANC; Franc Aleš doc. PharmDr., Ph.D; Dagmar Mudroňová; Mudroňová Dagmar prof. MVDr., Ph.D.; Natália Chomová; Natália PharmDr. Chomová; Peter Popelka; Popelka Peter prof. MVDr., Ph.D.; Jana Koščová; Koščová Jana doc. MVDr., Ph.D.
Original assignee: Masarykova Univerzita; Univerzita Veterinárskeho Lekárstva A Farmácie V Košiciach
Priority date: 2024-02-28
Filing date: 2024-02-28
Publication date: 2025-10-01

Abstract

Popisuje se probiotická krmná kompozice, určená zejména pro vodní živočichy. Tato kompozice obsahuje krmné pelety o velikosti 0,2 až 6 mm, opatřené obalovou vrstvou obsahující pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fyziologického roztoku a/nebo polysacharid(y) obsahující(ch) α-1,4-glukany a/nebo α-1,6-glukany, přičemž obalová vrstva dále obsahuje jednu nebo více probiotických bakterií čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus.

Description

Probiotická krmná kompozice, určená zejména pro vodní živočichy, a způsob její přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká stabilní probiotické krmné kompozice určené zejména pro vodní živočichy a způsobu j ej i přípravy.

Dosavadní stav techniky

Probiotické bakterie jako živé mikroorganismy při podávání v dostatečném množství mají pozitivní vliv na zdraví hostitele. Perorální podávání bakterií vodním živočichům však představuje dosud adekvátně nedořešený problém. Samotná bakteriální suspenze totiž není pro vodní živočichy atraktivní a při aplikaci na vodní hladinu nedochází k jejímu zkrmení. Proto je třeba navázat bakterie na chuťový atraktant. Zároveň je nezbytné, aby krmná směs byla stabilní, jelikož životaschopnost bakterií postupně klesá. Tento problém představuje asi největší překážku ve zpracování probiotických bakterií určených pro podávání vodním živočichům.

Většina probiotických bakterií navrhovaných jako biologická ochrana v oblasti akvakultury patří mezi bakterie mléčného kvašení. Z publikace Nadanasabesan, N. et al. Mucosal barrier status in Atlantic salmon fed marine or plant-based diets supplemented with probiotics. Aquaculture, 2022, 547: 737516 je známá příprava krmných granulí s obsahem Lactiplantibacillus plantarum (stará nomenklatura: Lactobacillus plantarum·, dále: L. plantarum) a Limosilactobacillus fermentum (stará nomenklatura: Lactobacillus fermentum', dále: L. fermentum). Pelety zde byly obaleny kulturou izolátu L. plantarum a/nebo L. fermentum s následnou aplikací rybího oleje jako chuťového atraktantu. Obal pelet zde byl nanesen ve vakuových obalovacích zařízeních. Metoda vakuového obalování je založena na principu rozdílného tlaku vzduchu, který umožňuje pronikání bakteriální disperze do porézních pelet. Vzduch, který se nachází uvnitř pelet, se evakuuje, čímž se umožní následný průnik nastřikované bakteriální disperze do krmivá. Princip spočívá v tom, že na evakuované pelety se pomocí rozprašovací trysky nanese směs L. plantarum a/nebo L. fermentum ve sterilním fýziologickém roztoku, a pelety se rovnoměrně obalí při kontinuálním míchání ve vakuové komoře. Následně se obalová směs vtlačí do pórů pelet pomocí vyrovnání tlaku v komoře, kdy je opět dosaženo běžného, atmosférického tlaku. Vakuové obalování umožňuje průnik tekutin až do 40 % obsahu pelety a lze jím aplikovat i více vrstev pomocí opakovaných nástřiků. Potom je na pelety aplikován rybí olej jako chuťový atraktant.

Tato technologie je však přístrojově náročná a neumožňuje dostatečně robustní produkci pelet na terénních pracovištích, kde nejsou nákladná vakuová obalovací zařízení k dispozici. Mikroorganismy, které zčásti zůstanou i na povrchu pelet, zde nejsou nijak vázány a během skladování a manipulace může dojít k setření obalu. Navíc je tato technologie podstatně omezena pórovitostí pelet a vtlačováním mikroorganismů do pórů může poškodit buněčnou stěnu mikroorganismů zvláště tam, kde jsou póry nedostatečně velké.

Patentový dokument CZ308210 popisuje způsob přípravy pelet pro vodní živočichy, kde je aktivní látka nanesena na povrch pelet pomocí sorbentu a fixována pomocí pH dependentního polymeru, který brání předčasnému uvolnění léčiva do vody. Tento způsob však není určen pro živé organismy, jelikož akrylátový pH dependentní polymer je aplikován v organickém rozpouštědle, při jehož použití by došlo k denaturaci bakterií.

Další možností je příprava krmné směsi, uvedené v publikaci Chomová, N., et al. Development and evaluation of a fish feed mixture containing the probiotic Lactiplantibacillus plantarum prepared using an innovative pellet coating method. Frontiers in Veterinary Science 10, 2023: 1196884. Zde se krmná směs vytvoří nanesením vodní disperze L. plantarum ve směsi se separátně připraveným škrobovým hydrogelem. Zde se nejprve připraví bakteriální kultivát v MRS (De Man

- 1 CZ 2024 - 74 A3

Rogosa-Sharpe) bujónu, bakterie se centrifugují a dispergují ve fyziologickém roztoku, který se zahustí modifikovaným škrobem. Toto řešení však vyžaduje centrifugační zařízení a k prevenci mikrobiální kontaminace je třeba minimálně dodržení laboratorních podmínek, což limituje průmyslovou využitelnost.

Z těchto důvodů zatím není známa široce využitelná, přístrojově nenáročná, jednoduchá a nenákladná metoda, která by dokázala bakterie zpracovat do formy, ve které je obsah probiotických bakterií stabilní a kterou by vodní živočichové aktivně přijímali.

Cílem předloženého vynálezu je tedy poskytnout probiotickou krmnou kompozici a způsob její přípravy, splňující požadavky stability co do obsahu probiotických bakterií a současně zachovat atraktivitu zejména pro vodní živočichy. Příprava kompozice musí být jednoduchá, nízkonákladová a široce využitelná.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je probiotická krmná kompozice určená zejména pro vodní živočichy, například ryby. Kompozice podle vynálezu obsahuje komerčně dostupné krmné pelety (jádra) o velikosti obvykle 0,2 až 6 mm, které jsou vodní živočichové zvyklí konzumovat, opatřené obalovou vrstvou obsahující pevné složky MRS (De Man-Rogosa-Sharpe) bujónu a/nebo pevné složky fýziologického roztoku a/nebo polysacharid(y) obsahující a-l,4-glukany a/nebo a-1,6glukany, a dále obsahující jednu nebo více probiotických bakterií čeledi Laci abaci Haceae. s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus.

V jednom provedení vynálezu je probiotická krmná kompozice určená zejména pro ryby, například lososovité ryby, jako je pstruh, losos nebo sivěn.

Ve výhodném provedení vynálezu je mezi povrchem krmných pelet (jádry) a obalovou vrstvou uspořádána vnitřní obalová vrstva. Vnitřní obalová vrstva, která přiléhá k jádru, je tvořena mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem. V kompozici podle tohoto provedení vážou sorbenty probiotické bakterie. Probiotické bakterie tak mají předpoklad déle setrvat ve střevech živočichů, a zaručit tak lepší kolonizaci probiotickými bakteriemi. Vrstva sorbentu také usnadňuje obalení pelet a zvyšuje adhezi (vnější) obalové vrstvy.

Vrstva(y) obalu s výhodou tvoří pevnou disperzi.

Mikrobiologicky inertní organický sorbent jsou s výhodou huminové a/nebo fulvinové kyseliny. Tyto kyseliny mají velkou sorpční schopnost, čehož se výhodně používá při detoxifikaci zažívacího ústrojí živých organismů (EMEA. Committee for Veterinary Medical Products „Humic Acids and Their Sodium Salts, Summary Report 1999).

Mikrobiologicky inertní anorganický sorbent je s výhodou oxid křemičitý nebo křemičitany, výhodněji ve formě metasilikátů nebo fýlosilikátů. Tyto sorbenty jsou komerčně dostupné, například pod názvy Sipemat®, Neusilin®, Redmond®.

Všechny typy zde uvedených mikrobiologicky inertních sorbentů jsou komerčně dostupné obvykle ve formě prášku.

(Vnější) obalová vrstva obsahuje pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fýziologického roztoku a/nebo polysacharid(y) obsahující a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany, a probiotické bakterie. Ve vodných hydrogelech těchto směsí se obvykle probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus kultivují. Přímé použití těchto médií pro přípravu vrstvy obalu umožňuje, že k obalování je možné

-2CZ 2024 - 74 A3 využít přímo kultivační médium, což je disperze ve formě hydrogelu s obsahem probiotických bakterií, případně jeho naředěnou formu. Tímto se lze při přípravě vyhnout náročné separaci probiotických bakterií z kultivátu, kde zpravidla z různých, chemických, fýzikálních i biologických důvodů dochází k redukci počtu živých mikrobů. Navíc zde probiotické bakterie zůstávají ve svém přirozeném prostředí, což opět podstatně sníží redukci počtu živých mikrobů i v průběhu skladování.

Fyziologický roztok je 0,9 hmota. % sterilní vodný roztok chloridu sodného.

Ve výhodných provedeních jsou probiotickými bakteriemi Lactiplantibacillus plantarum a/nebo Limosilactobacillus fermentum.

Nq výhodných provedeních jsou probiotickými bakteriemi komerčně dostupné Lactiplantibacillus plantarum R2 Biocenol™ CCM 8674 a/nebo Limosilactobacillus fermentum R3 Biocenol™ CCM 8675 uložené podle Budapešťské smlouvy v České sbírce mikroorganismů Masarykovy univerzity Brno, Česká republika.

Ve výhodných provedeních je probiotická krmná kompozice podle předkládaného vynálezu připravitelná z mikrobiologicky inertního sorbentu (je-li přítomen) v množství 0,4 až 1 hmota. %, výhodně 0,5 až 0,7 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost složek, z MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany a/nebo a-1,6glukany v množství 10 až 30 hmota. %, výhodně 12 až 25 hmota. %, výhodněji 15 až 20 hmota. % vztaženo na celkovou hmotnost složek, přičemž uvedený MRS bujón a/nebo fyziologický roztok a/nebo polysacharid(y) dále obsahují probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus jejichž množství v MRS bujónu a/nebo fyziologickém roztoku a/nebo polysacharidu/ech je od 10⁹ do 10¹²KTJ/g (počet jednotek tvořící kolonii vztažené na gram použitých složek). Zbytek hmotnosti kompozice tvoří krmné pelety (jádra).

Ve výhodném provedení probiotická krmná kompozice podle předkládaného vynálezu obsahuje mikrobiologicky inertní sorbent (je-li přítomen) v množství 0,5 až 1,2 hmota. %, výhodně 0,6 až 0,8 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost probiotické krmné kompozice, pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a1,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany v množství 2 až 20 hmota. %, výhodně 2 až 15 hmota. %, výhodněji 2 až 10 hmota. % vztaženo na celkovou hmotnost probiotické krmné kompozice, přičemž uvedené pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fyziologického roztoku a/nebo polysacharid(y) dále obsahují probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus, jejichž množství v probiotické krmné kompozici je od 10⁷ do 10¹² KTJ/g (počet jednotek tvořící kolonii vztažené na gram probiotické krmné kompozice). Zbytek hmotnosti kompozice tvoří krmné pelety (jádra).

Výsledná probiotická krmná kompozice podle předkládaného vynálezu obsahuje probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus v množství alespoň 10⁷ KTJ/g.

Tloušťka obaluje malá, takže velikost a tvar výsledné krmné kompozice jsou prakticky nezměněny oproti samotnému jádru a umožní tak snadnou konzumaci. Navíc obal, který je hydrofilní, je značně porézní, což umožní mechanismem kapilární elevace prostoupení oleje obsaženého v jádru až na povrch obalené pelety, a tedy odpadá nutnost přísady chuťového atraktantu.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy probiotické krmné kompozice, v němž se krmné pelety pro vodní živočichy volitelně nejprve obalí mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem, přičemž uvedený sorbent je ve formě suchého prášku; a následně se na krmné pelety nanese směs MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany

- 3 CZ 2024 - 74 A3 a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus, a v průběhu nanášení nebo následně se pelety suší při teplotě do 50 °C.

S výhodou je v kroku přípravy použito množství mikrobiologicky inertního organického a/nebo anorganického sorbentu 0,5 až 1,2 hmota. %, výhodně 0,6 až 0,8 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost složek, množství MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany 10 až 30 hmota. %, výhodně 12 až 25 hmota. %, výhodněji 15 až 20 hmota. % vztaženo na celkovou hmotnost složek, přičemž uvedený MRS bujón a/nebo fýziologický roztok a/nebo polysacharid(y) obsahuje probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Li mos i lactobacillus. jejichž množství v MRS bujónu a/nebo fyziologickém roztoku a/nebo polysacharidu/ech je s výhodou od 10⁹ do 10¹² KTJ/g (počet jednotek tvořící kolonii vztažený na gram použitých složek). Zbytek hmotnosti kompozice tvoří krmné pelety (jádra).

V prvním, volitelném, kroku postupu se tedy krmné pelety (jádra) nejprve obalují mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem ve formě suchého prášku. Tento prášek sorbentu v suchém stavu adheruje na povrch jader na základě fýzikálních van der Waalsových sil, a vytvoří tak vnitřní obalovou vrstvu.

S výhodou se tento první krok obalování provádí tak, že se na pohybující se krmné pelety postupně nebo najednou nanese sorbent, až se na povrchu pelet vytvoří uniformní vrstva.

V druhém popsaném kroku obalování se na krmné pelety opatřené vnitřní obalovou vrstvou nanese směs MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-1,4glukany a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus, s výhodou ve formě vodné disperze. Postupné nanášení vodné disperze může být střídáno fází sušení pomocí přiváděného zahřátého vzduchu, případně může být nanášení a sušení souběžné, nebo může fáze sušení následovat až po úplném nanesení vodné disperze. Teplota sušicího vzduchu je s výhodou 25 až 50 °C, což zajistí, že nedochází k termické denaturaci probiotických bakterií. Po vysušení do konstantní hmotnosti vznikne jednovrstvý nebo dvouvrstvý (v případě přítomnosti vnitřní obalové vrstvy) obal ve formě pevné disperze.

K oběma krokům obalování lze využít klasické obalovací nebo dražovací bubny, případně peletizační talíře, nebo jakékoliv mísící zařízení, které umožní míšení nebo rotaci jader a rovnoměrné rozvrstvení obalovací ch látek na jejich povrchu během procesu obalování.

Probiotická krmná kompozice podle předkládaného vynálezu zajistí stabilitu v podmínkách skladování po dobu 6 měsíců, kdy počet živých probiotických bakterií čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus byl v rozmezí od 10⁸ do 10⁷ KTJ/g při teplotě 4 °C.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Graf znázorňující množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici (logKTJ/g) podle příkladu 1 při různé době skladování.

Obr. 2: Graf znázorňující množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici (logKTJ/g) podle příkladu 4 při různé době skladování.

Obr. 3: Graf znázorňující množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici (logKTJ/g) podle příkladu 7 při různé době skladování.

-4CZ 2024 - 74 A3

Obr. 4: Graf znázorňující množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici (logKTJ/g) podle příkladu 8 při různé době skladování.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady uvádí konkrétní postupy provedení, aniž by jimi byl předmět vynálezu omezen.

Příklad 1

Byla připravena probiotická krmná kompozice určená zejména pro vodní živočichy s následujícím složením a postupem přípravy:

Složení

Komponenta	Hmotn. %
Disperze probiotické kultury L. plantarum v MRS bujónu	20,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	79,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6

Postup přípravy • Byla připravena vodná disperze probiotické kultury v MRS bujónu (HiMedia, Indie) obsahující kmen L. plantarum a kultivace proběhla při 37 °C v anaerobním prostředí až do obdržení požadovaného obsahu bakterií 10¹¹ KTJ/ml.

• Na 79,4 hmota. % krmných pelet (jader) bylo v obalovacím bubnu (Erweka DKS, Germany) aplikováno 0,6 hmota. % sorbentu - huminových látek vyrobených z aktivovaného leomaditu s vysokým obsahem huminových kyselin (65 hmota. %) a minimálním zastoupením fůlvinových kyselin (méně než 5 hmota. %). Průměrná velikost částic sorbentu nepřesahovala 200 pm. Směs byla míšena po dobu 5 min při rychlosti 1050 rpm tak, aby docházelo k plynulé rotaci jader.

• Na krmné pelety obalené sorbentem byla ve stejném zařízení následně rovnoměrně nanesena disperze probiotických bakterií v MRS bujónu v množství 20 hmota. % na celkovou hmotnost obalených pelet při rychlosti 10-50 rpm tak, aby docházelo k plynulé rotaci jader.

• Obalené pelety byly sušeny při teplotě 37 °C po dobu 5 hodin v horkovzdušné sušárně s výsledným obsahem vody do 13 hmota. %. Obsah L. plantarum ve výsledné krmné kompozici bezprostředně po výrobě byl 10⁸ KTJ/g.

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 5,8 hmota. % pevných složek MRS bujónu s obsahem probiotických bakterií, 93,5 hmota. % krmných pelet, 0,7 hmota. % huminových látek z aktivovaného leonarditu.

Obsah L. plantarum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 6 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁷ KTJ/g.

Příklad 2

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 1, avšak při přípravě byla použita probiotická bakterie L. fermentum.

- 5 CZ 2024 - 74 A3

Složení

Komponenta	Hmotn. %
Disperze probiotické kultury L. fermentum v MRS bujónu	20,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	79,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 5,8 hmota. % pevných složek MRS bujónu s obsahem probiotických bakterií, 93,5 hmota. % krmných pelet a 0,7 hmota. % humínových látek z aktivovaného leonarditu.

Obsah L. fermentum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 6 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁷ KTJ/g.

Příklad 3

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 1, avšak při přípravě byla použita směs dvou probiotických kmenů L. plantarum a L. fermentum v poměru 1:1.

Složení

Komponenta	Hmotn. %
Disperze směsi probiotických kultur L. plantarum aL. fermentum v MRS bujónu v poměru 1:1	10,0 + 10,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	79,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 5,8 hmota. % pevných složek MRS bujónu s obsahem probiotických bakterií (L. plantarum a L. fermentum), 93,5 hmota. % krmných pelet a 0,7 hmota. % humínových látek z aktivovaného leonarditu.

Obsah směsi probiotických kultur L. plantarum a L. fermentum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 6 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁷ KTJ/g.

Příklad 4

Složení

Komponenta	Hmotn. %
25 obj. % disperze směsi probiotické kultury L. plantarum ve fyziologickém roztoku	11,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	87,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6
Polysacharid/y obsahující a-l,4-glukany a a-1,6glukany	1,0

-6CZ 2024 - 74 A3

• Na 87,4 hmoto. % krmných pelet (jader) bylo v obalovacím bubnu (Erweka DKS, Germany) aplikováno 0,6 hmota. % sorbentu - huminových látek vyrobených z aktivovaného leomaditu s vysokým obsahem huminových kyselin (65 hmota. %) a minimálním zastoupením folvinových kyselin (méně než 5 hmota. %). Průměrná velikost částic sorbentu nepřesahovala 200 pm. Směs byla míšena po dobu 5 min při rychlosti 1050 rpm tak, aby docházelo k plynulé rotaci jader.

• Vodná disperze probiotické kultury v MRS bujónu byla následně centrifugována (4 500 rpm, 15 minut) (Rotina 420 R (Hettisch, Germany) při 22 °C pro oddělení biomasy od kultivačního média. Supernatant byl odstraněn a sediment dvakrát promyt a resuspendován ve fýziologickém roztoku za vzniku 25 obj. % suspenze. K této suspenzi bylo přidané 1 hmota. % polysacharidů, obsahujících a-l,4-glukany a a-l,6-glukany a směs byla míchána na elektromagnetické míchačce do vytvoření probiotického polysacharidového hydrogelu.

• Na krmné pelety obalené sorbentem byl ve stejném zařízení následně rovnoměrně nanesen probiotický polysacharidový hydrogel v množství 12 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost obalených pelet, při rychlosti 10-50 rpm tak, aby docházelo k plynulé rotaci jader.

• Obalené pelety byly sušeny při teplotě 37 °C po dobu 4 hodin v horkovzdušné sušárně s výsledným obsahem vody do 11 hmota. %. Obsah L. plantarum ve výsledné krmné kompozici bezprostředně po výrobě byl 10⁸ KTJ/g.

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 2,2 hmota. % pevných složek fyziologického roztoku s obsahem probiotických bakterií, 96,0 hmota. % krmných pelet, 0,7 hmota. % huminových látek zaktivovaného leonarditu a 1,1 % polysacharid/ů obsahující(ch) a-l,4-glukany a a-l,6-glukany.

Obsah L. plantarum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 10 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁸ KTJ/g.

Příklad 5

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 4. Na rozdíl od příkladu 4 byl při přípravě použit probiotický kmen L. fermentum.

Složení

Komponenta	Hmotn. %
25 obj. % disperze směsi probiotické kultury L. fermentum ve fyziologickém roztoku	11,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	87,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6
Polysacharid/y obsahující a-l,4-glukany a a-1,6glukany	1,0

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 2,2 hmota. % pevných složek fýziologického roztoku s obsahem probiotických bakterií, 96,0 hmota. % krmných

-7 CZ 2024 - 74 A3 pelet, 0,7 hmota. % humínových látek zaktivovaného leonarditu a 1,1 % polysacharid/ů obsahující(ch) a-l,4-glukany a a-l,6-glukany.

Obsah L. fermentum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 10 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁸ KTJ/g.

Příklad 6

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 4, avšak oproti příkladu 4 byla při přípravě kompozice použita směs dvou probiotických kmenů L. plantarum a L. fermentum v poměru 1:1.

Komponenta	Hmotn. %
25 obj. % disperze směsi probiotických kultur L. plantarum a L. fermentum ve fyziologickém roztoku v poměru 1:1	5,5 + 5,5
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	87,4
Humínové látky z aktivovaného leonarditu	0,6
Polysacharid/y obsahující a-l,4-glukany a a-1,6glukany	1,0

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 2,2 hmota. % pevných složek fýziologického roztoku s obsahem probiotických bakterií (L. plantarum a L. fermentum), 96,0 hmota. % krmných pelet, 0,7 hmota. % humínových látek z aktivovaného leonarditu a 1,1 % polysacharid/ů obsahující(ch) a-l,4-glukany a a-l,6-glukany.

Obsah směsi probiotických kultur L. plantarum a L. fermentum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 10 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁸ KTJ/g.

Příklad 7

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 4, avšak oproti příkladu 4 byl při přípravě pouze vynechán mikrobiologicky inertní organický nebo anorganický sorbent.

Složení

Komponenta	Hmotn. %
25 obj. % disperze směsi probiotické kultury L. plantarum ve fyziologickém roztoku	11,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	88,0
Polysacharidy obsahující a-l,4-glukany a a-1,6glukany	1,0

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 2,2 hmota. % pevných složek fýziologického roztoku s obsahem probiotických bakterií (L. plantarum a L. fermentum), 96,7 hmota. % krmných pelet a 1,1 % polysacharid/ů obsahující(ch) a-l,4-glukany a a-l,6-glukany.

-8CZ 2024 - 74 A3

Příklad 8

Byla připravena probiotická krmná kompozice podle způsobu popsaného v příkladu 4, avšak oproti příkladu 4 při přípravě bylo 0,6 hmot. % huminových látek nahrazeno 1 hmota. % siliky.

Složení

Komponenta	Hmotn. %
25 obj. % disperze směsi probiotických kultur L. plantarum a L. fermentum ve fyziologickém roztoku v poměru 1:1	11,0
Krmné pelety (Inicio 918, Biomar, DK)	87,0
Koloidní oxid křemičitý (Degussa, Germany)	1,0
Polysacharidy obsahující a-l,4-glukany a a-1,6glukany	1,0

Složení výsledné kompozice, vypočtené na základě snížení vlhkosti při sušení, je: 2,3 hmota. % pevných složek fýziologického roztoku s obsahem probiotických bakterií (L. plantarum a L. fermentum), 95,5 hmota. % krmných pelet, 1,1 hmota. % siliky a 1,1 % polysacharid/ů obsahující(ch) a-l,4-glukany a a-l,6-glukany.

Obsah L. plantarum ve výsledné krmné kompozici při skladování po dobu 11 měsíců při teplotě 4 °C neklesl pod koncentraci 10⁸ KTJ/g.

Příklad 9

Počty probiotických bakterií v krmných probiotických kompozicích z výše uvedených příkladů provedení byly stanovovány v pravidelných časových intervalech plotnovou metodou na MRS agaru. Z probiotické krmné kompozice byl odebrán vzorek o hmotnosti 1 g, který byl práškován a naředěn v 9 ml fýziologického roztoku. Následně byly vzorky ředěny decimálním ředěním fýziologickým roztokem a aplikovány v množství 100 μΐ na agarové plotny. Připravené plotny byly kultivovány při 37 °C po dobu 48 h v anaerobním prostředí. Výsledky jsou vyjádřeny jako počet jednotek tvořící kolonii (KTJ) na gram probiotické krmné kompozice. Viabilita probiotických kmenů nanesených na peletách byla u všech vzorků po dobu 6 měsíců při teplotě 4 °C v rozmezí 10⁸ až 10⁷ KTJ/g (viz tabulka č. 1). Na obrázcích 1 až 4 je znázorněno množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici postupně podle příkladu provedení 1, 4, 7 a 8 při různé době skladování.

Tabulka č. 1: Přehled viability probiotických kmenů

Příklad provedení	1	2	3	4	5	6	7	8
Množství probiotických bakterií v probiotické krmné kompozici (KTJ/g)	10⁷	10⁷	10⁷	10⁸	10⁸	10⁸	10⁷	10⁸
Doba skladovaní (měsíc)	6	6	6	10	10	10	6	11

Průmyslová využitelnost

Kompozice podle vynálezu je určena pro výživu zejména vodních živočichů.

Claims

1. Probiotická krmná kompozice, určená zejména pro vodní živočichy, vyznačující se tím, že obsahuje krmné pelety o velikosti 0,2 až 6 mm, opatřené obalovou vrstvou obsahující pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fyziologického roztoku a/nebo polysacharid(y) obsahující a-1,4glukany a/nebo a-l,6-glukany, přičemž obalová vrstva dále obsahuje jednu nebo více probiotických bakterií čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactíplantíbacíllus a/nebo Limosilactobacillus.

2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že je připravitelná z MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) v množství 10 až 30 hmota. %, výhodně 12 až 25 hmota. %, výhodněji 15 až 20 hmota. % vztaženo na celkovou hmotnost složek, přičemž uvedený MRS bujón a/nebo fýziologický roztok a/nebo polysacharid(y) dále obsahují probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactíplantíbacíllus a/nebo Limosilactobacillus, jejichž množství v MRS bujónu a/nebo fýziologickém roztoku a/nebo polysacharidu(ech) je od 10⁹do 10¹²KTJ/g (počet jednotek tvořící kolonii vztažené na gram použitých složek), způsobem, kdy se na krmné pelety nanese směs MRS bujónu a/nebo fyziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus, a v průběhu nanášení nebo následně se pelety suší, s výhodou při teplotě do 50 °C.

3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus^ množství alespoň 10⁷ KTJ/g.

4. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že mezi povrchem krmných pelet a obalovou vrstvou je uspořádána vnitřní obalová vrstva tvořená mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem.

5. Kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že mikrobiologicky inertní organický sorbent jsou huminové a/nebo fůlvinové kyseliny, a mikrobiologicky inertní anorganický sorbent je oxid křemičitý nebo křemičitany, výhodněji ve formě metasilikátů nebo fylosilikátů.

6. Kompozice podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že je připravitelná z mikrobiologicky inertního sorbenta v množství 0,4 až 1 hmota. %, výhodně 0,5 až 0,7 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost složek, způsobem, kdy se krmné pelety pro vodní živočichy nejprve obalí mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem, přičemž uvedený sorbent je ve formě suchého prášku, a následně se na ně nanese směs MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-1,4glukany a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus

7. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany v množství 2 až 20 hmota. %, výhodně 2 až 15 hmota. %, výhodněji 2 až 10 hmota. % vztaženo na celkovou hmotnost probiotické krmné kompozice, přičemž uvedené pevné složky MRS bujónu a/nebo pevné složky fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) dále obsahují probiotické bakterie čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus jejichž množství v probiotické krmné kompozici je od 10⁷ do 10¹² KTJ/g, a dále popřípadě kompozice mikrobiologicky inertní sorbent v množství 0,5 až 1,2 hmota. %, výhodně 0,6 až 0,8 hmota. %, vztaženo na celkovou hmotnost probiotické krmné kompozice, přičemž zbytek kompozice je tvořen materiálem krmných pelet.

8. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že probiotickými bakteriemi jsou L. plantarum a/nebo L. fermentum.

- 10CZ 2024 - 74 A3

9. Způsob přípravy probiotické krmné kompozice, vyznačující se tím, že se na krmné pelety nanese směs MRS bujónu a/nebo fyziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího(ch) a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacillaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo Limosilactobacillus, a 5 v průběhu nanášení nebo následně se pelety suší, s výhodou při teplotě do 50 °C.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se před nanesením směs MRS bujónu a/nebo fýziologického roztoku a/nebo polysacharidu(ů) obsahujícího a-l,4-glukany a/nebo a-l,6-glukany s jednou nebo více probiotickými bakteriemi čeledi Lactobacíllaceae, s výhodou bakterie kmene Lactiplantibacillus a/nebo LimosilactobacillussQ krmné pelety pro vodní živočichy nejprve obalí ίο mikrobiologicky inertním organickým sorbentem a/nebo mikrobiologicky inertním anorganickým sorbentem, přičemž uvedený sorbent je ve formě suchého prášku.