CZ204294A3 - Pharmaceutical preparation for treating fungal infections and method of determining suitability of matters as a multiplying agent for fungicidally active matter - Google Patents

Description

- 1

Farmaceutický prostředek pro ošetřování houbových infekcí a způsob posuzování vhodnosti látek jakožto násobící li o činidla pro látku fungicidně účinnou

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku pro ošetřování infekcí, zvyšujícího citlivosti houbové buňky k proti-houbovému činidlu a způsobu posuzování vhodnosti látek jakožto násobícího činidla pro látku fungicidně účinnou.

Dosavadní stav techniky V ý s k y t v á ž n ý c h . -1 ohrožujících houbových infekcí vzrůstá nfekcí krevního řečiště (Banerjee if Medicine 91 (3B), str. 86S až alarmující měrou. Počet infekce krevního řečiště houbou Candida albicans mimo nemocnice vzrostl v letech 19 80 až 19 90 o 3 70 Ve stejné době výskyt infekcí krevního řečiště houbou C. albicans v nemocnicích vzrostl o 487 % S výjimkou koagulase negativních staphylokeků je statisticky C. albicans nejrychleji rostoucí oblastí nemocničně ošetřovaných i a kol fi o cl 19 91, America n J o\

Rostoucí výskyt nosokomiá1ních houbových infekcí je podpo-cván změnou lékařské praxe včetně invazních chirurgických proce-

r.i sů , týkající Γ li se náh z v ý š e η é c herno terapie r cesy n a r usují imunitní daří li o u b o v ý m infekcím. •ady kloubců a otevřené chirurgie srdce, i. k o v i n y a epidemie AIDS. Všechny tyto p r o -systém a vytvářejí podmínky, za kterých se Přibližně 90 % nosokomiá1ních houbových infekcí je působeno třídou Candida. Zbylé houbové infekce jsou v ě tš incu působeny třídou Aspergillus species, Cryptococcus species a Pneumocys t i s car-rini i . Na neštěstí je diagnos a ho n bového o n emocnění obtížná a náročná na čas. Spíše než na čekání výsledků diagnostických zkoušek se často musí nasazovat experimentální proti houbová terapie iniciovaná sloučeninou například amphotericinem B (vysoce toxickým) 2 nebo alespořím jedním z azolů (ke kterým si třídy hub rychle vytvářejí odolnost)- Proto by byl velice žádoucí Protihoubový prostředek se širokým spektrém účinnosti spojeným s nízkou toxicitou -

Objev a vývoj Protihoubových sloučenin pro specifické druhy hub vykázal určitý úspěch. Jelikož třída Candida Představuje hlavní houbové infekce, byl navržen scrining pro nové Protlhoubo-vé sloučeniny k objevení sloučenin účinných proti třídě Candida-'7 Průběhu vývoje produktu se protihoubová aktivita obecně optimalizovala se zřetelem účinnosti proti Candida albicaris- Následkem coho tyto sloučeniny proti Candida nemají často klinicky významnou účinnost proti jiným druhům Hub. Je však zajímavé Poznamenat, že při vyšších koncentracích jsou některé z těchto sloučenin •schopny ničit jiné třídy hub za Předpokladu, že protihoubový terč Je v organismu přítomen- Zpětně takové výsledky naznačují, že tyto organismy mají nějaké přirozené mechanismy odolnosti, které Jim umožňují přežit při klinicky závažných koncentracích některých protihoubových sloučenin. Takové obecné mechanismy odolnosti < Protihoubově účinným sloučeninám zůstávaly nepopsané v případě ~>ub po desetiletí.

Problém odolnosti, proti působení několika drog (mdr - mul-tiple drug resistance), zprostředkovávaný mdr genem, byl nejdříve zjištěn v průběhu vývoje režimu chemoterapie rakoviny- Rakovinové buňky s odolností k četným drogám vykazují odolnost i k vysokým koncentracím velkého množství cytotoxických sloučenin, často tyto cytotoxické sloučeniny nemají společné strukturální charakteristiky ani nevykazují interakci s běžnými terči v buňce- Odolnost Proti těmto cytotoxickým sloučeninám je zprostředkovávaná Ven směřujícím čerpadlem, závislým na ATP. V důsledku tohoto mechanismu nevytvoří toxické koncentrace určité sloučeniny k. akumulaci v buňce-

Kromě výtoku, je také zřejmé, že vtok se rovněž může snížit v buňkách vykazujících mdr (Gottesman a Pastan, 1993, Annual Re-v;i.ew of Biochemistry 62 · str - 385 až 427), Byla charakterizována zcela velká rodina mdr genů, zahrnující četné zcela odlišné organismy. K dnešnímu dni seznam organismů, kt.eré mají funkci jako már, zahrnuje četné druhy b..d:l er I \ . mušku (..V os o P li i. la rr.i · i um iCdr I >. v . ^lasínodium fďlciPaiujm, homn sapiens, kvasinky Sacchai-omyces ce-revjsiae, Caeoorhabditis elegans . Lelshrrianla donovanii , mořské houby a rostlinu Arabidopsis thaliana.

Desetiletí výzkumu vedl o k popisu odolnosti proti mnoha drogám fenolvPu v buňkách lidské rakoviny. Extenzivní výzkum vedl ke skupinám sloučenin, které jsou schopny obráti t mdr fenotyP četných k dorgám odolných linii. rakovinových buněk a učinit je citlivými na Působení eyt otoxiekých sloučenin (naříklad. blokáto-ry vápenných kanálků, ant.iarrhytmi.ka, antihyper tensiva, antibiotika, antihistamlny, látky potlačující imunitu, steroidové hormony , modifikované steroidy, ll.Pofilní kationtv, dikerpeny, deter~ gentv, antidePresant v, antipsvchotika jakož také četné jiné hvd~ rofobní amf ipatic. k.é sloučeniny a jejich analogy (Sottesman a Pas-tam 1933, Annu a 1 Review c>f Biochemi stry 62, str - 38b až 42.7 ) .

Takové sloučeniny se označují Jakožto inhibitory mdr. klinická aplikace lidských mdr inhibitorů při. ehernotrupil rakoviny se sta..... la oborem intenzivního výzkumu -

Nejnovéji byla objevena existence od mdr odvozených genů v nepatogennírh houbách jakož také v klíčové oporl;unis;tické pato-peru i : houbě. Tyto geny se označují jako ' podobné mdr , Protože e--xlstuje homolopie mezi Proteiny kódovanými, těmito Pěny a lidským rri d t - -1 g e r i o v ý m p r o d u k. 1 m. S objevením mdr Podobných genů v četných houbách včetně klíčové patogenní houby, jako je Aspergi 1 lus f.lavus, Aspergillus fu~ m-i tíaI u a Cryptococcus neofonnans, vyhl ídka použi tí kombinované teraple, zahrnující, protihoubové činidlo mající doložené spektrum úči.nnosti. s houbovým mdr lnhl.bit.orem se stala skutečností .

Kombinovaná terapie umožňuje rozSiřeni spektra Protjhoubové účinnosti Pro danou protlhoubovnu sloučeninu, která drive vykazovala omezeni nj' k.iinickv významnou Protihoubovou účinnost- Podobné u sl oučeni.n ·, které vykazuji protihoubovou účinnost, se také může účinnost násobit houbovým mdr inhibitorem, takže protihoubová ú" činnost, tčchto sloučenin se rozšíří na dříve odolné druhy.. 4

Podstat av νι ι/,ι | (-zu

Podstata způsobu zvyšování citlivosti houbové· buňky k. proti-houbovému Činidlu spočívá Podle vynálezu v tom, že se podává takové buňce Účinné množství (i) protihoubového činidla a (li) či-ridla násobícího jeho účinek.

Farmaceuticky prostředek podle vynálezu obsahuje účinné nnožstvl (l) protihoubového činidla, (li) činidla násobícího jeho C činek, a farmaceuticky vhodné ex.cl.pi enty ·

Vynález se také tyká způsobu stanoveni násobícího účinku sloučeniny na protihoubové činidlo působící na houbové buňky, přičemž a) se nechává růst kultura houbové buňky v přítomnosti (i) Proti-houbového sloučeniny, ke které je houbová buňka odolná a (li) sloučeniny s možným násobícím účinkem protihoubového činidlo a b) mčřl se násobiči protihoubové působeni sloučeniny na protihoubové činidlo - Případné používaném výrazem "subjekt" se zde vždy mini organismus, orgán, orgánový systém nebo buněčná linie organismu, 'Ό ktervch žije linie houbových běněk nebo ve kterých žiji linie houbových buněk. Subjek jako takový může byt ošetřován in vítro nebo in vivo- Především je subjektem savec včetně lidi., u kterých se Provádí ošetřeni i η vivo· Výrazem "proti.hov.ibové činidlo" nebo “protihoubová sloučeni- na" se zde vždy mini sloučenina nebo Prostředek, které jsou ey..... sostatické nebo cytotoxické se zřetelem na houbové buňky. Výrazem "násobící činidlo" ("potentiatlng agent") "násobeni", "násobek" nebo "násobený" a Podobně se zde vždy mini vlastnost sloučeniny, sloučenin nebo prostředků Podporovat účinnost proti houbově působícího činidla nebo protihoubové působící stouleni ny na houbovou buňku Výrazem "podpořená účinnost" a "podpora účinnosti" se míní schopnost Protihoubové působícího činidla nebo protihoubové siou Ceniny vykazovat cytostatické působeni nebo cytostati.cké jevy bud v nižší, koncentraci, než je cytostatická nebo cytotoxlcká účin 5 nost v nepřítomnosti násobil ,'s. činidlu nebo cvΊ ostatlcknu nebci oytotoxl ekou účinnost ne houbové buňky j inak, odolné, příslušnému p r r; 11 i. h o u b o v ě p Q s o b 1 c 1. rri u č i., r t 1 d ].u ne b i: i p r o 1.i h o u b o v é s 1 o u č e r i i. r i y v r i e— p ř 11 omno s t.i r >ádob i c 1 h o či r i id 1 a - Výrazem "odolný" nebo "odolnost" se mini schopnost., organismu růst v přítomnosti činidla, které je cytotoxické na tento organismus. Výrazem "Pr ot i houbová účinnost" nebo "protihoubový jev" se zde mini cytostatické nebo cvtotoxlcké působení, protihoubového činidla nebo protihoubové sloučeniny na houbovou buňku.. Výrazem "podáni" se zde vždy mini vhodné podáni množství protihoubového činidla nebo Pr ot1 houbové sloučeniny i n vítr o nebo in v i vři buňce, takže pak může dojit, k prof yloktiekému nebo tetra-peutickému účinku.. Podáním mule být i. jen uvedeni do styku sloučeniny s linii buněk, nebo to může být o sobě známé podáni savcům jakožto ošetřovanému subjektu- Jakožto běžné dávkovači, formy se uvádějí formy podávané orálně nebo pod jazyk, jako jsou napřik-1ad práδky, ku1Íčky, tab1ety, kapsle, siruΡ dá1e vstřikovací iri~ traveriozní roztoky nebo koloidni směsi, prostředky podávané ti-ansdei-málné. nebo jiné externalní prostředky, jako jsou roztoky, krémy, gely nebo jiné masti a/nebo prostřednictvím implantátů s rychlým nebo pomalým uvolňováním účinné látky,

Protihoubové činidlo a násobiči činidlo se mohou Podávat bud (a) současně (popřípadě formulováním dvou látek ve společném nosiči) nebo <b) v různé chvíli v průběhu ošetřování - V tomto druhém případě se dvě sloučeniny Podávají v dostatečně krátké době, aby násobící činidlo podpořilo Pr o·,i houbovou účinnost, proti-houbového Prostředku na houbové buňky. Kromě toho je možné, aby jedna nebo několik protihoubové působících sloučenin a jedno nebo několik, násobících činidel bylo obsaženo v jediném farmaceutickém prostředíu- Násobiči činidlo se Podává v dostatečném množství ko sníženi množství. protihoubového činidla potřebného k dosaženi citlivosti houbových buněk, k množství. Podávaného protihoubového činidla- Používané množství protihoubového činidla podle vynálezu zá~ v i -vi ne příslušném ničeném houbovém organismu, ne podmínkách zfetřenl, ne zvloleném protihoubovém Činidle a na zvoleném riáso-"Ίηί rn činidle -

Far mace-u t lek*5 prostředky protihoubového činidle nebo proti-houbových činidel e násobícího činidle nebo násobících činidel., oud samotných nebo ve směsi se mohou připravovat o sobě známým způsobem , přičemž se protihoubové činidlo nebo protihoubová činidla a násobiči činidlo nebo násobíc! činidla, bud samotná nebo ve směsi zPrecováevají spolu s farmaceuticky vhodným nosičem. Vhodné nosiče a jejich formulace včetně delších lidských proteinu například lidského sérového albuminu, jsou popsány například, v Publikaci. Remington s Pharmaceutical Sciences, 16. vydání., 1980, Mack Publishing Co-, Oslo- Farmaceutické prostředky obsahují účinné množství protihoubového činidla a násobícího činidla bud samotné nebo ve směsi se vhodným množstvím nosiče Pro přípravu farmaceutického prostředku vhodného Pro účinné podání hostiteli. Takové Prostředky se mohou Podávat orálně, topinky, pareriterálně nebo nasálně nebo opthaImickou cestou nebo jinak k zajištěni u~ volnováril protihoubové účinné látky a násobícího činidla na místě infekce v účinné formě- Následující Příklady vynález blíže objasňuji- trčíte Použité látky a Podmínky nejsou však nijak míněny jako omezujíc! nýbrž toliko jako objasňující - křiklady Provedení Přiklad 1

Klinický izolát AsPergilius fumigatus, kmen iOAF (společnost Eli Lilly and Company) se použije Pro Protihoubové zkoušky citlivosti. a násobícího účinku- Spory AsPergilius fumlgatus, kmen 10AF se připraví naočkováním bramborového dextrosového škrobu (Difeo I.. aboratorl.es, Detroit. ML) spor ami d louhodobě uloženými . Dest ičky se inkubují Při. teplotě 16 C po dobu 24 hodin a Pak ještě pυ dubu jednoho až dvou dni Při teplotě místnosti až do chvíle zřejmě sporul aci.; - bpory se sklidí zaplavením dest i dek 0,05% roztokem I weenu a jemným setřeenírn povrchu destičky k supensovánl spor . Spory se Pak získají odstředěním a resuspenduj1 se ve studením ú-ložném koriservovaném prostřed! obsahujícím 50 g/1 lak tosy, 100 ml/3. glycerolu a 850 rnl vody- Suspenze spor, připravená tímto způsobem, zůstává živoucí Po dobu několika měsíců, Pokud, se uloží Při teploté -70 "C. Přibližné 1 x 106/ml spor AsPergillus fumlgatus, kmen 10AF se suspendujte v au tok 1 á vovaném sojovém agaru TryPtirsase (ochlazeném přibližné na teplotu 50 °C) a 15 ml suspenze se vnese na každou z Petři destiček. Povrch agaru těchto Petr! destiček, se nechá zaschnout v biologickém poklopu ("biohazard hood.) - P r o t i.h ou b o v á sloučenina P1061 se rozpust! ve 100% ethanolu v koncentraci bud 1 nebo 1 mg/ml. Tato Protihoubová sloučenina K106 1 je popsána v amerlckrn patentovém spise číslo 5 057493. Vnese se 30 μ,].. roztoku 1 mg/ml R10b1 na zkušební kotouček s anti-bl c 11 lískou citlivosti (Olfco Laboratoř les , Dětmi, t MI). Po Přidáni, antibi etického roztoku na kotouček, se kotouček necita zaschnout na vzduchu v biologickém poklopu- Po zaschnutí se kotoučky umístí, na povrch petrc destiček obsahujících spory AsPergil. 1. us tumi.gat.us·> i- mel i Ί 0AF: .

Sloučenina (například domnělé činidlo), jejíž násobiči působení na R1061. proti AsPergillus fumlgatus se zkouší, se rozpust! v dl. methylsult oxidu - Množství sloučeniny, Přidávané do dl.methyl .-· sul f c»-l du , závisí na rozpustnosti jednotlivé zkoušené sloučeniny. Vnáší, se 30 μ i. suspenze, obsahující, zkoušenou sloučeninu, na zkušební kotouček s citlivostí P antibiotikům (Olfco Laboratories, ’. í.iitii. Ml).. Tyt r.i kotoučky, obsahující. zkoušenou s..l < lučeni nu , se nec hají, zaschnout na vzduchu v biologickém poklopu · Pak se položí na Povrch zaschlých» Petři dešti, ček , obsahu jících spory AsPergillus fumlgatus, přibližně 3 cm od kotoučku , ob sa h u j 1 c 1 h o Pro 1.1 .houbové činidlo· Petři destičky, obsahující, oba kotoučky, se Inkubu.jí Při teplotě 35 "C přes noc- Příští ráno se Petři destičky zkoumají se zřetelem na zuny inh-j b! ce rastu okr.» J.o kotoučků - V tabulce I je seznaní sloučenin (to je domnělých násobících 8 Γ j. nlde.l ) a výsledku, získaných s těmito sloučeninami při shora popsané zkoušce schopnosti násobit účinnost R 106 I proti. AsPergil-3,us fumlga tus - Při. shora uvedenvch koricentracích R1061 se nepozoruje žádni významná zóna inhibice růstu okolo kotoučku obsahujícího R.106 í . V tabulce I výsledek "+" znamená, že je zóna inhibice růstu na zkušební misce, že tedy sloučenina, obsažená v kotoučku. Přiléhajícím na kotouček s antibiotikem, násobí protihoubovou ú-i'činnost pí- otl.houbové sloučeniny K106I. . Výsledek “ —" znamená, že u.·η. zóna inhibice růstu na zkušební misce, že tedy sloučenina, obsažená v kotoučku, Přiléhajícím na kotouček s antl.biotl.kem, ne~ násobl pn >t i houbovou účinnost Pr ot i houbové sloučeniny R. 1061. . Tabulka I také obsahuje krátký popis četných zkoušených sloučenin se zřetelem na schopnost násobit protihoubovou účinnost R1061. tabulka 1 Výsledek V y s v é 11. <.ní. bio k á 1 o i " C a + + kaná .1 k. u + lidský mdr inhibitor antineop 1 astové či rtidlo lidský rndr inhibitor

Zkou δ e n á s1o učeη111 a vet" a Pánvi J. * 300 mg/kotouček2 vl.nd.olin a r i ti. P s y ch o ti ck. é. č 1. r i i d 1. o u k. 11. d ií o vad prostř edek lidský mdr inhibitor 400 i n g / k c 11 o u č e k. 2 660 mg/Rotouček3 t.r i t .1 ui η o per az i n1 440 mg/k.otouček 1

1 produkt společnos ti Sigma Chemical Comparty, St- Louis MO 2 R 106 I koncentr ace 20 mg/kotouček. 3 R.1061 koncentrace 140 mg/kotouček Příklad 2

Protoplasty Lenoši ! i i um chrysogenum (společnost tli. Lil.lv and Comparty) se vytvoří s Novozyme 234 podstatné způsobem, který popsal Pro Cephaiosporium acrernoniurn Queener a kn 1 . , 13 66

Mi crobl o logy 1985, American Society tor Miter obl.o.1. ogy , str - 468 až 47 2 u ’,· k, i! 1" 1. d a 1' oj - 1 9 8 7., Current Genetics 12, ·. ·. 3 i - 2 37 a ž 348 . V p r ϋ b é h u vytvář oni P ·η i i i IJ iijm r:hr ysogenum , prc \oP i a-ů ů a ná~" sled né re Qo nerat e bunééné s • tény se používá ο,.η. hari.ioy J akoř to os- moll ck.ého tabl] izát ořu SP'.I Se než chloridu sodného, ja k se popi- suje ve s h c V c! L vede Tié litr ratúře. Připraví se Petři des vleky, i< 1 er é o fo s ahu ji agarr .'Vl i 1.1 VI'"·;;; lvu, která má tyto složky: kvas n.icnou dusí kijVou ba sl bc, z a rnl.nok.yso .kin a síranu amonného (1,7 g /1) (Dit- c o L. aborát or i es, Del r e i (. MI ); síran amonný (8 g/1); a SotC harosa (12 2 g/t; l.rlf :i uor i peraxir (koneéná končenir a co 2 5C m M; Sigma Chem i ca ! C o ^ t i t. Či log # 1-8516); a chlorid kademnatý (k.c noř n á k.orr cent r .·:.!re 3 rtiH/m] ) - Při. biu né 2 x 10 ' protop.tastů P eriix lilium chrv sogenum se v*r e s oi. na při v roh ztuhl ého aguru do 4 m'| mék.k é a g a - r ové l"i oi" nl V i" St vy , kt erá má t. v t o s .1. o žky: kvasní c v i o u d u s i k o v o u b a "· si. b ez aiTi inokyse lín a sir ar u amonného (1,7 g/I) (Dl.fcc 1... <xb orat.o ” r i. es , Oetr ol t MI) ; si .ran um nnv (5 g/1); a sarharosa (1 2.5 g/1) ; a a Q a r (4 g/ 1) - Dos tlel y se l.r kubujl přes noc Při teplot é 15 "C . PřlSt 1 ráno s e Přidá hygromycin 6 (konečná konce ntrace 250 rncj/m ! , Br.ie hr inger Mar nhe .i o C a ta log 11 843 5o5 ) na deštit: ky d o 4 mi mek k é a r 9 a rové ho r n:f V| St.vy sestávající z kvasnicné dus í .k ci v é b a -· se bez a m i. r- to kysel i η a síranu amonného (1,7 g/J.) <O j ico Iaborato- r :i es Del ΙΊΊ it MI ) ; ze síranu amonného (5 g/1); a ze Svj C h a r o s y ( 1 V C \ > <·- ·; g / I ! ; 3 z ao 3 r u (4 g/1) - Destičky se inkubujl po dobu 4 8 ho- d i n Při te P i oté 28 "C . 1'rová déjl se dalSl zkoušky, při k.ter ých se koříc sntrac e trifl uor r Per azinu a hygromycinu B méni, J a l<. u vedeno V ta au lee 11 V vsi dkv té t.o z kouSky jsou uvedeny v tabulce I I - \/ y s j.edků j e zřejmé > ŽO t-O Xick é Puso benl hygromycinu B se v při padé 1 T i i “ cil j i um i h "V sogenurn π ásobl v při t omnos ti tr i r .1 u or op er a z i rtu ·· V ta- b! .11c a I3 výs lebek * Sf M :.··! i.-.un. -i a růst bunék tem.e:i.ll:ium c kir ys oQenum a t ,td ! . · · ér Lox iké Působě nl hygromyclnu B není náso 'ί.ΊΊΟ tr ,i - t .1 u o "oPi r a i i. iem. Výši edek znamená, že se nepozoruje r lis t kuj.- tur y ken i i LJj.um chr ysoQenum a tudíž, že toxické působ .ιιΐ "tygr· o- ni v cl "1U b j e násob eno tr i t It.to r operazl rtem -

1 O

Tabulka I i Riis t Perric:i 1.11 urn H v Q r o m y c. ϊ r ι B mg/ml 0 0, 250 1,000 2 „ 000 3.000 4.000 5.000 5.000 chrvííogeruim Ti- i t 11.; or op. ·ι · a z Ir i pM 500 250 500 500 500 500 500 0

Pust + FV umys 1 ová využi twlnos 1' 2 P Cl sob z Vyt íovánl eltl l.vostx houbových bunCT . k Prot-l..hoi ib r vé či či ι- nýrn I át.Pám Podávánim Pr iti. i i‘n u.;bi ι·.·Λ tíč i nných J át. k. spolu s Ο:! ni d I \ Která jej Ir I") Ci činek n á s o b 1. 2 p ů s o b z k c i u ž enl vhodnost1 č:i ni d< k násobeni účinnosti protihoubove Púsoblch 1 á t i i< .

V

Claims (1)

1. Γ» \ 'Τ’ Γ ν' Τ , 1- . ν .. ν ( -· 1 ... χ : 1.....\. ... , η _ ι λ ρ τ i 1 r .< c- -. i- -- .-. - X .... τ. ο 1. J 1. · i 1 Ο >·, 1-. J 1 Ρ 4- ... ^ ,-. X.

   ν, r. - 1 , - ... 1 7 „· .. } 1 .