CZ205496A3

CZ205496A3 - Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny, způsob jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4

Info

Publication number: CZ205496A3
Application number: CZ962054A
Authority: CZ
Inventors: Martin Schwarz
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1994-01-20
Filing date: 1994-01-20
Publication date: 1997-03-12

Abstract

Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny obsahující PBMC aktivované IL-10 a farmaceuticky vhodný nosič, způsob jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku k léčení rakoviny, způsobu jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4.

Dosavadní stav techniky

Imunologické přístupy k léčení rakoviny jsou založeny na poznatku, že rakovinové buňky poněkud zmařily obranu organismu proti jinde se vyskytujícím nebo cizím buňkám a molekulám, a že tato obrana může být léčebně povzbuzována k zabíjení rakovinových buněk nebo zabraňování jejich růstu, například jak o tom pojednává Klein [Immunology, Wi1ley-Interscience, New York, str, 623 až 648, 1982]. Nové poznatky, že imunitní efektory mohou přímo nebo nepřímo mařit růst nádorů, vedl k obnovenému zájmu o tento přístup k léčení rakoviny [Heberman, Concepts Immunopath. 1=96 (1985), (přírodní zabijácké buňky zabraňují růstu nádorů); Rosenberg ^a kol. Ann.Rev.Immunol. 4^:681 (1988) (použití zabijáckých buněk aktivovaných IL-2 k léčení rakoviny); Ralf a kol., J.Exp.Med. 167=712 (1988) (ničivá činnost makrofágů vůči nádorům podporovaná lymfokiny) Tepper a kol., Cell 57=503 (1989) (IL-4 má ničivý účinek na nádory); M.Cohen, Lymphokines and Tumor Immunity“ -lymfokiny a imunita vůči nádorům), str. 237 až 253, S. Cohenem vydané publikaci Lymphokines and the Immune Response lymfokiny a imunitní odezva (CRC Press, Boča Raton, (1990)1.

Schopnost imunitní odezvy vůči novotvarům je řízena rozmani2 tými typy buněk a zahrnuje působení T-buněk a cytokinů odvozených od monocytů. Jedním z imunologických přístupů, který se ukázal jako klinicky slibný, byla tak zvaná “adoptivní imunoterapie používající zabijáckých buněk aktivovaných IL-2 [Rosenberg, Sci. Am., str. 62 až 69 (květen 1990)]. Ačkoli se IL-2 samotný nebo v kombinaci s několika tradičními chemoterapeutickými činidly jeví jako účinný k léčení určitých zhoubností (například karcinomu ledvinových buněk), vedly některé nešťastné vedlejší toxické účinky jako propouštění cévního řečiště a otoky spojené s podáváním účinných dávek IL-2 k názoru, že rizika by mohla převážit užitečnost [Cotran a kol.,J.Immunol. 139:1882 (1987); Edwards a kol. Cancer Res. 52:3425 (1992)].

L idské -endothel iální buňky cév jsou obzvlášť citlivé na toxicitu IL-2, jak je zřejmé ze zvýšené propustnosti cév (to je syndrom cévní netěsnosti) a otoků. Jeden z činitelů přispívajících k této patologii může být zesílen ulpíváním T-buněk a neutrofilních leukocytů, aktivovaných IL-2, na jednovrstvové cévní výstelce, jak bylo dříve pozorováno in vitro [Edwards a kol.; Damle a kol. 138:1779 (1987)].

Alternativním přístupem k imunologickému léčení novotvarových chorob je adoptivní přenos imunních buněk. Adoptivní imunoterapie je definována jako přenášení do jedince s nádorem aktivních imunologických reagencií, jako jsou buňky s protinádorovým působením, které mohou zprostředkovat buď přímo nebo nepřímo protinádorové účinky. Adoptivní imunoterapie představuje atraktivní přístup k léčení novotvarových chorob. Je třeba poznamenat, že jelikož jsou do jedince přenášeny aktivní imunologické reagencie, není potřebná imunitní schopnost jedince. Tudíž potlačení imunity, které obecně souvisí s nádorovým stavem nepředstavuje hlavní problém při této terapeutické alternativě. Jelikož není potřebná imunitní schopnost jedince, a ve skutečnosti může být blahodárná k účinkům adoptivního přenosu imunních buněk, může být adoptivní imunologie snadno kombinována s ostatními terapiemi, jako je che3 raoterapie nebo ozařování.

Pacienti, prodělávající chemoterapii nebo ozařování, mají sklon mít nižší imunitu a budou mít obecně vyčerpanou dodávku efektorových jednojaderných buněk periferní krve (PBMC), jež jsou k disposici k aktivování. U takových pacientů by terapie vykazující účinnost při nízkém poměru efektorových buněk k buňkám cílovým byla tudíž obzvlášť výhodná.

Schopnost imunitní odezvy vůči novotvarům je řízena rozmanitými typy buněk a zahrnuje působení T-buněk a cytokinů odvozených od monocytů. Adoptivní imunoterapie používající rekombinantních lidských cytokinů vyvinula podávání jednojaderných buněk periferní krve (PBMC) stimulovaných mimotělně [Phillips a kol., Clin. Oncol. 5 :19 3 á“: ( 1987 X; J?errusia, Curr . Opin . Immunol. 3 : 49 :( 1991) ] následované podáváním IL-2 [Rosenberg a kol. J. Immunol. 138: 1779 (1985)]. Mimotělní zpracování PBMC vytváří zabijácké buňky aktivované lymfokiny (lymphokine-acti vated killer LAK) a aktivované přírodní zabijácké buňky (natural killer NK) mající cytolytické účinky na různé nádorové buňky.

Uvádí se [Nagasawa a kol. Cell.Immunol. 133:317 (1991)], že lidské IL-5, IL-7 [Stotter a Lotze, Arch.Surgery 126:1525(1991)] a IL-12 [Gately a kol. J.Immunol. 147:874 (1991) ] podporují cytolytickou aktivitu v lidských PBMC. Zdá se, že interleukin-10 (IL-10), původně popsaný u myší jako syntetický cytokinový inhibiční faktor (cytokine synthesis inhibitory factor) vylučovaný specifickými pomocnými substrukturami T-buněk, moduluje diferenciaci myších cytotoxických T-buněk. [Chen a Zlotnik,J.Immunol . 147:528 (1991)]. Zjistilo se také, že lidské PBMC, inkubované se supernatanty, získanými z buněk COS transfektovaných lidským IL-10 cDNA, lyžují cíle nádorových buněk in vitro. T-buňky odpovídající IL-10 se zvýšeným cytolytickým potenciálem byly identifikovány jako CD56+ fenotyp, indikativní pro NK-buňky.

Za jistých okolností může IL-4 nepříznivě ovlivňovat vytváření LAK aktivity IL-2 [Nagler a kol. J.Immunol. 141:2349 (1988)]. Kultivují-li se například lidské PBMC v přítomnosti jak IL-2, tak IL-4, je lyse LAK-oi11 ivých cílů silně snížena [Spits a kol. J.Immunol. 141=29 (1988)1. Jsou-li PBMC předběžně kultivovány v prostředí doplněném IL-2 po dobu 3 dnů před přidáním IL-4, je však výsledkem cytolytická aktivita [Spits a kol.1. Kromě toho může být blokáda cytotoxicity řízená IL-2 působením IL-4 snížena, je-li do původní inkubační směsi začleněn alfa-interferon (of-IFN) nebo alfa-faktor nádorového odumírání tkáně (tumor necrosis factor-alfa TNF-ae) [Svisher a kol. Cell. Immunol . 128: 450 (1990)1.

Kedar a kol. [Cancer Immunol.Immunother. 35=63 (1992)1 nedávno naznačil, že po sobě následující podávání IL-2 a oe-IFN je účinným imunoterapeutickým režimem k ošetřování sarkomů MCA-105 a karcinomů Ml09 na myších nádorových modelech. Primárním poznatkem z této studie bylo, že po sobě následující podávání cytokinů se jeví jako účinnější než současné podávání obou cytokinů.

Proveditelnost a účinnost adoptivní imunoterapíe jakožto způsobu léčeni různých chorob, zejména léčení novotvarových chorob (rakoviny) u lidí, je číslo 4 690915 (Rosenberg) popsána v americkém patentovém spise Jak už bylo uvedeno shora, chybějí způsoby provádění takového léčení, které nejsou tak toxické jako způsoby používající IL-2 samotného. Je také potřeba terapie, která je účinná při nízkých poměrech efektořových k cílovým buňkám.

Vynález splňuje tyto požadavky tím, že poskytuje farmaceutický prostředek k léčení rakoviny obsahující IL-10 samotný nebo v kombinaci s IL-2 a/nebo oe-IFN ke zvýšení cytolytické aktivity PBMC, obzvláště buněk LAK a NK.

Podstata vynálezu

Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny spočívá podle vynálezu v tom, že se že obsahuje PBMC aktivované IL-10 spolu s farmaceuticky vhodným nosičem.

Při jednom provedení prostředek IL-10 v kombinaci zvýšení aktivace buněk LAK, techniky, které používají IL-2 buněk NK a LAK. Vynález silně vynálezu obsahuje farmaceutický s množstvím IL-2 postačujícím ke avšak nezpůsobujícím toxické vedlejší účinky přičítané používání IL-2 samotného.

Při jiném provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje IL-10 v kombinaci s množstvím ce-IFN, postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK.

Při ještě jiném provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje IL-10 v kombinaci s (a) množstvím IL-2 postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK, avšak nezpůsobujícím toxické vedlejší účinky přičítané používání IL-2 samotného, (b) množstvím ořIFN postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK.

V uvedených prostředcích se používá s výhodou lidských IL-10, IL-2 a αί-IFN, nejvýhodněji rekombinantních IL-10, IL-2 a ot-IFN.

Vynález znamená zlepšení oproti způsobům dosavadního stavu k vyvolání cytolytického působení redukuje toxické vedlejší účinky, které jsou typickým důsledkem používání IL-2 v takových způsobech léčení tím, že IL-2 vylučuje úplně, nebo silně snižuje množství IL-2, které musí být použito.

Pokud nejsou definovány jinak, mají zde použité názvy stejný význam jak je jim rozumněno v oboru, na který je vynález zaměřen.

Pokud jde o zde používaný název adoptivní imunologie, znamená to terapii zahrnující přenos aktivovaných funkčních imunních buněk do pacienta. Tyto buňky zahrnují s výhodou buňky LAK a NK pocházející z aktuálního pacienta prodělávajícího léčbu.

Zde použitý termín regrese je zde definován jako měřitelné zmenšení rozměru alespoň jednoho nádoru, jak se v oboru běžně měří.

Pokud jde o interleukin-10 nebo IL-10, je zde definován jako protein, který (a) má aminokyselinovou dokonalou sekvenci (to jest chybějící sekreční vůdčí sekvenci) IL-10, jak je uvedena v souboru americkém patentovém spise číslo (přihláška vynálezu číslo 07/917,806 z 20. července 1992, která odpovídá mezinárodní přihlášce vynálezu WO 91/003349 a (b) má biologickou aktivitu, která je společná s nativním IL-10. Pro účele vynálezu jsou glykosilované (to je vytvořené v eukariotických buňkách jako jsou buňky CHO) a neglykosilované (to je chemicky syntetizované v nebo vytvořené v E-. jcoli) IL-10 stejnocenné a lze jich používat zaměnitelně. Zahrnuty jsou také muteiny a jiné analogy, včetně proteinu BCRF1 (Epstein Barrův virus virální IL-10), který má biologickou aktivitu IL-10.

IL-10, vhodný k použití podle vynálezu, lze získat z řady zdrojů. Může být například izolován z kultury aktivovaných buněk vylučujících protein. Dále může být IL-10, nebo jeho aktivní fragmenty připraven chemickou synthesou za použití standardních v oboru známých technik [Merrifield, Science 233:341 (1986) a Altherton a kol., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, I.R.L. Press, Oxford],

S výhodou je protein nebo polypeptid získáván rekombinantními technikami za použití izolované nukleové kyseliny kódující polypeptid IL-10. Obecné způsoby molekulární biologie jsou popsány v literatuře [například Sambrook a kol. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 2. vydání 1989 a Ausubel a kol. (vydavatelé) Current Protocols in Molecular Biology, Green/Woley, New York (1987 a periodické doplňky)]. Příslušné sekvence je možno získat stadardními technikami z každé genomické nebo cDNA knihovny. Lze použít technik polymerazové řetězové reakce (PCR) [například PCR Protocols: A Guide to Methods and App7 lications, 1990, Innis a kol. (vydavatel) Academie Press, New

York, New York.

Knihovny jsou vytvořeny z nukleové kyseliny extrahované z příslušných buněk [například zveřejněná mezinárodní přihlášku vynálezu číslo W0 91/00349, kde jsou popsány rekombinantní metody přípravy IL-10]. Užitečné genové sekvence lze nalézt například v různých databázích sekvencí, například GenBank a BMPL nebo nukleové kyseliny a PIR a Swiss-Prot pro protein, c/i Intelligenetics Mountain View, California, nebo Genetic Computer Group, University of Wiconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin.

Klony, obsahující sekvence jež kódují lidský IL-10, jsou deponovány ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryfand pod „čísly 68191 a 68192. Identifikace ostatních klonů, obsahujících sekvence kódující IL-10, se provádí buď hybridizací nukleové kyseliny nebo imunologickou detekcí zakódovaného proteinu, je-li použito expresního vektoru. Oligonukleidové vzorky, založené na deponovaných sekvencích uvedených v mezinárodní přihlášce vynálezu číslo W0 91/00349, jsou obzvlášť užitečné. Sekvence oligonukleotidových vzorků lze také připravit z konzervovaných oborů příbuzných genů v jiných druzích. Alternativně je možno použít degenerovaných vzorků založených na aminokyselinových sekvencích IL-10.

Standardních metod je možno použít k produkci transformovaných savčích, kvasinkových nebo hmyzích buněčných linií, které expresují velká množství polypeptidu. Exemplární kmeny E. coli, vhodné jak k expresi tak ke klonování zahrnují W3110 /ATCC Bi , 27325, X1776 (TCC č. 31244), X2282, EE1 (ATCC Mp/31343). Exemplární savčí buněčné linie zahrnují buňky COS-7, myší buňky L a buňky CHP (Sambrook (1989) a Ausubel a kol., 1987 doplňky).

K expresování DNA kódujících IL-10 je možno použít různých expresních vektorů. Použít lze konvenčních vektorů, používaných k expresi rekombinantních proteinů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Mezi vhodné vektory patří vektory pcD, které popsal Okayama a kol., Mol. Cell. Biol. 3:280 (183); a Takebe a kol., Mol. Cell. Biol. 8:466 (1988). K dalším savčím expresním vektorům, založeným na SV40, patří vektory objevené Kaufamanem a kol., [Mol. Cell. Biol.1:1304 (1982)] a vektory popsané v americkém patentovém spise číslo 4 675285. Tyto vektory, založené na SV40, jsou obzvlášť užitečné v opičích buňkách COS-7 (ATCC č. CRL 1651) stejně jako v jiných savčích buňkách, jako jsou myší buňky L [ Pouwels a kol. (1989 dodatky) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York].

IL-10 je možno vyrábět v rozpustné formě jako vylučovaný produkt transformovaných nebo transfektovaných kvasinek nebo savčích buněk. Peptidy je pak možno čistit standardními postupy známými v oboru. Například mohou čisticí operace zahrnovat precipitaci síranem amonném, ionexovou chromatografií, gelovou filtraci, elektroforézu a afinitní chromatografií [Methods of Enzymology Purification Principles and Practices, nakladatelství Springer, New York, 1982 ] .

Alternativně lze IL-10 vyrábět v nerozpustné formě jako agregáty nebo inklusní tělesa. V takové formě se IL-10 čistí standardními postupy dobře známými v oboru. Příklady čisticích operací zahrnují separaci inklusních těles z narušených hostících buněk odstřeďováním a pak rozpouštění inklusních těles chaotropickým činidlem a redukčním činidlem takže peptid zaujme biologicky aktivní uspořádání. Podrobnosti k těmto postupům popisuje například Winkler a kol. [Biochemistry 25:4041 (1986], Winkler a kol., [Bio/Technology 3:9923 (1985]; Koths a kol., [americký patentový spis číslo 4 569790].

Sekvence nukleotidů, použité k transfektování hostujících buněk, lze modifikovat podle standardních technik k vytváření IL-10 nebo jeho fragmentů s různými požadovanými vlastnostmi. Takové modifikované IL-10 se mohou lišit od sekvencí vyskytujících se v přírodě na úrovni primární struktury, to je aminokyselin, insertů, substitucí, vypuštění a fůzí. Modifikací lze použít v řadě kombinací k vytvoření konečného modifikovaného řetězce proteinů.

Varianty sekvencí aminokyselin lze připravit k různým záměrům, včetně zvýšení poločasu životnosti sera, usnadnění čištění nebo přípravy, zlepšení terapeutické účinnosti a snížení závažnosti nebo výskytu vedlejších účinků při terapeutickém použití. Variantami sekvencí aminokyselin jsou obvykle předem určené, v přírodě se nevyskytující varianty, ačkoli jiné mohou být variantami po translaci, například glykosylované varianty nebo proteiny, které jsou konjugovány na polyethylenglykol (PEG). Takových variant je možno v provedeních podle vynálezu použít, pokud si zachovají biologickou aktivitu IL-10.

Modifikace sekvencí kódující polypeptidy lze snadno uskutečnit různými * technikajni, jako je mutagenese, zaměřená na určité místo [Gillman a kol. Gene 8:81 (1987)]. Většina modifikací se vyhodnocuje rutinním skrínováním ve vhodném testu pro požadované vlastnosti. Například mezinárodní zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 91/00349 popisuje řadu zkoušek in vitro, vhodných k měření aktivity IL-10.

Lidského IL-10 se s výhodou používá k ošetřování lidí, ačkoli je možno použít virálního IL0-10 nebo IL-10 z některých jiných druhů savců. Nejvýhodnějším používaným IL-10 je rekombinantní lidský IL-10. Příprava lidského a myšího IL-10 byla popsána v mezinárodním patentovém spise číslo WO 91/00349. Klonování a expresi virálního IL-10 (proteinu BCRF1) z Epstein Barrrova viru popsal Moore a kol. [Science 248:1230 (1990)]. Rekombinantní lidský IL-10 je také obchodním produktem například společnosti PreproTech,Inc., Rocky Hill, NJ.

Mezi jedince, vhodné k léčení způsoby podle vynálezu, patří všichni jedinci s novotvarovým onemocněním, u kterých by mohla být blahodárná stimulace cytolytické aktivity PBMC, obzvláště buněk LAK a NK. Příklady pacientů s rakovinou uvádí například shora uvedený Rosenbergův patentový spis a článek v americkém vědeckém tisku. Vhodnými pacienty pro léčení způsoby podle vynálezu jsou jedinci s disposicí na zvýšení úrovně endogenního IL-4, kde IL-4 blokuje aktivaci cytolytické aktivity IL-2. U takových jedinců by vhodné léčení zahrnovalo předléčení IL-10 před podáváním IL-2.

Standardních způsobů a technik, popsaných pro výrobu IL-10 k použití podle vynálezu, je možno použít také k výrobě IL-2 a α-IFN. IL-2 a α-IFN jsou také obchodně dostupné (například IL-2 je obchodním produktem společnosti Cetus Corporation, Emeryville, CA a α-IFN obchodním produktem společnosti Schering Corp., Kenilworth, NJ ) .

Mimotělní aktivace PBMC (s výhodou získaných standardními způsoby z ošetřovaného pacienta) a podávání takových buněk se provádí výhradně způsobem podle shora uvedených prací Rosenberga s tou výjimkou, že .IL/-10 spolu se sníženými úrovněmi IL-2 a/nebo α-IFN se používají jak je popsáno v tomto vynálezu. Počet podávaných aktivovaných PBMC je přibližně ÍO⁶ až přibližně 10¹² buněk. S výhodou, nikoli však nutně, je podávání takových buněk doprovázeno a nebo následováno podáváním IL-10, jak zde popsáno.

Podle jednoho provedení jsou PBMC ativovány předzpracováním IL-10 [například přibližně třídenní inkubací při teplotě 37 ’C v přítomnosti 4 ng/ml (100 jednotek/ml) nebo 40 ng/ml lidského IL-10]. Pak se buňky promyjí k odstranění volného IL-10 a přidají se malá množství (zpravidla přibližně 2 jednotky/ml) IL-2.

Podávání cytolytických buněk, aktivovaných IL-10, samotných nebo v kombinaci s ostatními zde používanými cytokiny, se uskutečňuje s výhodou intravenosní infusí. Lze to provádět například centrálním intravenosním katetrem do velké periferální cévy, nebo do hepatické tepny perkutánním katetrem.

IL-10 se obecně podává jako farmaceutický prostředek obsahující farmaceutický nosič a účinné množství IL-10 samotného nebo v kombinaci s IL-2 a/nebo α-IFN. Farmaceutickým nosičem může být jakákoli netoxická látka vhodná k dodávání prostředku podle vynálezu pacientovi. Prostředky vhodné k parenterálnímu podávání takových drog jsou dobře známé [například Remington's Pharmaceuti 11 cal Science. 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980]. Alternativně mohou být prostředky podle vynálezu vpraveny do pacientova těla systémem implantování nebo injektování drogy [například Urquhart a kol., Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 24:199 (1984); Lewis (vyd.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenům Press, NY.1981); americký patentový spis číslo 3 270960].

Podávání cytokinů je možné dobře známými cestami včetně intravenosního, intraperitoneálního, a subkutánního. Výhodné je intravenosní podávání.

Pokud jsou prostředky podávány parenterálně, jsou formulovány do injektovatelných jednotkových dávek (roztoků, suspensí, emulsí) spolu s farmaceutickým nosičem. Příklady takových nosičů jsou normální solanka, Ringerův roztok, dextrosový roztok a Hankův roztok. Použít je možno také nevodných nosičů jako fixovaných olejů a ethyloleátu. Výhodným nosičem je 5% směs dextrosy a solanky. Nosič může obsahovat malá množství aditivů, jako jsou látky usnadňující isotonicitu a chemickou stálost, například pufry a konzrervující látky. IL-10 je s výhodou formulován ve vyčištěné formě v podstatě prosté agregátů a jiných proteinů v koncentraci přibližně 5 až 20 gg/ml.

Prostředky podle vynálezu je možno dodávat také technikami standardní genové terapie, včetně například přímého injektování DNA do tkání, použtí rekombinantních virálních vektorů a implantace transfektovaných buněk [například Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10:180 (1992)].

Společné podávání jednoho nebo několika popsaných terapeutických činidel může být současné (spolu s podáváním IL-10), nebo postupné. S výhodou je například podáván IL-10 před podáním 11-2. Podávání α-IFN může být současné s IL-10 a/nebo IL—2 nebo postupné. Všechna podávaná činidla mají být v pacientově těle v úrovni postačující k terapeutickému účinku vyvolání ústupu nádoru .

Účinným množstvím se zde míní množství IL-10 postačující ke snížení nebo prevenci vedlejších účinků v adoptivní imunoterapii a k současnému podpoření cytolytické aktivity buněk LAK a NK. Účinné množství cytokinů, potřebné pro jednotlivého pacienta, se může měnit v závislosti na takových činitelech, jakými jsou například stav a typ léčeného novotvarového onemocnění, celkový zdravotní stav pacientaa, způsob podávání, závažnost vedlejších účinků, množství a druh současně podávaných drog.

Množství cytokinů postačující ke zvýšení aktivace buněk LAK je zde definováno jako průměrné množství cytokinů, potřebě k vytvoření alespoň 25% nárůstu úrovně cytolytické aktivity vyvolané IL-10 samotným v cytolytickém testu, založeném na Daudiho buňkách. S výhodou je, nárůst nejméně asi 50% a nejvýhodněji nejméně asi 100%.

S výhodou se IL-10 podává v maximální snesitelné dávce od přibližně 10 jednotek na kilogram hmotnosti (J/kg) za den až do přibližně 10⁸ jednotek na kilogram hmotnosti (J/kg) za den. Podobně se mají podávat také IL-2 a α-IFN v maximální snesitelné dávce (například pro IL-2 je dávka : 10⁵ J/kg tělesné hmotnosti podávaná intravenosně každých 8 hodin v 50 ml 0,9% solanky s 5% albuminu jako nosiči; pro (X-IFN je dávka: 10⁶ J/kg tělesné hmotnosti podávaná intravenosně každých 8 hodin v 50 ml 0,9% solanky s 5% albuminu jako nosiči). Jak bylo shora uvedeno, stanoví dávkování lékař v mezích určených jako snesitelné pro každého pacienta individuálně.

Způsobů podle vynálezu je možno také používat v souvislosti s tradičními postupy léčení rakoviny, jako je ozařování a chemoterapie, při použití tradičních chemoterapeutických činidel jako jsou alkaloidy Vinca, sloučeniny platiny a 5-fluorouraci 1.

Ošetřování lidských jednojaderných buněk periferní krve IL-10 samotným nebo v kombinaci s jinými cytokiny vyvolává nárůst cytolytické aktivity vůči lidským cílovým nádorovým. Jelikož je účinnost imunoterapie do velké míry závislá na nádorovém zatíže13 ní, bylo by obzvlášť blahodárné aplikovat zde popsané způsoby léčení po excisi většiny primární hmoty nádoru. Zánětlivé reakci, ke které typicky dochází v místě chirurgického zákroku, může být také s výhodou terapeuticky předcházeno.

Vynález blíže objasňují, bez záměru na jakémkoliv omezení, následující příklady praktického provádění.

Příklady provedení vynálezu

Účinek IL-10 na cytolytickou aktivitu lidských jednojaderných buněk periferní krve

Výsledky studfe účinku vytvoření cytolytické aktivity lidských jednojaderných buněk periferní krve působením IL-10 in vitro jsou shrnuty do následujících poznatků:

1. IL-10 stimuluje aktivitu lymfokiny aktivovaného ničení (LAK) a přírodních zabijáckých buněk (NK) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve. Cytolytická aktivita řízená IL-10 může být neutralizována krysími monoklonálními protilátkami proti IL-10.

2. IL-10 odvozené z expresních systémů CHO a E.coli vykazují podobné obrazce koncentrační odezvy ve stimulaci aktivit LAK a NK a jsou tudíž biologicky rovnocenné.

3. PBMC zpracovaný IL-10 a nízkými koncentracemi IL-2 vykazuje aktivity LAK větší než jsou pozorovány s každým cytokinem samotným.

4. PBMC předem ve dvou dnech zpracovávaný IL-10 vykazuje zvýšenou cytolytickou aktivitu po následné přísadě IL-2.

5. IL-10 působí opačně na schopnost IL-4 zabraňovat aktivitě LAK vyvolané IL-2.

6. IL-10 spolu s IL-2 vytvářejí zlepšenou cytolytickou aktivitu LAK při nízkém poměru efektorových buněk k cílovým buňkám.

Vedle účinků pozorovaných na PBMC se zjistilo, že endothe14 liální buňky, kultivované v přítomnosti IL-10, vykazují neporovnatelnou odezvu na exogenní faktory (to je na gama-IFN a na TNFa), zatímco endotheliální buňky, inkubované v přítomnosti IL-2, byly bez odezvy vzhledem k toxicitě IL-2.

Materiál a metody

Rekombinantní lidské cytokiny a protilátky Anti-IL-10

Standardními metodami se připraví rekombinantní IL-10 (odvozený jak z E.coli, tak z CHO). Po vyčištění standardními metodami jsou získané aktivity 4,1 χ 10⁷ (E.coli) a 2,1 χ 10⁷jednotek/mg(CHO)_r , zjištěné testem proliferace buněk MC-9 [Thompson-Snipes a kol., J.Exp.Med. 173:507 (1991)]. Přibližně 4 ng v podstatě homogenního IL-10 má přibližně 100 jednotek takto definované biologické aktivity.

Od doktora John Adamse z institutu DNAX molekulární biologie Palo Alto, CA, se získala krysí protilidská IL-10 monoklonální protilátka označená 19F1.

Izolace lidských periferních jednojaderných krevních buněk (PBMC)

Za použití heparinu nebo EDTA jako protisráž1 ivých látek se získá periferní krev od zdravých dospělých dárců. PBMC se separují dvouoperačním protokolem sestávajícím z dextranové sedimentace následované odstředěním na aparátu FICOL PAQUE^R při 1250 otáčkách za minutu. Mezifázové spoje, tvořené především lyrofocytyty a monocyty, se shromáždí a promyjí se nejméně dvakrát RPMI obsahujícím 10 % zárodečného telecího séra (complete medium) (JRH Biosc i ences ) .

Testy cytotoxicity

Ze sbírky tkání American Type Tissue Collection se získají cílové buňky Daudi (citlivé na LAK) a K5762 (Citlivé na NK) s objednacím číslem CCL 213 a CCL 243. Buňky Daudi a K 562 se označí izotopem ⁵¹Cr jak je popsáno v literatuře Spits a kol. [J. Immunol. 141:29 (1998)]. Po kultivační periodě se PBMC shromáždí, promyjí se dvakrát a použijí se jako efektorové buňky v testu uvolňování izotopu ⁵¹Cr (Spits a kol.). 5xl0³ buněk, značených izotopem ⁵¹Cr, se smísí s různým množstvím efektorových buněk (E/T = 20:1; 5:1 a 2:1) ve 100 μΐ 96 důlkových destiček se dnem tvaru V. Před 4-hodinovou inkubací při teplotě 37 'C v navlhčeném prostředí 5X oxidu uhličitého se destičky odstřeďují při 1000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Po 4 hodinách se destičky odstřelují 5 minut při 500 x g. Supernatanty se shromáždí přístrojem SKATR0N^R (Skatron Instruments) a v gama čítači (LKB-Pharamcia) se provede sečtení. Celková lyse se stanoví inkubováním izotopem ⁵¹Cr značených cílových buněk s IX SDS. Údaje jsou průměrem ze tří stanovení. Percentuelní lyse se vypočte následovně:

cpm uvolněných experimentálně - cpm spontánních X lyse = - x 100 cpm totální lyse - cpm spontánní

Inkubace lidských PBMC s cytokiny

a. Inkubace se samotným IL-10

PBMC, izolované popsaným způsobem, se udržují v koncentraci lxlO⁶ buněk/ml v RPMI-1640, obsahujícím 10 X zárodečného telecího séra doplněného IL-10 nebo lidským IL-10 (CHO) při teplotě 37 *C po dobu tří dnů, pokud není uvedeno jinak. Cytolytická aktivita se stanoví, jak popsáno shora.

b. Současná inkubace s IL-10 a IL-2

PBMC se inkubují 3 dny se 4 ng/ml IL-10 s lidským IL-2 (Genzyme) (2 nebo 20 J/ml) nebo bez něho při teplotě 37 *C.

c. Postupná inkubace s IL-10 a IL-2

PBMC se inkubují 2 dny se 4 ng/ml IL-10 v úplném prostředí.

Lidský IL-2 se přidává do konečné koncentrace 3 nebo 20 J/ml. Po inkubaci přes noc se stanoví cytolytické aktivity LAK a NK.

Účinek monoklonálnich protilátek anti-IL-10 na aktivaci IL-10 buněk LAK a NK.

PBMC se inkubují tři dny se 4 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 μg/ml monoklonálni protilátky anti-IL-10 (19F1) nebo isotypické kontrolní (krysí IgG2a).

Účinek IL-10 na cytolytickou aktivitu lymfokiny aktivovaných zabijáckých'. buněk a přírodních zabijáckých buněk v lidských jednojaderných buňkách periferní krve.

Cytolytická aktivita buněk LAK a NK může být operativně rozlišena na základě použitých cílových nádorových buněk. Tradičními cíli pro cytolytickou aktivitu aktivovaných buněk LAK jsou buňky Daudi, odvozené z lidského Burkittova lymphomu. Jako specifických cílů pro cytolytickou aktivitu aktivovaných buněk NK se použije buněk z buněčné linie K562, lidské erytroleukemické linie buněk. Při těchto pokusech se lidské PMBC zpracovávají tři dny při různých koncentracích IL-10. Cytolytická aktivita se stanoví shora popsaným standardním testem uvolňování ⁵¹Cr.

Výsledky založené na aktivitě LAK jsou v tabulce I, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

Tabulka I

Stimulace	lymfokiny aktivovaných	PBMC IL-10 (ng/ml)^b 4	(vyjádřená jako %
lyse³) Dárce	0	Koncentrace 0,04	IL-10 0j 4
40	100
1	0	4,25	18,3	44	26,2	67,5
2	0	5,5	7,2	10	31,5	27,6

3	18	17,7	29,2	39,1	29,7	55,1
4	0	8,8	10,2	22,2	35,8	35,9
5	4,6	8,1	15,6	20,6	20,1	12,1
6	14,6	19,7	40,7	54,4	42,9	43,4
Průměr	6,2	10,6	20,2^C	31 ,7^C	31,0^c	40,2^C
	±3,3	±2,6	±5,1	±6,8	±3,2	±8,0

^a Percentuální lyse cílů Daudi ⁵¹Cr ve standardním testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské PMBC, připravené od normálních dárců, se zpracovávají tři dny IL-10 před-stanovením cytolytické aktivity. ^c Významný rozdíl mezi IL-10 zpracovaným a střední kontrolou při p 1 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Údaje v tabulce I ukazují vliv IL-10 na aktivitu LAK v PBMC, získaných od šesti lidských dárců. Ačkoli je rozmanitost mezi dárci zřejmá, vyvolal IL-10 u všech dárců nárůst cytolitické aktivity v závislosti na koncentraci. Statisticky významná aktivita (p< 0,05) je pozorována při koncentracích IL-10 0,4 ng/ml nebo větší. Je také patrno, že PBMC dárce se základní úrovní cytolytické aktivity (to je v nepřítomnosti cytokinu) 5% nebo méně nejvíce vypovídají o IL-10 při všech zkoušených poměrech efektorových buněk k cílovým buňkám (údaje neuvedeny).

Podobných výsledků bylo dosaženo vůči jiným cílovým buňkám, včetně buněčné linie lidské rakoviny ledvin, dvou různých lidských melanomových liniím a lidských linií rakoviny tlustého střeva. Buněčné linie rakoviny ledvin a melanomů použil také Rosenberg a pacienti s takovými nádory byli léčeni Rosenbergem in vivo pomocí adoptivní imunoloterapie IL-2. Ve všech případech byla percentní lyse cílových buněk závislá na koncentraci IL-10.

Při dalších pokusech se zjistilo, že IL-10 samotný nebo v kombinaci s IL—2 vyvolává nárůst cytolytické aktivity vůči buň18 kám U937 (lidská histiocytoma), SW62O (lidská rakovina tlustého střeva) a SKBR3 (lidská rakovina prsu). V experimentech s použitím buněk HS294T (lidská melanoma) jako cílových se při zkoušených koncentacích neukázalo, že IL-10 vyvolává odezvu.

Základní cytolytická aktivita NK (to je lyse cílových buněk K562 v nepřítomnosti cytokinů) má sklon být vyšší než základní aktivita LAK. Aktivita NK může být dále zvýšena cytokiny, jako je IL-2 [Perussia uvedený shora, Phillips a Lanier, J. Exp. Med. 164:814 (1986)].

Účinek IL-10 na aktivitu NK byl vyhodnocen u PBMC těchže šesti shora uvedených dárců v pokusech probíhajících paralelně s testy LAK. Výsledky jsou obsaženy v tabulce II, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

Tabulka II

Stimulace aktivity NK (vyjádřená jako % lyse³) v PBMC působením IL-10)

Koncentrace IL-10 (ng/ml)^b

Dárce	0	0,04	0.4	4	40	100
1	22,2	30,6	25,2	57,2	51 , 5	49,7
2	20,4	24,7	31,3	56,7	65,6	71,5
3	61,4	55,6	37,9	81,1	80,8	81,5
4	13,8	25,2	23,2	37,5	52,2	54,2
5	13,0	19,9	20,2	25,1	23,5	20,3
6	15,9	25,3	45,4	66,6	43,7	56,1
Průměr	24,4	30,2	30,5	54,OC	52,75=	55,5^C
	± 7,5	±5,2	+ 3,9	±8,2	±7,8	±8,5
³ Percentuelní lyse cílů	Daud i ⁵¹Cr	ve standardním testu	uvolňo-

vání chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské PMBC, připravené od normálních dárců, se zpracovávají tři dny IL-10 před stanovením cytolytické aktivity.

^c Významný rozdíl mezi IL-10 zpracovaným a střední kontrolou při p <. 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Jak z tabulky II vyplývá, vyvolává IL-10 významné, na dávce závislé zlepšení cytotoxicity zprostředkované buňkami NK v PBMC dárců. Došlo ke statisticky významnému nárůstu lytické aktivity při koncentracích IL-10 4 ng/ml nebo větší. Podobně jako u aktivity LAK, měnil se u různých dárců účinek IL-10 na NK.

Porovnání účinků IL-2 s účinky IL-10 na endotheliální buňky

Provedly se ^pojcusy k vyhodnoceni životnosti monovrstvy endotheliálních buněk po vystavení účinkům IL-10. Endotheliální buňky, kultivované v přítomnosti IL-10, vykazují neporovnatelnou odezvu na exogenní cytokiny (gama-IFN a TNF-α), zatímco paralelní kultury, vystavené působení jednotkových ekvivalentních dávek IL-2 po stejně dlouhou inkubační dobu, ztatily schopnost odezvy, způsobené toxicitou IL-2.

Účinek monoklonálních protilátek anti-IL-10 na aktivaci buněk LAK a NK působením IL-10

Jak vyplývá z tabulek III a IV, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky s průměrnými hodnotami, stimulace cytolytické aktivity LAK a NK 40 ng/ml IL-10 je snížena trojásobně (pí. 0,05) v přítomnosti 2 μg/ml anti-IL-10 monoklonální protilátky 19F1. Výsledky vytvořené místo toho za použití 2 μδ/ιηΐ isotypických kontrolních protilátek krysího IgG2a, vedly k úrovni cytolytické aktivity statisticky neodlišitelné od výsledků získaných se 40 ng/ml IL-10 samotného.

Tabulka III

Inhibice lymfokiny aktivované cytolytické aktivity zabijáckých buněk, vyvolaná IL-10 (vyjádřená jako procento lyse³) působením monoklonálních protilátek anti-IL-10

Inkubační podmínky*³

Dárce	Medium		40 ng/ml IL-10	IL-10 + 19F1	IL-10 +1gG 2a
1	5,6		23,5	15,7	28,2
2	4,7		21,3	11,0	17,5
3	£.4		, 42,5	0,0	35,8
4	2,1		42,0	12,8	26,5
5	4,7		19,1	0,0	11,65
Průměr	4,5±O,	6	29,6+5,3	7,9 ^c±3,3	23,9±4,3
³ Percentuální vání chrómu při	lyse cílů Daudi ⁵¹Cr poměru efektorových	ve standardním k cílovým buňkám	testu uvolňo- 20:1. Údaje

jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve, izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny 40 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 mg/ml 19F1 (anti-lidský IL-10) nebo krysím IgG2a (isotypická kontrola) před stanovením cytolytické aktivity.

^c Významný rozdíl mezi zpracování IL-10 samotným a IL-10 v přítomnosti protilátek anti-IL-10 při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Tabulka IV

Neutralizace aktivity přírodních ničivých buněk vyvolaná IL-10 (vyjádřená v procentech lyse³) působením monoklonálních protilátek anti-IL-10

Inkubační podmínky¹⁵

Dárce	Medium	40 ng/ml IL-10	IL-10 + 19F1	IL-10 +IgG2a
1	21,1	38,3	20,6	27,2
2	28,0	71,0	22,2	53,2
3	22,2	- . 51,5	0,0	70,5
4	18,0	25,4	12,3	20,8
5	23,2	53,2	54,5	84,9
Průměr	22,5±1	,6 47,9±7,6	19,l^c±6,6	51,3±12,7
^a Percentuální	lyse cílů Daudi ⁵¹Cr	ve standardním	testu uvolňo-
vání chrómu při	poměru efektorových	k cílovým buňkám	20:1. Údaje

jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny 40 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 mg/ml 19F1 (anti-lidský IL-10) nebo krysím IgG2a (isotypická kontrola) před stanovením cytolytické aktivity.

^c Významný rozdíl mezi zpracování IL-10 samotným a IL-10 v přítomnosti protilátek anti-IL-10 při p £ 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Cytolytická aktivita vyvolaná kombinací IL-10 a jiných cytokinů

a. Současná inkubace IL-10 s IL-2

Lidské PMBC se inkubují s podmaximálními stimulačními kon22 centracemi IL—2 (2 nebo 20 U/ml) v přítomnosti IL-10 při poměru efektorových buněk k cílovým buňkám 5:1 s výsledky uvedenými v tabulce V, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

Tabulka V

Indukce cytolitické aktivity aktivované lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse³) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou inkubací IL-10 a IL-2

Inkubační podmínky¹³

Dárce	Medium	2U IL-2	4 ng IL-10	IL-10+IL-2	20U IL-2
1	0,0	3,3	3,7	15,9	24,6
2	2,6	7,6	3,8	23,5	41,0
3	6,1	5,0	1.3,3	17,7	11,4
4	3,3	50,1	51,6	68,7	80,0
5	2,4	9,4	12,8	29,3	45,7
6	9,9	28,9	16,0	38,8	67,1
Průměr	4,1	17,4	16,8	32,3	44,9^C
	±1,42	±7,6	±7,2	±7,2	±10,4
³ Percentuelní lyse	cílů Daudi ⁵¹Cr ve	standardním testu	uvolňo-

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve, izolované od normálních dárců, se zpracovávají tři dny před stanovením cytolytické aktivity 4 ng/ml IL-10 a 2 J/ml IL-2.

^c Nebyl zjištěn významný rozdíl mezi cytolitickou aktivitou v PBMC dárců zpracovaných IL-10 a IL-2 ve srovnání s 20 J/ml IL-2 samotného při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Jak z tabulky V vyplývá, došlo k dodatečnému nárůstu akti23 vity LAK (poměr efektorových buněk k cílovým buňkám 5:1) po společné inkubaci 2 J/ml IL-2 a 4 ng/ml 1L-10. Tato úroveň aktivity, která je významně větší než aktivita s cytokinem samotným, se blíží úrovni produkované 10-násobně vyšší koncentrací IL-2. Tento výsledek je statisticky významný při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

b. Současná inkubace IL-10 a a-IFN

PBMC inkubované společně s IL-10 a α-IFN vykazují podobný nárůst lytické aktivity oproti buňkám Daudi, nikoli však oproti cílovým buňkám NK. Je to patrno z tabulky VI, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

fi

Tabulka VI

Indukce aktivity zabijáckých buněk aktivovaných lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse³) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou inkubací IL-10 a a-IFN

Inkubační podmínky^b

Dárce	Medium	O-IFN	IL-10	IL-10+a-IFN
1	4,4	7,9	17,8	35,7
2	1,0	11,7	15,4	32,0
3	1,6	12,3	5,5	26,4
Průměr	2,3	10,6	12,6	31,4
	±1,0	±1,4	±3,8	±2,7

³ Percentuální lyse cílů Daudi ⁵¹Cr ve standardním testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny před stanovením cytolytické aktivity 4 ng/ml IL-10 a 100 J/ml a-IFN.

Pozorované rozdíly cytotoxické aktivity vyvolané v PBMC od dárců působením IL-10 a α-IFN v porovnání s aktivitami vyvolanými IL-10 a α-IFN samotnými jsou statisticky významné, při p < 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.

Na rozdíl od toho současné inkubace s IL-10 a IL-4, IL-5, GMCSF nebo gama-IFN nejsou tak účinné jako IL-10 samotného (údaje neuvedeny).

Následná inkubace s IL-10 a IL—2

Při použití popsaného způsobu se udržují PBMC v mediu samotném nebo v mediu doplněném IL-10. Po dvou dnech se přidá IL-2 na konečnou koncentraci 2 nebo 20 J/ml. Cytotoxická aktivita vůči buňkám Daudi se posuzuje po další inkubaci přes noc. Výsledky od pěti dárců jsou obsaženy v tabulce VII, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

Tabulka VII

Indukce cytolytické aktivity aktivovaná lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse³) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou předběžnou inkubací IL-10 následovanou IL-2

Pre-inkubační podmínky^b

Dárce	Medium	IL-10^c	IL-2^d	IL-10 IL
1	29,7	21,1	44,8	116,0
2	5,5	18,3	12,2	20,7
3	14,7	58,1	74,5	100,0
4	26,2	59,5	54,3	81,9
5	4,8	28,2	22,5	40,6

Průměr	16,2 ±5,1	37,0 ±9,0	41,7 ±11,4	71,8 ±17,9
a Percentuální	lyse cílových	buněk Daudi	⁵¹Cr ve standardním

testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve připravené od normálních dárců se udržují v mediu doplněném 4 ng/ml IL-10 po dobu dvou dnů před přísadou 2 U/ml IL-2. Cytolytická aktivita je zjištěna po dodatečné inkubaci přes noc.

^c PBMC od dárců byly inkubovány tři dny s IL-10 ^d PBMC od dárců byly inkubovány v mediu samotném před přidáním IL-2 , ^e PBMC od dárců byly inkubovány 2 dny s IL-10 před přidáním 20 J IL-2.

Jak z tabulky VII vyplývá, ve skupinách, kde byly PBMC dárců předem zpracovány IL-10 před přidáním IL-2, je zřejmá 2-násobně vyšší cytolytická aktivita (78,8 ± 17,9%) ve srovnání s úrovní patrnou u kultur udržovaných v kompletním mediu pouze před přidáním IL-2 (41,7% ± 11,4). Pozorované rozdíly mezi vzorky předběžně zpracovanými IL-10 a vzorky nezpracovanými IL-2 jsou statisticky významné při pl 0,14.

« Podobný obraz zlepšené cytolytické aktivity je patrný u postupných inkubací s IL-10 následovaných inkubací α-IFN (údaje nejsou uvedeny).

Blokáda cytotoxicity vyvolané IL-2 působením IL-10 a IL-4

V mediu obsahujícím 20 J/ml samotného IL-2, 20 J/ml IL-2 plus 1000 J/ml IL-4 nebo 20 J/ml IL plus 1000 J/ml 1L-4 plus 4 ng/ml IL-10 se kultivují PBMC od šesti lidských dárců. Výsledky obsahuje tabulka VIII, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.

Tabulka VIII

Antagonismus blokády IL-4 lymfokiny aktivované cytologické aktivity vyvolané IL-2 působením IL-10 (vyjádřená jako procento lyse³) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve.

Dárce	Medium	IL-2^b	IL-2^C+ IL-4	I L-2^d +1L-4+1L-10
1	12,7	27,6	35,0	45,7
2	*5,4	. _x 26,3	17,5	33,7
3	1,7	25,1	14,1	36,0
4	3,8	29,5	14,1	22,1
5	3,3	47,1	17,1	63,8
6	6,6	49,5	20,6	40,8
Průměr	5,5	34,2	19,7	40,3
	±1,6	±4,5	±3,2	±5,7
³ Percentuelní lyse cílových buněk Daudi ⁵¹Cr ve standardním testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.

^b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají po dobu tří dnů 20 J/ml IL-2. ^c PBMC od dárců byly inkubovány po dobu tří dnů s 20 J/ml IL-2 a 100 J/ml lidského IL-4 ^d PBMC od dárců byly inkubovány spolu s J/ml IL-2, 1000 J/ml lidského IL-4 a 4 ng/ml IL-10.

Z údajů tabulka VIII vyplývá, že je patrná přibližně 34,2% lyse cílových buněk citlivých na LAK po zpracování 20 J/ml samotného IL-2. Je-li začleněno 1000 J/ml lidského IL-4 na začátku in27 kubační periody, je cytolytická aktivita potlačena přibližně dvojnásobně. Toto potlačení způsobené IL-4 však nebylo pozorováno, bylo-li v průběhu prvních 24 hodin inkubace přidáno 4 ng/ml

IL-10.

Mezi výsledky vytvořenými IL-2 samotným a výsledky vytvořenými všemi třemi cytokiny dohromady není významný rozdíl (pl 0,05 zjištěným Studentovým t-testem), což znamená, že antagonismus blokády způsobené IL0-10 je v podstatě úplný.

Aniž dojde k odchýlení od ducha a rozsahu vynálezu, jsou možné různé modifikace a varianty vynálezu, jak je pracopvníkům v oboru zřejmé. Specifická provedení jsou zde nabízena pouze jako příklady a vynález je vymezen pouze následujícími patentovými nároky.

Průmyslová využitelnost

Použití interleukinu-10 (IL-10), formálně útlumového faktoru buněčné synthese pro výrobu farmaceutických prostředků k adoptivní imunoterapii při léčení novotvarových chorob (rakoviny) povzbuzováním cytolytické aktivity jednojaderných buněk periferní krve.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. lb Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny, v y ζηβά u j í c í se tím, že obsahuje PBMC aktivované IL-10 a farmaceuticky vhodný nosič.
2. Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny podle nároku 1,vyznačující se tim, že dále obsahuje IL-10 samotný nebo v kombinaci s IL-2 a/nebo oc-IFN.
3. Způsob výroby farmaceutického prostředku k léčení rakoviny, vyznačující se tím, že se směšují PBMC aktivované IL-10 s farmaceuticky přijatelným nosičem.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se tím, že se směšují IL-10 v kombinaci (a) s množstvím IL-2 postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK, avšak nezpůsobujícím toxické vedlejší účinky a/nebo (b) s množstvím ae-IFN postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK.
5. Použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4.