CZ20598A3

CZ20598A3 - Inhibice buněčného dýchání a produkce rostlin se samčí sterilitou

Info

Publication number: CZ20598A3
Application number: CZ98205A
Authority: CZ
Inventors: Andrew James Greenland; Simon William Jonathan Bright; Paul Richard Drayton; Philip John Bell
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1995-07-24
Filing date: 1996-07-11
Publication date: 1998-04-15
Also published as: CN1197481A; RU2168545C2; TR199801883T2; BR9609535A; NO980314L; AR002924A1; NZ312750A; PL324656A1; NO980314D0; GB9515161D0; TR199800112T1; HUP9802858A2; JPH11509417A; BG102274A; HUP9802858A3; TR199801884T2; AU6465296A; AU705759B2; EP0853674A1; WO1997004116A1

Description

Oblast techniky produkce rostlin se samčí

Předkládaný vynález se týká způsobu produkce rostlin se samčí sterilitou tak, že se využije gen, který se může v rostlině exprimovat a inhibuje základní buněčnou funkci, a tím poruší úplnou expresi vybraných znaků rostlin.

Dosavadní stav techniky

Naše mezinárodní patentová přihláška č. WO 90/08831 popisuje a nárokuje si inhibici dýchání užitím různých porušovacích genů (porušovačů) , které také nazýváme geny inaktivující pyl.

Schopnost takových inaktivujících genů působit tímto způsobem je velmi rozdílná, a proto je nutné nadále zlepšovat genové sekvence, aby bylo možné vybírat vhodné geny pro určité aplikace.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout geny, které se použijí pro brzdění genové exprese.

Podle předkládaného vynálezu je poskytnut způsob brzdění (inhibice) genové exprese v cílovém rostlinném pletivu zahrnující trvale transformovanou rostlinnou buňku takového druhu, že z ní může být regenerována celá rostlina, s rekombinantním genem (t.j.rekombinantní molekulou DNA) nesoucím tkáňově nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucím porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat buněčné dýchání v cílovém pletivu, což

vede k odumření buněk. Porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, genů kódujících a- nebo βtubulin, krátké ko-suprese ve směru čtení („sense) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), a krátké, ve směru čtení orientované („sense), molekuly genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT) z vnitřní mitochondriální membrány.

Utlumení („down-regulation) genové aktivity způsobené ko-supresí ve směru čtení („sense co-supression) je popsáno v naší mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/08299.

Geny a- nebo β-tubulinu působí jako porušovače tím, že destabilizují uspořádání mikrotubulů v rostlinných buňkách, čímž ruší základní funkci mikrotubulů v cílové tkáni, což vede k odumření buněk.

Užití krátké ko-suprese ve směru čtení dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), porušuje buněčné dělení a vede k růstovým defektům v cílovém orgánu nebo pletivu.

Promotor je nejlépe promotor specifický pro prašník a/nebo tapetum nebo promotor specifický pro pyl, takže exprese porušovacího proteinu v příslušném pletivu regenerované rostliny vede k rostlině se samčí sterilitou. Výhodněji je promotor specifický pro prašník a/nebo tapetum izolován užitím sekvencí cDNA, které jsou ukázány na obrázcích 1, 2, 3, a způsoby popsanými v naší mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/08826.

Plasmidové vektory obsahující sekvence DNA z obrázků

1,2,3 jsou deponovány podle Budapešťské konvence.

Plasmíd pMSIO v hostitelském kmeni Escherichia coli RR1 obsahující genovou sekvenci na obr. 1, byl deponován v národní kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40090.

Plasmíd pMS14 v hostitelském kmeni E. coli DH5a, obsahující genovou sekvenci na obr. 2, byl deponován v národní • · • ·

kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40099.

Plasmid pMS18 v hostitelském kmeni E. coli RR1, obsahující genovou sekvenci na obr. 3, byl deponován v národní kolekci průmyslových a mořských bakterií 9. ledna 1989 pod přístupovým číslem NCIB 40100.

Izolace a charakterizace těchto genových sekvencí je plně popsána ve WO 93/01294.

Je možné použít také jiné promotory, například promotor MFS14 specifický pro tapetum.

Předkládaný vynález také poskytuje rostlinu, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí geny obsahující tkáňově specifický nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat základní buněčnou funkci jako je například dýchání, uspořádání mikrotubulů nebo buněčné dělení v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk.

Vynález také poskytuje rostlinu, zejména jednodšložnou rostlinu, konkrétně kukuřici, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí geny obsahující tkáňově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen inhibovat základní buněčnou funkci jako je dýcháni, uspořádání mikrotubulů v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu Turfl3, krátké, ve směru čtení orientované, molekuly genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT), genů kódujících a- nebo β-tubulin a krátké ko-suprese ve směru čteni dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a ROA.

Tyto rekombinantní geny být použity jako prostředek inhibice buněčného růstu v řadě organismů, od jednoduchých jednobuněčných ke složitým mnohobuněčným organismům, jako jsou rostliny a zvířata. Použitím tkáňově nebo buněčně specifických promotorů mohou být ve složitých organismech zaměřeny a zničeny konkrétní buňky nebo tkáně. Jedno konkrétní použití zamýšlené pro tento vynález je zničení buněk nezbytných pro vývoj samčího květu, což vede k samčí sterilitě.

Vynález tedy poskytuje způsob prevence nebo inhibice růstu a vývoje rostlinných buněk založený na rekombinantních genech, které inhibují základní buněčnou funkci jako je dýchání nebo uspořádání mikrotubulů. Technika má široké použití u velkého množství zemědělských plodin, kde se vyžaduje inhibice konkrétních buněk nebo tkáně.

Obzvláštnímu zájmu se těší inhibice samčí plodnosti u kukuřice pro produkci hybridů Fl in šitu. Koncept inhibice mitochondriální funkce jako mechanismu pro samčí sterilitu pochází z určitého předběžného výzkumu cytoplasmatické samčí sterility typu T u kukuřice (cms-T), který prokázal spojení mezi samčím sterilním fenotypem a mitochondriální dysfunkcí. Ačkoliv musí být ještě určen přímý kauzální vztah mezi mitochondriální dysfunkcí a cms-T, narůstající důkazy potvrzují, že jsou nezbytné plně funkční mitochondrie, zejména v tapetálních buňkách prašníků. Toto je kritické zejména během mikrosporogeneze, protože metabolické požadavky kladené na tapetální buňky mají za následek 40-násobné zvýšení počtu mitochondrií.

Vynález poskytuje tedy řadu negativních mutací, které působí v mitochondriích tak, že inhibují dýchání. Jsou-li exprimovány specificky v prašníkovém pletivu kukuřice, mají tyto mutace za následek samčí sterilní fenotyp.

K porušení buněčné funkce se používá také expresi genů anebo β-tubulinu. Během normálního buněčného života je exprese tubulinových genů regulována jejich endogenními promotory a úzce souvisí s požadavky buněk na tyto proteiny, které jsou polymerizovány a složeny do mikrotubulů během růstu a vývoje ···· 0 0 0 0 rostliny. Expresí tubulinových genů neregulovaným způsobem za použití netubulinových promotorů v konkrétním pletivu nebo stádiu vývoje je porušena rovnováha mezi volnými tubulinovými monomery a molekulami, které jsou polymerizovány v mikrotubulech, což má za následek nestabilitu komplexu mikrotubulů a buněčnou dysfunkci. Tento účinek při expresi v buňkách tapeta nebo jiných buňkách prašníku způsobí, že jsou rostliny sterilní.

Navrhuje se také použití krátké ko-suprese ve směru čtení dvou základních genů buněčného cyklu, např. cdc25 a ROA, k utlumení funkce. Tento účinek při expresi v tapetu nebo jiných buňkách prašníku způsobí, že jsou rostliny sterilní.

Způsob použitý pro transformaci rostlinných buněk není pro tento vynález obzvláště podstatný a může být použita jakákoliv metoda vhodná pro cílovou rostlinu. Transgenní rostliny se získají regenerací z transformovaných buněk. Z literatury jsou známy četné transformační postupy, jako je např. infekce za použití Agrobacterium tumefaciens nebo jeho plasmidu Ti, elektroporace, mikroinjekce rostlinných buněk a protoplastů, mikroprojektilová transformace a transformace pylové láčky. Pro plné detaily známých metod se odkazuje na literaturu.

Nyní bude popsán vývoj a testování těchto rekombinantních genů jako porušovačů mitochondriální funkce v jednobuněčném organismu, kvasince. Bude také popsán mechanismus, kterým jsou tyto rekombinantních geny použity pro inhibici růstu a diferenciace buňky v transformované rostlině postupů je použít kvasinku jako identifikaci a optimalizaci rekombinantních genů proteinů, které porušují mitochondriální funkci, rostlinné buňky transformovány vybranými rekombinantními geny a budou z nich regenerovány celé rostliny.

Cílem těchto modelový systém pro pro expresi Poté budou • ·

Popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje	sekvenci	cDNA	specifickou	pro	prašník,
nesenou plasmidem pMSIO Obrázek 2 ukazuje	sekvenci	cDNA	specifickou	pro	tapetum,
nesenou plasmidem pMS14 Obrázek 3 ukazuje	sekvenci	cDNA	specifickou	pro	prašník,

nesenou plasmidem pMS18.

Obrázek 4 ukazuje sekvenci genu T-urfl3 (sekvence s identifikačním číslem 1) s primery Turf-1 (sekvence s identifikačním číslem 2) a Turf-2R (sekvence s identifikačním číslem 3), které jsou podtrženy.

Obrázek 5 ukazuje DNA kódující oblast 59 aminokyselin z genu ATP-2 z Nicotinia plumbaginifolia (sekvence s identifikačním číslem 4 a 5) s primery PREB-IB (sekvence s identifikačním číslem 6) a PREB-R (sekvence s identifikačním číslem 7.

Obrázek 6 ukazuje štěpné místo sekvence pre-β.

Obrázek 7 je mapa vektoru pCaMVI-,Ν.

Obrázek 8 je mapa vektoru RMS17.

Obrázek 9 je mapa vektoru pIE109.

Obrázek 10 ukazuje promotorovou sekvenci MFS14 (sekvence s identifikačním číslem 8) s následujícími rysy:

pozice 2198 začátek transkripce CCTACAA (souhlasný CTCATCA) pozice 2167 ATCCATT (možný motiv sekvence TATA) pozice 2141 CCAT (možný motiv sekvence CAAT) pozice 2233 začátek cDNA CACACAG pozice 2295 začátek translace GCAACAATGGCG (souhlasný TAAACAATGGCT).

Obrázek 11 je mapa vektoru RMS11.

Obrázek 12 je mapa vektoru pMANT3.

Obrázek 13 ukazuje konstrukci vektorů pro transformaci kukuřičné buněčné linie.

• · • ·

Obrázek 14 je graf ukazující počty transformovaných rostlin v různých pokusech.

Vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Sestrojení vektoru RMS17 pro transformaci kukuřice

Pro amplifikaci genu T-urfl3 z kukuřice cms-T (linie

RW33:TMS) a mitochondriální cílové sekvence pre-β z Nicotiana plumbaginifolia se použila metoda polymerázové řetězové reakce - PCR. Vzorky DNA z rostlinného materiálu byly připraveny za použití metody popsané Edwardsem a kol. (Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1349) .

Kompletní gen T-urfl3 byl amplifikován metodou PCR pomocí primerů turf-1 (5'ATCGGATCCATGATCACTACTTTCTTAAACCTTCCT-3', identifikačním číslem 2) (5'TAGTCTAGATCACGGTACTTGTACGCTATCGGT - 3', identifikačním číslem 3), které byly sekvence s a turf-2R sekvence s navrženy podle publikované sekvence (Dewey a kol., 1986, Cell, 44, 429-449). Podmínky PCR byly následující: 3 5 cyklů denaturace v 94°C po 0,8 min, nasednutí primerů v 65°C po 1 min a prodlužování řetězce v 72 °C po 2,5 min. Aby se napomohlo následnému klonování, byly primery pro PCR navrženy tak, že zavedly jedinečná restrikční místa BamHI a Xbal na 5' a 3' konce genu, v uvedeném pořadí. Pozice těchto primerů odpovídající sekvenci genu T-urfl3 je ukázána na obrázku 4.

Podobně byla amplifikována metodou PCR oblast 59 aminokyselin z genu ATP2 z Nicotiana plumbagini folia, která kóduje funkční mitochondriální cílovou sekvenci pre-β, pomocí primerů PREB-IB (5'ATCGGTACCGCCATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCGCCT-3', • · • · · • · ·· · sekvence s identifikačním číslem 6) a PREB-R (5'ATCGGATCCCGCTGCGGAGGTAGCGTA-3', sekvence s identifikačním číslem 7) , které byly navrženy podle publikované sekvence (Boutry a kol., 1987, Nátuře, 328, 341). Podmínky pro PCR byly stejné jak je uvedeno výše, kromě teploty pro nasednutí primerů, která byla snížena na 60 °C. Aby se napomohlo následnému klonování, byly PREB-IB a PREB-2R navrženy tak, že zavedly jedinečná restrikční místa Kpnl a BamHI na 5' a 3' konce amplifikovaného fragmentu, v uvedeném pořadí. Pozice těchto primerů odpovídající genu ATP2 je ukázána na obrázku 5.

Po amplifikaci v PCR byl fragment pre-B štěpen Kpnl a

BamHI, aby vznikly kohezivní konce, a byl klonován do odpovídajících míst vektoru pUC18 za vzniku plasmidu pPBl. PCR produkt TURF13 byl štěpen BamHI a Xbal a klonován na odpovídající místa v pPBl za vzniku plasmidu pPB2. V pPB2 je sekvence pre-β fúzována s genem T-urfl3 při dodržení čtecího rámce tak, že po expresi v rostlinné buňce je celý produkt transportován do mitochondrií. Štěpení sekvence pre-β v předpovězeném místě mezi zbytky 55 a 56 uvolní protein Turfl3, který na svém NH₂ konci obsahuje další 4 zbytky ze sekvence pre-β (obrázek 6).

Genová fúze pre^/T-urf13 v pBB2 je odstraněna štěpením enzymy Kpnl a Balí, opatřena tupými konci a klonována do plasmidu pCAMVI_xN (obrázek 7) , který byl naštěpen BamHI a opatřen tupými konci za vzniku pPB3. Tento klonovací krok umístí fúzovaný gen pre^/T-urf13 pod transkripční kontrolu promotoru CAMV 35S. V tomto rekombinantním genu je přítomen intron Adhl, aby zvýšil úroveň exprese v kukuřičných buňkách (Mascarenhas et al., 1990, Plant Mol. Biol., 15, 913-920) a sekvence nos 3' poskytuje místo pro přidání polyA. Aby vznikl konečný vektor RMS17 (obrázek 8), byla zavedena selekční kazeta PAT z pIE109 (obrázek 9) jako fragment EcdRI do jedinečného místa BcoRI v pPB3, což umožňuje in vitro selekci transformovaných kukuřičných buněk na médiu s bialaphosem.

• · • ·

Příklad 2

Transformace buněk BMS kukuřice plasmidem RMS17

Cílem tohoto pokusu bylo ukázat, že exprese rekombinantního genu prep/T-urfl3 v kukuřičných buňkách BMS pěstovaných v tkáňové kultuře vede ke snížení životaschopnosti buněk, jak bylo měřeno stanovením transgenních kalusů po transformaci. Vektor RMS17 (obrázek 8) byl do kukuřičných buněk BMS pěstovaných v tkáňové kultuře zaveden pomocí transformační techniky užívající mikrovláken karbidu křemíku. Příprava mikrovláken karbidu křemíku

Se suchými mikrovlákny se vždy zacházelo v digestoři, aby se předešlo vdechnutí a možnému poškození plic. Tato vlákna mohou být karcinogenní, protože mají podobné vlastnosti jako azbest. Vlákna Silar SC-9 byla poskytnuta Advanced Composite Materiál Corporation Greer, South Carolina, USA. Sterilní suspenze vláken byla připravena následujícím postupem. Přibližně 50 mg vláken bylo vloženo do předem zvážené 1,5 ml zkumavky Eppendorf, která byla uzavřena a zvážena znovu, aby se určila hmotnost vláken. Víčko zkumavky bylo proděravěno injekční jehlou a přikryto dvojitou vrstvou hliníkové folie. Zkumavka byla sterilizována v autoklávu (121°C, 15 psi, 20 minut) a usušena. Pro každý pokus se připravily čerstvé suspenze vláken, protože bylo publikováno, že úroveň transformace DNA byla vyšší při použití čerstvých roztoků než při použití roztoků starších. 5 % (hmotnost/objem) suspenze vláken byla připravena ve sterilní deionizované vodě. Seuspenze se několik sekund třepala na mikrotřepačce, aby se vlákna resuspendovala těsně před použitím.

Přenos (transformace) DNA do buněk

Všechny postupy se prováděly v digestoři s laminárním prouděním vzduchu za aseptických podmínek. DNA byla do buněk transformována následujícím postupem. Specifické modifikace této metody jsou v textu vyznačeny.

···· 0 · 00 · Β • · « 0 · · « ·· » 4 • 0 ···*

0 <

0 00

Buňky a suspenze mikrovláken byly pipetovány za použití pipetových špiček Gilson s odříznutým koncem. Do sterilní zkumavky Eppendorf se odměřilo 100 μΐ čerstvého média BMS (viz příloha 1) . K němu se přidalo 40 μΐ 5 % (hmotnost/objem) suspenze vláken a 25 μΐ (1 mg/ml) plasmidové DNA, vše bylo protřepáno na stolní mikrotřepačce (Vortex Genie 2 Scientific Industries, lne) nejvyšší rychlostí po dobu 60 s. Okamžitě po protřepání bylo přidáno 500 μΐ buněčné suspenze, tj . 250 μΐ buněk (po stočení). Zkumavka Eppendorf byla poté uzavřena víčkem a protřepána nejvyšší rychlostí po dobu 60 s ve vzpřímené pozici. Pro transformaci dalších buněčných linií byl použit stejný postup.

V tomto pokuse byly zahrnuty tři kontroly. Dva pozitivní kontrolní vektory, z nichž pPG3 obsahoval samotnou selekční kazetu PAT, a RMS15, který je totožný s RMS17 kromě toho, že gen T-urfl3 je nahrazen genem mitochondriálního rozpojovacího proteinu, UCP, který nemá žádný účinek na buňky BMS pěstované v tkáňové kultuře. V obou rekombinantních genech je přítomná cílová sekvence pre-β. Negativní kontrolu, která by měla kompletně zabránit založení transgenních kalusů, poskytl RMS13, který je totožný s RMS17 kromě toho, že fúzovaný gen preP/T-urfl3 je nahrazena genem cytotoxické ribonukleázy, barnázy.

Průměrný počet transgenních kalusů založených v tomto pokuse je ukázán v tabulce 1.

TABULKA 1

		Počet transgenních kalusů v pokusu
Vektor	Průměr	1	2	3
pPG3	-	44	33	39
RMS13	0	0	0	0
RMS15	40	30	43	38
RMS17	12	13	23	16

·· ΒΒ

Β Β Β Β

Β Β·Β • ΒΒΒΒ Β

Tato data ukazují, že vzhledem ke dvěma pozitivním kontrolám, pPG3 a RMS15, vede exprese fúzovaného genu prep/Turfl3 k významnému snížení (p < 5 % nebo lépe) v zakládání transgenních kalusů. Toto naznačuje, že protein T-urfl3 zacílený na mitochondrie, má na buňky škodlivý účinek, pravděpodobně díky zhoršení mitochondriální funkce. Exprese cytotoxické ribonukleázy, barnázy, kompletně ruší založení transformovaných kalusů.

Příklad 3

Sestrojení vektoru RMS11 pro transformaci kukuřice

RMS11 je transformační vektor, ve kterém je exprese fúzovaného genu pre-P/T-urf13 řízena promotorem z kukuřičného tapeta MFS14. Sekvence promotoru MFS14 a nepřekládané zaváděcí oblasti od pozice -2198 do +97 je ukázána na obrázku 10. Tímto způsobem je exprese proteinu T-urfl3 omezena na buňky tvořící pyl a není v celé rostlině.

Aby se sestrojil RMS11, byl fragment Kpnl-Sall z pPB2 obsahující fúzovaný gen pre-p/T-urf13 opatřen tupými konci a vložen do tupě zakončeného místa BamHI plasmidu pSC9 za vzniku pPB4 . V pPB4 je fúzovaný gen pre-P/T-urf13 nyní umístěn mezi pozicemi -152 až +97 promotorového fragmentu a 3' polyadenylační sekvencí nos. Tato kompletní kazeta byla z pPB4 odstraněna štěpením Sad a FcoRI a klonována do odpovídajících míst pSC7 za vzniku plasmidu pB5. pSC7 obsahuje oblast pozic -153 až -5800 promotoru MFS14, takže vložení fragmentu SacI-EcoRI z pPB4 obnoví plný promotor MFS14 o délce

5,8 kb.

RMS11 (obrázek 11) byl dokončen vložením in vitro selekční kazety PAT z plE109 do jedinečného místa EcoRI plasmidu pPB5.

• ·

Příklad 4

Transformace buněk kukuřice vektorem RMS11 metodou bombardování mikročásticemi, která vede ke vzniku trvale transformovaných rostlin se samčí sterilitou

K transformování regenerovatelné buněčné kultury kukuřice metodou bombardování mikročásticemi byl použit vektor RMS11. Rostlinný materiál

Embryogenní drobivý kalus typu II byl indukován z nezralých zygotických embryí vyjmutých z rostlin A188, buď pěstovaných ve skleníku nebo na poli, a to 10 až 12 dní po opylení pylem z inbrední linie B73. Médium použité pro indukci a udržování kalusu bylo založeno na médiu typu N6 podle Armstronga a Greena. Médium obsahovalo 6 mM L-prolin, 2 % (hmotnost/objem) sacharózu, 2 mg/1 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinu (2,4-D) a 3 % (hmotnost/objem) Gelrit (Obchodní značka, Caroline Biological Supply), a mělo hodnotu pH 6,0. Kalus byl pěstován 4 týdny před tím, než byla indukována suspenzní kultura. Suspenzní kultura byla indukována v tekutém médiu typu MS obsahujícím 100 mg/1 myoinositolu, 2 mg/1 2,4-D, 2 mg/1 1-naftalenoctové kyseliny (NAA), 6 mM L-prolin, 200 ml/1 hydrolyzátu kaseinu (Difco Laboratories), 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 5 % (objemových) kokosového mléka (Difco Laboratories), a mělo hodnotu pH 6,0. Buněčné suspenze byly udržovány v médiu ve 125 ml Erlemeyerových baňkách při teplotě 28 °C ve tmě na třepačce s rychlostí 125 rpm. Suspenze byly každého 3,5 dne pasážovány tak, že bylo odebráno 3 ml (po stočení) buněk a 10 ml starého média a přeneseno do 20 ml čerstvého kultivačního média. Suspenzní kultury byly v době, kdy byly použity pro bombardování, staré 6 měsíců až 1 rok. V některých transformacích byly použity suspenzní kultury předtím uchowávané kryoprezervací a obnovené.

Bombardování mikročásticemi • ·

Buněčné suspenze byly přefiltrovány přes 1,0 mm a pak 0,5 mm sítko. Buňky o celkovém objemu 0,2 ml (po stočení), které prošly sítkem, byly resuspendovány v 5 ml média a rovnoměrně naneseny na disk filtračního papíru Whatman 4 pomocí vakuové filtrace v mikroanalytickém Precipitace plasmidové DNA wolframové mikročástice, a držáku o průměru v nadšroubovicové poté bombardování

4,7 cm. formě na použitím přístroje PDS-100 Biolistics (Obchodní značka, DuPont) byly provedeny v podstatě tak, jak popisuje výrobce. Cílové destičky byly bombardovány jednou.

Selekce transformovaných buněk a regenerace rostlin

Každý disk filtračního papíru s buňkami byl po bombardování přenesen na médium typu N6 obsahující 100 mg/1 myoinositolu, 2 mg/1 2,4-D, 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 0,3 % (hmotnost/objem) Gelrit, a mělo pH 6,0. Pro selekci byl využit gen NPTII, a proto bylo médium doplněno kanamycin sulfátem v koncentraci 200 mg/1. Disky byly přeneseny na čerstvé médium se selekčním činidlem po 7 dnech, a pak opět po 14 dnech. Suspense pak byla rozdělena na 2 stejné části a každá byla přenesena na Petriho misku 100x20 mm s 20 ml pevného média obsahujícího selekční činidlo a 3 % Gelrit (hmotnost/objem). Po 2 až 5 týdnech byly rychle rostoucí, a tedy pravděpodobně transformované, kalusy přemístěny na čerstvé selektivní médium. Rostliny byly z kalusu regenerovány tím, že se kalusy přesadily na médium typu MS obsahující 1 g/1 myoinositolu, 1 mg/1 NAA, 6 % (hmotnost/objem) sacharózu a 3 % (hmotnost/objem) Gelrit, mělo pH 6,0. Po dalších 2 až 3 týdnech byly kalusy přesazeny na MS médium obsahující 0,25 mg/1 NAA a 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a přemístěny na světlo, kde se začalo objevovat klíčení embryí. Poté byly rostlinky pěstovány na médiu typu MS poloviční koncentrace obsahujícím 500 mg/1 myoinositolu, 3 % (hmotnost/objem) sacharózu a 0,3 % Gelrit a mělo pH 6,0 a to po dobu 1 až 2 týdnů před tím, než byly přesazeny do skleníku.

• · • ·

Po přesazení do skleníku byla každá rostlina z nezávisle transformovaného klonu testována na přítomnost rekombinantního genu MFS14/pre-B/T-urf13 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) . DNA byly izolována z malých kousků listového pletiva metodou dle Edwardse et al. , (1991, Nucleic Acid Research 19, 1349) . Tato DNA pak byla užita v PCR s oligonukleotidovými primery 14-SA (5'-AGACGCTGAGCTCAAGGACGTGA-3', sekvence s identifikačním číslem 9) a turf-2R (viz příklad 1).

V době kvetu byly rostliny z každého nezávisle transformovaného klonu vizuálně hodnoceny ve skleníku podle stupnice vyvinuté pro hodnocení linií se samčí sterilitou (viz tabulka 2) . Rostliny hodnocené stupněm 4 a níže jsou funkčně sterilní. Hodnocení nezávislých klonů pozitivních v PCR jako kumulativní skóre je ukázáno v tabulce 3 a porovnáno s linií kukuřice, která vznikla transformací bombardováním plasmidem RMS11, ale byla v PCR negativní.

Sterilní rostliny byly zpětně kříženy pylem z fertilních netransgenních rostlin BE70. Semena vzniklá jedním takovým křížením (klon YK23, rostliny 5xBE70) byla vyseta ve skleníku a rostliny ponechány do květu. Přítomnost rekombinantní molekuly MFS14/pre-B/T-urf13 byla vyhodnocena pomocí PCR a testem PAT (který hodnotí přítomnost selektovatelného markéru použitého při transformaci). Hodnocení fertility těcto rostlin ukazuje tabulka 4. Nežádoucí, v PCR negativní rostliny, byly ze skleníku odstraněny ještě před kvetením. Rostliny 1 a 2 měly nejednoznačný výsledek PCR testu a byly ponechány ve skleníku až do kvetení. Rostlina 12 byla udržována jako kontrola. Jak je vidět v tabulce 4, 6 rostlin z potomstva bylo sterilních, a tato sterilita korelovala s přítomností vneseného transgenu, jak bylo potvrzeno testem PCR a PAT. To je v souladu s přítomností jediného transgenního lokusu zodpovědného za sterilitu.

TABULKA 2

Klasifikace prašníků (podle L.M. Josephsona)

Třída 0	Žádné prašníky nejsou vyvinuty
Třída 1	Je vyvinuta méně než polovina prašníků a všechny jsou malé, suché a tvrdé, nepráší pyl
Třída 2	Většina prašníků je vyvinuta, ale všechny jsou malé, suché a tvrdé, nepráší pyl
Třída 3	Jsou vyvinuty částečně fertilní prašníky, práší trochu pylu, poměr vyvinutých prašníků je vysoce variabilní
Třída 4	Lehce abnormální prašníky, vyvinuty přibližně na 75 až 100 procent
Třída 5	Normální prašníky a plně fertilní

Rostliny kukuřice spadající do třídy 4 a 5 byly považovány za fertilní.

TABULKA 3

Klon	počet rostlin	stav fertility	P.C.R
WK23	2	0	+
	3	3	+
WK23	2	0	+
YK23	3	0	+
	1	4	+
YE23	4	5	-

TABULKA 4

ROSTLINA	TEST PCR	TEST PAT	STAV FERTILITY
YK23/5/1	+ /-	-	0
YK23/5/2	+ /-	+	0
YK23/5/3	-	ODSTRANĚNO
YK23/5/4	-	ODSTRANĚNO
YK23/5/5		ŽÁDNÉ KLÍČENÍ
YK23/5/6	+	+	1
YK23/5/7	+	+	0
YK23/5/8	-	ODSTRANĚNO
YK23/5/9	+	+	0
YK23/5/10	-	ODSTRANĚNO
YK23/5/11	+	+	0
YK23/5/12	-	-	5

Přiklad 5

Konstrukce vektoru pRMS-23 pro transformaci kukuřice

Zkoušelo se, zda exprese, souhlasně se směrem čtení, krátké rekombinantní molekuly DNA odvozené z genu pro adenin nukleotid translokátor (ANT) kukuřice vede k poruše růstu buněk kukuřice. Fragment z kukuřičného genu ANT byl izolován metodou PCR a oligonukleotidových primerů navržených podle sekvence kukuřičného genu, který publikoval Bathgate et al. (1989, Eur. J. Biochem., 83, 303-310).

Fragment genu ANT byl amplifikován pomocí primerů MANT-1 (5'-ATGCCCGGGCTTGCAATGTCTGTTAGCGGTGGCATCA-3', sekvence s identifikačním číslem 10) a MANT-2RB (5'ATGCCCGGGCGATGGGGTAAGATGCAAGACCA-3', sekvence s identifikačním číslem 11). Podmínky pro PCR byly: 35 cyklů složených z denaturace při 94 °C po 0,8 min, nasednutí primerů při 65 °C po 1 min a prodlužování řetězce při 72 °C po 2,5 min. Kvůli usnadnění klonování byly primery pro PCR navrženy tak, že vnesly jedinečné restrikční místo Smál na 5' i 3' konec klonovaného genu. Sekvence kukuřičného genu ANT byla publikována v Eur. J. Biochem. (1989) 183, 303-310. Sekvence primeru MANT-1 odpovídá sekvenci ze začátku kódující sekvence genu a sekvence MANT-2R leží blízko konce genu.

Po proběhnutí PCR, ve které vznikl fragment DNA očekávané velikosti 1050 bp, byla DNA naštěpena Smál a fragment byl subklonován do místa Smál plasmidu pUC18, čímž vznikl plasmid pojmenovaný pMANTl. Následovalo zavedení fragmentu SacI-EcoRI polyadenylační signální sekvence ze 3' konce genu nos do 3' konce klonovaného genu ANT, a tak vznikl plasmid pMANT2. Dále byl vložen fragment HindiII-BamHI nesoucí 35s promotor CaMV a intron ADH1 z pCaMVIJSI (obr. 5) do příslušných míst pMANT2, a tím vznikl pMANT3. Konstrukce pRMS-23 (obr.12) byla ukončena vložením genové kazety PAT z plasmidu pIE109 (obr.7), umožňující in vitro selekci, do jedinečného místa EcoRI plasmidu pMANT3.

Příklad 6

Transformování buněk BMS z kukuřice plasmidem pRMS-23

Cílem tohoto pokusu bylo ukázat, že exprese plasmidu pRMS-23 v kultivovaných buňkách BMS kukuřice snižuje životaschopnost buněk, měřenou jako schopnost zakládat transgenní kalusy jako důsledek transformace. Vektorové DNA byly vneseny do buněk BMS v buněčné kultuře technikou, která pro transformaci využívá vláken karbidu křemíku, jak je popsáno v příkladu 2.

Po transformaci plasmidem pRMS-23 byl stanoven průměrný počet transgenních kalusů relativně vzhledem k pozitivní kontrole transformované pPG3, která obsahovala samotnou in vitro selekční genovou kazetu (tab. 5). Data v tabulce • · ukazují, že exprese krátkého úseku genu translokátoru adenin nukleotidu významně snižuje vznik transgenních kalusů.

TABULKA 5

	Počet transgenních kalusů v pokusu
	1	2	3	Průměr
Pokus 1
pPG3	16	20	22	19
pRMS-23	3	4	3	3
Pokus 2
pPG3	49	48	40	46
pRMS-23	10	15	23	16

Příklad 7

Konstrukce vektorů pTBR a pTBS pro transformování kukuřice

Zkoušelo se, zda neregulovaná exprese genu a-tubulinu povede k poruchám růstu buněk kukuřice. Byly připraveny dva rekombinantní geny, obsahující cDNA kódující α-tubulin ze dvou biotypů Eleusine indica. Plasmid pTBR (obr.13) obsahuje cDNA pro α-tubulin z biotypu Eleusine indica rezistentního k dinitroanilinu, který byl klonován jako Hinfl fragment s tupými konci do pCaMVI_xN s tupými konci štěpeného BamHI (obr.7). pTBS (obr. 13) obsahuje cDNA pro α-tubulin z citlivého biotypu, který byl klonován stejně jako v případě popsaném pro pTBR.

Příklad 8

Transformace buněk BMS kukuřice vektory pTBR a pTBS

Cílem pokusu bylo ukázat, že exprese pTBR a pTBS v kultivovaných buňkách BMS kukuřice vede ke snížení životaschopnosti buněk vyjádřené jako schopnost zakládat po • » transformaci transgenní kalusy. Vektorové DNA byly vneseny do buněk BMS v buněčné kultuře technikou, která pro transformaci využívá vláken karbidu křemíku, jak je popsáno v příkladu 2.

Po transformaci vektory pTBR a pTBS byl stanoven průměrný počet transgenních kalusů relativně vzhledem k pozitivní kontrole transformované pPG3, která obsahovala samotnou in vitro selekční genovou kazetu (obr. 14). Data v tabulce ukazují, že neregulovaná exprese genu pro α-tubulin z obou biotypů Eleusine indica významně snižuje vznik transgenních kalusů.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález se týká způsobu produkce rostlin se samčí sterilitou tak, že se využije gen, který se může v rostlině exprimovat a inhibuje základní buněčnou funkci, a tím poruší úplnou expresi vybraných znaků rostlin. Vynález poskytuje způsob inhibice růstu a vývoje rostlinných buněk založený na rekombinantních genech, jejichž exprese vede k inhibici základní buněčné funkce jako je dýchání nebo uspořádání mikrotubulů. Konkrétní použití zamýšlené pro tento vynález je zničení buněk nezbytných pro vývoj samčího květu, což vede k samčí sterilitě. Technika má široké použití u velkého množství zemědělských plodin, kde se vyžaduje inhibice konkrétních buněk nebo pletiva.

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 357 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: T-urfl3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

ATCGGATCCA	TGATCACTAC	TTTCTTAAAC	CTTCCTCCCT	TTGATCAAGG	TTTGGTATTT	60
TTCGGTTCTA	TTTTTATTTT	TTTTTTGTGC	ATATTATTGA	TAAAGGGATA	TCTCCGTAAA	120
ATGGATGATT	CCTATTTGGC	TCAACTCTCC	GAGTTAGCCA	ACCACAATAG	AGTGGAAGCG	180
GCAAAAGCGG	GCCACGTGGC	CCTGCATGAG	CTATCCTTCT	CGTGGTTGAG	GGGGGTTCAA	240
ATTAGGGTGA	GGACCTTACC	TATACAACGG	AATGAAGGAG	GGGGTCGAAG	CAACGACCAA	300
TCCACTCTCT	CTAAGCCTAA	GTATTCCTCA	ATGACCGATA	GCGTACAAGT	ACCGTGA	357

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Turf-1 primer • · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

ATCGGATCCA TGATCACTAC TTTCTTAAAC CTTCCT 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Turf-2R primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

TAGTCTAGAT CACGGTACTT GTACGCTATC GGT 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 269 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: gen ATP-2 z Nicotinia plumbaginifolia (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (3) POZICE: 1...267 (D) DALŠÍ INFORMACE: /startovací kodon = 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

ATG Met 1

GCT Ala

TCT Ser

CGG Arg

AGG Arg 5

CTT Leu

CTC Leu

GCC Ala

TCT Ser

CTC Leu 10

CTC Leu

CGT Arg

CAA Gin

TCG Ser

GCT Ala 15

CAA Gin

48

CGT

GGC

GGT

CTA

ATT

TCC

CGA

TCG

TCA

GGA

AAC

TCC

ATC

CCT

AAA

96

Arg

Giv

Gly

Gly 20

Leu

lle

Ser

Arg

Ser 25

Ser

Gly

Asn

Ser

lle 30

Pro

Lys

TCC

GCT

TCA

CGC

GCC

TCT

TCA

CGC

GCA

TCC

CCT

AAG

GGA

TTC

CTC

TTA

144

Ser

Ala

Ser 35

Arg

Ala

Ser

Arg 40

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly 45

Phe

Leu

AAC

CGC

GCC

GTA

CAG

TAC

GCT

ACC

TCC

GCA

GCG

GCA

CCG

GCA

TCT

CAG

192

Asn

Ara 50

Ala

Val

Gin

Tyr

Ala 55

Thr

Ser

Ala

Ala 60

Pro

Ala

Ser

Gin

CCA

TCA

ACA

CCA

AAG

TCC

GCC

AGT

GAA

CCG

TCC

GGA

AAA

ATT

ACC

240

·· ·· ·· ·· » · · · » · ·· • · · · · ♦ · ·

Pro 65	Ser	Thr	Pro	Pro	Lvs 70	Ser	Ala
GAT	GAG	TTC	ACC	GGC	GCT	GGT	TCG
Asp	Glu	Phe	Thr	Gly 85	Ala	Gly	Ser

ATC GG Ile

Ser Glu Pro Ser Gly Lys Ile Thr 75 80

269 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 89 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

Met

Ala

Ser

Arg

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

Gin

Ser

Ala

Gin

1

-

5

10

15

Arg

Gly

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Gly

Asn

Ser

Ile

Pro

Lys

20

25

30

Ser

Ala

Ser

Arg

Ala

Ser

Arg

Ala

Ser

Pro

Lys

Gly

Phe

Leu

35

40

45

Asn

Arg

Ala

Val

Gin

Tyr

Ala

Thr

Ser

Ala

Pro

Ala

Ser

Gin

50

55

60

Pro

Ser

Thr

Pro

Lys

Ser

Ala

Ser

Glu

Pro

Ser

Gly

Lys

Ile

Thr

65

70

75

80

Asp

Glu

Phe

Thr

Gly

Ala

Gly

Ser

Ile

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: PREB-IB primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

ATCGGTACCG CCATGGCTTC TCGGAGGCTT CTCGCCT 37 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA

(vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: PREB-2R primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

ATCGGATCCC GCTGCGGAGG TAGCGTA 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 2285 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární
(il)	TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
(vii)	PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: promotor MFS14
(xi) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
AAAAGCGTAC	CAGTAAGGGA	TAAAGAAAAT	AAACAAACAC	GAAATGCTTC	CCCATCGGCC	60
AATTCGCCTA	GGTGTGCTAG	GAACTGGCCT	ATATGTTCGT	GTGTGCTTCT	CCTATTTTCA	120
CCAGAAAACT	TAGAAAACTC	TGGTATCCTT	GCCCCTTGTG	GATATGGGAC	AATGTCAAAC	180
CGGTGATCAT	ATGGCTTCTG	ATATC-ATTGC	CCCACTCTAT	CCACACCAAC	TCCGAGTCTA	240
TCTCAAAATA	GTTTAGCCAT	CTCTTCCCTA	ATTTTCTACA	TTGCACTCGG	TGGCAGACCA	300
CCGGACCCTA	GGCTGTGGGG	TTCATTCGGT	CGGGCATTGT	TATGCCGACC	TTCTTGCCAT	360
GACCGATTC-A	TAATGTTGAT	CGGCCTGTGA	TCATATGGCG	TGTTGTGGGT	TAAATATGTA	420
GGGGGCAGA^	CATACTGCCG	TTGTGGTATG	TAATAATTTG	GTGCATAGTG	TGCGACAGTA	480
GGTTCTGTGT	ATGTGTATCC	GATATGTCCG	GTGGTACATC	TGAACTGGCC	GGTTGTGTTA	540
GCTATTATTG	GGGCGCCACG	CGTAGCCCTG	GTGCGGCCCG	GACTATCCGG	CAGAGAAAGC	600
CGACGGTCTG	TGTAAGGGCC	GAACTATCCA	GACAAAAGCT	CGGACGGTCC	GACCGTGTAG	660
AGGGCCGTCG	ATCTGCCAAG	CAAGGACGAT	GGTGATGGTA	TTTGCCCTC-G	ATATGAGTTC	720
ATCAACATAC	CATATAATGG	ATGGGGCTGC	AAATCCCCAT	TTGTCGCCGA	TGTATTAGAC	780
ataaatatca	TGTTACTAGT	TTCATATGAT	GGAAAACTAG	GAGCAACAGA	CTTCTCCAAC	840
ATACACGTTA	ATTTTCTAAT	TGGTTCTTCT	AACCCTCTAA.	TCTAATGCTT	CATTTGATTA	900
TGCAAATGGT	CTACATACTG	TTTAATAGAT	TGGATG.TCGT	CGGGTTTACT	TACGTTAGGG	960
ACTTGAAGCG	AAGATAGAAG	AGATGTGACG	TCGGTATCGC	ATGTTTGACA	ACTTTCTGGT	1020
GACGATCCAC	CATGTATTGT	GACAAC-AATT	TCTCCTTCGT	TTGACACATG	TAGTCCTCGT	1080
ATTGTTGTTG	CTCATCGGTC	C-TCGGACTCT	TAATAGCCGG	CTTTAGGATA	TTGTCCGGC-G	1140
AC-ATATCC-GT	GTGATCTTTA	Gz“AC CGC CAT	TTGAT G GC CT	GAGTTTTAGT	AGATCTAGAC	1200

···· ····

ACATTTCCCC AACGGAGTCG CCAAAAAGTG TGTTGGCGCC GATCCAGGCG CGAAACACTG 1260

GAGATGGACC GTTTGGCGGT GTTCTCCGGG TGAGGACGGT CCGCGACCTG GGTCCAGCAG 1320

CGACTCTCCT CTACGTGTGT CCGGACGGTC CGTCGTCTGG GGCTCGGACG GTCGCGATGG 1380

CGCAGAGGGT CTTCTTCTTC GCAGCCGACC TAGATCTCGC CTCCCGGGAG GGACCGTCGG 1440

GGAGGAGAGA TTGTAGGGTG TGTCTTGGCG TCGACAGGCC ACACAATACG CCTCTAGTCG 1500

ACGTAGAGCC GAAGAGAGGT GAAGGATTGA GGTAGAAGGA GGCTAAACTT GGGCTAAACT 1560

AGAACTACTG CTAATGCATA AGGTAAAAAC GAGAAGTGGA CTTCATTTGA TCGATTGTGG 1620

AAGTAATCTG ACTGTAGCCC TTTATCTATA TAAAGGGGAG GTATGGACCC GTTACAAGCC 1680

GTTTTCCGAG CTAATCTCAC GGTTTTAGTT AATAAATCCT GCGAGAAACT CGGAACTCTA 1740

ACTGATTCTA CTCATGCGCG AACCATTCGT GCGCCACCGC TGCCCGTCCC GCGATCGCTC 1800

AGTTAACCCT GTGTTGTGCG CTGTGATTTG GTGGCATATA AAACCACATT TGCAATAAAA 1860

ATTTGTAGGG ATTTAACATA CCAAGTGCTG CGAAAGGAAT CGTTTTCGGA GGACCCAAAA 1920

TTAAAGAGGC AGATGCTAGA GCTCGTCCAG CTCAGCGCTG AGCACCTGTG TTGTCTTCCT 1980

CGTCCACGCC GGCGGAGATG AACGGCAACA AAGGCGGAAA GGCCGAGACG CTGAGCTCAA 2040

GGACGTGACA CCGCGCGTAC CTCGCGTTCA GTTGGCTCAC ACAACAGCAG CTCGCTCGCC 2100

CCAAGC7CCC GCGTCCTGAT CCGTAGGTGA GCCATGCAAA GGTCGCCGCG CGCCCTGATC 2160

CATTGCACCC TTCAAAGCTC GAACCTACAA ATAGCGTGCA CCAGGCATCC TGGCCACACC 2220

CACACAGCAA GCCAGCAGAG CAGAAAGCAG CCGCAGCCCC AGCCCCCACA AAGACGAAGG 2280

CAACA 2285 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: 14-SA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

AGACGCTGAG CTCAAGGACG TGA 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

	25	• fa ·· • fafa fa • fa • fa • fa • fafafa fafafafa	• fa fa • • fa fa • fa
(ii)	TYP MOLEKULY: DNA
(vii)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) ORGANISMUS: MANT-1 primer
xi) POPIS	SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM	10:

ATGCCCGGGC TTGCAATGTC TGTTAGCGGT GGCATCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: MANT-2RB primer (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

ATGCCCGGGC GATGGGGTAA GATGCAAGAC CA ty ΙοΓ-IŠ

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob brzděni (inhibice) genové exprese v cílovém rostlinném pletivu vyznačující se tím, že zahrnuje trvalou transformaci rostlinné buňky takového druhu, že z ní může být regenerována celá rostlina, rekombinantním genem nesoucím tkáňově nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového rostlinného pletiva, a dále nesoucím porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat buněčné dýchání v cílovém pletivu, což vede_ k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, genů kódujících a- nebo β-tubulin, krátké ko-suprese ve směru čtení („sense cosupression) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), a krátkého úseku genu translokštoru adenin nukleotidu (ANT), orientovaného ve směru čtení („sense), z vnitřní mitochondriální membrány.
2. Rostlina, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí tkáňově specifický nebo vývojově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen, je-li exprimován, inhibovat základní buněčnou funkci, jako je dýchání, uspořádání mikrotubulů nebo buněčné dělení v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, genů kódujících a- nebo β-tubulin, krátké kosuprese ve směru čtení („sense) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a aktivátoru replikačního počátku (ROA), a krátkého úseku („sense) genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT) z vnitřní mitochondriální membrány.
3. Rostlina, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí tkáňově specifický promotor, který funguje v buňkách cílového pletiva, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen inhibovat základní buněčnou funkci jako je dýchání, uspořádání

SUBSTITUTE SHEET • · · < · · · · <

• · · · « ·· *»· ·· mikrotubulů v buňkách cílového pletiva, což vede k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, krátkého úseku („sense) genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT), genů kódujících a- nebo β-tubulin a krátké ko-suprese vedoucí k utlumení („sense down-regulation) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a ROA.
4. Rostlina podle nároku 2 nebo 3, která je jednoděložná rostlina.
5. Rostlina podle nároku 4, která je kukuřice.
6. Způsob podle nároku 1 nebo rostlina podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že promotor je promotor specifický pro prašník a/nebo tapetum.
7. Způsob nebo rostlina podle nároku 6, vyznačuj ící se t í m, že promotor je izolován za použití sekvencí cDNA z jakéhokoliv obrázku 1 až 3.
8. Způsob nebo rostlina podle nároku 6, vyznačuj ící se t í m, že promotor je promotor z genu MFS14 (sekvence s identifikačním číslem 8).
9. Samčí sterilní rostlina kukuřice, která má ve svém genomu trvale inkorporovanou rekombinantní molekulu DNA nesoucí promotor specifický pro tapetum, který funguje v buňkách tapeta, a dále nesoucí porušovací gen kódující takový protein, který je schopen inhibovat základní buněčnou funkci jako je dýchání nebo uspořádání mikrotubulů v buňkách tapeta, což vede k odumření buněk, přičemž porušovací gen je vybrán ze skupiny skládající se z genu T-urfl3, krátkého úseku („sense) genu translokátoru adenin nukleotidu (ANT), genů kódujících a- nebo β-tubulin a krátké ko-suprese vedoucí k utlumení („sense downregulation) dvou základních genů buněčného cyklu kukuřice, cdc25 a ROA.