CZ209397A3

CZ209397A3 - Stabilní kompozice obsahující transgenní rostlinný materiál

Info

Publication number: CZ209397A3
Application number: CZ972093A
Authority: CZ
Inventors: Robert Franciscus Beudeker
Original assignee: Gist-Brocades B. V.
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-11-06
Publication date: 1998-03-18
Also published as: SK90797A3; EE9700152A; NZ322011A; JPH10512456A; CN1168084A; CA2209010A1; PL321186A1; AU7567696A; TR199700582T1; AU728203B2; HUP9801179A3; WO1997016981A1; HUP9801179A2; IL121208A; MX9705064A; IL121208A0; EP0804087A1; BR9606683A

Description

Vynález popisuje použití enzymů v průmyslových postupech, kterými jsou příprava potravinových , nebo krmivových kompozic.

Dosavadní stav techniky

Použití enzymů v krmivech pro zvířata pro hospodářské zvířectvo je stále častěji využíváno. Tyto ensimy jsou produkovány mikroorganismem, který je využíván ve velkém měřítku ve fermenterech, obzvláště v průmyslové přípravě enzimů, A konečně fermentační perioda a bujón mikroorganismů jsou předmětem řady filtračních kroků, k oddělení biomasy z těchto enzimů. Roztok enzymů je prodáván· jako kapalina po přídavku různých stabilizátorů, nebo je vyráběn jako suchá formulace.

Kapalné enzymy a suché formulace jsou používány v komerčním měřítku, v krmivářském průmyslu. Kapaliny mohou být aplikovány do krmivá po granulaci s preventivním ínaktivačním zahříváním enzymů pomocí granuiačních procesů.Problém je ten, že množství enzymů v konečném krmivovém přípravku je velmi malý, a vytváří obtížně realizovatelnou homogenní distribuci

Ol-1357'97-Čť • · · · • · · a · « · f B · · • · a a · a* ·*ι· ·· · '· ·· • Β · * • · Β ·· • Β t«B · · • B a Β »>· Β « · a molekul· enzymů do krmivá. Kapaliny jsou obecně hůře mísitelné než suché složky. Jsou ponřeba specifická opatření k přidání potravin do krmiv po grahuiací, která není běžná u více mletých krmiv.

Suché formulace enzymů, na druhé straně, mají nevýhody v inaktivaci enzymů během granulace, Během granulace je krmivc stlačeno skrze matrici a takto utvořené je krájeno do vhodných granulí, s různým tvarem·. Obsah hmoty, která je včleněna do granulí je obecně mezi 18 až 19 %. Přímo po granulaci teploty mohou dosahovat od 6 0 do 9 5 ⁴C. Kombinovaný účinek vysokého obsahu a vysokých teplot je škodlivý pro většinu enzymů. Tyto nevýhody jsou také u ostatních typů termomechanického působení na potravu jako je vytlačování a expanze.

Tyto problémy překonává metoda pro přípravu tepelně stabilních enzymových prernixů, obsahujících jeden, nebo více enzymů, které zadržují účinnou hladinu aktivity během obecného peletačního procesu, který byl publikován ( Haarakilta, A (1988)Evropská patentová přihláška 0257 996 Bl) .

Způsob obsahuje následující kroky:

smísení malého množství nosiče který je fyziologicky přijatelný a schopný absorbovat vodný roztok enzymu, s vodným roztokem enzymu pro časový úsek schopný absorbovat enzym na nosič, a tím utvořit komplex nosiČ/enzym; granulace komplexu nosič/enzym; a sušení gratulovaného

0M357-97-ČÍ » · · · · · • · · · ·

0 0 0 0 0 0 0 0 · · 00 0000 00

- ·· «V ·· · 00 0 • 0 0 00 • · ··· * · • ·0·

000 00 00 komplexu nosič/enzym o obsahu mezi 7% a 15 % s výhodou méně nes okolo 10 % hmotnostních.

Tato metoda je pracná a výsledkem není zlepšená odolnost granulí.

Různě vyráběné enzymy jsou různě formulovány různými metodami, pro zlepšení stability produktů enzymů v suchém stavu během granulace a uskladnění potravy . Bylo například navrženo, Se formulace vyznačující se tím, že část produktu jsou povlečené granule a tím mohou zlepšit odolnost vůči granulačním podmínkám. (WO 92/12645) .

Tato úsilí zdůrazn'ují nutnost řešení tohoto problému- v průmyslu a vyřešení tohoto výrobního problému.

Podstata vynálezu

Nyní bylo naočekávaně zjištěno, že enzymy jsou nejodolnější vůči' termomechanickým procesům, jako je granulace, jestliže jsou přidávány do potravy ve formě transgenního rostlinného materiálu, ve kterém mají být tyto enzymy produkovány za pomoci exprese transgenu. Tento vynález popisuje termomechanické způsoby výroby kompozice obsahující jako aktivní složku polypeptid, ve kterém jsou kompozice vyrobitelné pomocí suroviny, která obsahuje transgenní rostlinný materiál,ve kterém byl polypeptid biosyntetizován patřičnou

01-1357-97-Če' ·· ·* ·· · «» *·

Ι· · · · · ·* · I φ · • ««*» · · , · * · * «ν · · « «»«· « • · · « * · « · · «»*··* «· ··» ti «4 expresí zde uvedeného transgenu, termomechanickám způsobem. Výhodným termoraechanickýra způsobem je granulace, vytlačování a expanze,

Vynález popisuje použití těchto kompozic v potravě pro zvířata, nebo jako její směsi. S výhodou jsou kompozice podle vynálezu používány ve způsobu pro zvýšení přírůstků u zvířat, ve kterém jsou zvířata krmena krmivém s obsahem těchto kompozic.

Vynález dále popisuje způsob přípravy termomechánicky upravených kompozic,s obsahem polypeptidú jako aktivní složky.

Terrnomechanické způsoby použité podle tohoto vynálezu jsou často používány při komerční výrobě krmív, při které se vyskytuje množství způsobů jako je vytlačování, granulace, expanze, nebo jejich kombinace. Všechny tyto způsoby jsou vyznačené vstupem tepelné energie, obvykle ve formě páry a mechanické energie, to jest provádění míchání potravy.

Granulace je klasickou metodou výroby potravy, která může být také aplikována jako terrnomechanické působení na některou surovinu. Suroviny jsou míchány, a po snížení tlaku páry přidáním několika barů jsou transportovány do míchané matrice. Matrice obsahuje díry, obvykle několik stovek těchto děr, skrze které je produkt protlačován, Je spuštěna rotace ramen v raatrici.

vi-io3/-y/-v.e

·· »·»· »· «φ*

Protlačování je alternativní cestou pro produkci krmivá která múze být také použita jako termomechanické působení na některý surovinový materiál.

Suroviny jsou vloženy do nekonečné šroubovice, která se obecně skládá z několika tlakových kruhu s klesajícím tvarem. Tyto šroubovité disky vedou do matrice, Teplota se zvýší v závislosti na tření produktu mezi šroubovicí a obalem a zvyšuje se také s tlakem. Rozdíl tlaků mezi vnějškem a vnitřkem extruderu vede k částečnému odpaření vody, z konečného hlediska a toto zapříčin^vuje expanzi produktu.

Expanze je proces, který je celkem podobný extruzi, ale není tvořen materiálem v definované hmotě a obecně není tvořen matricí.

Alternativní cestou pro výrobu enzymů pro použití v krmivu pro zvířata, je cesta exprase genů nekódovaných krmivových enzymů jako je mikrobiální fytáza, v rostlinách a v semenech rostlin ( Pen a ostatní EP-A-0 449 375.Použití rostlin, nebo jejich semen pro exprasi těchto enzymů, buďto přímým, nebo nepřímým postupem, je srovnatelný s použitím v potr.avě pro zvířata.

Transgenní rostlinné materiály podle tohoto vynálezu s výhodou obsahují jeden, nbo více požadovaných polypeptidú, které jsou produktem exprese transgenu obsaženém v rostlině, který je tvořen odvozeným rostlinným materiálem. Tohoto je

01-1357-97’Čc

Μ ·» • · « « ί ί ?

• · · «··· ♦ · ·· b « · b · b b b b • · ·!· dosaženo cestou zavedení do rostliny stavební základy exprase obsahující DNA sekvence kódované požadované polypeptidy mající odpovídající účinnost, jako je například enzym fytáza, (tento enzym je podrobně popsán v práci (Pen a ostatní EP -A-0 443 375) )

Transgenní rostliny, a transgenní rostlinný materiál, jak je zde definován, zahrnuje rostliny ( tak také jejich části a bun^ky těchto rostlin) a jejich piogeny, které byly geneticky modifikovány za použití technik založených na rekombinaci DNA, zvyšování, nebo změnu produkce požadovaných polypeptidú v rostlinách, nebo v orgánech rostlin.

V tomto případě je transgen chápán jako specifická genetická modifikace, to znamená, jako sekvence nukleosidu v transgenu rostliny.

V kompozici podle vynálezu jsou poplypeptidy aplykovány jako aktivní složky, kdežto aktivní složka je definována jako zakódovaná pomocí transgenu.

Polypeptidy používané podle vynálezu mohou být produkovány konstitučně v transgenních rostlinách, ve všech tkáních,během všech vývojových stádií rostlin.V některých případech,kterým je například degradace enzymů v buněčné stěně,může být požadováno omezení exprese transgenní specifické části rostliny,ve které požadovaná exprese polypeptidú není na překážku interference rozvíjení hostitelské tkáně.Geny kódující žádoucí polypeptidy mohou být také vyjádřeny v konstrukci -/nebo zvláštním tkáňovým • 9 99 ·· 9 «« φ*

999 9 « 99* 999 9 • 9 9 99· 99 9·

9 9 99 9 9 9 9999 9

999 · b 9 999

9999 99 999 99 99

Oi-1357-97-Če způsobem.Tyto geny mohou být řízeny promotorem indukce.Ve výhodném provedení vynálezu jsou použity neporušené,mleté,nebo rozmělněné části,ve kterých byl požadovaný polypeptid specificky vyjádřen za použití specifického promotoru semene.Avšak bude evidentní z tohoto dosavadního stavu techniky,že exprese polypeptidů v dalších rostliných orgánech je ekvivalentní a může vést k podobným výhodám během aplikace,jak je popsáno v tomto vynálezu.

Výběr druhů rostlin je nejprve určen použitím rostlin ,nebo jejich částí a přístupnost pro transformaci.V souvislosti s tímto vynálezem jsou rostliny vybrány z následující skupiny,ale tato skupina rostlin neomezuje vynález.Těmito rostlinami jsou:zemědělské plodiny,jako je obilí pro přípravu potravin,dále květák(Brassica oleracea),artičok(Cynara scolymus),ovoce jako jsou jablka(Malus,e.g.domesticus),banán(Musa,e.g.

acuminata) , angrešt) , rybíz (Ribes, e ,.g . rubrum) , višně a třešně(Prunus,e.g.avium),okurka(Cucumis,e.g.sativus),vinná réva(Vitis,e,g.vinifera),citron(Citrus limon),meloun(Cucumis melo),ořechy(Juglans,e.g.regia,Arachis hypogeae),pomeranč(Citrus,e.g.maxima),broskev(Prunus, e ,g.persic

a),hruška(Pyra,e.g,communis),švestka(Prunus,e.g . doméstica),j shoda(Pragar ia,e.g.

moschata),rajče(Lycopersicon,e.g.

escuíentum) , voj těška (Medicago, e .g . sativa.) ,brukev zelná(e.g.Brassica oleracea),štěrbák(Cichoreum,e.g.

01-1357-97-Če

8·· « *· ·« • ♦ *» · « · · • · * « ·« • · · · ·*♦ « · • * · · » · ·· »·· · » endivia),pórek(Allium,e.g, porrum),hlávkový salát(Lactuca,e.g.

sativa), špenát(Spinacia tabacura),kořenová třtinová(Maranta,e.g. vulgaris),mrkev(Daucus oleraceae),tabák(Nicotiana,e.g.

zelenina,jako je maranta arundinacea),řepa(Beta,e.g. e.g, carota),kasava(Manihot e.g. esculenta),turín(Brassica,e.g,rapa),ředkvička(Raphanus e.g. sativus) , jam (Dioscorea, e.g. esculenta) , batata (Ipornoea batatas)a semena;fazole(Phaseolus,e.g.

vulgaris),hrách(pisum,e.g. sativura),merlík zvrhlý(Glycin,e.g. max),pšenice(Triticum,e,g. aestívum), ječmen(Hordeum,e, g.

vulgare),kukuřice(Zea,e.g, mays),rýže(Orysa,e.g, sativa),řepkové semeno(Brassica napus),proso seté(Panicum L.),slunečnice(Helianthus annus),oves set.ý(Avena sativa) , hlízy ,jako jsou:brambory(Solanum,e,g.

tuberosum),kedluben(Brassica,e.g. oleraceae)a podobné.

Výhody tohoto vynálezu spočívají v tom, že polypeptidy, jestliže jsou přidány do kompozice, jako aktivní příměs, a ve formě transgenního rostlinného materiálu jsou více odolné k

inaktivaci	během jednotlivých	kroku	při termomechanických
postupech,	jako je tabletování,	ve	srovnání	ve srovnání s
obecnými	úpravami a postupy,	ve	kterých	byly přidány

polypeptidy jako kompozice.

Bude zřejmé, že tyto výhody nejsou nezbytně omezeny na specifické ztělesnění určitých příkladů které jsou zahrnuty v této přihlášce; to jest enzymy, jako je phytáza, nebo xylanáza,

0M357-97-Če

·· •	«	·· • ♦	»· v ·	a *	fe* •' *	« · •
a	fe	• ·	a' ·	•	• · ·'·	•
•	•	«	i fe	*	fe	«
* «		MM	««	*·«	fe·	« ·

které jsou přidávány do kompozic pro tabletování a používány jako výživa pro zvířata.

S ohledem na výhody podle tohoto vynálezu, by mohly být použity některé kompozice, které jsou podrobeny termomechanickému působení, a které obsahují jeden, nebo více polypeptidů jako aktivních látek,

Výhody podle tohoto vynálezu budou budou lépe vysvětleny v případě polypeptidů s citlivostí na biologickou aktivitu, to jest, citlivé k tepelné inaktivaci.

Termosenzitivní polypeptidy jsou zde definovány jako polypeptidy- s velkou biologickou účinností, která se zráčí při termomechanickém postupu použitým podle vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou polypeptidy a/nebo DNA sekvence, které je kódují heterologní s ohledem na transgenní hostitelskou roístlinu, ve kterých probíhá exprese DNA sekvencí.

Heterologní zde znamená, že DNA sekvence a/nebo polypeptidy nepocházejí z hostitelského organizmu, to znamená, že jsou odvozeny od dalších rostlinných druhu, savců, nebo mikroorganizmů, jako jsou houby, nebo bakterie,

Předložený vynález je zvláště výhodný, jestliže probíhá exprese glykosilovaných protteinú, v transgenních rostlinách , zatímco jejich glykosilace se může lišit v přírodě se vyskytujících celých částí těchto poteinú.

01- 1357-97-Če «* ·· * · ·· «» * · » * · · · · ···· • · · · · » i··· • » · · » · · * «··«« * ·' » · ♦ » htfc ·· ···· 99 ··· ·· ··

Výhodnými enzymy podle tohoto vynálezu jsou enzymy použité pro výživu zvířat. Výživou pro zvířata je zde rozuměno, ze také zahrnuje oblíbenou potravu. Funkce těchto enzymů je zlepšení konverzního poměru výživy, to jest pomocí snižováni viskozíty, nebo pomocí snižování antivýživového účinku určitých výživových sloučenin.

Alternativně mohou být výživové enzymy (jako je phytáza) použity ke snižování v hnojivech, množsví sloučenin, které jsou škodllivé k životnímu prostředí. Výhodnými enzymy pro tyto účely jsou:

Fosfatáza, kterou je výhodně fytáza a/nebo kyseliny fosfotázy; karbohydráza jako jsou amylotické enzymy a pletivo rostlinných buněk degradované enzymy ve kterých jje s výhodou cellu lasa, hemicellulasa, nebo galaktanáza;

proteáza, kterou je výhodně proteáza s neutrálním, a/nebo kyselým pH; lipáza , kterou je výhodně fosfolypáza, kterou je výhodně pankteatická fosfolipáza savců A2.

Fosfolipidy podle vynálezu mohou obsahovat neenzymatické biologické účinnosti, jako jsou antigenní determinanty, které se používají jako vakkcíny a/nebo vystavěné polypeptidy, které zvyšují obsah esenciálních aminokyselin.

Průměrnému vynález může polypeptidů, transgenních odborníkovi v tomto oboru bude jasné, že být proveden pomocí kombinace požadovaných ve kterých jsou obsaženy kombinace různých rostlin, a exprese růyných požadovaných

0M357-97-Če «* *9 ·· 9 99 99 ♦ · 9 · 9999 9999

9 · 99 9 99«·

9 9 99 9 9 9 9999 9 • 9 9 999 999

9999 ·4 999 « polypeptidú, tak jako kombinace různých požadovaných polypeptidú, u kterých probíhá vzájemná exprese v jedné transgenní rostlině.

Dalším výhodným provedením vynálezu je tabletovací stabilita fytaza Aspergillus niger, která byla testována jestliže je enzym obsažen v mletých semenech, olejnatého semena řepky (Brassica napus} ve kterém proběhla exprese genu fytázy

A. níger.

Klonování genu fytázy A. niger. je popsána ( van Gorcom et al. EP A-0 420 358 ) .

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je tvorba stabilní tablety endoxylanázv Aspergillus která je provedena pomocí exprese genu houby kódované tímto enzymem v semenech tabáku. Klonování Aspergillus endoxylanázového genu bylo přesněji popsáno v EP-A- 0 463 7066 - Graff et al.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stabilní specifická exprese semene Aspergillus niger fytázového genu pomocí řízení promotoru kruciferinu v olejnatých semenevh řepky olejky

01-1357-97-Če • · to to »· tototo· toto toto I · · « f · «· • toto· « toto a to· toto

Podrobný popis způsobu aplikovaný na exprasi semen houbové fytázy v semenech řepky olejky byly popsány v EP-A-0 449 375 Pen et al. (1991) , který je začleněn zde v odkazech .

V podstetě binární vektor pMOG23 (uložen v E.eoli K12 DH5a, v centrální sbírce Schimmel Cultures2S.1.1990 pod číslem CBS 102.90) byl použit jako výchozí látka pro konstrukci specifické exprese vektoru pro fytázu. Specifické semeno fytázy v expresní kazetě bylo shromážděno v pMOG23 , obsahující následející hlavni články.

Transkripce fytázy cDNA a její dokončení jsou řízeny pomocí 5'a 3'- regulátorů sekvence odvozených od kódovaného genu Brassica napus 12S uloženého proteinu kruciferinu (gen cruA; Ryan et al. ,1989, Nucl. Acids Res. 17.: 3584) .Alfalfa Mosaic Virus RNA4 vedoucí sekvence je použita k stabilizaci mRNA (Bredero et al.,1980, Nucl, Acids Res. 8:2213) a Tobacco PR-S signál peptidu (Cornelissen et al., 1986 , Nature321:531) je spárován k sestavení části fytázy cDNA kódující zralý protein a dále k dosažení extracelulární exprese fytázy.

Tento binární vektor obsahuje chimerní fytázový gen, který byl mobilizován, v triparentální mating s Ξ. coli K-12 deformovaném RK2013 (obsahující plasmid pRK2013^

Nati. Acad. Sci. USA 77: 7347 ),

LGA4404 ( Hoekerna et al., 1933, Nátuře 303 : 179) , že obsahuje plasmid s genovou virulencí nezbytnou pro přenos T-DNA do rostliny. Napětí bylo použito pro transformaci semena. (Brassica napus cv. Westar) (Ditta et al., 1930, Proč. v Agrobacteríum deformace

01-1357-97-Čé »· «··« ·» · ·· ·· • · ·· · » · · • · · « · · β • · 4 » · ··*· * • · · * · v · ·· · ·« A A

Byl odejmut sterilizovaný povrch části stonku 5 až 6 týdenních rostlin, ještě předtím , než vykvetlykterý byl po 24 hodinách umístěn na MS medium (Fty et al. , (1987), Plant cell

Reports £., 321) a poté společně kultivován po dobu 48 hodin s

Agzobacterium na Čerstvých plátcích se stejným médiem. Transgenní rostliny rašily a rostly na selekčním mediu (500 mg/1 karbenicillin, 40 mg/ 1 paromomycin) a dále analyzovány jak je popsáno v EP-A-0 449 375 Pen et al.

Za pouřití výše uvedených postupů hodnoty exprese fytázy v olejnatýcn semenech řepky olejky bylo dosaženo hodnot as do 10 % rozpuštěného protéinu odpovídající hodnotě okolo 500 FTU/g. Jedna jednotka aktivity fytázy (FTU) je definována jako množství enzymu, které uvolňuje anorganický fosfor z 1.5 mM fytátu sodného v poměru 1 jumol/min při 37 ° C a při pH 5.5.

Příklad 2

Stabilita fytázy v olejových semenech řepky olejkv během tabletování .Tabletovací podmínky byly takové, Že tablety obdržené při teplotě 55 °C a poté za podmínek 7 5 °C po tabletizaci.

Dva nezávislé pokusy byly provedeny jeden v laboratorním měřítku a druhý v průmyslovém měřítku.

Překvapivě bylo zjištěno, že fytáza Aspergillus niger. produkovaná v semenech řepky olejky je značně odolnější k ♦ 0

Ol-1357-97-Če ν· • 0 0 • 0 00 • 0

0 0

0 0 ' «00

00 • · 0 ♦

0 00

000 0 0

0 0

00 tabletizačním podmínkám než běžné komerční formulace fytázy v Aspergillus niger.

Stabilita enzymů v ještě nemletých semenech, které byly použity je zřejmě nezávislá na neporušenosti semen.

Natuphos® je komerční produkt obsahující fytázu Aspergillus niger která může být obdržena z BASF, Ludwigshafen, Germany.

Tabulka 1

Účinek tabletování na stabilitu různvch enzymových formulací

Procento zbytkové účinnosti Procento zbytkové účinnosti

Produkt_Lab. měřítko_Prúm, měřítko

Komerční

Nautuphos® prásek_£2_38

Mletá semena řepky

10QFTU/g 62

01-1357-97-Če ♦ · ·* ·» • · ♦ · · · • « · * · * · · · · « « · · · · ·· ·· · ·« • ·· ·· •· · «· · • · · ·· • · ·«· * · • · · « ·»« ·· ··

Příklad 3

Stabilita fytázv v olejových semenech řepky olejkv během mletí semen

Komerční rozvoj fytázy v olejových semenech řepky zahrnuje mletí semen. Dále odlišné mlecí podmínky byly srovnány se stabilitou účinnosti fytázy jako exprese v olejových semenech během mletí,

Používané mlecí metody jsou dobře známe' odborníkům ze stavu techniky.

Výsledky ukazují, že různé druhy mletí nemají drtastický efekt na stabilitu enzimů.

Tabulka 2

U'činek různých typů mletí na stabilitu expresi fytázy v olejových semenech řepky olejky

Mlecí metoda

Vločkování

Procento zbytkové účinnosti

Vločkování/
odvločkování	90
Vločkování/drcení	91 %
Vločkování/jehlové mletí za mrazu	8 9

Ol-1357-97-Ce ·· ·· » » · • ·· « · » · « • · 9 ·· ··

Drcení___7 5

Jehlové mletí_87

Příklad 4

Stabilní exprese endoxvlanázv v semenech tabáku za řízení promotoru CaMV 35S

Aspeigíllus endoxyianázového genu byl klonován jak je popsáno podrobněji v Draff et all, EP-A-0 463 706.

Plazmid E.coli plMlOO obsahující Aspergillus endoxylanásový gen který je uložen v Central Bureau voor Schimmelcultures 19.7.1990 a bylo mu přiděleno číslo CBS 322.90, Použitím splynutí PCR s plMlOO jako chemického vzorku v genu xylanázy byl odstraněn jednotlivý intron.

Tato exprese v umělé cDNA v semenech tabáku s následujícími podobnými postupy byla popsána detailněji pro expresi fytázy v tabáku(Pen et al,1993,Bio/technology 11:811) ,V souladu s kódováním fragmentu cDNA dospělý enzym byl spojen do struktury kódující sekvence signálního peptidu v tabákovém proteinu PRS(Cornelissen et al.,1986,Nátuře 321: 531)v binárním expresním vektoru pMOG29 (Pen et al,1992,Bio/technology 10:292) .

Expresní kazeta v pMOG29 obsahovala následující články, konstitutivní cauliflower mozaikový virus (CaMV)353 promotoru s dvojitým zvysovacem ( Guilley et al.,1982, Cell 30 : 763); syntetický Alfalfa Mosaic vedoucí virus RNA4 vede k stabilizaci sekvence mRNA ( Bredero et al., 1980, Nucl.Acíds Res. 8: 2213);

01-1357-97-Čc • ·9« 99 9 9« 9*

99· · 9 ♦ 99 9 9 9 9 · 9 9·· 99 9« • 9 9 99 9 9 9 9999 9

999 9 9 9 99·

9999 99 999 99 99 a Agrobacterium tumefacíens nopaline synthasy (NOS)terminátor ( Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12 : 8711).

* Tento binární vektor obsahuje chimérní endoxylanázový gen, j který byl mobilizován, v triparenterální matici s E.coií K-12 napětí RK2013 ( obsahující plazmid PRK2013) . ( Ditta et al.,

1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77.: 7347 ), v Agrobacteiium napětí LBA4404 (Hoekema et al., 1933, Nátuře 303 : 179), že obsahuje plazmid s genovou virulencí nezbytnou pro T-DNA přenos do rostliny.

Toto napětí bylo použito pro transformaci disků listů tabáku (Nicocíana tahačům cv Petit Havana SR 1)podle postupů Horch et , al. (1985, Science 227 : 1229). Transgenní rostliny byly vybrány na médiu obsahujícím 100 mg/1 kanamycinu.

Značná exprese tohoto endoxylanázového genu v tabáku výsledkem v naximální hladině exprese 1,5 % rozpustného proteinu v semenech odpovídající okolo 1625 EXU na gram semena. Jedna jednotka endoxylanázové aktivity (EXU) je definováno jako množství enzymů, které je volné 3.346 mikrornolú redukce cukrů měřené jako xylozový ekvivalent z 1 % xylanu z ovsa setého, pčenice při 40 °C při pH 3,5,

Příklad 5

Stabilita endoxvlanázy v tabákových semenech během tabletování

01-1357-97-Oe ·« ·· ·· b β· ·* • bbb ♦ · ·· ♦ · b · • · b · b b b · b b • * b b · b b v ···« « b b · bbb · b · ·· ·♦·» «« «·» bb ·>

Tabletovací podmínky, že jídlo obdržené při teplotě 65°C, během stavu a 75 °C po tabletování.

Experimenty byly provedeny v laboratorním měřítku.

Mletá semena a mikrobiální enzymový produkt byl označen jako Lyxasan Forte® '( obdržený z BASF , Ludwigshafen, Gerrnany) byl přidán do jídla na konečnou koncentraci 6500 EXU/kg krmivá.

Závěr je takový, že endoxylanáza produkovaná v semenech je značně odolnější k tabletizaci, než běžné formulace obsahující mikrobiální enzym.

Tabulka 3

Účinek stability tabletování různých formulací endoxylanázy

Procenta zbytkové aktivity

Komerční Lyxasan For te®-prášek_15.

Mletá tabáková semena s expresí endoxylanázy

Claims

I. Termomechanícký zpracovaná kompozice obsahující jako aktivní složku polypeptid,vyznačující se tím, že kompozice je obdržena termoraechanickým působením na neupravený materiál, který obsahuje transgenní rostlinný materiál, ve kterém byl polypeptid biosyntetizován patřičnou expresí transgenního

Γ materiálu zde uvedeného,12. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že termomechanícký způsob je vybrán z granulování, vytlačování, a expanze, nebo jejích kombinací.

Kompozice podle některého z nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že transgenním rostlinným materiálem je semeno.
4. Kompozice podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že polypeptid je heterologní k transgenní rostlině.
5. Kompozice podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, Že poiypeptidem je enzym.

Kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že enzym je vybrán ze skupiny obsahující fosfatázu, karbohydrázu, proteázu a liDázu, fLoiíri / tta/ovr /va·

Ol-L357-97-Ce ·* *««· ·» * «« » • · ·· » · · 9 • · · · · ft* • · · · ··« · « • · · · · « «· ··· ·· 4*
7. Kompozice podle nároku 6, kde enzymem je fungální fytáza, a/nebo fungální xylanáza.
8. Použití kompozice uvedené v některém z předchozích nároků 1 až 7 jako krmivo pro zvířata, nebo jako jeho směs.
9. Způsob podpory růstu zvířat, vyznačující se tím, že zvíře je nakrmeno krmivém, které obsahuje kompozici, která, je definovaná v některém z předešlých nároků 1 až 7.
10. Způsob výroby termomechanicky zpracované kompozice, která obsahuje polypeptid jako aktivní složku, vyznačující se tím, že neupravené materiály obsahují rostlinný transgenní materiál,ve kterém byl biosyntetizován polypeptid patřičnou expresí, zde uvedeného transgenního . materiálu, který je podroben termomechanickému zpracování, které je výhodně vybráno z granulace, vytlačování, nebo expanze.