CZ219891A3

CZ219891A3 - Způsob výroby makrotetrolidových insekticidů

Info

Publication number: CZ219891A3
Application number: CS912198A
Authority: CZ
Inventors: Josef Ing Csc Jizba; Irena Ing Skibova; Margita Rndr Csc Blumauerova
Original assignee: Mikrobiologicky Ustav Csav
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1993-02-17
Also published as: CS277547B6

Abstract

Makrotetrolidy obecného vzorce I kde Ri, R2, R3 a R4 jsou methylové nebo ethylové skupiny, jsou přírodní pesticidy s insekticidním, akaricidním, kokcidiostatickým a anthelmintickým účinkem, produkované různými druhy střeptornycet.Jejich účinnost se zvyšuje s počtem ethylových skupin v molekule. Streptomyces griseus, použitý pro vypracování postupu výroby, produkuje při submersní kultivaci na půdé se škrobem, lihovarskými výpalky a sušenými kvasnicemi směs nonaktinu, monaktinu, dinaktinu a tetranaktinu v poměru 8 : 27 : 57 : 8. Při kultivaci na půdě stejného složení, ke které byl přidán propionan sodný a hydrogenfosforečnan draselný, je produkován dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 2:26: 72. Chemickou isolací tohoto komplexu z mycelia produkčních kultur byla získána směs trinaktinu a tetranaktinu v poměru 1 : 3, obsahujícíjen stopové množství dinaktinu.

Description

Vynáloz se týká způsobu výroby makrotetr©lidových insekticidů trinaktinu a tetranaktinu biosyntetickou cestou.

Z.ti^áty, způsobené škodlivým hmyzem a roztoči při pěstování a skladování zemědělských plodin, představují každoročně až 30 % světové produkce. Účinná ochrana rostlin proti škůdcům je tedy jedním z hlavních faktorů, určujících výši a kvalitu sklizně, a tím i jednou z nejsnáze dostupných reserv v zemědělství. Dlouhodobá aplikace syntetických agrochemikálií mé však negativní ekologické důsledky (nahromadění nerozložitelných toxických látek v půdě nebo plodinách, vývoji odolných forem Škůdohne.

ců, uhynutí neškodných organismů, a pod/), a proto je věnována zvýšená pozornost výzkumu a vývoji přírodních insekticidů, předeším produktů mikroorganismů, V minulých letech byla objevena celá řada mikrobních metabolitů s pesticidními účinky, jen několik z nich však mělo vlastnosti vhodné prc praktickou aplikaci (Misato a sp., Adv.

σ/

Appl. Microbiol. 21, 53*88, 1977; Mistato, J. Pesticide oa

Sci. 7, 301*305, 1982; Leshpande a sp., Enzyme Microb. ai

Technol. 10, 455*473, 1988). Mezi ně patří látky typu makrotetrolidů (Dominguez a sp., Helv. Chim. Acta 45, 129*^?ý!38, 1962; Beck a sp., Helv. Chim. Acta 45, 620*630,1962;

Kellůr-Schierlein a &p·, Antimicrob. Agents Chemother. aa^v

1966, 644*650, 1967; Ando a sp., J. Antibiot, 24, 418*422, 1971) obecného vzorce I

-

CH.

R, (i) kde R^, R^ a R^ jsou methylové nebo ethylové skupiny:

	^E1	^r2	^E3	^R4
la	Nonaktin	CH.,	^C,I3	CH 3	CH^
Ib	Monaktin	CH₃	^OH3	CK₃	ch₂ch₃
IC	Dinaktin	CR3	ch₃	oh₂ch₃	oh₂ch₃
Id	Trinaktin	^CH3	oh₂oh₃	ch₂ch^	oh₂ch₃
ío	Tetranaktin	ch₂ch	ch₂ch₃	CH₂CH₃	oh₂ch₃

Makrotetrolidy jsou. aktivní proti hmyzu a roztočům ca (Oishi a sp., Antibiot. 23, 105*106, 1970; Ahdo a sp.

Oř·'

J. Antibiot. 24, 347*352, 1971; Sagawa a sp., J. Econ.Enai^r tomol. 6.5, 372*375» 1972) a mají také účinky kokcidiostatické (Sakamoto a sp., Deutsche Patentschrift DE 2802455 C2, 1978) a anthelmintické (Nippon Kayaku Co. Ltd., a Chugai Pharm. Co., Ltd., Japan Kokai Tokkyo Koho 8157,714, 1981)· Jsou neškodné pro teplokrevné živočichy (Oishi a sp.,

J

... χ ...

J. Antibiot. 23, 105*106, 1970} Sagawa a sp., Jh Econ. Entomol. 65, 372*375, 1972) a pi-o rostliny (Hirano a ap., <32’'

J. Econ. Entomol. 66, 349*352, 1973) a snadno rozložitelné půdní mikroflorou (Sasaki a sp., Appl. Environ. MicroQ3z biol. 40, 264*268, 1980). Jejich aktivita se zvyšuje e počtem ethylových skupin v molekule; nejúčinnější je trinaktin (vzorec Id) a tetranaktin (vzorec Ie).

Nonaktin, monaktin, dinaktin a trinaktin jsou proík/ad dukovány řadou druhů streptomycet, např/různými kmeny

Streptoinyces griseus, S. chrysomallus, S. flaveolus, S.tsusimaensís nebo S. werraensis (Smith, J. Antibiot. 28, 1000* *1003, 1975). Tetranaktin ve směsi s dinaktinem a trinaktinem byl isolován pouze z kultur S. aureus (Ando a sp., J. a γ

Antibiot. 24, 347*352, 1971), kdežto S. roseochromogenes tvoří nonaktin, monaktin, dinaktin, trinaktin i tetranaktin v kvantitativním poměru 22 : 33 ·. 33 í 9 : 3 (Smith, J. Anag r\ tibiot. 28, 1000*1003, 1975). Komplex makrotetrolidů (t^zv. polynaktin), obsahující dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru. 10 : 40 : 50 (Shichi a sp. , U.S. Pat. 4,843,092, 1989) je vyráběn japonskou firmou Chugai Pharm. Co.,Ltd., fermentací s použitím S. aureus jako produkčního mikroorganismu a úspěšně aplikován v praxi buů samostatně, nebo ve l klad ' směsi s chemickými pesticidy např/pro velkoplošnou ochranu čajovníkových nebo pomerančovníkových plantáží (Sagawa a sp., Japan Koka! T.okkyo Koho 74066.56, 1974,’ Chugai Pharm. Co», Ltd., a Hokko Chem. Industry Co», Ltd«, Japan Kokai Tokkyo Koho 5846006, a 5846009, 1983).

Patentově chráněný k-men S.' aureus ani komerční preparát polynaktinu nejsou v &SFR dostupné. Tetranaktin lze sice připravit chemickou syntézou (Schmidt a Werner, a?

J. Chem. Soc. Chem. Commun.-1986 /13/» 996*997), tento postup je však velmi pracný a nákladný a dává jen malé výtěžky požadované látky. Uvedené nevýhody byly odstraněny vypracováním nového pot3tupu podle vynálezu, jehož podstatou je, že k submersní kultuře mikroorganismu Streptomyces griseus se na začátku kultivace přidá propionan sodný a hydrogenfosforečnan draselný a po 96. hodinách fermentace se izoluje hotový produkt. Přídavkem propionanu je inhibována biosyntéza nonaktinu, monaktinu. a dinaktinu za současné stimulace tvorby trinaktinu a tetranaktinu. Přídavkem hydrogenfosforečnanu je eliminován inhibiční účinek propionanu na růst produkční kultury, což vede ke značnému zvýšení obou požadovaných makrotetrolidů. Způsob výroby biosyntetíckou cestou podle vynálezu je jednodušší než způsob výroby cestou chemickou, protože probíhá od začátku až do konce samovolně ve fermentační nádobě bez zásahu lidské ruky až do doby, kdy je izolován hotový produkt.

Způsob výroby podle předloženého vynálezu je zřejmý z dále uvedených příkladů;

Příklad 1

a) Příprava inokula

Kmen Streptomyces griseus J-24.9 (odvozený od půdního izolátu S. griseus LKS po opakované aplikaci UV světla) byl kultivován 10-dní při -teplotě 28 °C na šikmých agarech se sporulační půdou s kvasinkovým a sladovým výtažkem (Shirling o Gottlieb, Int. J. Syst. Bncteriol. 14, 313*340, 1966). Dobře vysporulované kultury byly uchovávány při 4 °C a používány k přípravě vegetativního inokula po dobu nejdéle tří měsíců.

Vegetativní inokulum bylo pěstováno na rotačním třepacím stroji (2,7 Hz) při teplotě 28 °C v 500 mL varných baňkách, plněných 60 mL fermentační půdy, která obsahovala 40 g rozpustného škrobu, 7/ g lihovarských výpalků a 5 g sušených kvasnic v IX vodovodní vody. Výchozí pH půdy po sterilisaci bylo 6,0 (před sterilisací bylo upraQ2' véno na 6,9*7,0). Celkový obsah anorganického fosfátu v půdě (stanovený metodou dle Weil-Malherbea a Greena, Biochem.

αϊ

ď. 49, 286*292, 1951) byl 2,5 mM. Půda byla naočkována inokulem z agarové kultury, obsahujícím přibližně 6. x 10^ spor. Vegetativní inokulum bylo kultivováno 24 hodin.

b) Příprava druhé vegetativní generace

Vlastní submersní kultivace podle vynálezu probíhala ve druhé vegetativní generaci na stejné fermentační půdě a za stejných podmínek jako při přípravě inokula po dobu 96 hodin. Kultury byly očkovány 3 ml vegetativního inokula.

c) Analytické stanovení makrotetrolidů

Po skončení kultivace bylo mycelium ze dvou paralelních kultur druhé vegetativní generace (120 mL fermentační tekutiny) odděleno centrifugací, promyto 50 mL destilované vody a extrahováno 2 x 50 mL methanolu a 1 x 50 mL směsi methanolu a chloroformu (1 : 1), Spojené extrakty (150 mL) byly po přidání 1 g křemeliny (Celit No. 545) odpařeny do sucha. Odparek byl extrahován 40 inL směsi chloroformu a methanolu (95 : 5) a extrakt přefiltrován. Zbylý sediment na filtru byl extrahován 40 téže směsi a extrakt přefiltrován. Oba filtráty byly spojeny a odpařeny do sucha. Odparek byl rozpuštěn v 10 ml dichlormethanu a 1 mX» roztoku byl použit pro kvantitativní spektrofotometrické stanovení (při 380 nm) celkového obsahu makrotetrolidů metodou dle Suzukiho a sp, (J. Antibiot. 24, 675*679, 1971), založenou na tvorbě komplexu těchto látek s pikranem sodným. Zbylých 9 mL roztoku bylo odpařeno do sucha a odparek byl rozpuštěn v 1 m/, směsi methanolu a chloroformu a/ (3 : 2). Roztok (1*5 /il, v závislosti na koncentraci makrotetrolidů ve vzorku) byl použit pro tenkovrstevnou chromatografii na deskách K.ieselgelg₀ (0,25 mm, 200 x 200 mm) v systému octan ethylnatý-chloroforin-dichlormethan (7:3:1) Po dvojím vyvíjení byl chromatogram postříkán koncentrovanou kyselinou sírovou a zahřát při 150 °C po dobu 10 minut. Kvantitativní poměr mezi složkami makrotetrolidového komplexu byl stanoven densitometričky na přístrojí Shimadzu CS-930 při 590 nm.

Za uvedených kultivačních podmínek dosahoval kmen

S. griseus J-249 průměrné produkce 626 mg makrotetrolidového komplexu v 1 L fermentační tekutiny. Tento komplex obsahoval nonnktin, monaktin, dinaktin a trinaktin v poměru 8 : 27 : 57 : 8.

o ty Oi-t ,/

d) Stanovení suché váhy mycelia

Pro zjištění absolutních hodnot nárůstu kultur byla stanovena suchá váha. mycelia-, promy-tého destilovanou vo7.

dou o zbavoného interferující přítomnosti makrotetrolidů opakovanou extrakcí^le postupu, popsaného v odstavci c)> Mycelium bylo sušeno na předem zvážených papírových filtrech dva dny při laboratorní teplotě (do dosažení konstantní iWtbjp).

Průměrná v4hp suchého myceli.fi z kultury, vyrostlé za podmínek, uvedených v odstavci b), byla 6,73 mg/1 mL.

Příklad 2

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že do kultur druhé vegetativní generace byl na počátku kultivace přidán sterilní vodný roztok hydrogenfosforečnanu draselného (1 mL) v koncentraci 46 mg /60 mL půdy. Celkový obsah anorganického fosfátu se tímto způsobem zvýšil (ve srovnání s údajem v příkladu 1) z 2,5 mM na 7.>0 mM.

Za těchto kultivačních podmínek dosahoval kmen

S. griseus J-249 průměrné produkce 732 mg makrotetrolidového komplexu v 1 L fermentační tekutiny, t^j. o 16,9 % více než za podmínek, uvedených v příkladu 1. Komplex obsahoval nonaktin, monaktin, dinaktin a trinaktin v poměkiw* o f/ι »£ f/ ru o : 26 : 58 ! 10. Průměrná váho suchého mycelia byla 7', 53 mg/1 mL, t.j. o 12,6 % vyšší než u kultur, pěstovaný clMle postupu v příkladu 1,

P ř í k 1 a d 3

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze' s tímrozdílem, že do kultur druhé vegetativní generoce byl no počátků kultivace přidán sterilní vodný roztok propionenu sodného (2 mL) v koncentraci 500 mg na 60 tnL půdy. Ve srovnání s údaji v příkladu 1 ee za těchto podmínek sice snížil celkový výtěžek makrotetrolidů no 353 mg na 1 fermentační tekutiny (tyj. o 43,7 %) zároveň ne však výrazně změnilo složení komplexu, který obsahoval monoktin, dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 3 : 9 : 32 : 56 (spolu se stopovým množstvím množstvím nonaktinu).

Průměrná suchá zváte/myče o 14,2 % nižší než u kultur, pěstovaných^dle postupu v příkladu 1.

lia byla 5,78 mg/1 mL., t7j ví ( DO

Příklad 4

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že do kultur druhé vegetativní generace byly na počátku kultivace přidány sterilní vodné roztoky propionanu sodného (2 mZ) v koncentraci 500 mg a hydrogenfosporečnanu draselného (1 mZ) v koncentraci 46 mg/ 60 m# fermentační půdy.

Za těchto kultivačních podmínek dosahoval kmen S. griseus J-249 průměrné produkce 577 mg makrotetrolidového komplexu v 1 L fermentační tekutiny, týj. jen \L· o 7,3 % méně než při postupu, uvedeném v příkladu 1, a o 35,7 % vice než za podmínek, uvedených v příkladu 3.

Komplex obsahoval dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 2 : 26 : 72. , fo β is-L f*

Průměrná p&ctBf suchého mycelia byla 6,82 mg/1 mL, o 1,3 % vyšší než u kultur, pěstovanýchMdle příkladu .1, o 17',9 % vyšší než u: kultur, získaných za podmínek, popsaných v příkladu 3·

a

P ř í k 1 a d 5

Kultivace byla provedena postupem, popsaným v příkladu 4 pouze s tím rozdílem, že fermentační půda byla rozplněna do 130 baněk po 100 m/, a do kultur druhé vegetativní generace, naočkovaných 5 m/ inokula, bylo přidáno 833 mg propionanu sodného a 76,7 mg hydrogenfosforečnanu draselného/100 mL půdy.

Po skončení kultivace byla fermentační tekutina (13 Ρ») zcentrifugována a oddělené mycelium bylo promyto destilovanou vodou (3 a extrahováno methanolem (4x2/) a směsí chloroformu a methanolu (1 : 1) (4x2/). Extrakty byly spojeny a po přidání Gelitu (30 g) odpařeny do sucha, Odparek byl extrahován směsí chloroformu a methanolu (95 : 5) (3 x 300 m/). Přefiltrované extrakty byly spojeny a odpařeny do sucha. Odparek (11,6 g) byl krystalován ze směsi hexanu a acetonu při teplotě -15 °C. Bylo získáno 1,6· g krystalické směsi makrotetrolidů. Matečný louh byl odpařen do sucha. K odparku byl přidán methanol (15 m/) a voda (200 m/). Emulsní 3měs byla zalkalisována hydrouhličitanem sodným a extrahována chloroformem (4 x 100 m/). Extrakt byl odpařen do sucha a odparek překrystalován z methanolu. Bylo získáno 1,8 g ki'ystalické směsi.

Celkový obsah makrotetrolidů, stanovený postupemSdle příkladu 1 v hrubém extraktu mycelia, byl 4»5 g. Výtěžek krystalického produktu po isolaci byl 3,4 g, t/j. 7/6 %.

Stajně jako v příkladu 4 nebyl v isolovaném produktu nalezen nonaktin a monaktin. Dinaktin byl přítomen jen ve stopovém množství. Hlavními složkami byly trinaktin a

X ~ tetranaktin v poměru 1 : 3. Jejich identita byla potvrzena hmot^sXní/ a NMR-spektrometrií ve srovnání s literárními vídají.

Přesto, že Streptomyces griseus není podle publikovaných údajů producentem tetranaktinu, způsobem předloženého vynálezu se podařilo získat tetranaktin ve vysokém výtěžku (za současného potlačení nežádoucích méně aktivních složek makrotetrolidového komplexu) i u tohoto mikroorganismu. Složení výsledného produktu (trinaktin a tetranaktin v poměru: 1 : 3> se stopovým množstvím dinektinu) je dokonce výhodnější než u komerčně vyráběného japonského preparátu polynaktinu, který obsahuje dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 1:4:5.

Obecná účinnost a využitelnost postupů, uvedených v příkladech 3 a 4, byla potvrzena také u osmi jiných kmenů S. griseus, produkujících makrotetrolidy, uchovávaných v Mikrobiologickém ústav.u ČSAV.

Claims

P&TEhJTOVÉ nároky fí-fr-M-Ž-T-—V-¥-N--Á-fc--B-Z·. U/

Způsob výroby inakrotetrolidových insekticidů trinaktinu a tetranaktinu obecného vzorce I

R, (i) kde R·^ “ θ&β /u -trinaktinu/ nebo CHgCH /te-t-etranaktinu-X a Rg ” ^R3 ^s ^4 “ CH^CHy biosyntetickou cestou, vyznačující se tím, že mikroorganismus Streptomyces griseus je pěstován za subinersních podmínek ve formenteční půdě se škrobem, lihovarskými výpalky a sušenými kvasnicemi, ke které bylo v nulté hodině kultivace přidáno 8,33 mg propionanu sodného a 0,77 mg hydrogenfosforečnonu draselného na 1 m$ půdy * ^Výsledný pro-/ y&ukt obsahuje trinakt-t-fi—a—tetranaktin v poaěru-í t 3/