CZ232998A3

CZ232998A3 - Použití Ribavirinu pro modulaci exprese lymfokinů, ošetření nevirových nemocí, nevirových podílů nemocí a použití analogů Ribavirinu

Info

Publication number: CZ232998A3
Application number: CZ982329A
Authority: CZ
Inventors: Robert Tam; Kandsamy Ramasamy; Devron Averett
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 1999-04-14
Also published as: DK0879056T3; RU2186569C2; HUP9900681A3; EP0879056A1; ES2172764T3; PT879056E; UA46815C2; SK100498A3; ATE216886T1; DE69712316D1; NZ330784A; DE69712316T2; PL187439B1; EP0879056A4; NO983372D0; HU220105B; CZ293584B6; AU1747897A; NO983372L; HUP9900681A2

Description

(54) Název přihlášky vynálezu:

Použití Ribavirinu pro modulaci exprese lymfokinů, ošetření nevirových nemocí, nevirových podílů nemocí a použití analogů Ribavirinu (57) Anotace:

Ribavlrin je podáván pacientovi s intenzitou dávek v rozmezí, které je účinné pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Detailněji, Ribavirin je použit pro potlačení Th2 zprostředkované reakce T bunék a podporu Thi zprostředkované reakce T buněk. Jeden nebo více analogů Ribarinu jsou v jeho jednom aspektu podávány pacientovi s intenzitou dávkování, která je účinná pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Analogy Ribavirinu mohou být použity pro potlačení nebo zvýšení Th 1 nebo th2 zprostředkovaných reakcí T buněk.

• ·

POUŽITÍ RIBAVIRINU® PRO MODULACI EXPRESE LYMFOKINÚ, OŠETŘENÍ NEVIROVÝCH NEMOCÍ, NEVIROVÝCH PODÍLŮ NEMOCÍ A POUŽITÍ ANALOGŮ RIBAVIRINU®

Oblast techniky

Vynález zahrnuje oblast výzkumu imunologie.

Dosavadní stav techniky

Lymfokiny představují skupinu polypeptidů náležící do řady cytokinů, t.j. molekul, které jsou podobné molekulám hormonů a mohou ovlivňovat řadu buněčných funkcí a aktivovat spojení mezi různými buňkami. Nedávný výzkum pomohl objasnit roli lymfokinů v imunitních reakcích. Produkce lymfokinů prostřednictvím stimulátoru CD4⁺ (a také v CD8⁺) T buněk často spadá do jednoho ze dvou fenotypů, Th1 a Th2, v jak v myším tak i lidském systému (Romagnani, 1991, Immunol Today 12: 256-257, Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol 7: 145-173). Th1 buňky produkují interleukin 2 (IL-2), faktor zvýšení odumírání tkáně (TNFa) a interferon gama (IFNx), tyto jsou především odpovědné za imunitu zprostředkovanou buňkami, takovou jako opožděný typ přecitlivělosti. Th2 buňky produkují interleukiny (ILinterleukin), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 a IL-13 a především se podílejí na zabezpečení optimální podpory humorální imunitní reakce, takové jako IgE a lgG4 přesun isotopiekých protilátek (Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol, 7: 145-173).

Silně polarizované Th1 a Th2 reakce nehrají různé role pouze v imunitních reakcích, ale mohou podporovat různé imunopatologické reakce. Th1-typ reakcí představuje diskutovanou specifickou autoimunitu orgánů, takovou jako experimentální autoimunní retinitida prostřední vrstvy oční koule (Dubey a spol., 1991, DEur cytokine network2: 147-152), experimentální autoimunní encefalitida (EAE) (Beraud a spol., 1991, Cell Immunol 133: 379389) a insulindependentní cukrovka (Hahn a spol., 1987, Eur J Immunol 18: 2037-2042), v kontaktní dermatitidě (Kapsenberg a spol., Immunol Today 12: 392 - 395) a při některých chronických zánětlivých onemocněních. Oproti tomu Th2-typ reakcí je zodpovědný za náchylnost k alergickým atopickým chorobám (proti běžným alergenům vnějšího okolí), takovým jako alergické astma (Walker a spol, 1992, Am Rev Resp Dis 148 : 109-115) a atopická dermatitida (van der Heijden a spol., 1991, J Invest Derm 97: 389-394), které jsou domněle znovu vyvolanými infekcemi protozou zůstávající v tkáních, takovými jako např. vyvolaná helminty (Finkelman a spol, 1991, Immunoparasitol Today 12 (Imunitní parasitologie dnes): A62-66) a Leishmania major (Caceres-Dittmar a spol., 1993, Clin Exp Immunol 91: 500 • · • fefe fe

až 505), které jsou přednostně vyvolané při jistých primárních deficitech imunity, takových jako hyper-lgE syndrom (Del Přete a spol, 1989, J. Clin Invest 84: 1830 - 1835) a OmennÓs syndrom (Schandene a spol., 1993, Eur J Immunol 23: 56-60) a jsou spojovány se sníženým hyper-lgE syndromem (Del Přete a spol., 1989, J Clin Invest 84: 1830 - 1835) a OmennÓs syndromem (Schandene a spol., 1993, Eur J Immunol 23: 56 - 60( a se snížením schopnosti potlačit HIV replikaci (Backer a spol, 1995, Proč Soc Nat Acad Sci USA (Akademie věd USA) 92: 11135- 11139).

Je tedy jasné, že modulace profilů lymfokinů výše uvedených stavů nemocí bude terapeuticky výhodná. Podpora Th1 reakce bude nejpravděpodobněji vést ke změně Th2 fenotypů a naopak. Monoklonální protilátky (mAb) k lymfokinům, lymfokiny samotné a jiná činidla, taková jako antioxidační činidla založená na thiolu (Jeannin a spol., 1995, J Exp Med 182: 1785 1792) se projevily jako měnící patogenezi určitých chorob potlačením cytokinových typů podporujících chorobu, jak Th1 neboTh2. Např. intacelulární infekce způsobené prvoky jsou omezeny pomocí IFN%, ale znovu vyvolány působením IL-4, zatímco infekce vyvolané nematocidy jsou kontrolovány pomocí IL-4 a znovu vyvolávané IFN% (Heinzel a spol., 1989, J. Exp Med 162: 59 - 72, Else a spol., 1994, J Exp Med 179: 347 - 351). Insulin dependentní cukrovka u NOD myší a EAE u myší a krys může být zlepšena ošetřením pomocí IL-4 nebo anti- IFN% mAb ještě před plným rozvinutím choroby (Rapoport a spol., 1993, J. Exp Med 178: 87 - 99, racke a spol., 1994, J Exp Med 180: 1961 - 1966, Campbell a spol., 1991, J. Clin Invest 87. 739 - 742). Dodatečně, autoimunní vštěp oproti hostitelské chorobě (GVHD), který je charakterizován syndromem podobným lupus erythematodes, je spojován s Th2 produkcí lymfokinů a je tlumen prostřednictvím IL-4 protilátky (Umland a spol., 1992, Clin Immunol Immunopathol 63: 66 - 73). Na druhé straně Th1 cytokiny jsou produkovány při akutním GVHD, ve kterém dárcovské CD8⁺ T buňky se vyvíjí do CTL a narušují hostitelský imunní systém. Ošetření s anti-IFN% nebo anti-TNFa mAb zlepšuje chorobu a ošetření s anti-IL-2 mAb mění akutní GVHD na autoimunní GVHD (Via a Finkelman, 1993, Int Immunol 5: 565 - 572). Klinické zkoušky vlastností a rekombinantu IL-2 při ošetření HIV infikovaných pacientů bylo ve vývoji od roku 1983 (Volberding a spol, 1987, AIDS Res Hum Retroviruses, 3: 115 - 124). Souvislost zde přichází ze skutečnosti, že vývoj AIDS byl označen jako spojovaný se zvýšením typu produkce lymfokinů (Clerici a Shearer, 1994, Immunol Today 15: 575 - 581). Během doby progrese choroby vzniká u infikovaného jednotlivce snížená exprese Th1 lymfokinů, takových jako IL-2 (Maggi a spol., 1987, Eur J Immunol 17: 1685 - 1690, Gruters a spol., 1990, Eur J Immunol 20: 1039 - 1044, Clerici a spol., 1993, J Clin Invest 91: 759 - 765), průvodní jevy a zvýšená produkce Th2 lymfokinů, takových jako IL-4 a IL-10 (Clerici a spol., 1994, J Clin Invest. 768-775, Hoffman a spol., 1985, Virology 147. 326 - 335). T-buňky z asymptomatického nebo dlouho trvajícího ošetření s IL-2 zvýšily jejich anti-HIV účinky,

I ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · ··· · · zatímco vliv IL-4 nebo IL-10 snížil jejich schopnost potlačit HIV replikaci a produkovat IL-2 (Barker a spol., 1995, Proč Soc Nat Acad Sci USA 92: 11135 - 11139).

Tyto běžná imuno modulační terapeutika (mAbs a rekombinant cytokinů) však nejsou neomezená. Např. při vleklém ošetření monoklonální protilátkou vyvíjí hostitelská fauna protilátky proti monoklonálním protilátkám, tímto omezují jejich plnou použitelnost. Byly vyvinuty „humanizované“ monoklonální protilátky, které zjevně snižují riziko vyvolané imunitní reakce na tyto mAbs. Avšak, tyto látky se stále ještě vyvíjí a nové mAbs v dodatku ponechávají značné proteiny a proto mohou nastat potíže při dosažení jejich cílových lokalizací. Terapeutika založená na cytokinech jsou také limitována. Např. IL-2 ošetření autoimunní GVHD vede u myší ke vzniku akutní GVHD.

Ribavirin® (1-b-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazoI-3-karboxamid) je syntetický nukleosid schopný zamezit replikaci RNA a DNA virů (Huffman a spol., 1973, Antimicrok. Agents Chemother 3 (Antimikrobiální činidla chemoterapie) : 235, Sidwell a spol., 1972, Science 177: 705). Máme ověřené poznatky z dalších pozorování, ve kterých autoři podotýkají, že Ribavirin®, v dodatku k jeho protivirovým účinkům má vliv na jisté umunitní reakce (přehled Jalley a Suchil, 1984, Clinical Applications of Ribavirin® (Klinické aplikace Ribavirinu®): str. 93 - 96). Máme také ověřeny poznatky z jiných pozorování, že Ribavirin® ovlivňuje proliferaci mitogen- a antigen aktivovaných T a B lymfocytů. (Tam a spol., 1995 (údaje nejsou uvedeny), Peavy a spol., 1980, Infection and Immunity 29 (Infekce a imunita): 583 - 589) a dále, pokud je kombinovaný s cyklosporinem, Ribavirin® projevuje účinky na dlouhodobé přežívání aloimplantátu, Jolley a spol., (1988, Transplantation Proč 20 (transplantace Proč). 703 - 706).

Dodatečně máme pozoruhodně pokročilý předběžný výzkum díky demonstrace, že Ribavirin® alespoň zčásti moduluje typ cytokinů imunitní reakce podporou Th1 reakce a potlačením Th2 reakce. Z pohledu do minulosti, tento objev není v rozporu s předběžným výzkumem. Za prvé, Ribavirin® je znám pro svoje útlumové účinky na obě funkční humorální imunitní reakce (Peavy a spol., 1981, J Immunol 126. 861 - 864, Powers a spol., 1982, Antimicrob Agents Chemother (Antimikrobiální chemoterapeutická činidla) 22:108 - 114) a IgE-zprostředkovanou modulaci vylučování žírných buněk (Marquardt a spol., 1987, J Pharmacol Exp Therapeutics (Časopis farmakologických experimentálních terapeutik) 240: 145 - 149, (obě Th2 lymfokin zprostředkované jevy)). Za druhé, Ribavirin® antagonizuje protivirové účinky azidothymidinu (AZT) na okrajové krevní lymfocyty u HIV pacientů (Vogt a spol., 1987, Science (Věda) 235: 1376 - 1379). Tento objev je pozoruhodný, protože AZT snižuje IL-2 receptory (II-2R), ale ne IL2 expresi (Viora camponeschi, 1995, Cell Immunol (Imunologie buněk) 163: 289 - 295). Je proto možné, aby Ribavirin® antagonizoval AZT modulací IL-2 exprese a zvýšením snížených úrovní IL-2R. Za třetí, ošetření Ribavirinem® imuno-oslabených pacientů pro chronické GVHD (Th2 - zprostředkovaná porucha) vede k dramatickému rozkladu nemoci, výsledek, který nenastává s běžnými imunosupresívními terapiemi, takovými jako cyklosporin a glukokortikoidy • · ··· · (Cassano, 1991, Bone Marrow Transplantation (Transplantace kostní dřeně) 7: 247 - 248). Konečně, ošetření Ribavirinem® (jeden rok) pacientů pro hepatitidu C (HCV) odhaluje méně nakupenin lymfocytů a mnohem menší poškození jater než kontrolou Placebem (Dusheiko a spol., 1994, Hepatology 20: 206A). Tento výzkum může odrážet skutečnost, že ačkoliv převládající imunitní reakce na hepatitidu C je zprostředkovaná Th1 lymfokiny, T buňky Th0/Th2 fenotypu mohou být infikovány HCV (Zigneco a spol., 1994, datum neuvedeno) a tato infekce může způsobit další destrukci hepatocytů zprostředkovanou protilátkou.

Podstata vynálezu

V souhlasu s jedním aspektem předloženého vynálezu je nukleosid Ribavirin®® podáván pacientovi s intenzitou dávek, která je efektivní pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Vysvětleno podrobněji, Ribavirin®® je použit pro potlačení Th2 zprostředkované reakce T buněk a podporu Th1 zprostředkované reakce T buněk.

Ribavirin® je použit podle vynálezu pro léčbu nevyrovnaností exprese lymfokinů místo podávání Ribavirinu®®, který je velmi dobře znám pro jeho antivirové účinky. Tyto nevyváženosti mohou být shledány jako průvodní jevy alergických atopických nemocí, takových jako alegiské astma a atopická dermatitida, infekce z helmintů a leischmaniózy a různých prvotních a druhotných deficitů imunity, které mohou nebo nemusí být spojeny s virovou infekcí.

V souladu s dalším aspektem předloženého vynálezu je jeden nebo více analogů Ribavirinu® podáváno pacinetovi s intenzitou dávek, která je efektivní pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Analog(y) Ribavirinu® mohou být použity pro potlačení nebo zvýšení Th1 nebo Th2 zprostředkovaných reakcích T buněk.

Ve svém výhodném celku je Ribavirin® podáván pacientovi ústně s intenzitou dávek, která dosahuje úrovně krevního séra mající průměrné hodnoty 0,25 až 12,5 mg/mí a nejvýhodněji průměrně 2,5 mg/ml. U běžných jednotlivců je tato optimální úroveň séra vymezena přibližně

4,5 mg/kg/den hmotnosti těla, která může být podávána s intenzitou dávek od 200 až 1200 mg. Výhodná dávkování jsou rozdělena do několika menších dávek, které jsou následně podávány během celého dne.

Ribavirin® byl na trhu již několik let, a proto je mnoho způsobů dávkování a forem podávání známo a všechny vhodné intenzity dávek a způsoby podávání mohou být použity. Např. Ribavirin dotečně k ústnímu podávání může být podáván intravenózně, intramuskulárně, intraperitoneálně, místně a podobně, všechny způsoby, které jsou známé, mohou být použity. Farmaceutické formulace obsahující Ribavirin® mohou také obsahovat jeden nebo více farmceuticky akceptovatelných nosičů, které mohou zahrnovat masťové základy, takové jako stabilizátory (podporující dlouhodobé skladování), emulgační prostředky, pojivá, wl O|5.5 A»- e zahušťovadla, soli, ochranná činidla, rozpouštědla, disperzní prostředky, nánosy, antibakteriální a protiplísňová činidla, isotonická a absorpční útlumová činidla a podobné. Použití takových prostředků nebo činidel pro farmaceutické aktivní substance je dobře známé ze současného stavu techniky. Kromě prostředků nebo činidel, které jsou s Ribarinem® neslučitelné, je uvažováno jakékoliv použití těchto prostředků a činidel v terapeutických prostředcích a přípravách. Přídavné aktivní příměsi mohou být také inkorporovány do uváděných prostředků a příprav.

Ribavirin®, dodatečně k terapeutickému použití Ribavirinu® uvažovanému podle vynálezu, může být také použit jako laboratorní nástroj pro studium absorpce, distribuce, absorpce buněk a působení.

Bylo také shledáno, že několik analogů Virazolu (dříve známých a neznámých), které byly dříve zamítnuty pro jejich minimální účinky, také projevují výrazné cytokinické účinky. Náš výzkum ukazuje, že existuje několik tříd analogů Virazolu majících tyto účinky, příklady jsou uvedeny následně v textu pod označením „Analogy Ribavirinu®“. Tyto příklady jsou zaměřeny na charakteristiku pozicí, ve kterých Virazol může být modifikován pro získání aktivních prostředků, tento objev nebude tedy limitován znázorněnými specifickými modifikacemi. Je také zvažováno, že tyto modifikace mohou být aplikovány se standardní D formou Virazolu, stejně jako se L formou Virazolu.

Přehled obrázků na výkresech

Tabulka 1 ukazuje klidové a PMA/jonomycinem aktivované úrovně lymfokinů, IL-2, IL-4. TNFa IFN% (pg/ml) v 48 a 72 hodinách, měřeno v extracelulárních supernatantech, a experesi buněčného povrchu IL-2 (IL-2R) a IL-4 (IL-4R) receptorů (průměrná intensita fluorescence kanálků) z lidských T buněk.

Obrázek 1 ukazuje grafické znázornění vlivu Ribavirinu® a interferonu a na extracelulární expresi IL-2, IL-4, TNFa a IFN% v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech. Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta zvýšení exprese lymfokinů následně po ošetření pouze PMA/jonomycinem.

Obrázek 2 je grafickým znázorněním vlivu 2, 10 nebo 50 mM Ribavirinu® za přítomnosti 2000 U/ml interferonu a (levá část) a vlivu 500, 1000 nebo 2000 U/ml interferonu a (pravá část) za přítomnosti 10 mM Ribavirinu® na extracelulární expresi IL-2 (A a C) a IL-4 (B a D) v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech.

Obrázek 3 je grafickým znázorněním vlivu Ribavirinu® a interferonu a na IL-2, IL-4 a IFN% mRNA expresi v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech.

Obrázek 4 je grafickým znázorněním vlivu Ribvirinu® a interferonu a na expresi buněčného povrchu IL-2 a IL-4 receptorů v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech. Výsledky jsou ·· ta · ·· • ta· · · · · · • · · · · ·· ·· ·· vyjádřeny jako procenta zvýšení exprese receptorů lymfokinů následně po ošetření pouze PMA/jonomycinem.

Obrázek 5 je grafickým znázorněním exprese intracelulární IL-2 exprese v klidových (A a E) nebo aktivovaných CD4⁺ (horní část) nebo CD8⁺ (dolní panel) T buňkách ošetřených pouze PMA/jonomycinem (B a F) nebo za přítomnosti 10 mM Ribavirinu® (C a G) nebo 5000 U/ml interferonu a (D a H). Údaje z jednoho experimentu jsou ukázány a vyjádřeny jako procenta buněk projevujících dvojí pozitivní zbarvování pokud se jedná o IL-2 a GD4 nebo CD8.

Obrázek 6 je grafickým znázorněním pozorovaných Robavirin® analogů.

Obrázek 7 je souborem grafů znázorňujících výsledky různých koncentrací Ribavirin® analogů na IL-2, TNF a, IFN χ, IL-4 a IL-5.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Typy buněk a purifikace T buněk

Okrajové krevní mononukleární buňky (PBMC) byly isolovány ze žlutočervené vrchní vrstvy použitím Ficoll-Hypaque centrifugace s hustotním gradientem z 60 ml krve od zdravých dárců. T-buňky byly následně purifikovány z PBMC použitím Lymphokwik isolačního činidla lymphocytů specifického pro T-buňky (LK-25T, One Lambda, Canora Park CA). Průměrný výnos 40 až 60 x 10⁶ T-buněk byl následně podroben inkubaci přes noc při teplotě 37 °C v 20 až 30 ml RPMI-AP5 (PRMI-1640 médium (ICN, Costa Mesa, CA) obsahující 20 mM HEPES útlumového roztoku, pH 7,4, 5 % autologní plazma, 1 % L-glutaminu, 1 % penicilin/streptomycin a 0,05 % 2-merkaptoethanol) pro odstranění jakýkoliv nečistot ulpěných na buňkách. T-buňky byly ve všech zkouškách promyty RPMI-AP5 a následně umístěny do mikrotitračních desek (plátů) s 96 otvory (komůrkami) s koncentrací buněk 1 x 10⁶ buněk/ml.

Příklad 2

Aktivace T-buněk a léčka Ribavirinem®

T-buňky byly aktivovány dodáním 500 mg jonomycinu a 10 mg forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) a podrobeny inkubaci po dobu 48 až 72 hodin při teplotě 37 °C. T-buňky aktivované PMA/jonomycinem byly ošetřeny 0,5 až 50 mM Ribavirinu® nebo 250 až 10.000 U/ml kontrolního antivirového interferonu a (Accurate, Westbury, NY) ihned po aktivaci a znovu ošetřeny po 24 hodinách. T-buňky z každého plátu byly použity pro

Ί • ·· ·· ·· • · · · · • · · • · · · • · · ·· ···· · ·· ·· • · · · · • · · ·· • · ··♦ · · imunofluorescenční analýzu a supernaíanty použité pro extracelulární měření cytokinů. Následně po aktivaci bylo 900 ml buněčného supernatantu z každého mikroplátu přeneseno na jinou mikrodesku pro analýzu produkce cytokinů pocházejících z buněk. Buňky byly následně použity v imunofluorescenční analýze, kterou byly zjištěny úrovně intracelulárních cytokinů a exprese receptorů cytokinů.

Příklad 3

Analýza extracelulárních cytokinů

Koncentrace lidských cytokinů pocházejících z buněk byly určeny v buněčných supernatantech z každého mikroplátu. Aktivací vyvolané změny úrovní interleukinů-2 (IL-2) byly určeny použitím obchodně dostupného prostředku ELISA kit (R & D systems Quantikine kit, Minneapolis, MN) nebo biologickou zkouškou použitím IL-2 odvozených typů buněk, CTLL-2 /ATCC, Rockville, MD). Aktivací vyvolané změny úrovní intrleukinů-4 (IL-4), faktoru zvýšení odumírání tkáně (TNFa) interleukinů-8 (IL-8) (R & D systems (Quantikine kit, Minneapolis, MN) a interferonu χ (IFN χ) (Endogen (Cambridge, MA) byly určeny použitím ELISA kitů. Všechny výsledky získané použitím ELISA byly vyjádřeny v pg/ml a použitím CTLL-2 biologického testu v počtech za minutu vyjadřujících celulární inkorporaci ³H-thymidinu závislou na IL-2 (ICN, Costa Mesa, CA) podle CTLL-2 buněk.

Příklad 4

Studia přímé imunofluorescence (Receptory cytokinů)

Buňky, pro účely přímého zabarvování povrchových buněčných antigenů protilátkami konjugovanými fluorescencí, byly dvakrát promyty isotonickým rozpouštědlem solného roztoku, pH 7,4 (Becton Dickinson, Mansfield, Ma), resuspendovány v 50 ml isotonického rozpouštědla solného roztoku a rozděleny do dvou vzorků. Jedna část vzorku byla zabarvena buď s PE-anti CD25/FITC-anti CD4 nebo s PE-krysí anti myši IgG + anti-CDw124/FITC-anti CD4 mAb a nespecifikovaná fluorescence byla vyhodnocena zabarvením druhé části s PE/FITCoznačenou kontrolní monoklonální protilátkou upravenou jako isotyp. Všechny monoklonální protilátky označené fluorescencí byly získány od Bectom Dickinson (San Jose, CA) až na antiCDw124, který byla získána od Pharmingen, San Diego, Ca. Inkubace byly provedeny při teplotě 4 °C v temnotě po dobu 45 minut použitím saturačních mAb koncentrací. Nezaregistrovaný štítek byl odstraněn omytím v PBS dříve než byla provedena analýza s FACScan průtokovým cytometrem (Becton Dickinson).

Hustota antigenů byla přímo určena v protékajících živých CD4⁺T buňkách a vyjádřena jako střední hodnota fluorescence (MCF). Povrchová exprese specifických antigenů (CDw124, CD25) byla představena jako střední hodnota změny (MCS) získaná odečtením MCF FITCnebo PE- označených upravených na isotyp (lgG1) kontolních mAb-zabarvených buněk od MCF FITC- nebo PE-označených antigen-specifikovaných mAb zabarvených buněk. Alternativně, povrchová exprese CD4⁺-podmnožiny buněk zabarvených s CD28 mAb byla určena odečtením MCF CD28⁺ CD4⁺ od MCF CD28' CD4' buněk..

Životaschopnost kontrolních neošetřených buněk a buněk ošetřených Ribavirinem® a interferonem α byla určena v každé dávce všech oligonukleosidů od četných dárců zabarvením vitálním barvivém, propidium-jodidem (5 mg/ml konečná koncenrace). Procentický podíl živých buněk, které vylučují propidium-jodid, byl určen průtokovou cytometrií a byl > 90 % (rozmezí 90 až 99 %) u ošetření se všemi použitými koncentracemi.

Příklad 5

Analýza imunofluorescence iníracelulární exprese cytokinů

Pro analýzu intracelulární exprese IL-2 v CD4⁺ a CD8⁺ T buněčných podmnožin byly T buňky nejdříve ošetřeny poslední 4 hodiny ze 48 až 72 hodin aktivace s 10 mg Brefeldin A (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) pro minimalizaci sekrece nově syntetizovaných IL-2 do extracelulárního prostředí. Následně po aktivaci, 900 ml buněčného supernatantu z každého mikroplátu bylo přemístěno na jinou mikrodesku pro analýzu produkce cytokinů odvozených z buněk. Před přímým zabervením (30 min., 4 °C, v temnotě) s FITC konjugovanými protilátkami buněčných antigenů povrchu, CD4 a CD8, buňky byly promyty dvakrát isotonickým ředidlem solného roztoku, pH 7,4 a resuspendovány v 100 až 150 ml zabarvovacího útlumového roztoku (fosfátový tlumený roztok, pH 7,4 obsahující 1 % fetálního telecího séra (FCS) (Hyclone, Logn, UT) a 0,1 % azidu sodného) a rozděleny na dva vzorky. Obarvené buňky byly promyty v 1 ml zabarveného tlumivého rozotku a peletky buněk byly resuspendovány v 100 ml ustalovacího roztoku (4 % paraformaldehyd v PBS), následovalo odsávání supernatantu. Ustálené buňky byly ponechány 20 minut při teplotě 4 °C, následně promyty v 1 ml zabarveného tlumivého roztoku a peletky buněk byly resuspendovány s promícháním v 50 ml rozpustného tlumivého roztoku (0,1 % aponin (ICN, Costa Mesa, CA) v PBS). Pórovité buňky byly obarveny PE-označenou IL-2 protilátkou při teplotě 4 °C po dobu 30 minut v temnotě a následně promyty v 1 ml tlumivého roztoku upravujícího propustnost, resuspendovány v 250 ml zabarvujícího tlumivého roztoku, následovala FACS analýza.

• · > 99 99

9 · 9 « • · · · · • · 999 9 « • 9 9 « » ·· ··

Příklad 6

Analýzy mRNA cytokinů

Celková RNA byla oddělena z klidových T buněk a buněk ošetřených Ribavírinem® a interferonem a a neošetřených aktivovaných T buněk použitím obchodních variant guanidium thiocyanát/fenol extrakčních technik (Trizol činidlo (GIBCO/BRL)). RNA byla promyta 70 % ethanolem a konečně resuspendována v 10 μΙ DEPC upravené vody.

cDNA reakce syntézy byla provedena pomocí instrukcí výrobců (Promega, Madion, WI). 1pg celkové RNA byl rychle zahřán na teplotu 65 °C po dobu 10 minut a ochlazen ledem před sloučením s 2 μΙ lOXtlumivého roztoku zpětné transkripce (100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 500 mM KCI, 1 % Triton X-100), 5 mM MgCI, 2 μΙ 10 mM dNTPs (1 mM každé dNTP), 0,5 μΙ Rnase útlumového prostředku, 1 μΙ oligo (dT)₁₅ priméru (0,5 pg/pg RNA) a 0,65 μΙ AMV zpětné transkriptázy (H. C.). Reakce byla inkubována při teplotě 42 °C po dobu 1 hodiny, dále při teplotě 95 °C po dobu 10 minut a 5 minut na ledě.

PCR reakce byla provedena použitím GeneAmp PCR kitu (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, Ca). RT reakční směs (3 μΙ) byla v nové zlumavce sloučena s 5 μ110 X PCR tlumivého roztoku (500 mM KCI, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCI₂ a 0,01 % (w/v) želatiny), 1 μΙ 10 mM dNTP a 1 U taq DNA polymerátu. Použité priméry byly následující: interleukin-2, interleukin-4, interferon-g (lidský) priméry (Stratagene, La Jolla, CA) a PHE7 ribozomální gen. Podmínky zesílení byly 45 sekund při teplotě 94 °C, 1 min při teplotě 57 °C a 2 minuty při teplotě 72 °C pro 35 cyklů, následovalo 8 minut při teplotě 72 °C. PCR produkty byly analyzovány v 2 % gelu agarózy obsahujícím ethidiumbromid. Podle elektroforézy byly produkty PCR přemístěny na Hybond N+ membránu (Amersham, Arlington Heights, IL) v 20 X SSC přes noc a zbaveny pohyblivosti použitím 0,4 m NaOH. Skvrny byly hybridizovány s ³²Ρ-χΑΤΡ označenými oligonukleotidovými sondami v Rapid-hyb tlumivém roztoku (Amersham) po dobu 1 hodiny při teplotě 42 °C. Každá cytokinová směs primérů byla použita jako sonda značená radioaktivním izotopem (podle instrukcí). Ekvivalentní dávka byla testována prostřednictvím hybridizace sondou vyvinutou z pHE7 testovacího priméru. Promyté kapky byly následně analyzovány použitím Phosphorlmageru.

9« ·· • · · · • · · • 9 · • · 9

9999

• 9 9 9 • 9 9 · ·

9 9 • * 9 ·

Příklad 7

Vliv Ribavirinu® na úrovně extracelulárních cyíokinů v aktivovaných T buňkách

Ošetření PMA/jonomycinem (48 až 72 hodin) lidských T buněk látkově zvýšilo úroveň všech analyzovaných cytokinu, tj. IL-2, IL-4, TNFa, IFN% (tabulka 2). První číslo v každé buňce ukazuje aritmetický průměr a čísla v kulatých závorkách znázorňují relevantní rozmezí, N = 4. V předložené zkoušce znázorněné na obrázku 1 dodání Robavirinu® s intenzitou dávkování 0,5 až 50 mM zvyšuje aktivované úrovně Th1 cytokinů, IL-2 a TNFa maximálně v 5 mM (30 %) a 20 mM (36 %), jednotlivě. Oproti tomu interferon-a tlumil IL-2 a TNFa expresi způsobem závislým na dávkování (rozmezí 250 až 10.000 U/ml, maximální útlum 33 % a 38 %, jednotlivě) v porovnání s úrovněmi v neošetřených aktivovaných T buňkách. Dodatečně, Ribavirin® zprostředkoval souhlasný pokles v aktivovaných úrovních Th2 cytokinu, IL-4 (mezní útlum 74 % v 2 mM), zatímco interferon-a maximálně snížil extracelulární IL-4 kolem 26 % (10.000 U/ml). Použití kombinací Ribavirinu® a interferonu a, obrázek 2 ukazuje, že konstantní množství 2000 U/ml interferonu a potlačilo přírůstek Ribavirinu® závislý na dávkování aktivovaných IL-2 úrovní (A) a zvrátil útlum aktivovaných IL-4 úrovní ( C). Podobně, konstantní množství 10 mM Ribavirinu® zvrátilo útlum zprostředkovaný interferonem a závislý na intenzitě dávkování aktivovaných IL-2 úrovní (B) a potlačil zvýšení aktivovaných IL-4 úrovní (D).

Příklad 8

Vliv Ribavirinu® na úroveň cytokinů mRNA v aktivovaných T buňkách

Tyto protichůdné vlivy Ribavirinu® a interferonu-a na aktivované úrovně extracelulárních cytokinů byly také pozorovány v úrovni transkripce. Obrázek 3 znázorňuje, že ošetření PMA/jonomycinem lidských T-buněk látkově zvyšuje IL-2, IL-4 a !FN% mRNA úrovní. Ošetření Ribavirinem® (2,5 a 10 mM), následně po aktivaci T buněk, zvýšilo IL-2, snížilo IL-4 a nemělo žádný vliv na IFN% mRNA. Oproti tomu interferon a v 100, 2000 a 5000 U/ml snížil IL-2, zvýšil IL-4 a snížil IFN% mRNA. Jednotlivé vlivy Ribavirinu® a interferonu a závislé na intenzitě dávkování na IL-2, TNFa a IL-4 mRNA exprese se tedy shodovaly s analýzami ELISA: Tyto data ukazují, že Ribavirin® podporuje syntézu Th1 cytokinů, IL-2 a TNFa a potlačuje expresi Th2 cytokinů, IL-4 v aktivovaných lidských T buňkách.

• ·

Příklad 9

Vliv Ribavirinu® na úrovně receptorů IL-2 a IL-4 v aktivovaných T buňkách

Použitím FACS analýzy jsme porovnali vlivy Ribavirinu® a interferonu a na expresi IL-2 (CD25) a IL-4 (CDw124) expresi receptorů v aktivovaných T buňkách. Ošetření PMA/jonomycinem zvyšuje CD25 a CDw124 expresi z klidových úrovní 50,16 ± 0,45 a 62,31 ± 1,46 na aktivované úrovně 162,48 ± 2,89 a 87,53 ± 3,98, jednotlivě (n = 4). Podle tří předložených experimentů obrázek 4 ukazuje, že Rivabirin® (1 až 50 mM) má malý vliv na aktivované úrovně IL-2 a IL-4 receptorů, zatímco interferon a s intenzitou dávkování 250 až 10.000 U/ml snižuje IL-2 expresi receptorů a zvyšuje IL-4 expresi receptorů způsobem závislým na dávkování v porovnání s úrovněmi receptorů v kontrolních aktivovaných T buňkách. Tyto údaje tedy ukazují, že vliv Ribavirinu® na syntézu cytokinů působí nezávisle na expresi receptorů cytokinu. Oproti tomu, vliv ošetření interferonem a na IL-2 a IL-4 receptory koreluje s pozorováním jejich vlivu na aktivované IL-2 a IL-4 exprese.

Příklad 10

Vliv Ribavirinu® na intracelulární IL-2 úrovně v CD4 a CD8+ podmnožinách aktivovaných T buněk

Testovali jsme, zda vliv Ribavirinu® na IL-2 expresi byl specifický k CD4' nebo CD8⁺ T buňkám. Intracelulární IL-2 exprese v ustálených a propustných aktivovaných T buňkách byla určena dvoubarevnou průtokovou cytometrií použitím fluorescenčně označených protilátek na CD4 nebo CD8 a na IL-2. Obrázek 5 znázorňuje, že pň ošetření Ribavirinem® v 10 mM roste procentický podíl CD4⁺ T buněk vyjadřujících IL-2 z 82 % na 91 % a procentický podíl CD8⁺vyjadřující IL-2 se zvyšuje z 81 % na 91 %. Oproti tomu procentický podíl GD4⁺ buněk vyjadřující IL-2 a CD8⁺ buněk vyjadřující IL-2 při ošetření interferonem a (5.000 U/ml) byl 81% a 71 % jednotlivě. Tyto data ukazují, že Ribavirin® má vliv na intracelulární IL-2 expresi, který nerozlišuje mezi CD4⁺ nebo CD8⁺ T buněčnými podmnožinami Oproti tomu ošetření interferonem a má malý vliv na CD4⁺ T buňky a stejnoměrně snižuje IL-2 expresi v CD8⁺ T buněčné podmnožině.

• ·

4« ·· 4 ·· • 4 · « ·· · · • · « · · · • · 4 4 · · ·

-4 O ··· 4 4 4

I £. «· · ·4· ·· 4 »4

Příklad 11

Analogy Ribavirinu®

Existuje několik tříd analogů Ribavirinu®, které jsou uvažovány jako klinicky efektivní při modulaci Th1 nebo Th2 zprostředkovaných reakcích T buněk. Tyto zahrnují molekuly spadající do genetického vzorce obrázku 6, ve kterém X je O, S, CH₂, CHOH nebo N-CO-R^; A, B a C jsou nezávisle N, P, CH, C-OH, C-CH₃, C-alkyl, C-alkenyl, C-CH₂, -CN, C-halogen, C-CN, CCOQCHa, C-NH₂, C-SNH_2i C-SO₂-NH_2i C-CONH₂, C-CS-NH_2i C-C(NH)NH_2i CPO2-NH₂ nebo Cheterocyklický kruhový systém; D je S, Se, Te, PH, NH nebo NR₁₂; R₄ je H, (CH₂)p(OH), halogen, CN, (CH₂)pONH₂, (CH₂)pNH_2l CH₃, CH₂SPH nebo (CH₂)-heteroeyklický kruh; R₂ je H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, halogen, CN, NH_2i ONH_2i NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃ nebo COOMe; R₃, R_4i R_5i R_6i R₇ a R₈ jsou nezávisle H, OH, OCH₃, SH, SCH₃, halogen, CN, NH₂, ONH₂, NHCH₃, (CH₂)OH, (CH₂)pNH₂, CH₃, COOMe nebo fenyl; R₉ je H, halogen, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH₂, SO₂NH₂, PO₂NH₂, (CH₂)p, (CH₂)p-heterocyklický kruhový systém nebo (CH₂)p-glukóza; R₁₀ je H, halogen, NH₂, CH₃, CONH, CSNH₂, COOMe, SNH_2iSO₂NH₂, PO₂NH_2i (CH₂)p, (CH₂)p-heterocyklický kruhový systém, (CH₂)p-glukóza, O-CH₃, 0CH₂CH₃ nebo amino kyselina; Y je O, S, NH-HCI, NOH, N0CH₃ nebo NOCH₂PH; R₁₀ & Y v kombinaci jsou heterocyklické kruhové systémy takové jako thiazol, imidazol, atd.; Rn je CH₃(CH₂)pNH₂, (CH₂)p-heterocyklický systém, (CH₂)p-amino kyselina nebo (CH₂)p-eukr (glukóza, atd.); p je celé číslo od O do 8; a výše uvedené zahrnují jak L typ tak i D typ nukleosidů.

Tyto molekuly mohou být vyrobeny podle jednoho nebo více z následujících typických schémat.

1. Syntéza ICN1369 (pyrazomycin): Metodologie syntézy této sloučeniny je popsána v následujících citovaných dokumentech; (a) J. Farkas, Z. Flegelova a F. Sorm, Tetrahedron Letts., 22, 2279(1972); (b) S. De Bernardo a M. Weigele, J. Org. Chem. (Časopis organické chemie), 41, 287(1976); ( c) J. G. Buchanan, A. Stobie a R. H. Wightrnan, J. Chem Soc Chem. Commun, 916(1980); N. Karagiri, K. Takashirna, T. Haneda a T. Kato, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 553(1984).

2. Syntéza ICN3438 (1-3-D-xylofuranosyl-1,2,4-triazol-3-barboxamid); Syntéza této sloučeniny byla provedena podle následující procedury popsané v J. T. Witkowski, M. Fuertes, P. D. Cook a R. K. Robins, J. Carbohydr. Nucleosides (Karbohydrátové nukleosidy), Nukleosidy 2(1), 1(1975)).

3. Syntéza ICN3844 (1-(5-O-sulfamoyl-3-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazol-3-karboxamin): Sloučenina byla připravena podle procedury popsané v G. D. Kini, Β. M. Henry, R. K.

• ·

9«

	• 9	9 99		99	• 9
•	« 9	99 9	9	• 9	9	•
•	•
•	• ·	9 9	9	9 999	•	9
•	9 • 999	9 9 999 99	9	9 «9	9 «9	•

Robins, S. B. Larson, J. J. Marr, R. L. Berens, C. J. Bacchi, H. C. Nathan a 3. S. Keíthly, J. Med. Chem., 33,44(1990)).

4. Syntéza ICN4625 (1-(3-deoxy-p-D-erythropentofuranosyl)-1,2,4-triazol-3-karboxamid): Sloučenina byla připravena použitím následující metody syntézy:

5. Syntéza ICN5531 (5-amino-1-p-D-ribofuranosylpyrazol-4-karboxamid): Tato sloučenina byla připravena podle metodologie syntézy uvedené v Β. K. Bhattacharya, R. K. Robins a G. R. Revankar, J. Heterocyclic Chem. (Časopis heterocyklické chemie), 21, 795(1990).

6. Syntéza ICN5676 (1-3-D-arabinofuranosyl-1,2,44riazol-3-karboxamid): Syntéza této sloučeniny byla provedena podle následující procedury popsané vJ. T. Witkowski, M. Fuefles, P. D. Cook a R. K. Robins, J. Carbohydr. Nucleosides (Karbohydrétové nukleosidy), nukleosidy 2(1), 1(1975)).

7. Syntéza ICN5839 (Ι-β-D-erythrofuranosyl-l ,2,4-karboxamid): Tato sloučenina byla připravena podle následujícího schématu syntézy:

·· ···· ·· ··

8. Syntéza ICN6242 (2-bromo-1-p-D-ribofuranosylimidazol-4-karboxamid): Tato sloučenina byla připravena podle následující znázorněné metody:

Rcf;P. C. Srivastava, Q. A. Ivanovics, R. J. Rousieau and R. K. Robins,

J. Org. Chem., 40, 2920 (1975) ’

Ac^O/Py

V

1. NBA/THF

2. NaOMe/MeOH

9. Syntéza ICN11808 (1-p-D-ribofuranosyl-pyrazol-3,4-dikarboxamid): Syntéza této sloučeniny byla popsána v Y. S. Sanghvi, Β. K. Bhattacharya, G. D. Kini, S. S. Matsumoto, S. B. Larson, W. J. Jolley, R. K. Robins a G. R. Revankar, J. Med. Chem, 33, 336(1990) a v souladu s tím byla pňpravena uvedená sloučenina.

10. Syntéza ICN12204 (2-(p-D-ribofuranosyl)imidazol-5-karboxamid): Syntéza této sloučeniny byla provedena podle následující procedury uvedené v J. Igoleo, Τ. H. Dinh, A. Keib a C. Perreur, Chimie Therapeutique (Chemoterapeutika), 207(1972).

Pro karbocyklické deriváty 4'-thiocukrů a 4'-azacukrú analogů Ribavirinu® mohly být následující cukry kondenzovány vhodnými heterocyklickými sloučeninami a odvozeny podle popisu výše uvedeného schéma a poznámek.

4'-thiocukr

Karbocyklický cukr

1. Karbocyklické cukry mohou být připraveny podle následující procedury uvedené v literatuře: M. Yoshikawa, Y. Yoshikawa, Y. Inoue, S. Yamaguchi a N. Murakami, Tetrahedron, 50, 9961(1994); L. Agrofoglio, E. Suhas, A. Parese, R. Condom, S. R. Challand, R. A. Earl a R. Guedj, Tetrahedron, 50,10611(1994).

2. 4-azacukr byl připraven podle procedury uvedené v literatuře: E. J. Reist, D. E. Gueffroy a L. Goodman, J. Am. Chem. Soc., 87, 677(1965).

3. 4-thio-D-ribofuranóza byla připravena podle následující procedury uvedené v literatuře: M. Hobek a R. L. Whistler v „Methods in Carbohydrate Chemistry, (Metody v karbohydrátové chemii)“, odd 1,292(1962).

Dokumentace efektivnosti účinků analogů Robavirinu® pň modulaci Th1 a Th2 cytokinu je ukázána na obrázku 7 a v následující tabulce. Analýzy uvedené na tomto místě obsahují krátký seznam 35 testovaných analogů Ribavirinu® a všechny zkoušky byly provedeny třikrát. Všeobecně je zřejmé, že testované sloučeniny spadají do tří hlavních kategorií: (1) sloučeniny takové jako ICN1369 a ICN3844, které potlačují IFNx, IL-2, IL-4, IL-S a TNFa; (2) sloučeniny takové jakoRibavirin®, které zvyšují IL-2 a TNFa a potlačují ILA a IL-5; a (3) sloučeniny takové • * • · ·· ·· jako ICN6242, ICN3839 a ICN3531, které zvyšují IL-2 a IFN% a potlačují IL-4 a IL-5. Takové aktivní látky uvedené výše budou možným přínosem pro určení, ve které modulaci cytokinů bude vyvolána vhodná imunitní reakce.

Tabulka 2

Koncentrace buněk na jeden otvor = 2 χ 10⁶ x 24 = 48 χ 10⁶ v 48 ml (celkový objem každého otvoru = 2000 μΙ)

	1	2	3	4	5	6
A		PMA ICN	PMA ICN	PMA ICN 10 μΜ 1369	PMA ICN 5 μΜ1369	PMA ICN 2μΜ 1369
B	PMA ICN 10 μΜ 3438	PMA ICN 5 μΜ 3438	PMA ICN 2 μΜ 3438	PMA ICN 10 μΜ 3844	PMA ICN 5 μΜ 3844	PMA ICN 2 μΜ 3844
C	PMA ICN 10μΜ 4625	PMA ICN 5 μΜ 4625	PMA ICN 2μΜ 4625	PMA ICN 10 μΜ 5531	PMA ICN 5 μΜ 5531	PMA ICN 2 μΜ 5531
D	PMA ICN 10 μΜ 5676	PMA ICN 5 μΜ 5676	PMA ICN 2 μΜ 5676	PMA ICN 10 μΜ 5839	PMA ICN 5 μΜ 5839	PMA ICN 2 μΜ 5839

Koncentrace na jeden otvor = 2 χ 10⁶ x 24 = 48 x 10⁶ ve 48 ml (Celkový objem v každém otvoru = 2000 μΙ)

	1	2	3	4	5	6
A	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10 μΜ 6242	5 μΜ 6242	2 μΜ 6242	10μΜ11808	5 μΜ 11808	2μΜ 11808
A	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10μΜ12204	5μΜ12204	2μΜ12204	10 μΜ RIB	5 μηι RIB	2 μΜ RIB

Ribavirin® a analogy Ribavirinu® se ukázaly jako účinné pň modifikaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Specifické celky a aplikace byly přímo uvedeny, ale odborníkům

zkušeným v oboru bude jasná možnost dalších mnoha modifikací, aniž by se odchýlili od konceptu vynálezu. Vynález proto není zamýšlen jako limitní, mimo smysl pňložených nároků.

-1 «·«« φ

♦ φ · φφφ

V φ φ

PATENTOVÉ NÁEOEY

Claims

1. způsob inverzně modulovaných odpovědí Th1 a Th2 lymfocytů vyznačující se tím, že se přidá Ribavirin k lymfocytům v koncentraci, která zvyšuje Th1 reakci a potlačuje Th2 reakci.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že Th2 reakce byla předtím zvýšena pomocí antigenů.

3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že Th2 reakce byla předtím zvýšena pomocí hlístu.

4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že Th2 reakce byla předtím zvýšena pomocí protilátky.

5. Způsob inhibování virusu pomocí růstu viru v prostředí mající iymfocyty, vyznačující se tím, že jsou produkovány Th1 a Th2 odpovědi cytokininu a je přidán Ribavirin k tomuto prostředí v koncentraci která zvyšuje Th1 reakci a potlačuje Th2 reakci.

6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že virus obsahuje Heptitis C.

7. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že virus je lidským virusem deficity imunity.

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že je přidáno množství Ribavirinu poskytující koncentraci od 0,25 do 12,5/UM v mediu, které podporuje Iymfocyty.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že dále zahrnuje přidání interferonu alfa k lymfocytům.

Ύ\/ ZlTR -^8 • Φ · ·· ·· Μ » · · · · · »«·* • · · · · · · · • · · · · · · · · · * • · · · · · · ·· ·· ·· · 9 9 9 9 9 9 οοοοι 0005 0002 0001 005 052 05 ^_02 01 5 2 1

3·

Γ3

X) η