CZ23748U1 - Sestava pro selektivní izolaci a analýzu látek z biologických vzorků - Google Patents

Description

Technické řešení se týká sestavy pro selektivní izolaci a analýzu látek z biologických vzorků, jehož součástí je zařízení pro čípovou kapilární elektroforézu.

Dosavadní stav techniky

Komplexnost biologických vzorků je základním problémem ztěžujícím stanovení vybraných analytů. Každému stanovení musí předcházet určitá forma extrakčního, separačního nebo izolačního procesu. Metody co nejjednoduSŠí detekce biologicky významných látek z velmi malých objemů vzorku jsou obecně velmi důležité.

Extrakce případně izolace minoritních složek komplikované směsi vede k výrazným ztrátám v objemu vzorku a tento jev představuje významný problém především u vzorků, jejichž získání ve větších objemech může být komplikované (mozkomíšní mok, nádorové výpotky aj.). Současný trend vede k intenzivnímu tlaku na rychlost, jednoduchost a komplexnost analytických metod. S tím souvisí také snaha o miniaturizaci analytických přístrojů, které by umožnily přenositelnost těchto zařízení a jejich použití mimo laboratoř, tedy přímo v místě odběru vzorku (např. v přírodě nebo u lůžka pacienta). Analýza in šitu urychluje celý analytický proces a snižuje celkové náklady na analýzu.

Podstata technického řešení

Výše uvedené požadavky do značné míry splňuje sestava pro selektivní izolaci a analýzu látek z biologických vzorků podle technického řešení.

Podstatou technického řešení je sestava pro izolaci a analýzu látek z biologických vzorků, jehož součástí je zařízení pro čipovou kapilární elektroforézu. Toto zařízení zahrnuje elektroforetický Čip s rezervoáry obsahujícími povrchově modifikované magnetizovatelné částice, přičemž je elektroforetický čip ve spojení s magnetem.

Izolace pomocí povrchově modifikovaných magnetických částic se provádí přímo v rezervoáru elektroforetického čipu pro kapilární elektroforézu působením vnějšího magnetického pole, které je realizováno pomocí stacionárního magnetu nebo elektromagnetu. Při tomto způsobuje možné využít velmi malého objemu snadno dostupného vzorku, jako jsou veškeré typy tělních tekutin (krev, krevní sérum, mozkomíšní mok, pot, moč, nádorové výpotky).

Sestava podle technického řešení umožňuje izolaci látek pomocí magnetizovatelných částic s povrchem selektivně modifikovaným pro studovaný analyt a identifikaci analyzovaných látek pomocí kapilární gelové elektroforézy v mikrofluidním uspořádání. Magnetizovatelné Částice s povrchem selektivně modifikovaným pro záchyt proteinů, nukleových kyselin nebo dalších analytů, umístěné v rezervoáru komerčního mikrofluidního čipu slouží jako extrakční fáze s vel35 kým povrchem a tím také s vysokou extrakční kapacitou. Kapilární elektroforéza optimalizovaná pro analýzu specifického analytu následně poskytuje informace nejen o koncentraci sledované látky, ale například i čistotě a dalších parametrech.

Ve výhodném uspořádání se využívá komerčně dodávaného elektroforetického čipu, v jehož rezervoáru je prováděna izolace sledované látky (nukleové kyseliny, proteinu) pomocí modifikova40 ných magnetizovatelných částic. Pro manipulaci s magnetizovatelnými částicemi se ve výhodném uspořádání používá vnějšího magnetického pole, jehož zdroj je umístěn pod elektroforetickým čipem. Alternativní možností je využití tubulámího magnetu vkládaného do rezervoáru elektroforetického čipu. Magnetické pole lze realizovat buď pomocí stacionárního magnetu požadované velikosti nebo elektromagnetu. Po ukončení promývacích procesů spojených s izolací je možné „odpadní“ (neboli použité) magnetické částice v rezervoáru ponechat, protože nedochá-1 CZ 23748 Ul zí k jejich migraci separačním kanálem a tím rušení procesu stanovení, případně je lze odstranit pomocí zmíněného tubu lamího magnetu.

Pojem „povrchově modifikované magnetizovatelné částice“ zahrnuje částice vyrobené z magnetických materiálů (např. Fe₂O₃, Fe₃O₄ aj.) o rozměrech v řádu nano- nebo mikrometrů modifiko5 váné látkou schopnou interagovat s analytem (např. protilátka, oligonukleotidová komplementární sekvence, aj.).

Pojem „rezervoár elektroforetického čipu“ pojmenovává prostor na elektroforetickém čipu, který je určen k nanášení roztoků. Jde o miniaturní nádobku, která je součástí plastového pláště čipu a vymezuje vstupy do jednotlivých kanálů v čipu.

io Pojem „tubulámí magnet“ pojmenovává magnet tyčinkovitého tvaru o rozměrech vhodných pro vsunutí do rezervoáru elektroforetického čipu.

Pojem „elektromagnet“ pojmenovává magnet tyčinkovitého tvaru o rozměrech vhodných pro vsunutí do rezervoáru elektroforetického čipu, jehož magnetické vlastnosti jsou ovládány pomocí průchodu elektrického proudu.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1: Princip izolace biomolekul z homogenátu vzorku pomocí magnetizovatelných částic a magnetu.

Obr. 2: Izolace biomolekul z homogenátu vzorku pomocí magnetizovatelných částic v zařízení pro čipovou kapilární elektroforézu.

Obr. 3: Možnosti manipulace s magnetizovatelnými částicemi pomocí planámího, tubulámího magnetu nebo elektromagnetu.

Technické řešení bude podrobněji popsáno pomocí příkladu provedení a přiložených obrázků. Uvedený příklad není omezující z hlediska dalších možných provedení v rozsahu nároků na ochranu.

Příklady provedení technického řešení

Základní postup izolace biomolekul pomocí magnetizovatelných částic je uveden na obr. I. Ve zkumavce (a) je homogenát vzorku, do kterého byly přidány magnetizovatelné částice. Při procesu zvaném hybridizace (interakce dvou vláken nukleových kyselin), konjugace (proteinprotein interakce) či dalších fyzikálně-chemických interakcích (adsorpce, iontová interakce) dochází k navázání konkrétních biomolekul (DNA, RNA, proteiny) na specificky modifikovaný povrch magnetizovatelných částic (b), který je upraven podle druhu izolovaných molekul. Například pro izolaci nukleové kyseliny je povrch magnetizovatelných částic modifikován řetězcem komplementárním k hledané sekvenci nebo řetězcem tvořeným repetitivní sekvencí (oligo dT, oligo G apod.). Pri izolaci proteinů se používá modifikace streptavidinem, avidinem, neutravidi35 nem, proteiny G, A, polymemími sloučeninami nebo například protilátkami (monoklonální, polyklonální). Konjugované složky pri hybridizaci bývají pro výslednou detekci biologické interakce značené; nejčastěji technologicky využívané způsoby značení zahrnují streptavidin-biotin nebo avidin-biotin, neutravidin-biotin apod. Poté následuje promyti magnetizovatelných částic s již navázanými molekulami, při kterém se odstraní ostatní interferující látky (c). Oddělení izo40 lovaných biomolekul od magnetizovatelných částic se docílí zvýšením teploty (d), změnou iontové síly, změnou složení elučního roztoku či dalšími fýzikálně-chemickými změnami prostředí, ve kterém hybridizace probíhá (e). Po oddělení izolovaných biomolekul se magnetizovatelné částice přitáhnou magnetem a cílové biomolekuly se odpipetují do nové zkumavky (t). Takto separované b iomo leku ly jsou připraveny pro další analýzu.

Předmětem technického řešení je sestava umožňující izolaci biomolekul pomocí magnetizovatelných částic i analýzu pomocí čipové kapilární elektroforézy (obr. 2). Schematické znázornění

CZ 23748 Ul komerčně dodávaného čipu je uvedeno v části (A). K. tomuto čipu je připojen magnet, umožňující práci s magnetizovatelnými částicemi přímo v čipu (A), (B). Obrázek (C) ukazuje princip separace pomocí magnetizovatelných Částic, homogenát s cílovými biomolekulami, interakci částic s cílovou skupinou biomolekul, promytí a odstranění interferujících látek, denaturaci a nás5 lednou separaci ve spojení s detekcí cílových biomolekul pomocí čipové kapilární elektroforézy.

Možnosti manipulace s magnetickými částicemi v jamce elektroforetického čipu jsou znázorněny na obr. 3. Částice je možné přidržet na dně jamky pomocí planámího magnetu umístěného pod čipem (obr. 3 A), případně lze částice z jamky vyjmout pomocí tenkého tubulámího magnetického mechanismu (obr. 3B, 3C). Přesná manipulace s čipem podél os x a y, stejně jako manipulace io s magnetickým separátorem v ose z, je v ideálním případě zajištěna pomocí 3D mikromanipulátoru. Realizace magnetického separátoru je možná pomocí permanentního magnetu o vhodném tvaru a rozměrech nebo pomocí elektromagnetu.

Příklad l

Izolace oligonukleotidů specifických pro virus žloutenky typu B s využitím sestavy podle těch15 nického řešení

Streptavidinem modifikované magnetizovatelné částice I byly konjugovány s biotinem značeným oligonukleotidem (HBV) komplementárním k hledanému oligonukleotidů specifickému pro virus žloutenky typu B.

Příprava magnetizovatelných částic k hybridizaci mimo čip v mikrozkumavce

Magnetizovatelné částice v nativním roztoku se odebraly v objemu 110 μΐ, umístily se do mikrozkumavky, mikrozkumavka se přiložila k magnetu 5 a nativní roztok se odsál. Přidalo se 200 μΐ promývacího roztoku (50 mM HEPES), roztok se pipetou 5x promíchal, přiložit k magnetu 5 a promývací roztok se odsál.

HBV oligonukleotíd značený biotinem se rozpustil v 2 M NaCÍ roztoku na výslednou koncent25 raci 5 pg/ml a přidal se k promytým částicím. Mikrozkumavka se vložila do termostatu a třepala se 30 min při 1100 rpm a teplotě 25 °C. Pak se přenesla na magnet 5, 2 M roztok NaCl s HBV oligonukleotidem se odsál a 3x promyl 50 mM roztokem HEPES, po posledním promytí se roztok odstranil, takže v mikrozkumavce zůstaly pouze HBV oligonukleotidem modifikované magnetizovatelné částice 1.

K promytým modifikovaným magnetizovatelným částicím i v mikrozkumavce s HBV oligonukleotidem se přidalo 110 μΐ hybridizačního roztoku (100 mM Na₂HPO₄, 100 mM NaH₂PO₄, 0,5 M NaCl a 0,15 M Tris-base s upraveným pH = 7,5.

Vlastní izolace a analýza cílových molekul na elektroforetickém čipu

Do každého z 11 rezervoárů 4 elektroforetického čipu, určených pro vzorky, se napipetovalo 6 μΐ připravených modifikovaných magnetizovatelných částic I na hybridizaci (obr. 2B) a do každého rezervoáru 4 elektroforetického čipu se napipetovalo maximálně 5 μΐ homogenátu 2 vzorku (obr. 2C). Homogenát 2 vzorku s modifikovanými magnetizovatelnými částicemi I se pipetou 5x promíchal.

Celý elektroťoretický čip 3 s napipetovanými vzorky (obr. 2C) se překryl parafilmem a umístil do termostatu a třepal se 10 min pří 600 rpm a teplotě 25 °C. Elektroťoretický čip 3 se pak umístil na 30 - 60 s na magnet 5 (obr. 2A), až se modifikované magnetizovatelné částice J, přitáhly k magnetu 5, opatrně se odsál roztok nad částicemi a přidalo se 10 μΐ promývacího roztoku (50 mM HEPES). Poté se elektroforetický čip 3 odstranil z dosahu magnetu 5 a vzorek s promývacím roztokem v jednotlivých jamkách se 5x promíchal pipetou. Promývání se třikrát zopako45 válo, při posledním promytí se promývací roztok odsál a elektroforetický čip 3 se ponechal na magnetu 5.

-3CZ 23748 Ul

Do jednotlivých rezervoárů 4 elektroforetického čipu (obr. 2B) se přidalo 10 μΐ 50 mM HEPES, elektroforetický čip 3 se překryl parafinem, umístil na termostat a třepal se 10 min při 600 rpm a teplotě 85 °C. Po uvolnění vzorku z modifikovaných magnetizovatelných částic I (eluci) se elektroforetický čip 3 okamžitě umístil na magnet 5 a led. Analýza vzorků pomocí vyhodnocova5 čího zařízení 8 kapilární čipové elektroforézy se provedla podle návodu dodávaného k vlastnímu elektroforetickému čipu 3 a kapilární čipové elektroforéze a spustila se analýza. Pomocí streptavidinem modifikovaných magnetizovatelných částic 1 se takto přímo v elektroforetickém čipu 3 izoloval hledaný biotínem značený HBV oligonukleotid, který se následně analyzoval zařízením kapilární elektroforézy. Pomocí softwaru dodávaného k elektroforetickému čipu 3 se vyhodnotily ío vzorky a získala se informace o množství oligonukleotidů specifických pro virus žloutenky typu

B, jejich čistotě a také velikosti oligonukleotidového fragmentu.

Průmyslová využitelnost

Sestava pro selektivní izolaci a analýzu látek z biologických vzorků zahrnující zařízení pro čipovou kapilární elektroforézu s rezervoárem elektroforetického čipu, obsahujícím povrchově modi15 fikované magnetizovatelné částice ve spojení s magnetem umožňuje současně izolaci biologicky významných molekul z biologických vzorků pomocí povrchově modifikovaných magnetizovatelných částic i analýzu na jednom zařízení. Pri tomto způsobu izolace analytu nevznikají ztráty odebraného biologického vzorku. Sestava podle technického řešení umožňuje efektivní, snadnou a rychlou izolaci a analýzu látek z velmi malých objemů biologických vzorků i mimo laboratoř.

Claims (8)

1. t. Sestava pro izolaci a analýzu látek z biologických vzorků, jehož součástí je zařízení pro čipovou kapilární elektroforézu, vyznačující se tím, že zařízení pro čipovou kapilární elektroforézu zahrnuje elektroforetický čip (3) s rezervoáry (4) obsahujícími povrchově modifikované magnetizovatelné částice (1), přičemž je elektroforetický čip (3) ve spojení s magnetem

   25 (5).
2. 2. Sestava podle nároku 1, vyznačující se tím, že magnet (5) je v podobě stacionárního magnetu nebo elektromagnetu.
3. 3. Sestava podle nároků ta 2, vyznačující se tím, že magnetizovatelné částice (1) jsou paramagnetické mikro- nebo nanočástice.

   1 výkres

   Seznam vztahových značek:

   1- modifikované magnetizovatelné částice 35 2 - homogenát vzorku

   3- elektroforetický čip
4. 4- rezervoár elektroforetického Čipu
5. 5 - magnet
6. 6- elektromagnet

   40
7. 7- ovládání elektromagnetu
8. 8- vyhodnocovací zařízení.