CZ237597A3

CZ237597A3 - Bicyklický derivát isothiomočoviny, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ237597A3
Application number: CZ972375A
Authority: CZ
Inventors: James Edwin Macdonald
Original assignee: Astra Aktiebolag
Priority date: 1995-02-11
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1998-05-13
Also published as: CA2211299A1; SK104097A3; FI973273L; ES2143181T3; US6040314A; MX9705965A; CN1181070A; AU699546B2; DE69606165D1; DK0808307T3; HUP9801363A3; FI973273A0; TR199700769T1; US5786364A; FI973273A7; EP0808307A1; NZ301831A; HUP9801363A2; ATE188689T1; KR19980702114A

Description

Česká republika * .

DERiVÁTV)BICYKLICK^|lSOTHIOl)RE¥|POUŽíTELNÉ V TERAPIÍ i ento vynaiez se tyxa novycn sioueenm. postupu pn jepcn popravě, směsi, Kíere ie obsahují a jejich využili jako nervově ochranných činidel.

uenvaty iniourey a isotmourey uyiy popsaný unve pro ruzna terapeutická využiti. WO 94/i 2165 (Wellcome) popisuje jednoduché deriváty ísothiouiey pro použití při léčení mimo jiné systernické hypolense, septiekério šoku a zánčtlivýeh případů, WO 95/09619 (Wellcome) (publikováno po prioritním datu léto žádosti) popisuje substituované deriváty urey a isoihiourey pro použití při léčbě eeiebrální isenčniie, patent Velké Británie e. 1178242 (Wellcome) prozrazuje, že bisisotlnourea rná prolizánětlivý účinek, žádost o Evropský paieni č. 41 1615 (Warner Larnberl) prozrazuje, že deriváty iniourey lze použít při leeei iení symptomů snížené schopnosti poznávat, žádost o Evropský patent ě. 392802 (Deecnaini prozrazuje, ze uenvaty Iniourey ize použit pn leeeni urorieniamien. eerebrovaskulárních nebo neuronálních poruch.

uenvaty isotmourey jsou také známy jako přechodné chemické sloučeniny při přípravě derivátů guanidmu (viz patent Spojených států 4,211,867 (MeNeil Laboratories) a Svuiliesis (1988) 6, 460-466 (Rasmussen)), který vyjadřuje meíylester kyseliny 4dimelylaminofenylkarbauiiniidové a patent Spojených států 5,223,498 (Boots).

Deriváty N-alkoxyíenyl-N -quinoiinyl-triiourey použitelné jako tuberkulostatieká činidla jsou popsány v DE-B-i 157626 (Hoeehst).

Zadost o Mezinárodní patent WU 95/05363 (Eisons) (vydaná po prioritním datu této zadosti) popisuje denvaty N-íenyl amidmu. ktere jsou indikovaný pro léčbu mimo jiné neuiOoegenerau vnmo onemocněni.

• · · · • · • · • ·

Nyní jsme objevili novou a výhodnou skupinu derivátů isoíhiourey.

Podle vynálezu jsou určovány sloučeniny vzorce 1

kde

D představuje alkyl C1 až 6

T představuje C3.5 saturovaný nebo nesalurovaný alkylenový řetězec substituovaný /ΖΊ t \ I \ MJ I .. 1. . J : J . /ΓΊ TV M VXZ t i T Z 7 \ M/V\ i v n? j _m - t, -u-tu njk -1ΝΠ- suusuiuovany -iv.n₂) _m - a a ϊ , neuu -u-iLn_2/i_a - in(a) / I I \

ΙΛ n₂Jh-, r r · . \ ii τ r\___1. . zm 1 .

u je αγί, \j neuu vn₂.

-I z\ .1 .

a a b. které mohou být stejné nebo odlišné, představují celé čisto od o uo 3 za podmínky. Že a+b je v rozmezí ou 1 do 3;

X a Y, které mohou být stejné nebo odlišné, představují vodík, alkyl Ci až 6 nebo .i . τ \ z~\

SKUplIlU -(V n₂lnVnebo NXY společně představují pipendinyl, pyrrohdinyl, morpholinyl nebo tet rahyd ro i soq u í hol i nv 1;

qj je lenyi neuo tenyi suusiituovany jeunnn neuo více suosiituenly vyoranymi ze skupiny skládající se z ž alkvlu

C1 až 6, alkoxy C1 až 6, Influorometylu, halogenu, nitro a

Kyano, • · · · • · • · in a njiezávisle jsou celá čísla od nuly do 5.

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

• · · · • · · • · · ♦ · · • · · · · ·

Ljoporucujenie. aoy i preusiavovaio -u-(cn2)_a - iN(A)jen2)b. vwzviasie paK, aoy i představovalo -U-íCH?);, - N(X)-(CH2)b a U představovalo CHj. Zejména doporučujeme, aby T představovalo -U-(CH?)_a - N(X)-(CH2)i,. u představovalo CH? a aa b každé bylo 1.

f ZZ^T I

X I Z \Z\ ZZ>I I

Doporučujeme, aby D představovalo alkyl Cl až 3, především metyl nebo elyl, zejména elyl.

x rz v\ zz^tt \

Kúyz i pieusiávuje -υ-(υπ2/ί, - ΐΝ(Λΐ-(νη·2^, uoporucu|erne, auy λ preasiavovaio vodík, metyl nebo skupinu -(CH/jQ.

Γ T Ζ/~Ί T \

Když T představuje C?-s saturovaný nebo nesaturovaný aikylenový řetězec suostituovany -(v n?i_m - ινλϊ neoo -u-(cn2j2 -ívn- suoslttuovany -ti_n?j_m - ινλϊ, doporučujeme, aby X a Y nezávisle představovaly vodík, metyl nebo skupinu -(CH?)Q, přestože se nedoporučuje, aby X a Y společně představovaly skupinu -(CFhjQ. Především doporučujeme, aby jeden z X a Y představoval vodík nebo metyl a ostatní představovaly skupinu -(CH?)Q izopoi lícujeme, aoy n oyio rovno i.

Doporučujeme, aby Q představovalo fenyl nebo vybraným ze skupiny skládajíeí se z alkylu Cl až 6, halogenu, nitro a kyano. Především doporučujeme, aby substituovaný alkylem Cl až 6 nebo halogenem.

fenyl substituovaný substituentem aikuxy Cl až 6, trifiuoromelvlu, Q představovalo fenyl nebo fenyl rouie tonulo vynalezu je taxe zajíst ován proces pro pnpravu sioueenin pouie vzorce i a jejich farmaceuticky přijatelných solí, který zahrnuje (a) přípravu sloučeniny poule vzorce 1, kde X nebo alespoň jeden z X a Y představuje alkyl Cl až 6 nebo skupinu -(CH₂)„Q, reakcí příslušné sloučeniny podle vzorce 1, kde X nebo jeden z nebo oba X a Y představují vodík, se sloučeninou podle vzorce 11 !<' - L kde 1\| představuje alkyl Cl až 6 nebo skupinu -(CH?.)„Q a L je odstupující skupina.

nebo toj piipravu sioueenmy pooie vzorce i, kuc i představuje v 3-5 saturovaný neoo nesaiuiovaný alkylenový řetěz substituovaný -(CH₂)_m -NXY nebo -O-íCH₂)₂-NH substituovaný -(CH₂)„, -NXY reakcí odpovídající sloučeniny, kde T představuje C3.5 saturovaný nebo nesaiuiovaný alkylenový řetěz substituovaný -(CH₂)_m -L nebo -0(CH₂)₂-NH substituovaný -(CH₂)_m -LaL představuje odstupující skupinu.

se sloučeninou podle vzorce 111

T I I 111 kde X a V jsou stejné, jak je definováno výše nebo (e) reagují se sloučeninou podle vzorce IV

kde T je podle výše uvedené definice, se sloučeninou poule vzorce V

D-L V ··· · · · · ···· • · · · · · · · · · · · • · ·«· · * · ···· · • · · ♦ · · ··· ·· ··· · · ···· ·· ·· kde D je pudle výše uvedené definice a L je odstupující skupina.

a kde je nutné nebo Žádoucí upravit konečné sloučeniny na její farmaceuticky přijatelnou sůl nebo naopak, jak je popsáno dále.

v postupeen (a) a (o) se ouuou reaKCe uSKuteenovat za stanuarumen pounnneK, riapr. reakcí dvou materiálů v inertním rozpouštědle za základních podmínek při pokojové teplotě po dobu až 12 hodin. Často jsme shledali vhodným upravit amin pomocí NaH dříve, než bude reagovat sjinou sloučeninou, 'vhodné odstupující skupiny L kyselinu suifonovou, liifluorokarbonovou kyselinou sírovou, halogenid, obsahují thioalkyl, alkylový a aryiový alkohol a íosylové skupiny, ostatní jsou vyjmenovány v Moderní organické chemii i„zvuvanceu uigaitie v-i íel i usu y j, j.ivialen i ivoj ), j.vyuain. ivicvjíaw-nin na silaiie ou a jsou v tornlo oboru dobře známy. Doporučujeme, aby L představovala halogenid, především bromid.

V procesu (e) bude reakce pokračovat kombinací těchto dvou reagenlů v inertním rozpouštědle, např. acetonu. Vhodné odstupující skupiny, které může L reprezentovat, zahrnují thioalkyl, kyselinu sírovou, írifiuorokarbon suifonovou kyselinu, halogen, alkylové a arylové alkoholy a íosylové skupiny, ostatní jsou vyjmenovány v Moderní organické chemii („Advanced Oiganie Chernistry“), j.Mareh (1985 ), 3.vydání, McGraw-Hiii na straně 315 a jsou v tomto oboru dobře známy. Doporučujeme, aby byly použily deriváty jodiuu, toiuensuifonátu nebo suifonátu metanu.

.sloučeniny pouie vzorce i v inonou υνί připraveny pouie inetouv Kasmussena et ai v Syiithesis (1988) 456-459. Sloučeniny podle vzorce 111 mohou být takto připraveny reakcí sloučeniny podle vzorce Ví

• · kue T jě poule výše uvéueué definice, S běiizúylěul iSOlliiokyanáíem následovaným vodním alkalickým rozštěpením výsledného derivátu benzoyllhiourey.

Sloučeniny poule vzorce VI mohou být připraveny redukcí příslušné sloučeniny poule vzorce Vlk

kde T je podle výše uvedené definice

Redukční reakce může být provedena za několika podmínek, např. ičcli, které byly popsaný vj řvlarcli „Advanced Orgame Chemistry“, 3.vydání (1985) na stranách 11031104. Mezi nimi je katalytická liydíogenaee, použití kovu Zn, Sn nebo Fe, AIH? -AlCb, sulfidů a jiných. Doporučujeme prováděl tuto reakci hydrogenact při atmosférickém tlaku za

Λ 1. 1’ přítomnosti paiauia a umiKoveno Kataiyzatoru po uoou typicKy i-h noumy neuo 00 dokončení redukce.

Sloučeniny podle vzorce Vlí, v nichž je T podle výše uvedené definice a X nebo alespoň jeden z X a Y představuje alkyl Cl až ó něhu skupinu -(CH^ÚQ, mohou být připraveny v reakci odpovídající sloučeniny poule vzorce Vil, v němž X nebo Y představuje vodík, se sloučeninou poule vzorce 11.

Tato reakce může být provedena za podmínek analogických s těmi, které jsou popsány výše v procesu (a).

• ·

Sloučeniny poule vzorce Vil, v němž T představuje saturovaný nebo nesaturovaný alkylenový řetěz C3-5 substituovaný -(Cr^),,, - NXY nebo -O-(CH2)2-NH- substituovaný (CH?),,, - NXY, mohou být připraveny reakcí příslušné sloučeniny, v níž T představuje salutovaný nebo nesaturovaný alkylenový řetěz C3.5 substituovaný -(CH2)_m - L nebo -0(CH?)?-NH- substituovaný -(CH?),,, - L a L představuje odstupující skupinu, se sloučeninou ze vzorce tlí.

Tato reakce může být provedena za podmínek analogických k těm. které jsou popsány výše v procesu (b).

Sloučeniny ze vzorce Vík kde X představuje vodík, jsou buďto známy nebo mohou být připraveny známými způsoby. Např. mohou být připraveny nitrací nenitrovaného derivátu. Tato nitrační reakce se obecně provádí reakcí nenitrované aromatické sloučeniny s kyselinou dusičnou samostatně nebo ve vodě, v kyselině octové, v anhydridu kyseliny octové nebo v kyselině sirové. Další podrobnosti těchto reakcí a další alternativní činidla jsou uvedeny v J March „Advanced Orgamc Chemistry¹·*·, 3. vydání (1985) na stranách 468470.

dioueenmy ze vzorců 11, 111 a v jsou duu to známy neoo monou ovi připraveny obecně známými metodami.

Sloučeniny ze vzorce 1 mohou být připraveny jako takové nebo jako adiční kyselé soli typu popsaného výše. Nebo mohou být připraveny jako nefannaceulicky přijatelná adiční sul, např. sůl kyseliny šťavelové, a jakýkoli produkt této reakce může být následně konvertován konvenčními prostředky na farmaceuticky přijatelnou sůl

0011 siouceum ze vzorce 1 monou ovi lOimovany reaKci vome Kysenny, zasauy neoo jejich soli s jedním nebo více ekvivalenty příslušné zásady nebo kyseliny. Reakce rnůže být prováděna v rozpouštědle nebo v prostředí, v němž se sůl nerozpouští, např. ve vodě, dioxanu, elanolu, lelrahydrofuranu nebo dietyléleru, nebo směsi rozpouštědel, která může být odstraněna in vaeuo nebo vysušením v mrazu. Reakce může být výměnným procesem nebo muže být prováděna na lontoměmčové pryskyřici.

• · · · · ·· · · · ·

Tam, kde je to nutné, aminové nebo jiné reaktivní skupiny mohou být chráněny použitím ochranné skupiny, jak je popsáno ve standardním ie.xtu Greene a Wuts: „Ochranné skupiny v organické syntézi“ („Protectíng groups m Orgamc Synlhesis“), 2.vydání (i99i). Aminové chránící skupiny, které mohou hýl zmíněny, především zahrnují alkyloxykarbonyl C2 až 7, např. t-butyloxykarbonyl, fénylalkyloxykarhonyl C8 až 13, např. benzyloxykarbonyl. Doporučujeme však, aby aminové skupiny byly chráněny úpravou pomocí anhydriuu kyseliny tnfluorooetové ve vhodném rozpouštědle (např. metylenchlofid, metanol) při pokojové teplotě. Odstranění ochrany lze dosáhnout hydrolýzou ve vodě.

Sloučeniny poule tohoto vynálezu a přechodné sloučeniny mohou být izolovány ze svvch reakčních směsí standardními technikami.

Termín „alkyl Cl až 6“ zahrnuje přímý řetěz, větvený, saturovaný, nesaturovaný, alifatický a cyklický alkyl obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů. „Alkyl Cl až 3“ může být vyjádřen podobně.

Sloučeniny ze vzorce I mohou existovat v enantiomenckýeh formách. Různé optické izomeiv mohou být izolovány separací racemické směsi sloučenin s použitím konvenčních technik, např. i i akční krysializací nebo HPLC. Nebo mohou být jednotlivé enantiomery vytvořeny reakcí vhodných opticky aktivních výchozích materiálů za reakčních podmínek, které nezpůsobí racemizaci.

Přechodné sloučeniny mohou také existovat v enantiometrickýeh formách a mohou být použity jako čisté enenlioineiy. diastereomery, rascemáty nebo směsi.

Sloučeniny obecného vzorce 1 vykazují užitečnou farmakologickou aktivitu u zvířat. Především mají užitečnou schopnost inhibovat syntézu oxidu dusičného a předpokládá se, že je lze využít při léčbě nebo profylaxi onemocnění osob nebo za podmínek, v nichž syntéza nebo nadbytečná syntéza oxidu dusičného spolupůsobí, např. hypoxie, třeba v případech srdeční zástavy, infarktu a neonatální hypoxie, neurodegeneraiivních případů včetně degenerace nervů nebo odumření nervů u poruch jako jsou íschémie, hypoxie.

• ·

nypogiyícemie, epilepsie a u externími poraněni (napnxiau poraněni nneny a niavy), Kieee a toxicita způsobená hyperbanekým kyslíkem, demence, např. pre-senilní demence, Alzheinierova choroba a denience v souvislosti s AIDS, Sydennauisova chorea, Parkmsonova choroba. Huntingtonova choroba, amyoíiopická laterální skleróza, KorsakoíTova choroba, imbecilita související s onemocněním mozkových cév, poruchy spánku, schizofrenie, pocity úzkosti, deprese, sezónní emoční porucha, pásmová nemoc (porucha biorytmu), deprese nebo jiné symptomy související s premenslruálním syndromem (PMS). pocity úzkosti a septický šok Lze předpokládal, že sloučeniny ze vzorce i mohou být účinné také při prevenci a žíněné tolerance vůči opiátům a diazepinúm, léčení drogové závislosti, při úlevě od bolesti a léčbě migrény a jiných vaskulárních bolestí hlavy. Sloučeniny předkládaného vynálezu mohou také vykázal užitečnou iinunosupresivní aktivitu, být prospěšné při léčení a profylaxi zánětů, při léčení poruch gastroirileslinální pohyblivosti a při vyvolání porodu. Tyto sloučeniny mohou být také užitečné při léčbě rakoviny, která vyjadřuje synlázu oxidu dusičného.

oioucenmy počne vzorce i uuciou piavciepououne zviaste pouziteme pí i íčcne neoo prevenci neurodegenerativnieh problémů nebo migrény nebo pro prevenci a změnu tolerance vůči opiátům a diazepmům nebo pro léčbu drogové závislosti a především při léčbě nebo prevenci neurodegenerativnieh poruch. Především se zajímáme o případy vybrané ze skupiny sestávající z hypoxie, ischemie, infarktu a amyotropieké laterální sklerózy.

Tím. v souladu s dalšími aspekty vynálezu, zajišťujeme použili sloučeniny podle vzorce 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli jako léčiva.

rooie jméno rysu tonoto vynaiezu zajíst ujeme použití sioučemny ze vzorce I nebo její íarniaeeutieky přijatelné soli při výrobě léku pro léčbu nebo prevenci výše uvedených onemocněni nebo stavů, a metodu léčby nebo prevence jedné z výše uvedených chorob nebo stavů, což zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny ze vzorce i nebo její farmaceuticky přijatelné soli osobě, která je citlivá na takovou chorobu nebo na takové slav.

• · • ·· · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · !()

Pro výše uvedené terapeutické indikace se bude samozřejmě podaná dávka lišit, stejně jako se bude lišit použitá sloučenina, způsob podání a předpokládaná léčba. Avšak všeobecně vzato, uspokojivých výsledků je dosaženo, jestliže jsou směsi podány člověku v denní dávce v pevné formě v množství mezi 1 mg a 2000 mu.

Sloučeniny podle vzorce 1 i jejich farmaceuticky přijatelné deriváty mohou být používány samostatně nebo ve formě vhodných léčivých přípravků a podávání.

|z o ?. i c ,

Podle vynálezu je poskytována farmaceutická ^sloučenina) obsahující pokud možno méně než 80% a ještě raději méně než 50% sloučeniny podle vzorce i, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, spolu s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Z-ajisi ujeme taxe zpusoó přípravy tasoveno larmaceuti

Icot^ípo iltř 'síožeiý, která zahrnuje míšeni ingrediencí.

Příklady takových ředidel a nosičů jsou; pro tablety a dražé: laktóza, škrob, mastek, kyselina stearová; pro kapsle: kyselina vinná nebo laktóza; pro injekční roztoky: voda, alkoholy, glycerin, rostlinné oleje, pro čípky: přírodní nebo ztužené tuky nebo vosky.

Sloučeniny ve formě vhodné pro orální, tj. esofageální podání zahrnují: tablety, kapsle a dražé, dlouhodobě uvolňující směsi zahrnují lakové, v nichž je aktivní příměs vázána na íoniorneriičovou pryskyřici, která může být potažena difúzní překážkou, která modifikuje uvolňovací vlastnosti orvskvřice.

Doporučujeme, aby směs obsahovala až 50%, nejlépe do 25% hmotnostních sloučeniny podle vzorce I nebo jejího farmaceuticky přijatelného derivátu.

Syntéza enzymu oxidu dusičného má množství isoforem a sloučeniny podle vzorce 1 a jejich farmaceuticky přijatelné soli mohou byl pioíříděny ohledně inhibující činnosti syntézy Oxidu dusičného postupy, které jsou založeny na pracích Bredta a Snydera v Proč. iNati.rt.cau. Sci j ivvuj, 6/, ooz-oď? a rorsiermanna ei ai., c.ur. j. marni. (ivvzj, zzj, ioiÍ65 následovně. Syntéza oxidu dusičného konvertuje Ή-L-arginin na Ή-L-citrulin, který

• · · • · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· může být separován kaliontovou výměnnou chromalografií a počítáním.

kvantifikován seinlilačním • ·

Lndění A trti i nuem na mmuicni axiivnu neuronami svmazv oxiuu uusieneno enzym byl ízoiúvan z hippocampu nebo malého mozku krysy. Hippocampus nebo malý mozek samce krysy Sprague-Dawley (250-275 g)je odňat zvířeti po anestezi CO2 a stětí hlavy. Na hladině plovoucí směs (supernatant) z malého mozku nebo nippocampu je připlavena homogenizací v 50 mM Tris-HCl s tlumicím roztokem 1 mM EDTA (pH 7,2 při 25°C) a cenlrifugací po dobu 15 minut při 20.000 g. Reziduální L-arginin je odstraněn ze supei natantu chromatografií postupně pomocí sloupců sodíkové formy a vodíkové formy Dowex AG-50W-X8 a další cenlrifugací při 1000 g po dobu 30 sekund.

rro anaiyzu je prioano zjlu nnairnno supernaianiu oo Kazae z vo misek (z unraem desky s 96 miskami) obsahujících 25pi roztoku L-argininu (s koncentrací 18 liM ^!H-Largininu, 96 nivi Ή-L-argininu) a také 25μ1 analytického ústojného roztoku (50 mlvi HEPES, ImM EDTA, 1,5 mM CaCE, pH 7,4) nebo 25 ni testovací směsi v ústojném roztoku při 22°C. Do každé testovací zkumavky je přidáno 25μΐ kompletního analytického ' . ’ ¹1 . 1 z r r\ i r γχύ a ir x λ z> m 1 x 4 τ-χτ'ττ ι oo x λ usiojneno ιυζιυκιι uu πηνι rwmd, i ttiivi i,? nnvi cavi2 i πηνι υιι, ιυυμινι

NADPH, lOug/rnl kalrnodulinu, pH 7,4) pro nastartování reakce a reakce je ukončena po 10 minutách přidáním 200 μΐ kaše ukoněovacího ústojného roztoku (20 mM HEPES, 2 mM r^-1 Γ'χ'Τ' * i t r r \ t . > ’ Γ'χ a r rw \ r a / rx zx a r\r\ 1 cu 1 λ, pn 3,3) a pieuva uowex /wj-juw-ač zoo-^υυ ok.

Značený L-citrulin je oddělen od značeného L-áiginnlu filtrováním každé filtrační desky a 75 μΐ každé ukončené reakční látky je přidáno k 3 ml seintilačního koktejlu. Leitruiin je poié kvantifikován scintilačníin počítáním.

V typickém experimentu za použití eerebelární vrchní vrstvy se bazální aktivita zvýší o

000 dpm/in! vzorku nad srovnávací reakcí, která má aktivitu 7 000 dpin/rril. Referenční standard N-nítro-L-argínm, který poskytuje 80% útlum syntázv oxidu dusičného při koncentraci i uM. je testován ve zkoušce pro ověření tohoto postupu.

• v

Třídění B (B) Třídění na indukovanou inhtbičnt aktivita neuronální svntázv oxidu dusičného

Enzym je po mouKCi popraven z Kuitivovanycn nasKycn ounecnvcn unii koiorekláiního karcinomu, DLD-i (získaného z Evropské banky buněčných kultur zvířat, European Collection of Anirnal Cell Cultures). Buňky DLD-1 jsou kultivovány v médiu R.PMI 1640 doplněném 10% sérem zárodku krávy, 4mM L-glutaminu a antibiotiky (i00 jednolek/ml penicilínu G, i 00 pg/ml streptomyeinu a 0,25 pg/m! ampnoterieinu B) a i 00 pg/m! kanamycinu. Buňky normálně rostou v 225 cm' baňkách s obsahem 35 mi roztoku a jsou udržovány na teplotě 37”C a při zvlhčené atmosféře s obsahem 5% CO?.

Syntéza oxidu dusičného je produkována buňkami v reakci na mterferon - okolo 250

TIZ...1II , 1 ΛΛΑ I II...I ΙΓΜ.. ΑΛΑ IT/...I II / . ΑΛΑ I I Z...1 T* ΙΓ -,Ρ. Π _ 1 ,Ζ Π AA I. . j:, u/miiL-i, iuuu u/ini irisy, zuu u/uii iL-o a zuu u/iin iixr-ana.ro upiynuu i/-zu iioum v kultuře je provedena sklizeň buněk ěk seškrábnutím vrstvy buněk z povrchu baňky do kulturního roztoku. Buňky jsou sebrány eentníugací (lOOOg po dobu 10 minut) a lyzát připraven přidáním roztoku s obsahem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 při 20°C), 10% (v/v) glycerolu, 0,1% (v/v) Tritonu-X-lOO, 0,1 pM dithioíhreiíolu a koktejlu inhibitorů proleázy obsahujícího leupepun (2 pg/ml), inhibitor trypsinu ze sojových bobů (10 pg/ml), aprolmin (5 pg/ml) a fenylmetylsulfonyl fluorid (50 pg/ml) uo buněčných pelet.

r\ i · /> r 11 i . · i i . ' , t r c\ \ ι , · τ τ ζ~χΐ / τ τ -ύ r ν ΛΛΟΛη λ r\ r\ λ λ rro zkoušku je zd pi Komejiu suDsrraru pumivi iris-nn jpn /,3 pn zu c j, nou ρινί NADPH, 20 prví návin adenin dinukleoíidu, 20p’v1 návin monoilukleotidu, 4 pM tetrahydrobiopterinu, i 2 pM L-argininu a 0,025 pCi L-['H] argininu) přidáno do misek hllraění desky s 96 miskami (velikost otvoru 0,45 pM) s obsahem 25 pl roztoku testované směsi v 50 iriAI Tris-HCl. Reakce započne přidáním 50 pl buněčného lyzátu (příprava víz výše) a po inkubaci po dobu i hodiny při pokojové teplotě je ukončena přidáním 50 pl !4 ·· ·* ·*· «· ·· · ·« ·· » · · I

99 k · · «

I * · · • · · · « • · <

** ·«

Značený L-eitruhn je oddělen od značeného L-argimnu s použitím Dowex AG-50VV. Ke zkušební látce je přidáno 150 μΐ 25% hydratační kaše Dowex 50W (ve formě Na+) a poté je celek filtrován na deskách s 96 miskami. Ze 70 μΐ filtrátu jsou vytvořeny vzorky a přidány do misek v desce s 96 miskami s obsahem pevné seinlilační látkv.

Poté, co vzorky uschnou, je L-citrulm kvantifikován seinlilačníin čítáním.

V typickém experimentuje bazální aktivita 300 dprn na 70 μΐ vzorku, což se zvýší na 1900 dprn v reagenčních kontrolách.. Aminoguanidin, který dává IC50 (50% koncentrace inhibitoru) při 10 μϊνΐ, je testován jako standard za účelem prověření postupu.

i nclém L (C) Třídění na inhibující aktivitu endoteliální syntázy oxidu dusičného

Enzym může být izolován z endoleliálních buněk lidské pupeční žíly (human umbihcal vein endothelial cell, HUVEC) postupem založeným na práci Poliock et al. (1991) Proč.

XI-, A . . 1 f’ · η n i n tív. i rx λ ct λ γα ví i tt ti m rx 1. 1 .1 .......... - .1 ΓΊ . ...Z -- Ζ-» - .... í f' - ..

ixai. .-vcau sci., oo, ιυηου-tunon. duiikv nu vra uyiy zakoupeny ou viuileucs coip isati Diego, Kalifornie, Spojené státy) a kultivovány ke shluknutí. Buňky mohou být živeny k průchodu 35-40 bez významných ztrát výtěžku syntázy oxidu dusičného. Jakmile buňky dosáhnou shluknutí, jsou opětně suspendovány v Dulbeecově fosfátovém slaném úslojném roztoku, odstředěny při 800 ot./rnin. po dobu 10 minut, pelety buněk homogenizovány r r\ a <

v ietlove chladnem roztoku jomiVi ins-HCl, i mM EDTA, 10% glycerolu, 1 mrví iciiyiiiieiyibunuiiyinuui luu, z μινι íeupepimu pn pn %z. ru ctniunugaci pii jh duu uiacKacn za minutu po dobu 60 minut je peleta rozpuštěna v homogenizacnim úslojném roztoku, který také obsahuje 20 mívl CHAPS. Po 30 minutách inkubace na ledu je suspenze odsířeďována při 34 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minul, 'výsledná vrchní vrstva je uložena při -80C až do použití.

Pro zkoušku je přidáno 25 μΐ konečné vrchní vrstvy do každé misky z desky o 96 miskách, obsahující 25 μΐ roztoku L-argininu (o koncentraci 12 μΜ ^!H-L-argininu, 64 nM Ή-L-agininu) a také 25 μί zkušebního tlumicího roztoku (50 mM HF.PES, 1 mM EDTA, i,? rnivi tací?, pn /mj neoo Z3 μι zkuseDm směsi v uumicim rozroxu pn zz o, uo kazue . 1..1.. ___ ne .1 i._ _i. v ~1 ____x_i... / c r\ ...» t urnrr 1 niisKy uyiu pnuauu zj μι Ruinpieuiinu zRUseuninu iiuinicmu iuzluru iju iuivi πεγεο, i . . A Λ Γ’ΓΧΤ' Λ I í* - - A Λ I .. . A 4 1 ΖΧΖΧ ,.ΑΑ XI Α ΓΑ Γ»Τ Τ ΙΟ 1 1 _ 1 ... . .1. . 1 ’ 1 Ο . . Α <

ιπινι cum, ι,3 iuivi vavi2. ι πιινι υ ι ι, ιυυ μινι i\nurn, ιυ uu/mi Kainiouuunik ιζ μινι íetiahydrobiopterinu, ρΗ 7,4) pro spuštění reakce a reakce se zastaví po 30 minutách j: ^xíxía ,.ι ΓΛΛ/ l.y. 1...1-...:1.. , l.-1. _ _ ... . i.. /-> íx ..a i i irnrr -x ... a a rrvri piiuaiiim zuu μι 3cr/o Rase URUiíCuvacinu iiuuiicinu ιυζιυκυ ιζυ unvi πεγε3, z iuivi i:u i λ, pn 3,3 ) a uovvex a\cj-3uvv-.\o venkusi υκ,η ζυυ-ηυυ.

Značený L-ciíruiin je oddělen od značeného L-arginmu filtrací do jiné desky s 96 miskami a 75 ul každé ukončené reakce je přidáno k 3 ml scintiiačnírio koktejlu. L-citrulin je poté kvantifikován scmtilačnim počítáním.

V typickém pokuse je základní aktivita zvýšena 5000 uprn/ml vzorku nad srovnávacím reagentem, kíeré má aktivitu í 500 dpm/ml. Referenční standard. N-nitru-L-arginin, která poskytuje 70-90% útlum syntázy oxidu dusíku při koncentraci i μΜ je prověřena ve vzorku pro ověření postupu.

Směsi mohou být také testovány ve vzorku ex-vivo pro stanovení rozsahu infiltrace v mozku.

fříděni ϋ (D) Rozbor ex vivo na inhibujíct aktivitu neuronální syntázy oxidu dusíku samcům Krys opiague-uawiey izju-z/j gj oyio muavenozne pouano io rng/Kg zkušební směsi rozpuštěné v 0,9% solném roztoku nebo samotný solný roztok pro kontrolu. V předem stanoveném čase (typicky 2-24 liouin) po podání byla zvířata zabita, vyňal malý mozek a supernatant (na povrchu plovoucí část) připraven a analyzován na aktivitu syntázy oxidu dusíku, jak bylo popsáno v Třídění A.

Jako další potvrzující zkouška byla aplikována část supernaiantu malého mozku do sloupce 2-5-ADP Sepharose (který váže syntázu oxidu dusíku) a následně vyluhovaná NADPH. Eluent byl testován na aktivitu syntázy oxidu dusíku poule postupu v Třídění A.

Sloučeniny, které pronikly uo mozku krysy a bránily neuronální syniáze oxidu dusíku měly za následek sníženou aktivitu oxidu dusíku jak v preparátu supernaiantu tak v elueniu ze sloupce 2-5-ADP Sepharose.

V jednotlivých tříděních na útlum činnosti syntázy oxidu dusíku je aktivita sloučeniny vyjádřena jako 1C50 (koncentrace substance léku, která dává 50% útlum enzymu při analýze). Hodnoty IC50 pro zkušební sloučeniny byly zpočátku odhadnuty z tlumící

I *7 i / .1.,¹½ . i i η _ i r> r\ dKiiviiv i. iv a ιυυ ρινί roztoků sloučenin. Sloučeniny, které uílumilv enzym o minimálně

3o~/o pn iu μ ivi, oviv testovaný znovu s použitím vnouncjsicn Koncentraci ihk, auy oyia stanovena hodnota ÍC₅<>

V třídění A výše (třídění na aktivitu vzhledem k neuronáiní isoformě syntázy oxidu dusíku) dala sloučenina z níže uvedeného příkladu 1 IC50 s méně než ΙΟμ,Μ, což naznačuje, že pravděpodobně vykáže využitelnou terapeutickou aktivitu.

V tříděních B a C (třídění na aktivitu vzhledem k makrofágům a endoteliálním izoformám syntázy oxidu dusíku) dala sloučenina z příkladu i hodnoty IC50 vyšší 1 ukrát než byly dosaženy v třídění A, což naznačuje, že vykazuje žádoucí selektivitu.

Sloučeniny z přikladli 2 byly také testovány v třídění A a také daly hodnotu 1C50 nižší než iuuiví. Proto se u iéto sloučeniny také předpokládá užitečná terapeutická aktivita.

Srovnáme-li sloučeniny z předešlé techniky, mají sloučeniny ze vzorce 1 a jejich farmaceuticky přijatelné soli výhodu, že mohou být méně toxické, účinnější, déle působící, rníl širší rozsah působnosti, být účinnější, selektivnější vzhledem k neuronáiní izoformě enzymu syntázy oxidu dusíku, vytvářet méně průvodních příznaků, být snadněji absoibovateíné nebo mít jiné užitečné farrnakoiogické vlastnosti.

Vynález je ilustrován následujícími příklady, aniž by jimi byl omezen:

uriKiaa 1

N-( i ,2,3.4-telrahydiOÍsoquinolin-7-yl)etyl ester kyseliny karbamimidothiové (a) 2-(7-amino- i ,2,3.4-tetralivdiOisouuinoiin)2,2.2-ti líiuoiOacetamiu K roztoku 4,21 g (23,6 mmol) 7-nilro-i,2,3,4-letrahydroisoquinolinu a 3,6 mL (926 mmol) trietvlaminu v i00 mLK meíylen chloridu bylo přidáno při 0°C 3,5 mL (25mmol) anhydriuu kyseliny tri Ω nor octové. Reakční směs byla míchána přes noc. Reakční směs byla extrahována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Vodní fáze byla převedena na zásaditou a extrahována inelylen chloridem. Suchá organická fáze (síran hořečnalý) dala N-(7-mlro1.2,3,4-íetiahydiOisoúuinohn) li iuuoroačetauiid jako žlutou pevnou látku. Tato sloučenina byla okamžitě sebrana v 200 mL etanolu, bylo přidáno 0,50 g 5% palauia na uhlíku a směs byla hydrogenována na přístroji Parr Hydrogenator při 45 psi po dobu 1,5 hodin. Katalyzátor byl odstraněn filtrací a rozpouštědlo bylo odpařeno. Reziduum bylo smícháno $ 100 mL petioléíei u, čímž dalo 5,45 g (95%) sloučeniny uvedené v titulu ve formě šedé pevné látky, bod tání ó 1 -3°C.

(bi i ,2,5.4-lelrahvdroizoquinoiin-7-thiourea

K roztoku 1,3 mL (9,7 mmol) benzoylu izolhiokyanálu v 13 mL acetonu při zpětném toku bylo rychle přidáno 1.25 g (5,12 mmol) 2-(7-ainino-l,2,3,4-teii'ahydtOizoc|umolÍnu) tnfluoroacetamidu v takovém poměru, aby byl kontrolován zpětný tok. Po ukončení adice byla reakční srněs míchána po dobu 3 hodin. Při chlazení byla sebrána pevná látka a byla propláchnula 30 mL acetonu, čímž poskytla 1,74 g (83%) středního l-benzoylu-3-[2-(2-22-ti iuuoiúacěiamidu) 1,2.3,4-teÍrahydiOÍzoquiiiolin-7-ihiouiey] ve formě bělavé látky. Tato sloučenina byla okamžitě přidána k 20 mL 5% roztoku hydroxidu sodného a výsledný roztok byl zahříván na 80°C po dobu 1 nodinv. Po ochlazení na teplotu okolí byl roztok filtrován, čímž poskyil 0,78 g (74%) sloučeniny uvedené v titulu, bod tání 198-203^uC.

(c) N-(l.2,3,4-tetrahvdroisoquinoiin-7-yDetv! ester kyseliny karbamimidothioické

K roztoku o,/? g (3,61 iimioi) i,z,j/+-tetranyuroi$oqumoiin-/-lniourey v iu díl izopropanolu bylo přidáno 0,35 g (3,7 mmol) kyseliny inetansulfontcké ve 2 mL izopropanolu. Reakční směs byla míchána čtvrt hodiny před přidáním 0,85 mL (8,4 mmol) etyl metansulfonátu. Reakční srněs byla zahřívána ve zpětném proudění po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo bylo oddestilováno ve vakuu na olej, který byl rozpuštěn ve 100 mL vody.

Vodní fáze byla přeměněna na zásaditou pomocí saturovaného kyselého uhličitanu sodného a vodní fáze byla extrahována okřát pomocí lOOmL metyien chloridu. Smíšené extrakty byly vysušeny přes síran hořečnatý a koncentrovány, čímž vzniklo 0,61 g oleje, který v klidu ztuhl. Sloupcová chroinatograíie na silikagelu použitím 10% metanolu v chloroformu • ·· · • · · · · · saturovaného čpavkem uoskvtla 0,45 u (53%) sloučeniny uvedené v titulu ve formě bílé pevné látky.

A Λ C' / / » 4 < I I λ iVIX ZXU (IVITI i).

in-j-( /.(( i j-cnioi oienyi nnelvi a mety!lammoiitiuanvileivi ester Kysenny karbamimidothiové (a i /-( t j-enioi oienvi jKaroonyi laniino-j-nitroiiiuan

K hydrochioridu 2-amino-5-niiroindanu (1,5 g, 7,0 mmol) v metylén chloridu (50 ml) při 0°C byl přidán trieíylamin (2,1 ml, i5,0 mmol) a následně 3-chiorobenzoy! chlorid (i,0 ml, 7.5 mmol). Směs byla okamžitě nasypána do vody a vrstvy odděleny. Vodní vrstva byla extrahovaná metylén chloridem (2 X 20 ml) a srnísené extrakty propláchnuty vodou.

vysušeny pres iVigbUj, iillrovány a koncentrovány na olei, který byl homogenní podle clu omatouralie na tenké vrstvě (TLC1 a použit okamžitě v následuiícírn kroku:

1V1.5 (IVI+H) =?!/.

_____ i\.___x-j\_____, r ..:,...-:..4-.1 υ/χρ-υιιυι uicnyi jiuciyi jaiiiinu-j-iim mniian

K 2-((3-c'nioiofeny])karbonyl)amnio-5-nitioindanu (2,2 g 7,0 mmol) v kyselině nr in n i i τ i ir / i rv κ ,i r ... J -> c leuaiiyoioiiSiove [inrj t/j inu ovi po KapKacn pnaavan oni.inr u.u ivi, jj nu, j?

. 1. 4 .1*mmol). Směs byla reřluxována po dobu 12 hodin, zchlazena na 0°C, prudce ochlazena pomocí 4N HC1 (60 ml) a reíluxována po dobu 1 hodiny. Výsledný roztok byl odpařen na oiej, kicry Pyi změněn na zasadily pomoci 50% NaOH a extrahován meiyien chloridem (J A ml). Smíšené extrakty byly promyly vodou, vysušeny přes MgSCL. filtrovány a

I ΓΑ A I ΤΛΊ nitroindan: (2.1 u, 88% ve dvou krocích); bod tání 234-237°C.

Koncentrovaný na oiej. /.pracovaní irrt/nci poskvuo z-lu-cnioioieiiyu meiyimrnmo-?• · • ·

2U • · · · · • · · · (c) 2-((3-čhloroíenvl)meivl)(metvl)amino-5-iiitíOindan

IX

2-((3-eh!oi'0fenyl)melyl)amin0-5-nitroindanu (4,4 g. i 4,5 mmol) v kyselině mravenčí (5,5 ml) byl přidán formaldehyd (12 ml). Směs byla ohřívána, aby refluxovala, po dobu 30 minul, zchlazena, neutralizována pomocí 2N NaOH a extrahována etyí acetátem (3x70 ml). Smíšené extrakty byly promyty vodou, vysušeny přes MgSCh, filtrovány a koncentrovány na olei: (4,2 g, 9i%); M.S. (ivi+H)’ = 3 i7.

(ú i z-(j j-cnioiOienyi)rnetyi mrnetyi/arnmo-j- arninouenzen

K z-ii-i-ciiloroienyijnietyijiineÍyijainino-j-nilioniuanu (4,j g, i5,0 inmoij v 85% rvcon/rijo t ιου tni) ovi pnuan κυνυνν zinek t /, i g. ιυν.υ minou, dmeš uyia miciiana po dobu 5 minut, filtrována přes celit [celíte] a odpařena na olej. Olej byl vylit do zásadité vody a extrahován elvlacetátem (3 X 100 ml). Smíšené koncentráty byly promyty vodou, vysušeny přes ivigSOj, filtrovány a koncentrovány na olej; (3,6 g, 92%), M.S. (ivi+H) =

Zň /.

• · · ·

2!

• · » · · » · 1 * · · · • · • · ' (e) 5-(2-(((3-chÍoforenyl)metyl)(melyl)amtno)indatiyl)- i -benzoyl-2-thiourea

K roztoku benzoyl izolhiokyanátu (2,7 g. Ió,5 mmol) v I5 mí suchého acetonu předehřátého na velmi jemný refiux bylo přidán rychle tak, aby bvi silný refiux pod '-í f Í .t.t .... P... IV.

KOniíoiOiL z-uj-cnioroienviinieiviHnieiviiamíno-j-ainiiiooenzcn u, ππηυυ rozpuštěný v I0 rnl suchého acetonu. Reakční směs byla refluxována po dobu 30 minut, nalila na led za intenzivního míchání, a extrahována etvl acetáíem (3 X 100 mi). Smíšené * * r· za extrakty byly promyly vodou, vysušeny pres iVlgbUj, iiilrovany a koncentrovaný na pevnou \ n i -a r\ O z íaiKu, Kiera ovia reKiysraiizovana z ir.v i.-»,iz g, Wo): dou raní ιζδ-iuu v (0 5-(2-(((3-chlorofenyl)metyi)(metyi)amino)indanyl)-2-thiourea dmeš j-(z-Hi.i-cnioroienyi)meÍyiAmelyijannnojinuanyi)-1-oenzovi-z-tniourey o,i g, 7. i2 mmol) a 40 m! 2,5 N vodného hydroxidu sodného bylo zahřáto na 90C po dobu 35 minut a mícháno. Teplá reakční směs byla nalita do 60 mi vody za stálého míchání. Pioduki byl extrahován do tří dávek metylenchlondu. Smíšené extrakty byly promyly vodou, vysušeny přes síran horečnatý a koncentrovány do sucha, U rezidua byla provedena čni omaíogiabe přes siiikagěl (8. i etylaceiát/hexan) a reziduum bvio koncentrováno na olej:

(2.2 g. IVI.Í5. (IVI + I-I) = 2-40.

(g) N-5-(2-(((3-cliioiOÍenyi)metyl)(metyl)amino)iiidaiiyl)etyl ester kysehuv

5T2-(((3-chioromnyi)oieívi)(inety'i)amino)indanyÍ)-2-thiourea (2.2 g, 6,33 ininoi) byla rozptýlena v 20 ml elanolu 200 a směs byla zpracována 0.41 ml kyseliny metansulfonové a n 1,35 mí etvl meiansulíonatu. Směs byla refluxovana po dobu 4 hodni, odpařena, upravena na zásadu nasyceným hvdi ouhličitanern a extrahována metvien chloridem (3x30 rnl).

dmisene exirakiv oyiy promyly vooou, vysušeny pres ivigdu.}, mirovany a Koncentrovaný • · · · · · · * • · · · • 9

na olej, který byl rozpuštěn v etyl acetátu a ošetřen IPA/HCl. Pevné látky byly filtr ovaiiv a omyty 1PA: (2,40 g, 83%), bod tání dec > 150^l’C.

rriKiaa j

Lzinyúrucnioriů etyi ester Kysenny

X 1

1NJZ.

-metyl- i ,2.3.4-tetralrydroísoC|Uinolin-7-yl) karbamimidothiove iroehlorid (a) 7-mtro-2-metyl-1.2.3.4-tetrahydroÍ2oquinolin nyui

Roztok 4,00 g (18,7 mmol) 7-nitroizocjuinoiinu v 10 ml kyseliny mravenčí a 17 ml 38% vodného formaldehydu byl ohříván při refluxu po dobu 1 hodiny. Reakční směs byla ochlazena, nalita na led a učiněna zásaditou pomoct vodného čpavku. Gumovité reziduum, které se vysráželo, bylo dvakrát extrahováno pomocí inelylenchlondu. Suchá (síran hořečnatý) organická fáze byla koncentrována, aby poskytla hrubý 7-nitro-2-metyl-l ,2,3,4tetrahydroisouuinolin ve formě hustého oleje. Tento olej byl okamžitě zachycen etanolern (50 rnl) a do roztoku byl přidáván roztok kyseliny chlorovodíkové v etanolu, dokud nebyl roztok zřetelně kyselý podle lakmusu. Byl přidán éter, aby vyvolal srážení a byla sebrána vysieuna pevná mísa υ ninouiosu j.vv g ivj/o) uiuiin Sloučeniny ve loiine Ziuie pevne látkv, bod tání 236-8°C (dec).

(b) 7-arnino-2-nietyi- i ,2.3,4-tetralivdroizoquinolin hydrochlorid

Suspenze 3,98 (i 7,5 mino!) 7-nilro-2-metyl-1,2,3,4-tetraliydiOÍzoquinolin hydrochlondu a 0.4 g 10% paiádta na uhlíku v 200 rnl etanolu byla hydrogenována při 50 psi po dobu 2 hodin. Katalyzátor byl filtrován a promyl malým množstvím vody. Filtrát byl koncentrován, Čímž vznikl vodný roztok. Absolutní etanol byl přidán a následně odpařen, čímž odvedl přebytečnou vodu až vznikla pevná látka. Tato pevná látka byla rozpuštěna v borkérn etanolu (60 ml) a pro vyvolání krystalizace byl pomalu přidáván éter. Produkt by sebrán v množství 3,38 g (97%o) titulní sloučeniny ve founě bčlavé pevné látky, bod tání • · · · • · ·· ··· · (c) 2-inelvl-i ,2.,3,4-ičliahydiOizoquiiioiin-7-LhiOurča g (ί 9,5 mrnol) Ivydrochlondu 7-aniino-2-rneiyl-1,2,3,4ietrahydroizoquinoiinu v i 00 mi vody byl učiněn zásaditým roztokem uhličitanu draselného a byl dvakrát extrahován tneiylén chloridem. Suchá (síran hořečnalý) organická fáze byla i - ~ ..x- ~ .λ .. .. i-_ .. .4.1 - ·> i zrxrxn / \ .,1...: i. x „ „ . . _ i' x _ i ...: _ nr _χ _ i ,: i._ .i

Kulicemiuvdiia, auy pus.\yiid ,),u y [yy/oj vonic uaze vc lOimc oicjc. i cmo oicj DVí zachycen v acetonu (75 ml) a uo 100 rnl acetonu bylo přidáno 2,21 g (19,4 mmol) kyseliny Irifiuorooctové. Roztok byl zahříván na refiux, kde bylo po kapkách přidáváno 5,2 ml (39 mrnol) benzyl ízolhiokvanátu. Reakční směs byla ohřívána po dobu 1 hodiny a pak ochlazena na okolní teplotu. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a výsledný olej byl zachycen v metanolu (150 tni) a 2.5 M hydroxidu sodného (50 ml). Tento roztok byl zahříván na 65°C po dobu jedné hodiny a pak ochlazen na teplotu okolního prostředí. Metanol byl odstraněn ve vakuu a vodný roztok byl chlazen, aby se produkt vysrážel. Pevná látka byla shromážděna v množství 2,22 g titulní sloučeniny ve formě lehce nažloutlé pevné látky s bodem tání Í84-6°C. Získali jsme také druhou várku titulní sloučeniny (0,79 g, (d) N-(2-nietvi-1.2,3,4-tetrahydroizoquinoiin-7-yl) diliydrochiorid eíyl ester kyseliny karbamimidothiovf ix suspenzi υ.δδ g (u,o minou z-meíyt-1 ,z,3,4-teíranyuroizoquinoiinu-7-lniourey v 8 ml izopropanolu bylo přidáno 0,39 g (3,9 mmol) kyseliny melansulfonové. Roztok byl ohříván na refiux půl hodiny, aby bylo zajištěno vytvoření metansulfonátové soli, protože jak sůl tak volná báze byly nerozpustné v izopropanolu. K tomuto roztoku bylo přidáno 1,5 ml (14 mmol) eiylnielansulfonálu a zahřívání pokračovalo přes noc, čímž vznikl čirý roztok. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a výsledný olej byl zaehycen ve vodě. učiněn zásaditým uhličitanem draselným a dvakrát extrahován rneiylenehioridem. Suchá (síran hořečnalý) organická íáze byla koncentrována, aby byl získán olej. Tento olej byl zachycen v eianoiu a okyselen kyselinou chlorovodíkovou v eianoiu. dokud v lakmusu nebyl zřetelně kyselý Bvl přidán éter a vznikla sůl ve formě viskózního oleje. Rozpouštědlo bylo • 9 • · uekantováno a olej byl několikrát propláchnut éterem. Olej byl zachycen uo vody (25 roztok byl zpracován odbavovacím uhlíkem. Roztok byl filtrován a filtrát byl zředěn na 500 ml vodou. Tenio roztok byl vysušen zmrazením, čímž vzniklo 1,06 g (78%) titulní siuucemny jaw niononyuiai. ividiv i/ zju (μτπ), ínívik (Ulviou/uzu) /,jj (U, in), /,1/ z - 1 n\ λ z z*:.._i ' - otn -> r\ o x z... ztt\ o » -7 /_ ->n\ i on οτη (5, 1 Π), 151IOKC 5, ΖΠ), (lil, ΟΓΐ), J, I / (5, 3Π/, I,JV ( l, 3Π/.

. r\ ___ϊ \ .

ju mi i a

Příklad 4 tz-tnelvi-, i.z.j,H-tetí'anvoiOisoquinoiin-/-yij oinvoiOeniono rnetyi ester Kysenny

K suspenzi 1.00 g (4,52 minol) 2-metyl-i,2,3.4-íetrahydiOÍsouuinohn-7-thiouiey (příklad 3, krok (c)) v 10 ml izopropanolu bylo přidáno 0,44 g (4,5 mmol) kyseliny metansulfonové. Roztok byl míchán při teplotě okolí po dobu 2 hodin, aby bylo zajištěno vytvoření metansulfonové soli, protože jak sůl tak i volná báze byly nerozpustné v isopropanoiu. K tomuto roztoku bylo přidáno 6,7 g (47 mmol) metyl jodidu a reakční směs Dyia niicnana pres noc. rvozpousiecuo uyio oosiraneno ve váKuu a reziduum úyio rozpuštěno ve vodě, upraveno odbavovacím uhlíkem a filtrováno, aby bylo dosaženo čirého, bezbarvého vodného roztoku. Tento roztok bvi učiněn zásaditým pomocí uhličitanu draselného a dvakrát extrahován meíyienchloridein. Organické fáze byly smísenv, vysušeny (síran horečnatý) a končenu ovány ve vakuu, čímž bylo získáno 1,02 g (96%) výrobku jako volné baze. Tento olej byl zachycen v etanolu a byl učiněn zřetelně kyselým přidáním kyseliny chlorovodíkové uo elanolu. Přidání většího množství éteru způsobilo, že se sůl

1 1 ouueinajaKO oiej. twzpousieuio dvio cuerio a icnio oiej uyi neKOiiKiai propiacnnui eiereni. Tento olej byl zachycen v 250 rnl vody a byl opět upraven odbai vovacírn uhlíkem. Roztok byl filtrován a filtrát bvl zředěn na 500 ml vodou. Tento roztok byl vysušen mrazem, čímž jsme získali g titulní sloučeniny ve formě bílé pevné látky.

a λ r* /zni -v-» x z , » tx x ; n.í γλ / γμιιγ zx /rxozvi ι i x i, r\ / ·*· i < i τ τχ zx λ r\ i z v i ' ivid (ii/ no (rn-rnj. inivik (ljivi^u/ijzu.i i 1,0-11.v (siroKe, m), v,<+-v, / (siroKe,

T TX in).

I . - Z Z .1 I t T\ 7 O A í J I l Γ\ 7 10 Z- 1 1 1\ 4 0 A _ 1 -- O T TX O O O 7 Z _ 1 _ ), ου tu, inj, /(u, in), /,io ^s. ιη), β,ζ-β,υ tsuoKe m, zn), (snoxe iii,

4i_j\ τη í _ til.

um. z.o / js,Jn j, z, /u t s, ju).

• · · · «

JUDr. Ivan KOREČEK

Advokátní a patentová kancelář 160 00 Praha 6. i\a haslé sv. Jiří 9 P.O. BOX 275, 160 +) Praha 6 Česka republika ívaioKv

i. dtoucenma uouie vzorce i

Claims

ΓΛ ' II I Μ 1 v a u je aiKVi ei azo

T je saturovaný nebo nesalurovaný alkylenový řetěz Cm subsiiluovaný-(CH₂)_m-N.XY, -u-iernj? -iNm - suDSiuuovany -(un₂j_m-iNA r, neoo -υ-ιοη₂),_π - ι\(α) - en₂jb-, γι’. Mír as .. .1. _ f’i i u je ΐΝπ. vj neuo v,¾ a a b. které mohou být stejné nebo rozdílné, reprezentují celé číslo 0 až 3 za předpokladu, že součet a+b je od jedné do tří, a a Y, které mohou být stejné nebo rozdílné, reprezentují vodík, alkyl C i až 6 nebo

Skupinu “(νπ2ΜΛ nebo NXY společné reprezentuje ptpendmyi, pyrolidinyl, morpholinyl nebo tet rahyd iOtSOCj umoliny 1,

Q je fenvl případné substituovaný alkylem Ci až 6, alkoxy Cl až 6, trifluorometylem, halogenem, nitro nebo kyano, m a n nezáviste reprezentují celá čísla od 0 do 5, a její fat tnaceutteky přijatelné soli.

:. Sloučenina podle vzorce I, podle nároku 1, kde T představuje -U-(CH₂)_a-N(X)3 Sloučenina podle vzorce i, podle nároku i nebo nároku 2, kde T představuje

1 I í Z^T T \ Μ/λ/\ ZZ'T T \ _ r T .. X · . r«í t υ-ι ν^η2ΛΑΐ a mv ri2)b- u pieustavuje v,n₂ • · ··

4. Sloučenina poule vzorce 1, poule kteréhokoli nároku 1 až 3, kde T představuje tt zm i x mz v\ zr>Ti v . tt . x . j _. _. : . λί r _ i., v. j _ i. · . i u-tvri2,/b- a u pieusiavuje v n? a Kazue a a oje i.

j. dioucenina počne vzorce i, počne Kterenoxon naroKii i az % xcie u je eiyi.

6. Sloučenina podle vzorce I, poule nároku 1, který je.

N-( l.2,3,4-tetrahydroísoquinolin-7-y¹i) etyl ester kyseliny karbaniiniidotiové; N-ó-(2-(((3-ch!orofeny!)meíy!)metyi)ammo)mdanyl)eíy! ester kyseliny karbamimidothiové;

N-(2-mety'i-1,2,3,4-teírabydroiSOCjUinoiin-7-yl)etyl ester kyseliny karbamimidothiové, N-(2-rnetyl-! ,2,3,4-tetrahydiOizoquinolin-7-yl) metyl ester kyseliny karbarnunídoilioiové nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoli z nich.

Sloučenina podle kteréhokoli z nái oků i až 6 pro užití jako léč leeivo.

_z LcmpeiiCč

8. Farmaceutické» s l o že n f ýsk i á d aj í c í se ze sloučeniny, jak je nárokováno v kterémkoli z nároků i až 6 s příměsí farmaceuticky přijatelného ředidla nebo nosiče.

v. užni sloučeniny, jaK naroKovana v KieremKoii z naroKu i az o, pn vyrooe texu pro léčbu nebo prevenci neurodegeneraiivních poruch nebo pro prevenci a změnu tolerance vůči opiátům a diazepinůrn nebo pro léčbu ío.xikomanie.

!0. Proces přípravy sloučenin poule vzorce l, jak definováno v kterémkoli nároku i az o, a jejícn íarmaeeutiCKy pnjateinycn sou, coz zanrnuje (a) připlavu sloučeniny podle vzorce I, kde X nebo alespoň jeden z X a Y je alkylem Ci až 6 nebo skupin -(CH?)_nQ, reakcí příslušné sloučeniny podle vzorce í, kde X nebo jeden nebo oba X a Y představují vodík, se sloučeninou podle vzorce li

R'-L ···*
2/ kde R^! představuje alkyl Cl až 6 nebo skupinu -(CH₂)_nQ a L je odstupující skupina;

nebo (b) přípiavu sloučeniny podle vzorce 1, kde T představuje C3.5 nasycený nebo nenasyceny aikyienovy reiez suósiiiuovany -(CrÍ2)_m-iNA Y nebo -0-(CH?)2-NHsubsíituováný -(CrÍ2)_m-NXY reakcí příslušné sloučeniny, kde pieusiavuje tasycený nebo nenasycený alkylenový řetěz substituovaný -(CH?)m - L nebo -O-íCH?)?nH- substituovaný -(CHajm - L a L představuje odstupující skupinu.

se Sloučeninou pouie vzorce 111

XYNH lil

Kue λ a 1 jsou pouie uennice v naroxu 1, neuo i c) reaguji se sioucemnou pouie vzorce 1 v r

1 v r

kue T je podle definice v nároku 1, se sloučeninou podle vzorce V kde D ie nodie definice v nárol· oku 1 a l je odstupující SKupma, a Kue je to nutné neuo zauouci Konvertovat výslednou /slouČetynu na jgjrý..

lannaceulicKy přijatelnou sui neuo naopaK.