CZ241998A3 - Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká způsobu přípravy purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem za použití výměnné reakce báze nukleové kyseliny, která se provádí v přítomnosti enzymu, a mikroorganizmů produkujících enzymy, použitých pro přípravu purinové nukleosidové sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Je znám způsob přípravy nukleosidové sloučeniny za pomoci výměnné reakce báze nukleové kyseliny, prováděné v přítomnosti enzymu. Při této známé metodě se však uskutečňuje rovnováha mezi výchozími látkami a reakčními produkty, která vede k tomu, že se nedosáhne zvýšení výtěžku. Pro překonání této obtíže zveřejnění japonského patentu (Kokai) číslo 4-197193 uvádí výměnnou reakci báze mezi inosinem nebo 2'-deoxyinosinem (zde označovaným jako deoxyinosin) a pyrimidi_Λ novou bází, která se provádí ve vodném roztoku fosfátu v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy (EC2.4.2.1) a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy. (EC2.4·.2.2) a pak se hypo xanthin vytvořený touto výměnnou reakcí převede na kyselinu — močovou* pomoc í- xanthinoxidasy- tak že. se* zvýší ^výtěžek.reakce Při tomto způsobu, protože kyselina močová nemůže působit jako substrát nukleosidové fosforylasy, reakce, probíhá jednosměrně k vytvoření pyrimidinového nukleosidu.

Avšak JP 4-197193 zmíněný výše, který je usměrněn na. způsob účinné přípravy pyrimidinového nukleosidu pomocí inosinu nebo deoxyinosinu a pyrimidinové báze jako výchozích látek, neuvádí způsob přípravy purinové nukleosidové slouče·» » • · · « · »* · « · ·«« · • ♦ ·· • · · · * * · * · ·» ·· niny za použití pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze jako výchozích materiálů, které jsou snadno dostupné při nízkých nákladech. Tam, kde se použije pyrimidinová nukleosidová sloučeniná^jáko* výchozí*'látkaje“hutné· přidat enzym sloužící k rozkladu pyrimidinové báze, vytvořené výměnnou reakcí bází do reakčního systému, aby se vychýlila rovnováha a zvýšil reakční výtěžek.

Avšak příprava nebo izolace enzymu z přírodního produktu ve vysoce aktivním stavu nebyla dosud zmíněna. Jinými.,,, slovy způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny za vysokého výtěžku při použití pyrimidinové nukleosidové sloučeniny jako výchozí látky dosud nebyl zjištěn. Přirozeně to má vysokou důležitost pro vývoj způsobu přípravy purinové nukleosidové sloučeniny, která je stabilní při vysokém výtěžku.

Podstata vynálezu

Za těchto okolností původci vynálezu provedli rozsáhlý výzkum mikroorganizmů produkujích enzymy účinné pro přeměnu pyrimidinové báze získané při výměnné reakci mezi pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninou a purinovou bází, na sloučeninu nezpůsobilou působit jako substrát pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy, a zjistili, že mikroorganizmy náležející k druhům Arthrobactor species,.Bacillus species',I Pseudomonas species nebo Rhodococcus species jsou schopny produkce takových enzymů, které se objevují v tomto vynálezu.

Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu je vytvořen způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem, který zahrnuje stupeň podrobení pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vod- 3 Β Β · ««·· * ·

Β·· ném roztoku obsahujícím fosfátové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosfo_ rylasy, přičemž pyrimidinová báze vytvořená reakcí se převede mikroorganizmem nebo enzymem odvozeným z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu nezpůsobilou působit jako substrát pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové j fosforylasy.

i • Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu je vytvořen mikroorganizmus schopný produkce uracilthymindehydrogenasy a dihydrouracildehydrogenasy, přičemž tento mikroorganizmus, je vybrán ze skupiny zahrnující Arthrobactor species, YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megatearium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909).

Způsob tohoto vynálezu pro přípravu purinové nukleosidové sloučeniny využitím výměnné reakce báze. nukleové kyseliny umožňuje přípravu purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem a s vysokou stabilitou za použití startovacích látek pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze, které jsou snadno dostupné při nízkých nákladech.

Další cíle a výhody tohoto vynálezu budou dále uvedeny v popisu·/ který následuje a zčásti budou, zřejmé z tohoto popisu nebo mohou být zjištěny při provádění tohoto vynálezu.

* .* j Tyto cíle a výhody tohoto vynálezu mohou být realizovány a získány pomocí prostředků a kombinací, na které je dále příslušně poukázáno.

Popis přiložených výkresu

Přiložené výkresyl/ které jsou začleněny a tvoří část tohoto popisuj/ zobrazují nyní výhodná provedení vynálezu a spolu s obecným popisem uvedeným výše a detailním popisem

* ·* » « » · · » · · ·

A » · · výhodných provedení uvedeným dále!/ slouží k vysvětlení principů tohoto vynálezu.

-+F ₍ _ , ₄· _t J _

Gbr. 1 je graf ukazující časové změny v koncentraci každé ze složek reakčního systému v příkladu 1 obsahujícím roztok uracilthyminového rozkladového enzymu!/ a obr. 2 je graf ukazující časové změny v koncentraci každé ze složek reakčního systému v příkladu 1, který neobsahuje roztok uracilthyminového rozkladového enzymu.

Detailní popis vynálezu

První aspekt tohoto vynálezu je směrován na způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny zahrnující stupeň podrobení pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosfátové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, přičemž pyrimidinová báze vytvořená při reakci se převede pomocí mikroorganizmu nebo enzymu odvozeného z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy.

> <·

Startovací látky

Pyrimidinová nukleosidové sloučenina použitá jako startovací látka je bud přírodního typu nebo nepřírodního typu a není zvlášt omezena, pokud tato sloučenina akceptuje působení pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a vytvořená pyrimidinová báze akceptuje působení použitého rozkladového enzymu. Například pyrimidinová nukleosidové sloučenina zahrnuje uridin, deoxyuridin, 5-methyluridin a thymidin a také je možné použít nepřírodního typu pyrimidinového nukleosidu a nepřírodního deoxypyrimidinového nukleosidu.

• 49

Purinová báze použitá v tomto vynálezu není zvlášř omezena pokud tato báze akceptuje působení purinové nukleosidové fosforylasy a zahrnuje například přírodní purinové báze jako je adenin, guanin a hypoxanthin, a nepřirodní*puriný zahrnující benzimidazol, aminované puriny jako je 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin, halogenované puriny jako je 2-chlorpurin, 6-chlórpurin, 2,6-dichlorpurin a 2-amino-6-chlorpurin, a thionované puriny jako je 6-merkaptopurin a 6-methylthiopurin.

Mikroorganizmy a enzymy

V principu purinová nukleosidové fosforylasa a pyrimidinová nukleosidové fosforylasa, které jsou použity v tomto vynálezu^ mohou být jakéhokoli původu.

Enzymy odvozené z mikroorganizmů, které jsou použity v tomto vynálezu pro rozklad pyrimidinové báze nejsou zvláště omezeny, pokud tyto enzymy umožňují konverzi pyrimidinové báze vytvořené výměnnou reakcí báze na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy a zahrnují například uracilthymindehydrogenasu (EC1.2.99.1) a dihydrouracyl dehydro-.. genasu (ECl.3.1.1). Zvlášř je žádoucí použít enzymy vytvořené z mikroorganizmů specifikovaných dále a z Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191.

Jak je zde použito pomocí mikroorganizmů nebo enzymů odvozených z mikroorganizmů znamená provádění při rozkladové reakci pyrimidinové báze pomocí suspenze mikroorganizmů (to je bakteriální suspenze), nebo enzymů produkovaných z mikroorganizmů.

V souhlase s tím v tomto vynálezu mohou být použity suspenze obsahující mikroorganizmy nebo enzymy produkované z těchto mikroorganizmů pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze.

• 9

- 6 • 9 ~Φ·

9 9 «

9 9 9

9 9 *

Jinými slovy, bakteriální suspenze samotná obsahující mikroorganizmy může být použita pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze.. Alternativně enzymy produkované ze suspendovaných mikroorganizmů mohou být použity pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze.

Stabilizátor ribosa-l-fosfatu

Při výměnné reakci báze tohoto vynálezu, která se provádí v přítomnosti pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy, cukerné deriváty ribosa-lfosfatu nebo deoxyribosa-l-fosfatu se produkují jako meziprodukty. Tyto meziprodukty jsou nestabilní. Když se ponechajístát, tyto meziprodukty se rozloží během doby na cukr jako je ribosa nebo deoxyribosa a fosfátové ionty. Jestliže fosfatasa je přítomna v reakčnim systému, hydrolýza meziproduktů se dále urychlí.

Mělo by být poznamenáno, že cukr jako je ribosa nebo deoxyribosa vytvořený rozkladem meziproduktů nepůsobí jako substrát nukleosidové fosforylasy, což vede ke snížené tvorbě purinového nukleosidu nebo deoxypurinového nukleosidu. Aby se zvýšila tvorba účinku těchto purinových nukleosidových sloučenin, původci vynálezu provedli rozsáhlý výzkum ve snaze najít látku účinnou pro stabilizaci cukerného derivátu jako je ribosa-l-fosfat nebo deoxyribosa-l-fosfat a také ucmnou pro inhibici aktivity fosfatasy, přičemž nalezli kombinaci některých druhů komplexotvorných sloučenin, která je účinná pro stabilizaci cukerného derivátu a pro inhibici aktivity fosfatasy.

Konkrétně vynálezci zjistili, že je účinné použít alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující glycin, • 4

- 7 «44 · « *· « »«·♦»· 4 4

4 · ♦ · •V» · ·· ·*

4 ·4 • ••V 4

4 4

44 iminodioctovou kyselinu, nitriltrioctovou kyselinu, ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), ethylenglykol-(2-aminoethylether)tetraoctovou kyselinu (EGTA) a jejich soli v kombinaci s kyselinou boritou nebo její~solí. Zejména sé^prominentní účinek vytvoří kombinací kyseliny borité a ethylendiaminotetraoctové kyseliny.

Reakční podmínky a izolační rafinace

Pokud jde o reakční pomínky, počáteční koncentrace pyrimidinové nukleosidové sloučeniny použité jako startovací látky v tomto vynálezu, by měla být 5 až 300 mM, výhodně 10 až 50 mM. Na druhé straně počáteční koncentrace purinové báze, která má obecně nízkou rozpustnost^ by měla být 5 až 30ĎmM, výhodně 10 až 50 mM, přičemž se počítá, že všechna purinová báze, která je zpočátku přidána, bude rozpuštěna. Pro počáteční koncentraci fosfátových iontů dostačuje, aby byla 1 až 20 mM. Obecně nukleosid a purinová báze jsou uspořádány ve stejné počáteční koncentraci.

Také výtěžek produktové purinové nukleosidové sloučeniny se zvýší obecně se zvýšením poměru koncentrace nukleosidu k fosfátovým iontům.

Když se přichází ke komplexotvorným sloučeninám použitým jako stabilizátor, množství kyseliny borité nebo její soli by mělo být 5 až 200 mM, výhodně 50 až 100 mM. Na druhé straně množství protějšku kombinace, například EDTA nebo její soli, by mělo být 2 až 12 mM, výhodně 4 až 6 mM.

Hodnota pH reakčního systému by měla být 6,5 až 10,5, výhodně 7,0 až 8,0. Reakční teplota by měla být 35 až 60 °C, výhodně 35 až 45 °C.

* • · ··♦· * 4 • · • 4 44 ··« · · • · 4

Vytvořený produkt může být izolován z reakční směsi pomocí například krystalizace nebo chromatografie.

“** ^Λ ‘ 11 ·Ι|I ί||l| Φ -MO.-M TW- - -,ττ -] · _ . - ťrr Princip a teorie tohoto vynálezu

1. V prvním stadiu tohoto vynálezu reakce mezi pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninou a fosfátovým iontem se provádí v přítomnosti fosfátového iontu a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, čímž se vytvoří pyrimidinová báze a cukerný derivát, ve kterém se fosfátový iont váže k 1-poloze cukru, jako je ribosa-l-fosfat nebo 2-deoxyribosa-l-fosfat.

J

2. V druhém stadiu se substituční reakce provádí mezi cukerným derivátem vytvořeným v prvním stadiu a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy tak, že se vytvoří purinová nukleosidové sloučenina a fosfátový iont.

Při ararižování stadia 1 a 2 se výměnná reakce báze provádí mezi pyrimidinovým nukleosidem a purinovou bází v prvním a druhém stadiu v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, takže se vytvoří pyrimidinová fáze a purinová nukleosidové sloučenina.

*3

3. V tomto vynálezu reakční systém obsahuje enzym sloužící ke konverzi pyrymidinové báze na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy. Alternativně reakční systém obsahuje mikroorganizmy produkující příslušný enzym.

Je žádoucí použít v tomto vynálezu mikroorganizmy produkující enzym jako je uracilthymindehydrogenasa nebo dihydrouracildehydrogenasa, i když mikroorganizmy použité v tomto vynálezu nejsou zvlášř omezeny.

4> » • 4 4 « 4444

4

4·4 · • 4 44 • 4 4 ·

4 4 4 • · ·♦ 444 4 4 • 4 4

4« 4 4

V předloženém vynálezu příslušný enzym nebo mikroorganizmy produkující enzym jsou přítomny v reakčním systému společeně s akceptorem elektronu tak·,! že se převede pyrímidinová báze na'sloůčeninu”neschopnou''působit jako' substrátfFpro-pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu a purinovou nukleosidovou fosforylasu. V případě, kde se použije bakteriální suspenze při reakci, akceptor elektronu nemusí být přidán do reakčního systému!,! poněvadž akceptor elektronu je obsažen v bakteriích.

Mělo by být poznamenáno, že převedená pyrímidinová bázemi -která je neschopna působení jako substráty pro purinovou nukleosidovou fosforylasu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu, není zahrnuta ve výměnné reakci substrátu a tedy ' je vyloučena z reakčního systému. Následkem toho je rovnováha reakce posunuta směrem na stranu^ na které se tvoří protuktová purinová nukleosidová sloučenina, což umožňuje získat požadovaný produkt ve vysokém výtěžku.

4. Dále je možné pro reakční systém, aby obsahoval enzym sloužící dalSímu rozkladu převedené sloučeniny, když je to nutné, jak je to popsáno dále ve spojení s výhodným provedením.

Výhodné provedení

Při výhodném provedení tohoto vynálezu se uridin nebo 2'-deoxyuridin (zde označovaný jako deoxyuridin) použije jako startovací látka pyrimidinové nukleosidové sloučeniny. Purinová báze se použije jako báze nukleové kyseliny. Dále pu rinová nukleosidová fosforýlasa¹,! pyrímidinová nukleosidová fosforylasa a uřacilthymindehydrogenasa (EC 1.2.99.1), se použijí jako enzymy.

··♦· (1) V prvním stadiu se reakce mezi uridinem nebo deoxyuridinem a fosfátovými ionty provádí v přítomnosti fosfátových „iontů, a,pyrimidinové nukleosidové^fosforylasy tak,^že se vytvoří urac-il a ribssa-l-fosfat nebo 2-deoxyribosa-l-fosfat (dále zde označovaný jako deoxyribosa-l-fosfat).

(2, V druhém stadiu se substituční reakce mezi vytvořeným ribosa-l-fosfatem nebo deoxyribosa-l-fosfatem a purinovou bází provádí v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy. Purinový nukleosid a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi ribosa-l-fosfatem a purinovou bází. Na druhé straně 2'-deoxypurinový nukleosid (zde dále označovaný jako deoxypurinový nukleosid) a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi deoxyribosou-l-fosfatem a purinovou bází.

Jinými slovy v prvním a druhém stadiulj které jsou výše popsány, sé výměnné reakce bází provádějí mezi uridinem nebo deoxyuridinem a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy tak, že se vytvoří uráčil a purinový nukleosid nebo deoxypurinový nukleosid.

(3) Umožněním, aby uracilthymindehydrogenasa samotná nebo jak uracilthymindehydrogenasa a akceptor elektronu (oxidační typ) jako je NAD, byly přítomny v reakčním systémulj uráčil vytvořený rozkladem uridinu nebo deoxyuridinu se nevratně převede na kyselinu barbiturovou. Protože vytvořená kyselina barbiturová nemůže působit jako substráty purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, není kyselina barbiturová zahrnuta ve výměnné reakci a je vyloučena z reakčního systému.

999 9 «

9 «

9« ·« · 9 • 9999 • ·

999 9

- 11 Následkem toho se rovnováha reakce posune směrem na stranu na které se tvoří požadovaný produkt purinové nukleosidové sloučeniny, což umožňuje získat požadovaný produkt ve vysokém 'výtěžku?'*¹'' ' ' ' ^{ť 1} - -** ¹ - ——* - -i — (4) Dále umožněním, aby barbiturasa (EC 3.5.2.1) byla přítomna v reakčním systému^ kyselina barbiturová se rozloží na močovinu a malonovou kyselinu. Následkem toho se výměnná reakce podporuje v přítomnosti uracilthymindehydrogenasy.

Například kde se získá 2'-deoxyguanosin (zde dále ozna čovaný jako deoxyguanosin) jako produktová purinová nukleosidová sloučenina ze startovacích látek deoxyuridinu jako pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a guaninu jako purinové ^; báze, přičemž reakce se provádí následovně:

'-Ďeoxyuridin’.

PYNP ^H0 OH

Pi

N·

N

H ''NH

nh₂

2-Deoxyribosa.- Uráčil ^1_fosfat

2’-Deoxyguanosin

Guanhl·

2-Deoxyribos£^1_ fosfát · ·

9999

9 99i

9 9 9 9 « 9 9 9

99

9 99

9 9 9

9 9

9 9 9

V reakčním schématu uvedeném výšel·' zkratky PYNP, PUNP a Pi představuje popořadě pyrimidinovou nukleosidovou fosfo— rylasuU purinovou nukleosidovou fosforylasu a fosfátové ionty.

Z prvního a druhého stadia (1) a (2) popsaných dříve, se stanoví reakční schéma uvedené dále:

2’-Ďeoxyguanosin Uráčil

V tomto reakčním schématu uvedeném výše zkratky PYNP a PUNP představuji popořadě pyrimidinovou nukleosidovou a purinovou nukleosidovou fosforylasu jako v dříve popsaném reakčním schématu.

• · * • »· 44

4 «4 · «· 4 · 4 • 4 4

44

Uráčil

⁺ Akceptor elektronu

,Barbiturasa o —-II h₂n nh₂ močovina

COOH

I ch₂

I

COOH kyselina malonová

Při výhodném provedení tohoto vynálezu se uridin nebo deoxyuridin použije jako pyrimidinová nukleosidová sloučenina. Také purinová báze se použije jako báze nukleové kyseliny.) Dále purinová nukleosidová fosforylasa, pyrimidinová nukleosidová fosforylasa a dihydrouracildehydrogenasa (EC 1.3.1.1) se použijí jako enzymy.

(1) Reakce mezi uridinem nebo deoxyuridinem a fosfátovými ionty se provádí v přítomnosti pyrimidinové nukleosidová fosforylasyU čímž se vytvoří uráčil a ribosa-l-fosfat nebo deoxyribosa-l-fosfat.

99

- 14 • ta· · (2) Pak ribosa-l-fosfat nebo deoxyribosa-l-fosfat takto vytvořené se podrobí substituční reakci s purinovou bází v pří tomnosti purinové nukleosidové fosforylasy. V tomto případě ^v ' ^r ·&- I. *9-^ · -M~- -TÉ I. i. * -r . ... · - * purinové nuleosidové a fosfátové ionty se vytvoří reakcimezi ribosa-l-fosfatem a purinovou bází. Podobně deoxypurinové nukleosidové a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi deoxyribosa-l-fosf atem a purinovou bází.

v

Tam, kde se reakce (1) a (2) uvedené výše uskutečňují společně, může být řečeno, že výměnné reakce bází se provádějí mezi uridinem nebo deoxyuridinem a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, čímž se vytvoří purinový nukleosid nebo deoxypurinový nukleosid a uráčil.

(3) Umožněním, aby dihydrouracyldehydrogenasa samotná nebo jak dihydrouracildehydrogenasa, tak akceptor elektronu (redukční typ) jako je NADE byly přítomny v reakčním systému, uráčil vytvořený rozkladem uridinu nebo deoxyuridinu se nevratně převede na dihydrouracil. Takto vytvořený dihydrouracil, který nemůže působit jako substráty pro purinovou nukleosidovou fosforylasu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu, není zahrnut ve výměnné reakci substrátu a tak je vyloučen z reakčního systému. Následkem toho se rovnováha reakcae posune na stranu, na které se tvoří požadovaný produkt purinové nukleosidové sloučeniny, což umožňuje získat požadovaný produkt kvantitativně.

(4) Dále se dihydrouracil rozkládá na N-karbamoyl-betaalanin přítomností dihydropyrimidinasy (EC 3.5.2.2). Jako následek se podpoří reakce dihydrouracildehydrogenasy.

Tam, kde se například získá 2¹-deoxyadenosin (zde dále označovaný jako deoxyadenosin) jako požadovaná purinová

4 4 • 4444

4 ·· • 4 4 4 *

4 4 4 4 4

444 4 ·· ·· • 4 44

444 4 4

4 4

44 nukleosidová sloučenina z deoxyuridinu, který je pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninou použitou jako jedna ze startovacích látek a adeninu, který je použitou purinovou bází jako — -*----- -druhý-startovací - materiál, „reakce, se. provádí následovně:.

2’-Deoxyuridin

2-Deoxy ribosa. - Uráčil fosfat

Adenin

HO-i _n PUNP

Ph —

OH

2-Deoxyribosai- fosfát

2’-Deoxyadenosin + Pi

Zkratky PYNP, PUNP a Pi uvedené ve*· výše uvedeném reakčním schématu mají dříve definovaný význam.

Reakční schéma uvedené dále jě stanoveno z odstavců (1) a (2) uvedených výše:

** Φ Φ *

I φ φφφφ φ · φφφ φ φφ φ« φ φφ·φ φ φ φ φ φ φ φφ

2'-Deoxyuridin

ΝΝ'

Η

ΝΗ,

ΝΗ

PUNP

ΡΥΝΡ

Adenin

2'-Deoxyadenosin

Ο 'ΝΗ

Ν^Ο Η

Uráčil

Zkratky ΡΥΝΡ a PUNP uvedené v tento reakčním schématu mají dříve uvedený význam.

'NH

I + akceptor elektronu 'N O H

Uráčil

Dihydrouracil dehydrogenas^ 'NH

I + akceptor elektronu

N^o H

Dihydrouracil

NH

Λ_ο ^{+ H}>°

H

Dihydropyrimidinasa o

---► h₂n-c—nh-ch₂-ch₂-cooh

Dihydrouracil

N-carbamoyl-p-alanin

4 4 • 4 4·4 4 ·

• 44 4

Druhý aspekt tohoto vynálezu je směrován k mikroorganizmům produkujícím uracilthymindehydrogenasu nebo dihydrouracildehydrogenasu. Tyto mikroorganizmy jsou vybrány ze skupiny zahrnující Arthrobactor''species ’ YGK’222 (FERM'BP-^f -5907), Bacillus megáterium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas species IGK 443 (FERM BP-5909).

Mikroorganizmy produkující enzymy a jejich identifikace

Vynálezci zjistili, že alespoň jeden ze série enzymů sloužících k přeměně pyrimidinové báze na sloučeniny neschopné působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy je produkován mikroorganizmy. Konkrétně u těchto mikroorganizmů bylo zjištěno, že produkují alespoň jeden enzym vybraný ze skupiny zahrnující (1) uracilthymindehydrogenasu, (2) dihydrouracildehydrogenasu, (3) uracilthymindehydrogenasu a barbiturasu (EC3.5.2.1) a ¢4) dihydrouracildehydrogenasu a dihydropyrimidinasu (EC3.5.2.2).

Kultivační podmínky a příprava enzymů

Tyto mikroorganizmy dobře rostou v běžném kultivačním mediu bakterií a vytvářejí požadované enzymy. .Pro zvýšení aktivity enzymů je účinné přidat pyrimidinovou bázi do kultivačního prostředí. /*

Kultivované kmeny mohou být použity jako takové jako surový enzym. Je také možné získat surový enzym běžnou metodou pro využití v tomto vynálezu.

Arthrobactor species YGK 222 (FERM BP-5907),

Bacillus megáterium YGK 252 (FERM BP-5908), Pseúdomonas species YGK 443 (FERM BP-5909), a 4 · • *« ·

4

4·· 4

- 18 4 44 • 4 · ·

4 44

Rhodococcus erythropolis JCM 3132,

Rhodococcus erythropolis JCM 3191.

* - · ” — — *· ..<*·, - 'Η- -mi-*·,·· ... . .>.· n — — η, · _k . ,

Symbol JCM znamená, že kmeny jsou uloženy v Japonské sbírce mikroorganizmů v Institutu fyzikálního a chemického výzkumu (Rikagatu Kenkyusho). Tyto kmeny jsou získatelné z Japonské sbírky mikroorganizmů uvedené výše.

Ostatní kmeny to je YGK 222 (FERM BP-5907), YGK 252 (FERM BP-5908), YGK 443 (FERM BP-59Ů9), jsou uloženy v Národním institutu biovědy a humánní technologie, Agentura průmyslové vědy a technologie. Tyto mikroorganizmy YGK 222 (FERM BP-5907), YGK 252 (FERM BP-5908), YGK 443 (FERM BP-5909) byly uloženy 11. dubna 1997 podlé Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganizmů pro účely patentového postupu.

Tyto mikroorganizmy jsou uloženy pod depozitními čísly uvedenými v závorkách.

Bakteriální vlastnosti těchto uložených kmenů byly studovány podle Bergey's Manual of Determinative Bacteriology č. 8 (1975), ”Bergey's Manual of Systematic Bacteriology č. 1 (1984) a č. 2 (1986), čímž se získaly výsledky uvedené níže. Experimenty byly prováděny způsobem popsaným v Classificationand Identification of Microorganisms sestavené Takei Hasegavou, revidované vydání, publikované Gakkai Shuppan Center, 1985. Tyto údaje jsou zde začleněny formou odkazu.

Arthrobactor species YGK 222

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinka o rozměru 0,5 až 0,7krát 1,0 až 5,0 mikrometru (2) Gramův kmen: pozitivní (3) Polymorfismus buňky: je rozpoznán nápadný polymorfismus koku až tyčinky doprovázející růstový cyklus (4) Pohyblivost: pohyblivost je rozpoznána při kultivaci po dobu 5 až 24 hodin v kapalném kultivačním mediu připraveném přídavkem bujónu do kvasinkového extraktu (5) Adherentní stav bičíku: 1 až 2stranný bičík (6) Spora: žádná (7) Odolnost vůči kyselinám: žádná.

2. Kultivační vlastnosti (1) Kultivace na bujónové agarové plotně: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá, průsvitná a má drsný povrch, se vytvoří při kultivaci při 30 °C po dobu 24 hodin (2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté a průsvitné mikroorganizmy rostou dobře po celém kultivač ním médiu (3) Bujónová kapalná kultivace: růstová rychlost' je nízká. Dobrý růst byl zjištěn v třepané kultuře mající přidaný kvasinkový, extrakt. . ..

(4) Bujónová želatinová očkovaná kultura: povrchová oblast samotná je mírně ztekucéná (5) Lakmusové mléko: žádná změna

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: negativní (2) Denitrifikační reakce: negativní (3) MR test: negativní (4) VP test: negativní

- 20 • 9 9 9 9 9 9 9 · « 9 9 99 9 * 99

1999 « 9 99 9 « 9··9 · • 9 · · · · 999

999 9 99 99 99 99 (5) Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfidu: negativní ~(7)*Využití kyseliny-citronové:· - Christensen agar: negativní Koser medium: negativní (8) Využití zdroje anorganického dusíku: nitrát: pozitivní amonná sůl: negativní (9) Chromogenese: žádná £l0) Ureasa: negativní (11) Oxidasa: negativní (12) Katalasa: pozitivní (13) Oblast růstu:

pH rozmezí: 5,5 až 9,5 teplotní rozmezí: 19 až 38. °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15) O-F test: glukosa: žádná změna sacharosa: žádná změna (16/Využití různých zdrojů uhlíku

L-arabinosa D-xylosa + / '

D-glukosa +

D-mannosa +

D-fruktosa +

D-galaktosa + maltosa + sacharosa + laktosa trehalosa + «•to to to · to · · · · · · · · 9 · » · to to»·» · to · · · · ··· ♦ · • · to··* ··· ··· ě toto «to · * *·

D-sorbitol +

D-mannitol + inositol + glycerin škrob

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (molární %) = 69,6 4

Mikroorganizmy byly vyčištěny, aby náležely k Arthrobac tor species na základě bakteriologických vlastností uvedených výše.

t

Bacillus megaterium YGK 252

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinky o rozměrech l,6krát 4,0 až 9,9 mikrometrů (2) Gramův kmen: pozitivní (3) Polymofismus buňky: žádný (4) Pohyblivost: rozpoznána (5) Adherentní stav bičíku: rozpoznán, peritrichální bičík (6) Spora: sporangia nejsou zduřená, spora je elipsoidální (7) Odolnost vůči kyselině: žádná

2. Kultivační vlastnosti (1) Bujónová agarová plotnová kultivace: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá a opakní a má drsný povrch, je vytvořena při kultivaci při 30 °C po dobu hodin (2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté a opakní mikroorganizmy, mající mírně suchý povrch a drsný okraj rostou dobře podél rýhy

- 22 ·· · · (3) Bujónová kapalná kultivace: růstová rychlost je nízká. Dobrý růst je zjištěn, když se přidá kvasinkový extrakt.

)„Bu jónová želatinová. očkovaná, kultura ^ povrchová.oblast samotná je mírně ztekucená (5) Lakmusové mléko: mírná kyselost a koagulace je zjiStěna

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: pozitivní (2) Denitrifikační reakce: pozitivní

4.

(3) MR test: pozitivní (4) VP test: negativní (5) Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfidu: negativní (7) Využití kyseliny citrónové: Christensen agar: pozitivní Koser medium: pozitivní (8) Využití zdroje anorganického dusíku nitrát: pozitivní amonná sůl: pozitivní (9) ' Chřomogeneze: žádná (10) Ureasa: pozitivní (11) Oxidasa: pozitivní (12) Katalasa: pozitivní (13) Oblast růstu , pH oblast: 5,5 až 10,5 oblast teplot: 10 až 43 °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15) O-F test glukosa: žádná změna sacharosa: žádná změna

4· *

4

4 (16) Využití různých zdrojů uhlíku

L-arabinosa

D-xylosa

D-glukosa - ~ ’

D-mannosa

D-fruktosa

D-galaktosa maltosa sacharosa laktosa trehalosa

D-sorbitol

D-mannitol inositol glycerin škrob +

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (molární %) = 34,7 fdikroorganizmus byl vyčištěn, aby náležel k Bacillus megaterium na základě bakteriologických vlastností uvedených výše. .

Pseudomonas species YGK 443

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinky o rozměrech 0,4 až 0,6krát 0,6 až

2,4 mikrometru (2) Gramův kmen: negativní (3) Polymorfismus buňky: žádný (4) Pohyblivost: rozpoznána (5) Adherentní stav bičíku: 4 až 5 polárních bičíků bylo zjištěno

- 24 • 1 · · i **

4·· · · (6) Spora: žádná (7) Odolnost vůči kyselině: negativní

2. Kultivační vlastnosti (1) Bujónová agarová plotnová kultivace: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá a má hladký povrch se vytvoří při kultivaci při 30 °C po dobu 24 hodin (2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté průsvitné a lesklé mikroorganizmy rostou dobře podél rýhy (3) Bujónová kapalná kultivace: dobrý růst je zjištěn při třepání kultury (4) Bujónová želatinová očkovaná kultura: žádná změna (5) Lakmusové mléko: alkalické a, nepeptonizované

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: pozitivní (2) Denitrifikační reakce: negativní (3) MR test: negativní (4) VP test: negativní (5) -Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfidu: negativní * “ (7) Využití kyseliny citrónové Christensen agar: pozitivní Koser medium: pozitivní (8) Využití zdroje anorganického dusíku nitrát: pozitivní amonná sůl: pozitivní (9) Fluorescentní chromogeneze: žádná

-JV

- 25 • · *K .· >’···’ ·* * ·· • · ···/·< *♦ Γ ·*>.· ···* · *· i • · i* .· v* ·· * *»* · »»

Sfap<?j>

(10) Ureasa: pozitivní (11) Oxidasa: pozitivní

A \±4j aHučUSócí; pGóxbivni (13) Oblast růstu pH oblast: 4,2 až 10,5 teplotní oblast: 17 až 43 °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15) O-F test glukosa: O (oxidační) sacharosa: žádná změna (16) Rozklad argininu: negativní (17) Využití různých zdrojů uhlíku

L-arabinosa + D-xylosa + D-glukosa + D-mannosa + D-fruktosa + D-galaktosa + maltosa + sacharosa + laktosa trehalosa + D-sorbitol

D-mannitol + inositol + glycerin. + škrob • 0 %%* '·’*«· 0 % · · • ·♦/·?

· 3 ** ,· 0^ 0 9· \ ♦· *··* · · _Β*«0 · *# 4 ♦ *8 0 * 4 4

0* ♦· íý'·

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (molární %) = 62,3

Mikroorganizmus byl vyčištěn, aby náležel k Pseudomonas species na základě bakteriologických vlastností uvedených výše.

Příklad^ provedení vynálezu

Předložený vynález je popsán detailněji s odkazem na přípravné příklady, experimenty a příklady, které následují.

Přípravný příklad 1

Příprava bakteriální suspenze obsahující purinovou nukleosidovou fosforylasu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu

Bacillus stearothermofilus JTS 859 (FERM P-9666), který je bakterií produkující purinovou nukleosidovou fosforylasu (PUNP) a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu (PYNP) byl kultivován následovně.

Pro kultivaci bakterií bylo použito kultivační medium o pH hodnotě 6,2 a obsahující 10 g baktotriptonu, 5 g kvasnicového extraktu, 3 g glukosy, 3 g stolní soli, 1 g inosinu a

1 vody. Do 1,5 1 kultivačního media bylo přidáno 3 x 10 spor Bacillus stearothermophilus JTS 859 (FERM P-9666) pro kultivaci při cirkulaci vzduchu vvm a kultivační teplotě 65 °C a pH hodnotě 6,0 až 6,4 za použití 3 litrové fermentační nádoby vybavené horními a spodními míchacími lopatkami, z nichž každá má průměr 70 mm. Během kultivace se míchací lopatky otáčely rychlostí 500 otáček/min. Po skončení kultivace byly bakterie centrifugálně sdruženy (10 000 G), 4 °C, 15 minut).

·· · Β ·. Β

Β Β Β Β · · • ΒΒ ΒΒ Β Β ΒΒ

5 ΒΒΒΒ •ΒΒ Β ΒΒ ΒΒ g vlhkých bakterií takto získaných bylo suspendováno ve 30 ml lOmM roztoku fosforečnanu draselného (pH 7), takže se připraví bakteriální suspenze obsahující purinovou nukleosidovou fosforylasu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylasu {zde dále označovanou jako PUNP*PYNP enzymový roztok).

Přípravný příklad 2

Příprava bakteriální suspenze mající rozkladovou aktivitu pro uráčil a thymin.

Bakteriální suspenze Arthrobactor species YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908),( Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909), Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191, přičemž každý má rozkladovou aktivitu pro uráčil a thymin, byla připravena následovně.

Pro kultivaci bakterií bylo použito kultivační medium mající hodnotu pH 7,0 a sestávající ze 2 g uracilu, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 3 g hydrogenfosforečnánu dvojdraselného, 6 g kvasnicového extraktu a 1 1 vody. Kultivační medium bylo dáno do 21itrové Erlenmeyerovy baňky a inokulováno 3.10? bakterií nebo spor výše zmíněných mikroorganizmů.

Za těchto podmínek byla kultivace prováděna po dobu 15 hodin při 35 °C, přičemž se Erlenmeyerova baňký otáčela rychlostí 200 otáček za minutu.

Po skončení kultivace byly bakterie centrifugálně sdruženy (10 000 G, 4 °C, 15 minut), a vlhké bakterie takto získané byly suspendovány v 6 ml pufrového roztoku (pH 7) obsahujícího 10 mM fosforečnanu draselného tak, aby se připravila bakteriální suspenze (zde dále označovaná jakoroztok enzymu rozkládající uráčil·thymin.

«4 ϊ 4 4 4 ··» • » • ·· ♦

4 · 4 4 · · · * · · 4 4 4 < 4*

4 4 4 4 ·*♦ * *

44 4 · · · ·· 44 4« «·

Experiment 1

Produkce enzymu z mikroorganizmů rozkládajícího uráčil a thymin ml reakčního roztoku obsahujícího bud 50 mM uracilu nebo 50 mM thyminu, 100 mM fosforečnanového pufrového roztoku (pH 7), a 0,05 ml některého enzymového roztoku rozkládajícího uráčil*thymin odvozeného od kmenů připravených v přípravném příkladu 2 bylo ponecháno reagovat při 35 °C po dobu 15 minut a rozkladová aktivita pro thymin a uráčil v reakčním roztoku byla měřena vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií.

Tabulka 1 ukazuje výsledky. Rozkladová aktivita U uvedená v tabulce 1 značí množství enzymové aktivity vyžadované pro rozklad 1 mikromolu substrátu (uracilu nebo thyminu) za minutu při 35 °C.

Tabulka 1

Kmen			Rozkladová aktivita (U/vlhké bakterie g)
		. -	uráčil	thymin
Arthrobactor species YGK	222		36,4 ·	14,5
Bacillus megaterium YGK	252		5,8	2,1
Pseudomonas speacies YGK	443		2,2	1,4
Rhodococcus erythropolis	JCM	3132	10,6	4,2
Rhodococcus erythropolis	JCM	3191	7,8	3,2

• a * a a a a a a a · a a a aaaa · · ·· a aaaa a * a a a a aaa a · s s » * » aaa aa* « aa aa aa *a

- 29 Experiment 2

Produkce enzymu bakterie produkující enzym rozkládající uráčilthymin _~ ..... , ml reakčního roztoku obsahujícího 50 mM uracilu,

100 mM fosforečnanového roztoku (pH 7) a 0,05 ml kteréhokoli z enzymových roztoků rozkládajících uráčil·thymin odvozeného z kmenů připravených v přípravném příkladu 2 bylo ponecháno reagovat při 35 °C. po dobu 15 až 30 minut. Přítomnost uracilthymindehydrogenasy, barbiturasy, dihydrouracildehydrogenasy a dihydropyrimidinasy stejně.jako tvorba a mizení kyseliny barbiturové a dihydrouracilu bylo detekováno sledováním pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie.

Tabulka 2 ukazuje výsledky. Symboly a v tabulce 2 popořadě označují, že enzym byl detekován nebo nedetekován.

Mělo by se poznamenat, že kde například aktivita dihydropyrimidinasy je vyšší než aktivita dihydrouracildehydrogenasy, vytvořený produkt dihydrouracil není detekován. Z toho vyplývá, že symbol v tabulce 2 nutně nepopírá stoprocentně přítomnost příslušného enzymu.

Tabulka 2

Detekce každého enzymu
Kmen č.	uracilthymin- dehydrogenasa	barbiturasa	dihydro- uracil- dehydroge- nasa	dihydro- pyrimidi- nasa
YGK 222	+	+
YGK 443		+	+
YGK 252	+	+	+	+
JCM 3132	+	+	-	-
JCM 3191	+	+	-	-

• * · 4 · ·· ·« » · *

4 · ·· »·'

Příklad 1

Příprava purinového nukleošidu pomocí ΡϋΝΡ·ΡΥΝΡ enzymového - “— roztoku-a-enzymového .roztoku...rozkládá jícího, uráčiljthymin

100 ml vodného roztoku (pH 7) obsahujícího 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, 1,25 mM fosforečnanu draselného, 2 ml PUNP PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1, 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uráčil*thymin odvozeného z Arthrobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném příkladu 2, 100 mM kyseliny,borité a 4 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny bylo ponecháno reagovat při 35 °C po dobu 110 hodin takU že se měří koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Obr. 1 ukazuje výsledky.

Další experiment byl prováděn podobně s výjimkou toho, že enzymový roztok rozkládající uráčil’thymin nebyl přidán do reakSního roztoku, takže se měří koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Tabulka 2 ukazuje výsledky.

V každém obr. 1 a 2 je thymidin označen bílými čtverci a deoxyguanosin je označen černými kosočtverci. Dále thymin a 5-methylbarbiturová kyselina jsou označeny popořadě černými trojúhelníky a bílými trojúhelníky.

Obr. 1 ukazuje tvorbu 5-methylbarbiturové kyseliny. Protože kyselina se rozkládá jakmile se objeví, osvětluje to, že uracilthymindehydrogenasa a barbiturasa jsou přítomny v enzymu rozkládajícím uráčil'thymin. V případě obr. 1 thymidin zmizel v podstatě úplně, ačkoli startovací látka guanin byla nalezen, že zůstává jenom mírně.

Γ

- 31 Οι ί I *«*’4»* i*..* Λ* ♦·' ·*

Deoxyguanosin byl vytvořen v množství 14,9 mM (výtěžek 75%ní)

Ve srovnání s obr. 2 pokrývajícím případ, kde enzymový roztok rozkládající uráčil-thymin nebyl přítomen, obr. 1 dokládá, že požadovaný produkt deoxyguanosin byl vytvořen ve velmi velkém množství.

Příklady 2 až 11

Příprava purinových nukleosidu pomocí různých startovacích látkových nukleosidů a různých startovacích látkových purinových bází

Reakce byla prováděna při 35 °C po dobu 90 hodin za stejných podmínek jako v příkladu 1, s výjimkou toho, že byly použity pyrimidinové nuleosidové sloučeniny a purinové báze uvedené v tabulce 3. Koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi byly měřeny s výsledky uvedenými v tabulce 3.

Tabulka 3 také ukazuje srovnávací příklady. Tyto srovnávací příklady byly stejné jako samotné příklady s výjimkou toho, že 0,5 ml destilované vody bylo přidáno do reakčního systému místo roztoku enzymů rozkládajících uráčil·thymin použitého v příkladech. Jak je zřejmé z tabulky 3, výtěžek purinové nukleosidové sloučeniny se zvýší přídavkem enzymového roztoku rozkládajícího uráčil»thymin. Zejména výtěžky guanosinu a deoxyguanosinu byly značně zvýšeny přídavkem enzymového roztoku rozkládajícího uráčil·thymin.

- 32 · 9 • 9 ·

9*99 • 9 β 9 9 • 9 9 9

9 99' • >9 9 9

9 9 9

9« • 9*9

9 * 9* ··· · ·. 9 9 ·,

9 9*

Tabulka

i Μ* > Ρ W >N 0

M u Ή ~·ΓΤ *(0 p c '(0 ·Ρ η ε λ: >!

» ε 0 Ρ Ή’Ρ - Ο/ φ q

μ, s*·· wr«i

r- in rd

8,8

2,2

OO co

12,4

Γ- 1—1 rd

σι ΓΩ rd

Γ- κ η

ΓΜ » <Ν

(N te rd rd

q

ν ρ

ε

0 Ρ

C

*

Ρ

ο

>p

γΗ

ε

Q.

ε -η

0

r>

sp

Γ-

CO

ΟΊ

CN

σ

Μ1

CN

>

>» υ

Ρ

Ή

tl

*

·*

*.

*.

t*

P

Ν to

Μ

r-

co

r-

m

r-

CN

ΓΊ

o

q ρ

>Ρ

H

rp

Γ—t

Η

Η

Ρ

rd

Γ~Ι

·—1

>

φ 3

a

P

Ρ

•H

•Η

co

ω

O

Ο

P

Ρ

P

•Ρ

'(0

P

Ρ

>

>1

ΐ>Ί

0

X

X

q

0

0

•H

Φ

φ

P

q

TJ

q

q

Ρ

3

Ρ

•H

tp

•Η

Ή

Η

Qj >

co

q

O .

co

ω

q

0

0 to

O

•P

N

Ο

0

•Ρ

Η

'fti

ρ q

q

w

(0

q

q

01

to

q

•Η ·Ρ

φ

0

P

φ

(0

0

Ρ

C

q

QJ

« C

P

q

Ή,

Ρ

3

q

•Η ν

Η

•Η

»p

0 Φ

tú

•P

ε

(0

•r|

Ε

ω

ϋ)

q

o

Φ >υ

>1

>1

•Η

>1

>

>1

Ή

Ο

0

•P

>

Η 3

X

X

Ν

X

X

X

Ν

α

C

ω

p

,Χ 0

O

0

q

0

Ο

0

q

φ

(0

0

> 3 H

Φ

Φ

Φ

φ

φ

Φ

φ

Ρ

3

q

3-

q ω

P

P

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

(0

Ρι

•r|

<Ρ

rd

q

Ο

q

0

q

‘rl

Ν

•Ρ

Ν

P

p

Φ

Ρ

(0 .

P

Ρ

P

TJ

Ρ

Ρ

P

>

q

•Η

q

Ρ

q

0

q

(O

ε

q

q

ιθ

ε

q

α

<0

q

•r|

X

Ή

Ρ

•Η

X

•Η

•Η

•r|

X

Ρ φ

q

0

Ν

q

0

0

Ν

q

q

0

Ρ Ν

φ

a

q

φ

*Φ

a

q

φ

(0

a

3 '(0

P

>1

φ

Ρ

Ρ

>1

φ

Ρ

3

>1

klí λ)

(0

P

Ρ

Φ

(0

Ρ

Ρ

Φ

Οι

P

>,

q

>

0

P

'ίθ '(0

3

> >

q

α

q

q

CO

0 0 (0

Ρ

•Η

•rl

•Η

CO ί

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

•Η Ή ·Η

q

q

q

-Ρ

•Η

•rl

•Η

Ό ω C

Ή

•r|

•Η

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

•Η 0 Φ

p

TJ

Ρ

3

3

3

3

q

q

q

ε φ >υ

H ·

•P

•Η

>1

>1

>.

•rl

•r|

•r|

•Η ιΡ 3

6

ε

ε

κ

X

X

X

Ρ

P

P

ρ -χ ο

>1

>1

>1

0

0

Ο

Ο

•Η

P

•r|

Ji 3 Η.

p

p

Ρ

φ

φ

φ

φ

Ρ

P

P

a q co

P

P

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

Ρ

3

3

3

>P

cm

<P

-*·

D-)

π-

ΟΟ

θ'»

O »r

v

* · ♦ · ·♦ ···» · ♦ · · · · • · · · « « - • · · ·

Příklad 12

Účinek enzymového roztoku rozkládajícího uráčil-thymin, odvozeného od kteréhokoli z kmenů, na tvorbu purinové nukleosidové 'sloučeniny’ '* »—Bylo připraveno 100 ml roztoku CpH 7) obsahující 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, 1,25 mM fosforečnanu draselného, 2 ml PUNP-PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1, 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uráčil thymin odvozeného z kteréhokoli kmene, který byl připraven v přípravném příkladu 2, 100 mM kyseliny borité a 4 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny. V tomto příkladu byly také prováděny srovnávací příklady stejným způsobem s výjimkou toho, že bylo přidáno 0,5 ml destilované vody do reakčního systému místo použitého enzymového roztoku rozkládajícího uráčil·thymin.

Reakční systém byl podroben reakci při 35 °C po dobu 100 hodin tak, že se měřily koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Tabulka 4 ukazuje výsledky.

Enzymový roztok rozkládající uráčil·thymin odvozený z jakéhokoli z kmenů byl zjištěn, že je účinný pro zvýšení výtěžku produktu deoxyguanosinu.

Tabulka 4

Tvorba· deoxyguanosinu (mři)

Kmen

Enzymový roztok rozkládající uráčil •thymin přítomen

12,4

3.2 2,7

5.3 4,6 nepřítomen

Arthrobactor species YGK 222 Bacillus megaterium YGK 252 Pseudomonas species YGK 443

Rhodococcus erythropolis JCM 3132 Rhodococcus erythropolis JCM 3191

2,4

2,4

2,4

2,4

2,4 • 1« »»»» *·»* t · · ·,;· ·· · · ·» * ···· · · ·· · · ···* · * · ··'·.· ♦'· · ··· · ·· ·· ·· ··

- 34 Příklad 13

Stabilizace meziproduktu (ribosa-l-fosfat) a inhibice rozkladu fosfatasou ml vodného roztoku (pH 7) obsahující 5 mM ribosa-l-fosfatu, stabilizátor uvedený v tabulcae 5 (4 mM EDTA a 100 mM každého ze stabilizátorů bylo použito), 0,02 ml PUNP*PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1 a 0,01 ml enzymového roztoku rozkládajícího uráčil·thymin odvozeného z Arthrobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném příkladu 2, byly podrobeny reakci při 35 °C po dobu 72 h. Přítomnost ribosa-l-fosfatu a ribosy vznikající z rozkladu ribosa-l-fosfatu v reakční směsi byla zkoušena tenkovrstvou chromatografii, jejíž výsledky jsou uvedeny v tabulce 5. Zkoušení bylo prováděno způsobem popsaným Ishii a j. v Agric. Biol. Chem., 53(12), 3209-3218 (1989),. což je zde začleněno formou odkazu.

Tabulka 5 také ukazuje kontrolu, která byla prováděna stejným způsobem s výjimkou, že 100 ml tris(hydróxymethyl)aminomethanhydrochloridu (zde označovaného jako tris) bylo přidáno do reakčního systému místo PUNP*PYNP enzymového roztoku a použitého enzymového roztoku rozkládajícího uráčil•thymin.

-Případně symbol + uvedený v tabulce 5 označuje,'že byl/ zjištěn rozklad ribosa-l-fosfatu, přičemž symbol označuje, že rozklad nebyl zjištěn.

Při kontrole, to znamená tris(kontrola), při které nebyl přidáván enzymový roztok, rozklad moc neprobíhal, což dokládá, že v enzymovém roztoku byla obsažena fosfatasa.

Na druhé straně rozklad ribosa-l-fosfat nebyl zjištěn v případě použití jak kyselina borité, tak EDTA, což dokládá, že tyto stabilizátory slouží k inhibicí aktivity fosfatasy obsažené

9 4 • · 9 ·

4*44 4 * • 4 ·· 4

4 · j · ·,· ΐ 4 4· 4 4

4’ 4 4

44‘ 44

4 4 4 • 4. 44.

444 · ·

4<4 · • 4ι »· v enzymovém roztoku a přispívá ke stabilizaci ribosa-l-fosfatu.

Tabulka 5

Stabilizátor

Rozklad ribosa-l-fosfatu tris (kontrola) + tris + kyselina boritá ⁺ gl^cin + kyselina boritá + glýcin + kyselina boritá + tris + tris + EDTA + kyselina boritá + EDTA glýcin + EDTA + EDTA . +

Příklad 14

Účinek stabilizátor při tvorbě deoxyguanosinu

100 ml vodného roztoku (pH 7) obsahujícího 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, stabilizátor uvedený v'tabulce 6, 2 ml PUNP*PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1 a 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uráčil· thymin odvozeného od Arthrobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném příkladu 2, byl podroben reakci při 35 °C po dobu 90 hodin. Množství stabilizátoru označeného x v tabulce 6 bylo 4 mM, množství jiného stabilizátoru bylo 100 mM.

«' * · », • φ » Φ · .· ·

Φ ΦΦ»« Φ · · '· ·

Φ « Φ ·' Φ Φ'

ΦΦΦ * · ·’ ·

- 36 · Φ ’ • * . Φ.Φ φ ·»· Φ · φ Φ .·

Množství deoxyguanosinu obsaženého v reakční směsi bylo měřeno, přičemž výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

” “ Experimentální data dokládají, že kombinace kyseliny borité a komplexotvorné sloučeniny podobné EDTA, přičemž tato kombinace je také testována v příkladu 13, je účinná pro inhibici rozkladu ribosa-l-fosfatu tak, že se stabilizuje ribosa-1-fosfat a tak se zvyšuje účinnost tvorby purinové nukleosidové sloučeniny.

Tabulka 6

Stabilizátor	Tvorba deoxyguanosinu (mM)'
tris (kontrola)	0
kyselina boritá	i,5
gl^cin	0
iminodioctová kyselina*	0
nitrilotrioctová kyselina	0
EDTA*	0
EGTA*	0
tris+EDTA*	0
glycin+EDTAx	' 0,4
kyselina boritá+tris	2,0
kyselina boritá+glycin	4,7
kyselina boritá + iminodioctová kyselina* i 4,9
Kys.boritá + nitrilotrioctová	kyselina* 11,6
kyselina boritá + EDTA	12,7
kyselina boritá + EGTA*	9,6

4

4 4 ♦ · * 444 4 44

4 4

4' 4 4 · 4

4 4 4

4 4*

44* · 4

4 4.

Další výhody a modifikace jsou lehce zřejmé odborníkům v oboru. Tudíž vynález v tomto svém širším aspektu není omezen, na,konkrétní, detaily-a.příkladná- provedení,-která-jsou zde ukázána a popsána. V souhlase s tím mohou být provedeny různé modifikace bez odchýlení se od ducha nebo rozsahu obecného vynálezeckého konceptu jak je definován v připojených patentových nárocích a jejich ekvivalentech.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny, za-»,...hrnující-stupeň*podrobení pyrimidinové nukleosidovésloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosforečnanové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylasy a pyrimidinové nukleosidové fosforylasy, vyznačený tím, že pyrimidinové báze vytvořená touto reakcí se převede mikroorganizmem nebo enzymem odvozeným z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylasy a purinové nukleosidové fosforylasy.
2. 2. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 vyznačený tím, že alespoň jedna sloučenina vybraná že skupiny zahrnující glycin, iminodioctovou kyselinu, nitrilotríoctovou kyselinu, ethylendiamintetraoctovou kyselinu a ethylenglykol(2-aminoethyleťher)tetraoctovou kyselinu a kyselinu boritou nebo borát, se přidá jako stabilizátor ribosa-l-fosfatu nebo deoxyribosa-l-fosfatu, které se vytvoří jako meziprodukty při výměnné reakci báze.
3. 3. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že se uvedený mikroorga3 nizmus vybere ze skupiny zahrnující rod Arthrobactor, rod Bacillus, rod Pseúdomonas a rod Rhodococccus·.
4. 4. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že se pyrimidinová nukleosidová sloučenina vybere ze skupiny zahrnující uridin, deoxyuridin, 5-methyluridin a thymidin.
5. 5. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že purinová báze se vybere » r · • 9 · * »999 · 9 · · • « 999 9 · • 0 0* ·· 99 ze skupiny zahrnující adenin, guanin, benzimidazol, halogenovaný purin a aminovaný purin.

   , —
6. 6. - * -^Způsob’přípravy purinové'nukleosidové'sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že enzymem odvozeným z mikro organizmu je uracilthymindehydrogenasa nebo dihydrouracildehydrogenasa.
7. 7. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1, 2 nebo 3 vyznačený tím, že uvedeným mikroorganizmem je Arthrobactor species YGK 222 (FERM BP-5907),

   Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908), Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909), Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191.
8. 8. Mikroorganizmus schopný produkovat uracilthymíndehydrogenasu nebo dihydrouracildehydrogenasu vybraný ze skupiny zahrnující Arthrobactor species YGK 222 (FERM BP-5907),-Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909).