CZ24985U1 - Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce - Google Patents
Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce Download PDFInfo
- Publication number
- CZ24985U1 CZ24985U1 CZ201226680U CZ201226680U CZ24985U1 CZ 24985 U1 CZ24985 U1 CZ 24985U1 CZ 201226680 U CZ201226680 U CZ 201226680U CZ 201226680 U CZ201226680 U CZ 201226680U CZ 24985 U1 CZ24985 U1 CZ 24985U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insulin
- octapeptide
- derivative
- derivatives
- chain
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 142
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 title claims description 19
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 51
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 33
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 32
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 20
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 49
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 14
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 cyclic alcohols Chemical class 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N apidra Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CNC=N1 RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700039926 insulin glulisine Proteins 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229940112930 apidra Drugs 0.000 description 4
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- DJGMNCKHNMRKFM-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pent-4-ynoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC#C)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 DJGMNCKHNMRKFM-SFHVURJKSA-N 0.000 description 3
- TVPIDQLSARDIPX-SFHVURJKSA-N (2s)-5-azido-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCN=[N+]=[N-])C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 TVPIDQLSARDIPX-SFHVURJKSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 3
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 description 3
- 229960002068 insulin lispro Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 description 1
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 description 1
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 1
- 101100537302 Mus musculus Itfg1 gene Proteins 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000011549 crystallization solution Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 description 1
- 229960000696 insulin glulisine Drugs 0.000 description 1
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940060975 lantus Drugs 0.000 description 1
- 229940102988 levemir Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N propan-2-yl 2-[[[(2R)-1-(6-aminopurin-9-yl)propan-2-yl]oxymethyl-(pyrimidine-4-carbonylamino)phosphoryl]amino]-2-methylpropanoate Chemical compound CC(C)OC(=O)C(C)(C)NP(=O)(CO[C@H](C)Cn1cnc2c(N)ncnc12)NC(=O)c1ccncn1 VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-koncí B-řetězce
Oblast techniky
Technické řešení se týká nových derivátů insulinu s vysokou vazebnou afinitou vůči receptoru insulinu, způsobu jejich syntézy a případného použití in vivo.
Dosavadní stav techniky
Metabolické onemocnění diabetes mellitus, nebo-li cukrovka, postihuje ve světě miliony lidí. Statistické odhady hovoří jasně: počet lidí postižených diabetem bude neustále růst, přičemž v roce 2030 bude na světě asi 438 milionů diabetiků. Z tohoto důvodu je velmi důležitý výzkum interakce insulinu s receptorem insulinu, kteiý by mohl vést k vývoji nových derivátů insulinu s vlastnostmi, zvyšujícími komfort diabetických pacientů.
Insulin je peptidový hormon jehož hlavní funkcí je regulace koncentrace glukózy v krvi a umožnění jejího vstupu do buňky. Mimo to má insulin zásadní vliv na metabolismus bílkovin a tuků. Primární struktura insulinu je tvořena peptidovými řetězci A (21 aminokyselin) a B (30 aminokyselin), které jsou navzájem spojeny dvěmi intermolekulámími disulfidickými můstky (A7-B7 a A20-B19). Dále je jeden intramolekulámí můstek přítomný v řetězci A (A6A11). Sekundární a terciární struktura insulinu je schématicky znázorněna na Obrázku 1.
Řetězec A formuje dvě šroubovice. Řetězec B vytváří v tzv. T-stavu šroubovici jen ve své střední části. V tzv. R-stavu (kteiý se vytváří pouze za přítomnosti malých cyklických alkoholů jako je např. fenol) tato šroubovice v B-řetězci pokračuje až k N-terminální aminokyselině Bl. (Whittingham J. L., Edwards D. J. a spoluautoři Biochemistry 1998, 37, 11516). Fyziologický význam T-a R- konformací není doposud znám.
Jako monomer insulin existuje jen při nízkých koncentracích. Při vyšších koncentracích vytváří dimery a za přítomnosti zinečnatých iontů hexamery (Antolíková E., Žáková L. a spoluautoři 2011,7 Biol. Chem. 286, 36968).
Biologický účinek insulinu je primárně zprostředkován vazbou monomeru insulinu na receptor insulinu. Receptor insulinu je tetramemí membránový glykoprotein skládající se ze dvou extracelulámích podjednotek a a dvou transmembránových a intracelulámích podjednotek β. Podjednotky jsou navzájem spojeny několika disulfidickými můstky (McKem N. M., Lawrence M. C. a spoluautoři 2006, Nátuře 443, 218). Vazba insulinu na receptor aktivuje enzym tyrosinkinázu, který je součástí intracelulámí části β-podjednotky, a poté dochází ke spuštění signalizační kaskády a biologických účinkům insulinu.
Insulin se pravděpodobně váže na extracelulámí podjednotky a, nicméně struktura komplexu isulinu vázaného na receptor stále není známá. Předpokládá se, že molekula insulinu musí při vazbě na receptor podléhat jistým konformačním změnám (De Meyts P. 2004, Bioessays 26, 1351, Ludvigsen S., Olsen Η. B. a Kaarsholm N. C. 1998, J. Mol. Biol. 279, 1, Hua Q. X., Shoelson S. E. a spoluautoři 1991, Nátuře 354, 238, Dodson E. J., Dodson G. G. a spoluautoři 1983, Biopolymers 22, 281). Jednou z předpokládaných konformačních změn oproti strukturám znázorněným na Obrázku 1 je odklon C-konce B-řetězce od centrální části molekuly insulinu (Obrázek 2).
Tento odklon má za důsledek odkrytí předtím skrytých aminokyselin A1-A3, které jsou podle všech dosavadních poznatků nezbytné pro vazbu insulinu na receptor a jsou součástí tzv. vazebného místa 1 v molekule insulinu (které tvoří aminokyseliny GlyAl, IleA2, ValA3, GlnA5, ThrA8, TyrA19, AsnA21, ValB12, TyrBló, GlyB23, PheB24, PheB25) (Mayer J. P„ Zhang F. a DiMarchi R. D. 2007, Biopolymers 88, 687). Pro vazbu insulinu na receptor dále jsou nezbytné i aminokyseliny SerA12, LeuA13, GluA17, HisBlO, GluB13 and LeuB17, které tvoří tzv. vazebné místo 2 (Schaffer L. 1994, Eur. J. Biochem. 221, 1127, Conlon J. M. 2001, Peptides 22, 1183, Ward C. W. a Lawrence M. C. 2009, Bioessays 31, 422).
- 1 CZ 24985 Ul
Deriváty čí analogy insulinu jsou látky, které vycházejí svojí strukturou ze struktury molekuly lidského insulinu, avšak cílenými modifikacemi v aminokyselinové sekvenci A či B řetčzcc jc u nich dosaženo pozměněných biologických účinků a rozdílné vazebné afinity vůči receptoru.
Deriváty insulinu jsou vyvíjeny především pro zlepšení kvality léčby diabetů a ke zvýšení komfortu pacientů. Dalším důležitým důvodem přípravy derivátů insulinu je snaha o vyjasnění interakce insulinu s receptorem insulinu, neboť jak již bylo výše zmíněno, donosud není interakce těchto dvou proteinů dopodrobna prozkoumána a krystalový komplex obou molekul nebyl doposud připraven.
V současné době je na trhu celkem 5 farmaceutických přípravků s obsahem těchto derivátů, využívaných v lékařské praxi (Mooradian A. D., Bembaum M., Albert S. G. 2006, Annals Intern. Med. 145, 125). Tři z nich jsou tzv. rychle působící insulinové deriváty (Lispro, Aspart a Glulisine). Vyznačují se rychlejším nástupem a rychlejším odezněním účinku vzhledem k lidskému insulinu. Zbylé dva deriváty (Glargine a Detemir) patří mezi tzv. dlouhodobě působící deriváty a vyznačují se několikanásobně prodlouženou dobou účinku. Principem zmíněného působení těchto klinicky používaných derivátů je změna jejich rozpustnosti vzhledem k přirozenému insulinu. Té je docíleno především ovlivněním schopnosti dimerizace a tvorby hexamerů, změnou i soel ektri ckého bodu (pí) molekul derivátů či zvýšením schopnosti vázat se na sérové proteiny.
Všechny tři klinicky používané deriváty s rychlým nástupem účinku (Lispro, Aspart a Glulisine) byly připraveny modifikacemi aminokyselin v primární struktuře molekuly lidského insulinu za účelem snížení schopnosti dimerizace molekuly a tím zvýšení rozpustnosti dané látky, vedoucí ke zrychlenému vstřebávání. Hlavním výhodou při aplikaci těchto látek je tak rychlejší snížení koncentrace glukózy v krvi při hyperglykemických stavech než při podání klasického lidského insulinu. Zároveň umožňují pacientům dřívější příjem potravy po aplikaci derivátu než po podání lidského insulinu. Insulin Lispro, první vyvinutý derivát s rychlým nástupem účinku (Howey D. C., Bowsher R. R. a spoluautoři 1994, Diabetes 43, 396), byl připraven záměnou aminokyselin lysinu a prolinu v pozicích 28 a 29 B-řetězce. Na trhu je dostupný od roku 1996 pod názvem Humalog (firma Eli Lilly). Insulin Aspart byl připravený záměnou aminokyseliny prolinu v pozici 28 B-řetězce za kyselinu asparagovou (Setter S. M., Corbett C. F. a spoluautoři 2000, Annals Pharmacother. 34, 1431). Pro klinické použití byl schválen v roce 2000 pod názvem Novalog (firma Novo Nordisk). V molekule derivátu Glulisine je v řetězci B substituovaná asparagová kyselina na pozici B3 lysinem a molekula lysinu na pozici B29 kyselinou glutamovou (Rave K., Klein O. a spoluautoři 2006, Diabetes Care 29, 1812). Insulin Glulisine je klinicky dostupný od roku 2004 pod názvem Apidra (firma Sanofi Aventis).
Dlouhodobě působící derivát Glargine je derivát insulinu s náhradou asparaginu glycinem v pozici 21 A-řetězce a přidanými dvěma molekulami arginínu v pozici 30 B-řetězce (Rosenstock J., Schwartz S. L. a spoluautoři 2001, Diabetes Care 24, 631). Je komerčně dostupný od roku 2003 pod názvem Lantus (firma Sanofi Aventis). V případě Glarginu se projevuje zvýšení pí molekuly derivátu. Po jeho subkutánní aplikaci dochází k tvorbě precipitátů a pomalejšímu uvolňování do krve. Druhý dlouhodobě působící derivát insulinu, Detemir, vykazuje díky přítomnosti hydrofobního postranního řetězce vyšší schopnost tvorby hexamerů. To spolu s vyšší afinitou k plazmatickému albuminu přispívá k výslednému prodlouženému efektu této látky. Detemir byl připraven připojením kyseliny myristové na lysin pozici 29 B-řetězce (Plank J., Bodenlenz M. R. a spoluautoři 2005, Diabetes Care 28, 1107). Je komerčně dostupným od roku 2006 pod názvem Levemir (firma Novo Nordisk).
V nedávné době oyio připraveno několik vysoce aktivních derivátů insulinu s N—meíhylovanou aminokyselinou v poloze B26 (Žáková L., Kazdová L. a spoluautoři 2008, Biochemistry ΑΊ, 5858) a následně byly určeny i jejich krystalové struktury (Jiráček J., Žáková L. a spoluautoři 2010 Proč. Nati, Acad, Sci. U.S.A 107, 1966). Překvapivě bylo zjištěno, že tyto deriváty se vyznačují novým typem β-ohybu typu 11 v polohách B24-B26. Vytvoření tohoto ohybu vede k odkrytí předtím zakrytých aminokyselin A1-A3. Předpokládá se, že podobný β-ohyb se může vy- 2 CZ 24985 Ul skytovat v tzv. aktivované formě insulinu při vazbě hormonu na receptor. Přítomnost tohoto ohybu v C-konci B-řetězce insulinu, který je částí molekuly důležitou pro dimerizaci insulinu, má za následek, že tyto deriváty mají výrazně sníženou schopnost dimerizace (Jiráček J., Žáková L. a spoluautoři 2010, Proč. Nati. Acad. Sci. US.A 107, 1966) a v organismu tudíž vykazují rychlejší nástup fyziologického účinku než přirozený insulin.
Předkládané technické řešení popisuje rychle působící deriváty insulinu, jejichž účinek je, kromě snížení schopnosti dimenzovat, zprostředkován zejména výraznou afinitou k receptoru insulinu. Podstata technického řešení
Technické řešení popisuje nové deriváty lidského insulinu obecného vzorce I, mající cyklickou io strukturu v C-konci B-řetězce, které vykazují vysokou afinitu vůči receptoru insulinu a zároveň mají potlačenu schopnost tvořit dimeiy. Tyto vlastnosti nové deriváty insulinu obecných vzorců předurčují k použití jako rychle působící insuliny, snižující hladinu glukózy in vivo. Výhodou těchto sloučenin je kromě snadné přípravy také modularita jejích struktury, která umožňuje dodatečné přizpůsobení jejich biologických vlastností.
Předmětem tohoto technického řešení jsou deriváty insulinu obecného vzorce I,
DOI-X (I) kde DOI je des(B23-B30)oktapeptid-insulin, což je lidský insulin bez C-terminálního oktapeptidu B23-B30, a X je modifikovaný oktapeptid zvolený ze skupiny, zahrnující následující oktapeptidy typů 1 až 8, napodobující sekvenci B23-B30 lidského insulinu, připojené k DOI amido20 vou vazbou mezi karboxylovou skupinou C-terminálního ArgB22 v molekule DOI a aminoskupinou N-terminálního GtyB23 v molekulách oktapeptidů 1-8, přičemž Rt v molekulách oktapeptidů 1-8 je H či benzyl a R2 je H či (CH2)rNH2.
-3CZ 24985 Ul
Sloučeniny vzorce I obsahují několik chirálních center v modifikovaném oktapeptidů, které mohou být v (5) či (/?) konfiguraci. Jedná se především o C“-atomy aminokyselin v polohách B26, B27, B29 a B30.
Nové deriváty insulinu podle předkládaného technického řešení jsou připraveny cyklizací části molekuly insulinu pomocí Cu’-katalyzované cykloadice mezi alkynem a azidem za vzniku triazolu, který se stává součástí struktury derivátu insulinu a stabilizuje tak sekundární strukturu v proteinu. Podle našich vědomostí se jedná o první deriváty nativního proteinu s triazolovým můstkem.
io Jednou z výchozích surovin pro přípravu nových derivátů insulinu je DOI, který je připraven z vepřového insulinu tryptickým štěpením podle literatury (Young J. D. a Carpenter F. H. 1961, J. Bioí Chem. 236, 743, Bromer W. W. a Chance R. E. 1967, Biochim. Biophys. Acta. 133, 219, Žáková L., Barth T. a spoluautoři 2004, Biochemistry 43, 2323).
Lineární prekursory modifikovaných oktapeptidů 1-8 jsou připraveny podle literatury (Žáková
L., Zyka D. a spoluautoři 2007, J. Pept. Sci. 13, 334) metodou syntézy na pevné fázi za použití 2Cl-chlorotritylové pryskyřice, komerčně dostupných NK-Fmoc-chráněných aminokyselin a kondenzačních činidel HBTU/DIPEA (2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát/N,N-dÍísopropylethylamin) či D1C/HOBT (N,N-dicyklohexylkarbodiimid/N-hydroxybenzotriazol. Pro cyklizací jsou do lineárních oktapeptidů v polohách B26, B27 a B29 či B30 umístěny aminokyseliny ((/?)- či (S)-enantiomery) s postranním řetězcem obsahujícím azidoskupinu či terminální alky novou skupinu. V případě azidoaminokyseliny obsahuje postranní řetězec
-4CZ 24985 Ul až 4 atomy uhlíku a v případě terminální alkyn obsahující aminokyseliny obsahuje její postranní řetězec 3 až 6 atomů uhlíku.
Intramo leku lamí cyklizace oktapeptidů za vzniku monomem ích molekul je dosaženo Cu’-katalyzovanou cykloadicí mezí alkynem a azidem za nízké koncentrace peptidu (asi 80 x 10'6 mol.l'1) v prostředí t-butanol: H2O (Isaad A. L., Papini A. M. a spoluautoři 2009,7. Pept. Sci. 15, 451).
Cyklické oktapeptidy jsou k DOI připojeny metodou enzymové semisyntézy za katalýzy trypsinem podle literatury (Žákova L., Zyka D. a spoluautoři 2007, J. Pept. Sci. 13, 334). Případně přítomná fenylacetylová chránící skupina Ne-aminoskupiny lysinu v poloze B29 je odstraněna enzymaticky pomocí penicilín G acylasy podle literatury (Žákova L,, Zyka D. a spoluautoři 2007,7. Pept. Sci. 13,334).
Předmětem technického řešení je i farmaceutický prostředek, obsahující deriváty insulinu obecného vzorce I.
Předmětem technického řešení je rovněž farmaceutický prostředek, obsahující deriváty insulinu obecného vzorce I, určený pro léčbu diabetů.
Kromě toho je předmětem tohoto technického řešení i farmaceutický prostředek, obsahující kromě derivátů insulinu obecného vzorce 1 také farmaceuticky přijatelné nosiče, excipienty a diluenty.
Farmaceuticky přijatelnými solemi se rozumí soli kationtů nebo aniontů spadajících do obecného vzorce I s příslušnými protionty, které jsou akceptovatelné pro použití ve farmacii. Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou soli alkalických kovů a alkalických zemin, amoniové soli, soli kovů, soli aniontů anorganických či organických kyselin, jako jsou například halogenidy, sírany, uhličitany, acetáty, sukcináty a mnohé další.
Sol váty obsahují spolu s molekulou sloučeniny, spadající do obecného vzorce I, i molekuly vody či jiných látek, například rozpouštědel, které jsou přijatelné pro použití ve farmaceutických prostředcích.
Látky podle předkládaného technického řešení vykazují vysoké vazebné afinity vůči receptoru insulinu v membránách lidských IM-9 lymfocytů.
Dále tyto látky podle předkládaného technického řešení vykazují biologickou aktivitu in vivo v myších, která je dána poklesem hladiny glukózy v krvi.
Modularita struktury C-termínálních oktapeptidů B23-B30 derivátu insulinu a snadná syntéza spojováním těchto oktapeptidů s DOI umožňuje rozsáhlé strukturní variace sloučenin podle předkládaného technického řešení, které mohou vést k modulaci jejich biologické aktivity například ve smyslu rychlého nástupu účinku, prodlouženého účinku či zvýšené stabilitě proti proteolytické degradaci.
Popis obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje schEmaticky struktury monomeru insulinu v T-stavu (vlevo) a v R-stavu (vpravo).
Obr. 2 znázorňuje předpokládaný odklon C-konce B-řetězce insulinu (tmavě šedá šipka) od centrální části molekuly.
Obr. 3 znázorňuje vazebné křivky lidského insulinu (·), derivátu insulinu 15 (▼) a derivátu insulinu 16 () na receptor insulinu v membránách lidských IM-9 lymfocytů. Na ose x je vynesen log koncentrace testovaného insulinu, na ose y jeho vazebná afinita vzhledem k lidskému insulinu (v %).
Obr. 4 znázorňuje schopnost přirozeného insulinu (přerušovaná čára a ·, n = 10), derivátu insulinu 16 (plná Čára a ·, n = 9) a insulinového derivátu Apidra® (Giulisine, tečkovaná čára a A, n
-5CZ 24985 Ul = 10) snižovat hladinu krevní glukózy v myších in v i v o: n značí počet zvířat v pokusu. Na ose x je uveden čas (v minutách), na ose y koncentrace glukózy v krví.
Obr. 5 znázorňuje porovnání uspořádání peptidových řetězců R6 monomeru lidského insulinu (lznj.pdb) a derivátu insulinu 15.
Obr. 6 detailní zobrazení nového typu ohybu v C-konci B-řetězce derivátu insulinu 15. Dvě vodíkové vazby mezi CO v pozici B27 a NH v pozici B30 a kyslíkovým atomem C-temináini COOH skupiny v pozici B30 jsou vyznačeny přerušovanými čarami.
Obr. 7 porovnání řetězců B23-B30 v nativním lidském insulinu a v derivátu insulinu 15. Pro zjednodušení jsou zobrazeny pouze postranní řetězce aminokyselin v polohách B24-B26.
ío Příklady provedení
| Seznam uvedených zkratek: | |
| Bz | benzyl |
| DIPEA | Ν,Ν-diisopropylethylamin |
| DCM | dichlormethan |
| DIC | N,N-dicyklohexyIkarbodÍÍmid |
| DOI | des(B23-B30)oktapeptid-ínsulin |
| DMF | N,N-d i methyl formám íd |
| Fmoc | 9-fluorenylmethyloxykarbonyl |
| HBTU | 2-( 1 H-benzotríazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát |
| HOBT | N-hydroxybenzotriazol |
| NMP | N-methyl-2-pyrrolidon |
| TFE | 2,2,2-trifluorethanol |
| RP-HPLC | vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi |
| HR-ESI | hmotnostní spektoskopie o vysokém rozlišení, využívající elektronspray ionizaci |
| TPCK | p-tosyl-L-fenylalaninchlormetylketon |
| HEPES | 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl]ethan sulfonová kyselina |
| EDTA | kyselina ethylenůiamintetraoctová |
| BSA | hovězí sérový albumin |
| MeOH | methanol |
| t-BuOH | t-butanol. |
A) Příprava nových sloučenin
Obecná metoda přípravy lineárních prekursorů pro cyklické oktapeptidy
Lineární oktapeptidy byly připraveny metodou syntézy na pevné fázi. Jako póly měrní nosič byla použita vysoce acidolabilní 2-Cl-tritylová pryskyřice firmy Merck-Novablochem (obvykle v množství odpovídajícím 400 x 10'6 molu aktivních skupin). Manuální syntéza probíhala v plastové injekční stříkačce s fritou. Pro syntézu oktapeptidů byly použity aminokyseliny s primárními α-aminoskupinami chráněnými pomocí skupiny Fmoc a s chráněnými hydroxylovými skupinami postranních řetězců pomocí terciárního butylu (tBu). V případě použití lysinu v poloze B26 byl pro chránění Ne-am i no skupiny použit fenylacetyl odštěpitelný enzymaticky za použití pěnici lin40 G-acylasy (Fluka 76427) (Žáková L., Zyka D. a spoluautoři 2007, .Z Pept. Sci. 13, 334). Navázání první aminokyseliny na pryskyřici bylo docíleno přídavkem aminokyseliny (1 ekvivalent) a DIPEA (3 ekvivalenty) k pryskyřici (1 ekvivalent) v DCM v celkovém objemu 1 ml. Reakce probíhala asi 2 hodiny za teploty místnosti. Poté byla pryskyřice s navázanou aminokyselinou ponechána cca 2 x 10 minut v 2 x 2 ml směsi DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1). Tím došlo k deakti45 vování a zablokování zbývajících nezreagovaných chloridových skupin pryskyřice. Chránící skupina (Fmoc) primární α-aminoskupiny byla odstraněna opakovaným (5 a 20 min) působením 1 ml 30% (obj./obj.) roztoku piperidinu v DMF. Úspěšnost reakce byla hodnocena spektrofoto-6CZ 24985 Ul metricky měřením absorbance vzniklého dibenzofulven-piperidinového komplexu při vlnové délce 301 nm (ε = 7 040 M^cm'1). Navázání další aminokyseliny bylo katalyzováno použitím kondenzačního činidel HBTU a DIPEA v 2 ml NMP. Reakce probíhala vždy nejméně 1 hodinu. Poměr látkových množství jednotlivých složek reakce (aminokyselina: HBTU:DIPEA) byl roven
3:3:6 vzhledem k aminoskupině přítomné na pryskyřici (1 ekvivalent). V alternativním případě, kdy byla směs ponechána reagovat přes noc, byla použita činidla HOBT a DIC v prostředí směsi rozpouštědel DCM a NMP v poměru 1:1 (1 ml). V tomto případě bylo látkové množství všech složek reakce ekvimolámí. Kontrola úspěšného provedení reakce byla provedena Kaisérovým testem (Kaiser E., Colescott R. L. a spoluautoři 1970, Anal. Biochem. 34, 595) na přítomnost io primárních aminoskupin. Podle výsledku testu se buď zopakovala reakce se stejnou aminokyselinou, nebo se přistoupilo k odstranění chránící skupiny Fmoc poslední navázané aminokyseliny. Oktapeptid byl z polymemího nosiče pryskyřice odštěpen působením 5 ml směsi 20% (obj./obj.) TFE a 20% (obj./obj.) kyseliny octové v DCM po dobu 2 hodin. Následně byl produkt štěpení odpařen do sucha a zbylé chránící skupiny (tBu) byly odstraněny působením 5 ml směsi 50% kyseliny trifluoroctové (TFA), 2% triisopropylsilanu a 2% H2O v DCM po dobu hodiny, všechny procentní údaje jsou objemová procenta. Produkt byl poté opět odpařen do sucha, 3x promyt diethyletherem a rozpuštěn v 10% kyselině octové. Oktapeptid byl dále přečištěn pomocí IRPHPLC, lyofilizován a identifikován pomocí hmotnostní spektrometrie. V případě vysoké čistoty byl surový oktapeptid dále použit bez RP- HPLC purifikace.
Příklad 1
Oktapeptid 9
Lineární oktapeptid 9 jako prekursor cyklického oktapeptidu č. 12, kde R[= Bz, byl připraven metodou syntézy na pevné fázi za použití 400 x 10’6 molu 2-Cl-tritylové pryskyřice podle obecné metody popsané výše. Pro polohu B30 byla použita nepřirozená aminokyselina (S)-2-(Fmocamino)-4-pentynová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 00397) a pro polohu B27 (S)-5-Azido-2(Fmoc-amino)pentanová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 714291). Výtěžek po RP-HPLC purifikaci byl 21 % (77 mg, 84 pmol). HR-ESI ε^Η^ΝπΟ,ο [M+H]+ vypočteno 922,421, nalezeno 922,42.
-7CZ 24985 Ul
Příklad 2 Oktapeptid 10
Lineární oktapeptid 10 jako prekursor cyklického oktapeptidu č. 13, kde R, a R? - H, byl připra5 ven metodou syntézy na pevné fázi za použití 400 x 10'6 molu 2-Cl-tritylové pryskyřice podle obecné metody popsané výše. Pro polohu B29 byla použita nepřirozená aminokyselina (S)-2(Fmoc-amino)-4-pentynová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 00397) a pro polohu B27 (S)-5Azido-2-(Fmoc-amino)pentanová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 714291). Vzhledem k vysoké čistotě produktu nebyl oktapeptid pre párován pomocí RP-HPLC. Výtěžek surového peptidu io byl 66% (231 mg, 264 pmol), HR-ESI C46H56NiiOio [M+H]1 vypočteno 876,401, nalezeno
876,40.
Příklad 3
Oktapeptid 11
Lineární oktapeptid 11 jako prekursor cyklického oktapeptidu č. 14, kde R, a R? = H, byl připraven metodou syntézy na pevné fázi za použití 400 pmol 2-Cl-tritylové pryskyřice podle obecné metody popsané výše. Pro polohu B29 byla použita nepřirozená aminokyselina (S)-2-(Fmocamino)-4-pentynová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 00397) a pro polohu B26 (S)-5-azido-2(Fmoc-amino)pentanová kyselina (Sigma-Aldrich kat. číslo 714291). Výtěžek peptidu po RP- 8 CZ 24985 Ul
HPLC purifikaci byl 16 % (53 mg, 65 pmol). HR-ESI C^H^NnO^ [M+H]+ vypočteno 814,385, nalezeno 814,384.
Obecná metoda přípravy cyklických oktapeptidů
Lineární oktapeptid obecného vzorce 1-8 (50 mg, 1 molámí ekvivalent) byl rozpuštěn v takovém 5 objemu směsi voda:tBuOH (2:1) aby byla koncentrace peptidu 90 x IO-6 mokl'1. K. roztoku byla přidána kyselina askorbová (14 ekvivalentů) a po jejím úplném rozpuštění CuSO4.5H2O (14 ekvivalentů) v takovém objemu směsi voda:tBuoH (2:1), aby byla výsledná koncentrace peptidu 80 μτηοΙ.Γ1. Reakční směs byla po krátkém zamíchání ponechána stát při laboratorní teplotě. Průběh reakee byl monitorován pomocí RP-HPLC před a 20 min po přidání io CuSO4.5H2O. Vznik cyklického produktu se projevil vymizením výchozího lineárního peptidu a vznikem nového produktu s kratším retenčním časem. Reakční směs (asi 600 ml) byla odpařena na rotační vakuové odparce do objemu asi 10 ml a peptid by odsolen na kolonce nosiče reverzní fáze (Chromabond® C-18, objem asi 12 ml). Odsolený oktapeptid byl dále přečištěn pomocí RPHPLC, lyofilizován a identifikován pomocí hmotnostní spektrometrie.
Příklad 4
Cyklický oktapeptid 12 (tj. oktapeptid spadající do obecného vzorce 7, kde Rj = Bz a R2 = H) byl připraven z lineárního oktapeptidů 9 (50 mg, 0,054 mmol) podle obecného návodu uvedeného výše. Výtěžek po RP-HPLC purifikaci byl 50% (25 mg, 0,027 mmol). HR-ESI CYJUóN] ]O|(, [M+H]+ vypočteno 922,421, nalezeno 922,42.
-9CZ 24985 Ul
Příklad 5 Oktapeptid 13
Cyklický oktapeptid 13 (tj. oktapeptid spadající do obecného vzorce 6, kde R| a ÍC - H) byl při5 praven ze surového lineárního oktapeptidu 10 (150 mg, 0,171 mmol) podle obecného návodu uvedeného výše. Výtěžek po RP-HPLC purifikaci byl 39 % (58 mg, 0,066 mmol). HR-ESI
C^Hg^NjiOio [M+H]+ vypočteno 876,401, nalezeno 876,40.
Příklad 6 Oktapeptid 14
ío
Cyklický oktapeptid 14 (tj. oktapeptid spadající do obecného vzorce 2, kde Ri a R? = H) byl připraven ze surového lineárního oktapeptidu 11 (50 mg, 0,062 mmol) podle obecného návodu uvedeného výše. Výtěžek po RP-HPLC purifikaci byl 35 % (18 mg, 0,022 mmol). HR-ESI C46H56N| 1O10 [M+H]+ vypočteno 814,385, nalezeno 814,38.
Obecná metoda přípravy derivátů insulinu s cyklickými strukturami v C-konci B-řetězce
Nové deriváty insulinu obecného vzorce 1 byly připraveny metodou enzymatické semisyntézy podle Žákové a kol. (Žáková L., Zyka D. a spoluautoři 2007, J. Pept. Sci. 13, 334). Cyklický oktapeptid (150 x 10'3 mol.f1) a DOI (30 x 10'3 mol.f1) byly rozpuštěny v směsi (celkový objem 200 μΙ) obsahující 55% (obj./obj.) DMF ve vodě, 20 x 10'3 mokl'1 octan vápenatý a 4,7 mg
- 10 CZ 24985 Ul
TPCK trypsinu (Sigma-Aldrich, T-1426 či T-8802). pH roztoku bylo upraveno přidáním několika mikrolitrů N-methylmorpholinu na hodnotu 6,9 až 7,0. Reakční směs byla ponechána reagovat za míchání při laboratorní teplotě po dobu 4 až 24 hodin. Vznik produktů byl monitorován pomocí RP-HPLC. Reakce byla zastavena přidáním vychlazeného acetonu. Precipitát byl rozpuštěn v 10% (obj./obj.) kyselině octové ve vodě a produkt purifikován pomocí RP-HPLC. Identita produktu byla potvrzena pomocí hmotnostní spektrometrie na přístroji na přístroji LTQ Orbitrap XL od firmy Thermo Fisher Scientific.
Příklad 7
Derivát insulinu 15
Derivát insulinu 15 byl připraven za použití cyklického oktapeptidu 12 (27 mg) podle obecného postupu uvedeného výše. Výtěžek (vztažený k DOI jako k limitní složce rekce) po RP-HPLC purifikaci byl 14% (4,9 mg, 0,85 μηιοί). HR-ESI [M+H]+ vypočteno 5 766,58, nalezeno 5 766,58.
Příklad 8
Derivát insulinu 16
Derivát insulinu 16 byl připraven za použití cyklického oktapeptidu 13 (26 mg) podle obecného postupu uvedeného výše. Výtěžek (vztažený k DOI jako k limitní složce rekce) po RP-HPLC
- 11 CZ 24985 Ul purifikaci byl 14 % (4,9 mg, 0,86 μιηοΐ). HR-ESI [M+H]' vypočteno 5 720,56. nalezeno 5 720,57,
Příklad 9
Derivát insulinu 17
NH%
B28
Derivát insulinu 17 byl připraven za použití cyklického oktapeptidu 14 (18 mg) podle obecného postupu uvedeného výše. Výtěžek (vztažený k DOI jako k limitní složce rekce) po RP-HPLC purifikaci byl 17% (4,4 mg, 0,78 μπιοί). HR-ESI [M+H]+ vypočteno 5 658,548, nalezeno 5 658,55.
ίο B) Vazebná afinita derivátů insulinu
Principem testování vazebné afinity insulinových derivátů je kompetice derivátu s lidským insulinem, radioaktivně značeným na tyrosinu v pozici A14 pomocí isotopu l25I (Perkin-Elmer, USA, 2200 Ci/mmol, τ = 60 dní) o vazebné místo na insulinovém receptoru. Při testování byla použita metodika postupu podle De Meytse (De Meyts P. 1976, Methods irt Receptur Research, M.
Dekker, New York, 301). K testování vazebných afinit insulinových derivátů vůči receptoru insulinu in vítr o byla použita buněčná linie lidských lymfocytů 1M-9 s vysokou mírou exprese isoformy A insulinového receptoru.
Buňky IM-9 byly pěstovány podle doporučeného postupu dodavatele (ATCC, Manassas, USA; LGC Standards, Polsko). Buňky rostly v podmínkách zvlhčené atmosféry s 5% obsahem CO2, při teplotě 37 °C, v komerčně dostupném médiu RPMI-1640 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (hmotn./obj.), 2 x 10'3 mol.f1 glutamin a 100 U/ml penicilinu/streptomycinu (všechny chemikálie od firmy Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA). Pro zajištění optimálních podmínek růstu byly buňky pasážovány 3x týdně. Buňky byly nejdříve spočítány a poté naředěny na koncentraci 2 miliony/ml.
Zásobní roztoky insulinu a derivátů byly připraveny v 0,1% kyselině octové. Koncentrace byly určeny měřením absorbance při 280 nm a extinkčních koeficientů (ε) 5 840 MÝcrn1 pro lidský insulin a deriváty obsahující čtyři tyrosiny v molekule, respektive 4 560 MÝcrn'1 pro deriváty s pouze třemi tyrosiny. Ředěním vazebným pufrem (viz níže) byly následně připraveny roztoky o klesající koncentraci testovaného derivátu insulinu. V reakční směsi byly buňky inkubovány vždy s roztokem insulinového derivátu o příslušné naředěné koncentraci a o konstantním množstvím radioaktivně značeného insulinu (20 000 impulsů za minutu). Reakce probíhala po dobu 2,5 h, při teplotě 15°C ve vazebném pufru o následujícím složení: 100 x 10’3 mol.f1 HEPES/NaOH pH 7,6; 100 x 10'3 mol.l'1 NaCl, 5 x 10'3 mol.l'1 KC1, 1,3 x 10'3 mol.l’1 MgSO4,1 x 103 mol.l'1 EDTA, 10 x 10'3 mol.l'1 glukóza, 15 x 10'3 mol.l'1 octan sodný a 1% BSA (hmotn./obj.). Celkový reakční objem byl 500 μΐ. Směs byla míchána každých 30 minut. Z každé
- 12 CZ 24985 Ul zkumavky byly vytvořeny duplikáty o objemu 200 μΐ a reakce byla zastavena přídavkem 200 μΐ vazebného pufru o teplotě 4 °C. Směs byla dále odstřeďována při 15 000 g po dobu 10 min, při 4 °C. Po odsátí supematantu byla změřena radioaktivita pelety na γ-počítači. Získaná data byla vyhodnocena za použití modelu vazby do jednoho vazebného místa pomocí programu vytvořeného v aplikaci Excel a vyvinutého v laboratoři Pierre De Meytse (Groth A. V., Shymko R. M. 2008, Computer program: One-site model fitting), či za pomoci GraphPad Prism 5.0 za použití stejného modelu vazby do jednoho místa a určena byla hodnota disociační konstanty (Ad) derivátu či lidského insulinu vůči receptoru. Použitá koncentrace 125I-radíoaktivně značeného insulinu byla 0,01 χ IO'9 mokr1. Jako Kd 125I-značeného insulinu vůči receptoru bylo použita hodnota 0,3 x 10‘9 mokl1.
Výsledky vazebné studie s deriváty insulinu 15-16 a lidským insulinem jsou uvedeny v Tabulce 1 a na Obrázku 3.
Tabulka 1
Hodnoty disociačních konstant (Ad) lidského insulinu a derivátů insulinu vůči receptoru insulinu v membránách lidských IM-9 lymfocytů. Relativní vazebná afinita derivátů je vyjádřena v % vůči lidskému insulinu (100%) a definována jako (Ad lidského insulinu/Ad derivátu insulinu) x 100. (n) je počet měření.
| Ad ± SEM [xlO^maU4] (o) | Relativní vazebnáafinita pq | |
| Lidský insulin | 0,369 ±0,031(5) | 100 |
| 15 | 0,364 ± 0,056 (4) | 101,4 |
| 16 | 0,176 ±0,016 (4) | 209,7 |
C) Schopnost derivátu insulinu 16 snižovat hladinu krevní glukózy u myší in vivo
Principem metody je měření hladiny krevní glukózy u myších samců, kterým bylo subkutánně (s.c.) podáno přesné množství insulinu či jeho derivátu. Samci myší kmene C57B1/6, staří 10 týdnů, dodaní firmou AnLab s.r.o. (Praha, Česká republika) byli chováni při teplotě 23 °C s denním cyklem 12 hodin světlo a 12 hodin tma (světlo od 6,00 hodin). Myši měly volný přístup k vodě a byly chováni na standardní dietě (ST-1 BERGMAN, Mlýn Kocanda, Jesenice, Česká republika). Veškeré in vivo experimety byly konány v souladu se zákonem č. 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání. Pět dní před experimentem byly myši odděleny samostatně do jednotlivých klecí a ráno před započetím pokusu byly myši zváženy, byla jim odebrána potrava a voda ponechána ad libidum. Po 5 hodinách hladovění byla každé myši odstřižena špička ocasu a změřena hladina glukózy v krvi glukometrem (Glucocard X-meter od firmy Arkray Factory. Inc., Japonsko). Poté byl každé myši subkutánně aplikován lidský insulin, fyziologický roztok nebo derivát insulinu. Každou skupinu, které byl aplikován jeden druh látky, tvořilo 8 až 10 myší. Dávka insulinu/derivátu byla 0,75 U na 1 kg hmotnosti zvířete. Jedna jednotka insulinu či derivátu U je definována jako 6 χ 10'9 molu látky. Dávka na jednotlivou myš byla spočítána z průměrné hmotnosti myší v pokusu a byla aplikována v s.c. objemu 100 χ 10'6 litru fyziologického roztoku. Hladina glukózy v krvi byla následně měřena glukometrem v časech 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120 a 150 minut od aplikace látky.
Výsledky in vivo pokusů s lidským insulinem, rychle působícím klinicky používaným derivátem Glulisine (Apidra) a derivátem insulinu 16 jsou znázorněny na Obr. 4. Z grafu plyne, že derivát insulinu 16 má stejně rychlý nástup účinku jako klinicky používaný derivát s rychlým nástupem účinku Glulisine (Apidra). Myší model použitý v tomto pokuse, na rozdíl od lidského, neumožňuje rozlišení rychlejšího nástupu derivátů ve srovnání s lidským insulinem.
- 13CZ 24985 Ul
D) Určení krystalové struktury derivátu insulinu 15
Derivát insulinu 15 byl rozpuštěn v 20 mmoLl'1 HC1 v koncentraci 9 mg/ml. Krystaly byly získány metodou „zavěšené kapky“ z roztoku získaného smícháním 1 ml roztoku derivátu 15 a 2 ml roztoku obsahujícího 0,6 mokl'1 Na2SO4, 0,3 mokl'1 Tris/HCl o pH 7,5, 0,6 x 10'3 mokl'1 acetát zinečnatý a 0,06% (w/v) fenol. Krystaly vyrostly během 3 až 4 týdnů a byly přiřazeny do skupiny P3, s rozměry' prostorové buňky 6,1 nm, 6,1 nm a 8,2 nm, a ~ β - 90°, γ ~ 120°, a jedním R6 hexamerem derivátu 15 v asymetrické buňce. Krystaly derivátu 15 o velikosti asi 0,1 mm x 0,1 mm x 0,05 mm byly za pomoci kryosmyčky (Hampton Research, Velká Británie) přemístěny z krystalizačního roztoku do tekutého dusíku. Rentgenografieká data byla získána na stanici ID23EH2 v ESRF v Grenoble (Francie) za použití detektoru mar225 CCD. Souhrn dat a statistických údajů o krystaluje v Tabulce 2.
Krystalová struktura byla vyřešena na základě modelu R6 hexameru lidského insulinu (struktura lznj.pdb). Struktura byla dále upřesněna pomocí programů Refmac 5 (Murshudov G. N., Vagín A. A. a Dodson E. J. 1997, Acta crystallogr. D 53, 240) a CCP4 (Bailey S. 1994, Acta Crystallogr. D 50, 760). Model derivátu 15 byl vytvořen v programu COOT (Emsley P. a Cowtan K. 2004, Acta Crystallogr. D 60, 2126). Struktura derivátu insulinu 15 byla porovnána s jinými deriváty insulinu pomocí programu LSQKAB (Bailey S. 1994, Acta Crystallogr. D 50, 760) superpozicí Ca atomů v polohách B9-B19.
Derivát 15 krystaloval pouze za přítomnosti fenolu jako R6 hexamer. Celková struktura R6 hexameru derivátu 15 se značně podobá struktuře R6 hexameru lidského insulinu (Iznj. pdb/lmso.pdb) což se odráží v nízké rms odchylce (0,068 nm) mezi jejich vzájemnými atomy (Obr. 5).
Struktura monomeru derivátu 15 je odvozena ze struktury jeho R6 hexameru a je opět velmi podobná struktuře monomeru lidského insulinu odvozeného z jeho R6 hexameru (lmso.pdb) což se odráží v nízké odchylce (0,068 rms nm) mezi atomy těchto dvou oligomerů. Uspořádání a pozice atomů jejich hlavních peptidových řetězců je takřka shodná až po GlyB23.
Tabulka 2
Souhrn dat a statistických údajů o krystalu hexameru derivátu insulinu 15. Hodnoty v závorkách platí pro slupku s nej vyšším rozlišením
| Sběr dat | |
| Paprsek | ESRF ID23EH2-mar225 |
| Vlnová délka (nm) | 0,087260 |
| Prostorová grupa | P3, |
| Roanéry buňky | |
| a,b, c(nm) | 6,1; 6,1; 8,2 |
| Ο,Ρ,ΥΓ) | 90,90,120 |
| Rozlišeni (nm) | 5,0-0,154 (0,157-0,154) |
| ReffB | 0,068(0.488) |
| 21,6(0,3) | |
| Kompletnost (%) | 100(100) |
| Redundance | 5,7(5,7) |
| WilsonAv B faktor (nm2) | 0,0152 |
- 14CZ 24985 Ul
| Upřesňování | |
| Rozlišení (nm) | 5,282-0,154 |
| Počet reflexí | 48163 |
| 0,1689/0,2104 | |
| Počet atomů | 2949 |
| Derivát | 2559 |
| Ligand/iont | 16 |
| Voda | 374 |
| 5-faktory | |
| Derivát | 20,59 |
| Ligand/iont | 12,83 |
| Voda | 31,739 |
| Standardní odchylky (R.m.s.) | |
| Délky vazeb (nm) | 0,0033 |
| Vazebné úhly (**) | 3,067 |
| Ramachandranflv diagram (%) | |
| Preferované/Povolené/nepovolené | 99,25/0/0,75 |
| Krystnlizačnf podmínky | 0.6 mol.!'1 Na2SO4, 0.3 mol.1'1 Tris pH 7.5, 0.6 x l0 J mokr' ZnAc, 0.06% (w/v) fenol |
| Kiyoprotektant | - |
Od této aminokyseliny se začínají obě struktury lišit přičemž vzdálenosti Ca atomů v pozicích B24, B25, B26, B27 a B28 v lidském insulinu a derivátu 15 jsou 0,067 nm, 0,137 nm, 0,120 nm,
0,309 nm a 0,260 nm. Důsledkem je, že řetězec B24-B28 derivátu 15 se vzdaluje od řetězce A o
0,07 až 030 nm ve srovnání s lidským insulinem. Díky přítomnosti triazolového můstku směřují aminokyseliny v pozicích B29 a B30 blíže k řetězci A. Následkem toho jsou aminokyseliny B29 a B30 derivátu 15 vklíněny mezi aminokyseliny B26-B28 a A1-A4. Celý konec B-řetězce (aminokyseliny B28-B30 je propojen s N-koncem A-řetězce (aminokyseliny A1-A3) systémem dobře io uspořádaných molekul vody, který pomáhá stabilizovat strukturu této části derivátu 15.
Triazolový můstek mezi pozicemi B27 a B30 má za důsledek vytvoření nového β-ohybu mezi těmito pozicemi. Skupina CO v pozici B27 vytváří vodíkovou vazbu (0,33 nm) s NH v pozici B30. Takto stabilizovaný β-ohyb má smíšený charakter typu I a typu VIII. Úhly φ a ψ pro pozice n+1 a n+3 v tomto β-ohybu jsou -56°, -43°, -149° a -163°. Stabilita ohybuje dále posílena vodí15 kovou vazbou mezi atomem kyslíku C-terminální COOH skupiny a NH skupinou v pozici B27 (Obr. 6). Tento nový typ β-ohybu v insulinu, nemá rozhodující vliv na konformaci postranních řetězců aminokyselin v pozicích B24-B26 (Obr. 7). Feny lový kruh PheB24 má stejnou pozici jako v lidském insulinu a ve vysoce aktivních derivátech insulin N-methylováných v poloze B26 (Jiráček J., Žáková L. a spoluautoři 2010, Proč. Natí. Acad. Sci. U.S.A 107, 1966). OH skupina fenolického kruhu TyrB26 derivátu 15 je nicméně odkloněna o 0,102 nm od pozice též skupiny v lidském insulinu. Další větší změnou oproti lidskému insulinu je odklon Ca atomu v pozici B27 o 0,178nm. Nejvíce je ve srovnání s lidským insulinem ovlivněna pozice fenylového kruhu v pozici B25 (Obr. 7), která se nejvíce blíží pozici PheB25 ve vysoce aktivních derivátech N-methylovaných v pozici B26 (Jiráček J., Žáková L. a spoluautoři 2010, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A
- 15CZ 24985 Ul
107, 1966). Změna pozice fenylu v pozici B25 je také doprovázena absencí vodíkové vazby mezi B25NH a A19CO, která má zásadní negativní vliv na dimerizační schopnosti insulinu (Antolíková E., Žákova L. a spoluautoři 2011, J. Biol. Chem. 286, 36968).
Claims (4)
- 5 1. Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce, mající obecný vzorec I,DOI-X (I) kde DOI je des(B23-B30)oktapeptíd-insulin, tedy lidský insulin bez C-terminálního oktapeptiduB23-B30, a X je modifikovaný oktapeptid zvolený ze skupiny, zahrnující následující oktapeptidy typů 1 až 8, kde substituent R] je H či benzyl a substituent R3 je H či (CH2)3-NH2, připojené k io des(B23-B30)oktapeptid-insulinu amidovou vazbou mezi karboxylovou skupinou C-terminálníhoArgB22 v molekule des(B23-B30)oktapeptid-insulínu a aminoskupinou N-terminálního GlyB23 v molekulách oktapeptidů 1-8Η2Ν-γ h2n- 16CZ 24985 Ul
- 2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje deriváty insulinu mající obecný vzorec I popsaný v nároku 1.5
- 3. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje deriváty insulinu mající obecný vzorec I opsaný v nároku 1, určený pro léčbu diabetů.
- 4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kromě derivátů insulinu majících obecný vzorec I popsaný v nároku 1, také farmaceuticky přijatelné nosiče, excipienty a diluenty.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201226680U CZ24985U1 (cs) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201226680U CZ24985U1 (cs) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ24985U1 true CZ24985U1 (cs) | 2013-03-04 |
Family
ID=47827518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ201226680U CZ24985U1 (cs) | 2011-12-08 | 2011-12-08 | Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ24985U1 (cs) |
-
2011
- 2011-12-08 CZ CZ201226680U patent/CZ24985U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9908925B2 (en) | Ultra-concentrated rapid-acting insulin analogue formulations | |
| CN102985440B (zh) | 包含额外的二硫键的胰岛素衍生物 | |
| CN102947331B (zh) | 包含额外的二硫键的胰岛素类似物 | |
| US10597436B2 (en) | Acylated insulin compound | |
| KR20120129875A (ko) | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 | |
| KR102940858B1 (ko) | 연장된 시간 작용 아실화된 인슐린 화합물 | |
| US10745458B2 (en) | Non-standard insulin analogues | |
| WO2016172269A2 (en) | Insulin analogs having shortened b chain peptides and associated methods | |
| JP2016506927A (ja) | Ｎ末端短縮型インスリン類似体 | |
| CZ24985U1 (cs) | Deriváty insulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce | |
| US10995129B2 (en) | Non-standard insulin analogues | |
| CZ308383B6 (cs) | Derivát inzulinu s cyklickou strukturou v C-konci B-řetězce | |
| NZ624493B2 (en) | Ultra-concentrated rapid-acting insulin analogue formulations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20130304 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20141218 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20181012 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20211208 |