CZ255397A3

CZ255397A3 - Mutantní proteiny, způsob jejich přípravy, farmaceutické prostředky, které je obsahují, a jejich použití

Info

Publication number: CZ255397A3
Application number: CZ972553A
Authority: CZ
Inventors: Joachim Dr. Hauber
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-02-13
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 1998-02-18
Also published as: HUP9801681A2; FI972763L; AU4665196A; WO1996025492A1; PL321239A1; FI972763A7; FI972763A0; MX9705757A; IL117113A0; EP0811060A1; HUP9801681A3; KR19980702160A; BR9606951A; NO973679L; CA2210538A1; CN1173897A; SK109997A3; JPH10509327A; NO973679D0

Description

Mutantní proteiny, způsob jejich přípravy, farmaceutické prostředky, které je obsahují, a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká mutantních proteinů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků, které je obsahují a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Replikace viru deficitu lidské imunity (HIV) závisí na funkci virového transaktivačního proteinu Rev. Protein Rev je akumulován v jaderném prostoru hostitelské buňky a váže se přímo a specificky na vysoce strukturovanou sekvenci RNA, nazývanou odezvový element Rev (RRE) , který sě vyskytuje na každé neúplně sestřižené virové mRNA. Po navázání, molekuly proteinu Rev konglomerují právě na RRE a spojují se s hostitelským kofaktorem nutným pro transaktivaci Rev, nazývaným eukaryotní iniciační faktor 5A (eIF-5A; starší název: eIF-4D). Výsledkem tohoto spojení je jaderněcytoplasmatická translokace neúplně sestřižené virové mRNA, následovně umožňující expresi virových strukturních proteinů (např. Gag, Pol, Env) a dále replikaci viru.

Mutantní proteiny Rev s transdominantními (dominantně_ negativními) fenotypy již byly popsány (viz. např. WO 90 /14 4 2 7.) . Tyto mu ta nt y Re v j a o u dá i e schopny va z oy na RRE RNA, nejsou však schopny funkčního spojení s jejich buněčným kofaktorem, a to kvůli mutaci v aktivační doméně proteinu Rev.

eIF-5A je endogenní protein, potřebný pro normální funkci buňky. Již bylo připraveno několik jeho různých variant (např. J. Biol. Chem. 264 (1989) 18527 - 18530; Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3105 - 3114) a všechny tyto varianty ···· • · · vykazují nežádoucí vliv na normální buněčné funkce, např. na buněčný růst.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že lze připravit takové mutantní formy proteinu eIF-5A, které neblokují endogenní funkci nativního eIF-5A, a normálně nevykazují aktivitu proteinu eIF-5A, inhibují však funkci proteinu Rev; mají tedy vzhledem k funkci proteinu Rev inhibující fenotyp.

Toto zjištění je velmi překvapující, neboť se nepředpokládalo, že faktor, který je neaktivní v buněčném prostředí přirozeném pro jeho nemutovanou formu, by mohl ..vykazovat inhibující efekt vůči metabolickým pochodům zahájeným vnějším mikroorganismem, jakým je virus. Také se nepředpokládalo, že takové mutantní formy proteinu eIF-5A včetně genů tohoto proteinu by vůbec mohly existovat, protože protein eIF-5A je nezbytný pro buněčnou regulaci (Biofactors 4 (1993) 95-104; TIBS 18 (1993) 475-479). Bylo předpokládáno, že takové proteiny včetně jejich genů by byli toxické vůči buňce, zatímco však geny a proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu (obzvláště M13, M14 a Μ13Δ) jsou neaktivní, netoxické a inhibují protein Rev, například jeho funkci v rámci viru HIV, a tím i replikaci HIV.

Předmětem tohoto vynálezu jsou mutantní formy proteinu ,-e-IF-5A, ---které postrádá ji ’svoj 1” přirozenou “buněčnou'aktivitu ! eIF-5A (v textu nazývaná - endogenní funkce eIF-5A) a zároveň inhibují funkci proteinu Rev, a mají tedy inhibiční fenotyp vzhledem k funkci Rev; dále jsou předmětem tohoto vynálezu jim odpovídající geny a příslušné sekvence DNA a cDNA, které je kódují.

Výhodné jsou mutanty, které jsou podstatně zbaveny endogenní funkce eIF-5A. Zde uváděným eIF-5A je výhodně

lidský eIF-5A a jeho mutanty jsou výhodně založeny na lidské nativní formě eIF-5A. Zde uváděným virem HIV je výhodně jeho forma HIV-1.

Mutantními proteiny se podle vynálezu rozumí polypeptídy včetně svých modifikovaných forem, jako jsou alelické modifikace nebo jejich fragmenty či deriváty schopné inhibovat funkcí proteinu Rev.a které výhodně nedisponují téměř žádnou endogenní funkcí eIF-5A. Pro farmaceutické účely se používají výhodně ve vysoce čisté formě, tedy podstatně zbavené substancí z nitrobuněčného prostředí.

Mutace zahrnují výhodně úsek nebo více úseků na polypeptidickém řetězci, začínající přibližně na úrovni odpovídající aminokyselině č. 130 v nativním genomu eIF-5A (obr. 3, identifikační č. sekvence - 17), zejména v úseku zhruba mezi aminokyselinou č. 135 a koncem molekuly, především však mezi č. 135 a č. 139.

Odpovídající geny nebo sekvence DNA nebo cDNA jsou ukázány například v tabulce č. 2 především pro mutanty elF5AM13, eIF-5AM14 a eIF-5AM13A; dále jimi mohou být takové geny či sekvence, které za přísných podmínek hybridizují se sekvencemi kódujícími zmíněné proteiny nebo geny či sekvence, které s nimi nehybridizuji pouze v důsledku degenerace genetického kódu, a zároveň výhodně nehybridizuj! s geny a sekvencemi odpovídajícími nativním formám.

Předmětem vynálezu jsou dále prokaryotní a eukaryotní hostitelské buňky, do kterých jsou transformované nebo _ 1 _ X- r _ _1 v t _ 1 1 T-v»-f TI _1 ^z uc-±iiuvdi:e · · = provést Dále jsou předmětem vynálezu biologicky funkční plasmidové nebo virové vektory DNA, obsahující gen nebo sekvenci DNA nebo cDNA definované výše. Předmětem vynálezu jsou také prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky, které jsou stabilně výše, a to tak, že hostitelská buňka je schopna expresi těchto genů nebo sekvencí DNA nebo cDNA transformované nebo transfektované vektory DNA výše uvedenými.

Předmětem tohoto vynálezu je dále způsob přípravy genů nebo sekvencí DNA nebo cDNA definovaných výše, a to včetně isolace příslušného nativního genu z odpovídajícího expresního systému, jeho nakloňování do příslušného systému, provedení požadované genetické mutace a izolace výsledného mutantu z klonů s požadovanou mutací.

Vynález dále zahrnuje způsob produkce výše definovaných proteinů, který zahrnuje kultivaci prokaryotních nebo eukaryotních hostitelských buněk za přítomnosti vhodných živin a za vhodných kultivačních podmínek, transformovaných nebo transfektovaných geny nebo sekvencemi DNA nebo cDNA definovanými výše, a to takovým způsobem, který umožňuje hostitelským buňkám produkci proteinu a popřípadě izolaci výsledného polypeptidického produktu exprese.

Vynález rovněž zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující výše definované proteiny, společně alespoň s jedním farmaceuticky vhodným nosičem, s pomocnou látkou nebo pouze s ředidlem. Nosičem mohou být rovněž buňky izolované z pacientova těla a upravené in vitro před jejich aplikací. Vynález dále zahrnuje použití výše definovaných proteinů nebo genů či sekvencí DNA nebo cDNA kódujících tyto proteiny při léčbě onemocnění vyvolaných retroviry, u kterých funkce jejich proteinu Rev závisí na funkci eIF-5A, jako jsou viry HIV, HTLV-I a HTLV-II. Předmětem vynálezu je také jejich ,,.p.OU Z x-t x.. j~á ko xě C-x -ν'ά--j-ě-j xCu = pOu-ž x Li - p x-O -p x‘ ip-i'ď vu.·, 1 é-č x-v-d —px O-— léčení onemocnění způsobených retroviry, u kterých funkce jejich proteinu Rev závisí na funkci eIF-5A, jako jsou viry HIV, HTLV-I a HTLV-II.

Postupy a metody nutné pro uskutečnění zde uváděného vynálezu jsou v oboru známé. Ačkoli jejich příprava zde není konkrétně uvedena, sloučeniny, reakční činidla, vektory, buněčné linie apod., kterých je zapotřebí pro uskutečnění

tohoto vynálezu, jsou všeobecně známé a běžně dostupné nebo je lze získat již konvenčními metodami ze známých a běžně dostupných zdrojů nebo jim podobné zdroje mohou být připraveny konvenčními metodami z jiných obecně známých a běžně dostupných zdrojů.

Příklady provedení vynálezu

a) Příprava mutantů eIF-5A

Lidská cDNA kódující eIF-5A (J. Cell Biol. 123/6, 1309 1320/(1993)) byla inzertována jako HindlII fragment do jediného restrikčního místa HindlII vektoru M13mpl8 (Pharmacia, Švédsko). Odpovídající jednořetězcová DNA byla použita pro mutagenezi metodou „oligonukleotidem řízené mutageneze in vitro, verze 2 (Amersham, UK). Sekvence všech mutantů byly určeny sekvencováním DNA s použitím Sequenase 2.0 z United States Biochemicals. Dále byla v buňkách COS provedena exprese všech mutovaných genů kódujících eIF-5A (viz. Tabulka č. 1), následovaná imunoprecipitační analýzou specifickou pro eIF-5A, kterou byla potvrzena přítomnost požadovaného produktu exprese.

·· ···· · · ee β o 999

Tabulka 1

Mutanty eIF-5A

Mutant Pozice (ak)

Mutace vázání Rev komplementace (ak) in vitro v kvasinkách

peF-5AMl	4,5,6	DLD—»EDL	nz.	ano
peF-5AM2	9,10	TG—»DL	nz.	ano
peF-5AM3	15,16,17	SAT—>ADL	nz.	ano
peF-5AM4	22,23,24	CSA—>GDL	-	ne
peF-5AM5	43,44,45	MST—>IDL	-	ne
peF-5AM6	46,47,48	SKT—>LDL	-	ne
peF-5AM7	64,65	FT—>DL	-	ne
peF-5AM8	69, 70	YE—>DL	-	ne
peF-5AM9	75,76	ST—>DL '	-	ne
peF-5AM10	98,99,100	YLS—>LDL	-	ne
peF-5AMll	104,105,106	DSG—»QDL	nz.	ano
peF-5AM12	126,127	KY—»DL	nz.	ano
peF-5AM13	135,136	IT—>DL	+	ne
peF-5AM14	138,139	LS—>DL	+	ne
peF-5AM15	141,142,143	MTE-»IDL	nz.	ano
peF-5AM16	149,150	IK—>DL	-	ne
·=· — -=·--=:···				. ..=,===,., ..
peF-5AM13A* 135	DLCCLP-STOP	+	ne

* peIF-5A13A je protein o 140 aminokyselinách (ak) po deleci C-terminálu proteinu peIF-5A. Jeho sekvence je: nativní od aminokyseliny č. 1 až po č. 134 a dále aminokyseliny: DLCCLP. Všechny ostatní mutanty jsou vzniklé substitucí aminokyselin.

esceββ + značí aktivitu nativní, - značí žádnou aktivitu, nz. značí nestanovováno.

Nukleotidové sekvence specifických oligonukleotidů použitých pro přípravu uvedených 17 mutantů jsou uvedeny v Tabulce 2 (identifikační č. sekvence 1 až 16). Poslední mutant, Μ13Δ, byl připraven za použití stejného oligonucleotidu jako M13; chyba v postupu mutageneze však způsobila vznik mutantu Μ13Δ.

Je nutno vzít na zřetel, že uvedené sekvence nukleotidů jsou pouze reprezentativními ukázkami pro 17 připravených mutantů, a že je možno připravit identické mutanty z celé řady jiných sekvencí, vezmeme-li v úvahu např. odchylky od standardního genetického kódu.

• · · · · * eeee β··

Tabulka 2

Oligonukleotidy použité pro přípravu mutantů eIF-5A

Ml:

5'

-

GGC

AGA

TGA

AGA

TCT

CTT

CGA

GAC

AGG

- 3'

M2:

5'

-

CTT

GGA

CTT

CGA

AGA

TCT

AGA

TGC

AGG

- 3'

M3:

5

-

GCA

GGG

GCC

GCA

GAT

CTC

TTC

CCA

ATG

C - 3'

M4 :

5'

-

CCC

AAT

GCA

GGG

AGA

TCT

ATT

ACG

TAA

G - 3'

M5:

5'

-

CGT

CGA

GAT

AGA

TCT

TTC

GAA

GAC

TGG

- 3'

M6:

5'

-

CGA

GAT

GTC

TAC

TTT

AGA

TCT

TGG

CAA

GCA CG

- 3'

M7:

5'

-

GGT

ATT

GAC

ATA

GAT

CTT

GGG

AAG

AAA

TAT G -

3'

M8 :

5'

-

GGG

AAG

AAA

GAT

CTA

GAT

ATC

TGC

CCG

- 3'

M9:

5'

-

GAT

ATC

TGC

CCA

GAT

CTT

CAT

AAT

ATG

G -3'

M10:

5'-

GGC

ATC

CAG

GAT

GGG

TTA

GAT

CTA

CTG CTC

CAG

AGC

G -2

i '

Mil:

5'

-

CTG

CTC

CAG

GAA

GAT

CTG

GAG

GTA

CGA

G -3 '

M12 :

5'

-

GAG

ATT

GAG

CAA

GAT

CTC

GAC

TGT

GGA

G -3'

M13:

5 '

-

GAA

GAG

ATC

CTA

GAT

CTG

GTG

CTG

TCT

GCC - 3

M14 :

5'

-

CCT

GAT

CAC

GGT

AGA

TCT

TGC

CAT

GAC

AGA GG

- 3'

M15:

5'

-

GCT

GTC

TGC

CAT

AGA

TCT

GGA

GGC

AGC

TG - 3'

Ml 6:

5'

—

GCA

GCT

GTT

GCA

GAT

CTG

GCC

ATG

GC -

- 3'

b) Testování buněčné aktivity eIF-5A mutantů eIF-5A v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

Sekvence kódující eIF-5A byly inzertovány do restrikčních míst BamHI a Xbal kvasinkového shuttle-vektoru pRSGAL za použití technologie polymerázové řetězové reakce (PCR). Pro účely testování komplementační kapacity různých mutantů eIF-5A v kvasinkovém kmeni Saccharomyces cerevisiae neobsahujícím eIF-5A byla použita plasmidová technologie publikovaná v Mol. Gen. Genet. 244, 646 - 652 (1994).

·· ····

Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1; několik mutantů eIF-5A, zvláště od peIF-5AM4 až po peIF-5AM10 a dále peIF-5AMl3, peIF-5AM16 a peIF-5AM13A bylo identifikováno jako nefunkční mutanty proteinu eIF-5A.

c) Vázání in vitro nefunkčních mutovaných proteinů eIF-5A k transaktivačnímu proteinu Rev viru HIV s použitím testu změny pohyblivosti v gelu

Geny nativní a všech nefunkčních forem proteinu eIF-5A byly inzertovány mezi restrikční místa BamHI a EcoRI prokaryotního expresního vektoru pGEX-3X (Pharmacia) s použitím polymerázové řetězové reakce a dále byla provedena jejich exprese ve formě fůzních proteinů obsahujících glutathion-S-transferázu (GST) v Escherichia coli, následovaná purifikací. Různé fůzní proteiny GST-eIF-5A byly dále použity v testech změny pohyblivosti v gelu spolu s RRE RNA označenou izotopem ³²P a s rekombinantním proteinem Rev (Nátuře 342, 816-819(1989)), podle postupu popsaného v časopise Biochemistry 32, 10497-10505 (1993).

Jako první byl testován vliv nativního proteinu GST-elF5A na komplex RRE:Rev. Jak je ukázáno na obrázku IA, přídavek proteinu GST-eIF-5A do reakční směsi RRE RNA obsahující Rev umožnil detekci komplexu o vyšší molekulové hmotnosti a o jednoznačně snížené pohyblivosti (Obr. IA, pruhy 5 a 4).

Tento nebyl detekovatelný za inkubace RRE RNA spolu s GST nebo se samotným GST-elF-5A (Obr'. IA, pruhy⁵ 2 a 3) . ’ - -·™

Dále bylo testováno, zda odezva specifická pro protein eIF-5A závisí na přítomnosti aktivační domény v transaktivačním proteinu Rev. Za účelem tohoto zjištění byly použity již dříve popsané mutantní proteiny Rev9A14 a RevllA14 (Biochemistry 32, 8945-8954 (1993)). Oba tyto proteiny obsahují vnitřní deleci v blízkosti C-terminálu a • · · · vykazují vůči RRE RNA specifickou vaznou afinitu a specificitu, která je porovnatelná s nativní formou Rev. Důležité je, že z proteinu Rev9A14 byla zcela odstraněna aktivační doména, která však v proteinu RevllA14 byla zachována. Nižší molekulová hmotnost obou proteinů způsobila posun proužků komplexu RRE:protein, který bylo obtížné určit při testu změny pohyblivosti v gelu. Výsledky však jednoznačně ukazují, že mutant s odstraněnou aktivační doménou Rev9A14 není schopen interakce s GST-eIF-5A (Obr. 1A, pruhy 6 a 7). Naproti tomu přídavek GST-eIF-5A k reakční směsi RRE:RevllA14 způsobil nový výsledek (Obr. 1A, pruhy 8 a 9; pomaleji se pohybující bod v pruhu 9), který indikuje interakci eIF-5A s aktivační doménou Rev.

Nakonec byly podle stejného postupu testovány vazebné schopnosti různých nefunkčních mutantních proteinů eIF-5A.

Jak plyne z obrázku 1B, většina mutantních proteinů GST-elF5A ztratila schopnost rozlišovat komplex RRE:Rev (pruhy 4 až 10 a pruh 13). Tři nefunkční mutantní proteiny: GST-elF5AM13, GST-eIF-5AM14 a GST-eIF-5AMl3A, však prokazují vázání, které je porovnatelné s vázáním nativního proteinu eIF-5A (Obr. 1B, pruh 3 a 11, 12 a 14).

Výsledky tedy ukazují, že mutanty eIF-5AMÍ3, eIF-5AM14 a eIF-5AM13A vyhovují požadavkům pro inhibitory funkce HIV-1 Rev, a to vzhledem:

(1) ke ztrátě endogenní funkce proteinu eIF-5A (viz.

.. . komplementaci v kvasinkách, Tabulka I), a . . ..

(2) k vazebné aktivitě vůči proteinu HIV-1 Rev (viz vázání Rev in vitro; Tabulka I a Obrázek 1B).

d) Konstitutivní inhibice replikace HIV-1 v lidských T buňkách retrovirálně zprostředkovaným genovým transferem transdominantních mutant eIF-5A.

Pro účely testování inhibičních fenotypů proteinů eIF-5AM13, eIF-5AM14 a eIF-5AM13A byly příslušné sekvence kódující eIF-5A inzertovány do restrikčního místa Xho I retrovirálního vektoru pBC 140, sbaleny in vitro za použití buněčné linie Am 12 a přeneseny do lidských T - buněk CEM pro konstitutivní expresi, jak je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. 89, 9870-9874 (1992). Exprese nativního genu eIF-5A, genu kódujícího eIF-5AM9 a samotného retrovirálního vektoru bylo využito pro referenční porovnání v těchto experimentech.

Rovněž byly provedeny experimenty s HIV-1, a to za použití TCID o hodnotě 2000/ml kmene HIV-1 SF2. Desátý den po infekci SF2 byly odebrány vzorky z kultivačního média pro test replikace HIV-1 pomocí stanovení proteinu p24 Gag za použití testu ELISA. Jak je ukázáno na Obrázku 2, replikace HIV-1 byla podstatně snížena v každé ze tří nezávisle klonovaných buněčných linií CEM (označené jako A, B, C) produkujících eIF-5AMl3, eIF-5AMl4 nebo elF5ΑΜ13Δ (Obrázky 2C, 2D a 2E; vlevo), a to v porovnání s buňkami CEM, produkujícími mutantní protein eIF-5AM9 (CEM-eIF-5AM9; Obr. 2B). Maximální virová replikace byla zjištěna v buňkách CEM produkujících parentální vektor pBC140 (vektor CEM; Obr. 2A) nebo nativní protein eIF-5A (CEM-eIF-5Awt; Obr. 2A) . Pozorované inhibující vlastnosti nebyly způsobeny obecnou inhibici buněčné proliferace, což dokladují srovnatelné počty buněk v experimentech (Obr. 2; vpravo).

Závěrem, tyto experimenty prokazují, že (1) konstitutivní exprese proteinů eIF-5AM13, eIF-5AM14 nebo eIF-5AM13A nemá v lidských T - buňkách CEM toxické účinky a (2) že eIF-5AMl3 , eIF-5AM14 a eIF-5AM13A jsou inhibitory replikace HIV-1.

·· ···

HIV je predominantním etiologickým původcem AIDS (syndromu získané imunodeficience); HTLV-I způsobuje mimo jiné ATL (leukémii T - buněk dospělých); HTLV-II souvisí etiologicky s některými případy variantní leukémie vlasových T - buněk. Bylo zjištěno, že transaktivátory HIV Rev a HTLV-I Rex jsou důležité pro virovou replikaci v médiu. Dále bylo prokázáno, že HTLV-I Rex je schopen funkčně nahradit protein Rev v HIV. Navíc, Rev a Rex jsou proto možnými cíly pro terapeutickou intervenci u postižených pacientů. Mutantní formy 6IF-5A podle vynálezu účinkují jako efektivní kompetitivní inhibitory nativní formy Rev nebo/a funkce nativního Rex v důsledku schopnosti Rex funkčně nahradit Rev v HIV. Vzhledem k tomu tyto mutantní formy eIF-5A mohou být také efektivními inhibitory replikace HIV nebo/a HTLV-I nebo/a HTLV-II. Mohou být tedy použity k ochraně lymfoidních nebo/a myeloidních buněk pacientů vystavených infekci a proto mohou být použity pro léčbu onemocnění způsobených HTLV-I a HTLV-II nebo HIV, a to včetně AIDS a ARS nebo ARC (syndromu nebo komplexu souvisejícího s AIDS). Také mohou být použity pro léčbu onemocnění způsobených AIDS protože jsou schopny inhibovat činnost proteinů HTLV-I Rex a HIV Rev. Tato vlastnost může být obzvláště prospěšná u pacientů infikovaných více než jediným virovým patogenem a dále u těch, u kterých není zjištěno, kterým z těchto dvou původců jsou infikováni.

Tento vynález je tedy určen pro profylaxi a terapii virových a obzvláště retrovirových onemocnění, jako jsou ATL, AIDS, ARS (nebo ARC), infekce způsobené viry jako jsou SIV (opičí virus deficitu imunity) jako je SIV_mac, FIV (kočičí virus deficitu imunity), EIAV (koňský virus infekční anémie), virus visna, virus deficitu imunity hovězího dobytka a zejména lidská retrovirová onemocnění, zvláště lidská ··· • Β retrovirová onemocnění způsobená patogeny regulovanými geny rex nebo rev nebo jejich ekvivalenty, jako je ATL, AIDS a ARS (nebo ARC). Zvláštní pozornost si zasluhuje multivalentní využití represorového efektu, neboť toto využití je výhodné při léčbě násobných, obzvláště podvojných virových infekcí, jak lze často pozorovat například u osob užívajících intravenózně drogy a infikovaných současně HIV a HTLV-I nebo při léčbě infekcí způsobených jedním patogenem za zvýšeného rizika další infekce, jako je infekce HIV či v případě profylaxe za takových situací, kdy je zapotřebí ochrany proti infekci způsobené spektrem různých virových kmenů.

Terapeutické možnosti tohoto vynálezu jsou zcela zřejmé, neboť potlačení například funkce Rex u HTLV-I a funkce Rev u HlVblokuje virovou replikaci, a tak zabráněním tvorby infekčních virových částic snižuje virovou zátěž a předpokládá se tedy, že prodlužuje latentní období infekce. Buňky osob infikovaných virem. HIV, mající ve svém genomu zaintegrovaný gen kódující mutantní represor eIF-5A, zůstanou funkční a tyto osoby budou neomezeně dlouho uchráněny před projevem symptomů onemocnění bez potřeby další dlouhodobé terapie.

Z tohoto pohledu jsou geny podle vynálezu samy o sobě léčivy určenými pro jednorázové nebo vícerázové dávkování buďto přímo in vivo nebo nepřímo in vitro, výhodně jako součást vektoru, například retrovirálního nebo plasmidového, a to ve formě vhodné pro dosažení přenosu ve funkční formě do cílových savčích buněk. Například inzerce genů kódujících tyto inhibitory virové replikace může být provedena in vitro do buněk pacientů přímou implantací do genomu lymfoidních nebo/a myeloidních buněk odebraných z těchto pacientů a tyto buňky mohou být pacientovi dodány po provedení inzerce. Vzhledem k tomu, že HTLV-I a HTLV-II, stejně tak jako i HIV se replikují v různých typech T - buněk, potom onemocnění která způsobují, budou vhodně léčena. T - buňky jsou proto • · · · požadovanými cílovými buňkami pro genetickou modifikaci využívající geny podle vynálezu. Dále, monocytní a makrofágové buňky, které jsou cílovými buňkami pro infekci HIV, jsou také vhodnými cílovými buňkami pro tuto modifikaci. Výhodně se provádí modifikace hěmatopeotických kmenových buněk, čímž se zajistí dlouhodobá ochrana buněčného potomstva násobného hematopoetického rodu.

Jedno využití uvedeného souvisí s konceptem genové terapie uveřejněným T. Friedmanem v Science, 244, (1989),

1275 nebo P.M. Lehnem v Bone Marrow Transplant 1 (1987) 243. Hematopoetické kmenové buňky jsou izolovány například z pacientů postižených AIDS/ATL, kultivovány in vitro a mutantní geny podle vynálezu, kódující inhibitor funkce, která má být potlačena, jmenovitě funkce Rev/Rex, jsou implantovány do těchto buněk za použití retrovirových vektorů. Tyto buňky, nyní již resistentní vůči virům, jsou vráceny do imunitního systému původního pacienta, kde se očekává jejich proliferace vzhledem k jejich získané selektivní výhodě v porovnání s ostatními kmenovými buňkami.

V požadovaném čase se bude populace hematopoetických buněk skládat výhradně z buněk produkujících represní faktor a bude resistentní vůči virům.

Postupy k dosažení uvedeného jsou již v oboru známé, viz, např. USP 4'868'116. Vektory, například retrovirové nebo plasmidové vektory pro přenos mutovaných genů podle vynálezu do cílových savčích buněk, jako jsou buňky kostní dřeně,, jsou uveřejněny nebo k nim existují odkazy, například v Science 244 (1989) 1275. Například různé transdominantní geny kódující Rev nebo/a Rex již byly inzertovány do retrovirových vektorových systémů. Po přenosu genu prostřednictvím retrovirů do lidských buněčných linií infikovaných např. HIV je inhibiční efekt mutantů zřejmý na inhibici produkce virů. Zmíněný terapeutický koncept je příkladem intracelulární • · · · imunizace vysvětlené v práci D. Baltimora v Nátuře, 335, (1988), 3'95. Souhrnem řečeno, tento koncept zahrnuje inzerci genu, který kóduje represor některé životně důležité funkce zvoleného viru, do příslušných cílových buněk, které tento virus infikuje (např. určité T - buňky a monocytní a ' makrofágové buňky v případě viru vyvolávajícího AIDS).

Použití tohoto konceptu při terapii represorem kteréhokoli viru je vázáno na podmínku, že použité vektory pro geny kódující tyto mutantní proteiny a použité metody pro inzerci těchto vektorů do náležitých buněk, identifikované jako modely, budou představovat efektivní a bezpečný intrabuněčný systém přenosu pro využití u lidí i u zvířat. Před experimentálním ověřením tohoto konceptu tedy stojí pouze etické překážky, které v současné době zabraňují genové terapii. První takové experimenty na osobách již však byly zahájeny, a to se zaměřením na bezpečnost a vlastní terapii (viz. G.T. Nabel, Human Gene Therapy, 5, (1994), 79-82).

Očekává se, že ve velmi krátké době po ověření neškodnosti tohoto postupu, budou tyto průkopnické experimenty následovány podobnými experimenty s terapeutickými cíly, a to . především za stavů ohrožujících život, jako je onemocnění AIDS a že tento vynález se ukáže jako velmi vhodný pro využití během těchto experimentů (viz. např. T. Friedman, Science 244 (1989), 1279, druhý sloupec: „Infekční onemocnění).

. ________„. Dalším. způsobem využití tohoto vynálezu je inzerce nikoli genu, nýbrž přímo represního proteinu podle vynálezu do cílových buněk. Orální nebo parenterální podání se provádí ’ běžným způsobem umožňujícím intracelulární penetraci, a to např. prostřednictvím lipozómů. V případech takového využití bude přesná dávka samozřejmě záviset na použité sloučenině, způsobu podání a požadované léčbě; určení nej vhodnější dávky v dané situaci je v možnostech kvalifikovaného odborníka.

• ·· · • ·· ·« ····

Je třeba vzít na zřetel, že v předchozím textu uvedený vynález může podléhat různým kombinacím nebo změnám jeho formy či jednotlivých detailů, aniž by došlo k odklonu od rozsahu tohoto vynálezu. Také je nutno vzít na zřetel, že do rozsahu tohoto vynálezu spadají také další mutanty mimo zde uvedených, a to včetně mutantů patřící mezi mutanty již zkonstruované a zde uvedené, které však zatím nebyly charakterizovány, ale mohou být shledány po detailnějším zkoumání jako inhibující nebo/a multivalentní, a dále další mutanty, které odpovídají výše uvedeným principům, ale nejsou zde specificky uvedeny.

In vitro experiment posunu RNA v gelu.

FP = volná sonda; eIF-5A (-) = bez eIF-5A.

·· ···· • © · • ··· © · » • · • · »· ;···· • © · · . · I · · • · · \· · t. · • · · · · » · • · · · ·«· ··· ©· ·

Popis obrázků:

Obrázek 1

Obrázek 2; Experimenty s HIV-1. Hodnoty p24Gag jsou ukázány vlevo. Počty buněk u příslušných experimentů jsou ukázány napravo:

A: CEM-vektor / eIF-5A wt B: CEM-eIF-5AM9 C: CEM-eIF-5AM13 D: CEM-eIF-5AM14

E: CEM-eIF-5AMl3A

Obrázek 3: (Sekvence č. 17): Sekvence cDNA a aminokyselin nativního lidského eIF-5A (J. Bioi. Chem. 264 (1989) 1581) (Sekvence č. 17); aminokyselina lysin znázorněná na pozici č. 50 je posttranslačně zmodifikována na hypusin. Aminokyseliny nativního eIF-5A, které byly zmutovány podle přehledu v Tabulce 1 jsou uvedeny v kurzívě. Specifické použité oligonukleotidy (Tabulka 2, Sekvence č. 1 až č. 16) odpovídají následujícím pozicím nukleotidů v Obrázku 3 (Sekvence č. 17):

Ml:	3-29	(27	nukleotidů)
M2:	12-38	(27	nukleotidů)
M3:	34-61	(28	nukleotidů)
M4 :	54-81	(28	nukleotidů)
M5:	120-146	(27	nukleotidů)
M6:	123-154	(32	nukleotidů)

M7 :	178-208	(31
M8 :	196-222	(27
M9:	211-238	(28
M10:	277-316	(40
Mil:	301-328	(28
M12 :	364-291	(28
M13:	391-420	(30
M14 :	399-430	(32
M15:	411-439	(29
M16:	433-458	(26
Μ13Δ	:391-421	(30
je bez translace,
STOP	na pozicích 4

(31 nukleotidů) (27 nukleotidů) (28 nukleotidů) (40 nukleotidů) (28 nukleotidů) (28 nukleotidů) (30 nukleotidů) (32 nukleotidů) (29 nukleotidů) (26 nukleotidů) (30 nukleotidů, pozice č. 409 je následována kodónem -424), výsledkem jsou změny aminokyselin uvedené v Tabulce 1 v sekvenci nativního proteinu.

·· ····

Seznam sekvenci

Informace o sekvenci č. 1 (Ml):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ:

(C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 1:

GGC AGA TGA AGA TCT CTT CGA GAC AGG

Informace o sekvenci č. 2 (M2):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ:

_ . . (C) Řetězec: dvojj..tý_ ,______₅ (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický ·«. ···· ······· · (x) Informace ο zveřejnění:

(Η) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 2:

CTT GGA CTT CGA AGA TCT AGA TGC AGG

Informace o sekvenci č. 3 (M3):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č, 3 :

GCA GGG GCC GCA GAT CTC TTC CCA ATG C

Informace o sekvenci č. 4 (M4):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 (B) Typ:

(C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 4:

CCC AAT GCA GGG AGA TCT ATT ACG TAA G

Informace o sekvenci č. 5 (M5):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:₌,(.I-.)._i=Da-tum=:podání_!:^ (J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 5:

CGT CGA GAT AGA TCT TTC GAA GAC TGG

9· ····

Informace ο sekvenci č. 6 (M6):

(i) Charakteristika sekvence:

(A)	Délka: 32 párů bází
' (B)	Typ:
(C)	Řetězec: dvojitý
(D)	Topologie:	lineární
(ii) Druh molekuly	: cDNA
(iii)Hypothetický:	Ne
(iii)Antisense: Ne

(vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 6:

CGA GAT GTC TAC TTT AGA TCT TGG CAA GCA CG

Informace o sekvenci č. 7 (M7):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ:

(C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: . lineární (ii) . Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:23

(I) Datum podání : (J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 7:

GGT ATT GAC ATA GAT CTT GGG AAG AAA TAT G

Informace o sekvenci č. 8 (M8):

(i) Charakteristika sekvence:

(A)	Délka: 27	párů bází
(B)	Typ:
(C)	Řetězec:	dvojitý
(D)	Topologie	: lineární

(A) Organismus: Syntetický (x) Publikační informace:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 8:

GGG AAG AAA GAT CTA GAT ATC TGC CCG

Informace o sekvenci č. 9 (M9):

(i) Charakteristika sekvence: . .

(A)	Délka: 28 párů bází
(B)	Typ:
(C)	Řetězec: dvojitý
(D)	Topologie: lineární

(ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne • · · · · · (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 9:

GAT ATC TGC CCA GAT CTT CAT AAT ATG G

Informace o sekvenci č. 10 (M10):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 40 párů bází (B) Typ:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:.(.xi.)__Pppijs_w,sekvence l „SsJsvendé ď. _m ,1_Q: .

GGC ATC CAG GAT GGG TTA GAT CTA CTG CTC CAG GAC AGC G

Informace o sekvenci č. 11 (Mil):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 11:

CTG CTC CAG GAA GAT CTG GAG GTA CGA G

Informace o sekvenci č. 12 (M12):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ:'' (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) · Organismus: Syn tet ic ký = · (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 12:

·· ····

GAG ATT GAG CAA GAT CTC GAC TGT GGA G

Informace o sekvenci č. 13 (M13) :

(i) Charakteristika sekvence:

(A)	Délka: 30	párů bází
(B)	Typ:
(C)	Řetězec:	dvoj itý
(D)	Topologie	: lineární

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 13:

GAA GAG ATC CTA GAT CTG GTG CTG TCT GCC

Informace o sekvenci č. 14 (M14):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ:

(C) Řetězec: dvojitý . .

(D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický

?

(x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 14:

CCT GAT CAC GGT AGA TCT TGC CAT GAC AGA GG

Informace o sekvenci č. 15 (M15):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 29 párů bází (B) Typ:

(A) Organismus: Syntetický (x) Publikační informace:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 15:

GCT GTC TGC CAT AGA TCT GGA GGC AGC TG

Informace o sekvenci č. 16 (M16):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ:

(C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární ·· ···· (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Syntetický (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:(I) Datum vyplnění:(J) Datum publikování:(xi) Popis sekvence: Sekvence č. 16:

GCA GCT GTT GCA GAT CTG GCC ATG GC

Informace o sekvenci č. 17 (wt):

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 465 párů bází (a 154 aminokyselinových zbytků) (B) Typ: cDNA (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: cDNA (iii) Hypothetický: Ne (iii)Antisense: Ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Homo sapiens (x) Informace o zveřejnění:

(H) Číslo dokumentu:J. Biol. Chem. 264 (1989) 1578(I) Datum podání:(J) Datum zveřejnění: 1989 (xi) Popis sekvence: Sekvence č. 17:

·· ·«·· • ··· ··· e eee

ATG

GCA

10

TTG

GAC

TTC

GAG

ACA

30 GGA

GAT

GCA

GGG

GCC

TCA

GAT

GAC

Met

Ala

Asp

Leu

Asp

Phe

Glu

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Ala

Ser

1

10

50

70

90

GCC

ACC

TTC

CCA

ATG

CAG

TGC

TCA

GCA

TTA

CGT

AAG

AAT

GGC

TTT

Ala

Thr

Phe

Pro

Met

Gin

Cys

Ser

Ala

Leu

Arg

Lys

Asn

Gly

Phe

20

110

130

GTG

CTC

AAA

GGC

CGG

CCA

TGT

AAG

ATC

GTC

GAG

ATG

TCT

ACT

Val

Leu

Lys

Gly

Arg

Pro

Cys

Lys

Ile

Val

Glu

Met

Ser

Thr

40

150

170

TCG

AAG

ACT

GGC

AAG

CAC

GGC

CAC

GCC

AAG

GTC

CAT

CTG

GTT

GGT

Ser

Lys

Thr

Gly

Lys

His

Gly

His

Ala

Lys

Val

His

Leu

Val

Gly

60

190

210

ATT

GAC

ATC

TTT

ACT

GGG

AAG

AAA

TAT

GAA

GAT

ATC

TGC

CCG

TCA

Ile

Asp

Ile

Phe

Thr

Gly

Lys

Tyr

Glu

Asp

He

Cys

Pro

Ser

230 250 270

ACT CAT AAT “ATG GAT GTG CCC AAC ATC AAA AGG AAT GAC TTC CAG ...

Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gin

90

290

CTG ATT GGC ATC CAG GAT GGG TAC CTA TCA CTG CTC CAG GAC AGC

Leu Ile Gly Ile Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser

100 ·· ····

330

GGG	GAG	GTA	CGA	GAG	GAC	CTT	CGT
Gly	Glu	Val	Arg	Glu	Asp	Leu	Arg
				110
		370
AAG	GAG	ATT	GAG	AAG	TAC	GAC	TGT
Lys	Glu	Ile	Glu	Lys	Tyr	Asp	Cys
10						430
GTG	CTG	TCT	GCC	ATG	ACA	GAG	GAG
Val	Leu	Ser	Ala	Met	Thr	Glu	Glu

140

350

CTC	CCT	GAG	GGA	GAC	CTT	GGC
Leu	Pro	Glu	Gly	Asp	Leu	Gly
390						⁼ 4
GGA	GAA	GAG	ATC	CTG	ATC	ACG
Gly	Glu	Glu	Ile	Leu	Ile	Thr

130

					450
GCA	GCT	GTT	GCA	ATC	AAG	GCC
Ala	Ala	Val	Ala	Ile	Lys	Ala

150

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mutantní protein eIF-5A, který inhibuje funkci Rev, a tím vykazuje inhibiční fenotyp vzhledem k funkci Rev nebo gen nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein.
2. Protein podle nároku 1, který nedisponuje podstatnou endogenní funkcí eIF-5A nebo gen nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein.
3. Protein podle nároku 1 nebo 2, kterým je protein elF5AM13, eIF-5AM14 nebo eIF-5AM13Á nebo gen nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein.
4. Prokaryotní nebo eukaryotní hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformována, nebo transfektována genem nebo sekvencí DNA nebo sekvencí cDNA podle nároku 1 nebo 2, a to takovým způsobem, který hostitelské buňce umožňuje expresi tohoto genu nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA.
5. Biologicky funkční plasmid nebo virový vektor DNA, vyznačující se tím, že obsahuje gen nebo sekvenci DNA nebo sekvenci cDNA podle nároku 1 nebo 2.
6. Pr o ka r yo t ní nebo eu karyotní hostite1s ká'ⁱ”bu-ňkav^:=^= - - · ~ · vyznačující se tím, že je stabilně transformována nebo transfektována biologicky funkčním plasmidem nebo virovým vektorem DNA obsahujícím gen nebo sekvenci DNA nebo sekvenci cDNA podle nároku 1 nebo 2.
7. Způsob přípravy genu nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje izolaci odpovídájícího nativního genu z příslušného expresního systému, inzerci tohoto genu do příslušného klonovacího systému, provedení požadované genetické mutace a získání výsledného mutantu z klonů obsahujících požadovanou mutaci.
8. Způsob produkce proteinu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci prokaryotních nebo eukaryotních buněk transformovaných nebo transfektovaných genem nebo sekvencí DNA nebo sekvencí cDNA podle nároku 1 nebo 2 za vhodných živných podmínek, a to tak, že hostitelské buňce je umožněna exprese proteinu a popřípadě také izolace požadovaného polypeptidického produktu exprese.
9. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 1 nebo 2 spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem, s pomocnou látkou nebo s ředidlem nebo ve formě buněk odebraných z pacientova těla a zpracovaných in vitro před jejich navrácením do těla.
10. Použití proteinu podle nároku 1 nebo 2 nebo genu nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein při léčbě onemocnění způsobených retroviry, jejichž funkce Rev závisí na eIF-5A.
11. Použ it í proteinu podle nároku 1 nebo 2 nebo genu - nebo. . .

sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein při léčbě onemocnění způsobených HIV, HTLV-I nebo/a HTLV-II.
12. Protein podle nároku 1 nebo 2 nebo gen nebo sekvence DNA nebo sekvence cDNA kódující tento protein pro použití jako léčivo.

99 9999 • · ·

9 999 9 9 «99 9
13.

pro

Rev

Použití proteinu podle nároku 1 nebo 2 k přípravě léčiva léčbu onemocnění způsobených retroviry, jejichž funkce