CZ258097A3 - Psychrofilní proteáza a psychrofilní bakterie - Google Patents
Psychrofilní proteáza a psychrofilní bakterie Download PDFInfo
- Publication number
- CZ258097A3 CZ258097A3 CZ972580A CZ258097A CZ258097A3 CZ 258097 A3 CZ258097 A3 CZ 258097A3 CZ 972580 A CZ972580 A CZ 972580A CZ 258097 A CZ258097 A CZ 258097A CZ 258097 A3 CZ258097 A3 CZ 258097A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protease
- enzyme
- psychrophilic
- activity
- temperature
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 106
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 104
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 103
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 103
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 84
- 241000589585 Chryseobacterium balustinum Species 0.000 claims description 22
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 21
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 21
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 9
- 108010049190 N,N-dimethylcasein Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 4
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 92
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 27
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 11
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 5
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 4
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108010085889 azoalbumin Proteins 0.000 description 3
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- -1 malt oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTSFKYMMVSEWPP-BVFKYQGHSA-N (2r,3r,4r,5r)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O LTSFKYMMVSEWPP-BVFKYQGHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000983556 Flavobacterium xanthum Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241001406782 Rhamnosa Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N amygdalin Natural products OCC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC(C#N)c3ccccc3 YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- BECVLEVEVXAFSH-UHFFFAOYSA-K manganese(3+);phosphate Chemical class [Mn+3].[O-]P([O-])([O-])=O BECVLEVEVXAFSH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006959 non-competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000010254 physiological adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006967 uncompetitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000001052 yellow pigment Substances 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
Psychrofilní proteasa a psychrofilní bakterie
Oblast techniky
Vynález se týká proteasy, která má vysokou aktivitu v rozsahu nízkých teplot, jejího použití a psychrofilní bakterie, která proteasu produkuje.
Dosavadní stav techniky
Psychrofilní bakterie jsou známy dlouhou dobu a jejich existence v podmínkách nízkých teplot byla potvrzena v řadě případů. Psychrofilní bakterie lze izolovat z různých prostředí vyznačujících se nízkými teplotami, například z půdy, rybných produktů nebo mléčných výrobků, stejně jako z arteficielního prostředí vyznačujícího se nízkými teplotami. Existují studie o psychrofilních bakteriích v potravinářské mikrobiologii, ale tyto studie se v podstatě týkají fylogenetiky mikroorganismů.
Existuje předpoklad, že enzymy získávané z psychrofilních bakterií budou rovněž psychrofilní, tedy, že jejich optimální teplota se bude nalézat v rozsahu nízkých teplot. Obecně platí. že psychrofilní enzym, který účinkuje efektivně při nízkých teplotách, lze přidat například do detergentu, který pak lze používat ve vodě při nízké teplotě. Lze se rovněž domnívat, že takový enzym lze použít v chemické reakci v přítomnosti organického rozpouštědla, které je těkavé při teplotě místnosti, i pro zlepšení kvality potravin při teplotě, kdy nedojde ke zkažení potravin. Studium enzymů
·. . · ·· ·· ···· • · · .... · · ·
... ······ z , ···· · · » · · ··· · • · · · · · · ···· · ··· ·· ·· · pocházejících z psychrofilních bakterií je velmi zajímavé i z hlediska fyziologické funkce a adaptačních mechanismů týkajících se nízkých teplot u psychrofilních bakterií.
Souhrn
Byl nalezen nový bakteriální kmen, který produkuje novou psychrofilni proteasu.
V souladu s tím, je předmětem tohoto vynálezu nová psychrofilní proteasa.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je nový mikroorganismus, ] který tuto psychrofilní proteasu produkuje. (
Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy této f $
psychrofilní proteasy pomocí uvedeného nového mikroorganismu. ,
Psychrofilni proteasa podle tohoto vynálezu má I následujícíc fyzikálně-chemické vlastnosti.
- Specifická aktivita a substrátová specificita: proteasa rozkládá kasein a dimethylkasein, avšak nepůsobí na ribonukleasu.
Optimální teplota: optimální teplota tohoto enzymu je přibližně 40 °C.
- Teplotní stabilita: za podmínek skladování při pH 7 po dobu 1 hodiny při 30 °C proteasa není prakticky inaktivována, avšak při 40 °C ztrácí přibližně 40 % své aktivity, a při 50 °C je rychle inaktivována, takže aktivita enzymu se úplně ztrácí během 15 minut.
Podle provedení vynálezu, kterému je dávána přednost, má tato proteasa rovněž následující fyzikálně-chemické vlastnosti:
·· ···· • ···· · • · • · · · ·
- Optimální pH: proteasa optimálně působí při pH 7,5;
- Stabilita enzymu z hlediska pH: proteasa je stabilní v rozsahu pH 6,0 až 10,0 v podmínkách skladování při 20 °C po dobu 1 hodiny;
- Molekulová hmotnost: přibližně 38 kDa (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti sodium dodecylsulfátu a metody gelové filtrace);
- Izoelektrický bod: přibližně 4,5.
Nový mikroorganismus podle tohoto vynálezu je Flavobacterium balustinum, které má schopnost produkovat psychrofilní proteasu, jak je popsáno výše.
Způsob přípravy psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu zahrnuje kultivaci mikroorganismu Flavobacterium balustinum a získání psychrofilní proteasy z mikrobiální kultury.
Krátký popis zobrazení
Obr. 1 znázorňuje výsledek Příkladu 2, který ukazuje vztah mezi teplotou a aktivitou proteas kmene P104 a proteasy Subtilysin Carlsberg.
Obr. 2 znázorňuje výsledek Příkladu 4 (2), který ukazuje vliv počátečního pH na aktivitu extracelulární proteasy a růst
Flavobacterium balustinum P104.
Obr. 3 znázorňuje výsledek Příkladu 4 (3), který ukazuje vliv kultivačních teplot na aktivitu extracelulární proteasy a růst Flavobacterium balustinum P104. Obr. 3 (A), (B) a (C) znázorňují výsledky získané při teplotách 10, 20 a 30 °C.
Obr. 4 znázorňuje výsledek eluce při gelové filtraci v Příkladu 5 (2) (c).
• ·
Obr. 5 znázorňuje výsledek chromatografické eluce v Příkladu 5 (2) (c).
Obr. 6 znázorňuje výsledek elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti sodium dodecylsulfátu pro zjištění molekulové hmotnosti v Příkladu 6.
Obr. 7 znázorňuje kalibrační křivku pro zjištěni molekulové hmotnosti v Příkladu 4.
Obr. 8 znázorňuje kalibrační křivku pro gelovou filtraci pro zjištění molekulové hmotnosti v Příkladu 6.
Obr. 9 znázorňuje výsledek izoelektrieké fokusace v Příkladu 7. {
Obr. 10 znázorňuje kalibrační křivku izoelektrieké J fokusace v Příkladu 7. |
Obr. 11 znázorňuje výsledek Příkladu 8, který ukazuje vliv , pH na enzymovou reakci prováděnou enzymem podle tohoto I vynálezu.
Obr. 12 znázorňuje výsledek Příkladu 9, který ukazuje stabilitu enzymu v závislosti na pH podle tohoto vynálezu.
Obr. 13 znázorňuje výsledek Příkladu 10, který ukazuje vliv teploty na enzymovou reakci prováděnou enzymem podle tohoto vynálezu.
Obr. 14 znázorňuje výsledek Příkladu 11, který ukazuje teplotní stabilitu enzymu podle tohoto vynálezu.
Obr. 15 znázorňuje výsledek Příkladu 13, který ukazuje vliv proteinového modifikátoru sodium dodecylsulfátu na enzym podle tohoto vynálezu.
Obr. 16 znázorňuje výsledek Příkladu 13, který ukazuje vliv proteinového modifikátoru močoviny na enzym podle tohoto vynálezu.
• · · · • · • ·
Obr. 17 představuje Lineweaver-Burkovo vynesení týkající se enzymu podle tohoto vynálezu zjišťované v Příkladu 16. Obr. 17 (A) ukazuje změnu hodnoty 1/v v rozsahu 0 až 2,0, obr. 17 (B) v rozsahu 0 až 0,2.
Podstata vynálezu
Bakterie produkující novou proteasu
Nová proteasa podle tohoto vynálezu je produkována mikroorganismy, které náleží k rodu Flavobacterium a mají schopnost produkovat proteasu, která má výše popsané vlastnosti.
Specifický příklad mikroorganismů, které mají schopnost produkovat proteasu podle tohoto vynálezu, výhodně zahrnuje Flavobacterium balustinum P104. Tento kmen je mikroorganismem izolovaným z vnitřností lososa a byl uložen v National Institute of Bioscience and Human-Techno1ogy, Ageney of Industrial Science and Technology pod číslem FERM BP-5006 dne
17. února 1995.
Bakteriologické vlastnosti Flavobacterium balustinum P104 podle tohoto vynálezu jsou vyjmenovány dále.
(1) Morfologické vlastnosti
Kmen má podobu krátkých bacilů o velikosti 0,4 až 0,5 x 1,7 až 1,9 mikrometrů.
(2) Povaha kultivačního media
Kmen rostl na agarovém mediu a produkoval žlutý pigment.
(3) Optimální podmínky růstu pH: kmen rostl v rozmezí pH hodnot 5 až 9, a optimální pH růstu bylo přibližně neutrální.
Teplota: kmen rostl v rozmezí teplot 10 až 30 °C, a optimální růstová teplota byla přibližně 20 C.
(4) Příslušnost k aerobním a anaerobním bakteriím: aerob.
(5) Příslušnost podle Gramova barvení: Gram negativní.
(6) Biochemické vlastnosti
Hlavní biochemické vlastnosti mikroorganismu
Flavobacterium balustinum P104 jsou uvedeny v Tab. 1.
Tabulka 1
| Testované vlastnosti | Výsledek |
| Galaktosidasa | - |
| Arginindihydrolasa | - |
| Lysindekarboxylasa | — |
| Ornitindekarboxylasa | - |
| Využití kyseliny citrónové | - |
| Produkce H^S | - |
| Ureasa | + |
| Trypto fanaminasa | - |
| Produkce indolů | + |
| Želatinasa | + |
| Glukosa | - |
| Ď-manitol | - |
| Inositol | - |
| D-sorbitol | - |
| Rhamnosa | - |
| Sacharosa | - |
| D-melibiosa | - |
| D-amygdalin | - |
| L-arbinol | - |
| Oxidasa |
Ačkoli se kmen jevil podle těchto vlastností jako Flavobacterium indolgenes, byl klasifikován jako Flavobacterium balustinum na základě porovnání sekvence DNA kódující 16S ribosomální RNA se sekvencí baží známého mikroorganismu, jak je popsáno v Příkladu 3.
Kultivační medium používané pro kultivaci mikroorganismu je buď tekuté nebo pevné, ale obecně je používána třepaná kultura nebo aerovaná kultura obsahující tekuté medium.
Lze použít libovolné kultivační medium pro kultivaci • · • · · · mikroorganismu, které je vhodné z hlediska růstu a produkce proteasy. Specificky příklady zdrojů uhlíku zahrnují glukosu, trehalosu, fruktosu, maltosu, sacharosu, škrob a oligosacharidy ze sladu. Příklady zdroje dusíku zahrnují kvasničný extrakt, sojovou moučku, moučku z bavlníkových semen, corn steep, různé aminokyseliny a jejich soli, a nitráty. Lze rovněž použít syntetická media nebo přírodní media obsahující vhodné anorganické soli jako fosfáty hořčíku, vápníku, sodíku, draslíku, železa a manganu, a jiné živiny podle potřeby.
Kultivační podmínky jako jsou pH a teplota lze určit v rozsahu produkce proteasy, třepaná kultura na tekutém mediu nebo aerovaná třepaná kultura se výhodně provádějí při neutrální hodnotě pH a teplotě okolo 20 °G.
Proteasa podle tohoto vynálezu je produkována v buněčné stěně bakteriální buňky, uvnitř buňky a v supernatantu kultury a je tudíž ve formě bakteriální stěny, hrubého enzymu získaného z bakteriální buňky, nebo supernatantu kultury na tekutém mediu, nebo ve formě extrahovaného a purifikovaňého enzymu. Enzym též může být v podobě proteasy imobilizované na substrátu pomocí známé metody.
Izolace enzymu
Pro izolaci a purifikaci enzymu podle tohoto vynálezu z kultury na tekutém mediu lze použít dobře známé metody a to buď jednotlivě nebo v kombinaci.
Proteasa podle tohoto vynálezu je převážně vylučována extracelulárně, zvláště v kulturách na tekutém mediu, proto
lze bakteriální buňky snadno odstranit například fitrací nebo centrifugací a získat tak hrubý roztok enzymu. Hrubý roztok enzymu lze dále purifikovat známými metodami. Tyto metody zahrnuji přednostně vysolování s použitím soli jako je amonium sulfát, precipitační metodu s organickými rozpouštědly jako jsou metanol, etanol, nebo aceton, adsorpční metodu se surovým škrobem, ultrafiltrační metodu, a různé chromatografické metody jako je gelová filtrační chromatografie nebo iontoměničová chromatografie. Typické příklady přednostně užívaných metod jsou uvedeny v Příkladech v dalším textu.
Vlastnosti proteasy
Byly zkoumány vlastnosti proteasy podle tohoto vynálezu a výsledky jsou uvedeny dále.
(1) Aktivita a substrátová specificita
Tento enzym dobře štěpí makromolekulám! proteiny jako kasein či dimetylkasein nebo denaturované proteiny. Rovněž štěpí gelatin, což je denaturovaný protein kolagenu v rozsahu asi 50% ve srovnání s kaseinem. Málo působí na ostatní přirozené proteiny a vůbec nepůsobí na ribonukleasu.
Průmyslově používané proteasy jako subtilisin nemají substrátovou specifitu a působí na většinu proteinů. Naopak, enzym podle tohoto vynálezu působí jen na makromolekulární proteiny nebo na denaturované proteiny, do kterých se poměrně snadno dostává.
Proteasa, která je obdobou enzymu podle tohoto vynálezu a je získána z psychrofilní bakterie Pseudomonas fluorescens, dobře štěpí makromolekulární proteiny jako kasein nebo • · · · · · dimetylkasein nebo denaturované proteiny. Avšak tato proteasa, která se liší od enzymu tohoto vynálezu, rovněž štěpí přirozené globulární proteiny jako hemoglobin a albumin hovězího séra v rozsahu asi 40 % ve srovnání s dimetylkaseinem. Proto má enzym podle tohoto vynálezu pravděpodobně vyšší substrátovou specifitu než známé enzymy.
(2) Optimální teplota a teplotní stabilita
Enzym podle tohoto vynálezu působí při teplotě 40 °C.
Když je enzym uchováván při pH 7 po dobu 1 hodiny, je zřídka inaktivován při teplotě do 30 °C, ale při 40 °C ztrácí % své aktivity. Při teplotě 50 °C je rychle inaktivován, takže do 15 minut ztrácí veškerou aktivitu.
Enzym podle tohoto vynálezu je tedy psychrofilním enzymem, projevujícím účinnou katalytickou aktivitu při nízkých teplotách.
(3) Optimální pH a rozsah pH kdy je enzym stabilní
Enzym podle tohoto vynálezu má optimální pH 7,5.
Je stabilní v rozmezí pH 6,0 až 10,0 za podmínek uchovávání při 20 °C po dobu 1 hodiny.
Enzym je tedy neutrální proteasou, která nepůsobí v extrémně kyselém nebo zásaditém rozmezí hodnot pH. Enzym se inaktivuje při uchovávání v extrémně kyselém nebo zásaditém rozmezí hodnot pH.
(4) Molekulová hmotnost
Enzym podle tohoto vynálezu má molekulovou hmotnost 38 kDa, která byla měřena pomocí metod elektroforesy na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti sodium dodecylsulfátu a gelové filtrace.
(5) Izoelektrický bod • · · * • · · · 1 • · · · · · · • · · • « « • ···· · • · ··· · ·
Enzym podle tohoto vynálezu má izoelektrický bod 4,5, který byl měřen pomocí izoelektrické fokusace.
(6) Inhibice aktivity
Proteasová aktivita enzymu není inhibována fenylmetylsulfonylfluoridem nebo jodoacetamidem, ale je značně inhibována kyselinou ethylendiamintetraoctovou, 2,2-bipyridylem, kyselinou citrónovou nebo kyselinou šťavelovou. Proteasová aktivita tedy závisí na kovových iontech, proto je pravděpodobně enzym podle tohoto vynálezu metaloproteasou. Z inhibice proteasové aktivity kyselinou citrónovou a šťavelovou vyplývá závislost enzymové aktivity na iontech vápníku.
Navíc je enzymovoá aktivita značně inhibována kovovými ionty jako Ag‘, Cu2 ' , Zn2-1, Co24 a Fe2+, mezi nimi pak zvláště Ag''. Není však inhibována Mg2'ani Ca2 1/ (7) Enzymová reakční kinetika
Enzym podle tohoto vynálezu vykazuje typ reakční rychlosti Michaelis-Mentenové v závislosti na koncentraci substrátu jako je kaseih. Hodnoty K klesají a hodnoty V stoupají se m raax zvyšující se teplotou. Navíc, enzymu vykazuje pozoruhodně vysoké hodnoty v rozmezí od 10 do 40 °C. Enzymy bývají obecně inhibovány nadbytkem substrátu. Avšak v případě enzymu podle tohoto vynálezu Kcat hodnota stoupá, když se systém blíží optimální pracovní teplotě. Enzym je tedy výhodný v tom ohledu, že nepozorujeme znatelnou inhibici rozkladnými produkty. Z Lineweaver-Burkeho závislosti lze rovněž usuzovat, že inhibice způsobená teplotou má smíšenou formu, to znamená, že vliv teploty představuje nekompetitivní nebo akompetitivní inhibici a vliv rozkladných produktů inhibici kompetitivní.
• Φ φφφφ • φ φ φ φ · φ · φ φ <
• φ φ ··· φ • · · • φ · φ φ φ • ···· · • · φφφφ ·
Použití enzymu
Psychrofilní proteasa podle tohoto vynálezu má optimální teplotu v nízkém teplotním rozsahu. Tedy, pomocí psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu, lze štěpit proteiny při nízké teplotě. Například detergent, který lze použít i ve vodě při nízké teplotě, je připraven přidáním proteasy podle tohoto vynálezu do detergentního přípravku. S výjimkou zahrnutí psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu, lze tento detergentní přípravek připravit konvenčními metodami. Stručně řečeno, lze jej připravit kombinací proteasy podle tohoto vynálezu s obvyklou detergentní složkou jako je povrchově aktivní činidlo pro detergenty, bělidlo nebo plnidlo.
Enzymová reakce psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu probíhá při nízké teplotě. Tedy, i když reakční systém obsahuje organické rozpouštědlo, které je těkavé při teplotě místnosti, může reakce probíhat za nízké teploty, kdy se organické rozpouštědlo neodpařuje. Navíc, když zamýšlíme zlepšit kvalitu potravin použitím proteasy podle tohoto vynálezu, je výhodné užít tuto proteasu, protože reakce probíhá při nízké teplotě, při které jsou potraviny účinně chráněny před rozkladem.
Vzhledem k tomu, že proteasa podle tohoto vynálezu je dostupná, očekáváme pokrok v dalším studiu fyziologických mechanismů psychrofilních bakterií a jejich aplikačních mechanismů při nízkých teplotách
Tento vynález je popsán podrobněji dále v souvislosti se specifickými příklady, ale rozsah vynálezu jimi není • · • · • · · · • · ·· ······ • ······ · • · · · · ··· ····· · · · · ··· · • · · · · · • ····· ·· · omezen.
V této souvislosti byly proteiny kvantitativně stanoveny barvicí metodou Bio-Rad Protein Assay a proteinové frakce eluátu získané pomoci chromatografie byly měřeny s využitím absorpce ultrafialového záření při 280 nm, pokud není uvedeno jinak.
Kromě toho byla aktivita proteasy měřena následovně. : (a) Rozkladná aktivita proteinu měřená s azokaseinem
0,05 ml roztoku enzymu bylo přidáno k 0,3 ml 0,067 M fosfátového pufru, obsahujícího 1 % (W/V) azokaseinu (pH
7,0) a směs byla udržována při teplotě 30 °C po dobu 30 minut. |
Reakce byla ukončena přidáním 6% roztoku trichloroctové l kyseliny. Po 15 minutách byla reakční směs centrifugována při f i
000 ot./min při teplotě místnosti po dobu 5 minut. ,
Absorbance supernatantu byla měřena při 340 nm. Enzymová I aktivita byla definována na základě AGU (jednotka rozkladu azokaseinu = azocasein digestion unit), která představuje nárůst absorbance o 0,001 za minutu při 340 nm.
(b) Rozkladná aktivita proteinu stanovená modifikovanou Ansonovou metodou
0,05 ml roztoku enzymu bylo přidáno k 0,3 ml 0,067 M fosfátového pufru obsahujícího 1% (W/V) koncentraci proteinu (pH 7,0) a směs byla potom udržována při teplotě 30 °C po dobu 30 minut. Reakce byla ukončena přidáním 7,5 % roztoku trichloroctové kyseliny. Po 30 minutách byla reakční směs centrifugována při 14 000 ot./min při teplotě místnosti po dobu 5 minut. Absorbance supernatantu byla změřena při 280 nm.
Enzymová aktivita byla definována na základě AU (modifikovaná Ansonova jednotka = modified Anson unit), která představuje
- o · · · «···· iJ · ···· · · · · · ··· · • · · · · · · • · · · · ··· ·· · · · produkci tyrosinu v množství 1 mol za minutu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (1) Vyhledávání nových bakteriálních kmenů
Izolace nového bakteriálního kmene byla provedena na agarovém mediu. Izolovaný vzorek vnitřních orgánů lososa byl resuspendován ve fyziologickém roztoku a supernatant byl použit jako zásobní roztok, ze kterého byl připraven 100 krát ředěný roztok. Objemy 0,2 ml zásobního roztoku a 100 krát ředěného roztoku byly nastříkány na agarové medium pro vyhledávání kmenů (polypepton 3 g/1, kvasničný extrakt 10 g/1, Na kasein 10 g/1, MgSO^.7 H20 0,2 g/1, agar 2,0 g/1; Petriho misky o průměru 9 cm) a agarové plotny byly kultivovány při teplotě 10 °C po 3 dny. Z kolonií vyrostlých na agaru byly vybrány dobře rostoucí izoláty pro subkultivaci a inokulaci na agarových plotnách pro vytvoření zásobních kultur.
Aktivita exoenzymu byla stanovena na agarovém mediu. Izolovaný bakteriální kmen byl inokulován v pruzích na agarové medium pro vyhledávání, jak bylo popsáno výše, a kultivován při 10 ”C po 3 dny. Na agarovou plotnu, na které rostly bakterie, byla následně nastříkána 10% kyselina trichloroctová a bakterie produkující proteasu byly detekovány vytvořením jasných skvrn.
(2) Kultivace izolovaného bakteriálního kmene a produkce enzymu • · · • · • · • · · · · ·
Izolované bakterie ze zásobního media byly inokulovány do 25 ml prekultivačního media (polypepton 10 g/1, endoextrakt 10 g/1, MgSO^.7 H^O 0,2 g/1, pH 7,0 ve 100 ml Ěrlenmeyerově baňce) a kultivovány na rotačním třepačce při 10 °C a 150 ot./min po dobu 48 hodin v TAITECNR-80, aby se stabilizovala růstová aktivita bakterií. Obvykle bylo inokulováno 0,25 ml prekultivačního roztoku do 25 ml media pro produkci enzymů (polypepton 5 g/1, kvasničny extrakt 2,5 g/1. Na kasein 5 g/1, MgSO4.7 Ha0 0,2 g/1, pH 7,0 ve 100 ml Ěrlenmeyerově baňce) a kultivovány na rotační třepačce při 10 °C a 150 ot./min po dobu 72 hodin. Kultivační medium bylo předtím sterilizováno párou při 121 °C (1,2 kgf/cm2) po dobu 15 minut.
Izolovaný bakteriální kmen byl uchováván na agarovém mediu pro uchovávání bakterií při 10 ”C a subkultivován po 2 týdnech až 1 měsíci.
(3) Měření proteasové aktivity
Kultivační roztok, získaný předchozím postupem (2), byl zcentrifugován (17 000 x g, 4 °C, 15 minut). Supernatant byl použit jako hrubý enzymový roztok. Proteasová aktivita byla měřena rozkladem azokaseinu. 0,05 ml hrubého enzymového roztoku bylo přidáno k 0,3 ml 0,067 M fosfátového roztoku, obsahujícího 1% (W/V) azokaseinu (pH 7,0) a směs byla inkubována při 20 °C po dobu 30 minut. Reakce byla potom ukončena 6% roztokem kyseliny trichloroctové a po 15 minutách byla reakční směs centrifugována při 14 000 ot./min a teplotě místnosti po dobu 5 minut. Absorbance šupernatantu byla změřena při 340 nm pomocí spektrofotometru (Beckman DU640). Enzymová aktivita byla stanovena na základě ACU (jednotka rozkladu azokaseinu = azokasein digestion unit), která *
• · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · φ • · · φ ·
Φ·· · · φφ φ představuje nárůst absorbance ο 0,001 za minutu při 340 nm.
Výsledkem kroků (1) až (3) byla izolace bakteriálního kmene P104 s proteasovou aktivitou. Bakteriální kmen vykazoval proteasovou aktivitu, která je ukázána v následující tabulce.
V tabulce uvedená rychlost růstu kmene byla získána porovnáním s růstem kmene Cytophaga xantha IFO 14972.
Tabulka 2
Bakteriální kmen s proteasovou aktivitou
| Kmen | Růstová rychlost | Proteasová aktivita (x 103 ACU/ml) |
| P104 | +++ | 0,982 |
Příklad 2
Proteasová aktivita u P104
Vliv teploty na enzymovou aktivitu byl zkoumán u kultivačního roztoku získaného kultivací kmene P104 produkujícího proteasu v teplotním rozmezí od 0 do 60 ”C. Teplotní závislost enzymové aktivity byla stejným způsobem zkoumána u Subtilisinu Carlsberg (Sigma), což je komerčně dostupná enzymová proteasa pocházející z Bacillus licheniformis.
Výsledek je ukázán na obr. 1, na kterém je specifická aktivita kmene P104 znázorněna čtverečky a specifická aktivita Subtilisinu Carlsberg trojúhelníčky.
Optimální teploty byly 40 C pro ěxoproteasu kmene P104 a 60 °C nebo více pro Subtilisin Carlsberg. Exoproteasa kmene P104 si zachovala při teplotě 20 °C a při optimální teplotě 40 a více procent proteasové aktivity. Proteasa Subtilisin
Carlsberg si zachovala jen asi 10% proteasové aktivity při optimální teplotě.
V rozmezí od 10 do 40 °C byla pro tyto exoproteasy vypočtena aktivační energie enzymové reakce. Výsledky ukazuje následující tabulka.
Tabulka 3
| Bakteriální buňka | Aktivační energie (kJ/mol) |
| P104 | 39,8 |
| Bacillus subtilis | 58,3 |
Příklad 3
Identifikace kmene P104 na základě sekvence baží v DNA pro 16S ribosomální RNA.
Vzorek kultivačního roztoku získaný podle Příkladu 2 byl odebrán do 1,5 ml mikrozkumavky a bakterie byly odděleny centrifugací. Genomová DNA byla extrahována s cílem amplifikovat DNA sekvencí baží kódující 16S RNA pomocí PCR (polymerasová řetězová reakce). Sekvence baží byla potom určena za použití Sangerovy metody a porovnána s databazí Genové banky (Genbank) pro identifikaci. Seznam použitých primerů je uveden dále, jako PCR bylo použito ÍF-Link a 5R-Link.
Primery:
1F-Link i 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTTGATCATGGCTCAG-3';
3R-Link: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGTCAATTCATTTGAGTT-3';
3F-Link: 5'-TGTTAAAACGACGGCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA-3';
5R-Link: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA-3'.
• ·
Výsledky srovnání s databazí Genové banky jsou uvedeny v následujících tabulkách. V těchto tabulkách Query představuje gen pro 16S ribosomální RNA pocházející z kmene P104 a Subject představuje 16S ribosomální RNA z Flavobacterium balustinum (FVBRR16SH). Bakteriální kmen byl identifikován jako Flavobacterium balustinum. Kmen P104 je tedy dále označován jako Flavobacterium balustinum P104.
·· · · ·· ·· ···· η q ··· ······»
Ιο ··· ······ • ···· · · · · · «·· « • · · · · · · • ·· · · ··· ·· · · · (a) Použitý primer ÍF-Link
Identita = 185/204 (90 %), podobnost = 185/204 (90 %)
| Qucry:l | G A T G A ACG | CTA | GCGGGAGGC |
| Sbjci:31 | GATNA ACG | CTA | G C G G G A G G C |
| Qucry:21 | CTAAC ACA | T G C | AAG CCG AGC |
| Sbjct:51 | CTAACACA | T G C | A A G C C G AGC |
| Query:41 | GGTATTTG • « « « » | T C T a | TTCGGGACA ( a aaa |
| Sbjct:71 | GGTATAGA | T T C | T TCGGA ATC |
| Qucry:6i | GAGAG agc | G G A | G T A C G G G T G |
| Sbjct:91 | TAGAG AGC | G G C | GTACGGGTC |
| Query:Sl | CGGAACAC | GTG | TGCAACCTA |
| Sbjctl 11 | CGGAACAC | GTG | TGCAACCTA |
| Query:101 | CCTTTATC | AGG | GGGATAGCC |
| Sb jer131 | CCNTTATC | AGG | GGGATAGCC |
| Query:121 | TTTCG AAA | G G A | AGA T TA AT A |
| Sbjcrl51_ | T T T C G A A A | G G A | AGATTAATA |
| Query:I4i | CCCCATAA | T A T | ATTGATTGG |
| 5bjct:171 | CCCNATAA | T A T | ATTGACTGG |
| Query:l6l | CATCAGTT | ACT | ATTGACAAC a i a a a « a « |
| Sbjct:191 | CATCAGTC | GAT | ATTGAA aac |
| Query:181 | TCCGGTGG | A T A | GAGATGGTC |
| Sbjc::211 | TCCGGTGG | A T A | GAGATGGGC |
| Query:201 | A C G C « a < 1 | ||
| Sbjci:231 | A C G C |
• · • · · · · · • · ·· · • · · • · · • ···· · • · • · · · · • · · • · · • · · · • 9
9 (b) Použitý primer 3F-Link
Identita = 208/330 (63 %), podobnost = 208/330 (63 %)
Query:l G A T A
Sbjcr.695 G A T A
Query:21 T T G C « « I *
Sbjct:715 T T G C
Query:4l G Τ Ν T
I · »
Sbjci:735 G Τ Τ T
Qucry:61 C C G A • * 4
Sbjct:755 A C G A
Query:81 C A G G
TTACTTAG : : : ; : i : :
TTACTTAG G A G G G A N G « » I « t • * · · I
GAAGGCAG N A 'C C T G A T
AACACCAA
TAACTGAC
AAGTGNGN • · · S i
AAGCGTGG A T T A O T T N
AAC ACCAA Τ T C A C T A T :::::::
GTCACTAT GC N G A T G N * · 4-444
GCTGATGG
TGAGTGAA • t * «44
4*4 4 « 4
GG A G C G A A CCATGGTC
Sbjct:775
QucryrlOl
Sbjci:795
Query:121
C A G G
G N C C • 4 4
4 4
G T C C
T A T C
A Τ T A
A C O N ; i :
A C G C
T C G N
G A T A
C G Τ N
4 * • * «
C G T A
Τ Τ Ν T
C C C T
C A C N < *
A A C G
G G G A
G G T A A Τ Ν T
I *
A T G C
Τ T A N
Sbjct:815 T A
Query:!41 N A
5bjct;835 G G
Qucryrlól A G • I
Sbjci:843 a G
Qucry:181 N C
Sbjct:865 G G
Query:20l C G
Sbjct:885 G A
A C T C G T
G Τ N C A G * 4 14 4
4 «14
G Τ T C A G
Τ N G T A T < « 4
T G A T A A
G N G T C N * * 4
4 4
G A G T A C
A A Ν T C A : : : i :
A A C T C A
Τ Τ Τ T G G
C G A G T A : i : :
A G A C TA
G Ν N A G N i I » < 4 4
G Τ T A G C
G Τ T C G C
G C Τ Τ T A
A C A N A G
A G C G A A
C A C C N G » I « ·
4* 4
N A C C T G
A G G Τ Τ T
A A G A A T
T G G C G G « I «
I 4
Τ T G A C G • · ··· · «V • · · · • · ·· ·
Qucry:201 NTGGCCNNTACACNCTGTGN
II «·· < I··
I « 11« I «II
Sbjct:9O5 GGNNCCNG CACAAG.CGGTGG
Query:22l T T T A T A T N G T N T A A N G C G T T > I · I I I « « « « I I I lili « II III · » I
Sbjct:925 ATTATGTGGTTTAATTCGAT Query:24l NATNCNAGAGGGTCCTNACC : : : i : : j : j : : : :
Sbjci:94í OATACGCGAOOAACCTTACC Query:261 ANGNTTNNTTNGGGTCNTCC « · I 11« | • I t «II |
Sbjct:965 AAGGCTTAAATGGGAATTGA Qucry:281 CAOCCTTCGTCTNTACTTGT
I « I lil l i
I « «I» «I
Sbj’Ci:983 CAGGTTTAGAAATAGACTTT Query:3O1 GNTTCGGACA
SbjcclOOS TCTTCGGACA • · · • · · • · · • · · · · • · • ·· · · • ·· ·· ···· ······ · • · · · · · ·· · · ···· • · · · · ··· ·· ·· · (c) Použitý primer 3R-Link
Identita = 128/162 (79 %), podobnost = 128/162 (79 %)
| Query*162 | T T N T T G G G N A T A A N A G G G N C |1 « » » «« « « 1 « a . |
| Sbjct:552 Query:142 | tttattgggttta aagggtc CNTCNGCGGACCTGTAAATC |
| Sbjct:572 Query:122 | CGTAGGCGGATCTGTAAGTC ATTGGT GATATC T C A O A G GC |
| Sbjct:592 Query:102 | AGTGGT GAAATCTCAT AG CT tgtctatgggactaccattg |
| Sbjct:612 Qucry;82 | taactatgaaactgccattg atgctccaggtcatgagtct |
| Sbjct:632 Query:62 | atactgcaggtcttgagt AA agcaggagtggctggaataa |
| Sbjct:652 Query;42 | agtagaagtggctggaataa gtactgtaacg gtgtaatgc |
| 5bj«:672 Qucry:22 | gtagtgtagcggtgaaa TGC atagatattactcagaaccc |
| Sbjct:692 Qucry:2 | AT AGAT ATT ACT T AGAAC AC C A |
Sbjci:712 C A • · ··· · ·· · · «· • · · ······ · • · · ··· · · · • ····· · · φ · φφφ φ • · · · · · · ··· · · ·Φ · φ φ · · · (d) Použitý primer 5R-Link
Identita = 237/273 (86 %), podobnost
237/273 (86 %)
| Querý:273 | C C | G | G | T a | A a | C | N | C « | C 1 C | T | T a | G a | G G < a | C C a a | A a | c | A |
| Sbjct:l)93 | C C | C | T | T | a A | • c | G | c | a T | T | a G | G G | a a c c | A | c | a A | |
| Query:253 | C A | C | G | T | A | A | T | A | C | A | A | T | C N | C A | A | G | N |
| Sbjct:l213 | C A | C | G | T | A | A | T | A | C | A | A | T | G G | C C | A | G | T |
| Query:233 | A C • t | A a | G a | A | O | N | G | T | A | G | C | N | A C | C A | G | N | C |
| Sbjct:1233 | A C | A | G | A | G | G | G | C | A | • G | a c | T | A C | C A | G | G | C |
| Query:213 | G N | C | T | G | G | A | T | G | C | G | A | A | T C | T C | G | A | A |
| Sbjci:1233 | G A | C | T | G | G | A | T | G | C | G | A | A | T C | T C | G | A | A |
| Qoery:193 | A N 1 | C | τ 1 | G | C 1 | Ň | c | T | c | A | G | A | N C | G G | A | N | T |
| Sbjct:1273 | 1 A G | C | T | N | a G | N | c | T | c | A | G | T | T C | G G | A | τ | τ |
| Qucry:173 | G G 1 1 | A 1 | G a | T 1 | C « | T < | G a | c a | A 1 | A 1 | C a | T a | C G a a | A C 1 ! | τ 1 | e | T |
| Sbjct:J293 | G G | A | G | T | c | T | G | c | A | A | c | T | C G | A C | T | c | T |
| Query:133 | A T 1 1 | G I | A a | A 1 | A | c 1 | T | G a | G a | A a | T | N | C G | C T | A | G | T |
| Sbjci:1313 | A T | G | A | A | G | c | T | G | G | A | A | τ | C G | g τ | A | G | τ |
·· • · • · · • · · · • ·· · • · • · ·· · • · · · · · · • · · · • ·· ·· ·
| Query:133 | A | A | T c | G C | A T A | T c | A G | N C A T | G A T |
| Sbjct:1333 | A | A | T c | G C | A T A | T G | A G | C G A T | G A T |
| Que;y:ll3 | N | c I | G G | T G | A A N | A C | G T | T G C G | N G G |
| Sbjct:1333 | G | c | G G | T G | A A T | A C | G T | T C C C | N G G |
| Qucry:93 | C | c | T T | G N | A A A | C A | C C | G C C C | G T C |
| Sbjct:I373 | C | c | T T | G T | A C A | C A | C C | G C N C | G T C |
| Qoery:73 | A 1 | A < | C C | C A | T 0 G | A A | G T | T T G G | G G T |
| Sbjc«:l393 | A | A | G C | C A | T G G | A A | G T | T T c O | G G 7 |
| Query:53 | A | C | C T | G N | A G T | C G | G T | G A C C | OTA |
| Sbjci:1413 | A | c | C T | G A | A G T | G Q | G T | G A C C | OTA |
| Query;33 | A | c | N G | G A | C C T | N C | C T | A G G G | T A N |
Sbjct;I433 ACAGGAGCTGCCTAGGGTAA Query:l3 NACAAGTAACTAG
Sbjci:J433 AACAAGTAACTAG ·· ·· ···· • · · · · • · · · · • · * ··· « • 9 9 9
99 * ·· 9 9
9 9 99
9 9 · • ···· · · • · ·
9999 · ···
Příklad 4
Kultura Flavobacterium balustinum PÍO4 (1) Měření koncentrace bakteriálních buněk
Kultivační roztok, získaný podle Příkladu 2, byl naředěn fyziologickým roztokem tak, aby byla zajištěna hodnota 0 až 5 buněk připadajících na komůrku počítače bakterií (bacterial counter cell). Buňky byly počítány za pomoci optického mikroskopu. Aby se získala korelace mezi počtem buněk a turbiditou suspense buněk, byly turbidity jednotlivých ředění kultivačního roztoku měřeny spektroskopicky při 6.S0 nm. Vztah mezi turbiditou a koncentraci bakteriálních buněk Flavobacterium balustinum P104 popisuje následující rovnice:
(Buňky/ml) = 1,13 x 10® x Abs.660 nm, kde 1,13 x 10® je faktor získaný z kalibrační křivky.
(2) Vliv pH
Bakteriální kmen byl kultivován při různých počátečních hodnotách pH kultivačních medií pro produkci proteasy v rozmezí od 5 do 9 se záměrem prozkoumat vliv počátečního pH na exoproteasovou aktivitu a růst.
Výsledky jsou zobrazeny na obr. 2.
Při alkalickém pH byl růst bakterií signifikantně snížen a rovněž se snížila proteasová aktivita. Nesignifikantní rozdíly, ať už v bakteriálním růstu nebo v proteasové aktivitě, byly pozorovány při kyselém pH. Růst bakteriálního kmene byl nejvyšší a proteasová aktivita dosahovala nejvyšší úroveň při neutrálním pH.
(3) Vliv kultivační teploty
Flavobacterium balustinum PÍ04 bylo kultivováno při • · · · · · ··· ··♦··· · ΟΛ ··· ······ o · ···· · * · · » ··· * • · · · · · · ···· « ··· · · · · · různých teplotách v rozmezí od 10 do 30 °C s cílem prozkoumat fluktuaci exoproteasové aktivity a růst v průběhu kultivace.
Výsledky jsou zobrazeny na obr. 3.
Zatímco bakteriální kmen dobře rostl při teplotách 10 a 20 °C, celkový nárůst biomasy při 30 °C byl asi poloviční ve srovnání s ustáleným stavem na konci růstu při 10 a 20 ®c.
Nejvyšší rychlost růstu vykazoval kmen při 20 °e, takže optimální teplota pro kultivaci je pravděpodobně 20 °C.
Příklad 5
Purifikace proteasy Flavobacterium balustinum P104 (1) Kultivace bakteriálního kmene
Izolovaný bakteriální kmen, získaný z následujícího kultivačního media pro uchovávání bakterií, byl inokulován do 25 ml prekultivačního media (ve 100 ml Erlenmeyerově baňce) a kultivován na rotační třepačce při 150 ot./min v TAITEC NR-80 při 10 °C po dobu 48 hodin. Vlastni kultura byla připravena inokulací 0,25 ml prekultivačního roztoku do 25 ml vlastního kultivačního media ve 100 ml Erlenmeyerově baňce a kultivována na rotační třepačce při 150 ot./min a 10 °C po dobu 72 hodin.
Zásobní medium:
polypepton 3 g/1 enzymový extrakt 2,5 g/1
Na kasein 20 g/1
MgSO^.7HaO 0,2 g/1 agar 20 g/1 pH 7,0 • · • · · · · • · · · · ·
Překultivační medium:
polypepton enzymový extrakt
Na kasein
MgSO .7H O 3 4 2 g/1
2,5 g/1 i g/i 0,2 g/1 pH 7,0
Kultivační medium:
| polypepton | 3 g/i |
| enzymový extrakt | 2,5 g/1 |
| Na kasein | 5 g/1 |
| KH PO .7H 0 2 4 2 | 3 g/1 |
| MgSO .7H 0 4 2 | 0,2 g/1 |
pH 7,0
Kultivační media byla sterilizována párou Za vysokého tlaku v autoklávu při 120 °C (1,2 kgf/cm2) po dobu 15 minut.
Flavobacterium balustinum P104 bylo uchováváno na agarových zásobních plotnách při 10 °C. Kmen byl subkultivován po 2 týdnech až 1 měsíci.
(2) Purifikace proteasy (a) Vysolování síranem amonným
Kultivační roztok, získaný v předchozím kroku (1), byl zeentrifugován (17 000 x g, 4 °C, 15 minut). Supernatant byl použit jako hrubý enzymový roztok. K hrubému enzymovému roztoku byl přidáván síran amonný tak, aby roztok obsahoval finální koncentraci síranu amonného rovnou 50 % jeho saturační koncentrace. Po pomalém míchání po dobu 1 hodiny, byl roztok zeentrifugován (17 000 x g, 4 °C, 15 minut) a byla získána • · 4
Q <r ··· · · · ·
J ··········· • · · · · ···· · ····· · příslušná saturační frakce (O až 50 %). Množství přidaného síranu amonného bylo počítáno na saturační koncentraci při 25 °C.
(b) Gelová filtrace
Gelová filtrace byla prováděna na preparační koloně HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade. Všechny operace sloupcové chromatografie byly prováděny při 4 C s použitím systému HiLoad System 50 (Farmacia Biotec Co.).
Kolona HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade byla ekvilibrována průtokem 20 mM Bis-Tris pufru (pH 6,0) při lineární rychlosti 60 cm/hodinu (poměr k objemu gelu byl nejméně 3, tj. 400 ml).
ml vzorek enzymového roztoku po vysolování síranem amonným byl nanesen na kolonu vybavenou zařízením Superloop. Kolona byla eluována 20 mM Bis-Tris pufrem (pH 6,0) lineární rychlostí 60 cm/hodinu a byly odebírány 5 ml frakce.
Eluční křivka je zobrazena na obr. 4.
Transparentní žlutý protein o vysoké molekulové hmotnost obsažený v kultivačním roztoku byl eluován jako vylučovací mez. Následující eluovaná frakce obsahovala bezbarvý transparentní protein vykazující UV absorpci při 280 nm. Fragment připojený k protease byl pravděpodobně odstraněn v důsledku přítomnosti proteasové aktivity v této frakci.
(c) Sloupcová chromatografie
Chromatografie na iontoměniči byla prováděna na koloně Sepharose Q HP. Jako chromatografický sloupec byla použita kolona 0,7 x 12,5 cm, vyrobená z pěti HiTrapQ (lml) kolon zapojených v sérii. Kolona byla ekvilibrována průtokem 20 mM Bis-Tris pufru (pH 6,0) lineární rychlostí 35 cm/hodinu (poměr • · • · · · · · • · k objemu gelu byl nejméně 5, t j. 25 ml).
Vzorek enzymového roztoku frakce eluované při gelové filtraci, která měla proteasovou aktivitu, byl nanesen na kolonu vybavenou Superloopem lineární rychlostí 17,5 cm/hodinu. Kolona byla poté přomývána 80 ml 20 mM Bis-Tris pufru obsahujícího lineární gradient 0 až 150 mM NaCl lineární rychlostí 35 cm/hodinu a byly sbírány frakce o objemu 2 ml. Lineární gradient NaCl byl připraven přidáváním 1 M NaCl do uvedeného pufru, aby byla zvýšena jeho iontová síla.
Elučni křivka je zobrazena na obr. 5.
Kromě toho je výše popsaný způsob purifikace shrnut v následující tabulce.
Tabulka 4
Shrnutí purifikace proteasy
| Množství (ml) | Protein Enzymová Spec. Účinnost aktivita aktiv, purifikací | Stupeň ϊ purifikace (x) | ||||
| (mg) | (xlO3 ACÚ) A | (XlO3 CU.mg-1; | (%) ) | |||
| Kultiv. materiál | 270 | 13,0 | 365 | 28,1 | 100 | 1 |
| Vysolení (NH j SO | 5 | 3,38 | 273 | 80,8 | 74,8 | 2,9 |
| Gelová filtrace | 25 | 0,752 | 77,7 | 103 | 21,3 | 3,7 |
| Chromatografie na iontoměniči | 18 | 0,154 | 29,3 | 190 | 8,03 | 6,8 |
Příklad 6
Stanovení čistoty a molekulové hmotnosti proteasy (1) Elektoforéza (a) Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti sodium
9 9999
9 99 999 9
9 9 · 9
9 9 9 9 9 9 dodecylsulfátu (SDS-PAGE)
Byl použit 10 % polyaktylamidový gel tloušťky 1 mm.
Elektroforéza byla prováděna s použitím elektrického proudu o hodnotě 20 mA až do doby, kdy bromfenolová modř (BPB) dosáhla spodní hranice gelu. Gelová plotna byla barvena vodným roztokem obsahujícím 30 % metanol, 10 % kyselinu octovou a 0,02 % Coomasie Briliant Blue R250 po dobu 1 hodiny a poté přes noc odbarvována odbarvovačem (30 % metanol a 10 % kyselina octová).
Molekulová hmotnost proteasy byla stanovena pomocí SDS-PAGE za použití fosforylasy, albuminu, ovalbuminu, karboanhydrasy, trypsinového inhibitoru a alfa-laktalbuminu jako markérů.
Výsledky a kalibrační křivka SDS-PAGE jsou uvedny na obr.
a 7. Enzym vykazoval jedno maximum (band) a lze jej proto pokládat za jednoduchý protein nemající subjednotkovou strukturu.
(b) Gelová filtrace
Molekulová hmotnost byla stanovena gelovou filtrační metodou pomocí kolony Hiprep 16/60 Sephacryl S-100 HR. Kolona byla ekvilibrována průtokem 50 mM fosfátového pufru obsahujícího 0,15 M NaCl (pH 7,0) při lineární rychlosti 30 cm/hodinu (poměr k objemu gelu byl nejméně 3, tj. 400 ml). 1 ml vzorek enzymového roztoku byl nanesen na kolonu a eluován stejným pufrem lineární rychlostí 30 cm/hodinu a byly sbírány frakce o objemu 2 ml. Volný objem byl stanoven pro Blue Dextran 2000 s albuminem (67 kDa), ovalbuminem (43 kDa), chymotrypsinogenem A (25 kDa) a ribonukleasou A (13,7 kDa) jako proteinovými standardy.
QQ ··· ······
ZO ······ ········ • · · · · · · ···· · ··· · · · · ·
Výsledky jsou ukázány na obr. 8. Kromě toho byly spolu korelovány hodnoty UV absorpce proteinu při 280 nm a enzymová aktivita. Absorpční křivka proteinu v UV oblasti spektra vykazovala maximální absorpci při 278 nm a žádnou absorpci v oblasti viditelného světla. Na základě těchto pozorování lze považovat protein za dostatečně čistý pro zkoumáni jeho vlastností. ?
Příklad 7
Izoelektrická fokusace i
Izoelektrická fokusace byla prováděna pomocí Phast systému j (Farmacia-Biotec Co.). Byl použit gel IEF3-9 a vzorek byl nanesen na gel v místě vzdáleném 3 cm od anody. Elektroforéza byla prováděna za následujících podmínek: 2 000 V, 2,5 mA, 15 eC, 410 Vh. Gelová plotna byla fixována ve 20 % roztoku TCA při 20 C po dobu 5 minut a poté omývána oplachovacím a odbarvovačím roztokem (30% metanol a 10% kyselina octová) po dobu 2 minut. Plotna byla nakonec opláchnuta a obarvena roztokem obsahujícím 0,02 % Coomasie Brilliant Blue R250 (50 °C, 10 minut). Jako pí markér byl použit Broad pí Calibration kit (Farmacia-Biotec Co.).
Výsledky a kalibrační křivka izoelektrické fokusace jsou zobrazeny na obr. 9 a 10.
Enzym se barvil jako jednotlivý pruh (band) s izoelektrickým bodem při pH 4,5.
Příklad 8
Vliv pH na enzymovou reakci
Azokasein byl štěpen enzymem při různých hodnotách pH.
Pufrující roztoky v reakční směsi měly koncentraci 67 mM a obsahovaly acetátový pufr (pH 4-5,5), KH^PO^-Na^PO^ (pH 6,0-8,0), Na2B4Ov-HCl (pH 8,0-9,0), Na^B^-NaOH (pH
9,5-10,0) a Na^HPO^-NaOH (pH 10,5-12,0).
Výsledky jsou ukázány na obr. 11.
Relativní aktivita enzymu při pH 7,5 jako optimálním pH se udržela na hodnotě 80 % v rozmezí pH 6,0 až 10,0. Enzym tedy funguje v poměrně širokém rozmezí okolo hodnoty neutrálního pH. Enzym však nefungoval uspokojivě při hodnotách pH 5,5 a nižších nebo při hodnotách pH 10,0 a vyšších, a při pH 12 byl inaktivován a ztrácel proteasovou aktivitu.
Příklad 9
Stabilita proteasy v závislosti na pH
Enzym byl zkoumán v pufrech o různém pH pomocí Econo-Pac (Biorad Co.). Pufrující roztoky měly koncentraci 67 mM a obsahovaly acetátový pufr (pH 4-5), KH^PO^-Na^HPO^ (pH 6-8), glycin-NaOH (pH 9-10) a Na^HPO^-NaOH (pH 11-12). Po výměně pufru byl enzym inkubován při 20 C po dobu 1 hodiny, aby bylo možno vyhodnotit zbytkovou proteasovou aktivitu.
Výsledky jsou ukázaný na obr. 12.
Bylo zjištěno, že enzym je stabilní v rozmezí pH 6,0 až 10,0 při teplotě 20 °C po dobu 1 hodiny, ale při zachování stejných podmínek je inaktivován při pH 4,0 a 12,0.
• · ·· ····
9 • 9 9 9 • 99 9 9 9
Příklad 10
Vliv teploty na enzymovou reakci
Azokasein byl štěpen enzymem při různých pH v teplotním rozmezí od 0 do 70 °C .
Podobná reakce byla prováděna s komerčně dostupnými enzymy jako jsou Subtilisin Carlsberg, V8 proteasa (izolovaná ze Staphylococcus aurcub V8), Sabinasa (Novonordisc), a Alkalasa (Novonordisc).
Výsledky znázorňující za předpokladu, že substrát byl přítomen v nadbytku a veškerý enzym byl přítomen ve formě komplexu enzym-substrát, jsou uvedeny na obr. 13, kde 0 představuje náš enzym, V8 proteasu, O Subtilisin Carlsberg, A Sabinasu a V Alkalasu.
Bylo zjištěno, že enzym má teplotní optimum při 40 °C a rychle se inaktivuje při reakční teplotě vyšší než je jeho optimální teplota. Bylo rovněž zjištěno, že všechny komerčně dostupné proteasy mají teplotní optimum 50 °C a vyšší, a že hodnota K<;at námi presentovaného enzymu je v rozmezí 10 až 40 °C vyšší než u kterékoliv ze srovnávaných proteas.
Příklad 11
Teplotní stabilita proteasy
Enzym byl inkubován při teplotách od 20 do 50 °C. Změny aktivity v závislosti na čase inkubace jsou uvedeny na obr. 14, kde Q představuji změny při 20 °C, φ při 30 °C, O při 40 °C a Z\ při 50 °C.
Enzym nebyl prakticky inaktivován při 20 nebo 30 °C, ale ««ΰ «β»»,»».
• · · · · · * · · • · · ··· · • · ·· · po jedné hodině inkubace při 40 ”C se postupně snížila jeho aktivita na 60 % aktivity pozorované při 20 nebo 30 °C, a při 50 °C byl enzym úplně inaktivován do 15 minut.
Enzym lze považovat za tepelně nestabilní, protože výše zmíněné teploty jsou nižší než optimální teploty proteas použitých v předchozím experimentu pro srovnání.
Příklad 12
Vliv inhibitorů
Jako inhibitory byly použity fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) působící na serinové proteasy, jodoacetamid (IAA), působící na cysteinové proteasy, kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA) působící na metaloproteasy, o-fenantrolin, 2,2'-bipyridyl, a citrát a oxalát působící specificky na Ca2* ionty. Po přidání inhibitorů v různých koncentracích do enzymového reakčního systému, byl tento systém inkubován při 20 C po dobu 1 hodiny, aby bylo možno stanovit zbytkovou proteasovou aktivitu. Výsledky ukazuje následující tabulka.
Tabulka 5
Vliv inhibitorů
| Inhibitor | Koncentrace | Zbytková aktivita (%) |
| Bez inhibitoru | 10 mM | 100 |
| PMSF | 10 mM | 99 |
| Jodoacetamid | 10 mM | 94 |
| EDTA | 10 mM | 8 |
| o-Fenantrolin | 10 mM | 91 |
| 2,2'-Bipyridyl | 10 mM | 39 |
| Citrát | 10 mM 100 mM | 41 0 |
| Oxalát | 10 mM 100 mM | 45 0 |
• · · • · · ···· ♦
Proteasová aktivita enzymu nebyla inhibována PMSF nebo IAA, ale výrazně ji inhibovaly EDTA, 2,2'-bipyridyl, citrát a oxalát. Bylo tak zjištěno, že proteasová aktivita je závislá na přítomnosti iontů kovů a tedy, že studovaný enzym je metalóproteasa. Z inhibice citrátem a oxalátem lze usuzovat, že proteasová aktivita je závislá na vápníku.
Příklad 13
Vliv látek denaturujících proteiny
Sodium dodecylsulfát (SDS) a močovina byly použity jako | látky denaturující proteiny. Po přidáni různých koncentrací { látek děnaturujících proteiny byl enzymový systém inkubován pri 20 °C po dobu 1 hodiny, aby bylo možno stanovit zbytkovou 1 proteasovou aktivitu.
Výsledky získané s SDS a močovinou jsou uvedeny na obrázcích 15 a 16.
Proteasa byla inhibována i v nízkých koncentracích SDS a úplné inaktivace bylo dosaženo při použití koncentrace 0,25 % SDS. Proteasa nebyla inhibována močovinou až do koncentrace
M, při použití 3 M močoviny činila zbytková aktivita 60 % a 4 M močovina úplně inhibovala aktivitu proteasy.
Příklad 14
Vliv iontů kovů
AgNO3, CuSO^, ZnSO4, CoSO^, FeSO^, MnSO4, CaCl^ a MgSO^ byly použity jako zdroj iontů kovů. Po přidání soli
9999
9 9 « · · 999999 9
9 9 9 · 9 9 9 9
DD · 9999 9 9 · 9 · 999 9
9 9 9 9 9 9
9999 · 99999 99 9 příslušného kovu v konečné koncentraci 1 mM, byl enzymový systém inkubován při 20 °C po dobu 1 hodiny a byla stanovena zbytková aktivita enzymu.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce
Tabulka 6
Vliv iontů kovů
| Kovový ion | Zbytková aktivita (%) |
| Žádný kovový ion | 100 |
| Ag* | 11 |
| Cu2M | 44 |
| Zn2+ | 61 |
| Co2* | 63 |
| Fe2+ | 76 |
| Mn2 | 95 |
| Ca2’ | 100 |
| Mg2* | 100 |
Studovaný enzym byl výrazně inhibován ionty Ag^, Cu2+, Zn2+, Co2*, a Fe2+. Při inhibici Ag^ byla zbytková aktivita pouze 10 %. Enzym nebyl vůbec inhibován ionty Mg2* a Ca2''.
Příklad 15
Substrátová specificita
Kasein (Hammarsten), dimethylkasein, želatina, hemoglobin, hovězí serumalbumin a ribonukleasa byly použity jako substrátové proteiny k měření proteolytické aktivity modifikovanou Ansonovou metodou. Azokasein a azoalbumin byly použity jako azoprotein-modifikující proteiny.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
·· · · ·· ·· ···· • · · ······ * • · · »·»··· ······ · · · · ··· · • · 9 9 9 9 9
9999 9 999 99 99 9
Tabulka 7
Substrátová specificita
| Substrát (1 %) | Rychlost hydrolysy (%) |
| Kasein (Hammarsten) | 100 |
| Dimethylkasein | 93 |
| Želatina | 53 |
| Hemoglobin | 18 |
| Hovězí serumalbumin | 17 |
| Ribonukleasa | 0 |
| Azokasein | 100 |
| Azoalbumin | 20 |
Enzym podle tohoto vynálezu dobře rozkládá í
vysokomolekulární proteiny a denaturované proteiny jako t í
například kasein a dimethylkasein a rovněž rozkládá želatinu j . . . i jako protein denaturovaného kolagenu s 50 % účinností ve ·$ srovnání s kaseinem. Enzym prakticky nerozkládá jiné přírodní | proteiny a zejména ne ribonukleasu. 1
Příklad 16
Kinetiká enzymové reakce s kaseinem
Vynesení podle Lineweavera a Burka byla získána při různých teplotách od 5 do 40 °C s roztokem obsahujícím 0,05 až % kaseinu jako enzymový substrát. Vynesení jsou znázorněna na obr. 17, kde horní graf (A) ukazuje změnu hodnoty 1/v v rozsahu 0 až 2,0 a spodní graf (B) změnu hodnoty 1/v v rozsahu až 0,2. Na obrázku Q představuje vynesení při 5 C, φ při °C, O při 20 ”C, při 30 °C a v při 40 °C.
Kinetická konstanta enzymové reakce byla získána z vynesení podle Lineweavera a Burka tak jak je znázorněno v tabulce uvedené níže.
9· 9
Tabulka 8
Substrátová specificita
| Substrát (1 %) | Rychlost hydrolysy (%) |
| Kaséin (Hammarsten) | 100 |
| Dimethylkasein | 93 |
| Želatina | 53 |
| Hemoglobin | 18 |
| Hovězí serumalbumin | 17 |
| Ribonukleasa | 0 |
| Azokasein | 100 |
| Azoalbumin | 20 |
Jak je z tabulky zřejmé, enzym vykazuje reakční rychlost typu Michaelis-Mentenové pro různé koncentrace kaseinu. Hodnota K klesala a hodnota V naopak stoupala se zvyšující m max se teplotou. Enzymová aktivita byla inhibóvána při vysoké koncentraci kaseinu při 5 a 10 °C. Obecně měl enzym tendenci být inhibován při nadbytečné koncentraci substrátu. Avšak enzym nebyl inhibován při koncentraci kaseinu 1 % při zvýšené reakční teplotě. Domníváme se, že důvodem pro toto chování bylo zvýšení hodnoty tím, že teplota se přiblížila optimální hodnotě a docházelo k malé inhibici produkty rozkladu kaseinu. Na základě vynesení podle Lineweavera a Burka se rovněž domníváme, že teplotní inhibice je smíšeného typu. To znamená, že vliv teploty je považován za nekompetitivní nebo akompetitivní inhibici a vliv produktů rozkladu kaseinu za kompetitivní inhibici.
Průmyslová využitelnost
Psychrofilní proteasa podle tohoto vynálezu má optimální teplotu v nízkém teplotním rozsahu. Tedy, pomocí psychrofilní • · · ·· · ) · · • · · proteasy podle tohoto vynálezu, lze štěpit proteiny při nízké teplotě. Například detergent, který lze použít i ve vodě při nízké teplotě, je připraven přidáním proteasy podle tohoto vynálezu do detergentního přípravku. S výjimkou zahrnutí psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu, lze tento detergentní přípravek připravit konvenčními metodami. Stručně řečeno, lze jej připravit kombinací proteasy podle tohoto vynálezu s obvyklou detergentní složkou jako je povrchově aktivní činidlo pro detergenty, bělidlo nebo plnidlo.
Enzymová reakce psychrofilní proteasy podle tohoto vynálezu probíhá při nízké teplotě. Tedy, i když reakční systém obsahuje organické rozpouštědlo, které je těkavé při teplotě místnosti, může reakce probíhat za nízké teploty, kdy se organické rozpouštědlo neodpařuje. Navíc, když zamýšlíme zlepšit kvalitu potravin použitím proteasy podle tohoto vynálezu, je výhodné užít tuto proteasu, protože reakce probíhá při nízké teplotě, při které jsou potraviny účinně chráněny před rozkladem.
Claims (10)
1. Psychrofilní proteasa, která má následující fyzikálně-chemické vlastnosti:
Specifická aktivita a substrátová specificita: enzym rozkládá kasein a dimethylkasein, ale nerozkládá ribonukleasu;
- Optimální teplota: enzym má optimální teplotu účinku 40 °C; a
- Teplotní stabilita: za podmínek uchovávání při pH 7 po dobu 1 hodiny není enzym prakticky inaktivován při teplotách do 30 °C, ale při 40 °C ztrácí přibližně 40 % své aktivity, a při 50 °C je rychle inaktivován, takže aktivita úplně mizí po 15 minutách.
2. Psychrofilní proteasa podle nároku 1, která má následující fyzikálně-chemické vlastnosti:
- Optimální pH: působí optimálně při pH 7,5 ; a
- Stabilita v závislosti na pH: enzym je stabilní při pH v rozmezí 6,0 až 10,0 za podmínek uchovávání při teplotě 20 °G po dobu 1 hodiny.
3. Psychrofilní proteasa podle nároku 1, kdy proteasa má molekulovou hmotnost 38 kDa podle měření polyakrylamidovou elektroforesou v přítomnosti sodium dodecylsulfátu a metodou gelové filtrace.
4. Psychrofilní proteasa podle nároku 1, kdy proteasa má • · ·
9 9 9
9 9 9
9 99 9 9
9 9
999 9 9 • ·· · · · ··· *« · · · · ·
9 9 9 9 9 9 99 99 9999
9 9 9 9 9
99 9 99 99 9 hodnotu izoelektrického bodu 4,5 podle měření pomocí izoelektrické fokusace.
5. Izolovaný mikroorganismus náležející druhu Flavobacteríum balustinum, který je schopný produkovat proteasu podle nároků
1 až 4.
6. Izolovaný mikroorganismus náležející druhu Flavobacteríum balustinum podle nároku 5, kdy mikroorganismus roste přednostně při teplotách v rozmezí 10 až 20 °C.
I
7. Izolovaný mikroorganismus náležející druhu Flavobacteríum j balustinum podle nároku 5, který představuje kmen Flavobacteríum balustinum P104 {FERM BP-5006).
8. Způsob přípravy psychrofilní proteasy, vyznačuj i cí se tím, že zahrnuje: kultivaci mikroorganismu
Flavobacteríum balustinum podle nároku 5, a izolaci psychrofilní proteasy podle nároku 1 z mikrobní kultury.
9. Způsob přípravy psychrofilní proteasy, vyznačující se tím, že zahrnuje: kultivaci mikroorganismu
Flavobacteríum balustinum podle nároku 6, a izolaci psychrofilní proteasy podle nároku 1 z mikrobní kultury.
·· · • · · • · · • ·· ·· • ·· ······ · • e » · · · « · · · · · · · • · · · · »·· ·» · · ·
10. Způsob přípravy psychrofilní proteasy, vyznačující se t í m, že zahrnuje: kultivaci mikroorganismu Flavobacterium balustinum podle nároku 7, a izolaci psychrofilní proteasy podle nároku 1 z mikrobní kultury.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7029904A JPH08214878A (ja) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | 低温性プロテアーゼおよび低温性細菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ258097A3 true CZ258097A3 (cs) | 1998-01-14 |
Family
ID=12288976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ972580A CZ258097A3 (cs) | 1995-02-17 | 1996-02-16 | Psychrofilní proteáza a psychrofilní bakterie |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08214878A (cs) |
| CN (1) | CN1181108A (cs) |
| BR (1) | BR9607452A (cs) |
| CA (1) | CA2211938A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ258097A3 (cs) |
| HU (1) | HUP9802061A3 (cs) |
| IL (1) | IL117164A0 (cs) |
| MA (1) | MA23810A1 (cs) |
| TR (1) | TR199700776T1 (cs) |
| ZA (1) | ZA961237B (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019080493A (ja) * | 2017-10-27 | 2019-05-30 | プリマハム株式会社 | プロテアーゼ、洗浄剤組成物、洗浄方法、微生物 |
| CN109749978B (zh) * | 2019-03-07 | 2019-10-11 | 自然资源部第一海洋研究所 | 利用低温蛋白酶促进细菌生长的方法 |
| CN110208411B (zh) * | 2019-06-10 | 2021-12-24 | 浙江龙传生物医药科技有限公司 | 用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂 |
-
1995
- 1995-02-17 JP JP7029904A patent/JPH08214878A/ja not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-02-16 CA CA002211938A patent/CA2211938A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-16 CZ CZ972580A patent/CZ258097A3/cs unknown
- 1996-02-16 MA MA24167A patent/MA23810A1/fr unknown
- 1996-02-16 HU HU9802061A patent/HUP9802061A3/hu unknown
- 1996-02-16 CN CN96193145A patent/CN1181108A/zh active Pending
- 1996-02-16 BR BR9607452A patent/BR9607452A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-16 ZA ZA961237A patent/ZA961237B/xx unknown
- 1996-02-16 TR TR97/00776T patent/TR199700776T1/xx unknown
- 1996-02-18 IL IL11716496A patent/IL117164A0/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9607452A (pt) | 1998-06-30 |
| ZA961237B (en) | 1996-08-27 |
| JPH08214878A (ja) | 1996-08-27 |
| HUP9802061A2 (hu) | 1998-12-28 |
| MA23810A1 (fr) | 1996-10-01 |
| CN1181108A (zh) | 1998-05-06 |
| IL117164A0 (en) | 1996-06-18 |
| CA2211938A1 (en) | 1996-08-22 |
| TR199700776T1 (xx) | 1998-02-21 |
| HUP9802061A3 (en) | 1999-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Laxman et al. | Optimization and scale up of production of alkaline protease from Conidiobolus coronatus | |
| Karadzic et al. | Purification and characterization of a protease from Pseudomonas aeruginosa grown in cutting oil | |
| Hua et al. | Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. nov. SK006 isolated from an Asian traditional fermented shrimp paste | |
| Setyorini et al. | Purification and characterization of two novel halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilis strain FP-133 | |
| Cui et al. | Production and characterization of alkaline protease from a high yielding and moderately halophilic strain of SD11 marine bacteria | |
| Qadar et al. | Optimization of protease production from newly isolated strain of Bacillus sp. PCSIR EA-3 | |
| Wang et al. | Purification and properties of an extracellular cold-active protease from the psychrophilic bacterium Pseudoalteromonas sp. NJ276 | |
| Hamamoto et al. | Characterization of a protease from a psychrotroph, Pseudomonas fluorescens 114 | |
| Lama et al. | Purification and characterization of a protease produced by an aerobic haloalkaliphilic species belonging to the Salinivibrio genus | |
| Gerze et al. | Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis megatherium | |
| Chitte et al. | Production of a fibrinolytic enzyme by thermophilic Streptomyces species | |
| Ghareib et al. | Thermostable alkaline protease from Thermomyces lanuginosus: optimization, purification and characterization | |
| Ingram et al. | Studies of the extracellular proteolytic activity produced by Propionibacterium acnes | |
| WO1996025489A1 (en) | Psychrophilic protease and psychrophilic bacteria | |
| CZ258097A3 (cs) | Psychrofilní proteáza a psychrofilní bakterie | |
| Morita et al. | Purification and characterization of a cold‐active protease from psychrotrophic Serratia marcescens AP3801 | |
| Aoki et al. | Anaerobic synthesis of extracellular proteases by the soil bacterium Bacillus sp. AM-23: purification and characterization of the enzymes | |
| Rashad et al. | Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme by Candida guilliermondii grown on sunflower oil cake | |
| JP3592811B2 (ja) | 低温活性アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法 | |
| Shumi et al. | Production of protease from Listeria monocytogenes | |
| Joseph et al. | Isolation, production and characterisation of novel gelatinase enzyme from Bacillus spp | |
| Gudzenko et al. | Influence of Cultivation Temperature on Activity of Proteolitic Enzymes of Bacteria Isolated from the Deep-Water Bottom Sediments of the Black Sea | |
| JP2882652B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ及びその生産性微生物 | |
| WO1998040473A1 (en) | Keratinolytic protease ek3 and xanthomonas maltophilia ek3 | |
| RATTRAY et al. | RECENTLY IDENTIFIED ENZYMES OF BREVIBACTERIUM LINENS ATCC 9174‐A REVIEW |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |