CZ258199A3 - Způsob elektronického zajištění výrobků proti krádeži a zařízení pro provádění tohoto způsobu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká pro transf-ekci a expresi exogenů in

¹ í , / oblasti^genove ťerapi,e„a_z.e jména .použití adenovirů pro expresi zainteresovaného terapeutického genu. Vynález se zejména týká nového způsobu léčení patologických stavů genetického původu založeného na kombinovaném použití dvou typů terapeutických činidel.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v korekci nedostatečnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) zavedením genetické informace do buňky nebo orgánu vykazujících uvedenou nedostatečnost nebo anomálii. Tato genetická informace může být zavedena buá in vitro nebo ex vivo do buňky extrahované z orgánu, přičemž modifikovaná buňka je potom- znovu zavedena do organismu, anebo přímo i*n vivo do příslušné tkáně. V tomto druhém případě existují různé fyzikální transfekční techniky, mezi které patří také použití viru ve funkci vektoru. V tomto ohledu byly testovány různé viry za účelem stanovení jejich schopnosti infikovat některé buněčné populace. Jedná se zejména o retroviry (RSV, HMS, MMS, atd·.), vir HSV, adeno-přidružené viry a adenoviry.

Z těchto virů zejména adenoviry mají některé zajímavé vlastnosti pro použití v genové terapii. Mají dosti široké hostitelské spektrum, jsou schopné infikovat kviescentní buňky a neintegrují se do genomu infikované buňky. Adenoviry jsou viry s lineární dvouřetezcovou DNA velikosti asi 36 kb. Jejich genom obsahuje zejména obrácenou repetiční sekvenci (ITR) na jejich konci, enkapsidační sekvenci, rané geny a pozdní geny (viz obr.1). Hlavní rané geny jsou geny El (Ela a Elb), E2, E3 a E4. Hlavními pozdními geny jsou geny L1 až L5.

- 2 Vzhledem k výše uvedeným vlastnostem adenovirů, byly tyto viry již použity pro přenos genů. Za tímto účelem byly připraveny různé vektory odvozené od adenovirů zahrnující různé geny (beta-gal, OTC, alfa-1AT, cytokiny, atd.). V každé z těchto konstrukcí byl adenovir modifikován takovým způsobem, aby byl neschopný replikace v infikované buňce. Takto jsou konstrukcemi popsanými v rámci dosavadního stavu techniky adenoviry s delecemi oblastí El (Ela nebo/a Elb) a případně oblasti E3, přičemž v úrovni těchto delecí je vložena sekvence heterologní DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; GoshChoudhury a kol., Gene 50 (1986)161).

Nicméně jak je tomu u všech známých virů, indukuje podání 'divokého adenovirů (Poutes a kol·., J.Virol.65 (1991)1450) nebo defektního rekombinantního viru neschopného replikace (Yang a kolΡΝΑΞ(1994)4407) výraznou imunitní odezvu.

Hlavní zásadou imunitního systému je integrita individua neboli vlastní integrita. Podle této zásady imunitního systému dochází k eliminaci infekčních činidel a k odmítání implantovaných roubů a nádorů, aniž by se při tom tyto mocné obranné mechanismy organismu obrátili proti vlastnímu organismu a indukovaly v něm autoimunitní nemoci. Tento stav neodezvy na vlastní antigeny, v rámci které jsou eliminovány pouze cizí antigeny; je definován jako stav fyziologické tolerance. Za účelem eliminace cizích činidel rozvijí imunitní systém dva typy mechanismů. V rámci prvního z těchto mechanismů produkuje pomocí lymfocytů B specifické protilátky, přičemž se v tomto případe hovoří o humorální imunitě. Tyto protilátky váží· antigen a buč ho inaktivují nebo ho vyloučí z organismu. Druhý obranný mechanismus se týká buněčné imunity a využívá lymfocity T a z těchto cytotoxické lymfocyty nesoucí specifický receptor uvažovaného antigenu. Rozpoznání antigenu receptorem T vyžaduje, aby tento byl exprimován v kombinaci s proteiny kódovanými geny hlavního histokompatibilitního komplexu (CMH) třídy I a třídy II.

V důsledku toho tato imunitní odezva rozvinutá proti

- 3 infikovaným buňkám představuje hlavní překážku při použití virálních vektorů v genové terapii, poněvadž 1) indukujíce destrukci infikovaných buněk omezuje dobu exprese terapeutického genu a tudíž i terapeutický účinek, 2) indukuje paralelně výraznou zánětovou odezvu a 3) způsobuje rychlou eliminaci infikovaných buněk po opakovaných injekcích. Je samozřejmé, že rozsah této imunitní odezvy vůči infikovaným buňkám se mění podle charakteru organu podstoupivšího injekci a v závislosti na použitém způsobu podání. Takto je exprese betagalaktozidázy kódovaná rekombinantním adenovirem dodaným do svalu imunokompetentních myší snížena na minimální úroveň 40 dnů po injekci (Kass.Eisler a kol., PNAS 90 (1993)11498).

Stejně tak je exprese genů transfekovaných adenovirem· do játra významně snížena v průběhu 10 dnů následujících po injekci (Yang a kol. 1994, Immunity 1 433-442) a exprese faktoru IX přeneseného adenovirem do hepatocytů hemofilních psů vymizí 100 dnů po injekci (Kay a kol.,PNAS9 1 ( 1 994 ) 2353 ).

V rámci perspektivního využití vektorů odvozených od adenovirů v genovém inženýrství se jeví jako nezbytné regulovat imunitní odezvu rozvinutou proti buňkám infikovaným uvedenými adenoviry.

Z výše uvedeného vyplývá, že uvedení v činnost imunitního systému vyžaduje především rozpoznání tímto imunitním systémem prvků, které jsou organismu cizí (nevlastní nebo vlastní avšak modifikované), jakými jsou vektory odvozené od adenovirů, které musí být v normálním čase zničeny. V průběhu posledních let byly vyvinuty imunointervenční strategie, jejichž cílem bylo vytvořit permisivní imunitní prostředí, tj. indukovat stav tolerance vůči předem definovaným cizím antigenům.

A přesně v této úrovni působí vynález. Vynález směřuje k zabránění rychlé eliminaci adenovirů z infikovaných buněk a tedy k prodloužení exprese in vivo terapeutického genu, které'tyto buňky nesou. ...........

V nedávné době přihlašovatel prokázal, že ko-exprese některých genů do infikovaných buněk je schopná indukovat imunoprotekční účinek a způsobit tak, že vektory nebo/a infikované buňky unikají působení imunitního systému. Jsou zejména používány adenoviry, ve kterých je exprese zainteresovaného terapeutického genu kopulována s expresí imunoprotekčního genu (FR n° 9412346). Může se zejména jednat o gen, jehož produkt působí na činnost hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na účinnost cytokinů a umožňuje tak výrazně snížit nebo dokonce potlačit jakoukoliv imunitní odezvu vůči uvedenému vektoru nebo vůči infikovaným buňkám. Takto dochází k alespoň částečně inhibici exprese proteinů MHC nebo prezentace antigenů, což má za následek výhodu spočívající ve značném omezení imu-. nitní reakce na přítomnost vektoru nebo infikovaných buněk a tedy v prodloužení terapeutického účinku.

Podstata vynálezu

Přihlašovat neočekávatelně prokázal, že je možné výrazně prodloužit terapeutický účinek vektoru tím, že se k němu přidruží imunosupresor. Přitom eliminace uvažovaného vektoru nebo/a destrukce infikovaných buněk imunitním systémem je zpožděna o dobu, která je výrazně delší než doba zpoždění, kterou by bylo možné očekávat při součtu imunoprotekčních účinků uvedeného vektoru a imunosupresoru. Výhodně léková kombinace podle vynálezu indukuje pseudo-nečinnost imunitního systému, která je příznivá pro dlouhodobou expresi terapeutického genu.

Ve smyslu tohoto vynálezu je imunosupresorem každá sloučenina, která je schopna inhibovat částečně nebo úplně alespoň jednu imunitní signalizační cestu. Obecně se imunosupresory používají obvykle při transplantacích za účelem předcházení odmítnutí cizorodých roubů a při léčení některých autoimunitních chorob. Klasicky používanými látkami jsou bu3 chemické imúnóšuprěšořy, jakými jsou kortikošteroidy, azathioprin, cyklo¹·' sporin, FK506, nebo biologické imunosupresory, jakými jsou polyklonální nebo monoklonálni protilátky. První kategorie imunosupresoru a z této zejména cyklosporin a FK506 inhibují významnou měrou produkci cytokinů, jako například produkci interleukinu 2, které hrají podstatnou úlohu při diferenciaci a proliferaci lymfocytních buněk. Bohužel účinnost tohoto typu imunosupresoru vyžaduje permanentní podávání, které je při při více nebo méně dlouhé době aplikace v rozporu s jejich toxicitou. Takto je azathiopropin potenciálně myelotoxický, zatímco cyklosporin. je nefrotoxický a může kromě toho způsobit hypertenzi nebo neurologické poruchy.

Pokud jde o protilátky, jedná se o protilátky řízené proti lymfoidním buňkám imunitního systému. První protilátkou použitou jako imunosupresor byla anti-CD3 řízená proti lymfocytům T Jejím cílem je jeden z polypeptidových řetězců molekuly CD3, který tvoří receptor pro antigen buněk T. Z toho vyplývá funkční inaktivace buněk T CD3+ rozpoznaných protilátkou. V případě problematiky, která je zde předmětem zájmu, by podání imunosupresoru tohoto typu společně s podáním rekombinantního adenoviru obsahujícího terapeutický gen bylo schopné blokovat imunitní reakci hostitele vůči virálnímu vektoru nebo/a vůči jeho produktům exprimovaným na povrchu infikovaných buněk. Na stejriém principu lze využít protilátky anti-CD4, anti-CD2, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1 a antiLFA-1 .

Přihlašovatel nyní vyvinul nový způsob obzvláště účinného a výrazného zpoždění nebo dokonce inhibice reakce imunitního systému, při kterém nedochází k problémům toxicity.

Přesněji definováno, vynález je odvozen od prokázání obzvláště výrazného synergického účinku spojeného s kombinovaným použitím rekombinantního adenoviru, ve kterém je exprese zainteresovaného terapeutického genu kopulována s expresí imunoprotekČního genu, který byl popsán výše, a alespoň jednoho imunosupresního činidla.

První předmět vynálezu se tedy týká lékové kombinace alespoň jednoho imunosupresního činidla a alespoň jednoho rekombinantního adenoviru, jehož genom obsahuje první rekombinantní .DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen, pro následné, přerušované nebo/a časově současné použití vhodné pro exogenovou transfekci in vivo nebo/a ex-vivo.

Jak již bylo uvedeno výše, spočívá vynález zejména na prokázání synergického účinku mezi aktivitou imunosupresního činidla a účinkem imunoprotekčního genu exprimovaného na expresi terapeutického genu.

Toto kombinované použití umožňuje výrazně prodloužený terapeutický účinek a výhodně vyžaduje významně snížené dávky zejména imunosupresního činidla.

Jak to bude uvedeno dále, mohou být obě složky kombinovaného ošetření použity následně, přerušovaně nebo/a časově současně. Výhodně se imunosupresní činidlo injikuje před a po injekci adenoviru. Podle této formy provedení vynálezu může být podání imunosupresního činidla provedeno v časovém odstupu a výhodně může být pravidelně obnovováno. V tomto specifickém případě jsou obě složky kondicionovány odděleně. V případě současného podání mohou být obě složky smíšeny bezprostředně před společným podáním nebo mohou být naopak podány současně avšak odděleně. Zejména mohou být způsoby podání obou činidel odlišné.

V rámci vynálezu lze jako imunosupresní činidlo použít každou sloučeninu, která jé schopna inhibovat částečně nebo úplně alespoň jednu imunitní signalizační cestu. Toto činidlo může být zejména zvoleno z látek, jakými jsou cyklosporin, FK506, azathioprin, kortikosteroidy a každá mono- nebo polyklonální protilátka. Jedná se výhodně o protilátky schopné inaktivovat imunní molekuly nebo vyvolat destrukci imunních buněk nesoucí -tyto-molekuly. Jako protilátku lze zejména po-··

- 7 užít protilátky anti-CD4, anti-CD3, anti-CD2, anti-CD8, antiCD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFAA-1. Může se rovněž jednat o hybridní molekuly, jakými jsou CTLA41g, fuzní protein mezi molekulou CTLA-4-(homolog k CD28) a imunoglobulinem. Místo G1Fc této molekuly vázané s molekulou B7 se ukazuje schopným inhibovat aktivaci buněk T (D.J. Lenschow, Science, 257, 789, 1992). Je samozřejmé, že rozsah vynálezu není nikterak omezen na výše uvedené imunosupresory. Tyto imunosupresory mohou být použity v izolované formě nebo v kombinaci.

Pokud jde o rekombinantní DNA přítomné v genomu adenoviru použitého v rámci vynálezu, jedná se o fragmenty DNA obsahující uvažovaný gen (terapeutický nebo imunoprotekční) a případně signály umožňující jeho expresi konstruované in vitro a potom vložené do genomu adenoviru. Rekombinantními DNA použitými v rámci vynálezu i mohou být komplementární DNA (DNAc), genomové DNA (DNAg) nebo hybridní konstrukce sestávající například z DNAc, do které by byly vloženy jeden nebo několik intronů. Může se rovněž jednat o syntetické sekvence nebo semisyntetické sekvence. Tyto DNA mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního a jiného původu. Výhodně se používají DNAc nebo DNAg.

Jako terapeutický gen použitelný pro konstrukci vektorů podle vynálezu lze uvést gen kódující produkt mající terapeutický účinek. Takto kódovaným produktem může být protein, peptid, RNA a podobně.

Pokud jde o proteinový produkt, může jít o produkt homologní vůči cílové buňce (tj. produkt, který je v cílové buňce normálně exprimován v případě, že tato buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě, umožňuje exprese proteinu například léčit nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi neaktivního nebo slabě aktivního proteinu způsobenou nějakou modifikací, a nebo ještě nadměrnou expresi uvedeného

-proteinu. Terapeutický gen může takto· kódovat buněčný .protein mající zvýšenou stabilitu, modifikovanou účinnost a podobně.

- 8 Proteinový produkt může být rovněž heterologní vůči cílové buňce. V tomto případě může exprimovaný protein například doplňovat nebo nahrazovat některou deficitní aktivitu v buňce, čímž činí buňku schopnou bojovat proti uvažované patologii nebo u ní stimuluje imunitní odezvu.

Jako terapeutické proteinové produkty ve smyslu vynálezu lze uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, atd., apoliproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), protein CFTR sdružený s mukoviscidosou, protinádorové supresní geny: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory implikované při koagulaci: faktory VII, VIII, IX, geny zasahující do reparace DNA a podobně.

Jak již bylo uvedeno výše, může být terapeutickým genem rovněž antimediátorový gen nebo antimediátorová sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genu nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na RNA komplementární k buněčným RNAm a blokovat tak jejich translaci na protein technikou popsanou v patentu EP 140 308. Antimediátory rovněž obsahují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně rozkládat cílové RNA (EP 321 201).

Terapeutické geny mohou být lidského zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního a jiného původu. Tyto geny mohou být získány libovolnou známou technikou a zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank.

Imunosupresní gen použitý v rámci vynálezu muže být řoz

- 9 ličného typu. Jak již bylo vysvětleno výše, jedná se o gen, jehož produkt působí na aktivitu hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na aktivitu cytokinu. Výhodně se jedná o gen, jehož produkt inhibuje alespoň částečně expresi proteinů komplexu MHC nebo antigenovou prezentaci. Jako výhodné příklady lze uvést některé geny obsažené v oblasti E3 adenovíru, gen ICP47 viru herpes nebo gen UL18 cytomegaloviru.

Oblast E3 genomu adenoviru obsahuje různé čtecí fáze, které alternativím svíjením poskytují různé proteiny. Z těchto proteinů je protein Gp19k (nebo(E3-19k) transmembránovým glykosylovaným proteinem lokalizovaným v membráně endoplasmového retikula (RE). Tento protein obsahuje luminální doménu vázající molekuly komplexu MHC-I a C-terminální cytoplasmový konec schopný vázat mikrotubuly (nebo tubulin),, které působí při zakotvení proteinu gp19k v membráně RE. Protein Gp19k je takto schopný zabránit expresi molekul MHC-I na povrchu buněk interakcí a sekvestrací v úrovni RE. Nicméně v nepřítomnosti virální replikace je protein gpT9k slabě exprimován adenoviry. Jinak je exprese- gp19k rovněž přizpůsobena k realizaci svíjení. Zavedení do vektoru podle vynálezu rekombinantní DNA obsahující sekvenci (výhodně DNAc) kódující gp19k umožňuje regulovat a optimalizovat expresi uvedeného proteinu. Zejména použití konstitutivních promotorů a suprese ostatních čtecích fází umožňuje silně zvýšit expresi uvedeného proteinu a vymanit se ze závislosti na virální replikaci a přítomnosti indukčních prvků. To umožňuje obzvláště výhodným způsobem značně snížit lyži za použití.CTL infikovaných buněk a takto zvýšit a prodloužit in vivo produkci terapeutického genu.

Další proteiny kódované oblastí E3 genomu adenoviru, jakými jsou proteiny 10,4k a 14,5k, mají některé zajímavé vlastnosti s ohledem na jejich zavedení do vektorů podle vynálezu .

Gen 1CP47 viru herpes simplex tvoří další imuhoprotekční gen, který je obzvláště zajímavý pro použití ve smyslu

- 10 vynálezu. Buňky infikované virem herpes simplex vykazují odolnost proti lyži indukované pomocí CTL. Bylo prokázáno, že tato rezistence může být poskytnuta genem ICP47, který je schopen omezit expresi molekul MHC-I na povrchu buněk. Inkorporace genu ICP47 do r.ekombinantní DNA podle vynálezu umožňuje rovněž rekombinantním virům podle vynálezu uniknout imunitnímu systému.

Gen UL18 cytomegaloviru tvoří další výhodný příklad imunoprotekčního genu podle vynálezu. Produkt genu UL18 je schopný vázat beta2-mikroglobulin (Browne a kol.,Nature 347(1990) 770). beta2-Mikroglobulin je jedním z řetězců molekul MHC-I. Zabudování genu UL18 do rekombinantní DNA podle vynálezu také umožňuje snížit počet funkčních buněk beta2-mikroglobulinu v buňkách infikovaných viry podle vynálezu a tedy snížit schopnosti těchto buněk produkovat kompletní a funkční molekuly MHC-I. Tento typ konstrukce tedy umožňuje chránit infikované buňky před Lyží způsobenou CTL.

Jak již bylo uvedeno výše, je imunoprotekčním genem použitým v rámci vynálezu při jiném výhodném způsobu provedení gen, jehož produkt inhibuje aktivitu nebo signalizační cesty cytokinů. Cytokiny tvoří skupinu vylučovaných proteinů, které působí jako signalizační molekuly imunitního systému. Mohou přitahovat imunitní buňky, aktivovat je, indukovat jejich proliferaci a dokonce působit přímo na infikované buňky tak, že je zabíjejí.

Jako příklady genů, jejich produkt působí na aktivitu nebo signalizační cesty cytokinů lze uvést geny zasahující do syntézy cytokinů nebo jejichž produkt je schopen sekvestrovat cytokiny, antagonizovat jejich aktivitu nebo interferovat s intercelulárními signalizačními cestami. Jako výhodné příklady takových genů lze uvést zejména gen BCRF1 viru Epsteina a Barrové, geny crmA a CRMB viru cowpox, geny B15R a El8R viru kravských neštovic, gen US28 cytomegaloviru a geny E3.14,7, E3-10,4 a E3-14,5 adenoviru.

-11Gen B15R viru kravských neštovic kóduje rozpustný protein schopný vázat interleukin-1 beta (sekretovaná forma interleukinu-1) a takto bránit tomuto cytokinu vázat se na jeho buněčné receptory. Interleukin-1 je ve skutečnosti jeden z prvních cytokinů produkovaných v odezvu na antigenovou agresi a hraje velmi důležitou úlohu při signalizaci imunitního systému na počátku infekce. Možnost zabudovat gen B15R do vektoru podle vynálezu výhodně umožňuje redukovat aktivitu IL1beta zejména při aktivaci imunitních buněk a tím způsobem lokálně chránit infikované buňky virem podle vynálezu proti výrazné imunitní odezvě. Rovněž mohou být použity homologní geny genu B15R, jakým je například gen viru cowpox.

Stejným způsobem gen B18R viru kravských neštovic kóduje protein homologní s receptorem interleukinu-6. Tento gen nebo každý funkční homologní gen je rovněž použitelný ve vektorech podle vynálezu pro inhibici vazby interleukinu-6 na jeho buněčný receptor a takto pro lokální snížení imunitní odezvy.

Stejným způsobem může být použit i gen crmB viru cowpox. Tento gen kóduje ve skutečnosti sekretovaný protein schopný vázat TNF a konkurovat receptorům TNF na povrchu buněk. Tento gen tudíž umožňuje ve virech podle vynálezu lokákně snižovat koncentraci aktivního činidla TNF schopného ničit infikované buňky. Rovněž mohou být použity i jiné geny kódující proteiny schopné vázat TNF a inhibovat alespoň částečně jeho vazbu na jeho receptory.

Gen crmA viru cowpox kóduje protein mající inhibiční aktivitu proteáz typu serpinu, který je schopný inhibovat syntézu interleukinu-lbeta. Tento gen může být tedy použit pro lokální snížení koncentrace interleukinu-1 a takto pro omezení rozvinutí imunitní a zánětové odezvy.

Gen BCRF1 viru Epsteina a Barrové kóduje analog interleukinu 10.· Produktem tohoto genu je cytokin schopný omezit imunitní odezvu a změnit její specifičnost mechanismem indukce proliferace .lymfocytů B.

- 12 Gen US28 cytomegaloviru kóduje protein homologní s receptorem zánětového proteinu makrofagů 1alfa (MIP-1alfa). Tento protein je tedy schopen působit jako konkureční činidlo receptorů MIP a inhibovat tak lokálně aktivitu uvedeného zánětového proteinu.

Produkt genů E3-14,7, E3-10,4 a E3-14,5 adenoviru·je schopen blokovat přenos intercelulárního signálů mediovaného některými cytokiny. Když se cytokiny váží na jejich receptor na povrchu infikované buňky, dojde k přenosu signálu do jádra indukujícího buněčnou smrt nebo zastavení proteinové syntézy. To je zejména případ nekrózního faktoru nádorů. Inkorporace genů E3-14,7, E3-10,4 nebo/a E3-14,5 do rekombinantní DNA podle vynálezu za účelem jejich konstituční nebo regulované exprese umožňuje blokovaž intracelulární signalizaci indukovanou faktorem TNF a takto chránit buňky infikované rekombinantními viry podle vynálezu před toxickými účinky uvedeného cytokinu.

Lokální a přechodná inhibice může být obzvláště výhodná. Takové inhibice může být dosaženo zejména volbou specifických expresních signálů (například cytokin-dependentní promotory), jak to bude popsáno dále.

Je samozřejmé, že mohou být použity i další homologní geny nebo geny mající obdobné funkční vlastnosti pro konstrukci vektorů podle vynálezu. Takové různé geny mohou být získány každou o sobě známou technikou a zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami, zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Kromě toho mohou být takové geny použity samostatně nebo v kombinaci anebo v kombinacích.

Vložení uvažovaných genů ve formě rekombinantních DNA podle vynálezu nabízí větší pružnost při konstrukci adenoviru a umožňuje lepší regulaci uvedených expresních genů.

Takto mohou být rekombinantní DNA (a tedy oba zainte

- 13 resované geny) zabudované do adenovirálních vektorů podle vynálezu sestaveny a uspořádány různými způsoby.

Mohou být nejdříve vloženy do stejného místa genomu adenovirů nebo do různých zvolených míst tohoto genomu. Rekombinantní DNA mohou být zejména vloženy alespoň částečně v úrovni oblastí El, E3 nebo/a E4 genomu adenovirů tak, že nahrazují nebo doplňují virální sekvence.

Výhodně se rekombinantní DNA vloží alespoň částečně v úrovni oblastí E1, E3 nebo E4 genomu adenovirů. V případěže se vloží na dvě různá místa, potom se upřednostňuje v rámci vynálezu použití oblastí El a E3 nebo E1 a E4. Příklady ve skutečnosti ukazují, že tato organizace umožňuje zvýšenou expresi obou genů, aniž by přitom docházelo k interferenci mezi těmito geny. Výhodně se rekombinantní DNA vloží tak, že nahrazují virální sekvence.

Tyto rekombinantní DNA mohou potom každá obsahovat transkripční promotor, přičemž tyto promotory mohou být stejné nebo odlišné. Tato konfigurace umožňuje dosáhnou vyšší expresní hladiny a nabízí lepší regulaci exprese genů. V tomto případě mohou být oba geny vloženy ve stejné orientaci nebo v opačných orientacích.

Rekombinantní DNA mohou rovněž tvořit jednotnou transkripční entitu. V této konfiguraci jsou obě rekombinantní DNA přilehlé a uložené takovým způsobem, že oba geny jsou pod kontrolou jediného promotoru a poskytují jedinou premediátorovou RNA. Toto uspořádání je výhodné poněvadž umožňuje použití jediného transkripčního promotoru.

Konečně použití rekombinantních DNA podle vynálezu umožňuje použití transkripčních promotorů odlišného charakteru a zejména silných nebo slabých promotorů, regulovaných nebo konstitučních promotorů, tkáňově specifických nebo ubikvitárních promotorů a podobně. . .

Volba expresních signálů a respektivní poloha rekombi

- 14 nantních DND je obzvláště důležitá pro dosažení zvýšené exprese terapeutického genu a výrazného imunoprotekčního účinku.

V rámci obzvláště výhodného způsobu provedení vynálezu se používá defektní adenovir obsahující první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen, přičemž obě rekombinantní DNA jsou vloženy v úrovni oblasti E1 .

V rámci jiného obzvláště výhodného způsobu provedení vynálezu se používá defektní adenovir obsahující první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen vložený v úrovni oblasti El a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen vložený v oblasti E3.

Jak již bylo uvedeno výše, jsou adenoviry podle vynálezu defektními viry, což znamená, že jsou neschopné replikovat se autonomním způsobem v cílové buňce. Obecně je tedy genom defektního adenovirů podle vynálezu zbaven alespoň sekvencí nezbytných pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buč odstraněny ({-.zcela nebo částečně) nebo mohou být učiněny nefunkčními anebo mohou být nahrazeny jinými sekvencemi a zejména terapeutickými geny. Defektní charakter adenovirů podle vynálezu je důležitým faktorem, poněvadž zajišťuje nerozšiřování se vektorů podle vynálezu po podání.

V rámci výhodné formy provedení vynálezu obsahují adenoviry podle vynálezu sekvence ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci a mají deleci celku nebo části genu E1.

Sekvence obrácené repetice (ITR) tvoří počátek replikace adenovirů. Tyto sekvence jsou lokalizované na koncích 3' a 5' virálního genomu (viz obr.1), odkud mohou být snadno izolovány klasickými technikami molekulární biologie, které jsou pro technika v daném oboru dobře známými technikami. Nukleotidová sekvence sekvencí ITR lidských adenovirů (zejména

- 15 sérotypů Ad2 a Ad5) je popsána v literatuře a to stejně jako psích adenovirů (zejména CAV1 a CAV2). Pokud jde například o adenovir Ad5, odpovídá levá sekvence ITR oblasti obsahující nukleotidy 1 až 103 uvedeného genomu.

Enkapsidační sekvence (také označovaná jako sekvence Psi) je nezbytná pro enkapsidaci virální DNA. Tato oblast musí být přítomna k tomu, aby umožnila přípravu defektních rekombinantních adenovirů podle vynálezu. Enkapsidační sekvence je lokalizována v genomu adenovirů mezi levou ITR (5') a genem E1 (viz obr.l). Tato sekvence může být izolována nebo uměle syntetizována klasickými technikami molekulární biologie. Nukleotidová sekvence enkapsidační sekvence lidských adenovirů (zejména sérotypů Ad2 a Ad5) je popsána v literatuře, stejně jako enkapsidační sekvence psích adenovirů (zejména CAV1 a CAV2). Pokud jde o adenovir Ad5, odpovídá enkapsidační sekvence oblasti obsahující nukleotidy 194 až 358 genomu.

Výhodněji obsahují adenoviry podle vynálezu sekvence ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci a mají deleci celku nebo části genů E1 a E4.

V rámci výhodné formy provedení vynálezu je genom adenovirů podle vynálezu zbaven delecemi celku nebo části genů E1, E3 a E4 a výhodně také celku nebo části genů E1, E3, L5 a E4.

Adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny z adenovirů různých původů. Ve skutečnosti existují různé typy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, avšak které mají srovnatelnou genetickou organizaci. Takto mohou být instrukce popsané v přihlášce vynálezu odborníkem snadno použity pro libovolný typ adenovirů.

Adenoviry podle vynálezu mohou být lidského, zvířecího nebo smíšeného (lidského a zvířecího) původu.

Pokud jde o adenoviry lidskéhopůvodu,dává se přednost použití adenovirů zařazených do skupiny C. Z různých sérotypů lidských adenoviru se v rámci vynálezu přednostně používají adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5).

Jak již bylo uvedeno výše, mohou být adenoviry podle vynálezu rovněž zvířecího původu nebo mohou obsahovat sekvence pocházející z adenoviru zvířecího původu. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že adenoviry zvířecího původu jsou schopné infikovat s vysokou účinností lidské buňky a že jsou neschopné propagovat se v lidských buňkách, ve kterých byly testovány (viz přihláška FR 93 05954). Přihlašovatel také prokázal, že adenoviry zvířecího původu nejsou nikterak transkomplementovány adenoviry lidského původu, což eliminuje jakékoliv rekombinaČní a propagační riziko in vivo v přítomnosti lidského adenoviru, které by jinak mohlo vést k tvorbě infekčních částic. Použití adenoviru nebo oblasti adenoviru zvířecího původu je tedy obzvláště výhodné vzhledem k tomu, že je tak ještě dále sníženo riziko spojené s použitím viru jako vektoru v genové terapii.

Adenoviry zvířecího původu použitelnými v rámci vynálezu mohou být adenoviry psího, bovinního, murinního (například: Mav1, Beard a kol.,Virology 75 (1990)81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (příklad: SAV). Z ptačích adenoviru lze zejména uvést sérotypy 1 až 10 dostupné v ATCC, jako například kmeny Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ACTT VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A(ATCC VR-829), T8-A(ATCC VR-830), K-11(ATCC VR-921), nebo také kmeny ATCC VR-831 až 835. Z bovinních adenovirů lze použít různé známé sérotypy, a zejména sérotypy dostupné v ATCC (typy 1 až 8) pod odkazy ATCC VR-313, 314, 639-649, 768 a 769. Rovněž je možné uvést murinní adenoviry FL (ATCC VR-550) a E20380 (ATCC VR-528), ovčí adenovir typu 5 (ATCC VR-1343) nebo typu 6 (ATCC VR-1340), prasečí adenovir 5359) nebo opičí adenoviry a to zejména adenoviry uvedené v ATCC pod čísly VR-591-594, 941-943, 195-203, a ipodobně.

Z adenovirů zvířecího původů se v rámci vynálezu výhod ně používají adenoviry nebo oblasti adenovirú psího původů a zejména všechny kmeny adenovirú CAV2 /kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-80)/. Psí adenoviry jsou předmětem četných strukturních studií. V rámci dosavadního stavu techniky (spi-: bey a kol.,J.Gen.Virol.70(1989 )165) byly takto popsány úplné restrikční mapy adenovirú CAV1 a CAV2 a rovněž byly klonovány a sekvencovány geny E1a a E3, jakož i sekvence ITR (viz zejména Spibey a kol.,Virus Res.1 4(1989 ) 24 1 ; Linné, Virus Res. 23(1992)119,WO91/11525).

Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny různými způsoby.

První z těchto způsobů spočívá v transfekci defektního rekombinantního viru připraveného in vitro (buď ligací nebo ve formě plasmidu) do kompetentní buněčné řady, tj. do řady nesoucí v trans všechny funkce nezbytné ke komplementaci defektního viru. Tyto funkce jsou výhodně integrované do genomu buňky, což umožňuje vyvarovat se rekombinačním rizikům a poskytuje buněčné řadě zvýšenou stabilitu.

Druhý přístup spočívá v ko-transfekci do příslušné buněčné řady DNA defektního rekombinantního viru připraveného' in vitro (buď ligací nebo ve formě plasmidu) a DNA viru helper. Podle této metody není nezbytné, mít k dispozici kompetentní buněčnou řadu schopnou komplementovat všechny defektní funkce rekombinantního adenovirus Část těchto funkcí je ve skutečnosti komplementována virem helper. Tento vir helper musí být sám o sobě defektní a buněčná řada nese v trans funkce nezbyt né k jeho komplentaci. Z buněčných řad použitelných výhodně v rámci vynálezu při tomto druhém přístupu lze zejména uvést lidskou embryonální renální řadu 293, buňky KB, buňky Hela, MDCK, GHK, a podobně (viz příklady).

Potom se multiplikované vektory rekuperují, purifikují a amplifikují klasickými technikami molekulární biologie.

Podle variantního provedení je možné připravit in vitro

- 18 a to bu3 ligací nebo ve formě plasmidu DNA defektního rekombinantního viru nesoucí příslušné delece a obě rekombinantní DNA.Jak již bylo uvedeno výše, mají vektory podle vynálezu deleci celku nebo části některých virálních genů, zejména genů E1, E3, E4 nebo/a L5. Tato delece může odpovídat jakémukoliv typu potlačení působícímu na uvažovaný gen. Zejména se může jednat o potlačení celku nebo části kódující oblasti uvedeného genu nebo/a celku nebo části promoční oblasti transkripce uvedeného genu. Uvedená suprese se obecně provede na DNA defektního rekombinantního viru, například digescí pomocí restrikčních enzymů a potom ligací technikami molekulární biologie, jakož i technikami popsanými v příkladech. Rekombinantní DNA mohou být potom vloženy do této DNA enzymatickým štěpením a potom ligací v úrovni selekovaných oblastí a ve zvolené orientaci.

Takto získaná DNA, která tedy nese příslušné delece a obě rekombinantní DNA, umožňuje přímo generovat defektní rekombinanthí adenovir nesoucí uvedené delece a rekombinantní DNA. Tato první varianta je obzvláště vhodná pro realizaci rekombinantních adenovirů, ve kterých jsou geny uspořádány ve formě jediné transkriponí jednotky anebo pod kontrolou oddělených promotorů, které jsou však vloženy do stejného místa genomu.

Rovněž je možné připravit rekombinantní vir ve dvou etapách, umožňujících následné zavedení obou rekombinantních DNA. Takto se DNA prvního rekombinantního viru nesoucího příslušné delece (nebo část uvedených deleci) a jednu z rekombinantních DNA konstruuje ligací nebo ve formě plasmidu. Tato DNA se potom použije pro generování prvního rekombinantního viru nesoucího uvedené delece a jednu rekombinantní DNA. DNA tohoto prvního viru se potom izoluje a ko-transfekuje s druhým plasmidem nebo DNA druhého defektního rekombinantního viru nesoucího druhou rekombinantní DNA, příslušné delece (část nepřítomná na prvním viru) a oblast umožňující homologní rekombinaci. Tato druhá etapa takto ,generuje, .defektní rekombinantní vir nesoucí obě rekombinantní DNA. Tato varianta přípra

- 19 vy je obzvláště vhodná pro přípravu rekombinantních virů nesoucích obě rekombinantní DNA vložené do dvou různých oblastí genomu adenoviru.

Obě činidla podle vynálezu, tj.imunosupresor a rekombinantní adenovir mohou být formulovány tak, aby získané formulace byly vhodné pro topické, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální a další podání.

=4 Výhodně farmaceutická formulace nebo farmaceutické for- mulace obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče vhodné pro injikovatelnou formulaci. Může se zejména jednat o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý a· podobně, nebo směsi těchto solí) mající sterilní a izotonický charakter nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované kompozice, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku poskytují rekonstituované injikovatelné tekutiny .

Dávky imunosupresoru a adenoviru použité pro injekci mohou být závislé na různých faktorech, zejména na použitém způsobu podání, na léčené patologii, na genu, který má být exprimován nebo také na požadované době léčení.

Obecně se rekombinantní adenoviry podle vynálezu formu, „ . 4 14 lují a podávají ve formě dávek obsahujících mezi 10 a 10 6 1Ω • pfu/ml, výhodně mezi 10 a 10 pfu/ml. Výraz pfu (plaque forming unit) odpovídá infekční potenci uvažovaného roztoku * a je stanoven infikováním příslušné buněčné kultury a stanovením, obvykle po 5 dnech, počtu pláží infikovaných buněk. Techniky stanovení koncentrace pfu virálního roztoku jsou velmi dobře zdokumentované v literatuře. Pokud jde o imunosupresory, mění se jejich dávky a injekční podání podle jejich charakteru. Nastavení obou těchto parametrů je ve schopnostech odborníka v daném oboru.

- 20 Léková kombinace podle vynálezu může být použita pro léčení nebo prevenci četných patologických stavů. Podle terapeutického genu vloženého do jeho adenoviru může být uvedená kombinace použita pro léčení nebo prevenci genetických chorob (dystr fie, muskoviscidoza, atd.), neurodegenerativních chorob {Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, ALS, atd.), hyperproliferativních patologií (rakoviny, restenóza, atd.), patologií spojených s poruchamy koagulace nebo dyslipoproteinemiemi, patologií spojených s virálními infekcemi (hepatitidy, AIDS, atd.), a dalších patologických stavů.

Předmětem vynálezu je rovněž každý způsob terapeutického ošetření, při kterém se použije nárokovaná léková kombinace .

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován formulací patentových nároků.

Stručný popis obrázků

Na připojených výkresech

- obr.1 znázorňuje genetickou organizaci adenoviru Ad5. Úplná sekvence adenoviru Ad5 je k dispozici na základě údajů zjištěných sekvencováním a umožňuje ý odborníkovi selekovat nebo vytvořit každé restrikč- ní místo a takto izolovat libovolnou oblast genomu.

- Obr.2 znázorňuje restrikční kartu adenoviru CAV2, kmen Manhattan (podle Spibey a kol., kterýžto odkaz již byl uveden výše).

- Obr.3 znázorňuje vektor pAD5-gp19k-betagal a

- obr.4 znázorňuje konstrukci adenoviru Ad-gpl9k-beta- -- - -- ·.. gal.,deltaE.1.,deltaEJ.· ...... .......

- 21 Metody klasicky používané v molekulární biologii, ja ko preprativní extrakce plasmidové DNA, odstředění plasmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinu fenolem nebo soustavou tvořenou směsí fenolu a chloroformu, precipitace DNA v solném prostředí ethanolem nebo isopropanolem, transformace do Escherichia coli, atd., jsou o sobě známé a hojně popsané v literatuře /Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1982; Ausubel F.M. a koi. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987/.

Plasmidy typu pBR322, pUC a fagy série M13 jsou komerčně dostupné (Bethesda Research Laboratories).

Za účelem ligace mohou být fragmenty DNA separovány podle velikosti elektroforézou na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, orecipitovány ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA ligázy fagu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Naplnění proemineitních konců 5' může být provedeno Kle nowovým fragmentem z DNA polymerázy I od E.coli (Biolabs) podle specifikací dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA polymerázy fagu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5 ' se provede šetrným ošetřením nukleázou S1.

Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena metodou vyvinutou Taylor-em a kol. /Nucleic Acids Res. 13(1985)8749-8764/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.

Enzymatická amplifikace fragmentu DNA technikou nazývanou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K.

- a -kcl. , Science 230 ( 1 985.) 1350-1354; Mullis K. B... a Fallona F.

- 22 A.,Meth.Enzym. 1 55(1987)335-350/ může být provedena za použití činidla DNA thermal .cycler (Perkin Elmer Cetus) podle specifikací výrobce.

Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sanger-em a kol. /Proč.Nati.Acad.Sci.USA,74 (1977)5463-5467/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.

Použité buněčné řady

V následujících příkladech se použijí nebo mohou být použity následující buněčné řady:

- lidská embryonální renální řada 239 (Graham a kol., J.Gen.Virol.36 (1977)59). Tato řada obsahuje zejména ve formě integrované ve svém genomu levou část genomu lidského adenoviru Ad5 (12 %).

- Lidská buněčná řada KB: pocházející z lidského, .epidermálního karcinomu. Tato buněčná řada je dostupná v ATCC (referenční číslo: CCL17), stejně jako podmínky umožňující její kultivaci.

- Lidská buněčná řada Hela: pochází z karcinomu lidského epitelu. Tato řada je dostupná v ATCC (refereční číslo: CCL2), stejně jako podmínky umožňující její kultivaci.

- Psí buněčná řada MDCK: podmínky kultivace buněk MDCK byly popsané zejména Macatney-em a kol., Science 44(1988)9.

- Buněčná řada gm DBP6 (Brough a kol., Virology 190 (1992) 624). Tato buněčná řada je tvořena buňkami Hela nesoucími gen E2 adenoviru pod kontrolou LTR z MMTV.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

- 23 Konstrukce defektních rekombinantních adenovirů obsahujících terapeutický gen (gen LacZ z E.coli) pod kontrolou promotoru LTR od RSV a gen gp!9k pod kontrolou promotoru LTR od RSV, přičemž oba geny jsou vloženy v úrovni oblasti El .

Tyto adenoviry byly konstruovány homologní rekombinací mezi plasmidem nesoucím levou část adenovirů Ad5, obě reKombinantní DNA a oblast adenovirů Ad5 (odpovídající proteinu IX) a DNA defektního adenovirů nesoucího různé delece

1. Konstrukce vektoru pAD5-gp19k-beta-gal (obr.3)

1.1. Konstrukce plasmidu pGEM-gp19k

Plasmid pAD5-gp19k-beta-gal obsahuje sekvenci DNA kódující protein gp19k adenovirů. Tento plasmid byl konstruován následujícím způsobem. Byl izolován fragment Xbal genomu divoké ho adenovirů Ad5 obsahujícího oblast E3 a tento byl Klonován do odpovídajícího místa plasmidu pGEM (Promega) za účelem generování plasmidu pGEM-E3. Fragment Hinfl obsahující kódující sekvenci proteinu gp!9k (nukleotidy 28628 až 29634 divokého adenovirů Ad5) byl potom izolován z plasmidu pGEM-E3. Konce tohoto fragmentu se uvolní působením Klenowova fragmentu DNA polymerázy od E.coli (viz obecné techniky molekulární biologie), načež se získaný fragment klonuje do místa Smál plasmidu pGEMzf+ (Promega).

Získaný plasmid byl označen jako pGEM-gp19k (obr.3).

1.2. Konstrukce vektoru pAD5-gp19k-beta-gal.

Tento příklad popisuje konstrukci plasmidu obsahujícího jednu nebo obě rekombinantní DNA obsahující jejich vlastní promotor, levou část genomu adenovirů a suplementární část (protein pIX)umožňující homologní rekombinací. Tento vektor byl konstruován z plasmidu pAd.RSvbetaGal následujícím zpuso

- --bem . -, ...................

- 24 Plasmid pAd.RSVbetaGal obsahuje v orientaci 5' směrem k 3' :

- fragment PvuII odpovídající levému konci adenovirů Ad5 obsahující: sekvenci ITR, počátek replikace, enkapsidační signály a amplifikátor,

- gen kódující beta-galaktosidázu pod kontrolou promotoru RSV (vir Rousova sarkomu),

- druhý fragment genomu adenovirů Ad5, který umožňuje homologní rekombinaci mezi plasmidem pAd.RSVbetaGal a adenovirem d1324. Plasmid pAd.RSVbetaGal byl popsán Stratford-Perricaudet-em a kol. (J.Clin.Invest. 90(1992)626).

Plasmid pAd.RSVbetaGal byl nejdříve digerován enzymy Eagl a Clal. Tato digesce generuje první fragment nesoucí zejména levou část adenovirů Ad5 a promotor LTR viru RSV, Paralelně se vyřízne enzymy Eagl a Xbal plasmid pAdRSVbetaGal. To poskytne druhý typ fragmentu nesoucího zejména promotor LTR viru RSV, gen LacZ a fragment genomu adenovirů Ad5, který umožní homologní rekombinaci. Fragmenty Clal-Eagl a Eagl-Xbal se potom ligují v přítomnosti fragmentu Xbal-Clal plasmidu pGEMgp19k (příklad 1.1) nesoucího kódující sekvenci gp19k (viz obr.3). Takto získaný vektor označený jako pAD5-gp19k-betaGal tedy obsahuje:

- fragment PvUII odpovídající levému konci adenovirů Ad5 obsahujícímu : sekvenci ITR, počátek replikace, enkapsidační signály a amplifikátor E1A,

- sekvenci kódující gp!9k pod kontrolou promotoru viru RSV (vir Rousova sarkomu),

- gen kódující beta-galaktosidázu pod kontrolou promotoru viru RSV (vir Rousova sarkomu) a

- druhý fragment genomu adenovirů Ad5, který umožňuje homologní rekombinaci.

2. Konstrukce rekombinantních adenovirů

2.1. Konstrukce rekombinantního adenovirů s delecí v oblasti E1, nesoucího obě rekombinantní DNA vložené ve stejné orientaci v úrovni oblasti E1

Vektor pAD5-gp19k-beta-gal byl linearizován a kotransfekován s deficitním adenovirálním vektorem v genu El do buněk helper (řada 293) přinášejících v trans funkce kódované oblastmi El (E1A a E1B) adenovirů.

Přesněji definováno, adenovir Ad-gpl9k-beta-gal,delta E1 se získá homologní rekombinací in vivo mezi adenovirem Ad-RSVbeta-gal (viz Stratford-Perricaudet, kterýžto odkaz byl citován výše) a vektorem pAD5-gp19k-beta-gal podlé následujícího protokolu: plasmid pAD5-gp19k-beta-gal linearizovaný pomocí XmnI a adenovir Ad-RSVbeta-gal linearizovaný enzymem Clal se kotransfekují do buněčné řady 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem umožnění homologní rekombinace. Takto generované rekombinantní adenoviry se potom selekují purifikací na desce. Po izolaci se DNA rekombinantního adenoviru amplifikuje v buněčné řadě 293, což vede k supernatantu* nad kultivačním prostředím obsahujícímu nepurifikovaný rekom1 o binantní defektní adenovir mající koncentraci asi 10 pfu/ml.

Virální částice se obecně purifikují odstředěním na gradientu chloridu česného o sobě známou technikou (viz zejména Graham a kol., Virology 52(1973)456). Adenovir Ad-gp19k-betagal,deltaE1 může být přechováván při'teplotě -80 °C ve 20% glycerolu.

2.2. Konstrukce rekombinantního adenovirů s delecemi v oblastech E1 a E3, nesoucího obě rekombinantní DNA vložené ve stejné orientaci v úrovni oblasti E1 (obr.4).

Vektor pAD5-gpl9k-beta-gal se linearizuje a kotransfekuje adenovirálním vektorem deficitním v genech E1 a E3 do bu

- 26 něk helper (řada 293) přinášejících v trans funkce kódované oblastmi E1 (E1A a E1B) adenoviru.

Přesněji definováno, adenovir Ad-gpl9k-beta-gal,delta El,delta E3 se získá homologní rekombinací in vivo mezi mutantním adenovirem Ad-dl1324 (Thimmappaya a kol·., Cell 31 (1982) 543) a vektorem pAD5-gp19k-beta-gal podle následujícího protokolu: plasmid pAD5-gp19k-beta-gal a adenovir Ad-d11324 linearizovaný enzymem Clal se kotansfekují do buněčné řady 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem umožnění homologní rekombinace. Rekombinantní adenoviry, které byly takto získány se potom selekují purifikací na desce. Po izolaci se rekombinantní adenovir amplifikuje v buněčné řadě 293, což vede k supernatantu nad kultivačním prostředí obsahujícímu nepurifikovaný rekombinantní defektní adenovir mající koncentraci asi 10¹⁰ pfu/ml.

Virální částice se obecně purifikují odstředěním v gradientu chloridu česného o sobě známou technikou (viz zejména Graham a kol.,Virology 52(1973)456). Genom rekombinantního adenoviru byl potom ověřen analýzou southern blot. Adenovir Ad-gp19k-beta-gal,deltaE!,deltaE3 může být přechováván při teplotě -80 °C ve 20¾ glycerolu.

Příklad 2

Prokázání imunoprotekční aktivity lékové kombinace podle vynálezu dospělých myších samiček DBA/2 se náhodně rozdělí do šesti skupin po deseti myších a tyto myši se ošetří podle následujícího injekčního protokolu:

-skupina 1a:

dostane intraokulární injekci 1O^ug monoklonálních protilátek -an- ti -CD 3 . ve-dnech -2, -1·, 1-,-2, 3-, -4- a—5 a v den-.O dostane intravenozní injekci 4.10 pfu viru Ad-RSVbeta-gal (viz

- 27 Stratford-Perricaudet a kol, viz výše),

-skupina 1b:

je ošetřena stejným způsobem jako skupina 1a za použití koncentrace viru 4.10$ pfu viru Ad-gp 19k-beta-gal (obr.4), -skupina 2a:

dostane intraperitoneální injekci 250^ug monoklonálních protilátek anti-CD4 ve dnech -2,-1, 1, 4 a 7 a v den 0 dostane g intravenózní injekci 4.10 pfu viru Ad-RSVbeta-gal,

-skupina 2b:

je ošetřena stejným způsobem jako skupina 2a za použití virální koncentrace 4,10$ pfu viru Adgp!9k-beta-gal,

-skupina 3a:

dostane intravenózní injekci 4.10$ pfu Ad-beta-gal bez současného podání imunosupresoru a

-skupina 3b:

dostane intravenózní injekci 4.10$ pfu Ad-gp19k-beta-gal bez současného podání imunosupresoru.

V různých časech byly vždy dvě zvířata z každé skupiny utracena za účelem odběru játer a sleziny.

2.1. Imunofluorescentní analýza rozdělení hlavních subpopulací lymfocytů (CD3+, CD4+ a CD8+) uvnitř splénocytů ,odebraných v den 15 po injekci

Suspenze izolovaných buněk se připraví z odebraných slezin. Vzorek těchto buněk se analyzuje imunofluorescenčně pomocí specifických protilátek pro každou lymfocytovou^ubpopulaci. Odečítání flúorescentních búhěRbyIo provedeno za-po

- 28 - *-————---------užití cytofluorometru (FACS Schan-Becton Dickinson). Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce I.

Tabulka I

	Skupina 3a Ad-^gal	Skupina 3b Ad-Pgalgpl9k	Skupina 1a anti CD3/ Ad-pgal	Skupina 2a anti CD4/ Ad^gaJ
	% buněk exprimunících beta-gal na povrchu buněk
CD3	20,4	17,5	20,6	21	5,4	6,1	12	10,3
CD4	13,4	12,6	15,3	16,8	4,4	5,1	2,7	4,1
CD8	5,5	5,5	6,1	6	20,2	23	7,9	6,7

Z tabulky je zřejmý jednoznačný úbytek buněk CD3+, CD4 + a CD8+ u zvířat ošetřených protilátkou anti-CD3 a selektivní úbytek buněk CD4+ u zvířat ošetřených protilátkou anti~CD4. .

2.2. Analýza cytotoxická kapacity splenocytů odebraných v den 32 po injikci a stimulovaných in vitro vůči histokompatibilním cílům exprimujícícm beta-gal

Druhý vzorek splenocytú izolovaných z ošetřených zvířat byl kultivován in vitro po dobu 4 dnů v přítomnosti buněk P815 exprimujících na jejich povrchu beta-galaktosidázu. Po ukončení.kultivace se vyhodnotí cytotoxická aktivita splenocytů vůči cílovému P815-beta-gal značenému radioaktivním izotopem Cr^\ Cytotoxická aktivita vyjádřená procentickou cytolýzou byla stanovena konvenčním způsobem v přítomnosti různých poměrů efektivních buněk a cílových buněk. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II.

- 29 Tabulka II

Skupina	2b	3A
Ošetření	Anti-CD4/ Ad-Pgal-gpl9k	AD-Pgal
Poměr efektivních a cílových buněk	Cytolýza	%)
80/1	4 2	13 14
40/1	2 1	13 9________
20/1	1 1	5 9
10/1	0 0	2 5__
5/1	_____________0 1_____________	1 2

Splenocyty, odebrané zvířatům, která byla ošetřena protilátkou CD4, tj. zvířatům skupiny 2b, vykazují jednoznačnou neutralizaci jejich cytotoxické kapacity.

2.3. Exprese aktivity beta-galaktosidázy v játrech po 15 a 32 dnech

Játra se rozdělí na úseky a vybarví X-gal za účelem zviditelnění (vyvíjení) aktivity beta-galaktosidázy a eosinem za účelem zviditelnění histologie řezu. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III

Tabulka III	Počet buněk exprimujících [3gal _____
15	32__________
Skupina 2a: (anti-CD4/ Ad-Pgal)	1	1
Skupina 2b: (anti-CD4/ Ad gpl9kpgal)	250	50
Skupina 3a: (Ad-βgal)________	3	0
Skupina 3b: (Ad gpl9k-Pgal)	25	0

- 30 Z výše uvedených výsledků vyplývá, že injekce protilátky anti-CD4 sdružená s injekcí Adgpl9k-beta-gal indukuje výrazně prolongovanou expresi uvažovaného genu. Takto je možné pozorovat 30 dnů po injekcích v případě skupiny 2b významnou beta-galaktosidázovou aktivitu. Toto prodloužení, které může být interpretováno jako důsledek jevu tolerance indukovaného podle vynálezu, je výrazně vetší, než je prodloužení, které by bylo možné očekávat v případě jednoduchého součtu účinků imunosupresoru anti-CD4 a rekombinantního adenoviru Ad gp19k -beta-gal.

Navíc nebyla po 30 dnech v případě skupiny 2b pozorována žádná zánětová reakce.

Claims (25)

NÁROKY

1. Léková kombinace alespoň jednoho imunosupresního činidla a alespoň jednoho rekombinantního adenoviru, jehož genem obsahuje první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen pro následné, přerušované nebo/a časově současné použití vhod né pro exogenovou transfekci in vivo nebo/a ex-vivo.

2. Léková kombinace podle nároku 1, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo se výhodně zvolí z množiny zahrnující cyklosporin, FK506, azathioprin, kortikosteroidy a monoklonální a polyklonální protilátky.

3. Léková kombinace podle nároku 2, vyznačená tím, že se jedná o protilátky schopné inaktivovat imunní molekuly nebo vyvolat destrukci buněk nesoucích tyto molekuly.

4. Léková kombinace podle nároku 3, vyznačená tím, že protilátka se zvolí z množiny zahrnující anti-CD4, anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFA-1 a CTLA4Ig.

5. Léková kombinace roků, vyznačená terapeutický protein.

podle t í některého z předcházejících nám , že terapeutický gen kóduje

6. · Léková kombinace podle některého z -nároků 1 až. 4, .v y značená tím, že terapeutický gen kóduje terapeutic kou RNA.

7, Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunoprotekčním genem je gen, jehož produkt působí na aktivitu hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na aktivitu cytokinů.

8. Léková kombinace podle nároku 7, vyznačená tím, že imunoprotekčním genem je gen, jehož produkt inhibuje alespoň částečně expresi proteinů komplexu MHC nebo antigenovou prezentaci.

9. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunoprotekční gen je zvolen z množiny zahrnující gen gp19k adenovirú, gen ICP47. viru herpes a gen UL18 cytomegaloviru.

10. Léková kombinace podle některého z předcházejících ná roků, vyznačená tím, že obě rekobinantní DNA genomu adenovirú tvoří jedinou transkripční entitu.

11. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA obsahují každá svůj transkripční. promotor, přičemž tyto promotory jsou buď identické nebo odlišné.

12. Léková kombinace podle nároku 11, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy ve stejné orientaci .

13. Léková kombinace podle nároku 11, vyznačená ť í m , že obě rékbmbiňáňťní DNA jsou' vloženy v opačné· orien tací.

14. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároku, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy do stejného místa genomu adenovirů, výhodně v úrovni oblastí E1, E3 nebo E4.

15. Léková kombinace podle nároku 14, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy v úrovni oblasti E1.

16. Léková kombinace podle některého z nároků 1 až 13, vy značená t í m , že obě rekombinantní DNA jsou vloženy do různých míst genomu adenovirů.

17. Léková kombinace podle nároku 16, vyznačená tím, že jedna z rekombinantních DNA je vložena v úrovni oblasti E1 a druhá rekombinantní DNA je vložena v úrovni oblas ti E3 nebo E4.

18. Léková kombinace podle některého z předcházejících ná roků, vyznačená tím, Že adenovirem je defektní rekombinantní adenovir obsahující sekvence ITRa sekvenci umožňující enkapsidaci, a nesoucí deleci celku nebo části ge nů E1 a E4.

19. Léková kombinace podle nároku 18, vyznačená tím, že se jedná o adenovir obsahující sekvence ITRa sekvenci umožňující enkapsidaci, a nesoucí deleci celku nebo části genů E1, E3 a E4,

20. Léková kombinace podle některé z nároků 1 až 19, vyznačený tím, že se jedná o adenovir, jehož genom je deleci zbaven celku nebo části genů E1, E3, L5 a Έ4.

21. Léková kombinace podle některého z předcházejících ná

- 34 roků, vyznačený tím, že rekombinantní adenovir je lidského, zvířecího nebo smíšeného původu.

22. Léková kombinace podle nároku 21, vyznačená tím, že rekombinantní adenoviry lidského původu jsou zvoleny z adenovirů zařazených do skupiny C, výhodně z rekombinantních adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5).

•

23. Léková kombinace podle nároku 22, vyznačená tím, že adenoviry zvířecího původu jsou zvoleny z množiny zahrnující psí, bovinní, murinní, ovčí, prasečí, ptačí a opičí adenoviry.

24. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo je injikováno před a po injekci adenoviru.

25. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo a rekombinantní adenovir se injikují současně.