CZ271198A3 - Biokonjugáty manganu nebo komplexy železa makrocyklických ligandů obsahujících dusík, působící jako katalyzátory pro dismutaci superoxidu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin působících jako katalyzátory pro dismutaci superoxidu. Vynález se týká komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které katalyticky dismutují superoxid. Z jiného hlediska se vynález týká komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které jsou konjugovány s cílovou biomolekulou.

Dosavadní stav techniky ..... ....... .....................

Enzym superoxid dismutáza katalyzuje přeměnu superoxidu na kyslík a peroxid vodíku podle rovnice (1) (zde uváděna pod pojmem dismutace).

O2 + O2 ~ + 2H —> O2 + H2O2 iU reaktivních kyslíkových metabolitů odvozených od superoxidu se předpokládá jejich podíl na patologickém procesu tkáně u řady zánětlivých onemocnění a poruch, jako například při reperfuzním poranění ischemického myokardu, zánětlivém onemocnění střev, revmatoidní arthritidě, osteoarthritidě, atheroskleróze, hypertenzi, metastázích, psoiráze, rejekci transplantovaných orgánů, poškozeních vyvolaných radioaktivním zářením, astmatu, chřipce, mozkové příhodě, popáleninách a traumatu. Viz například Bulkley, G. B., Reactive oxygen metabolites and reperfusíon injury: aberrant triggering of reticuloendothelial function, The Lancet, sv. 344, strany 934-936, 1, října, 1994; Grisham, Μ. B., Oxidants and free radícals in inflamatory bowel disease, The Lancet, sv. 344, strana 859-861, 24. října, 1994; Cross, C. E. a kol., Reactive oxygen species and the lung, The Lancet, sv. 344, strana 930-933, 1. října, 1944; Jenner P., Oxidatíve damage in neurodegenerative disease, The Lancet, sv. 344, strana 796-798, 17. října, 1944; Ceruttí, P. A., Oxy-radicals and cancer, The Lancet, sv. 344, strana 862-863, 24. října 1994; Simic, M. G., a kol., Oxygen Rradicals in Biology and Medicine, Basic Life Science, Vol. 49, Plenům Press, New York a Londýn, 1988; Weiss J. Cell. Biochem., 1991 Suppl. 15C, 216 Abstrakt C110 (1991); Petkau, A., Cancer Treat. Rev. 13, 17 (1986); McCord, J. Free Radícals Biol. Μβά.,_2^ 307 (1986); a Bannister, J. V. a kol., Crit. Rev. Biochem., 22, 111, (1987). Odkazy z The Lancet uvedené výše pojednávají * v ,« « « * ». » » ·

99999« · 9 9 ··· · 9

9 9 9 9 » 9 9 • 9 9 »·· 9 99 ·9 99 -y ο souvislosti mezi volnými radikály odvozenými od superoxidu a různými onemocněními. Přesněji, Bulkleyovy a Grishamovy odkazy přímo pojednávají o spojitosti mezi dismutací superoxidu a konečnou léčbou onemocnění.

Je též známo, že superoxid hraje roli při poruše vascular relaxing faktoru pocházejícího z endotelinu (EDRF), který byl identifikován jako oxid dusnatý (NO), a že EDRF je chráněn před porušením superoxid dismutázou. Tento fakt předpokládá hlavní úlohu aktivovaných kyslíkových částic odvozených od superoxidu v patogeneze vazospazmu, trombózy a atherosklerózy. Viz například Gryglewski, R. J. a kol , Superoxide Anion is Involved in the Breakdown of Endothelium-derived Vascular Relaxing Factof¹, Nátuře, sv. 320, strana 454-456 (1986) a Palmer, R. M. J. a kol., ” Nitric Oxide Release Accounts fot the Biological Activity of Endothelium Derived Relaxing Factor”, Nátuře, sv. 327, strana 523-526 (1987). ...... ................

Klinické úspěchy a studie na zvířatečh $ přirozenými, rekombinantními a modifikovanými enzymy superoxid dismutázy; které byly ukončeny nebo probíhají, dokazují terapeutický účinek snížené hladiny superoxidu u chorobných stavů uvedených výše. Vznikla však spousta problémů s použitím enzymů jako potenciálních terapeutických látek, zahrnující nedostatek aktivity pro orální aplikaci, krátký poločas in vivo, imunogenicitu enzymů, které nejsou odvozeny od lidských, a špatnou distribuci v tkáních.

Komplexy manganu nebo železa patnáctičlenných ligandú obsahujících dusík, které mají nízkou molekulovou hmotnost, napodobují funkci superoxid dismutázy (SOĎ) a jsou využitelné jako terapeutické látky. Tímto se odstraní mnoho problémům spojeným s enzymy SOD. Žádaná je schopnost přesně napodobit SOD k požadovanému účinku v těle, kde může být sloučenina zakoncentrována. U nezacílené sloučeniný’ jsou někdy nezbytné zvýšené dávky pro dosažení účinné koncentrace na požadovaném místě. Tyto zvýšené dávky mohou mít někdy za následek nežádoucí účinky u pacienta.

Nyní bylo zjištěno, že makrocykly nebo komplexy manganu nebo železa podle vynálezu mohou být připojeny, to znamená konjugovány, s jednou nebo více cílovou molekulou (molekulami) pomocí vazebné skupiny za tvorby cílové biomolekulymakrocyklu nebo cílové biomolekuly-komplexního konjugátu s manganem.

r »44 4 · ·· ·· · · · · · • ·4· 44 4

4 4 · • 4 4 4 4 • 4 4 . 44 4 4

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou nové biokonjugáty komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které mají nízkou molekulovou hmotnost, napodobují funkci superóxid dismutázy (SOD), a jsou využitelné jako terapeutické látky při stavech zánětlivého onemocnění nebo poruchách, které jsou vyvolány, alespoň částečně, superoxidem. Dalším předmětem vynálezu jsou nové biokonjugáty manganatých nebo železitých komplexů patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, které jsou využitelné jako kontrastní látky při magnetické rezonanci (MRI) s vyšší kinetickou stabilitou a lepší vazbou vodíku. Jiným předmětem vynálezu jsou biokonjugáty komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahující dusík, které mohou být cíleny na specifické místo v těle.

Podle vynálezu jsou biokonjugáty komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahujících dusík, vytvořeny tak, že (1) jedna až pět R” skupin je připojených k biomolekule pomocí vazebné skupiny, (2) X, Y nebo Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny, nebo (3) jedna až pět ’’R” skupin á jedna z X, Y nebo Z jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny; a biomoiekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající ze steroidů, hydrogenuhličitanů, mastných kyselin, aminokyselin, peptidů, proteinů, protilátek, vitramínů, lipidů, fosfolipidů, fosforečnanů, fosfonátů, nukleových kyselin, enzymových substrátů,, enzymových inhibitorů a enzymových receptorových substrátů a vazebná skupina je odvozena od substituentu připojenému k R” skupině nebo X, Y a Z, která je reaktivní v biomolekule, a je vybírána ze skupiny sestávající z -NH₂, -NHR10, -SH, -OH, -CÓÓH, -COOR10, CONH₂, -NCO, -NCS, -COOX”, alkenylu, alkinylu, halogenidu, p-toluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde Rw je alkyl, aryI, nebo alkylaryI a X” je halogeníd.

Vynález je zaměřen na biokonjugáty komplexů manganu nebo železa patnáctičlenných makrocyklických ligandů obsahující dusík, které katalyzují přeměnu superoxidu na kyslík a peroxid vodíku. Tyto komplexy jsou představovány obecným vzorcem I:

• 4 » 4 4« • 4 44*4 « 4 « »44 • 44*4 · • 4 4 4

44 44

kde R, R’, Ri, R/. R2, R2 , R3, R3, R4. R4, Rs, Rs, Re. Re, R7, R₇, Re, Rs, Rg a R_g představují nezávisle vodík, alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylalkyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl,. alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklické, arylové a aralkylové zbytky a zbytky připojené k α-uhlíku a-aminokyseliny; nebo R1 nebo R/ a R₂ nebo R₂, R3 nebo R3 a R4 nebo R4 , Rs nebo Rg a R₆ nebo R₆, R₇ nebo R₇ a Re nebo Re a Rg nebo Rg a R nebo R spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny tvoří nezávisle nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený kruh se 3 až 20 uhlíkovými atomy; nebo R nebo R a Rj nebo Ri a R₂ nebo R₂, R3 nebo R3 a R4 nebo R4 , R₅ nebo R₅ a Re nebo R6, R₇ nebo R₇ a R₈ nebo Re a Rg nebo Rg a R nebo R spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří nezávisle heterocyklus se 2 až 20 uhlíkovými atomy, obsahující dusík, za předpokladu, že pokud heterocyklus obsahující dusík je aromatický heterocyklus, který neobsahuje vodík připojený k dusíku, vodík připojený k dusíku uvedeného vzorce, tento dusík je též v makrocyklu a skupina R připojená ke stejnému uhlíkovému atomu makrocyklu není přítomna; a jejich kombinace; a kde (1) jedna až pět ”R skupin je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny, (2) jedna z X, Y a Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny, nebo (3) jedna až pět ”R” skupin a jedena z X, Y a Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny; a biomolekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající ze steroidů, hydrogenuhličitanů, mastných kyselin, aminokyselin, peptidů, proteinů, protilátek, vitramínů, lipidů, fosfolipidú, fosforečnanů, fosfonátů, nukleových kyselin, enzymových substrátů, enzymových inhibitorů a enzymových receptářových substrátů, a vazebná skupina je odvozena od substituentu připojenému k ”R” skupině nebo X, Y a Z, která je reaktivní s biomolekulou, a je vybtrána ze skupiny sestávající z -NH_2l -NHR₁₀, -SH, -OH, -COOH, -COOR10, -CONH₂₎ -NCO, 5 · fc · · ·· • » ·♦·· · · · · *·· » * *«· · * · · · *« * ··» «»· *« ·ι

NCS, -COOX, alkenylu, alknylu, halogenidu, p-toluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R₁₀ je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a X” je halogeníd; a kde M je Mn nebo Fe.

X, Y a Z představují vhodné ligandy nebo náboj neutralizující anionty, které jsou odvozeny od jakéhokoli monodentátového nebo polydentátového ligandu nebo ligandového systému nebo jeho odpovídajícího aniontu (například kyseliny benzoové a benzoátového aniontu, fenolového nebo fenoxidovéhp aniontu, alkoholu nebo alkoxidového aniontu). X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující halogeníd, oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, dioxygen, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniak, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloarylamino, aminoxid, hydrazin, alkylhydrazin, arylhydrazin, oxid dusičný, kyanid, kyanát, thiokyanát, izokyanát, izothiokyanát, alkylnitril, arylnitril, alkylizonitryl, arylizonitril, dusičnan, dusitan, azido, alkylsulfonovou kyselinu, arylsulfonovou kyselinu, alkylsulfoxid, arylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenovou kyselinu, arylsulfenovou kyselinu, alkylsulfínovou kyselinu, arylsulfinovou kyselinu, alkylthiolkarboxylovou kyselinu, arylthiolkarboxylovou kyselinu, alkylthiolthiokarboxylovou kyselinu, arylthiolthiokarboxylovou kyselinu, alkylkarboxylovou kyselinu (jako například kyselinu octovou, kyselinu trifluoroctovou, kyselinu oxalovou), arylkarboxylovou kyselinu (jako například kyselinu benzoovou, kyselinu ftalovou), močovinu, alkylmočovinu, arylmočovinu, alkylarylmočovinu, thiomočovinu, aryIthiomočovinu, alkylarylthiomočovinu, síran, siričitan, hydrogensíran, hydrogensiřičitan, thiosíran, thiosiřičitan, hydrosiřičitan, alkylfosfan, arylfosfan, alkylkfosfinoxid, arylfosfinoxid, alkylarylfosfinoxid, alkylfosfinsulfid, aryífosfin sulfid, alkylarylfosfinsulfid, alkylfosforitou kyselinu, arylfosforitou kyselinu, alkylfosfinovou, kyselinu, aryl fosfínovou kyselinu, alkylfosfinitou kyselinu, aryífosfinitou kyselinu, fosforečnan, thiofosforečnan, fosforitan, pyrofosforitan, trifosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, alkylquanidin, arylquanidin, alkylarylquanidin, alkylkarbamát, arylkarbamát, alkylarylkarbamát, alkylthiokarbamát, arylthiokarbamát, alkylaryltrhiokarbamát, alkyldithiokarbamát, aryldithiokarbamát, alkylaryldithiokarbamát, hydrogenuhličitan, uhličitan, chloristan, chlorečnan, chloritan, chlornan, bromistan, bromečnan, bromitan, bromnan, tetrahalogenmanganan, tetraflourborát, hexafluorfosforeečnan, hexaflorantimoničnan, fosfornan, jodáičnan, jodistan, metaboritan, tetraarylboritan, tetraalkylboritan, tertrát, šťavelan, jantaran, citrát, askorbát, sacharinát, aminokyselina, hydroxamová kyselina, thioparatoluensulfonát, a anionty iontoměničové pryskyřice, nebo systémy, kde jden nebo více X, Y a Z je nezávisle připojen k jedné nebo více skupinám R”, kde n je 0 nebo 1. Výhodné ligandy pro X, Y a Z zahrnují halogenid, organickou kyselinu, dusičnanové a hydrogenuhličitanové aníonty.

Vazebné skupiny, zde také pod názvem linkr”, jsou odvozeny od specifikovaných funkčních skupin připojených ke skupinám R nebo X, Y a Z a funkcí pojící se k biomolekule ke skupinám ”R” nebo X, Y a Z. Funkční skupiny jsou vybrány ze skupiny sestávající z -NH₂, -NHR₁₀, -SH, -OH, -COOH, -COOR₁₀, -CONH_2l -NCO, -NCS, COOX”, alkenylu, alkinylu, halogenidu, paratoluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde R₁₀ je alkyl, aryl, nebo alkylaryl a ”X” je halogenid. Běžně výhodnou alkenylovou skupinou je ethenyl a výhodnou alkinylovou skupinou je ethinyl. Funkční skupiny R nebo X, Y a Z jsou reaktivní s biomolekulou, to znamená reaktivní s funkční skupinou na steroidech, hydrogenuhličitanech, mastných kyselinách, aminokyselinách, peptidech, proteinech, protilátkách, vitramínech, lipidech, fosfolipidech, fosforečnanech, fosforitanech, nukleových kyselinách, enzymových substrátech, enzymových inhibitorech, enzymových receptorových substrátech a jiných cílových biomolekulách. Pokud je funkční skupina připojena ke skupinám ”R nebo X, Y a Z, reaguje s biomolekulou, funkční skupina je modifikována a tato odvozená funkční skupina je vazebnou skupinou. Například, pokud funkční skupina -NH₂ připojena ke skupině R“ rea„ guje se steroidem z příkladu 1, vazebnou skupinou je -NH-. Přesná struktura specifických vazrebných skupin je zřejmá odborníkům v této oblasti a závisí na specifické funkční skupině a vybrané biomolekule. Specifické reakční podmínky pro reakci funkční skupiny připojené ke skupinám ”R” nebo X, Y a Z s biomolekulou jsou odborníkům v této oblasti zřejmé.

Funkční skupina využitelná pro tvorbu vazebné skupiny, zde definovaná jako prekurzor vazebné skupiny” může být přítomna na skupinách R” v případě, že je připraven makrocyklus, nebo se může přidat nebo modifikovat po přípravě jejího makrocyklu nebo komplexu s manganem. Podobně, prekurzor vazebné skupiny může být přítomen na axiálním ligandu, to znamená na X, Y nebo Z, pokud se připraví komplex manganu nebo železa, nebo pokud se výměnná reakce axiálních liganů provede jako výměna axiálních liganů přítomných v komplexu manganu nebo železa.

Makrocyklus se může podle vynálezu vytvořit s manganem nebo železem před nebo po konjugaci s cílovou biomolekulou v závislosti na použité biomolekule. Konju7 gát makrocyklického komplexu a cílová biomolekula je zde definována jako biokonjugáť.

Využití léčiv je obecně známo odborníkům v této oblasti. Viz například J. A. Katzenellenbogen a kol., Journal of Nuclear Mediáne , Vol. 33, No. 4, 1992, 558, a J. A. Katzenellenbogen a kol., Bioconjugate Chemistry, 1991, 2, 353. Cílové látky jsou běžně biomolekuly. Biomolekuly podle vynálezu jsou biologicky aktivní molekuly, které jsou lokálně specifické, to znamená, že se koncentrují v určitém orgánu nebo tkáni. Biomolekuly jsou vybrány přesně podle distribuce biokonjugátu v tkáni prostřednictvím vazby na receptor, membránové asociace, membránové rozpustnosti, a podobně. Biomolekuly zahrnují například steroidy, hydrogenuhličitany (včetně monosacharidú, disacharidů a polysacharidů), mastné kyseliny, aminokyseliny, peptidy, proteiny, protilátky (včetně jejich polyklonálních a monoklonálních fragmentů),- vitamíny, lipidy, fosfolipidy, fosforečnany, fosforitany, nukleové kyseliny, enzymové substráty, enzymové inhibitory a enzymové receptorové substráty. Biomolekuly také zahrnují ty biomolekuly, které jsou kombinací biomolekul uvedených výše, například kombinaci steroidu s hydrogenuhličitanem, například digitonin.

Některé biomolekuly, které se mohou využít jako cílové pro určitý orgán nebo tkáň, jsou již známé, nebo jsou odborníkům v této oblasti zřejmé. Biomolekuly podle vynálezu jsou komerčně dostupné, nebo mohou být připraveny odborníkem v této oblasti pomocí běžných metod.

Obvykle je výhodné, pokud maximálně jedna skupina Ř”, připojená k uhlíkovému atomu umístěnému mezi atomy dusíku v makrocyklu, má makromolekulu připojenou pomocí vazebné skupiny. Výhodné sloučeniny jsou navíc takové, které mají jednu až pět, nejlépe jednu až dvě ze skupin R” připojených k biomolekule, a nemají X, Y a Z připojeny k biomolekule, nebo ty, které mají jednu X, Y a Z připojenu k biomolekule a skupinu ”R” připojenou k makromolekule nemají.

Výhodné sloučeniny jsou obvykle takové, kde alespoň jedna, výhodněji alespoň dvě ze skupin ”R”, kromě skupin”R”, které jsou připojeny k biomolekule představují alkylové, cykloalkylalkylové a aralkylové radikály a zbývající skupiny ”R” nepřipojené k molekule představují vodík, nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus, nebo heterocyklus obsahující dusík. Jiné výhodné skupiny sloučenin jsou takové, kde alespoň jedna, výhodně dvě Ri nebo R/ a R₂ nebo R₂, R3 nebo R₃ a R4 nebo R4 , R₅ nebo R§ a Re nebo Re, R₇ nebo R? a Re nebo Re a Re nebo Rg a R nebo R spolu s · ·

9··* * • 9 • · 9

9«

9 99

9·9 9 «

9 9

99 uhlíkovými atomemy, ke kterým jsou připojeny, představují nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus se 3 až 20 uhlíkovými atomy, a zbývající skupiny ”R kromě R” skupin, které jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny, kterou je vodík, heterocyklus obsahující dusík nebo alkylová skupina a ty, kde alespoň jedna, výhodně dvě R nebo R a Rí nebo R/ a R₂ nebo R_2l R₃ nebo R3 a R4 nebo R4 , R₅ nebo Rs a R_e nebo Re, R? nebo R₇ a R$ nebo Re a R₉ nebo Re spolu s uhlíkovými atomemy, ke kterým jsou připojeny, se vážou za vzniku heterocyklů obsahujícího dusík, se 2 až 20 atomy uhlíku a zbývající skupiny R kromě skupin ”R”, připojené k biomolekule pomocí vazebné skupiny, jsou nezávisle vybrány z vodíku, nasyceného, částečně nasyceného nebo nenasyceného cyklu nebo alkylových skupin.

Jak se zde užívá, skupiny ’’R představují všechny R skupiny, připojeny k uhlíkovým atomům makrocyklu, to znamená R R1, R./., R₂, R₂', R3, R3’, R4, R<, Rs-, Rs , Re , Rď , R₇. R7 3 Re , Re , Ř9, Rg .

Jiným výhodným provedením podle vynálezu je farmaceutická kompozice v podobě jednotkové dávky, která je využitelná pro dismutaci superoxidu, obsahující (a) terapeuticky nebo profylakticky účinné množství komplexu, popsaného výše a (b) netoxický, farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans nebo přísady.

Obecně přijatý mechanismus působení enzymů SOD na bázi manganu zahrnuje přechody centra manganu mezi dvěma oxidačními stavy (II, III). Viz J. V. Bannister. W. H. Bannister a G. Rotilio, Crit. Rev. Biochem., 22,111-180 (1987).

1) Μη (II) + HO₂ -> Mn(lll) + HO₂

2) Mn(lll) + O₂ -> Μη (II) + O₂

Formální redoxní potenciály pro O₂/ O₂ - a HO₂ / H₂O₂ při pH = 7 činí -0,33 V a respektive 0,87V. Viz A. E. G. Cass, v Metalloproteins ; 1. část, Metal proteins with Redox Roles, ed. P. Harrison, P. 121. Verlag Chemie (Weinheim, GDR) (1985). Při mechanismu uvedeném výše tyto potenciály vyžadují, aby byl domnělý katalyzátor schopen rychle přejít změnou oxidačního stavu v rozmezí od -0,33V do 0,87V.

Zde popsané komplexy odvozené od Μη (II) a obecně třídy C-substituovaných ligandů [15]anN_s byly charakterizovány za použití cyklické voltametrie měřením jejich redoxního potenciálu. Zde popsané C-substituované komplexy na bázi manganu mají reverzibilní oxidaci připřibližně +0,7V (SHE). Coulometrie ukazuje, že tato oxidace je ♦ · · • ·*·· ·*· jednoelektronový proces; přesněji, jedná se o oxidaci manganatého komplexu na manganity komplex. U těchto komplexů je pro jejich funkci katalyzátorůSOD zahrnut do katalytického cyklu oxidační stav Μη (III). To znamená, že komplexy maganité všech * * těchto ligandů jsou shodně kompetentní jako katalyzátory SOD, přičemž nezáleží na tom, která forma (Μη (II) nebo Mn(lll)) je přítomna v přítomnosti superoxidu, protože superoxid redukuje Μη (III) na Μη (II) za uvolnění kyslíku.

Komplexy na bázi železa podle vynálezu jsou částečně využitelné díky nečekaně zvýšené stabilitě komplexů na bázi železa, ve srovnání s odpovídajícími komplexy na bázi manganu. Tato zvýšená stabilita může být důležitá při orální aplikaci a tam, kde má cílová tkáň velmi nízké pH, jako například srdeční tkáň.

Jak se zde užívá, pojem alkyl” samostatně nebo v kombinaci, znamená nerozvětvený nebo rozvětvený řetězec alkylového radikálu obsahujícU. až 22 atomů uhlíku svýhodou 1 až přibližně 18 atomů uhlíku a nejlépe 1 až přibližně 12 atomů uhlíku, které volitelné nesou jeden nebo více substituentů, vybraných z (1) -NR30R31, kde R30 a R31 jsou nezávisle vybrány z vodíku, alkylu, arylu nebo aralkyiu; nebo R₃₀ je vodík, alkyl, aryI nebo aralkyl a R31 je vybrána ze skupiny sestávající z

-NR32 R33, -OH, -OR34,

*5

X

II

-P-CO^jXORjj);

kde R32 a R^je nezávisle vodík, alkyl, aryl nebo acyl, R^ je alkyl, ary! nebo alkaryl, Z’ je vodík, alkyl, aryl, alkaryl, - R34, -SR34 nebo -NR40 R41, kde R40 a R41 jsou nezávisle vybrány z vodíku, alkylu, arylu nebo alkarylu, Z” je alkyl, aryl nebo alkaryl , -OR34, SR34, -NR40 R41, -R35, je alkyl, aryl,

-OR>,, -NR40 R41, R36 je alkyl, aryl nebo -NR40 R41. R37 je alkyl, aryl nebo alkaryl, X’ je kyslík nebo síra a R^ a R₃₉ jsou nezávisle vybrány z vodíku, alkylu, arylu; (2) -SR42, kde R42 je vodík, alkyl, aryl nebo alkaryl, -SR34, -NR₃₂ R33,

X o o — Ϊ:-Ζ\ -S-^43, OT -?4AXB);

·4· ··· · · • ·*·« * «4 • ··♦· 4

4

4· 44 kde R34 je -OH, -OR34 nebo -NR₃₂ R»,a A a B jsou nezávisle -OR34, -SR34 nebo -NR32

R33;

(3) kde x je 1 nebo 2, a R44 je halogenid, alkyl, aryl nebo alkaryl ,-OH, -OR34, -SR34, -NR_K R33;

(4) -OR45, kde R45 je vodík, alkyl, aryl, alkaryl, -NR₃₂ R33;

X'	0	0
II — C—Z',	-8t=flki -P-PXE),or

kde D a E jsou nezávisle -OR34 nebo -NR₃₂ R33;

kde R46 je halogenid, -OH, -SH, -OR^ , -SR34 nebo -NR₃₂ R33; nebo (6) aminoxid vzorce —N R30R3:

s tou podmínkou, že R30 a R3, není vodík; nebo (7) kde F a G jsou nezávisle -OH, -SH, -OR34, -SR^, -NR32 R33; nebo

4« *4 * · · · * · ·· · • 4 4

4 • 4 4 4

4··

444 4 4 . 4 4 4

44 (8) -O-(-(CH₂)_a -0)_b -Rw, kde R₁₀ je vodík nebo alkyl, a a a b jsou celá čísla nezávisle vybrána ze skupiny od 1 do 6; nebo (9) halogen, kyan, nitro nebo azido. Alkyl, aryl a alkarylové skupiny substituentú alkylových skupin uvedených výše, mohou obsahovat jeden substituent navíc, ale jsou s výhodou nesubstituovány. Příklady takovýchto radikálů zahrnují, ale nejsou omezeny na methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, isobutyl, sec.butyl, terc.butyl, pentyl, isoamyl, hexyl, oktyl, nonyl, decyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, oktadecyl a eikosyl. Pojem alkenyl, samostatně nebo v kombinaci, představuje alkylový zbytek s jednou nebo dvěma dvojnými vazbami. Příklady takovýchto alkenylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na ethenyl, propenyl, 1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, izo-butenyl, cis-2-pentenyI, trans-2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl, 2,3-dimethyl-2-butenyl, ípentenyl, 1-hexenyl, .1-oktenyl,-decenyl, dodecenyl, tetradecenyl/hexadecenyl/cis- a trans-9-oktadecenyl, 1,3-pentadienyl, 2,4-pentadienyI, 2,3-pentadienyl, 1,3-hexadienyl, 2,4-hexadienyl, 5,8,11,14-eikosatetraenyl, a. 9,12,15-oktadekatrienyl. Pojem alkinyl” • A představuje samostatně nebo v kombinaci, alkylový zbytek s jednou nebo více trojnými vazbami. Příklady takovýchto alkinylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na éthinyl, propinyl (propargyl), 1-butinyl, 1-oktinyl, 9-oktadecinyl, 1,3-pentadiinyl, 2,4pentadiinyl, 1,3-hexadiinyl, a 2,4-hexadiinyF. Pojem cykloalkyl” představuje samostatně nebo v kombinaci, cykloalkylový zbytek obsahující 3 až přibližně 10, výhodně 3 až 8 a nejlépe 3 až 6 atomů uhlíku. Příklady takovýchto cykloalkylových zbytků zahrnuji, ale nejsou omezeny na cykloprópyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, cyklooktyl, a perhydronaftyl. Pojem cykloalkylalkyl” představuje alkylový zbytek, jak je definováno výše, který je substituovaný cykloalkylovým zbytkem, jak je definováno výše. Příklady cykloalkylalkylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklohexylmethyl, cyklopentylmethyl, (4-izopropylcyklohexyl)methyl, (4-t-butyl-cyklohexyl)methyl, 3cyklohexylpropyl, 2-cyklo-hexylmethylpentyl, 3-cyklopentylmethylhexyl, 1-(4neopentylcyklohexyljmethylhexyl, a 1-(4-iozpropyicyklohexyl)methylheptyl. Pojem cykloalkylcykloalkyl” znamená cykloalkylový zbytek, jak je uvedeno výše, který je substituovaný jiným cykloalkylovýmzbytkem, definovaným výše. Příklady cykloalkylcykloalkylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklohexylcyklopentyl a cyklohexylcyklohexyl. Pojem cykloalkenyl samostatně nebo v kombinaci, zahrnuje cykloalkylový zbytek s jednou nebo více dvojnými vazbami. Příklady cykloalkenylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklopentenyl, cyklohexenyl, cyklooktenyl, cyklopentadie12 « · • · · • ««·* * • · ·· · »1 * «·· · * • ♦ · ·· ·· nyl, cyklohexadienyl a cyklooktadienyl. Pojem cykloalkenylalkyl představuje alkylový zbytek jak je definováno výše, který je substituovaný cykloalkenylovým zbytkem, jak je definováno výše. Příklady cykloalkenylalkylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na2-cyklohexen-1-ylmethyl, í-cyklopenten-1-ylmethyl, 2-(1-cyklohexen-1-yl)ethyl, 3-(1cyklopenten-1-yl)propyl, 1-{1-cyklohexen-1-ylmethyl)pentyl, 1-(1-cyklopenten-1yl)hexyl, 6-(1-cyklohexen-1-yl)hexyl, 1-(1-cyklopenten-1-yl)nonyl a 1-(1-cyklohexen-1yljnonyl a 1-(1-cyklohexen-1-yl)nonyl. Pojem alkylcykloalkyl” a alkenylcykloalkyl” znamená cykloalkylový zbytek, jak je definováno výše, který je substituován alkylovým nebo alkenylovým zbytkem, jak je definováno výše. Příklady alkylcykloalkylových a alkenylcykloalkylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na

2-ethylcyklobutyl, 1-methylcyklopentyl, 1-hexylcyklopentyl, 1-methylcyklohexyl, 1-(9oktadecenyl)cyklopentyl.. a .1-(9-oktadecenyl)cyklohexyl. Pojem- alkyIcykloalkenyl” a alkenylcykloalkenyl” znamená cykloalkenylový zbytek, jak je definováno výše, který je substituován alkylovým nebo alkenylovým zbytkem, jak je definováno výše. Příklady alkylcykloalkenylových a alkenylcykloalkenylových zbytků zahrnují, ale nejsou omezeny na 1-methyl-2-cyklopentenyl, 1-hexyl-2-cyklopentenyl, 1-ethyl-2-cyklohexenyl_; 1-butyl2-cyklohexenyl, 1-(9-oktadecenyl)-2-cyklohexenyl a 1-(2-pentenyl)-2-cyklohexenyl. Pojem aryl” samostatné nebo v kombinaci, představuje fenylový nebo naftylový zbytek, který je volitelně nese jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny alkyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, aryl, heterocykl, alkoxyaryl, alkaryl, alkoxy, halogen, hydroxyl, aminu, kyan, nitro, alkylthio, fenoxy, ether, trifluormethyl a podobně, například fenyl, ptolyl, 4-methoxyfenyl, 4-(terc-butoxy)fenyl, 4-fluorfenyl, 4-chlorfenyl, 4-hydroxyfenyl, 1naftyl, 2-naftyl, a podobně. Pojem aralkyl” samostatně nebo v kombinaci, představuje alkylový nebo cykloalkylový zbytek, jak je definováno výše, kde je jeden vodíkový atom nahrazen arylovým zbytkem, jak je definováno výše, jako například benzylem, 2fenylethylem, a podobně. Pojem heterocyklický” znamená cyklickou strukturu obsahující alespoň jeden jiný druh atomu kromě uhlíku v kruhu. Nejčastěji zastoupený jiný druh atomu zahrnuje dusík, kyslík a síru. Příklady heterocyklů zahrnují, ale nejsou omezeny na pyrrolidinyl, piperidyl, imidazolidinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydrothienyl, furyl, thienyl, pyridyl, chinolyl, izochinolyl, pyridazinyl, pyrazinyl, indolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyrazolyl, pyridinyl, benzoxadiazolyl, benzothidiazolyl, triazolyl a tetrazolylové skupiny. Pojem nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus představuje spojené kruhové struktury, kde jsou dva uhlíkové atomy kruhu též součástí * * · • · ···· * • · · ·

«9 9

9, 99 ··♦ · 9 • 9 ♦

99' 99 patnáctičlenného makrocyklického ligandu Kruhová struktura může též obsahovat 3 až 20 uhlíkových atomů, výhodně 5 až 10 uhlíkových atomů, a může též obsahovat jeden nebo více jiných druhů atomů kromě uhlíku. Nejčastěji zastoupený jiný druh atomu zahrnuje dusík, kyslík, nebo síru. Kruhová struktura může též obsahovat více než jeden kruh. Pojem nasycená, částečné nasycená nebo nenasycená cyklická struktura” představuje kruhovou strukturu , kde je jeden uhlík kruhu též součástí patnáctičlenného tmakrocyklického ligandú. Kruhová struktura může obsahovat 3 až 20 uhlíkových atomů, výhodně 5 až 10 uhlíkových atomů, a může též obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo atomy síry. Pojem heterocyklus obsahující dusík znamená kruhovou strukturu, kde jsou dva uhlíkové a dusíkové atomy kruhu též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandú. Kruhová struktura může též obsahovat 2 až 20 uhlíkových atomů, s výhodou 4 až. 10 atomů uhlíku,, může být částečně nebo zcela nenasycená nebo nasycená a může též obsahovat atomy dusíku, kyslíku a/nebo atomy síry v té části kruhu, která není též součástí patnáctičlenného makrocyklického ligandú. Pojem organický kyselý aniont znamená karboxylové kyselé anionty s 1 až 18 atomy uhlíku. Pojem halogehid” znamená chlorid nebo bromid.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu se mohou připravit podle obecného postupu znázorněného schématem A, uvedeným níže. Amid aminokyseliny, který odpovídá amidovému derivátu přirozeně nebo nepřirozeně se vyskytující α-aminokyseliny, se redukuje na formu odpovídajícího substituovaného ethylendiaminu. Tento amid aminokyseliny může být amidovým derivátem jakékoli z mnoha obecně Známých aminokyselin. Výhodné amidy aminokyselin představuje vzorec:

kde R je derivát D nebo L forem aminokyselin alaninu, kyseliny asparágové, argininu, asparaginu, cysteinu, glycinu, kyseliny glutámové, glutaminu, histidinu, izoleucinu, leucinu, lyzinu, methioninu, prolinu, fenylalaninu, šeřinu, tryptofanu, treoninu, tyrozinu, valinu a/nebo R skupin nepřirozených α-aminokyselin, jako například alkylu, ethylu, butyíu, terc-butylu, cykloalkylu, fenylu, alkenylu, allylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, polycykloalkylu, polycykloarylu, polycykloheteroarylu, iminu, aminoalkylu, hydroxyalkylu,

w» * w V « t t · » · · ··!*·· * · ·*·· · · · · ·*· · · ··· · * ··· • I · «···· ·· · hydroxylu, fenolu, aminoxidu, thiolkylu, karboalkoxyalkylu, karboxylových kyselin a jejich derivátů, keto, ether, aldehyd, amin, nitril, halogen, thiol, sulfoxid, sulfon, sulfonové kyseliny, sulfidu, disulfidu, fosfonové kyseliny, fosfinové kyseliny, fosfinoxidu, sulfonamidu, amidu, aminokyseliny, peptidu, proteinu, hydrogenuhličitanu, nukleové kyseliny, mastné kyseliny, lipidu, nitro, hydroxylaminu, hydroxamové kyseliny, thiokarbonylu, borátu, boranu, boraza, silyl, siloxy/silaza, a jejich kombinace. Nejlepší jsou ty, kde R představuje vodík, alkylové, čykloalkanylové a aralkylové zbytky. Diamin se pak tosytluje za vzniku di-N-p-toluensulfon derivátu, který reaguje s di-O-tosylovaným tris-Ntosylovaným triazalakan diolem za vzniku odpovídajícího substituovaného Npentatosylpentaazacykloalkanu. Tosylující skupiny se pak odstraní a výsledná sloučenina reaguje s manganatou nebo železitou sloučeninou za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek pro tvorbu odpovídajícího substituovaného manganatého nebo železítého pentaazacykloalkanového komplexu. Pokud jsou ligandy nebo náboj neutra• s lizující anionty, to znamená X, Y a Z anionty nebo ligandy, které nemohou pocházet přímo ze sloučeniny manganu nebo železa, komplex těchto aniontů nebo ligandů se může vytvořit provedením výměnné reakce s komplexem, který byl připraven reakcí makrocyklu se sloučeninou manganu nebo železa.

Komplexy podle vynálezu, kde Rs a R₂ jsou alkyl a R₃, R’3, R4, R/ Rs, R’5, Re, R’e, R7, R7, Rs a Rs, mohou být alkyl, arylalkyl nebo cykloalkylalkyl a R nebo R’ a Rí nebo R’i jsou spolu s uhlíkovými atomy spojeny vazbou za vzniku heterocyklu obsahujícího dusík, mohou se také připravit podle obecného postupu uvedeného ve schématu B níže za použití metod známých odborníkům v této oblasti, pro přípravu prekurzoru manganatého nabo železítého pentaazadicyklo[12,3,1]oktadekapentanového komplexu. Viz například Alexander a kol., Inorg. Nucl. Chem. Lett., 6, 445 (1970). 2,6diketopyridin tak kondenzoval s triethylentetraminem v přítomnosti manganaté nebo železité sloučeniny za vzniku manganatého nabo železítého peritaazadicyklo[12,3,1]oktadekapentanového komplexu. Manganatý nabo železitý pentaazadicyklo[12,3,1]oktadekapentanový komplex se hydrogenoval s oxidem platiny při tlaku 68,8 kPa -6888,8 kPa za vzniku odpovídajícího manganatého nabo železítého pentaazadicylo[12,3,1 jokta dekapentanového komplexu manganu (II) nebo kovu (lil).

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu se mohou také připravit cestou dichloridu dvojsytné kyseliny, uvedenou ve schématu C níže. Triazáalkan se tak tosyluje ve vhodném systému rozpouštědla za vzniku odpovídejíícho tris(N15 *·· ·· 44 4»·*

4 4 4 4 4 4 ·>.. 44 • · 4 4444 · * 4 · ·· 4 4 ··· 4 4 4 4 4 «4 « 444 444 44 *4 p-toluensulfon) derivátu. Tento derivát reguje s vhodnou bází za vzniku odpovídajícího disulfonamtdového aniontu. Disulfonamidový aniont se dialkyluje s vhodným elektrofilem za vzniku derivátu dikarboxylové kyseliny. Tento derivát dikarboxylové kyseliny reaguje za vzniku dikarboxylové kyseliny, která pak reaguje s vhodným činidlem za vzniku dichloridu dvojsytné kyseliny. Požadovaný vicinální diamin se získá některou z možných cest. Jedna cesta je využitelná pro přípravu z aldehydu reakcí s kyanidem v přítomnosti amoniumchloridu a následnou reakcí s kyselinou za vzniku alfa amoniumnitrilu. Poslení uvedená sloučenina se redukuje v přítomnosti kyseliny a pak reaguje s vhodnou bází za vzniku vicinálního diaminu. Kondenzací dichloridu dvojsytné kyseliny s vicinálním diaminem v přítomnosti vhodné báze vznikne tris(p-toluensulfon)diaminový makrocyklus. p-Toluensulfonová skupina se odstraní, amidy se zredukují a výsledná sloučenina reaguje ,.s. manganatou, nebo železitou-sloučeninou za nezbytných bežvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného manganatého nabo železitého pentaazacykloalkanového komplexu.

Vicinální diaminy se připraví uvedenou cestou (známou jako Streckerova syntéza) a vicinální diaminy se v případě komerční dostupnosti zakoupí. K přípravě vicinálního diaminu se může použít jakákoli metoda.

Makrocyklické ligandy použitelné v komplexech podle vynálezu se mohou také připravit pyridindiamidovou cestou uvedenou v následujícím schématu D uvedeném níže. Polyamin, jako tetraaza sloučenina, obsahující dva primární aminy, tak kondenzuje s dÍmethyl-(2,6-pyridindikarboxylátem) při zahřátí ve vhodném rozpouštědle, jako například v methanolu, za vzniku makrocyklu se včleněným piperidínovým kruhem jako 2,6-dikarboxamid. Pyridinový kruh v makrocyklu se zredukuje na odpovídající piperidinový kruh v makrocyklu, diaminy se pak zredukují a výsledná sloučenina reaguje s manganatou nebo železitou sloučeninou za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného manganatého nebo železitého pentaazacykloalkanového komplexu.

Makrocyklické ligandy, využitelné v komplexech podle vynálezu, se mohou také připravit bis{halogenacetamidovou)cestou uvedenou ve schématu E níže. Triazaalkan se tak tosyluje ve vhodném systému rozpouštědla za vzniku odpovídajícího tris(N-ptoluensulfon)derivátu. Tento derivát pak reaguje s vhodnou bází za vzniku disulfonamidového aniontu. Bis(halogenacetamid), jako například bis(chloracetamid) vicinálního diamidu, se připraví reakcí diaminu s přebytkem halogenacetyl halogenidu, například s ·· • · • 4 ♦ * 4444 • 4 · « · » • 4 · ·· « 44* 4 4

4 ♦ · · • 4« 444 * «· ·· chloracetylchloridem, v přítomnosti báze. Disulfonamidový aniont tris(N-ptoluensulfon)triazaalkanu pak reaguje s bis(chloracetamidem) diaminu za vzniku substituovaného tris(N-tosyl)diamidového makrocyklu. p-Toluensulfonové skupiny se odstraní, amidy se zredukují a výsledná sloučenina reaguje s manganatou nebo železitou sloučeninou za nezbytných bezvodých a anaerobních podmínek a vzniku odpovídajícího substituovaného manganatého nebo železitého pentaazacykloalkanového komplexu.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu, kde R_b R,’, R₂₎ R₂ jsou odvozeny od diaminové výchozí látky a R₅, R₅’, R₇, R? a R₉, R₉’ mohou být H nebo jakákoli funkční skupina uvedená výše, se mohou připravit pseudopeptidovou metodou uvedenou ve schématu F níže. Substituovaný 1,2-diaminoethan představovaný, vzorcem ........ .........

kde Rí, Rý, R₂ a R₂ jsou substituenty na přilehlých atomech uhlíku produktu makrocyklického ligandu jak je uvedeno výše, a mohou se použít v této metodě v kombinaci s jakoukoli aminokyselinou. Diamin se může připravit jakoukoli běžně používanou metodou známou odborníkům v této oblasti. Skupiny R v makrocyklu, odvozené od substituentů na α-uhlíku a-aminokyselin, to znamená Rs, Rs’, R₇, R₇’, Rg a Rg’, se mohou odvodit od D nebo L forem aminokyseliny alaninu, kyseliny asparágové, argininu^asparaginu, cysteinu, glycinu, kyseliny glutámové, glutaminu, histidinu, izoleucinu, leucinu, lyzinu, methioninu, prolinu, fenyialaninu, šeřinu, tryptofanu, treoninu, tyrozinu, valinu a/nebo R skupin nepřirozených a-aminokyselin jako například alkylu, ethylu, butylu, terc.butylu, cykloalkylu, fenylu, alkenylu, allylu, alkinylu, arylů, heteroarylů, polycykloalkylu, poíycykloarylu, polycykloheteroarylu, iminu, aminoalkylu, hydroxyalkylu, hydroxylu, fenolu, aminoxidu, thiolalkylu, karboalkoxyalkylu, karboxylových kyselin a jejich derivátů, keto, etheru, aldehyd, aminu, nitrilu, halogenu, thiolu, sulfoxidu, sulfonu, sulfonové kyseliny, sulfidu, disulfidu, fosfonové kyseliny, fosfinové kyseliny, fosfinoxidu, amidu, aminokyseliny, peptidu, proteinu, hydrogenuhličitanu, nukleové kyseliny, mastné kyseliny, lipidu, nitro, hydroxylaminu, hydroxamové kyseliny, thiokarbonylu, borátu, •

boranu, boraza, silyl, siloxy, silaza, a jejich kombinace. Například, 1,8-dihydroxy, 4,5diaminooktan se monotosyluje, a reaguje s anhydridem Boc za vzniku odlišných NBoc, N-p-toluensulfon derivátů, Sulfonamid se alkyluje methylbromacetátem za použití hydridu sodného jako báze a zmýdelní na volnou kyselinu. Diamin obsahující N-ptoluensulfonglycin se použije jako náhrada dipeptidu ve standardní peptidové syntéze na bázi roztoku. Sloučením s esterem aminokyseliny nesoucím funkční skupinu vznikne odpovídající pseudo-tripeptid. Dvěma náslenými reakcemi, TFA štěpení-sloučení, vznikne pseudopentapeptid, z kterého může být odstraněna koncová N- a C- skupina jedním krokem za použití HCI/AcOH. Cyklizací zprostředkovanou DPPA s následnou redukcí LiAIH₄ nebo borem vznikne odpovídající makrocyklický ligand. Tento ligandový systém reaguje s manganatou nebo železitou sloučeninou, jako například s chloridem manganatým nebo chloridem železitým, .za nezbytnýeh-bězvodých aanaerobníčtí podmínek a vzniku odpovídajícího manganatého nebo železitého pentaazabicykloalkanového komplexu. Pokud jsou ligandy nebo náboj neutralizující anionty, to znamená X, Y a Z anionty nebo ligandy, které nemohou pocházet přímo ze sloučeniny manganu nebo železa, komplex s těmito anionty nebo ligandy še může vytvořit provedením výměnné reakce s komplexem, který se připravil reakcí makrocyklu se sloučeninou manganu nebo železa.

Makrocyklické ligandy využitelné v komplexech podle vynálezu, kde R_1f Rí, R3, R3, Rs, Rs, R7, R/, Rsa Rg’ mohou být H nebo jakákoli funkční skupina uvedená výše, a mohou se připravit podle obecné peptidové metody uvedené ve schématu G níže. Skupiny R v makrocyklu odvozeném od substituentú na α-uhlíku a-aminokyselin, to znamená Rí, Rí, R3.R3.R5, Rí, R7, R7’, Re a R9jsou definovány výše ve schématu F. Postup přípravy prekurzorů cyklického peptidu z odpovídajících lineárních peptidů jsou shodné, nebo se zřejmou obměnou již známých metod. Viz například Veber, D. F. a kol., J. Org. Chem., 44. 3101 (1979). Obecný postup metody ve schemtu G níže je příkladem využití přípravy funkcionalizovaného lineárního pentapeptidu od N-konce k C-konci na bázi roztoku. Reakční postup přípravy lineárního pentapeptidu se může případně provést na bázi pevné fáze za použití již známých metod. Reakce může postupovat od C-konce k N-konci a přeměnou se může dosáhnout sloučení di- a tri-peptidů, je-li třeba. Aminokyselina chráněná Boc se tak sloučí s esterem aminokyseliny za použití standardních činidel pro peptidovou slučovací reakci. Nový Boc-dipeptidový ester se pak zmýdelní na volnou kyselinu, která se opět sloučí s dalším esterem aminokyse18 • · ♦ * ···· * líny. Výsledný ester Boc-tri-peptídu se opět zmýdelní a tato metoda pokračuje až po přípravu Boc-chráněné pentapeptidové volné kyseliny. Boc-chránící skupina se odstraní za standardních podmínek a výsledný pentapeptid nebo jeho sůl se přemění na cyklický pentapeptid. Cyklický pentapeptid se pak zredukuje na pentaazacyklopentadekan s hydridem hlinito-lithným nebo borem. Poslední ligand pak zreaguje s manganatou nebo železitou sloučeninou za nezbytných anaerobních podmínek a vznikne odpovídající manganatý nebo želežitý pentaazacyklopentadekanový komplex. Pokud jsou ligandy nebo náboj neutralizující anionty, to znamená X, Y a Z anionty nebo ligandy, které nemohou přímo pocházet ze sloučeniny manganu nebo železa, komplex s těmito anionty nebo ligandy se může vytvořit provedením výměnné reakce s komplexem, který se připravil reakcí makrocyklu se sloučeninou manganu nebo železa.

Následující schémata znázorňují přípravu komplexů manganu-podle'vynálezu. Komplexy železa podle vynálezu se mohou připravit nahrazením použité sloučeniny manganu sloučeninou železa.

* «

SCHÉMA A

0 ·0 • * · • 0000 ·

0 00 00 0 0

• ·

999 9 9

9

Ne^-CHO

SCHÉMA C

I.TtCI, .

py*fin _Ts^N

1. KCN, NH₄a

NH.OH.tttf

2. HCT

BřCRjCOOCHj dtrf

Γγ-^· R’_e« H HsN+ci“ j Hy PtOý-Ha ...... R 6 R r₉4_P’’ *^r-^h

CI’HsN+ Aftťcr báze °yOCH₃CH,oU⁵

8-J L-*

HaN NHj

CICOCOCI 0

o.srW/H

nebo thf

I

H

• 4

SCHÉMA D • · · • »··♦ 4 •

• 4 4 • 44 • 4 4 · • •4 · « • · 4 · ·4

H₂.PtO_ř CHgOH HO

000 • * · • 0*0« 0 • Β0·« · 0000 « 0 ·00 •0 0« 0«

SCHÉMA E

»H V.

·»· »^r· ’ • · 9 · « « ϊ

♦ ··

·3

SCHÉMA F

F •V'??'

4 4 44 *· 4 4»» • 4 · · · · 4 4 · · · 444· · · · · ·· 4 4

4« 4 · 4 « I • 4 · 44444« 44» ··

SCHÉMA F {pokračování)

• 0

SCHÉMA G * 0 0 « 0 0 0 • 0 000 •00 ·« · ·· «000 * · 000« • 0 0 00 0 · · • 0 0 0 0 •0 000 00 ··

QOOVf

NaOKHaQ

CHjOH

V· I i

OQCNn

R i

BocNH

El edc-hci, HOBT, OMF.TCA,RT nebo +

NaOH, HjO CHjOH

BocNH

Ethyl cMoroformat, ' dmf,tea,o*c

'Et

O

EDOHCI, HOBT, dmf.tea.rt nebo

Ethyl cWwofonnat , DMF,TEA.0®C • φ • · φ φ φ · φφφφ φ • φ φ φφ φ φ

φφφ · • φφ φφ φ φ φ • φ φ φφ φφ

SCHÉMA G (pokračování)

ΜηΟ^,ΜβΟΗ

* · 9^ř ··..

4' 9 99 99 9 • *£? · · ·

099 999

Pentaazamakrocykly podle vynálezu mohou mít jeden nebo více asymetrických] atomů uhlíku a jsou tak schopny existence ve formě optických izomerů, stejné jakoj formě jejich racemických nebo neracemických směsí. Optické izomery se mohou získat⁷·

T z racemických směsí běžnými postupy, například tvorbou diastereomerních solí reakcí s opticky aktivní kyselinou. Příkladem vhodných kyselin je kyselina vinná, diacetylvinná, dibenzoylvinná, ditoluoylvinná a kafrosulfonová kyselina. Pak následuje separace směsi diastereoizomerů krystalizací za následného oddělení opticky aktivní baží z těchto solí. Různé postupy separace optických izomerů zahrnují použití chirální chromatografické kolony optimálně vybrané pro maximální oddělení enantiomerů. Další, použitelná metoda zahrnuje syntézu kovalentních diastereomerních molekul reakcí jedné nebo více sekundární aminoskupiny (skupin) sloučenin podle výriálězu š opticky čistou kyselinou v aktivované formě nebo opticky čistý izokyanát. Syntetizované diastereomery se mohou oddělit běžnými metodami, jako například chromatografií, destilací, krystalizací nebo sublimací, a pak hydrolyzovat na samostatný enentiomericky čistý ligand. Opticky aktivní sloučeniny podle vynálezu se mohou také získat z opticky aktivních výchozích látek, jako například z přírodních aminokyselin.

Sloučeniny nebo komplexy podle vynálezu jsou nové a mohou se využít při léčbě mnoha zánětlivých chorobných stavů a poruch. Například, reperfuzního poranění ischemíckého orgánu, jako například reperfuzního poranění ischemického myokardu, chirurgickým zákrokem vyvolané ischemie, zánětlivého onemocnění střev, revmatoidní artritidy, osteoartritidy, psoriázy, rejekce transplantovaného orgánu, radiací vyvolaného poškození, oxidací vyvolané poranění tkáně a poškození, atherosklerózy, trombózy, agregace destiček, mozkové příhody, akutní pankreatitidy, diabetů mellitu závislého na inzulínu, roztroušené intravaskulární koagulace, tukové embolie, respirační nedostatečnosti u dospělých a dětí, metastáz a karcinogeneze.

Aktivita sloučenin nebo komplexů podle vynálezu při katalýze dismutace superoxidu může být vysvětlena za použití techniky kinetické analýzy zastaveného toku, jak popisuje Riley, D. P., Rivers, W. J. a Weiss, R. H., Stopped-Flow Kinetic Analysis for Monitoring Superoxide Decay in Aqueous Systems, Anal. Biochem.. 196, 344-349 (1991), která je zde zahrnuta v odkazu. Kinetická analýza zastaveného toku je přesná a přímá metoda pro kvantitativní sledování rychlosti rozkladu superoxidu ve vodě. Kině' *τ* ^: · · ♦ ι«β t ta I V 1

->n ·Η·«··· · » · * ····*' ·>··|Μ· ' · * ixl«Pl '-'··· *«FÍ^· · ··· '·· *·^··Ι tická analýza zastaveného toku je vhodná pro screening sloučenin s SOD aktivitoujal katalytickou aktivitou sloučenin nebo komplexů podle vynálezu pro dismutaci superoxij du, jak ukazuje analýza zastaveného toku, korelující s léčbou výše uvedených chorob^ ných stavů a poruch. Celková denní dávka podaná pacientovi jednorázově nebcjv] několika dávkách se může pohybovat například od 1 do přibližně 100 mg/kg tělesné’ hmotnosti denně a většinou přibližně od 3 do 30 mg/kg. Kompozice jednotkové dávky by měla obsahovat několikanásobné nižší množství, než je denní dávka.

Množství aktivní látky, které se může smíchat s nosnou látkou, pro získání jednotkové dávky, se může lišit v závislosti na léčeném pacientovi a způsobu aplikace.

Dávkování pro léčbu chorobných stavů sloučeninami a/nebo kompozicemi podle vynálezu závisí na mnoha faktorech, včetně typu, věku, hmotnosti, pohlaví, starvovacíhorežimu a zdravotního.stavu pacienta, míry onemocnění; frekvence podávání, farmakologického hlediska, jako například aktivity, účinnosti, farmakokinetického a toxikologického profilu určité sloučeniny, zdaje léčivo využité v systému aplikace, a zda je podaná sloučenina součástí lékové kombinace. V aktuálním systému dávkování jsou tak velké rozdíly, a může se proto lišit ód výhodného systému dávkování uvedeného výše.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podat orálně, parenterálně, pomocí inhalačního spreje, rektálně, nebo lokálně v podobě jednotkové dávky obsahující běžné, »

netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, případně adjuvans a přísad. Lokální podání může také zahrnovat transdermální aplikaci, například transdermální náplasti nebo íontoforetické prostředky. Pojem parenterální, jak se zde užívá, zahrnuje podkožní injekce, intravenózní, intramuskulární, intrasternální injekce, nebo infuzní techniky.

Injekční preparáty, jako například sterilní voda pro injekce nebo olejové suspenze, se mohou připravit podle známých metod za použití vhodných disperzních nebo zvlhčujících látek a suspenzních činidel. Sterilním injekčním preparátem může být také sterilní injekční roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, například roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelné nosiče a rozpouštědla, která se mohou využít, patří voda, Ringersův roztok a izotonický. roztok chloridu sodného. Sterilní, fixované oleje jsou navíc běžně dostupné jako rozpouštědla nebo suspendující média. Pro tento účel se může použít jakákoli směs fixovaného oleje zahrnující syntetické mono- nebo diglyceridy. Mastné kyseliny, například kyselina olejová, navíc našly uplatnění v přípravě injekčních látek.

3o :

444 4 4 44««

44«« 4 · * · ··« 4 · « « « · « 4 *

4 »4« «·4 4« 4«

Čípky pro rektální aplikaci léčiva se mohou připravit smícháním léčiva s vhodným nedráždivým nosičem, například s kakaovým máslem a polyethylenglykolem, které jsou při běžných teplotách v pevném stavu, ale kapalné při rektální teplotě, a proto v rektu roztají a uvolní léčivo.

Pevné formy dávky pro orální aplikaci mohou zahrnovat kapsle, tablety, pilulky, prášky, granule a gely. U těchto pevných forem může být aktivní sloučnina smíchaná s alespoň jedním ředidlem, například s laktózovým cukrem nebo pryskyřicí. Takovéto formy dávek mohou také běžně obsahovat kromě inertních ředidel další látky, například lubrikační činidla, například stearát hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkovači formy obsahovat také pufrující látky. Připravené tablety a pilulky mohou mít navíc enterický povlak.

Kapalné formy pro orální aplikaci- mohou zahrnovat farmaceuticky přijatelně emulze, roztoky, suspenze, sirupy a tinktury obsahující běžně používaná inertní rozpouštědla, například vodu. Takovéto kompozice mohou také obsahovat přídavné látky, například zvlhčovadla, emulzífikační a suspendující látky a sladidla, barviva a aromatické látky.

Zatímco se mohou sloučeniny podle vynálezu podat jako samostatná aktivní farmaceutická látka, mohou se také použít v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami, které jsou známy jako účinné látky při určitém chorobném stavu, z nichž jedna působí léčebně.

Sloučeniny nebo komplexy podle vynálezu se mohou také využít jako kontrastní látky MRI. Diskusi o použití kontrastních látek v MRI je možné nalézt v patentové přihlášky číslo 08/397,469, která je zde zahrnuta v odkazu.

Předpokládané ekvivalenty běžných forem uvedených výše u sloučenin a derivátů, stejně jako u meziproduktů, jsou sloučeniny tomuto jinak odpovídající, se shodnými obecnými vlastnostmi jako jsou tautomery sloučenin a takové, kde jedna nebo více různých skupin R jsou jednoduché obměny substituentů, jak je zde definováno, například kde R je vyšší alkylová skupina než je uvedena, nebo kde jsou paratoluensulfonové skupiny jiné dusíkové nebo kyslíkové ochranné skupiny, nebo kde 0para-toluensulfon je halogenid. Anionty s jiným nábojem než 1, to znamená uhličitany, fosforečnany a hydrogenfosforečnany, se mohou použít místo aniontů s nábojem 1 tehdy, pokud nemají jinak vliv na celkovou aktivitu komplexu. Použití aniontů s nábojem jiným než 1 však způsobí mírnou modifikaci obecného vzorce komplexu uvedeného

Φ » « I * · · »· · » • b · • * Φ • Φ· · » * výše. Navíc, pokud je substituent navržen, nebo může být, vodík, přesná chemická podstata substituentu jiného než je vodík v této pozici, například uhlovodíkový zbytek nebo halogenidová, hydroxy, amino a podobná funkční skupina, není zásadní, pokud jinak nepůsobí na obecnou aktivitu a/nebo postup syntézy. Dále se předpokládá, že manganite a železnaté komplexy jsou ekvivalentní manganatým a železitým komplexům.

Chemické reakce popsané výše jsou obecné uvedeny z hlediska uplatnění jejich širší aktivity pro přípravu sloučenin podle vynálůezu. V některých případech reakce nejsou použitelné podle popisu pro každou uvedenou sloučeninu. Tyto sloučeniny rozpoznají odborníci v tomto oboru. U všech takovýchto případů se reakce provede s běžnými modifikacemi známými odborníkům v této oblasti, například pomocí vhodné ochrany interferujících skupin,.přeměnou na alternativní; běžnou'látku/rutinní modifikací reakčních podmínek a podobně, nebo jinými reakcemi zde uvedenými, nebo jinou běžnou metodou, použitelnou k přípravě odpovídajících sloučenin podle vynálezu. Všechny metody přípravy, všechny výchozí látky jsou známé, nebo je možno je jednoduše připravit z výchozích látek.

Bez dalšího popisu se předpokládá, že odborník v této oblasti může za použití uvedeného popisu využít tento vynález v jeho plném rozsahu. Následující výhodná provedení jsou proto stavěna pouze jako ilustrativní a nijak neomezují..

Příklady provedení vynálezu

Všechny činidla se použily v původním stavu bez přečištění, není-li uvedeno jinak. Všechna spektra NMR byla získána na spektrometrech pro nukleární magnetickou rezonanci -Varian VXR-300 nebo VXR-400. Kvalitativní a kvantitativní hmotnostní spektroskopie byla provedena na zařízení Finigan MAT90 a Finigan 4500 a VG40250T za použití m-nitrobenzyl alkoholu (NBA) a směsi m-nitrobenzyl alkohol/LiCI (NBALi) Teploty tání (mp) nejsou upraveny.

Následující zkratky vztahující se k aminokyselinám a jejich ochranným skupinám jsou v souladu s ustanovením komise IUPAC-IUB pro biochemickou nomenklaturu (Biochemistry 1972,11,1726) a všeobecným užíváním.

Ala L-alanin

Dala D-alanin

Gly glycin

ΦΦΦ * Μ»

Ser

DSer

Bzl

Boc

Et

TFA

DMF

HOBT. H₂O

EDC. HCI

TEA

DMSO

THF

DPPA

L-serin

D-serin benzyl terč -butoxykarbonyl ethyl kyselina trifluoroctová dimethylformamíd

1-hydroxy-()H )-benzotriazol monohydrát

-(3-dimethyíaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochlorid triethylamin dimethylsulfoxid tetrahydrofuran - - -.......

difenylfosforyl azid ‘Zkratka Cyc znamená 1,2-cyklohexandiamin (stereochemie, to znamená použití R,R nebo S,S). Následuje třípísmenový kód peptidové nomenklatury použité u pseudopeptidů obsahujících 1,2-cyklohexan diaminový zbytek”.

Příklad 1

A, Syntéza N-(p-toluensulfonyl)-(R.R)-1,2-diaminocvklohexanu

K míchanému roztoku (R,R)-1,2-diaminocyklohexanu {300 g, 2,63 mmol) v

CH₂CI₂ (5,00 I) se při -10°C po kapkách během 7 hodin za udržování teploty při -5°C až -10 °C přidal roztok p-toluensulfonylchloridu (209 g, 1,10 mol) v CH₂CI₂ (5,00 I) Směs se zahřála během míchání pres noc. na laboratorní teplotu. Směs se zakoncentrovala za vakua na objem 3 I a bílá pevná látka se odstranila Filtrací. Roztok se pak promyl H₂O (10x1 I) a vysušil nad MgSO₄. Odstraněním rozpouštědla za vakua se získalo 286 g (97,5% výtěžek) produktu ve formě žluté krystalické pevné látky: ¹H NMR (CDCfej δ 0,98-1,27 (m, 4H), 1,564-1,66 (m, 2H), 1,81-1,93 (m, 2H), 2,34 (dt, J = 4,0, 10,87 Hz, 1H), 2,42 (s, 3H), 2,62 (dt, J = 4,2, 9,9 hz, 1H), 7,29 (d, JH = 8,1 Hz, 2JH), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB-DTT-DTE) m/z 269 [M + Hf.

B, Syntéza N-(p-toluensulfonvO-N’-(Boc)-(R,R)-1,2-diaminocvklohexanu

9 9 «

• . · *

K míchanému roztoku N-(p-toluensulfonyl)-(R,R)-1,2-diaminocyklohexanu připravenému v příkladu 1A (256 g, 0,955 mol) v THF (1,151) se přidal 1N roztok vodného NaOH (1,15 I, 1,15 mol). Přidal se di-t-butyldikarbonát (299 g, 1,05 mol) a výsledná směs se míchala přes noc. Vrstvy se oddělily a u vodné vrstvy se upravilo pH na 2 pomocí 1N HCI a nasytila se pomocí NaCI. Vodný roztok se extrahoval pomocí CH₂CI₂ (2 x 500 ml), extrakty a vrstva THF se smíchaly a vysušily nad MgSO₄. Rozpouštědlo se odstranilo za vakua a získala se žlutá pevná látka. Surový produkt se přečistil krystalizací ze směsi THF-ether-hexan a získalo se 310 g (88,1% výtěžek) produktu ve formě bílé krystalické pevné látky: teplota táni: 137°C - 139°C : ¹H NMR (CDCI₃) δ 1,04-1,28 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,61-1,69 (m, 2H), 1,94-2,01 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,86 (široké s, 1H), 3,30 (široké d, J = 9,6 1H), 4,37 (široké d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,48 (široké d, J = 4,6 Hz, 1H), J.27 (d,. 1=..9,7-Hz, 2HX 7,-73 (d, J=-8,1Hz;-2H);-MS(LRFAB,NBA^--Li)Wž· 375 [M+· Li]*.

C. Syntéza Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-OMe

K míchanému róztokii N-(p-toluensulfonyl)-N’-(Boc)-(R,R)-1,2diaminocyklohexanu připravenému v příkladu 1B (310 g, 0,841 mol) v bežvodém DMF (3,11 I) se při 0°C po částech přidal NaH (37,4 g-60% v oleji, 0,934 mol) a výsledná směs se míchala 30 minut. Během 45 minut se po kapkách přidal methyl(bromacetát) (142 g, 0,925 mol) a směs se během míchání přes noc zahřála na laboratorní teplotu. Po 17 hodinovém míchání se rozpouštědlo odstranilo za vakua a zbytek se rozpustil v ethylacetatu (3 I) a H₂O (1 I). Roztok ethylacetatu se promyl nasyceným NaHC0₃ (1 I), nasyceným NaCI (500 ml) a vysušil nad MgSO₄. Rozpouštědlo odstranilo za vakua a zbývající olej se rozpustil v etheru. Krystalizací po přídavku hexanu se získalo 364 g (98% výtěžek) produktu (TLC (98:2 CHCI₃ -MeOH/silikagel(UV detn) se prokázalo, že produkt obsahoval 5% výchozí látky) ve formě bezbarvých jehliček: teplota tání čistého vzorku 151°C-152°C; ¹H NMR (CDCfe) δ 1,11-1,22 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,64-1,70 (m, 3H), 2,16-2,19 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 3,34-3,40 (m, 2H), 3,68 (s 3H), 4,06 (ABq, J = 18,5 Hz, Δν = 155 Hz, 2H), 4,77 (široké s, 1000H), 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,3 Hz, 2H); MS (LRFAB, DTT -DTE) m/z 441 [M + Hf.

D. Syntéza Boc-(R.R)-Cyc(Ts)-Glv-OH

K míchanému roztoku znečistěného Boc-(R,R)-Cyc(Ts)-Gly-OMe připraveného v příkladu 1C (217 g, 0,492 mol) v MeOH (1,05 I) se pomalu přidal 2,5 N roztok vodného * NaOH (295 ml, 0,737 mol) a výsledný roztok se míchal 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstranilo za vakua a zbytek se rozpustil v H₂O (1,5 I). Roztok se přefiltroval k odstranění. malého množství pevné látky a promyl se etherem (7 x 1 I) k odstranění nečistot (sloučenina 1B), smíchané filtráty se vysušily nad MgSO4 a odstraněním rozpouštědla za vakua zůstal zbytek 8,37 g. pH vodného roztoku se pak upravilo 1N HCI na 2 a produkt se extrahoval ethylacetátem (3 x 1 I). Extrakty se smíchaly, promyly nasyceným NaCI (500 ml) a vysušily nad MgSO4. Rozpouštědlo odstranilo za vakua a zbytek ethylacetatu se odstranil odpařením současně s etherem (500 ml) a pak CH₂CI₂ (500 ml) a získalo se 205 g (97,6% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (CDCI₃) δ ._1,.15.-1,22.(m, 4H),-1,48-(s_f -9H),-1_;55-T,68 (m_? 3H), -2;í2-2,15-(m,· 1H)_l'' 2;43'(s_l'3H), 3,41-3,49 (m, 2H), 3,97 (ABq, J = 17,9 Hz, Δν = 69,6 Hz, 2H), 4,79 (široké s, 1H), 7,31 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 8,81 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA - Li) m/z 443 [M + Li]*.

E. Syntéza Boc-(R,R)-Cvc(Ts)-Glv-Glv-QEt

K Boc-(R,R)-cyc(Ts)-gly-OH (18,1 g, 43,1 mmol) v DMF (480 m|) se přidal HOBt . H₂O (7,92 g, 51,7 mmol) a EDC . HCI (9,91 g, 51,7 mmol) a výsledná směs se míchala 20 minut při laboratorní teplotě. K tomuto roztoku se přidal GlyOEt. HCI (6,0 g, 43,1 mmol) a TEA (7,2 ml, 51,7 mmol) a výsledná směs se následně míchala 16 hodin; DMF se odpařil a zbytek se rozdělil mezi vodu (250 ml) a EtOAc (400 ml). Vrstva EtOAc se oddělila a prómyla 1N KHS0₄ (250 ml), vodou (250 ml), nasyceným NaHCO₃ (250 ml) a solankou (250 ml) a vysušila (Na₂SO4). Filtrací a zakoncentrováním se získalo 21,9 g (99% výtěžek) čistého produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO-d_e) δ 1,00 /1,10 (m, 1H), 1,19 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,50-1,56 (m, 3H), 1,75-1,84 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 3,30-3-40 (široké s, 2H), 3,75-4,01 (komplex m, 4H), 4,08 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 6,05 (široké s, 1H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 8,32 (t, J = 7,2 Hz, 1H); MS (HRFAB) m/z 518,2551 (M + Li)* ; 518,2512 vypočteno pro C₂4H₃₇N₃O₇SLi.

F, Syntéza TFA soli Cvc(Ts)-Glv-Gív-OEt • 9 ···« * 9 9 9 999 9 *

999 9 9 9 9 ·

9 999999 99 99

K roztoku Boc-Cyc(Ts)-GJy-Gly-OEt (21,2 g, 41,4 mmol) v CH₂ Cl₂ (180 ml) se přidal TFA (44 ml) a výsledná směs se míchala 30 minut při laboratorní teplotě. Roztok se zakoncentroval a zbytek se rozpustil v etheru (50 ml) a precipitoval v hexanu (500 ml). Rozpouštědlo se dekantovalo a zbytek se promyl směsí 10:1 hexan/ether (500 ml). Výsledný zbytek ze řádně vysušil za vysokého vakua a získalo se 20,7 g (95% výtěžek) produktu ve formě žlutohnědé pěny: ¹H NMR (DMS0-d₆) δ 0,85 -0,96 (m, 1H), 1,031,31 (komplex m, 7H), 1,09 (t, J = 7,6 Hz, 3H), 2,00 (m, 1H), 2,39 (s, 3H), 3,02 (široké s, 1H), 7,41 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 8,25 (široké s, 3H), 9,09 (t, J = 5,63 Hz, 1H). MS (HRFAB) m/z 418,1990 (M -TFA + Li)⁺; 418,1988 vypočteno pró C19H29N3O5S.

G. Syntéza Boc-Om(Z)-Cvc(Ts)-Gly-Glv-OEt--------- -----”------ ' '

K Boc-Orn(Z)-OH (8,37 g, 22,8 mmol) v DMF (200 ml) se přidal HOBt . H₂O (4,29 g, 27,4 mmol) a EDC . HCI (5,25 g, 27,4 mmol) a výsledný roztok se míchal 20 minut při laboratorní teplotě. K tomuto roztoku se přidala TFA sůl Cys(Ts) -Gly-Gly-OEt (12,0 g, 22,8 mmol) a TEA (3,82 ml, 27,4 mmol) a míchání pokračovalo dalších 16 hodin. DMF se odpařil a zbytek se rozdělil mezi vodu (200 ml) a EtOAc (250 ml). Vrstva , EtOAc se oddělila a promyla 1N KHSO₄ (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným NaHCO3 ’ (150 ml) a solankou (150 ml) a vysušila (MgSO₄). Filtrací a zakoncentrováním se získalo 15,1 g (87% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO-de) δ 1,00 1,94 (komplex m, 12 H), 1,15 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 2,38 (s, H), 2,98 (široké s, 2H), 3,303,46 (m, 2H), 3,70-3,82 (m, 4H), 3,90-4,02 (m, 1H), 4,05 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 5,00 (s, 2H), 6,43 (m, 1H), 7,17 (m, 1H), 7,20-737 (m, 8H), 7,87 (m, 2H), 8,30 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA + HCI) m/z 760 (M + H)⁺.

H. Syntéza TFA soli Orn(Z)-Cvs(Ts) -Gly-Gly-OEt

K roztoku Boc-Orn(Z)-Cyc(Ts)-Gly-Gly-OEt (14,5 g, 19,1 mmol) v CH₂ Cl₂ (120 ml) se přidal TFA (30ml) a výsledná směs se míchala 30 minut při laboratorní teplotě. Roztok se zakoncentroval a zbytek se rozpustil v etheru (100 ml). Ether se dekantoval, zbytek se vysušil za vysokého vakua a získalo se 15,5 g ( >100% výtěžek obsahující TFA) produktu ve formě oranžové pěny: ¹H NMR (DMSO-de) δ 0,97 -1,93 (complex m, 12H), 1,16 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,98 (široké s, 2H), 3,31-3,50 (m, 2H), 3,7136 ** « ··» ·»· · • · • 4 « 1

3,91 (m, 4H), 3,97-4,04 (m, 1H), 4,08 (q. J = 7,4 Hz, 2H), 5,00 (s, 2H), 7,23-7,39 (m, 8H), 7,77-7,81 (m, 2H), 8,18 (široké s, 3H), 8,41 (široké s, 1H); MS (LRFAB, NBA + HCI) m/z 660 (M -TFA)⁺.

I. Syntéza Boc-Gly-Orn(Z)-CvcfTs)-Gly-Gly-OEt

K roztoku Boc-Gly-OH (3,36 g, 19,2 mmoij v DMF (220 ml) se přidal HOBt. H₂O (3,52 g, 23,0 mmol) a EDC . HCI (4,41 g, 23,0 mmol) a výsledný roztok se míchal 20 minut při laboratorní teplotě. K tomuto roztoku se přidala TFA sůl Orn(Z)-Cyc(Ts)-GlyGly-OEt (14,8 g, 19,2 mmol) a TEA (3,20 ml, 23,0 mmol) a míchání pokračovalo dalších 12 hodin. DMF se odpařil a zbytek se rozdělil mezi vodu (200 ml) a EtOAc (350 ml). Vrstvy se oddělily a vrstva EtOAc se promyla 1N KHSO₄ (150 ml), vodou (150 ml), nasyceným NaHC0₃.(150. ml),, solankou (150 ml) a vysušila-(MgSO₄)? Filtrací a zakoncentrováním se získalo 13,7 g (87% výtěžek) čistého produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO-d_e) δ 0,96 -1,10 (m, 1H), 1,17 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,35-2,00 (komplex m, 10H), 2,97 (m, 2H), 3,60 (široké s, 2H), 3,67-3,84 (m, 4H), 3,93-4,03 (m, 3H), 4,06 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 6,92 (široké s, 1Ή), 7,19 (m, 1H), 7,24-7,37 (m, 7H), 7,60 (d, J = 8,3 hz, 1H), 7,76 (m, 2H), 7,38 (široké s, 1H). MS (LRFAB, NBA + Li)⁺ m/z 823 (M + Li)⁺.

J. Syntéza Boc-Gly-Orn(Z)-CvsfTs)-Gly-Glv-OH

K roztoku Boc-Gly-Orn(Z)-Cys(Ts)-Gly-Gly-OEt (13,3 g, 16,3 mmol) v methanolu (100 ml) se přidal 1N NaOH (25 ml). Výsledná směs se míchala při laboratorní teplotě a monitorovala TLC. Po 2 hodinách byla reakce zakončena. Methanol se odpařil a ke zbytku se přidala voda (50 ml). Tato vodná fáze se promyla EtOAc (2 χ 100 ml) a vrstvy EtOAc se zlikvidovaly. pH se snížilo na 3,5 pomocí 1N KHSO₄ a vodná fáze se extrahovala EtOAc (3 x 100 ml). Smíchané vrstvy EtOAc se vysušily (MgSO₄), přefiltrovaly, zakoncentrovaly a získalo se 11,7 g (91% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (CDCb) δ 0,98 -1,25 (m, 2 H), 1,38 (s, 9H), 1,40-1,92 (m, 10 H), 2,38 (s, 3H), 2,97 (m, 2H), 3,62 (široké s, 2H), 3,75-3,85 (m, 3H), 2,97 (m, 2H), 3,62 (široké s, 2H), 3,753,85 (m, 3H), 3,95-4,05 (m, 2H), 5,01 (s, 2H), 6,96 (široké s, 1H), 7,28 (m, 1H), 7,257,38 (m, 7H), 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,78 (m, 2H), 8,25 (široké s, 1H).

K. syntéza TFA soli Gly-Orn(Z)-CysfTs)-Gly-Glv-OH «44« 4 4 4 4 4· v.

-2*7 · 4 «··· 4 4 44444* 4 j\J / · 4 4 4 4 444 . t • 4 4 444 «44 *44« •i’

K roztoku Boc-Gfy-Orn(Z)-Cys(Ts)-Gly-Gly-OH (11,2 g, 14,3 mmol) v CH₂Cí₂ ň (100 ml) se přidalo TFA (24 ml) a výsledný roztok se míchal 30 minut při laboratorní ·>

teplotě. Roztok se zakoncentroval a rozmělnil v ethyletheru (500 ml). Filtrací se získalo 1

11,3 g (99% výtěžek) produktu ve formě bílého prášku: ¹H NMR (DMSO-d_s) δ 0,95 1,98 (komplex m, 12 H), 2,39 (s, 3H), 3,01 (m, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,65-4,10 (komplex m,

7H), 4,18 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 2H), 7,24-7,40 (m, 9H), 7,77-7,85 (m, 2H), 8,13 (široké s, 1H), 8,42 (d, J = 8,3 Hz, 1H); MS (HRFAB) 689,2953 (M -TFA )⁺; 689,2969 vypočteno pro C32H45N6O9S.

i

L. Syntéza cyklo -(Glv-Orn(Z)-Cvs(Ts) -Glv-Glv-)

Roztok TFA soli Gly-Orn(Z)-Cys(Ts)-Gly-Gly-OH (5,0 g, 6,23 mmol) v suchém .......odplyněném-DMF (1520 ml)-zreagovaí s TEA-(4,-74 ml; 12,5 rnmol) 'a zchladil se na -......

40°C. Po kapkách se během 10 minut přidal DPPA (1,64 ml, 7,60 mmol) a reakce se následně míchala 3 hodiny při -40°C. Reakce se pak umístila do lázně o teplotě -2°C a při této teplotě se nachala stát 16 hodin. Přidala se voda (1520 ml) a výsledný roztok se míchal se směsí kuliček ioňtoměňičové pryskyřice (750 g) hodin při laboratorní teplotě. Pryskyřice se odfiltrovala a roztok se zakoncentroval na objem přibližně 100 ml (DMF). Přídavkem ethyletheru (500 ml) vznikl pevný zbytek, který se rozpustil v methanolu (100 ml) a opět precipitoval přídavkem ethyletheru (500 ml). Filtrací se získalo 3,26 g (78% výtěžek) produktu ve formě bílého prášku: ’H NMR (CDCb) δ 0,96 -2,10 (komplex m, 14 H), 2,37 (široké s, 3H), 2,68-3,05 (m, 3H), 3,423,90 (komplex m, 8H), 4,14 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 4,97-5,08 (m, 3H), 6,42 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,20-7,39 (m, 7H), 7,65-7,78 (m, 2H), 9,15 (široké s, 1H), 9,22 (široké s, 1H);

MS (HRFAB) m/z 671,2842 (Μ + H )⁺; 671,2863 vypočteno pro C₃₂H₄₃N₆O₈S.

M. Syntéza cy/r/o-řGlv-Orn-Cys(Ts)-Gly-Glv-)

K roztoku cyklo -(Gly-Orn(Z)-Cys(Ts)-Gly-Gly-) (3,94 g, 5,90 mmol) v methanolu (40 ml) se přidalo Pd (černé) (1,0 g) a amoniumformiát (2,0 g). Reakce se refluxovala 2 hodiny a pak se zchladila. Směs se přefiltrovala v atmosféře argonu přes celtovou podušku , filtrát se zakoncentroval a získalo se 2,86 g (89% výtěžek) produktu ve formě bílé pěny: ¹H NMR (DMSO -d₆) δ 0,94 -2,22 (komplex m, 12 H), 2,39 (s, 3H), 2,55-2,95 (m, 7 H), 3,42-3,89 (komplex m, 9H), 4,11 (m, 1H), 4,39 (m, 1H), 6,43 (d, J = 8,4 Hz,

JO · * ···· · * Φ Φ ΦΦΦ « «

·. · · · φ « φ I ·· φ φφφ φφφ ·Φ

1Η), 7,27 (d, J = 9,3 Hz, 1 Η), 7,25-7,45 (m, 2Η), 7,64-7,80 (m, 2Η), 9,12-9,29 (m, 2H); MS (HRFAB) m/z 537,2511 (M + H)⁺; 537,2495 vypočteno pro C^HseNeSOe.

N. Syntéza cyklo-( Gly-Om(lithocholvl)-Cvs(Ts)-Gly-Gly-)

K roztoku cyWo-fGly-Orn-Cys(Ts)-Gly-Gly-) (1,0 g, 1,9 mmol) v CHCb (25 ml) se přidal NHS aktivní ester kyseliny lithocholové (881 mg, 1,9 mmol) a výsledná smés se následné míchala 16 hodin. Přídavkem ethylesteru (50 ml) vznikla pevná látka. Filtrací se získalo 946 mg (56% výtěžek) produktu ve žlutohnědého prásku; ’H NMR (CD₃ OD) δ 0,66 (m, 3H), 0,93 (široké s, 6H), 0,94-2,37 (komplex m, 48H), 2,43 (s, 3H), 2,80-4,60 (široké m, 14 H), 7,39 (široké s, 2H), 7,80 (široké s, 2H); MS (HRFAB) m/z 895,5432 (Μ + H )⁺; 895,5367 vypočteno pro C4eH₇5N₆O_flS.

O. Syntéza 2.3-(R.R)-cvklohexan-6-(SH3-(lithochoiylamino)propvlM,4,7.10.13-pentaazacvklopentadekanu

K suspenzi cyWo-fGly-Orn(lithocholyl)-Cys(Ts)-Gly-Gly-) (2,70 g, 3,00 mmol) v THF (50 mí) se přidal lithiumaluminium hydrid (51,0 ml a 0,1 M roztoku). Výsledná směs se následně refluxovala 16 hodin. Reakční směs se zchladila na -20°C a zakončila (opatrně) 5% Na₂SO₄ (30 ml) a následně methanolem (30 ml). Tento roztok se míchal 1 hodinu při laboratorní teplotě a zakoncentroval na suchý prášek. Prášek se rozsuspendoval v ethyletheru (3 χ 200 ml) a přefiltroval. Ether se zakoncentroval a olej rekrystalizoval z acetonitriiu a získalo se 800 mg (40% výtěžek) produktu ve formě bezbarvého oleje: ¹H NMR (C6D6) δ 0,64 (s, 3H), 0,67 (s, 3H), 0,88 (d, J = 3,0 Hz, 3H), 0,84-2,61 (komplex m, 52 H), 2,38-2,95 (komplex m, 14 H), 3,46 (m, 3H); ¹³C NMR (CDCI3) δ 71,4, 63,1, 62,6, 61,8, 58,2, 56,5, 56,1, 51,5, 50,4, 50,1, 48,3, 47,9, 46,1, 45,7, 42,6, 42,1, 40,4, 40,1, 36,4, 35,8, 35,7, 35,6, 35,4, 34,5, 31,9, 31,7, 31,6, 30,8, 30,5, 29,4 , 28,3, 27,2, 26,4, 26,2, 24,9, 24,2, 23,8, 20,8, 18,6, 12,0; MS (LRFAB, NBA + Li) m/z 677 (M + Li)⁺.

P, Syntéza ídichlor 2,3-(R,R)-cyklohexan-6-(S)-f3-(lithocholvaminó)propvll-1,4,7,10.13penta-azacvklopentadekanu manganatéhol

2,3-(R,R)-cyklohexan-6-(S)-{3-(lithocholyamino)propyl}-1,4,7,10,13-pentaazacyklopentadekan připravený v příkladu 10 (547 mg, 0,817 mmol) se přidal k horké39 • »· » » » ....

• · ··· · ' * * ΚΙ , _ν ··· · · * * * ·' * *· ·* a· a* mu bezvodému roztoku methanolu (50 ml) obsahujícímu chlorid manganatý (103 mg, 0,818 mmol) v atmosféře suchého dusíku. Po 2 hodinovém refluxu se roztok zredukoval na suchý zbytek, který se rozpustil ve směsi rozpouštědel THE (35 ml) a ethyletheru (5 ml) a přefiltroval přes celitovou podušku. Zakoncentrováním a rozmělněním v ethyletheru se po filtraci získalo 512 mg (79% výtěžek) komplexu ve formě bílé pevné látky: FAB hmotnostní spektrum (NBA) m/z 760 [M-Clf; Analýza vypočtená pro C^HraNeoMnCt C 61,79; H, 9,87; N, 10,55; Cl, 8,90. Skutečné hodnoty: C, 62,67; H, 9,84; N, 8,04; Cl, 8,29.

Příklad 2

Kinetická analýza zastaveného toku

Kinetická-analýza zastaveného, toku.se použila ke zjištění, zda může sloučenina kataiyzovat dismutaci superoxidu (Riley, D.P., Rivers, W. J. a Weiss., R. H., StoppedFlow Kinetic Analysís for Monitoring Superoxide Decay in Aqueous Systems,” Anal. Biochem. 196. 344-349 [1991]). Pro dosažení konzistentního a přesného měření byly všechny činidla biologicky čisté a neobsahovaly kov. Za tímto účelem byly všechny pufry (Cabiochem) biologicky odstíněny bez obsahu kovů a pracovalo se s nimi s laboratorními potřebami, které byly před použitím promyty nejprve v 0,1 N HCI, pak v přečištěné vodě, následné v lázni 10⁴M EDTA při pH 8, a pak se promyly v přečištěné vodě a sušily několik hodin při 65°C. Bezvodý roztok superoxidu draselného v DMSO (Aldrich) se připravil v suché, inertní atmosféře argonu ve vakuové atmosféře rukavicově skříně za použití suchých skleněných nádob. Roztok DMSO se připravil čerstvý před každým experimentem zastaveného toku. Pro rozdrcení žluté pevné látky superoxidu draselného (přibližně 100 mg) se použil hmoždíř s paličkou. Prášek se pak rozmělnil v několika kapkách DMSO a suspenze se dala do nádoby obsahující dalších 25 ml DMSO. Výsledná suspenze se míchala 1/2 hodiny a pak se přefiltrovala. Tento postup je reprodukovatelný při přibližně 2 mM koncentracích superoxidu v DMSO. Tyto roztoky se přemístily do rukavicového vaku v utěsněných zkumavkách před připojením stříkačky pod atmosférou dusíku. Je třeba vzít v úvahu, že roztoky DMSO/superoxid jsou velmi citlivé na vodu, teplo, vzduch a vnější kovy. Čerstvý, čistý roztok má slabé nažloutlou barvu.Voda pro roztoky pufrů se použila z vlastního systému pro výrobu deionizované vody ze systému Bamstead Nanopure Ultrapure Séries 550 a pak dvakrát předestilované, nejprve z alkalického managanistanu · * ···· ♦ · · · ··· · ·

444 4 4 · · 4 • 4 4 4 · · 444 44 44 draselného, a pak ze zředěného roztoku EDTA. Například roztok, obsahující 1,0 g managanistanu draselného na 2 litry vody a navíc hydroxid sodný potřebný pro úpravu pH na 9,0, se přidal do 2 litrové nádoby s horní částí upravenou pro destilaci rozpouštědla. Tato destilace oxidovala jakoukoli stopu organické sloučeniny ve vodě. Závěrečná destilace se prováděla v atmosféře dusíku v 2,5 litrové nádobě obsahující 1500 ml vody z předchozí destilace a 1,5 χ 10⁶ M EDTA. Tento krok odstranil zbývající stopy kovů z ultračisté vody. Pro zabránění ztráty EDTA z celého objemu z refluxního ramena do pevné horní části, se 40 cm vertikálního ramena obalilo skleněnými kuličkami a utěsnilo izolací. Tento systém produkoval odvzdušnénou vodu, u které bylo možné naměřit vodivost menší než 2,0 nanoohmů/cm²

Systém spektrometru pro měření zastaveného toku byl navržen a vyroben Kinetic. Instruments lne. (Ann Arbor, Ml) a byl připojen k osobnímu počítači MAC IICX. Soft-, ware pro analýzu zastaveného toku byl testován Kinetic Instruments lne. a zapsán v QuckBasic s ovladačem MacAdios. Běžný objem nástřiku (0,10 ml pufru a 0,006 ml DMSO) se kalibroval kvůli velkému přebytku vody ve směsi s DMSO. Aktuální poměr byl přibližně 19/1, proto byla počáteční koncentrace superoxidu ve vodném roztoku v rozmezí 60-120 μΜ. Vzhledem k tomu, že v literatuře uváděný absorpční koeficient superoxidu v H₂O je při 245 nm přibližně 2250 M'¹ cm'¹ (1), očekávala se počáteční hodnota absorbance přibližně 0,3-0,5 pro 2 cm měřící dráhu kyvety, což se také potvrdilo experimentálně. Vodné roztoky smíchané s DMSO roztokem superoxidu se připravily za použití 80 mM koncentrace Heppes pufru, pH 8,1 (volná kyselina + forma Na). Jedna ze zásobních stříkaček se naplnila 5 ml roztoku DMSO, zatímco jiná se naplnila 5 ml vodného roztoku pufru. Vstupní blok pro nástřik vzorku, směsná komůrka a spektrometrická buňka se předem temperovaly v cirkulující vodní lázni termostatu o teplotě 21,0 ± 0,5 °C.

Před zahájením sběru údajů pro rozklad superoxidu se získal průměr základní linie několika nástřiky pufru a roztoku DMSO do směsné komůrky. U těchto nástřiků se zaznamenal průměr a uchoval jako základní linie. První nástřiky získané během série měření byly vodné roztoky, které neobsahovaly katalyzátor. To potvrdilo, že žádná série měření neobsahovala kontaminační látky, které by mohly vzniknout zahájením rozkladu superoxidu. Jestliže se objevil rozklad superoxidu u nástřiků s roztokem pufru v pořadí jako druhý, použitým roztokem mohl být manganatý komplex. Potenciál SOD byl obecně zjišťován pro velké koncentrační rozmezí. Poněvadž byla počáteční kon41 · · ··♦· · · · · ♦·* · . · · · · ·· ·· · 1 ·· ♦ ··· ··♦ *· ·· centrace superoxidu po smíchání DMSO s vodným pufrem přibližně 1,2 χ 1(Γ* M, bylo třeba použít koncentraci manganatého komplexu, která byla alespoň 20 krát nižší než koncentrace substrátového superoxidu. Následně se sledovaly sloučeniny pro aktivitu SOD za použití koncentrací v rozmezí 5 x 10'⁷ M až 8 χ 10* M. Získané hodnoty z měření se převedly . do vhodného matematického programu (jako je například Cricket Graph) pro provedení standardní kinetické analýzy. Katalytická rychlostní konstanta pro dismutaci superoxidu mánganatým komplexem z příkladu 1 byla stanovena z line' ární závislosti získaných rychlostních konstant (Κ,^) na koncentraci manganatého j> komplexu. Hodnoty K^ se získaly z lineární závislosti In absorbance při 245 nm na čase dismutace superoxidu manganatým komplexem. K^ (M'¹ s'¹) manganatého komplexu z příkladu 1 při pH = 8,1 a 21°C byla zjištěna. 0,77 χ 10*⁷ M¹ s‘\ <

.. Makrocykl ickýligand-manganatého-komplexuobsahújící^_dúšík'z'příkládíj^1’je^ účinný katalyzátor pro dismutaci superoxidu, jak je Zřejmé z kio, uvedené výše.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Komplexní sloučenina obecného vzorce kde R, R, Ri, Ri. R₂, R2. R3, R₃, R4, R41 Rs, Rs, R6, Re! R7, Rz, Rej Re! R9 s Re předR· stavuji nezávisle vodík, alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, cykloalkylalkyl, cykloalkylcykloalkyl, cykloalkenylalkyl, alkylcykloalkyl, alkenylcykloalkyl, alkylcykloalkenyl, alkenylcykloalkenyl, heterocyklické, arylové a aralkylové zbytky a zbytky připojené k α-uhlíku a-aminokyselin; nebo R1 nebo R/ a R₂ nebo R₂, R₃ nebo R₃a 1^ nebo R₄ , Rs nebo R₅ a Re nebo Re, R₇ nebo R₇ a Re nebo Re a Re nebo Rg a R nebo R spolu s atomy uhlíku, ke kterému jsou nezávisle připojeny za vzniku nasyceného, částečně nasyceného nebo nenasyceného kruhu s 3 až 20 atomy uhlíku; nebo R nebo R a R1 nebo R1 a R₂ nebo R_{2 |} R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R₄ , R5 nebo R₅ a Re nebo Re, R₇ nebo R₇ a Re nebo Re a R₉ nebo Rs spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou nezávisle připojeny za vzniku heterocyklu se 2 až 20 atomy uhlíku za předpokladu, že když heterocyklus obsahující dusík je aromatický heterocyklus, který neobsahuje vodík připojený k dusíku, vodík připojený k dusíku uvedeného vzorce, tento dusík je též v makrocyklu a skupiny R připojeny ke stejným atomům uhlíku makrocyklu nejsou přítomny; a jejich kombinace;

   kde (1) jedna až pět R” skupin je připojeno k biomolekule pomocí vazebné skupiny, (2) jedna z X, Y a Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny, nebo (3) jedna až pět ”R” skupin a jedna z X, Y a Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny; a biomolekuly jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající ze steroidů, hydrogenuhličitanů, mastných kyselin, aminokyselin, peptidů, proteinů, protilátek, vitamínů,

   - ’ » -ww»» »»·» ,~ · · · · · · ····

   43 · · ···· · · · «' ♦·♦ · · • · · * * *·9 ·· « ··· ♦·· «· ·· lipidů, fosfolipidů, fosforečnanů, fosfonátů, nukleových kyselin, enzymových substrátů, enzymových inhibitorů a enzymových receptorových substrátů a vazebné skupiny jsou odvozeny od substituentu připojenému k R” skupině nebo uvedená X, Y a Z, která je reaktivní s biomolekulou, a je vybrána ze skupiny sestávající z -NH₂, -NHR₁₀, -SH, -OH, -COOH, -COOR₁₀, -CONH₂, -NCO, -NCS, -COOX”, alkenytu, alkinylu, halogenidu, ptoluensulfonátu, methansulfonátu, tresylátu, triflátu a fenolu, kde Rw je alkyl, aryl, nebo alkaryl a X” je halogenid; kde M je Mn nebo Fe a kde X, Y a Z jsou ligandy nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z halogenidu, oxo, aquo, hydroxo, alkohol, fenol, dikyslík, peroxo, hydroperoxo, alkylperoxo, arylperoxo, amoniaku, alkylamino, arylamino, heterocykloalkylamino, heterocykloarylamino, aminoxidu, hydrazinu, alkylhydrazinu, arylhydrazinu, oxidu dusičného, kyanidu, kyariátu, thiokyanátu, izokyanátu, izothiokyanátu, alkylnitrilu, - aryinitrilu,-alkyl izonitrylu,- arylizonitrilu, -dusičnanu,- dusitanu,--aztdo,.........

   alkylsulfonové kyseliny, ary Isulfonové kyseliny, alkylsulfoxidu, arylsulfoxidu, alkylarylsulfoxid, alkylsulfenové kyseliny, arylsulfenové kyseliny, alkylsulfínové kyseliny, arylsůlfinové kyseliny, alkylthiolkarboxylové kyseliny, arylthiolkarboxylové kyseliny, alkylthiolthiokarboxylové kyseliny, arylthiolthiokarboxylové kyseliny, alkylkarboxylové kyseliny, arylkarboxylové kyseliny, močoviny, alkyl močoviny, arylmočoviny, alkylarylmočoviny, thiomočoviny, arylthiomočoviny, alkylarylthiomočoviny, síranu, siřičitanu, disíranu, disiřičitanu, thiosíranu, thiosiřičitanu, hydrogensiřičitanu, alkylfosfinu, arylfosfinu, alkyIfosfinoxidu, arylfosfinoxidu, alkylfosfinsulfidu, arylfosfinsulfídu, alkylarylfosfinsulfdidu, alkylfosfonové kyseliny, arylfosfonové kyseliny, alkylfosfinové kyseliny, arylfosfinové kyseliny, fosforečnanu, thiofosforečnanu, fosforitanu, pyrofosforitanu, trifosforečnánu, hydrogenfosforečnanu, dihydrogenfosforečnanu, alkylquanidinu, .arylquanidinu, alkylarylquanidinu, alkylkarbamátu, arylkarbamátu, alkylarylkarbamátu, aryldithiokarbamátu, alkylaryldithiokarbamátu, hydrogenuhličitanu, uhličitanu, chloristanu, chlorečnanu, chloritanu, chlornanu, bromistanu, bromečnanu, bromitanu, bromnanu, tetrahalogenmangananu, tetraflourborátu, hexáfluorfosforečnanu, hexafluorantimoničnanu, fosfornanu, jodičnanu, jodistanu, metaboritanu, tetraarylboritanu, tetraalkylboritanu, vinanu, šťavelanu, jantaranu, citrátu, askorbátu, sacharinátu, aminokyseliny, hydroxamové kyseliny, thioparatoluensulfonátu, a aniontů iontoměničové pryskyřice, nebo jejich odpovídajících aniontů, nebo X, Y a Z jsou nezávisle připojeny k jedné nebo více skupinám ’R, kde n je 0 nebo 1.

   • · · · φ φ φφφφ > • φ φ ·· ΦΦΦ φφφφ φ • φ φ
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde 1 až 2 z R” skupin jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny a X, Y ani Z není připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1, kde jedna z X, Y a Z je připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny a žádná ”R skupina není připojena k biomolekule pomocí vazebné skupiny.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, kde maximálně jedna Έ” skupina, připojena k atomu uhlíku makrocyklu nacházejícího se mezi atomy dusíku, má biomolekulu připojenou pomocí vazebné skupiny.
5. 5. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jedna z ”R skupin, kromě ”R” skupin, které jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny, je vybrána ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, cykloalkylalkylu, aralkylu, alkarylu, arylu, heterocyklů a zbytků

   J připojených k α-uhlíkům a-aminokyselin a zbývající ⁿR” skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku, nasycených, částečně nasycených nebo nenasycených cyklů nebo heterocyklů obsahujícího dusík.
6. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde alespoň dvě zŘ” skupin, kromě ”R” skupin, které jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny, jsou vybrány ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, cykloalkylalkylu, aralkylu, alkarylu, arylu, heterocyklů a zbytků připojených k α-uhlíkům a-aminokyselin.
7. 7. Sloučenina podle nároku 5, kde alespoň jedna z ”R skupin, kromě ”R” skupin, které jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebné skupiny je alkyl, a zbývající R” skupiny jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku, nasycených, částečně nasycených nebo nenasycených cyklů.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jedna z Ri nebo R/ a R₂ nebo R_2l R₃ nebo R₃ a R₄ nebo R4 , Rs nebo Rs a Re nebo Re, R₇ nebo R₇ a Re nebo Re a R₉ nebo Rg’ a R nebo R spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, představují nasycený, částečné nasycený nebo nenasycený cyklus s 3 až 20 atomy uhlíku a zbývající skupiny R, kromě ”R skupin, které jsou připojeny k biomolekule pomocí vazebných skupin,

   -- -- ,-w V w v .,_···· · * ···

   45 J ······ · · · ··· · · • 0 * ··· «·« ··' ··'* jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku, heterocyklů obsahujících dusík nebo alkylových skupin.
9. 9. Sloučenina podle nároku 8, kde alespoň dvě z Ri nebo R_t a R₂ nebo R₂, R3 nebo R₃ , a Ft, nebo R4, Rs nebo R₅ a Re nebo Re, R_? nebo R? a Re nebo Re a R₉ nebo R₉’ a R nebo R spolu s atomemy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, představují nasycený, částečně nasycený nebo nenasycený cyklus s 3 až 20 atomy uhlíku a zbývající skupiny ^BR”, kromě ”R’ skupin, které jsou připojeny k bíomolekule pomocí vazebné skupiny, > jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku, heterocyklů obsahujících dusík nebo alkylových skupin.

   .1... IQ.· Sloučenina podle.nároku.8,.kde. uvedeným nasycenýrčástečně-nasyceným nebo.....nenasyceným cyklem je cyklohexyl.

   *
10. 11. Sloučenina podle nároku 10, kde uvedené zbývající skupiny ”R”, kromě R skupin,

    I. které jsou připojeny k bíomolekule pomocí vazebných skupin, jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku nebo alkylových skupin.
11. 12. Sloučnina podle nároku 1, kde uvedené R nebo R a Ri nebo R/ a R₂ nebo R₂,R3 nebo R₃ a R4 nebo R4 , R5 nebo R₅ a Re nebo Re, R₇ nebo R? a Re nebo Re a R₉ nebo R₉ spolu s atomy uhlíku, ke kterým jsou připojeny, tvoří heterocyklus obsahující dusík, se 2 až 20 uhlíkovými atomy a zbývající ”R” skupiny kromě ”R” skupin, které jsou připojeny k bíomolekule pomocí vazebných skupin, jsou nezávisle vybrány ze skupiny vodíku, nasycených, částečně nasycených nebo nenasycených cyklů nabo alkylových skupin.
12. 13. Sloučenina podle nároku 1, kde X, Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z aniontů halogenidu, organické kyseliny, dusičnanu a hydrogenugličitanu.
13. 14. Sloučenina podle nároku 1, kde M je Fe.
14. 15. Sloučenina podle nároku 1, kde M je Mn.
15. 16. Farmaceutická kompozice ve formě jednotkové dávky, využitelné pro dismutaci superoxidu, obsahující (a) terapeuticky nebo profylakticky účinné množství komplexu podle nároku 1 a (b) netoxický, farmaceuticky, přijatelný nosič, adjuvans nebo příměsi.
16. 17. Způsob prevence nebo léčby onemocnění nebo poruchy, která je vyvolána, alespoň částečně, superoxidem, zahrnující aplikaci pacientovi jako prevenci nebo léčbu terapeuticky, profylakticky, patologicky nebo resuscitačně účinného množství komplexu podle nároku 1.
17. 18. Způsob podle nároku 17, kde uvedené onemocnění nebo porucha patří do skupiny sestávající z ischemického reperfuzního poškození,,chirurgickým zákrokem vyvolané ischemie, zánětlivého onemocnění střev,., revmatoidní..arthritidy,_ atherosklerózy,- trombózy, agregace destiček, oxidací vyvolaného poškození a poruchy tkáně, osteoartriti·' * ⁵ dy, psoriázy, rejekce transplantovaného orgán, poruchy vyvolané radioaktivním záře-, ‘ ním, mozkové příhody, akutní pankreatitidy, diabetes mellitus závislého na inzuliriu, respirační nedostatečnosti u dospělých a dětí, metastázy a karcinogeneze.
18. 19. Způsob podle nároku 18, kde uvedené onemocnění nebo porucha patří do skupiny zahrnující ischemické reperfuzní poranění, mozkovou příhodu, atherosklérózu a zánét . livé onemocnění střev.