CZ27386U1

CZ27386U1 - Antiseptický přípravek na bázi bakteriofágového lyzátu pro lokální použití

Info

Publication number: CZ27386U1
Application number: CZ2014-29907U
Authority: CZ
Inventors: Roman PantĹŻÄŤek; Jiří Doškař
Original assignee: Masarykova Univerzita; Bohemia Pharmaceuticals S.R.O.
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2014-09-29

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká antiseptického přípravku na bázi bakteriofágového lyzátu pro lokální použití, který obsahuje vysoce virulentní a specificky účinné fágové částice, které mají velmi rychlý, silný a polyvalentní lytický účinek na původce stafylokokových infekcí.

Dosavadní stav techniky

Patogenní bakterie jsou původci infekčních chorob, které jsou v celosvětovém měřítku jednou z hlavních příčin lidských úmrtí. Mezi vůbec nejčastěji se vyskytující patogenní bakterie patří stafylokoky, způsobující celou řadu onemocnění, běžnými kožními infekcemi počínaje, přes závažná onemocnění orgánů jako osteomyelitidy, endokarditidy a pneumonie, až k těžkým sepsím končícím smrtí pacienta (jedinci s oslabenou imunitou, po léčbě nádorů, s implantáty, starší jedinci, pacienti s cystickou fibrózou). Mimořádnou důležitost má druh Staphylococcus aureus, který patří mezi hlavní původce komunitních a nemocničních (nozokomiálních) infekcí. Závažným problémem, který komplikuje léčbu pacientů, je vznik a šíření kmenů rezistentních k antimikrobiálním preparátům (zejména antibiotikům) jako důsledek neracionálního používání těchto látek k léčbě často banálních onemocnění. Problém zvyšujícího se počtu bakteriálních kmenů rezistentních na antibiotika může být řešen zavedením racionální fágové terapie, tzn. využitím bakteriofágů k léčbě bakteriálních infekcí jako alternativy nebo náhrady léčby antibiotiky, zejména proto, že je časově a finančně značně obtížné získávat nová účinná antibiotika (Gill and Hyman 2010, Curr. Pharm. Biotechnol. 11:2-14).

Dokument CZ 1156-79 (PV 1979-1156) popisuje antistafýlokokový lyzát pro místní použití s polyvalentním účinkem na Staphylococcus sp. Tento lyzát je určen k léčbě stafylokokových onemocnění, jejímž cílem je systematická eradikace původce onemocnění z ložisek infekce a potenciálních rezervoárů. Příslušný lyzát obsahuje účinnou složku ve sterilním tekutém médiu.

Z dokumentů CZ 20965 (UV) a CZ 21020 (UV) je známé léčivo s obsahem antistafylokokového lyzátu, kde lyzát je uchováván ve formě roztoku obsahujícím mimo jiné thiomersal, který je toxický.

Nevýhodou výše uvedených přípravků je jejich krátká expirace, jejíž prodloužení je řešeno přídavkem toxických činidel.

Úkolem technického řešení je předložení takového přípravku, který by bylo možné uchovávat po dlouhou dobu, a který by neobsahoval žádná toxická konzervační činidla.

Podstata technického řešeni

Tento úkol je vyřešen vytvořením antiseptického přípravku na bázi bakteriofágového lyzátu pro lokální použití s obsahem vysoce virulentních fágových částic při léčbě onemocnění vyvolaných kmeny bakterie Staphylococcus sp. Podstata technického řešení spočívá v tom, že antiseptický přípravek je v lyofilizované formě, jejíž účinnou lyrickou složkou jsou bakteriofágové částice, a dále lyzát bakteriálních stafylokokových buněk s imunomodulačním účinkem, peptidy z tryptonového kultivačního média a beta-kasein používaný jako protektivní látka pro lyofílizaci. Lyofílizací a použitím tryptonového kultivačního média je dosaženo zvýšení expirační doby až na dva roky. Navíc antiseptický prostředek neobsahuje toxickou konzervační látku thiomersal, čímž je omezena toxicita antiseptického přípravku. Lyofílizací bylo dosaženo přežití 10 až 20 % bakteriofágů, což je dostačující pro účinnost antiseptického přípravku.

Množství proteinů bakteriofágových částic činí 17 až 27 % hmotn., množství bakteriálních stafylokokových proteinů činí 60 až 70 % hmotn. a množství beta-kaseinu činí 7 až 17 % hmotn. přípravku. Tímto složením je dosažena optimální účinnost antiseptického přípravku, který obsahuje dostatečné množství bakteriofágových Částic, aby byl zajištěn terapeutický účinek antiseptického přípravku.

-1 CZ 27386 Ul

ΙΜΝ»

Bakteriofágový lyzát je vytvořen bakteriofágy z čeledi Myoviridae a podčeledi Spounavirinae, protože tyto bakteriofágy mají široké rozmezí hostitele, což je činí vhodnými pro využití ve fágové terapii.

Antiseptický přípravek obsahuje účinné bakteriofágové částice z více jak jednoho subtypu polyvalentního stafylokokového bakteriofága a fágových mutant s rozšířeným rozmezím hostitele pro širší aplikaci fágové terapie.

V jedné terapeutické dávce obsahuje antiseptický přípravek po rozpuštění lyofilizované formy v 10 ml vody pro injekce minimálně 10⁶ bakteriofágových částic na 1 ml přípravku, což je dostatečné množství pro účinnou terapii.

Také je výhodné, že směs více jak jednoho subtypu fága s rozšířeným rozmezím hostitele, obsahuje vždy hlavní kapsidový protein Mcp tvořící 90 % hmotn. proteinů bakteriofágových částic, přičemž zbývající množství do 100 % hmotn. tvoří kapsidový protein podobný ORF43 fága K, kapsidový protein podobný ORF95 fága K a hlavní protein bičíkové pochvy Mtsp. Zastoupení fágů ve směsi lze měnit tak, aby přípravek byl účinný na kmeny Staphylococcus sp. aktuálně cirkulující v lidské populaci. Složení hlavních fágových proteinů přitom zůstává konstantní. Díky tomu není nutné provádět rozsáhlé zkoušky bezpečnosti.

Nakonec je výhodné, že kromě bakteriofágových částic přípravek obsahuje proteiny ze stafylokokových buněk, které mají imunomodulační vlastnosti a zesilují účinnost přípravku: stafylokokový protein A tvoří 90 % hmotn. bakteriálních stafylokokových proteinů, přičemž zbývající množství do 100 % hmotn. tvoří DNA vazebný protein HU, protein chladového šoku, elongační faktory TU, G a Ts, ribozomální proteiny S2, S6, S7, S13, S14 a L7/L12, chaperon K a stafylokokové provozní enzymy: formát acetyltransferáza, L-laktátdehydrogenáza 2, omithin-karbamoyltransferáza, acetyltransferáza, arginindeamináza, superoxiddismutáza, enoláza, alkoholdehydrogenáza, fruktóza-bisfosfátaldoláza a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza.

Výhody antiseptického přípravku podle technického řešení spočívají v tom, že díky lyofilizačnímu kroku odpadá použití toxické konzervační látky, čímž je přípravek vhodnější pro účinnou terapii. Lyofilizací je dosaženo přežití 10 až 20 % bakteriofágů, což je významné navýšení proti dosavadním postupům konzervace bakteriofágů čeledi Myoviridae. Další výhodou technického řešení je, že při uchování při teplotách +2 až +8 °C klesá titr životaschopných částic během 18 měsíců pouze o jeden až dva řády.

Příklady uskutečnění technického řešení

Výchozím materiálem pro výrobu lyzátu jsou subtypy polyvalentního bakteriofága, které jsou uchovávány v lyofilizovaném stavu za dodržení systému jednotné inokulace (seed lot systém). Tyto bakteriofágy jsou při výrobě fágového lyzátu pomnoženy na nepatogenním pomnožovacím kmeni Staphylococcus aureus do vysokého titru (10⁸ — 10⁹ PFU/ml) a zpracovány do finálního antiseptického přípravku.

Používá se hlavně k eliminaci původců stafylokokových infekcí z ložisek infekce (hnisavé procesy kůže, podkoží a kožních adnex) i potenciálních rezervoárů (především nosohltanu, střevního a močového traktu). Představuje významný prostředek při komplexní léčbě chronických forem stafylokokových infekcí (hnisavé afekce, abscesy, píštěle, infekce postihující hluboko uložené měkké tkáně), který zabraňuje jejich vyústění v septický stav. Je též důležitou součástí preventivních opatření v předoperační přípravě s cílem zabránit vzniku superponovaných pyogenních komplikací po operativních intervencích.

Alternativním využitím antiseptického přípravku je uplatnění při konzervaci a uchovávání potravin, při výrobě krmiv pro hospodářská zvířata a využití při dekontaminaci povrchů (nemocniční prostředí, lékařské pomůcky).

Princip výrobního procesu

Bakteriální hostitelská kultura se kultivuje v tekutém tryptonovém médiu. Po dosažení růstu blížícího se hodnotě 1 χ 10⁹ CFU/ml se přidá aktivní fágový kmen v přibližném poměru MI = 1

-2CZ 27386 Ul (MI = multiplicita infekce), což znamená, že fágová částice připadá na 1 bakteriální buňku. Po proběhlé lýze bakteriální kultury se fágový lyzát uloží do lednice, kde je uchováván do dalšího zpracování. Léčivá látka je připravena jako směs obsahující vysoce účinné virulentní fágové částice s polyvalentním účinkem připravené kultivací subtypů bakteriofágů a standardizována ve své účinnosti podle koncentrace specifických fágových částic v 1 ml.

1. Oživení bakteriálního kmene

Lyofilizovaný kmen se po rozpuštění vyočkuje na 1,5% tryptonový agar a kultivuje se 24 hodin při teplotě +37 °C ± 1 °C. Narostlý bakteriální kmen se přeočkuje na potřebný počet ploten s 1,5 % tryptonovým agarem a kultivuje se 24 hodin při teplotě + 37 °C ± 1 °C. Narostlá kultura se použije pro zaočkování tekuté tryptonové půdy.

2. Příprava subkultur

Bakteriální kultura se z pevné půdy přeočkuje do Erlenmayerovy baňky se 100 ml tryptonové půdy. Množství zaočkovaných Erlenmayerových baněk závisí na potřebném množství subkultur pro výrobu (1-3 ks), kultivace probíhá 24 hodin při teplotě + 37 °C ± 1 °C.

3. Příprava fágového startéru metodou dvouvrstvého agaru

Petriho misky s 1,5 % tryptonovým agarem, který slouží jako základ, se přelijí 3 ml 0,36% tryptonového agaru, který obsahuje bakteriální suspenzi příslušné hostitelské bakterie Staphylococcus aureus a suspenzi bakteriofága, získaného resuspendováním lyofilizovaného fágového kmene v izotonickém roztoku. Následuje inkubace 24 h při teplotě +37 °C ± 1 °C. Poté se povrch každé plotny přelije tryptonovým tekutým médiem. Po 30 minutách se měkký povrch s 0,36% tryptonovým agarem smyje a centrifuguje 3 x 1 hodinu při 5000 RPM. Bakteriofág je obsažen v supematantu.

4. Příprava fágového startéru v tekuté půdě

Subkulturou hostitelské bakterie Staphylococcus aureus se inokuluje tryptonová půda. Kultivace probíhá v termostatu při teplotě +37 °C ± 1 °C tak dlouho, až je dosažena optická denzita biomasy 0,3 - 0,4 (měřeno na spektrofotometru při vlnové délce 500 nm). Do stafylokokové suspenze se přidá 15 - 20 ml fágového lyzátu (připraveného dle předchozího bodu, o min. títru 1 x 10¹⁰ PFU/ml).

Probíhá pomnožení bakteriofága při pokojové teplotě 18-20 hodin za stálého třepání. Následuje odstranění zbytků buněk centrifugaci 1 hodinu při 5000 RPM. Bakteriofág je obsažen v supematantu.

5. Příprava velkého objemu bakteriální suspenze

Bakteriální suspenze z Erlenmayerových baněk se zaočkuje do 3000 ml tryptonové půdy v 5 1 lahvi.

Kultivace při + 37 °C ± 1°C probíhá tak dlouho, než se dosáhne požadované optické denzity 0,25 - 0,35 (měřeno na spektrofotometru při vlnové délce 500 nm). Doba kultivace se pohybuje zpravidla v rozmezí 4 až 5 hodin. První vzorek na kontrolu denzity je odebrán po 3 hodinách kultivace, další vzorky jsou odebírány v závislosti na nárůstu bakterií.

6. Příprava velkého objemu fágového lyzátu

K bakteriální suspenzi se přidá fágový startér o min. títru 1 x 10¹⁰ PFU/ml v množství cca 50 60 ml. Startér je asepticky přidán v okamžiku, kdy je hodnota optické denzity vzorku v intervalu (0,25 - 0,35).

Bakteriolýza probíhá při pokojové teplotě 20 - 30 hodin. Během bakteriolýzy dochází k projasňování tekuté kultury. Optická denzita lyžované bakteriální suspenze musí poklesnout pod hodnotu 0,1.

-3CZ 27386 Ul

Kultivační média pro výrobu fágového lyzátu:

Tryptonová půda

- suroviny Trypton Oxoid, Yeast extract Oxoid, chlorid sodný, purifikovaná voda Tryptonový agar

- tryptonová půda, Agar Oxoid N° 1

Sterilizace připraveného tryptonového agaru i tryptonové půdy probíhá v parním sterilizátoru při teplotě 121 °C pro dobu 30 minut.

Mezioperační kontroly kultivace jsou založeny na ověření růstových vlastností pomocí kmene Staphylococcus aureus a mikroskopické kontrole.

ío Kontrola kritických kroků a meziproduktů

Krok	Metoda	Požadavky
1. Oživení a pasážování bakteriálního kmene	Mikroskopická čistota	G+ koky, průměr 0,8 -1 pm, jednotlivé, dvojice, hrozníčky, hloučky. Nesmí obsahovat cizí mikroorganismy
Kultivační čistota	Kolonie 1-2 mm, okraje rovné, povrch hladký, vypouklý, barva zlatožlutá (bílá, béžová), neprůhledná, konzistence mazlavá. Nesmí obsahovat kolonie jiného mikrobiálního druhu.
2. Příprava bakteriálních subkultur	Mikroskopická čistota	G+ koky, průměr 0,8 - 1 pm, jednotlivé, dvojice, hrozníčky, hloučky. Nesmí obsahovat cizí mikroorganismy
3. Příprava fágového startéru metodou dvouvrstvého agaru	Stanovení počtu fágových částic	min. 1 . 10¹⁰PFU/ml
4. Příprava fágového startéru v tekuté půdě	Měření denzity spektrofotometricky	Nárůst hostitelské bakterie na OD₅₀₀ 0,3 - 0,4
Stanovení počtu fágových částic	min. 1 . 10¹⁰PFU/ml
5. Příprava velkého objemu bakteriální suspense	Mikroskopická čistota	G+ koky, průměr 0,8-1 pm, jednotlivé, dvojice, hrozníčky, hloučky. Nesmí obsahovat cizí mikroorganismy
Měření denzity spektrofotometricky	Nárůst hostitelské bakterie na OD₅₀₀ nm 0,25,-0,35
6. Příprava velkého objemu fágového lyzátu	Měření denzity spektrofotometricky	Kontrola nárůstu bakteriofága pokles OD₅00nmPOd 0,1

Izolace nových subtypů bakteriofága a inovace antiseptického přípravku

Subtypy bakteriofága s širším rozmezím hostitele jsou izolovány z plaků vyrostlých po výsevu výchozího fága na necitlivé bakteriální kmeny Staphylococcus aureus. Izolace nových účinných subtypů je prováděna výsevem lyzátů fágů o vysokém titru na nárůst necitlivých kmenů. Jednotíš livé plaky, které na těchto kmenech vyrostou s velmi nízkou frekvencí (10‘⁹ - 10⁶), jsou pak použity k založení lyzátů obsahujících mutantní fágy. Pro dosažení širokého lyrického spektra může být selekce prováděna v několika stupních, během nichž jsou fágové mutanty získané na jednom rezistentním kmeni následně vysévány na další (jiné) rezistentní kmeny. Během tohoto procesu probíhají ve fágových genomech mutace, které ovlivňují lyrické schopnosti fága a vedou k rozšíření jeho rozmezí hostitele. Eventualita, že selektované fágy mohou být výsledkem modifikace indukované hostitelským kmenem použitým pro jejich selekci, je ověřena stanovením hodnoty účinnosti výsevu (eop) na testovaných kmenech a jejich schopnosti udržet si široké roz-4CZ 27386 Ul mezí hostitele po opakovaném pomnožení na propagačním kmeni (testování reverze). Na základě vlastních dlouholetých zkušeností má však většina takto získaných bakteriofágových subtypů charakter mutant, které si rozšířené rozmezí hostitele trvale udržují.

Výroba konečného přípravku

Popis a složení konečného přípravku

Hotový léčivý přípravek je lyofilizovaný prášek pro přípravu roztoku (lyofilizát) vyrobený sterilní filtrací a lyofilizací směsi antistafylokokového fágového lyzátu obsahující účinné fágové částice polyvalentního stafylokokového bakteriofága.

Antiseptický přípravek na bázi bakteriofágového lyzátu pro lokální použití obsahuje vysoce účinné virulentní fágové částice s polyvalentnim účinkem. Je standardizován ve své účinnosti podle koncentrace specifických fágových částic po rekonstituci prášku pro přípravu roztoku v rozpouštědle (voda na injekci) na 1 ml.

V jedné terapeutické dávce o objemu 10 ml je obsaženo minimálně 10⁶ bakteriofágových částic na 1 ml.

Výrobní proces konečného léčivého přípravku

Výroba šarže konečného přípravku kontinuálně navazuje na výrobu fágových lyzátů jednotlivých subtypů fágového kmene. Šarže konečného přípravku je vyrobena smícháním stejného množství fágových lyzátů jednotlivých subtypů bakteriofága, připravená směs je sterilně zfiltrována, rozplněna do lahviček a lyofilizována. Po ukončení lyofilizace jsou lahvičky s hotovým přípravkem uzavřeny zátkou, zajištěnou pertlí.

Filtrace

Směs lyzátů se po odebrání vzorku pro mikrobiální zátěž (100 ml) filtruje přes filtrační vrstvu o porositě 0,22 pm.

Mezioperační kontrola:

Stanovení mikrobiální zátěže přípravku - max. 10 PFU/100 ml.

Rozpiňování

Filtrovaný lyzát se rozplňuje po 10 ml do lahviček PNC 20 ml.

Mezioperační kontrola: Kontrola plněného objemu pomocí kalibrovaného odměmého válce.

Lyofilizace

Naplněné lahvičky překryté lyofilizační zátkou jsou lyofilizovány ve vakuu z hlubokého namražení (-45 °C) zahříváním na deskách do stanovené teploty (+30 °C).

Popis lyofilizačního cyklu:

I. Fáze: namražení desek na -50 °C, založení materiálu, namražení materiálu do vyrovnání teploty desek a materiálu na stejnou hodnotu (doba trvání fáze 1 hod.)

II. Fáze: Je udržována zmrazovací teplota desek na -50 °C a zahřívána vývěva (doba trvání fáze 30 min.)

III. Fáze: hlavního sušení - evakuace sušícího prostoru do nastaveného vakua (30-80 Pa). Po dosažení hodnoty tlaku, začíná ohřívání desek nastavené na teplotu +30 °C dle časového režimu. Tato fáze lyofilizačního procesu představuje přibližně 90 % celkového času a trvá přibližně 24 hodin.

IV. Fáze: Finální sušení za maximálního vakua (2 - 0,5 Pa) a maximální teploty +30 °C. Pokud je dosaženo teploty produktu shodné s teplotou topných desek a hodnoty vakua se při testu ukončení sušení nemění, je lyofilizace ukončena zrušením vakua.

Po ukončení lyofilizace jsou zátky zajištěny pertlí.

- 5 CZ 27386 Ul

Průmyslová využitelnost

Antiseptický přípravek podle technického řešení lze využít pro lokální terapii při léčbě onemocnění vyvolaných kmenem Staphylococcus sp.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Antiseptický přípravek na bázi bakteriofágového lyzátu pro lokální použití s obsahem vysoce virulentních fágových částic pro lokální použití při léčbě onemocnění vyvolaných kmenem bakterie Staphylococcus sp., vyznačující se tím, že jev lyofilizované formě, jeho účinnou lyrickou složku tvoří bakteriofágový lyzát, a přípravek dále obsahuje lyzát bakteriálních stafylokokových buněk s imunomodulačním účinkem, peptidy z tryptonového kultivačního média a beta-kasein, jako protektivní látku pro lyofilizací.
2. Antiseptický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství proteinů bakteriofágových částic činí 17 až 27 % hmotn., množství bakteriálních stafylokokových proteinů činí 60 až 70 % hmotn. a množství beta-kaseinu činí 7 až 17 % hmotn. přípravku.
3. Antiseptický přípravek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že bakteriofágový lyzát je vytvořen bakteriofágy z čeledi Myoviridae a podčeledi Spounavirinae.
4. Antiseptický přípravek podle alespoň jednoho z nároků laž3, vyznačující se tím, že bakteriofágový lyzát obsahuje účinné bakteriofágové částice z více jak jednoho subtypu polyvalentního stafylokokového bakteriofága a fágových mutant s rozšířeným rozmezím hostitele.
5. Antiseptický přípravek podle alespoň jednoho z nároků laž4, vyznačující se tím, že v jedné terapeutické dávce 10 ml obsahuje minimálně 10⁶ bakteriofágových částic na 1 ml přípravku.
6. Antiseptický přípravek podle alespoň jednoho z nároků laž5, vyznačující se tím, že hlavní kapsidový protein Mcp tvoří 90 % hmotn. proteinů bakteriofágových částic, přičemž zbývající množství do 100 % hmotn. tvoří kapsidový protein podobný ORF43 fága K, kapsidový protein podobný ORF95 fága K a hlavní protein bičíkové pochvy Mtsp.
7. Antiseptický přípravek podle alespoň jednoho z nároků lažó, vyznačující se tím, že stafylokokový protein A tvoří 90 % hmotn. bakteriálních stafylokokových proteinů, přičemž zbývající množství do 100 % hmotn. tvoří DNA vazebný protein HU, protein chladového šoku, elongační faktory TU, G a Ts, ribozomální proteiny S2, S6, S7, SI3, S14 a L7/L12, chaperon K a stafylokokové provozní enzymy: formát acetyltransferáza, L-laktátdehydrogenáza 2, omithin-karbamoyltransferáza, acetyltransferáza, arginindeamináza, superoxiddismutáza, enoláza, alkoholdehydrogenáza, fruktóza-bisfosfátaldoláza a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza.