CZ274699A3

CZ274699A3 - Prostředek obsahující "hedgehog" protein

Info

Publication number: CZ274699A3
Application number: CZ19992746A
Authority: CZ
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: F. Hoffmann - La Roche Ag
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 1999-08-03
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Řešení se týká prostředku obsahujícího ?hedgehog" protein, který dále obsahujejako pomocná činidla ionty zinku, síranové ionty, ionty hořčíku, ionty vápníku, cyklodextrin, neiontové detergenční činidlo a/nebo aniontový sacharid, ktetyje stabilní při teplotě okolí.

Description

Prostředek obsahující hedgehog protein

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků, výhodně farmaceutických prostředků, obsahujících hedgehog proteiny a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Hedgehog (hh) proteiny jsou známou rodinou secernovaných signálních peptidů, které jsou odpovědné za tvorbu různých struktur v průběhu embryogenese (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193 - 196; N. Perrimon, Cell 80 (1995), 517 - 520; C. Chiang et al., Nátuře 83 (1996), 407; M.J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 298 - 304; A. Vortkamp et al., Science 273 (1996), 613; C.J. Lai et al., Devolopment 121 (1995) 2349). Během jejich biosyntézy jsou po štěpení signální sekvence a autokatalytickém štěpení získány 20 kDa N-koncová doména a 25 kDa C-koncová doména. Ve své přirozené formě je N-koncová doména modifikována cholesterolem a palmitoylem (J.A. Porter et al., Science 274 (1996), 255 - 259; Pepinsky et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 14037 - 14045) . U vyšších organismů je hh rodina složena nejméně ze tří členů, označených sonic, indián and desert hh (shh, ihh a dhh; M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994)

- 51). Rozdílné aktivity hedgehog proteinů, které byly produkovány rekombinantní technikou, byly pozorovány po produkci v prokaryotických a eukaryotických organismech (M. Hyneš et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44 a T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469).

Hyneš et al., srovnávali aktivitu hh v supernatantu transformovaných buněk lidské enbryonální ledviny 293 • ·· · · · · 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 · » · •9 · · ·

99 9 9 ·· (eukaryotické hh) s hh produkovanými v E. coli a zjistili čtyřikrát vyšší aktivitu pro hh v supernatantu z ledvinně buněčné linie. Soudí se, že důvodem této vyšší aktivity je pravděpodobně další faktor, který je přítomen pouze v eukaryotických buňkách, posttranslační modifikace nebo odlišný N-konec, protože hh izolovaný z E. coli obsahuje 50% hh formy, která má dvě další N-koncové aminokyseliny (Gly-Ser) nebo je zkrácen o 5 - 6 aminokyselin nebo více agreguje (t.j. váže se na niklové-agarosové korálky).

Nakamura et al. srovnávali aktivitu shh v supernatantu transformovaných kuřecích embryonálních fibroblastů s shh fúsním proteinem izolovaným z E. coli, který stále ještě obsahoval N-koncovou polyhistidinovou část. Shh v supernatantu fibroblastů měl sedm-krát vyšší aktivitu než přečištěný protein E. coli při stimulaci alkalické fosfatasy (AP) v C3H10T1/2 buňkách. Soudí se, že tato zvýšená aktivita je způsobena molekulami jako jsou například kostní morfogenetické proteiny (BMP), které jsou přítomné pouze v supernatantu eukaryotických buněk a způsobují silnou indukci AP.

Pepinski et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 - 14045) identifikovali shh formu, která je modifikována kyselinou palmitovou. Tento shh mutant je 30-krát účinější než nemodifikovaná forma v C3H10T1/2 testu.

Kinto et al. (FEBS Letters 404 (1997) 319 - 323) popsali, že fibroblasty, které secernují hh, indukují ektopickou tvorbu kosti na i.m. implantátech na kolagenu. Proto mají hedgehog proteiny osteoindukčvní aktivitu. Hedgehog proteiny mohou také stimulovat tvorbu buněk chrupavek (Stott et al., 1997) .

Yang et al. (Devolopment 124 (1997) 4393 - 4404) popsali, že • 0 0 0 · 0 0 0 · · · · • · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · · · 0·· 0 000 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 •••0 ··· 00 00 0 0 00 vysoké lokální koncentrace hedgehog proteinů musí trvat po dobu alespoň 16 hodin v místě účinku v těle pro to, aby se projevila jejich farmaceuticky účinná in vivo aktivita. Nosič, který popsal Yang et al., t.j. chromatografické medium Affigel CM naplněné hedgehog proteinem, Ni agarosa, kterou popsal Marti et al., Nátuře 375 (1995) 322 - 325) nebo Affigel blue, který použil Lopez-Martinez et al., Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796 nebo heparinové agarosové částice, které byly použity, jsou méně vhodné pro farmaceutické aplikace, protože jsou imunogenní a mohou způsobit zánětlivé reakce.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je stabilní, výhodně vodný (výhodně farmaceutický) prostředek obsahující hedgehog proteiny.

Tohoto předmětu je dosaženo ve farmaceutickém prostředku obsahujícím hedgehog proteiny, který obsahuje hedgehog proteiny ve farmaceuticky účinném množství a jako pomocná činidla obsahuje ionty zinku, ionty hořčíku, ionty vápníku, síranové ionty, cyklodextrin, neiontová detergentní činidla a/nebo aniontové sacharidy jako je chondroitinsulfat nebo heparin.

Překvapivě bylo zjištěno, že jedno nebo více pomocných činidel vybraných ze skupiny zahrnující ionty zinku, ionty hořčíku, ionty vápníku, síranové ionty, cyklodextrin, neiontová detergentní činidla a/nebo aniontové sacharidy jako je chondroitinsulfat nebo heparin, je schopno stabilizovat hedgehog proteiny (ve farmaceutickém prostředku nebo v jiné formě), výhodně ve vodném roztoku. V důsledku toho může být aktivita hedgehog proteinů udržena delší dobu například při teplotě okolí a prostředek obsahující hedgehog proteiny může být skladován delší dobu při teplotě okolí. Pomocná činidla podle předkládaného vynálezu jsou také vhodná pro stabilizaci hedgehog proteinů v lyofilizované formě (výhodně jako zásobního nebo farmaceutického prostředku) a také jsou vhodná pro stabilizaci hedgehog proteinů během výroby prostředků obsahujících hedgehog proteiny jako jsou implantáty, mikročástice, gely, atd. a při vyšších teplotách (například při 37 °C).

Ve vodných roztocích hedgehog proteinů podle předkládaného vynálezu je pomocné činidlo v molárním nadbytku vzhledem k hedgehog proteinům. Tento nadbytek je výhodně 1 - 1000-násobný, lépe 1 - 100-násobný. Vodný roztok podle předkládaného vynálezu je zejména vhodný pro výrobu kombinací hedgehog proteinů s nosiči.

Proto je dalším předmětem předkládaného vynálezu vodný roztok hedgehog proteinu, který obsahuje molární nadbytek pomocných činidel podle předkládaného vynálezu vzhledem k hedgehog proteinu. Tento roztok je výhodně pufrovaný a/nebo lyofílizovaný.

Množství pomocných činidel podle předkládaného vynálezu je samo o sobě nedůležité a může se lišit ve velkém rozsahu. Výhodné množství závisí na farmaceutické kompatibilitě pomocného činidla a rozsahu stabilizačního účinku ve farmaceuticky přijatelné koncentraci. Ionty zinku jsou zejména vhodné jako stabilizační činidlo a mohou být výhodně použity v koncentraci například 0,01 až 100 mmol/l. Tato koncentrace má výrazný stabilizační účinek na hedgehog proteiny. Ionty zinku jsou přednostně přidány ve farmaceuticky kompatibilních dávkách.

«· · ♦ ♦ · · · · · · • · · · · · · · · φφ φ • · · · · · · · · · • · · · · · · · · «· · « · · • · · · · · · •··· ··· «· ·· φ· φφ

Cyklodextrinem může být v předkládaném vynálezu výhodně cyklodextrinsulfat. Koncentrace jsou výhodně v rozmezí od 1 do 20% hmotnostních. Heparin o nízké molekulové hmotnosti (přibližně 3 kDa) je výhodně použit jako aniontový pólysacharid. Koncentrace je výhodně od 0,5 do 50 mg/ml pro heparin o nízké molekulové hmotnosti a odpovídající molární množství se použijí pro heparin o vysoké molekulové hmotnosti. Síranové ionty se přednostně použijí ve formě síranu zinečnatého. Koncentrace síranových iontů je výhodně od 0,01 do 100 mmol/1. Vápníkové a hořečnaté ionty se výhodně použijí v koncentracích 0,01 až 100 mmol/1. Neiontovými detergentními činidly jsou výhodně polyoxysorbaty (například Tween^R20, Tween^R80), výhodně v koncentracích od 0,01 do 0,1% (hmot./obj.).

Hedgehog protein je výhodně přítomen na biologicky kompatibilním nosiči a v tomto případě se nosič váže na hedgehog protein v aktivním, složeném stavu a může lokálně uvolňovat hedgehog protein in vivo v jeho aktivní formě a kontrolovaným způsobem. Takové prostředky jsou zejména vhodné pro hojení defektů kostí a chrupavek, ale mohou být také použity pro hojení neuronálních defektů nebo pro systémové podání.

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje prostředek, lépe farmaceutický prostředek, hedgehog protein navázaný na hydrofilní nosič, který je biologicky kompatibilní a který může být použit například jako implantát. Nosičem je výhodně polymer, který

- se váže na hedgehog protein jako nosič s negativním nábojem v důsledku iontových interakcí,

- nezpůsobuje denaturaci hedgehog proteinu po navázání na nosič, • * · · · «· · * · · * · · · * • · · ···· ·« · 9 9 9 • · · · ·

- obsahuje alespoň 0,1 až 1, lépe 0,1 až 2 negativně nabité zbytky na monomer za neutrálních podmínek,

- nese náboj, který je způsoben acidickými skupinami, jako jsou síranové, karboxylové nebo fosfátové skupiny,

- má průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 50000 Da.

Bylo zjištěno, že po navázání na solubilní nebo insolubilní polymerovou matrici s negativním nábojem mohou být hedgehog proteiny reversibilně a aktivně uvolňovány kontrolovaným způsobem z nosiče in vivo. Takové matrice jsou popsány například v Evropské patentové přihlášce č. 98104416.7.

Farmaceutický účinek označuje neurologické účinky na nervové buňky, účinek na chondrogenesi a/nebo chondroindukci a výhodně účinek na osteogenesi a/nebo indukci, jak je popsáno v Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997) 319 - 323 pro kostní indukci, v Miao et al, J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899, pro účinek na nervové buňky a v Stott et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 2701 pro indukci buněk chrupavky.

Roztoky hedgehog proteinů s vysokými koncentracemi jsou nutné pro výrobu matricí, které jsou potažené hedgehog proteiny takovým způsobem, že vykazují odpovídající farmaceutickou účinnost při lokální aplikaci. Bylo zjištěno, že farmaceuticky vhodné nosiče potažené hedgehog proteiny by měly obsahovat koncentrace hedgehog proteinů od 0,1 do 10 mg/ml nosiče a vyšší. Zejména výhodné jsou takové nosiče, které obsahují hedgehog proteiny v koncentraci 0,1 až 10 mg/ml nosiče a vyšší, hedgehog proteiny jsou sami o sobě špatně rozpustné. Bylo nicméně překvapivě zjištěno, že rozpustnost hedgehog proteinů se významně zvyšuje, že hedgehog proteiny jsou chráněny před oxidací a že stabilita hedgehog proteinů je zlepšena při nízkých koncentracích (1 mg/ml a nižších) • · • · · * ♦ · 9 • *·· 4 «·· ·«· • * · · v roztocích, které obsahují arginin nebo argininiové ionty (výhodně argininiumsulfat). Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou proto vodné roztoky hedgehog proteinů podle předkládaného vynálezu v koncentracích 1 mg/ml a vyšších, které dále obsahují arginin nebo argininiové ionty a které jsou výhodně pufrované. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výroby nosičové matrice potažené hedgehog proteinem, který obsahuje inkubaci matrice s roztokem hedgehog proteinu podle předkládaného vynálezu v koncentraci 1-10 mg/ml hedgehog proteinu, který obsahuje pomocná činidla podle předkládaného vynálezu a arginin nebo argininiové ionty, výhodně jako argininiumsulfat a dále obsahuje izolaci matrice potažené uvedeným způsobem.

Takové roztoky jsou vhodné pro výrobu nosičových matricí, které obsahují hedgehog proteiny ve farmaceuticky účinných koncentracích a které jsou vhodné pro farmaceutické aplikace. Koncentrace argininu nebo argininiových iontů nebo argininiumsulfatu jsou výhodně mezi 10 a 700 mmol/1, nejlépe mezi 10 a 500 mmol/1 a výhodně je pH mezi 5 a 8, lépe je pH mezi 6 a 8.

Termín aktivita, jak je zde použit, znamená aktivitu alkalické fosfatasy (stimulaci exprese alkalické fosfatasy), kterou může polypeptid indukovat v savčích buňkách (aktivita v testu na alkalickou fosfatasu). V tomto testu je myší fibroblastová buněčná linie kultivována v mediu, které obsahuje fetální telecí sérum. Následuje přidání sterilního filtrovaného vzorku a buňky jsou lyžovány po asi 5 dnech a v buněčném lyzátu se určí alkalická fosfatasa podle štěpení chromogenního substrátu (pNP, p-nitrofenolu) (J. Asahina, Exp. Cell Res. 222 (1996) 38 - 47 a T. Nakamura (1997)).

Termín hedgehog protein označuje secernovaný signální protein, který je odpovědný za tvorbu mnoha struktur v embryogenesi. Zejména výhodné jsou sonic, indián a desert hh (M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994) 43 - 51). Výhodně se použije zpracovaná forma (zralá N-koncová signální doména) sonic hh proteinu (sekvence: EMBL databanka, č. L38518). Proteiny hedgehog rodiny vykazují výraznou homologii aminokyselinové sekvence a proto je také výhodná exprese takových nukleových kyselin kódujících hedgehog proteiny, které jsou z 80% nebo více homologní s výše uvedenou sekvencí hedgehog proteinu. Výhodně jsou použity deriváty hedgehog proteinů, které jsou popsány například v Evropské patentové přihlášce č. 98102095.1 a 98107911.4.

Prekursorový protein lidského sonic hedgehog proteinu obsahuje aminokyseliny 1 - 462 sekvence popsané v EMBL databance pod č. L38518. Aminokyseliny 24 - 197 představují zralou signální doménu, aminokyseliny 32 - 197 představují signální doménu zkrácenou o osm aminokyselin a aminokyseliny 198 - 462 představují autozpracovanou C-koncovou doménu po autoproteolytickém štěpení.

Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují farmaceuticky účinné dávky hh proteinu a mohou být podány lokálně nebo systémově. Je výhodné použití proteinů podle předkládaného vynálezu v kombinaci s jinými proteiny hedgehog rodiny nebo kostními růstovými faktory, jako jsou například kostní morfogenetické proteiny (BMP) Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expresion (1993) Academie Press Inc., 131 - 167) nebo s parathyroidálními hormony (Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277 - 289) nebo s inzulínu-podobnými růstovými faktory (IGP-1 nebo 2) a se členy rodiny ·· ·· tata »· ···· ···# ···· «tatata ·· « ··« · ··« ··· • · · · «

99 · transformujících růstových faktorů (TGF-β, GDF).

Prostředky podle předkládaného vynálezu výhodně obsahují polymer, který působí jako strukturální substance a zároveň má také adhesní funkci pro buňky. Kolagen je příkladem takové strukturální substance. V tomto případě je výhodné, že strukturální substance je přítomna v nižších koncentracích, než hydrofilní biologicky kompatibilní nosič podle předkládaného vynálezu.

Dále je pro výrobu prostředků také výhodné přidání pomocných činidel jako jsou cukry (manitol, sacharosa, laktosa, glukosa, sacharosa, trehalosa, výhodně 20 - 100 mg/ml) nebo aminokyselin jako je glycin nebo arginin, methionin, cystein, stejně jako antioxidačních činidel, jako je citrát, thioglycerol, acetylcystein, polyethylenglykol (1 - 10% hmotnostních), deetergenční činidla, výhodně neiontová detergenční činidla (výhodně v koncentraci 0,01 - 0,1% hmotnostních), například polysorbaty (Tween^R20 nebo Twenn^R80) nebo polyoxyethyleny, protizánětlivá činidla, lokální anestetika, antibiotika a/nebo stabilizační činidla, jako jsou lipidy, mastné kyseliny a glycerol.

V dalším výhodné provedení obsahují prostředky obsahující hedgehog proteiny podle předkládaného vynálezu dále suramin a takové prostředky mohou být výhodně použity.

Prostředky mohou obsahovat další farmaceutická pomocná činidla.

Ve výhodném provedení obsahuje prostředek hedgehog protein v koncentraci 0,1 - 100 mg/ml.

4449 • 49 ·· 44 • ♦ * 4 * »9 9

949 949 « 9 · « ·

Ve výhodném provedení prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelný pufr, který je biologicky kompatibilní, výhodně v rozmezí mezi pH 3 a pH 10, zejména v rozmezí mezi pH 5 a 8. Překvapivě bylo zjištěno, že pomocná činidla podle předkládaného vynálezu mohou také účinně stabilizovat hedgehog proteiny v kyselém prostředí. pH hodnota prostředku by měla být vyšší než 4, aby se zabránilo denaturaci a odštěpení zinku, který je v komplexu s hedgehog proteinem. Koncentrace pufru je výhodně 1 - 500 tnmol/1, lépe 5 - 150 mmol/1 a nejlépe 10 - 100 mmol/1. V nej výhodnějších provedeních je použito 300 mmol/1 pufru fosforečnanu draselného, pH 6,0 nebo 10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 500 mmol/1 argininchloridu, pH 6,0.

Následující příklady a publikace dále ilustrují vynález, jehož rozsah je určen patentovými nároky. Popsané způsoby jsou uvedeny jako příklady, které popisují předměty vynálezu i po provedení modifikací.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: DSC (diferenciální skenovací kalorimetrie) analýza různých prostředků obsahujících hedgehog proteiny

Roztoky hedgehog proteinů s koncentrací proteinů přibližně 0,5 mg/ml se analyzují v různých pufrech (50 mM HEPES-NaOH, pH 7,2 a 150 mM arginin-Cl, pH 7,4) s nebo bez stabilizačních činidel pomocí DSC (Nano Differential Scanning Calorimeter, Calorimetry Sciences Corporation, Utah, USA) při rychlosti ohřevu 2 K/min. Použijí se následující stabilizační činidla:

- octan zinku (Merck)

- síran zinečnatý (Merck) ·· « ·· 44 44 44 • · ·· 4 44 4 · 4 4 4 • · 4444 4444 * · · · 4444 4 444 444

4 4 4 · 4 4

4 4 4 444 44 4 « · · · ·

- heparin (o nízké molekulové hmotnosti, Sigma)

- sulfatovaný β-cyklodextrin (Aldrich)

- argininsulfat

Teploty přeměny (Tt) určené pro příslušné prostředky jsou shrnuty v tabulce. Z dat je možno pozorovat, že přidání substancí uvedených v textu zvyšuje teploty přeměny a proto zvyšuje stabilitu hedgehog proteinu. Měřené teploty by neměly být chápány jako absolutní hodnoty, ale spíše představují rozdíly ve stabilitě jednotlivých prostředků navzájem.

Teploty přeměny pro hedgehog proteiny v různých prostředcích

Prostředek Tt (°C) mM HEPES-NaOH, pH 7,2 52,0 mM HEPES-NaOH, 1 mM octan zinku, pH 7,2 56,8 mM HEPES-NaOH, 1 mM síran zinečnatý, pH 7,2 60,6

150 mM argininchlorid, pH 7,4 53,5

150 mM argininchlorid, 5% (hmot./obj.) sulfatovaný 55,6 β-cyklodextrin, pH 7,4

150 mM argininchlorid, 20 mg/ml heparin, pH 7,4 57,8

150 mM argininsulfat, pH 6,0 63,4

Příklad 2: Stabilita sonic hedgehog proteinu při 37 °C

Lidský sonic hedgehog protein se inkubuje v různých prostředcích při 37 °C. Vzorky se odebírají v uvedených časech a analyzují se pomocí rpHPLC.

• 4

4 4

444

4444

4

4 4

4 4 • 4

4

44 * 4 4

4 4

444 »44

4

4· 44

Prostředek A: PBS (10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 150 mmol/1 chloridu sodného, pH 7,4)

Čas (h)	Zpětný zisk (%)	oxidovaný shh (%)	přirozený shh (%)
0	100	-	78
1	104	-	44
5	173	-	68
24	134	71	29
48	140	76	24
72	142	84	16
96	39	79	21
168	31	79	21

Prostředek B: 150 mM arginin-Cl, 0,01% Tween 80, pH 6,0
Čas (h)	Zpětný zisk	(%) oxidovaný shh (%)	přirozený shh (%)
0	100		79
1	100	-	75
5	93	-	81
24	108	40	60
48	139	45	55
72	144	58	42
96	124	76	24
168	118	86	14

Je zřejmé, že hshh má v prostředku B vyšší stabilitu než v prostředku A. Oxidace shh je významně pomalejší v prostředku obsahujícím arginin a zpětný zisk je vyšší, protože je bráněno teplotou indukované agregaci hshh.

• •99 ···

Příklad 3: Stabilita sonic hedgehog proteinu při 37 °C

Lidský hydrofobně modifikovaný sonic hedgehog protein (palmitoylovaný shh, připravený podle EP 98116733.1) se inkubuje v různých prostředcích při 37 °C. Vzorky se odebírají v uvedené časy a analyzují se pomocí rpHPLC.

Čas (h)	Zpětný zisk (%)	přirozený shh (%)
0	100	91
1	81	80
5	-	84
24	74	70
48	25	47
72	31	40
96	4	0
168	4	0

Prostředek B: 150 mM arginin-Cl, 0,01% Tween 80, pH 6,0 tt · tttttttt tttttttt tt · tttt tt tttttttt tttttt tttttt « tttttttt tttt •tttttt tttttt ·· ·« ·· ··

Čas (h)	Zpětný zisk (%)	přirozený shh (%)
0	100	89
1	114	89
5	107	89
24	-	84
48	132	85
72	129	78
96	111	73
168	88	66

Je zřejmé, že hshh má v prostředku B vyšší stabilitu než v prostředku A. Zpětný zisk je vyšší, protože je bráněno teplotou indukované agregaci hshh.

Odkazy:

Asahina, J. Exp. Cell Res. 222 (1996) 38 - 47

Bitgood, M.J. et al., Curr. Biol. 6 (1996) 298 - 304

Chiang, C. et al., Nátuře 83 (1996) 407

Evropská patentová přihláška č. 98102095.1

Evropská patentová přihláška č. 98107911.4

Fietz, M. et al., Devolopment (Suppl) (1994) 43 - 51

Hyneš, M. et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44

Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277 - 289 Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323 Lai, C.J. et al., Devolopment 121 (1995) 2349 Lopez-Martinez et al v Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796 Marti et al., Nátuře 375 (1995) 322 - 325 Miao et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899

• ·	9 *9 99	9 9
9	9 9 9 9 9	9 9 9
•	9999 99« 9	99 9
9	9 9 9 9	•
9 9 9 9	9 9 9 99 ··	9 9

Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469

Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 - 14045

Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517 - 520

Porter, J.A. et al., Science 274 (1996) 255 - 259

Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193 - 196

StOtt et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 - 2701

Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613

Wozney et al., Cell Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic

Proteins and their Gene Expression, (1993) Academie Press lne. 131 - 167

Yang et al., Devolopment 124 (1997) 4393 - 4404

Claims

1. Prostředek obsahující hedgehog protein vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství hedgehog proteinu a jako pomocná činidla ionty zinku, síranové ionty, ionty hořčíku, ionty vápníku, arginin nebo argininiové ionty, cyklodextrin, neiontové detergenční činilo a/nebo aniontový sacharid.

2. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že obsahuje ionty zinku.

3. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že obsahuje cyklodextrinsulfat.

4. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že obsahuje ionty argininu nebo argininia.

5. Prostředek podle nároku 4vyznačující se tím, že obsahuje argininiumsulfat.

6. Prostředek podle nároku 1 nebo 2vyznačující se tím, že obsahuje ionty zinku v koncentraci 0,01 - 100 mmol/1.

7. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že hedgehog protein je navázán na hydrofilní nosič, který je biologicky kompatibilní.

8. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že hydrofilní nosič je polymer.

9. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8 • · • · ··· * • 9· ·· · ·

4 · · • · · 4 • · · ·»· ·» • · « V • · » · • · · · ··· · ··· • · ** ·· *

• r vyznačující se tím, že obsahuje hedgehog protein v koncentraci 0,1 - 100 mg/ml.

10. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9 vyznačující se tím, že prostředek je pufrovaný, s pH v rozmezí od 3 do 10.

11. Prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že hedgehog protein je navázán na biologicky kompatibilní nosič.

12. Způsob výroby prostředku obsahujícího hedgehog protein vyznačující se tím, že jako základní složky prostředku jsou použity hedgehog protein ve farmaceutickém množství, stejně jako ionty zinku, ionty hořčíku, ionty vápníku, síranové ionty, cyklodextrin, neiontové detergenční činidlo, argininium, argininiové ionty a/nebo aniontový sacharid.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačuj ící se tím, že je použit hedgehog protein v koncentraci 0,1 - 100 mg/ml.

14. Způsob pro zpomalení uvolňování hedgehog proteinu v lidském těle vyznačující se tím, že hedgehog protein je podán lokálně člověku ve farmaceuticky přijatelném prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 11.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že hedgehog protein je podán v koncentraci 0,1 - 100 mg/ml.

16. Vodný prostředek obsahující hedgehog protein vyznačující se tím, obsahuje jedno nebo více pomocných činidel vybraných ze skupiny zahrnující ionty zinku,