CZ276398A3 - Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk - Google Patents
Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk Download PDFInfo
- Publication number
- CZ276398A3 CZ276398A3 CZ19982763A CZ276398A CZ276398A3 CZ 276398 A3 CZ276398 A3 CZ 276398A3 CZ 19982763 A CZ19982763 A CZ 19982763A CZ 276398 A CZ276398 A CZ 276398A CZ 276398 A3 CZ276398 A3 CZ 276398A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- immunotoxins
- antibodies
- fragments
- immunotoxic
- Prior art date
Links
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 205
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 claims abstract description 109
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 claims abstract description 109
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 claims abstract description 109
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 109
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 53
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 53
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101000972284 Homo sapiens Mucin-3A Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 10
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims description 10
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 5
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims description 2
- 102100022497 Mucin-3A Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 57
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 48
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 31
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 31
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 17
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 11
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 10
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 8
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 5
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 5
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 3
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 206010041549 Spinal cord compression Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 2
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940051173 recombinant immunotoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N (7r,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-dihydro-7h-tetracene-5,12-dione;hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N 0.000 description 1
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVKOPZMDOFGFAK-UHFFFAOYSA-N 4-hydroperoxycyclophosphamide Chemical compound OOC1=NP(O)(N(CCCl)CCCl)OCC1 WVKOPZMDOFGFAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101100175010 Caenorhabditis elegans gbf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001069 Chymopapain Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 1
- 101000623904 Homo sapiens Mucin-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101150114927 MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 1
- 108010008705 Mucin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L Tiron Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C1O ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229960002976 chymopapain Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 231100001224 moderate toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Imunotoxický prostředek pro ničení nežádoucích cílových buněk,
zejménaprsní rakoviny nd»jiných rakovinných buněk,
vyjadřujících stejné cílové antigenyv populaci buněk ohsahující
nukleované buňky získané z periferijní krve, nebo buňkyCD-34+
sebrané z výše uvedených nukleovaných buněk, nebojiné
nezralé/ranné progenitorové buňky z krve, obsahující
imohoúěinné kmenové buňky podle vynálezu obsahuje dva
imunotoxiny zaměřené na antigeny vyskytující se vmaligních
buňkách, přičemž každý imunotoxin se skládá z konjugátu mezi
protilátkou abuněčnýmtoxinem, fragmentů protilátek atoxinů
nebo rekombinačně připravených protilátek, irrunotoxinů nebo
jejich fragmentů, kde protilátkyjsou zaměřeny na epitopy na
antigenu EGP2 vyjádřenémgenemGA733 ana epitopy na
antigenu vyjádřenémgenyMUC1, MUC2 nebo MUC3 nebo
jejich kombinací atoxinemje Pseuctomonas exotoxinA
Description
Vynález se týká imunotoxického prostředku pro ničení nežádoucích cílových buněk, zejména prsní rakoviny nebo jiných rakovinných buněk, vyjadřujících stejné cílové antigeny v populaci buněk obsahující nukleované buňky získané z periferijní krve, nebo buňky CD-34+ sebrané z výše uvedených nukleovaných buněk, nebo jiné nezralé/ranné progenitorové buňky z krve, obsahující mnohoúčinné kmenové buňky.
Dosavadní stav techniky
Tak zvané transplantáty autologních kmenových buněk obsahují izolované buňky z krve nebo kostní dřeně od nemocných rakovinou, které po předběžném působení na pacienty obsahují přiměřená množství nezralé progenitorové krve a imunní buňky na obnovení funkce nepracující kostní dřeně v krátké době nebo po delším časovém období po opětném vpravení buněk do krve pacientů, od nichž se buňky získávají. Oddělování autologních hematopoietických transplantátů s používáním protilátek jev oboru známé, když transplantáty představují nevybrané vzorky kostní dřeně. Takové oddělování uveřejnil m.j. Myklebust, A.T., Godal, A., Juell, S. a Fodstad, Porovnání dvou způsobů na bázi protilátek na eliminaci buněk prsní rakoviny z lidské kostní dřeně. Cancer Res. (USA) 1994, 54/1 (209-214) a Myklebust, A.T., Godal, A., Pharo, A. Juell, S. and Fodstat, 0. Eradikace buněk malobuňkové plicní rakoviny z lidské kostní dřeni imunotoxiny, Cancer Res. (USA) 1993, 53(16), 3784-88. Obě • ·
-2·· · publikace používají imunotoxinů, přičemž protilátka je konjugována na nějaký toxin. Principem je ničit maligní buňky ze získaných buněk kostní dřeně před opětných vstřiknutím buňkové suspenze do těla pacientova. V nedávných letech byly vyvinuty metody, při nichž princip ve skutečnosti bývá opačný.
S použitím tak zvané transplantace kmenových buněk je možnost se pokusit spolehlivě oddělit z krve nebo kostní dřeně podskupinu normálních buněk, které jsou schopné obnovit normální funkci kostní dřeně po opětném vpravení buněk do pacientova těla. Tyto kmenové buňky pozůstávají ze směsi nejméně zralých prekurzorů pro krev a imunních buněk a též diferencovanějších buněk. Získání takových buněk se dá zařídit buď tak zvanou afarezí periferijní krve, což je postup trvající jeden nebo několik dní, nebo imuno-absorpcí/ selekcí buněk CD34 + (nezralé progenitorní buňky) z krve nebo kostní dřeni s použitím různých postupů známých v oboru. Stray, K.M. et al., Oddělování mnohotvarových buněk z kostní dřeně nebo periferijní krve s použitím avidinu, biotinu, imunoadsorpce v:P.G. Adrian, G. Samuel and A.W.-W. Diana (Eds), Pokroky při očišťování a postupech očišťování kostní dřeně s.97-103, Orlando: Willelis lne., 1994, popisuje oddělování buněk kostní dřeně nebo produktu afareze z periferijní krve. Tento postup se užívá na provádění očištění u pacientů s lymfonem a u pacientů s rakovinou prsu. Tato metoda obsahuje postup obohacení pro buňky CD34 + před očištěním B-buněk nebo buněk prsní rakoviny s tak zvanou avidinovou kolonou. V tomto případě se provádí očišťování nepřímo v tom smyslu, že buňková suspenze se zprvu inkubuje s primárními protilátkami, které se váží na buňky prsní rakoviny; buňková suspenze se omývá a ještě jednou inkubuje s nějakou protilátkou, která provádí vazbu na primární protilátky. Tato krysí protilátka je biotinylována, tj. napojena na nějakou molekulu, která zařizuje pevnou vazbu na • ·
-3• · · • · · · • · · · · · • · · ·· · avidin. Když tato buněčná suspenze se nakonec naloží na kolonu s avidinem konjugovanými kuličkami, jsou nádorové buňky zachycovány vazbou mezi buňkami s primární protilátkou biotinylovaným sekundárním protilátkovým avidinem. Výsledkem očišťování s použitím takového systému byla aspoň 3,2 log deplece maligních buněk. Tento princip je značně náročný na čas a pracný, neboť s buněčnou suspenzí se musí manipulovat v několika postupech, včetně inkubace s protilátkou a dvojím omytím než se nakládá na kolonu. Proto je nesnadné zamezit poškozování kmenových buněk nebo nepřipustit, aby docházelo k nežádoucímu zachycování kmenových buněk v koloně, což by bohužel znamenalo ztrátu buněk velmi důležitých pro opětné dosažení normální funkce kostní dřeni. Tyer, C.L. et al.,
Buňky prsní rakoviny jsou účinně oddělovány z progenitorových buněk periferní krve s použitím imunomagnetického postupu. Resumé z prvního zasedání Mezinárodní společnosti pro hematoterapii a techniku štěpení, v Orlando na Floridě 1993 popisuje imunomagnetickou metodu podobnou té, které bylo použito v publikaci Myklebustově výše uvedené. Této metody se však používá na buňky periferijní krve. Tento princip je též zcela odlišný od používání imunotoxinů a efektivnosti očišťování měnící se od 3,3 do 4,8 log deplece maligních buněk v modelových pokusech. Toto resumé se nezmiňuje o nějakém dalším použití nepřímého systému s inkubací primárních protilátek s následujícím omytím a novou inkubací s kuličkami připojenými na protilátky, které zajišťují vazbu na primární protilátku, avšak toto je přijatelný předpoklad. Tento postup též obsahuje přídavné a snad traumatické zacházení s normálními buňkami a postup je časově náročný. Efektivita je omezená a resumé se nezmiňuje vůbec o oddělování populací buněk CD34+, což bude značným problémem u této metody, ježto selekce buněk CD34 + je sama o sobě časově náročná a pracná. Proto se ve • · • · • · · I
-4• · · · · · • · · · · · • · · ··· ·· · většině případů používá imunomagnetický princip pro selekci buněk SD34+, což v tomto případě je následováno jedním nebo dvěma imunomagnetickými postupy na účel očišťování. Proto se vyskytuje značné riziko destrukce buněk a ztráty buněk s metodou vyžadující dlouho trvajícího postupu a vyvolávající vysoké náklady. Lemoli, R.M. et al. (1994) v Transplantace kostní dřeně 13: 465-471 popisuje očišťování lidských hematopoietických buněk a použitím avidin-biotinové imunoabsorpční techniky. Zvýšilo se očišťování neoplastických buněk použitím několika imunotoxinů obsahujících ribosome inaktivující protein saporin a zaměřený na lymfoidní související antigeny CD30 a CD2. Tecce, R. et al. (1991), v
Int, J.Cancer, 49: 310-316 popisuje očišťování autologní kostní dřeni před transplantací u pacientů postižených monocytovou leukémií s 2 monocytickými, v buňkové řadě specifickými imunotoxiny vytvořenými se saporinem a 2 MoAbs o vysoké specifičnosti pro cirkulující monocyty a M5b akutní nelymfoidní leukémii (ANLL). Ve W091/00050 se popisují imunotoxiny obsahující myelomonocytický specifický MoAB 195 užitečný na očišťování ANLL od kostní dřeni. Tonevitsky, A.G. et al. (1986) v Int. J.Cancer, 37:263-373 popisuje očišťování myších erytroleukemických kmenových buněk od kostní dřeni s použitím imunotoxinu obsahujícího konjugát ricin-A-řetězce a MoAbMAE15, který zařizuje vazbu na povrch normálních a neoplastických myších erytroidních buněk: model a vyšetřování terapie s transplantací kostní dřeně. Při izolaci kmenových buněk pro transplantaci bylo jedním z hlavních cílů, aby buňky, které se uvažují pro opětné vpravení do pacientů, byly selektivně izolovány takovým způsobem, aby transplantáty neobsahovaly žádné maligní buňky. Nedávno bylo ukázáno, že při dřívějším způsobu takové preparáty kmenových buněk proti očekávání obsahovaly maligní buňky ve vyšetřovaných případech ve značném • · počtu. Až dodnes se vynaložilo jen omezené úsilí na odstranění nebo zničení -vybraných maligních buněk v takových transplantátech. Je tomu tak částečně proto, že kvalifikovaná osoba v oboru neviděla nutnost toho a též proto, že se očekávalo, že aktuální známé metody nejsou specifické a tím by též zničily nebo odstranily zranitelné kmenové buňky. Dále není získávání kostní dřeně nebo zmobilizované periferní krve od pacienta jednoduché a není bez omezení, a taková metoda očišťování transplantátů kmenových buněk se musí provádět v krátké časové lhůtě a musí být bez komplikací, aby nedošlo ke ztrátám nebo poškození normálních buněk. Proto se zřetelem k výše uvedenému je důvodem pro používání transplantátů kmenových buněk jednak to, aby transplantát byl naprosto bez rakovinných buněk, a jednak to, aby obnovení funkce kostní dřeně bylo rychlejší než po transplantaci s kostní dření bez selekce. Z toho vyplývá, že je naprosto nutné nalézt immunotoxický prostředek pro způsob ničení nežádoucích cílových buněk, který ponechává křehké normální kmenové buňky nepoškozené a který je praktický na provádění v kombinaci s postupy na izolaci kmenových buněk. Cílem tohoto vynálezu je nalézt prostředek pro metodu očišťování transplantátů kmenových buněk, které by neměly výše uvedené nedostatky.
Podstata vynálezu
Nedostatky dosavadního stavu techniky podstatnou měrou odstraňuje a vytčený cíl vynálezu splňuje imunotoxický prostředek pro ničení nežádoucích cílových buněk, zejména prsní rakoviny nebo jiných rakovinných buněk, vyjadřujících stejné cílové antigeny v populaci buněk obsahující nukleované buňky získané z periferijní krve, nebo buňky CD-34+ sebrané z výše • · · · · • · · · · · · · • · · · • · ···· uvedených nukleovaných buněk, nebo jiné nezralé/ranné progenitorové buňky z krve, obsahující mnohoúčinné kmenové buňky, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje dva imunotoxiny zaměřené na antigeny vyskytující se v maligních buňkách, přičemž každý imunotoxin se skládá z konjugátu mezi protilátkou a buněčným toxinem, fragmentů protilátek a toxinů nebo rekombinačně připravených protilátek, imunotoxinů nebo jejich fragmentů, kde protilátky jsou zaměřeny na epitopy na antigenu EGP2 vyjádřeném genem GA733 a na epitopy na antigenu vyjádřeném geny MUC1, MUC2 nebo MUC3 nebo jejich kombinací a toxinem je Pseuctomonas exotoxin A. S výhodou mohou být použitými protilátkami MOC31 a určitá protilátka zaměřená na antigeny zakódované geny MUC1, MUC2, MUC3 nebo jejich kombinaci. Podle výhodného provedení mohou být použitými protilátkami M0C31 a BM7 nebo jejich fragmenty nebo M0C31 a BM2 nebo 12H12 nebo jejich fragmenty nebo M0C31 a 595A6 nebo jejich fragmenty. Podle výhodného provedení mohou být protilátky MOC31 a volitelně BM7, 595, RM2, 12H12 nebo jejich kombinace nebo jejich fragmenty a toxinem je přírodní nebo rekombinační Pseudomonas exotoxin A, nebo jejich fragmenty. Předmětem vynálezu je tudíž immunotoxický prostředek pro selektivní oddělování populace buněk. Předmětem vynálezu je dále směs dvou nebo většího počtu protilátek napojených na bakteriální toxiny pro použití při očišťování získaných populací kmenových buněk v případech pevných nádorů. Použité protilátky jsou zaměřeny na antigeny související s cílovými buňkami.
Příklady provedení vynálezu
V následujícím úseku se vynález popisuje podrobněji s použitím příkladu očišťování transplantátů kmenových buněk > · · · « · · · · ·
-7získaných z periferijní krve na odstraňování buněk rakoviny prsu. Známé postupy na získávání buněk pozůstávají z imunoadsorpce/selekce kmenových buněk periferijní krve (PBSC) nebo CD-34+ buněk z krve nebo kostní dřeně. Avšak o těchto je známo, že nejsou neškodné a nemají dostatečně účinné postupy na očišťování populací těchto buněk pro nádorové buňky. Zdá se zřejmé, že dokonce mezi těmito nezralými buňkami se vyskytují maligní buňky, které podle dosavadních znalostí by neměly mít receptory CD34. Je důležité, že vynález dále popisovaný kupodivu očišťoval též rakovinné buňky bez toxicity vůči normálním progenitorům. Před získáváním transplantátů kmenových buněk z periferijní krve je nutno mobilizovat kmenové buňky z kostní dřeně použitím chemoterapie nebo ošetření s růstovými faktory, a to metodami známými v oboru. Získávání kmenových buněk se dá provádět podle jednoho nebo několika způsobů, závisí to na tom, jaký druh buněk se požaduje. Při jedné metodě se sbírají kmenové buňky periferijní krve. Toto se dá provádět tak, že se naplánuje, aby pacienti podstoupili leukoferezi 10. a 11. dne podávání G-CSF (10 μ/kg/den) po přijímání vysokých dávek chemoterapie a celkovém ozařování těla. Průtok krve se dá stanovit například na 70 ml/min. s použitím CS-300 Plus separátoru krvinek (Baxter Healthcare Corporation, Fenwal Division, Deerfield, IL USA). Průměrný objem krve ošetřované během takového postupu může být cca 10 1 po 2 hodiny na dvouprůchodní centrální žilový katetr. Dá se sebrat 50 ml PBSC a omýt fyziologickým fosfátovým roztokem (PBS), 1 % albuminu lidského sera (HSA) v Cobe Processoru 2991 na odstranění krevních destiček. Na použití tohoto vynálezu se dá koncentrace buněk (2-4 x 1010/afaréze) vyregulovat na 1 x 108/ml na negativní selekci (očištění) imunotoxiny. Jestliže se požadují buňky CD-34+, dá se to získat pozitivní selekcí s ISOLEXEM 50R nebo ISOLEX 300R (Baxter). Při této metodě se součin z afaréze • · • Λ
nebo z kostní dřeni, který může být ca 4 x 1010 buněk, smísit dohromady a inkubovat například s anti-CD34+ - monoklonální protilátkou 9C5 při 0,5 pg/l x 106 buněk při 4 °C po 30 minut na jemném rotátoru. Zpracované buňky se omývají s PBS s 1 % HSA na Cobe Processoru na odstranění nevázané protilátky. Přidávají se kuličky DYNALR M-450 k frakci CD34+ pří 0,5 kuličky na 1 nukleovanou buňku pří 4 °C po 30 minut. Magnetická separace rozet od necílových buněk se dá provádět odmýváním nevázaných buněk dvakrát nebo třikrát s PBS, 1 % HSA. Buňky CD34+ se pak dají uvolňovat z dynalových kuliček přidáváním například ChymoCell-R (Chymopapain) při finální koncentraci 200 pKat/ml v 15 minutách při pokojové teplotě. Tak se dají získávat buňky CD34+ vymýváním s PBS v 5 % citrátu sodného. Jsou též známy jiné postupy na selekci kmenových bunšk/počátečních progenitorových buněk. Vazební profil několika protilátek v buňkových liniích prsní rakoviny a nádorové materiály vyšetřovali jiní experti a částečně jsme to potvrdili též my. Protilátky, které provádějí vazbu na velké procento buněk prsní rakoviny a nikoli na důležité nezralé normální buňky v krvi a kostní dřeni byly konjugovány na Pseudomonas exotoxin A (PE) a schopnost ničit buňky prsní rakoviny v kultuře se vyšetřovala hlavně ve zkouškách produkujících kolonie. Na podkladě vazebního profilu protilátek produkovali tito vynálezci celkem pět různých imunotoxinů:
1. MOC31-PE: Tento konjugát váže ve značně vysokém procentu veškeré buňky prsní rakoviny a byl značně účinný v modelových pokusech a ve skutečné koncentraci s marginální toxicitou vůči normálním hematopoietickým progenitorovým buňkám.
2. NrLul0-PE: Tento se váže na tentýž antigen jako výše, avšak na jiný epitop. Je poněkud méně aktivní než MOC31-PE.
3. BM7-PE: Tento se váže na proteinovou část mucinového antigenu, který se hlavně vyskytuje na buňkách prsní rakoviny.
·· « · ·· ·· ·· • « · ···· ···» ; ; . , «·· »··· « « ···· * « · · · ·»· ··· • « · ··· · ·
Antigen se vyskytuje ve velkém procentu buněk prsní rakoviny, avšak nikoli na všech. Tento imunotoxin vykazoval vysokou specifickou aktivitu vůči rakovinným buňkám, avšak nebyl tak účinný, jako dva předcházející imunotoxiny.
4. RM2-PE: Tento se váže na cukr obsahující epitop na tomtéž antigenu jako RMT-PE. Tento imunotoxinprojevoval zhruba stejnou účinnost jako RM7-PE a jakožto průvodní jev měl značně nízkou toxicitu pro normální buňky.
5. MLuCl-PE: Tento se váže na zcela odlišný antigen, a to antigen LewisY. Tento imunotoxin byl poněkud méně aktivní než předcházející a též vykazoval mírnou toxicitu vůči normálním buňkám.
Imunotoxiny podle bodů 1, 2, 5 se zkoušely individuálně a v kombinaci při modelových pokusech očišťování regulérních vzorků kostní dřeně na rakovinné buňky (Myklebust et al.,
Cancer Research, 1994). Je však, jak již byla o tom zmínka, velkou předností používat transplantátů kmenových buněk kvůli kratšímu intervalu na opětné získávání normální funkce kostní dřeně (tj. bezpečnější postup). Avšak oproti tomu, co se očekávalo, bývají takové transplantáty kontaminovány nádorovými buňkami a bylo nutno aplikovat imunotoxiny schopné ničit veškeré rakovinné buňky v transplantátu, aniž by se významně postihly normální buňky. Byl zahájen výzkum na imunotoxiny více specifické pro prsní rakovinu než je MLuCl-PE a lépe vhodné na očišťování při prsní rakovině. Během tohoto výzkumu se neočekávaně zjistilo, že kombinace M0C31-PE a BM7-PE byla efektivnější, než souhrn každého z předcházejících imunotoxinů použitého samostatně. Toto je prokázáno dále v tabulce 1. Další vyšetření vazby mezi protilátkou a buňkovými liniemi ukázalo, že kombinace dává silnější vazbu než jednotlivé protilátky. MOC31 se váže na většinu buněk prsní rakoviny, též na ty, které jsou méně diferencovány. RM7 zjišťuje mucinový antigen, který ·· ·
10je vyjádřen na značné frakci buněk prsní rakoviny, též na buňkách, které jsou více diferencovány. NrLulO a RM2 se vážou na antigen uznávaný MOC31 a RM7 a se zřetelem k tomu nebylo příliš pravděpodobné, že by mohly něco přidat ke kombinaci imunotoxinů MOC31 a RM7. MLuCl-PE byl teoreticky zajímavý v tom smyslu, že je vazebný na odlišný antigen než jsou imunotoxiny výše zmíněné. MLuCl-PE byl však toxický pro normální buňky a modelové pokusy neukázaly žádnou jasnou přednost jeho zařazením do kombinace. V níže uvedeném příkladu se popisuje očištsování transplantátů periferijnich kmenových buněk (produkty afaréze). Dodatkem k tomu vynálezci provedli několik pokusů s použitím kombinace MOC31-PE a BM7-PE při pokusech, kdy se nádorové buňky přidávaly k získaným periferijním kmenovým buňkám nebo kostní dřeni před imunomagnetickou pozitivní selekcí buněk CD-34+. Výsledky z jednoho takového experimentu jsou ukázány v tabulce 2. Při dvou odlišných buňkových liniích se prokazuje, že pozitivní selekce CD34 + buněk sama o sobě (bez jakékoli jiné formy očišťování) odstraňuje až 3,8 log nádorových buněk z původní získané populace buněk. V jiných pokusech se čistící účinek selekce CD34 liší od 2-3 log, což se též uvádí v literárních pramenech. Když se použilo působení imunotoxinů na pozitivně vybranou populaci CD34 byl celkový čistící účinek větší než 4,7 log (tabulka 2) pro obě buňkové linie. Více než 4,7 log znamená v tomto případě, že byly odstraněny veškeré zjistitelné nádorové buňky. Při jiných experimentech jsme v separátních rozborech pěstovali nádorové buňky a normální progenitorové buňky vzaté z populace CD34+ po jednohodinovém působení imunotoxinem. Při těchto pokusech jsme pozorovali, že nádorové buňky jsou zničeny nebo umírají krátce po působení, kdežto nádorové buňky v nečištěných kontrolních populacích rostly a vytvářely kolonie a/nebo bujely s příchylností typickou pro buňkové kultury. Normální kmenové buňky nejsou • · ovlivňovány tímto působením, takže ve třech různých zkušebních systémech se přežití normálních progenitorových buněk zkracuje pouze nevýznamně. Tabulka 3 ukazuje podobný experiment, při němž buňky CD34 + byly inkubovány s imunotoxiny po dvě hodiny při 37 °C a prokazuje se, že kmenové buňky v podstatě přežívají působení imunotoxinů.
9 9 9 • ♦ · 9
999 99 9 • · · • · · • 9 9 9
9 99 99
9 9 ·
9
99
CM ω
μ &
£ •Η >
ο β
Μ ><υ β
β Λ ι—I
S
CM 'Ή β
φ >ο
Ή β
•Η >β a
ω
ÍX φ
ω
Λ
U
Ή υ
Ή •ΓΊ β
'>ι
4-) •β β
Ή
X ο
4J ο
β β
rH £ •Η fd
44 ι—I (1) β β
Λ -Η β >Φ Η '£>
CN tí x:
rH tí
Λ tí
H «φ · • φ φ • φφφ φ · ΦΦΦ· φφφ φφ ♦ φφ φφ ·· φ φ φφφφ φ φ φφφ· • φ φ φφ« φφ· φ φ · · φ φφ ·· ·· ε
Ο) tí
Ή
X!
Ο
4J
Ο tí i
*r-i tí
H >
O x:
tí tí
Ή tí ra tí a
o\° *rd
x:
>tí tí tí
X!
tí
4-) >o o
a
Ή
| tí | 4-1 | 0 | |
| 'tí | 'tí | x: | |
| > | tí | oj | |
| 0 | Xi | Ό | |
| x: | -H | >N | |
| >u | >tí | tí | |
| o | 4-1 | x: | |
| •H | tí | ||
| 4-1 | tí | ||
| ra | >tí | ι—H | |
| 0 | Ό | ε | |
| tí | 'tí | ||
| tí | > | a | |
| •H | 0 | a | |
| >U | tí | ||
| 'tí | a | r~t | |
| x; | '>< | Ή | |
| Ό | u | ||
| ε | >N | tí | |
| Ή | tí | tí | |
| 4-1 | x: | 4-1 | |
| tí | tí | ||
| tí | tí | ||
| T3 | X | tí | |
| 'tí | u | tí | |
| i—1 | tí | 0 | |
| X! | ra | x: | |
| •H | tí | ||
| >tí | Xi | > | |
| a | 0 | ||
| a | Í>1 | ||
| ra | 4-> | ||
| rtí | Ή | ||
| s, | U | >N | |
| Ή | tí | ||
| Ή | í> | 0 | |
| tí | Ή | a | |
| 0 | i—1 | ||
| i—1 | 4-> | !>ί | |
| 0 | 0 | 1-1 | |
| x: | tí | ||
| τ) | X! | ||
| tí | tí | ||
| 4-1 | W | ||
| >tí | a | ||
| 0 | > | 1 | |
| a | > | ||
| -tí | s | ||
| 0 | U | m | |
| x: | |||
| oj | tí | tí | |
| tí | tí | ||
| tí | £ | XÍ | w |
| > o | ra Ή | a 1 | |
| tí 0 | £ > 0 | N | i—1 co |
| N | •tí | u | |
| 0 | X4 | o | |
| a N | u tí tí a | T3 tí r—1 ra | s ítí tí |
| 0 | N | '>1 | •H |
| tí tí | XÍ u '>1 tí tí | > | X 0 |
| 4-1 >u | tí >tí | 4-> 0 | |
| 0 | ε | tí | |
| a | •tí | tí | |
| >u | tí | ε | |
| > | -X tí | a | H |
| (0 | N | •Q | u |
• fc · • fcfc • fcfcfc fc · ·«·· • fcfc • fc · • fc
I · • fcfc > · • fcfc na přežití kolonií v buňkách CD34+ vybraných ze zmobilizované periřerijni (0 b
'(tí >
O >U
O (tí •3 a
•H
X o
4-) a
Ή <0 r—I (L) o b Λ -H (tí >0 H '£>
| u 0 | 0 b |
| \(tí | |
| m | ω |
| a | |
| -H | 0 |
| >b | a |
| a | φ |
| 34 | -|—> |
| ΓΊ | 34 |
| (tí | |
| 0 | |
| a | b |
| 0 | |
| b | 34 |
| •H | N |
| X | 0 |
| 0 | b |
| 4J | |
| 0 | b |
| b | o |
| b | Ό |
| ε | <D |
| •H | > |
| 0 | |
| ω | b |
| a | |
| (tí | |
| b | i—1 |
| '(tí | |
| í> | 34 |
| 0 | |
| h | (tí |
| b | |
| 34 | .—. |
| b | b |
| •H | 34 |
| ω | |
| rd | •H |
| 1—1 | ε |
| h | (0 |
| b | |
| sT | |
| m | m |
| Q U | O ι—1 X |
| 34 | tn |
| >(D | |
| b b Λ | £ £ ω |
| in | o |
| O | 1 |
| i—i | o |
| a | |
| X | u |
| Φ | (0 |
| •H | |
| 4J | S |
| b | O |
| (tí | 1 |
| a | h> |
| a | |
| (ΰ | u |
| b | |
| Ό | b |
| <D | b |
| JJ | |
| i—1 | |
| b | |
| 0) | 34 |
| > | |
| b | O |
| 34 | T3 |
b Ό (0 i—I
Ή >b a
>
Ό
O
U (tí
I—I '(tí H b (D P (0 £
• ft · ft · · • · · · ft ft ft · • · · *
··
ft ft
Bylo velkým překvapením, že používáním dvou protilátek, zaměřených na antigeny vyjádřené epiteliálními buňkami podle tohoto vynálezu, každá kombinovaná s Pseudomonas exotoxinem A bakteriální toxin se ničily maligní buňky, aniž by se způsobila nějaká škoda normálním kmenovým buňkám při jejich získávání z periferijní krve a kostní dřeně. Je známo v oboru, že buňky mohou být ničeny bakteriálními exotoxiny a že ničící účinek se zvyšuje napojením toxinu na protilátky zaměřené na epitopy vyjádřené cílovými buňkami. Je však též známo, že jestliže nezralé buňky jsou vystaveny účinku jednoho nebo několika imunotoxinů, je dána naprostá možnost, že tímto působením se zničí normální kmenové buňky v populaci buněk. Dále jsou tyto normální kmenové buňky citlivé na působení ex vivo provázející mechanické poranění a teplotní změny. V tomto vynálezu je populace buněk, například transplantát kmenových buněk získaný z periferní krve, vystaven účinku směsi dvou protilátek, z nichž je každá konjugována na PE. Ježto jeden z imunotoxinů byl nadměrně aktivní, je k údivu prokázáno, že použitím směsi dvou protilátek napojených na bakteriální toxin se zdál očisůovací účinek větší než je souhrn účinků, když se imunotoxiny používají separátně. Tento vzájemně působící účinek je předveden v tabulce 4 tohoto popisu vynálezu s použitím protilátek BM7 a M0C31 napojených na Pseudomonas exotoxin A při ničení PM1 buněk rakoviny lidského prsu. Tyto imunotoxiny jsou oba monoklonální protilátky zaměřené proti antigenům souvisejícím s nádory s napojením na bakteriální toxin
Pseudomonas exotoxin A. Jedna z protilátek rozpoznává epiteliální antigen kódovaný genem GA 733-2, který je vyjádřen většinou rakovinných buněk, a proto se ho dá používat ve všech případech týkajících se karcinomů (například rakovina prsu, rakovina kolorektální, rakovina prostaty, rakovina vaječníku, rakovina plic a rakovina břišní slinivky). Jiná protilátka je zaměřena na mucin, slizový protein, který je poněkud odlišný od
-16• ft • · • ftft • ftftftft ft · • ft ft • · • ft • · · ftft ft ftft ft· ·« • ftft ft • ftft · •ftft ··· • · • ft ftft jednoho druhu rakoviny k druhému. Obecně se antigen dá popsat jako proteiny zakódované geny MUC-1, MUC-2 a MUC-3. Příklady výše uvedených monoklonálních protilátek jsou M0C31 a BM7. Konjugace protilátky a toxinu se dá provádět různými známými způsoby. Selekce dvou nebo většího počtu protilátek ve směsi na vazbu na bakteriální exotoxiny byla provedena takovým způsobem, že protilátková vazba byla zaměřena na epitopy vyjádřené na většině cílových buněk a nikoli na normální buňky. Problém při dřívějším způsobu byl, že jak maligní buňky i normální krevní buňky vyjadřují společné antigeny na povrchu buňky. V uvedeném případě v tomto pojednání se používá dvou monoklonálních protilátek M0C31 a BM7. První z těchto protilátek jsou zaměřeny na epiteliální buňky, které, jestliže se vyskytnou v periferní krvi, jsou maligní. Antigen (celý protein) je zakódován genem GA 733-2. Tento antigen však má několik epitopů a je důležité vzít si za cíl epitopy vyjádřené v nej hojnější míře. Protilátka BM7 je jednou z protilátek zaměřených na epitop antigenu vyjádřeného genem MUC1. Několik genů má zakódované podobné antigeny, například (MUC2, MUC3). Bakteriální toxin Pseudomonas exotoxin A má poměrně mírný toxický účinek na normální kmenové buňky a maligní buňky. Avšak, když je napojen na protilátky zaměřené na antigeny vyjádřené na cílových buňkách, je toxický účinek na tyto značně vyslovený. V tabulce 5 je ukázáno, že směs imunotoxinů podle vynálezu, dokonce po inkubační době pouhých 60 minut ničí buňky T-47 D, buňky MCF7 a buňky PM1, a to v mnohem vyšším stupni účinnosti než je známé v dosavadním oboru s j inými metodami. Kombinace těchto dvou imunotoxinů takto dává překvapující výsledky vzhledem k tomu, co by se mělo očekávat následkem selektivní účinnosti, jednoduchosti a pouze okrajové toxicity vůči normálním progenitorovým buňkám. Lze prohlásit, že je známé používání několika imunotoxinů pozůstávajících z Pseudomonas exotoxinu A konjugovaného na tři různé protilátky, viz Myklebust et al. 1993 a 1994. Jedné z
99
4 4 ·
4 · 9
999 999
9
-174 9 9 9 9 ♦ ··· 4 9
těch protilátek (M0C31) bylo použito podobným způsobem jako v tomto vynálezu na očištění buněk kostní dřeni bez selekce.
Avšak nezdá se, že jiné používané protilátky jsou optimální, mezi jiným proto, že jedna z nich je usměrněna na tentýž antigen jako M0C31 a proto, že druhá (MLuCl) reaguje křížem s normálními buňkami a tím imunotoxin vázaný na tuto protilátku může být snadno toxický pro většinu nezralých kmenových buněk.
V tomto vynálezu ohledně preparátů na čištění kmenových buněk jsme připravili jinou monoklonální protilátku, která zvyšuje účinek M0C31 a pozorujeme, že kombinace těchto dvou protilátek používaných jako imunotoxiny dává značně překvapující výsledky. Díky vysoce specifické aktivitě uvedených imunotoxinů se zdá možným podávat směs pro léčení pacientů trpících různými druhy karcinomu in vivo. Jestliže rakovinová nemoc je omezena, bude možné vstřikovat nebo provádět jejich infuze nebo směsi nitrožilně například tehdy, když se ukazuje šíření nemoci do kostní dřeně. Dále je možné vstřikovat tyto imunotoxiny samotné nebo v kombinaci u pacientů s dalším šířením nemoci s břišní vodnatelností nebo s pleurální efuzí. Třetí možnost je na léčení pacientů se šířením rakoviny na centrální nervový systém. V tomto případě se dají imunotoxiny vstřikovat přímo do nádorové tkáně, do míšního moku nebo do tepny přivádějící krev do mozku. Není známo, jak používat těchto imunotoxinů in vivo vyjma případ, že MOC31-PE byl použit v modelu leptomeningeálního nádoru pro malobuněčnou prsní rakovinu. BM7PE není v literatuře vůbec popisován. Důležitým problémem při používání imunotoxinů in vivo je okolnost, že jejich poločasy bývají často velmi krátké, tj. imunotoxiny se rozpadají a jsou odstraňovány z krve ještě dříve, než je v nádoru jejich koncentrace přiměřeně vysoká. V US PS 5 322 678 patentoval Morgan a j. určitou modifikaci části protilátky určitého imunotoxinů na snižování problému s krátkým poločasem in vivo.
• · · ···
- 18• · • · · • ····
Přihlašovatel tohoto patentu navrhuje podobné přizpůsobení toxinové části, což je postup dosud neprováděný ani známý.
Příklad 1:
Efektivní očiščování buněk prsní rakoviny od kmenových buněk periferní krve se získává s imunotoxiny. Vysokodávková chemoradioterapie s podporou autologních hematopoitetických kmenových buněk se používá stále častěji na léčení pacientů s několikerým zhoubným bujením (1,2). V případech, kdy tento postup je neúspěšný, bývá nej obvyklejší příčinou recidivy nemoci spíše než toxicita nějaká infekce a nedostatek v transplantaci (3). Je důležité, že existuje solidní důkaz, že u pacientů prodělávajících léčení vysokými dávkami může reinfuze autotransplantátů obsahující klonogenní nádorové buňky přispět k recidivě a ovlivňovat výsledek (4). Studie genového značkování autotransplantovaných buněk naznačují, že nádorové buňky zůstávající v reinfuzované kostní dřeni (BM) přispívají k návratu nemoci (5). Tento závěr je dále potvrzován výsledky u pacientů s folikulárními lymfomy, které naznačují, že účinné očišťování kostní dřeni zlepšuje vyhlídky přežití bez nemoci (6) . S použitím citlivých imunocytochemických postupů se dá pozorovat kontaminace nádorových buněk v histologicky normálních autotransplantátech kostní dřeni v rozsahu 37-62 % u pacientů s rakovinou prsu prodělávajících léčení s vysokými dávkami (7). Autotransplantáty kmenové buňky periferijní krve (PMSC) nasbírané afarezií po předběžném působení hematopoietickými faktory růstu a chemoterapií se používá stále více s přesvědčením, že tyto produkty budou sotva obsahovat nádorové buňky. Avšak nedávno se shledalo, že ačkoli výskyt nádorových buněk je méně rozsáhlý v autotransplantátech PBSC proti získávání BM, vyskytují se stále často maligní buňky ve zmobilizovaných sběrech PBSC u pacientů s rakovinou prsu (4,7) . Kromě toho ukazují nedávná zjištění, že chemoterapie a/nebo
• · · · • ♦ · · ··· ··· • · faktory růstu mohou zmobilizovat nádorové buňky do periferijní krve u pacientů s dříve zjistitelnými rakovinovými buňkami v kostní dřeni i bez jejich nálezu (7,8), což jsou výsledky, které dále zvyšují riziko kontaminace nádorových buněk ve štěpech PBSC. Na zamezení zpětné infuze maligních buněk in vitro může být zapotřebí očišťování autotransplantátů PBSC buněk prsního karcinomu. Zde podáváme zprávu o praktickém a rychlém očišúovacím způsobu, dokazující, že inkubační postup 60 minut s imunotoxiny přímo přidávanými do afarezního produktu selektivně ničí více než 5 log nádorových buněk. Materiály a metody:
Buňková linie: Buňková linie PM1 rakoviny prsu byla pořízena v naší laboratoři z ascitézní tekutiny odebrané u pacienta s pokročilou nemocí. Buňkové linie MCF7 a T-47D byly získány od American Type Culture Collection (Rockwille, MD) (ATCC HTB 22 a ATCC HTB 133). Buňky byly pěstovány v kultuře při 37 °C v atmosféře s 5 % CO2 v prostředí RPMI 1640 doplněné s 10 % teplem aktivovaného fetálního telecího séra (FCS) a antibiotiky (100 μ/ml penicilinu, 100 ^g/ml streptomycinu). Medium a přípravky byly zakoupeny od GIBCO v Paisley, Velká Británie. Lidská kostní dřeň a progenitorové buňky periferijní krve:
Buňky BM se získávají od zdravých dobrovolných dárců. Mononukleární buňky BM frakce MNC byly získány od LimphoprepR (Nycomed Pharma, Oslo, Norsko) a dvakrát omyty ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem (PBS) než se jich použilo v pokusech. PBSC byly připraveny od pacientů s ne-Hodgkinovým lymfomem. Na zmobilizování PBSC byli pacienti předem připraveni chemoterapií plus hematopoietickými faktory růstu (G-CSF, Neupogen, Amgen / Hoffman - La Roche, Bazilej, Švýcarsko). Jedenáct až dvanáct dní po chemoterapii, když počet buněk CD34+ v periferní krvi je vysoký, byly sbírány kmenové buňky s použitím CS-3000 plus separátor krvinek (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division, Deerfield, IL, USA).
9·
9 ·
9 9
999 ···
-209 9 9 9 9
9 9 9» *
9
Toxin, protilátky a sestavování imunotoxinů: Anti-MUCl (9) protilátka BM7 (IgGl) byl dar od S.Kaula (Ženská klinika na Univerzitě v Heidelbergu, SRN) a anti-EGP2 (10) protilátku MO31 IgG2a ochotně dodal L. de Leij (Universita v Groninngen, Holandsko) a MCA Development (Groninngen). PE byl získán od švýcarského ústavu pro séra a vakciny v Bernu, Švýcarsko. Každá protilátka byla konjugována na PE prostřednictvím trioetérové vazby vytvářené sulfo- -sukcinimidyl-4-(N maleimidomethyl) cyklohexan-l-karboxylátem (Pierce, Rockford, IL, USA), jak popsáno již dříve (11).
Působení imunotoxinů: Účinek léčení imunotoxiny na přežití klonogenních buněk rakoviny prsu se zkoušel inkubací 2xl06 exponenciálně rostoucích novotvarů buněk v RPMI s FCS s uvedenými koncentracemi imunotoxinů při 37 °C s jemným mícháním (100 ot/min na orbitálním inkubátoru Gallenkamp, Leicestershire, Velká Británie) na měnění časových úseků jak je uvedeno pro každý pokus. Buňky se omývaj í dvakrát v PBS s 1 % FCS před naočkováním při klonogenní zkoušce. Při některých experimentech se přimísilo 10 % novotvarových buněk k BM mononukleárním buňkám nebo PBSC, inkubovalo se s imunotoxiny, omylo se a účinek se posoudil na přežití novotvarových buněk nebo hematopietických progenitorových klonogenních buněk. Koloniové zkoušky pro novotvarové a hematopoietické progenitorové buňky. Klonogenní zkouška jemným agarem pro novotvarové buňky zde použité byla jíž popsána dříve (12). Byly inkubovány trojí kultury po 14 dní při 37 °C v 5 % CO2, 5 % O2 a 90 % N2 a kolonie o více než 50 buňkách se počítaly v Zeissově stereomikroskopu. Klonogenní kapacita upravených a neupravených normálních progenitorových buněk se vyhodnocovala ve zkouškách CFU-GEMM (13), při nichž se 5x104 PBSC na ml pěstovaly individuálně ve standartních metylcelulozových kulturách (HCC-4433 Methocult, Terry Fox Labs, Vancouver v Kanadě) v mediu IMDM (GIMBCO). Po 19 dnech inkubace se kolonie
ΦΦ φ • φ φ
BFU-E a CFU-GM spočítaly v kontrastním mikroskopu s inverzní fází. Každá zkouška se prováděla s trojími kulturami v 1 ml s miskami 35 mm při 37 °C v atmosféře s 5 % CO2 a 100 % vlhkostí. Výsledky: Růst lidských buněk prsní rakoviny v některém agaru.
V několika pokusech se pozoroval lineární vztah mezi počtem naočkovaných buněk a počtem vytvořených nádorových kolonií. S PM1 buňkovou čarou byla účinnost klonování v rozsahu 20 až 30 % (neukázáno). Při pokusech s buňkovými čarami T-47D a MCF7 se potvrdily lineární vztahy již dříve hlášené (14) s PE 27 % a 22 %. Těchto dat bylo použito na výpočet účinnosti deplece buněk prsní rakoviny získané tímto působením.
Účinnost jednotlivých a smíšených imunotoxinů při ničení buněk prsní rakoviny: Při modelových experimentech se používalo tří různých koncentrací každého imunotoxinu. Jak je znázorněno v tabulce 4, získaly se pouze okrajové účinky s konjugátem BM7 při dvou nižších koncentracích, kdežto 2,5 log ničení buněk se dosáhlo při 1,0 ^g/ml. S MUC-31 při 0,1 μg/ml až do 3 log ničení buněk se spatřilo a při nejvyšší koncentraci (1) /xg/ml byla účinnost aspoň 5 log, což je maximální účinek možný na vyhodnocení při tomto pokusu (14). Se směsí obou imunotoxinů, každý při uvedené koncentraci, se veškeré novotvarové buňky ničily již při 0,1 gg/ml (tabulka 4). Výsledky ukazují, že směs těch dvou imunotoxinů může ničit buňky prsní rakoviny značně účinně a data též naznačují, že zvýšeného účinku se dá dosáhnout kombinací těch dvou konjugátů. Podobných výsledků se dosáhlo tehdy, když se účinnost imunotoxinů zkoušela proti dvěma jiným buňkovým čarám prsní rakoviny (není ukázáno). Kvůli očekávané různorodosti ve vyjadřování antigenů na cílové buňky se zdálo logickým používat kombinaci imunotoxinů v dalším vývoji způsobu vhodného pro klinické používání.
(Ν (Ν
Μ* β
γΗ β
X) β
Η ·· · • · · • · · · • · ···· · • · · ·· · ··
I ·« ·· • · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ·· ··
Ή β
ω β
a 'β to
Ti •Η >β β
β
Λ
5“ί
Μ β
1) >υ •Η β
•Η >β
Ch <
β β
•Η >4
Ο
4J
Ο χ
β ω
β ο
τ β
<υ (Ο
CM
0) to τ
υ
Ή υ
Ή π
β
4-) •β β
•Η
X ο
4J
Ο β
i
Η
4->
[Q
Ο β
β •Η >υ '2
9ί β
Η >
Ο β
β
Ο β
β >
ο
| β 4-) CQ β | '>1 τ >Ν β 44 | ||
| Ή | ε | ||
| β | β | ||
| 'β | β | ||
| ί> | β | ||
| 0 | Τ) | ||
| 44 | β | ||
| >υ | |||
| 0 | £ | ||
| '>Ί | |||
| •Η | Ο | ||
| 4-> | £ | ||
| CQ | β | ||
| 0 | |||
| β | |||
| β | ω | ||
| -Η | |||
| >υ | Τ | ||
| 'β | υ | ||
| β | |||
| 44 | ω | ||
| β | |||
| £ | 44 | ||
| 0 | |||
| 4-> | Ch | ||
| β | |||
| β | Τ | ||
| Τ | υ | ||
| 'β | '>< | ||
| ι—1 | > | ||
| τ | •Η | ||
| -Η | γ~Ί | -γ4 | |
| >β | 4-) | υ | |
| Ch | 0 | β | |
| β | β | ||
| CQ | έ Ή β 'β > ο- υ | τ β -η | 4J β β |
| Μ •Η | -Η | υ β | |
| β | >β | 0 | |
| 0 I—1 | Ch | 44 | |
| Ο | β β Ch Ν | Τ | 'β |
| 44 | ο | β | |
| β | |||
| β | β | Τ |
4J >υ ο
Ch ο
τ τ
β β
>
ο β
ο
Ν ο
Ch
Ν τ
υ β
ω >υ •Η β
Ν β
4-1 >υ ο
Ch co ο
β 'β τ
Ή >υ ο
<ΰ
4-) •Η β
β σι ο
ο β
•ΓΊ β
CQ
Ή
Ν ’β
Τ β
I-1
C0 '>Ί >
β
4-)
Ο β
Τ
Ο
Τ
Ή β
τ β
>β
4-)
Μ β 4-) 'β β 44 •Η >β 4-) β β Τ β >
Ο β
Ch υ β
>
β >
Každý imunotoxin použitý
-23Vliv inkubační doby. Při výše uvedených pokusech se používalo pro imunotoxiny inkubace 120 minut. V klinickém prostředí by bylo z praktických důvodů výhodné používat ještě kratší inkubační dobu. Na vyšetření, zda se dá zkrátit doba vystavení účinku imunotoxinů bez újmy na specifické ničení novotvarových buněk, se zkoušela směs dvou konjugátů, použitých při koncentraci 1 ^g/ml pro každý, a to s různými inkubačnimi dobami vůči třem buňkovým liniím prsní rakoviny. Ve všech případech vyvolávalo 12Oti-minutové vystavení účinku imunotoxinů eradikaci veškerých tumorových buněk. Je důležité, že toto ošetření bylo stejně účinné, když inkubační doba byla zkrácena na 90 minut i dokonce na 60 min..(tabulka 5) a údaje dokazují, že při použitých koncentracích imunotoxinů postačuje nejkratší inkubační doba na zničení všech klonogenních novotvarových buněk, vyskytujících se v kulturách nádorových buněk.
·· ·· > · · 1 » · · <
• · · · · <
ΓΊ
LT)
Φ
Ή β
ω β
a ><υ β
Λ
Ή β
α) >υ •Η β
Η >β a
Γ>
ffl γΊ η
I
U
Ο <0 •β β
•Η
X ο
JJ ο
β β
ε •Η ω
>φ
JJ ω
ο β
α •Η >Φ 'β
Φ β
Λ
Ο
Τ β
>υ (0
Λ β
β •Η β > Ό ·Η Φ γ-ι Η >
β β
>0) ε
ο a
'Φ α
φ ω
Ή ε
Ή >β a
ο
Λ φ
β χ
ΓΊ 'Φ β JJ Ο ε φ ω
2ΐ >β β Λ 'Φ > Ο β . Ο 34 Τ Φ 'Φ β
Ή >
Ο
σι =t ω
β ra β
ο a
ε ο β Τ Φ ι—ι
Φ
Ή ε
φ >β β
τ a
φ
Q [>
I
Η ω
Τ υ
φ ω
β ο
a
| •Η | Π | |
| υ | u | |
| φ | '2l | |
| β | β | |
| JJ | JJ | |
| β | φ | |
| Φ | JJ | |
| Ο | ra | |
| β | 0 | |
| 0 | ε | |
| 34 | φ | |
| ra | ||
| > | β | |
| JJ | 0 | |
| Ή | > | |
| >Ν | Ti | |
| β | ||
| 0 | φ | |
| a | > | |
| β | '>Ί | |
| •Η | β | |
| X | Φ | |
| 0 | 34 | |
| JJ | ra | |
| 0 | Ή | |
| β | Ν | |
| β ε Ή | 34 Φ τ | |> a υ 2 |
| '>Ί | φ | |
| T | ι—1 | Ρ |
| >Ν | ω | υ |
| Φ | '>· | >α |
| > | ||
| 18 | Λ | λ |
• · · • · · • · · · · ·
-25 Na vyšetření, zda se toxicita vůči buňkám prsní rakoviny může změnit v přítomnosti velkého počtu normálních hematopoietických buněk, se konaly pokusy, při nichž se nádorové buňky přimísily v poměru 1:10 k PBPC získaným afarezií. Jak je znázorněno v tabulce 5, imunotoxiny zničily více než 5 log nádorových buněk PM1 též v přítomnosti normálních buněk, a to již po inkubační době pouze 60 minut. Ježto tyto výsledky byly stejné pro všechny tři linie buněk, udávají data, že postup s imunotoxiny se dá efektivně používat též v klinickém prostředí. Vliv podmínek inkubace a koncentrace buněk. Na vyšetření účinnosti postupu s imunotoxiny při podmínkách podobných těm, jichž by se použilo u klinických vzorků, se nádorové buňky PM1 přimísily v poměru 1:10 k PBPC při pokusech, při nichž neomyté buňky odebírané přímo z afarezního vaku před inkubací s imunotoxiny byly opětně suspendovány v normálním fyziologickém roztoku s ACD (vak se zásobním roztokem, R2220, Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). Výsledky se porovnaly s těmi, které se získaly při počátečních pokusech s buňkami, které byly omyty a opět suspendovány v RPMI s 10 % FCS. Shledalo se (tabulka 6), že v obou případech se působením imunotoxinů po 60 minut zničily veškeré buňky PM1, což naznačuje, že pro klinické použití se dají imunotoxiny vstřikovat přímo do afarezního vaku a že nízkou hodnotou pH při takových podmínkách se neovlivňuje cytotoxicita imunotoxinů.
• · • · ·
CN
| ί>Ί | 0 | 'Η β | |||||
| >φ | X | β | \β | ||||
| X | Ό ίΐ) | Η >Ν | >ι | > 0 | |||
| Φ | U/ >Li | β | X | υ | |||
| >Φ | > | 1SI | 0 | β | |||
| β | m | β | a | ε | β | ||
| β | ε | 0 | a | ||||
| X | φ | β | _j | 0 | Ν | ||
| > | X | fw | ι—I | >1 | |||
| τ—1 | β | Ν | >1 | γ—1 | φ | ||
| 2 | X | ο | X | X | |||
| Ρ4 | η | ο | X | ||||
| Ή | [J-. | X | X | ||||
| Ή | β | 0 | φ | φ | 0 | ||
| β | •ι—» | X | 1 | > | υ | 'β | |
| Φ | •Η | β | > | β | |||
| >υ | β | >. | θ | ε | β | φ | |
| Η | Φ | β | θ | β | ε | >υ | |
| β | 4-1 | Φ | L0 | X | β | β | |
| •Η | >Ν | Ν | X | β | |||
| •Η | β | 0 | Ν | ||||
| >β | Φ | |——1 | γΜ [_) | φ | X | ||
| & | řt | > | 0) | Ν | Ή | υ | |
| ρ | X | 'β | |||||
| Ο | ε | ίβ | β- ω | 'Φ | φ | β | |
| 2 | \β | γ-Η | β | >β | •Η | ||
| m | X | Α | ’ι 1 η | X | X | a | |
| >β | X | ι-Μ π | φ | β | |||
| β | β | X | φ | X | |||
| X | β | i> | > | ω | |||
| ι—1 | X | • | |||||
| η | £ | β | ι—1 | ίβ | φ | ||
| ι | \ζζ | ϊ> | ε | X | > | ||
| υ | ρ> | .X | >β | ||||
| Ο | 0 | 0 | >tí | γΗ | β | • | |
| 2 | β | X | 'í-l | m | |||
| 0 | Ή | r-1 Λ | ε | m | |||
| •β | X | β | φ | • | |||
| β | •Η | Ν | Sn | ·|-> | ,-χ | β | |
| Η | β | Φ | Γ—I | X | β | ||
| X | φ | β | 0 | •Η | |||
| 0 | σι | β | n | β | a | ||
| 4-) | 0 | 4-1 | AX | '>Ί | β | β | |
| 0 | β | β | tí | β | •Η | X | |
| β | a | A-H Q | >ϋ | a | ω | ||
| β | Ν | \(TS | φ | β | .— | ||
| £ | X | 'lU Vj | β | X | |||
| Η | !>Ί | I 1 s | 0 | ω | ω | ||
| X | r* fd | X | —- | U | |||
| Η | ο | >β | £ | a | |||
| ω | i—1 | β | β | •β | |||
| >Φ | ·· | m | A | β | β | ο\ο | |
| ε | τ—1 | N | -Η | Ο | |||
| ω | β | X | ι—1 | ||||
| β | X | 3 | β | 0 | |||
| X | β | φ | t-* | -β | X | ω | |
| ω | >φ | β | \s s | ε | 0 | ||
| 0 | ε | Ή | r* TÍ | β | β | H | |
| β | 0 | X | β | 2 | |||
| β | a | β | G) | 1—ί | ε | a | |
| -Η | X | »> | β | •Η | (X | ||
| >υ | |||||||
| 'β | Ή | 0 | •Η | ί> | |||
| Ν | X | υ | |||||
| β | X | Φ | >d) | 'φ | β | γΗ | |
| β | υ | β | rj | X | X | ε | |
| β | M | ω | β | ||||
| Φ | β | 4-) | P-* Γ) | X | X | ι—I | |
| υ | φ | β | rM | •Η | β | ||
| β | ω | CO | ι—1 | ♦Η | β | ||
| X | Ή | β | O | β | |||
| β | ε | 0 | rH | ο\° | 0 | ||
| X | Ή | > | X | 1—1 | β | ίβ | |
| β | >β | 0 | rd | a | β | ||
| •Η | a | β | β | 'β | |||
| 0 | Ή | β | !> | ||||
| X | ·. | X | u | Ο | ο | ||
| φ | 'β | Ή | υ | \ι~ί | X | ||
| β | β | β | m | β | β | ||
| Ή | •Η | β | β | ι—1 | φ | ||
| ε | > | a | X | ο\° | 0 | a | |
| X | 0 | φ | β | ο | β | ω | |
| <0 | 0 | X | ω | ω | CN | X | β |
| a | β | X | β | ω | |||
| β | β | Ή | 0 | ω | 0 | ||
| X | X | ο | X | >Φ | |||
| ι—I | φ | Ή | β | \β | W | β | |
| β | β | β | ι—I | X | m | 0 | X |
| X | •Η | ω | 0 | )Ν | a | X | >φ |
| β | >υ | β | Ν | β | β | a | |
| Η | '01 | & | Η | X | > | •η | 0 |
ί>Ί β
'β >
χ >υ ο
β β
(0 ><
χ &
ο β
β
Ή
X ο
X ο
β i
ο χ;
o
X >Ν β
S4 σι =t β
β •Η
X
Ο
X
Ο a
υ ο
>
η
Η >β >1 β
'β >
Ο
X β
X β
•Η
Ϊ>Ί
X >β β
Λ ίΝ
Λ • · · • · · · • · · · · · · • · · • · ·
« ·
-27V afarezním vaku bývá celkový počet buněk značně vysoký a bylo možno si představit, že při tak vysoké koncentraci buněk se účinnost postupu může snížit při porovnání s podmínkami použitými v modelovém vyšetření. Avšak při pokusech, kde se zkoušela tato možnost, se nepozoroval žádný rozdíl účinnosti, kdy celková koncentrace buněk byla zvýšená nejprve od lxlO7 na 5xl07 a pak na ΙχΙΟθ na ml (tabulka 6). Toxicita imunotoxinů vůči normálním hematopoietickým progenitořovým buňkám. Účinek imunotoxinů na přežití CFU-GM a BFU-E se vyšetřoval při podmínkách inkubace jak je popsáno výše. Shledalo se (tabulka 7), že i 20 minutová inkubace nukleovaných PBPC se směsí imunotoxinů nezkracovala přežití progenitorových buněk, ať byly zkoušeny po omytí a opětném suspendování buněk v RPMI s 10 % FCS, nebo když se neomyté buňky opět suspendovaly v normálním fyziologickém roztoku s ACD. Ježto v klinickém prostředí budou upravené buňky zmrazený a rozmraženy dříve než se vpraví zpět do pacienta, vyšetřoval se též účinek takových postupů na progenitorové buňky. Shledalo se, že zmrazováním a roztáváním se pouze nepatrně snižoval počet CFU-GM a BFU-E (tabulka 7). Je pozoruhodné, že působení imunotoxinů samotné významně nezkracovalo přežití progenitorových buněk, ačkoli se lehké snížení středního počtu buňkových kolonií pozorovalo v té skupině, kde se na buňky nepůsobilo při podmínkách s nízkou pH. Tyto údaje prokazují, že koncentrace imunotoxinů, která efektivně provede eradikaci novotvarových buněk po 60 minutové inkubaci, má pouze nevýznamný účinek na přežívání normálních klonogenních buněk, na něž se působilo dvakrát tak dlouho.
• * · · ► »» · > · · · ··· ··· • · • · · · • ·
ΓΟ >
β ι—I β
β
Η
X!
υ β
β ω
Ή
Ν
U a
£Ώ a
U ω
Ό •Η σι
β.
'Φ β
'Η β \β k > ο
U
Φ
-η β
β ω
β
Ο a
Ή
Ή β
Φ
Ν β
β ε
Ν
Ο a
co
Ολ
VD ιρ rd
Ο
ΓΟ +1 +1 <0
VD
Ο ΓΟ ι—I c+1 a
rn
Q co β >β > a ο
β β
•Η β
ω •Η ε
| 4-) | N | γ—1 |
| co | β | ^1 |
| -Η | β | 44 |
| >υ | ε | |
| Ν | Ο | |
| > | a | |
| β | CQ | |
| a | a | a |
| I | β | |
| a | 4-) | 'Φ |
| a | ω | β |
| m | 0 | β |
| a | ί> | |
| β | 0 | |
| β | φ | |
| £ | ι—1 | |
| o | φ | 44 |
| I | U | β |
| a | β | £ |
| a | 44 | |
| u | β | • |
| 44 | VD | |
| H | β | |
| >U | Ή | Φ |
| •β | υ | |
| > | 44 | ι—1 |
| Φ | β | |
| O | β | 44 |
| £ | Ή | β |
| PQ | ε | 4-> |
Ό ο
a >φ β
β
X
Lf) ε
Ή β
'β ί>
ο >0
Ο β
β
Ό
Φ >β a
u
4-) ω
'β >υ
Ή β
I—ι ο
β
4-) β
Ο 'Φ β
β >
Ο
U β
β a
Ν φ
β ο\ο πι
Μ •Η β
Ο ι—I Ο 44
4J
Φ >υ ο
a ε
Ή β
φ
Ν β
β ε
Ν
Ti φ
>β a
Ή β
φ
Ν β
β ε
Ν ο
a ε
Ή β
φ
Ν β
β ε
Ν
Ti
Φ >β a
Ο ο
γΟ
LP rd •4* t-d +1 +1 ο
Γ•Ψ a
ro r~+1 ro a
Τ)
Φ ω
β ο
a υ
<ο co ΓΟ
LP a
+1 a
ο
Γ-1
C0
ΓΟ +1 νο co a
+1 a
l—i a
ο ο
rd γο
ΓΟ ι—I
VD
O a
vd +1
C0
Γ0
ΓΟ +1
LP
Μ’
LP a
+1
LP co β
| γΗ | 0 | • | ||
| ΓΏ | 44 | 44 | m | |
| 1 | Φ | β | ||
| ο | β | ‘Γ~1 | Η | Ti |
| ο | •Η | >β | 0 | |
| £ | >υ | a | 4-) | |
| β | α) | |||
| «β | •Η | 44 | ε | |
| β | • | a | ||
| •Η | a | β | ΓΟ | β |
| X | ω | 44 | ||
| 0 | U | to | 0 | >ί |
| 4-) | 1 | a | γ—1 | |
| 0 | ο | Ή | \β | |
| β | β | β | •Η | |
| β | β | > | β | β |
| ε | 0 | •Η | φ | |
| Ή | Ή | υ | X | 4J |
| β | β | 0 | β | |
| •Η | 'β | β | 4-) | £ |
| ω | !> | a | 0 | |
| >φ | 0 | β | ||
| ε | Ν | β | β | TJ |
| ω | •Η | ε | 0 | |
| rH | Μ | Ή | a | |
| β | •Η | β | ||
| 4-) | 44 | γΗ | 0 | 0 |
| Ή | 0 | 0 | 44 | β |
| U | ε | β | 'Φ | 'β |
| •Η | Ν | 4J | Τ5 | C0 |
| X | β | >Ν | a | |
| 0 | 0 | 0 | β | 0 |
| Η | a | a | 44 | a |
φ υ
β β
β •Η ί>Ί β
Ή ε
Ό
Ο a
'Φ β
β >
υ β
β a
Ν α
u ο\ο
Ο
C0 ω
β
4J
Ν β
a £
a a
'Φ β β >
U 'Φ ><
>β β
β β
a
Ν
Φ £
4-) ο
φ £
Ν a
ε
Ή β
1-1 'β ε
β ο
β 'Φ β
β ί>
ο υ
β β
a
Ν β
'Φ
4->
£ >1 >β β
m ο\° Ο j—I ω
4-)
Ο β
Ti φ
γο β
>
Ti
Η >β a
β β
4J I—I β
U
Ή
Ό ο
β
4->
Ν υ
'>1 β
β ω
νβ
Ν to β 44 ι—I ί>1 44 ζ1 Ti ? ο
Q ω
+1
τ) φ
>β
4J
Ή β
τ β
β
Ti β
β
4-) ω
• · • ·
-29Diskuse: Analogní transplantace cirkulujících hematopoietických kmenových buněk vzbudila nedávno zájem kvůli jejich přednostem proti BM transplantaci (15, 16). Dodatkem k rychlé rekonstituci funkce kostní dřeně se předpokládá, že používáním PBSC by se mohlo odstranit riziko opětné infuze nádorových buněk kontaminujících transplantát. Avšak se ukázalo, že problém kontaminace nádorových buněk se snižuje, avšak nevylučuje (4) . Též by mělo být poznamenáno, že vysokodávková chemoterapie s používáním faktorů podporující kolonie může odvádět nádorové buňky do periferijní krve (7, 8). Proto je vysoce opodstatněný rychlý a praktický postup na očištění afarezních produktů.
Byla již podána zpráva o několika způsobech odstraňování buněk prsní rakoviny z BM, a to včetně chemo-imunoseparace, imunomagnetických postupů a používání imunotoxinů (14, 17, 18, 19). Na rozdíl od toho bylo dosud popsáno pouze jen málo studií o přípravcích na čištění PBSC, avšak imunotoxiny připravené s ribosom-inaktivačním proteinem (22, 23) byly použity na ničení lymfoidních nádorových buněk přidaných do sběrů CD34 pozitivních buněk připravených z BM (24). Při posledním vyšetření se získala čistící účinnost 2 log dodatkem k 3 log nepřímého očištění dosaženého selekčním postupem CD34. Cílem tohoto vyšetření bylo vyvinout bezpečný imunotoxinový postup na očištění buněk prsní rakoviny od PBSC. Výsledky získané v modelových pokusech ukazují, že 60-minutová inkubace s l^g/ml každého ze 2 konjugátů s antikarcinomovými protilátkami a PE účinně ničila veškeré nádorové buňky přimíšené k PBSC bez toxicity vůči normálním progenitořovým buňkám. Je důležité, že tato metoda připouští přidávání imunotoxinů přímo do afarezního produktu a po inkubaci jsou buňky omyty, odstředěny a připravené ke zmrazení. Zvláště kvůli své jednoduchosti a účinnosti by měl být tento způsob lákavý k použití při léčbě vybraných skupin pacientů s prsní rakovinou ve spojení s vysokodávkovou chemoterapií kombinovanou s transplantací PBSC.
-30• flfl ·· flfl • · · · · · · · • · · 9 9 9 9 • · · * flflfl flflfl
9 9 9 9 flflfl 9 9 · · flfl
Vysoká selektivní účinnost našeho postupu se dá připsat působení následujících činitelů: Zaprvé, o antigenu rozpoznávaném protilátkou MOC31 je známo, že se vyjadřuje na většině buněk v téměř všech vyšetřovaných vzorcích rakoviny prsu (10). Též protilátka BM7, která uznává dřeňový protein vyjadřovaný genem MUC-1 (9) , se váže na vysokou frakci buněk prsní rakoviny (25). Zdá se, že dohromady tyto dva monoklonály zahrnují v přijatelném rozsahu různorodost v antigenovém vyjadřování vyskytující se u rakoviny prsu. Zadruhé, již dříve jsme dokázali, že při sestavování imunotoxinů je důležité použít nějakého toxinu, který vyhovuje pro užité protilátky (11). Shledali jsme, že PE konjugace s určitým počtem monoklonálů, včetně těch jichž bylo zde použito, jsou značně účinné (14). Kromě toho jsou imunotoxiny s PE vždy toxičtější než ekvimolární koncentrace volných PE (11, 18) prokazujících specifičnost takových imunotoxinů. Očiščovací postupy musí být účinné a bezpečné a je též nutné, aby metoda byla praktická a dalo se jí používat v klinickém měřítku. Vedle té přednosti, že imunotoxiny se dají přidávat přímo do afarezního vaku, má naše metoda pouze 60-minutovou inkubační dobu na zničení všech klonogenických nádorových buněk. A dále, tento postup není toxický pro normální hematopoietické progenitorové buňky a při pokusech čištění BM byly dobře přípustné i mnohem vyšší koncentrace imunotoxinů (14). Též jsme ukázali, že zmrazování a rozmrazování PBSC, na něž působily imunotoxiny, nevyvolávaly žádnou další toxicitu a je pozoruhodné, že postup s imunotoxiny nezahrnuje nespecifickou ztrátu buněk, ke které by mohlo dojít při postupech používajících odstraňování nádorových buněk s imunokuličkami nebo imunoadsorpcí. Před tím jsme již vypočítali, že množství konjugátu zůstávajícího v kostní dřeni, na níž působily imunotoxiny po omytí, je ca 0,75 % celkového přidaného množství (26). Při klinickém prostředí by se pak očekávalo, že zpracování PBSC obsahujících zhruba 2xl010 • ·
-31 • ft ft • ftft • · · » • · ftft·· · ftftft mononukleárních buněk, s doporučenou koncentrací 2 aminotoxinu na ml (lxlO8 buněk) dá nejvýše 3 yg imunotoxinů ve finálním produktu. Toto představuje 100-150 krát méně volného toxinu, než teoreticky vypočítaná maximální přípustná dávka (26). Tím by se neočekávalo, že opětná infuze očištěných PBSC by způsobovala nějakou systémovou toxicitu. Úspěch nebo selhání vysokodávkové terapie kombinované s autologní transplantací hematopoietických progenitorových buněk může záviset dokonce více na účinnosti systematického působení než na účinnosti čištění štěpů (1). Nicméně je logické odstraňovat rakovinné buňky, které by se mohly vyskytovat v autotransplantátu a nedávné důkazy ze studií jiných nádorových typů ukazují důležitost očišťování (16). U rakoviny prsu navrhujeme používat jednoduchý, bezpečný a účinný postup jako je ten zde popisovaný.
Příklad 2:
Ježto buňky rakoviny prsu mohou vykazovat různou citlivost vůči imunotoxinům, takže očišťovací aktivita BM7 a MOC31 může být odlišná na buňkách rakoviny prsu u různých pacientů, opakoval se tentýž experiment, jak byl dříve proveden s PM1 buňkami prsní rakoviny (příklad 1) s jinou buňkovou linií, MA11. Shledalo se, že účinek imunotoxinového působení byl stejně dobrý, nebo dokonce lepší vůči buňkám MA11 oproti buňkám PM1 (tabulka 4). Výsledky potvrzují vysokou specifickou aktivitu očišťovací akce s imunotoxiny. V separátních pokusech se vyšetřovala kinetika aktivity ničení buněk imunotoxinů, a to v experimentu, kdy byly buňky PM1 prsní rakoviny přidány k progenitorovým buňkám periferijní krve (v poměru 1:100) . Po inkubaci po dvě hodiny byla suspenze smíšených buněk zmrazená a potom rozmražena před naočkováním buněk a životaschopnost rakovinových buněk a normálních progenitorových buněk v
999 «99« 9 · 9 9 • · · 9 999 9999 • · 9999 9 99«· 999 999 •99 «99 9 9 kulturách buněk, na něž se působilo nebo nepůsobilo imunotoxinem v tomtéž časovém úseku.
K příkladům 3 - 4:
Rakovinné buňky, které se šíří do kostí nebo kostní dřeni, do pleurálních a břišních dutin, do mozkových a míšních tkání a do urogenitálního traktu se dají ničit selektivně imunotoxiny vpravovanými do nádoru, do uvedených tělních kapalin nebo systematicky, např. na cílové metastatické nádorové buňky v tkáních, jako například v krvi, kostech a kostní dřeni.
Příklad 3:
Buňky MA-11 lidské prsní rakoviny byly vstřiknuty do levé srdeční komory krys s deficitem imunity. Kontrolní zvířata bez zásahu vyvinula symptomy stlačení míchy a musela být utracena 24-37 dní po buněčném vstřiku. Zvířata ošetřená nitrožilně s jedinou dávkou MOC31-PE (20 na krysu) dosáhla prodloužené přežití bez symptomů a některá z těchto zvířat žila déle než 50 dnů. Jiný experiment při tomtéž modelu potvrdil výsledky a v tomto případě některá ze zvířat přežívala po dobu pozorování 110 dní. Při těchto pokusech byla jedna skupina krys ošetřena s určitým imunotoxinem pozůstávajícím z protilátky 425.3 zaměřené proti receptoru EGF s konjugací na PE. Veškerá zvířata v této skupině přežila. Při třetím pokusu v tomto modelu vykazovaly kontrolní krysy symptomy stlačení míchy a musely být utraceny mezi 40. a 60. dnem po buněčném vstřiku. Do tohoto experimentu byly pojaty tři skupiny ošetření, a to jedna s 20 /xg 423.5-PE a jedna přijímající 10 mg každého z těch dvou imunotoxinů.
Dosáhlo se významného prodloužení přežití bez nemoci s oběma imunotoxiny použitými individuálně, což dávalo 6% dlouhé doby přežití s MOC31-PE a 60 % s 425.3-PE. Při pokusech s kombinací přežila všechna zvířata bez nemoci. Při čtvrtém pokusu v tomto modelu se účinek působení MOC31-PE porovnával s účinky cis• φ • · · φφφ
-33platinu a doxorubicinu. Při tomto pokusu všechna zvířata ošetřená MOC31-PE přežívala po více než 70 dní, kdežto doxorubicin ukázal pouze okrajový účinek a krysy ošetřené cisplatinem nežily déle než kontrolní zvířata ošetřená fyziologickým roztokem. Tyto údaje přesvědčivě ukazují, že použité imunotoxiny jsou značně vyšší kvality při ničení metastáz prsní rakoviny než doxorubicin a cis-platin, dva z nej obvykleji používaných léků na klinice.
Příklad 4:
Ve dvou různých experimentech se použilo buňkové linie MT-1 lidské rakoviny prsu. V prvním případě byly buňky vstřiknuty do levé srdeční dutiny a kontrolní zvířata musela být utracena kvůli symptomům stlačení míchy průměrně po době 19 dni. Zvířata ošetřená s 425.3-PE nitrožilně jeden den po buněčné injekci přežila všechna. Při ostatních experimentech byly nádorové buňky MT-1 vstřikovány přímo do dutiny s kostní dření v holenní kosti krys. Všechna neošetřená zvířata musela být utracena o 20 dní později kvůli narůstajícím holenním nádorům, kdežto krysy ošetřené s 20 gg 425.3-PE nitrožilně jeden den po buněčném vstřiku přežily všechny po více než 100 dní. Dále u modelu, kdy nádorové buňky MT-1 byly vstřikovány přímo do kostní dřeni krycích holení, porovnával se účinek BM7-PE podávaného buď 1. nebo 7. dne s účinky 425.3-OE ve skupinách zvířat ošetřených v těchže dnech jako s BM7-PE. A dále se rovněž vyšetřoval účinek doxorubicinu (Adriamycinu) vpravovaného nitrožilně 7. a 14. dne. Shledalo se, že oba imunotoxiny vyléčily 80 % krys, ať již byly podávány 1. nebo 7. dne. Když se kombinovaly poloviční koncentrace každého imunotoxinu, všechna zvířata přežila. Naproti tomu doxorubicin byl jasně méně účinný, neboť ponechával pouze 35 % zvířat naživu po 90 dnech. Kontrolní zvířata musela být utracena 20 dní po vstřiknutí buněk jako v předcházejících experimentech. Data potvrzují účinek 425.3-PE
-34• ftft ftft ftft • ft · ft ftftftft • ftft ftftftft • · ftft ftft· ··· • ftft · · · ftft • ft · ····· ftft ftft ft · • · · • ftft ftft ft jak bylo dříve ukázáno. Je důležité, že se shledalo, že RM7-PE je stejně účinný jako 425.3-PE. Obě látky měly jasně vyšší účinnost proti doxorubicinu, jednomu z klinických léků nej častěji používanému proti rakovině prsu. Kromě toho se kombinací těchto dvou imunotoxinů vyléčila všechna zvířata ze své nemoci.
Příklad 5:
Ve dvou sadách pokusů se zkoušel účinek rekombinačně připraveného imunotoxinů zaměřeného proti erbB2-genovému produktu a s rekombinačně zhotovenou obměnou PE. V modelu popsaném v příkladu 4 prodloužila nejvyšší koncentrace rekombinačního imunotoxinů významně délku života zvířat a 35 % krys přežilo. Při modelu, kdy MT-1 buňky prsní rakoviny byly vstřikovány intratekálně u krys s deficitem imunity se ošetření s rekombinačním imunotoxinem též podávalo intratekálně (1., 2. a 3.dne), mělo to za následek významné prodloužení délky života zvířat. Tento účinek byl závislý na dávce a dvěma různými dávkami se prodlužovala délka života zvířat od 10,6 dní (kontrolní zvířata ošetřená fyziologickým roztokem) na 23,4 dní a na 32,8 dní s' dvěma různými dávkami imunotoxinů. Při nejvyšší dávce přežilo 20 % krys. Ježto se nepozorovala toxicita ani při nejvyšší dávce imunotoxinů, očekává se, že účinek při optimálních dávkách může být dokonce lepší.
·· ·· » ♦ · · » φ · · •φφ φφφ φ φ ·· ··
-35 • · φ • ···· • *
Odkazy na literaturu
1. Peters, W.P., Ross, Μ., Vredenburgh, J.J., Meisenberg B., Marks, L.B., Winer, E., Kurtzberg, J., Bašt, R.C.J., Jones,
R., Shpall, E., Wu, K., Rosner, G., Gilbert, C., Mathias, B., Coniglio, D., Petros, W., Henderson, I.C., Norton, L., Weiss, R.B., Budman, D. and Hurd, D.: Vysokodávková chemoterapie a autologní podpora kostní dřeně jakožto konsolidace po léčení adjuvantem ve standartních dávkách pro vysoce rizikovou primární rakovinu prsu. J. Clin. Oncol., 11:1132-1143, 1993.
2. Armitage, J.O.: Transplantace kostní dřeni. N. Engl. J.
Med., 330:827-838, 1994.
3. Moss, T.J., Sanders, D.G., Lásky, L.C., and Bostrom, B.: Kontaminace při získávání kmenových buněk periferijní krve cirkulací neurobíastomových buněk. Blood, 76:1879-1883, 1990.
4. Ross, A.A., Cooper, B.W., Lazarus, H.M., Mackay, W., Moss, T.J., Ciobanu, B., Tallman, M.S., Kennedy, M.J., Davidson, N.E., Sweet, D., and et al.: Detekce a životaschopnost nádorových buněk ve sběru kmenových buněk periferijní krve u pacientů s rakovinou prsu s použitím imunocytochemických a klonogenických zkušebních postupů. Blood, 82:2605-2610, 1993.
5. Brenner, M.K., Rill, D.R., Moen, R.C., Krance, R.A., Mirro,
J., Jr., Anderson, W.F., and Ihle, J.N.: Značkování genů na sledování původu recidivy po analogní transplantaci kostní dřeně. Lancet, 341:85-86, 1993.
6. Gribben, J.G., Frredman, A.S., Neuberg, D., Roy, D.C.,
Blake, K.W., Woo, S.D., Grossbard, M.L., Rabinowe, S.N.,
Coral, F., Freeman, G.J., and et al.: Imunologické očiščování dřeně vyhodnocované pomocí PVR před autologní transplantací kostní dřeně pro B-buňkové lymfony. N. Engl. J. Med., 325:1525-1533, 1991.
7.Sphall, E.J. and Jones, R.B.: Uvolňování novotvarových buněk z kostní dřeně. Blood, 83:623-625, 1994.
-36φφ φ φ φ · φ • φφφ • · φφφφ φ • · φ • Φ φ · φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφφφ 9 Φ ΦΦΦ ΦΦΦ • Φ Φ
ΦΦ ΦΦ
8.Brugger, W., Bross, K.J., Glatt, Μ., Weber, F., Mertelsmann, R. and Kanz, L.: Zmobilizování novotvarových buněk a hematopoietických progenitorových buněk do periferijní krve pacientů s nádory s pevnou tkání. Blood, 83:636-640, 1994. 9.Strous, G.J. and Dekker, J. : Mucioné glykoproteiny. Crit. Rev. Biochem. Molecu. Biol., 27:57-92, 1992.
10. Leij, L.D., Postmus, P.E., Poppema, S., Elema, J.D., and
The, T.H.: Používání monoklonálních protilátek pro patologickou diagnózu plicní rakoviny. V: H.H. Hansen (ed.), Lung Cancer: Basic and Clinical Aspects, pp. 31-48. Boston:
Martinus Niijhoff Publishers, 1986.
11. Godal, A., Kumle, B., Pihl, A., Juell, S. and Fodstad, O.: Imunotoxiny zaměřené proti antigenům souvisejícím s melanomem o vysoké molekulové hmotnosti. Identifikace účinných kombinací protilátkových toxinů. Int. J. Cancer, 52:631-635, 1992.
ftft ft · • · ftftft • · • · • ft ·
-37• ft · • ftft · • · · · • · ···· · • · · • · • 9 • · • ft
12. Courtenay, V.D. and Mills, J.: Analýza kolonie in vitro pro lidský tumor vyrostlý u myši s potlačenou imunitou a zpracované in vivo s cytotoxickými látkami. Br. J. Cancer, 37:261-268, 1978.
13. Wang, M.Y., Kvalheim, G., Kvaloy, S., Beiske, K., Jakobsen, E., Wijdens, J. , Pihl, A., & Fodstad, 0.: Účinný imunomagnetický postup pro očišťování kostní dřeně při zhoubném bujení T-buněk. Bone Marrow Transplant., 9:319-323, 1992 .
14. Myklebust, A.T., Godal, A., Juell, S., Pharo, A., and Fodstad, 0.: Porovnání dvou způsobů na bázi protilátek na odstraňování buněk prsní rakoviny z lidské kostní dřeně.
Cancer Res., 54:209-214, 1994.
15. Eaves, C.J.: Kmenové buňky periferijní krve dosahují nových výšek. Blood, 82:1957-1959, 1993.
16.Sphall, E.J., Jones, R.B., Bearman, S.I., Franklin, W.A., Archer, P.G., Curiel, T., Bitter, Μ., Claman, H.N., Stemmer,
S.M., Purdy, Μ., Myers, S.E., Hami, L·., Taffs, S., Heimfeld, S., Hallagan, J. and Berenson, J. Transplantace obohacené CD34 - pozitivní autologní dřeně pacientů s rakovinou prsu po vysokodávkové chemoterapii: Vliv CD34 - pozitivních progenitorů periferijní krve a růstový faktor na očkované transplantaci. J. Clin. Oncol., 12:28-36, 1994.
-38φφ φ φφφ φ φ φφφ φ φ φφφφ φ φφφ φ φ φ φ φφ φφ φ φφφφ • φφφφ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φφ φφ
17. Bjorn, M.J., Groetsema, G., and Scalapino, L.: Protilátkový Pseudomonad exotoxin A konjugáty cytotoxické vůči buňkám rakoviny lidského prsu in vitro. Cancer Res., 46:3262-3267, 1986 .
18. Anderson,. I.C., Shpall, E.J., Leslie, D.S., Nustad, K., Ugelstad, J., Peters, W.P., and Bašt, R.C.Jr.: Vyloučení maligních klonogenních buněk prsní rakoviny z lidské kostní dřeni. Cancer Res., 49:4659-4664, 1989.
19.0'Briant, K.C., Shpall, E.J., Houston, L.L., Peters, W.P., Bašt, R.C.Jr.: Vyloučení klonogenních buněk prsní rakoviny z lidské kostní dřeně: porovnávání imunotoxinového léčení s chemoimunní separací s použitím 4-hydroperoxicyklofosfamidu, monoklonálních antilátek a magnetických mikrokuliček.
Cancer.68:1272-1278, 1991.
2O.Stray, K.M. , Corpuz, D., Colter, K.M., Berenson, R., and Heimfeld, S.: Očišťování novotvarových buněk od kostní dřeně nebo periferijní krve s použitím avidinové biotinové imunoadsorpce. Uvedeno v: P.G. Adrian. G.Samuel, and A.W-W. Diana (eds.), Pokroky v očišťování a zpracování kostní dřeně, str.97-103. Orlando: Wiley-Liss, lne., 1994.
21.Tyer, C.L., Vredenburgh, J.J., Heimer, M., Bašt, R.C.Jr., and Peters, W.P.: Buňky prsní rakoviny byly účinně odděleny od progenitorových buněk periferijní krve s použitím imunomagnetického postupu. Resumé k prvnímu zasedání
Mezinárodní společnosti pro hematologii a štěpovou techniku, Orlando, FL, 1993.
22.Stirpe, F., Barbieri, L., Battelli, M.G., Soria, M., and Lappi, D.A.: Ribosomový inaktivační protein z rostlin: dnešní stav a budoucí vyhlídky. Bio/Technology 10: 405-412, 1992.
23.Barbieri, L., Battelli, M.G., Stirpe, F.: Ríbosonový inaktivační protein z rostlin. Biochem. Biophys. Acta.
1154 :237-282, 1993.
• ft · • · ft
-39ftft · • ftft • · · ft • · ftftft· · • ftft • · ·
24. Lemoli, R.M., Tazzari, P.L., Fortuna, A., Bolognesi, A., Gulati, S.C., Stirpe, F., and Tura, S.: Pozitivní selekce hematopoietických CD34+ kmenových buněk zajišťuje nepřímé očišťování CD34 - lymfoidových buněk a oddělovací účinek se zvyšuje anti-CD2 a CD30 imunotoxiny. Bone Marrow Transplant., 13: 465-471, 1994.
25. Diel, I.J., Kaufmann, Μ., Goerner, R. , Costa, S.D., Kaul, S., and Bastert, G.: Detekce novotvarových buněk v kostní dřeni u pacientů s primární rakovinou prsu: prognostický faktor pro vzdálené metastáze. J.Clin. Oncol., 10: 1534-1539, 1992 .
26. Myklebust, A.T., Godal, A., Pharo, A., Juell, S., and Fodstad, O.: Eradikace malobuněčných buněk plicní rakoviny z lidské kostní dřeně pomocí imunotoxinů. Cancer Res., 53:37843788, 1993.
ft v
9 9 9
9 9 9
999 999
9
99 • 9
9 9
9999
9
Claims (6)
- Patentové nároky1. Imunotoxický prostředek pro ničení nežádoucích cílových buněk, zejména prsní rakoviny nebo jiných rakovinných buněk, vyjadřujících stejné cílové antigeny v populaci buněk obsahující nukleované buňky získané z periferijní krve, nebo buňky CD-34+ sebrané z výše uvedených nukleovaných buněk, nebo jiné nezralé/ranné progenitorové buňky z krve, obsahující mnohoúčinné kmenové buňky, vyznačující se tím, že obsahuje dva imunotoxiny zaměřené na antigeny vyskytující se v maligních buňkách, přičemž každý imunotoxin se skládá z konjugátu mezi protilátkou a buněčným toxinem, fragmentů protilátek a toxinů nebo rekombinačně připravených protilátek, imunotoxinů nebo jejich fragmentů, kde protilátky jsou zaměřeny na epitopy na antigenu EGP2 vyjádřeném genem GA733 a na epitopy na antigenu vyjádřeném geny MUC1, MUC2 nebo MUC3 nebo jejich kombinací a toxinem je Pseuctomonas exotoxin A.
- 2. Imunotoxický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že použitými protilátkami jsou MOC31 a určitá protilátka zaměřená na antigeny zakódované geny MUC1, MUC2, MUC3 nebo jejich kombinací.
- 3. Imunotoxický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že použitými protilátkami jsou MOC31 a BM7 nebo jejich fragmenty.
- 4. 2. Imunotoxický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že použitými protilátkami jsou MOC31 a BM2 nebo 12H12 nebo jejich fragmenty.• ΒΒΒ-41 ΒΒ Β • · · • · Β Β • · ΒΒΒΒ ΒΒΒΒΒΒ ΒΒ· ΒΒ
- 5. Imunotoxický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že použitými protilátkami jsou M0C31 a 595A6 nebo jejich fragmenty.t
- 6. Imunotoxický prostředek podle nároku 2, <vyznačující se tím, že protilátky jsou M0C31 a volitelně BM7, 595, RM2, 12H12 nebo jejich kombinace nebo jejich fragmenty a toxinem je přírodní nebo rekombinační Pseudomonas exotoxin A, nebo jejich fragmenty.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19982763A CZ276398A3 (cs) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19982763A CZ276398A3 (cs) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ276398A3 true CZ276398A3 (cs) | 2000-01-12 |
Family
ID=5465539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982763A CZ276398A3 (cs) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ276398A3 (cs) |
-
1997
- 1997-03-12 CZ CZ19982763A patent/CZ276398A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0954329B1 (en) | Method of killing target cells in harvested cell populations with two immunotoxins | |
| Andrews et al. | Rapid engraftment by peripheral blood progenitor cells mobilized by recombinant human stem cell factor and recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in nonhuman primates | |
| JP2001509778A (ja) | 移植片不全または対宿主性移植片病を伴わない同種異系造血幹細胞移植法 | |
| US20200308280A1 (en) | Methods for cancer treatment using a radiolabeled anti-cd45 immunoglobulin and adoptive cell therapies | |
| CN115785278A (zh) | 一种cik细胞与抗体联合治疗癌症的用途 | |
| CZ20013270A3 (cs) | Protilátkové a chemokinové konstrukty a jejich pouľití při léčbě autoimunitních chorob | |
| CN117980470A (zh) | 治疗性nk细胞群 | |
| WO1995013093A1 (en) | Treatment of a patient prior to transplantation | |
| CZ276398A3 (cs) | Immunotoxický prostředek pro ničení ; nežádoucích cílových buněk | |
| MacVittie et al. | Myelopoietin, a chimeric agonist of human interleukin 3 and granulocyte colony-stimulating factor receptors, mobilizes CD34+ cells that rapidly engraft lethally x-irradiated nonhuman primates | |
| MXPA98007252A (en) | Method to destroy cells objective does not wish | |
| JP4106488B2 (ja) | 同種移植片に対する免疫寛容の誘導および／または白血病処置のための、幹細胞およびｃｄ６枯渇幹細胞の使用 | |
| KR19990087546A (ko) | 하나 이상의 면역독소로 수집된 세포군에 있는 표적 세포를 괴사시키는 방법 | |
| US20150098924A1 (en) | Method for ex-vivo purging in autologous transplantation | |
| Claesson et al. | Effects of monoclonal anti‐T cell antibodies on rat cardiac allografts | |
| US20080241109A1 (en) | Method for Ex-Vivo Purging in Autologous Transplantation | |
| McCarthy et al. | Autologous bone marrow transplantation | |
| US20080095802A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs A) to activated lymphocytes in patients iwth transplanted organs, B) as radiosensitizers to cancer cells in paients undergoing radiation therapy, and C) in vitaminpbinding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| Omoto et al. | Anti-CD4 monoclonal antibody reduces the dose of cyclophosphamide required to induce tolerance to H-2 haplotype identical skin allografts in mice | |
| Vitetta et al. | The use of immunotoxins to kill neoplastic B cells | |
| CA2414401A1 (en) | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer | |
| Preijers | Ex vivo elimination of normal and malignant T cells from bone marrow grafts by ricin A-chain immunotoxins | |
| Kvalheim et al. | Stem cell isolation with immunomagnetic beads and tumor cell contamination | |
| JP2002529476A (ja) | 同種異系造血細胞移植を改良するための方法及び組成物 | |
| Andrews et al. | Rapid engraftment by peripheral blood progenitor cells mobilized by |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |