CZ277599A3

CZ277599A3 - Mikroorganismy se zvýšenou produkcí kyseliny klavulanové

Info

Publication number: CZ277599A3
Application number: CZ19992775A
Authority: CZ
Inventors: Barry Barton; John Patrick Griffin; Cecilia Anders; Susan Jensen; Roy Henry Mosher; Ashish Sudhakar Paradkar
Original assignee: Smithkline Beecham Plc; The Governors Of The University Of Alberta C/O Industry Liaison Office
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2000-02-16

Abstract

Nové bakteriální geny, mikroorganismy a způsoby pro zlepšení výroby 5Rklavamů, například kyseliny klavulanové.

Description

Mikroorganismy se zvýšenou produkcí kyseliny klavulanové

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových bakteriálních genů a způsobů pro zlepšení výroby klavamů, například kyseliny klavulanové. Předkládaný vynález také poskytuje nové organismy, které jsou schopné produkovat zvýšená množství kyseliny klavulanové.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganismy, zejména Streptomyces sp., produkují mnoho antibiotik včetně kyseliny klavulanové a jiných klavamů, cefalosporinů, polyketidů, cephamycinů, tunikamycinu, holomycinu a penicilinů. Významná je schopnost ovlivňovat absolutní a relativní množství těchto antibiotik produkovaná mikroorganismy a proto existuje mnoho studií zkoumajících metabolické a genetické mechanismy biosyntézy (Domain, A.L. (1990), Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics, v 50 years of Penicillin applications, history and trends). Je známo mnoho enzymů, které provádějí různé kroky v metabolické dráze a genů, které kódují takové enzymy.

Klavamy byly rozděleny do dvou skupin podle stereochemického uspořádání jejich kruhů (5S a 5R klavamy). Biochemické dráhy pro biosyntézu 5R a 5S klavamy nejsou dosud plně známé, ale předpokládá se, že jsou odvozeny od stejných výchozích jednotek (ještě neidentifikované 3 uhlíkové sloučeniny (Townsend, S.. and Ho, M.F. (1985), J. AM. Chem. Soc. 107(4) 1066 - 1068 a Elson,

S.W. and Oliver, R.S. (1978), J. Antibiotics XXXI NNo. 6, 568)) a argininu (Valentine, B.P. et al., (1993) J. Am. Chem. Soc. 15:

• · · · • · • ·

1210 - 1211) a že mají některé spoléčíhé meziprodukty (Iwata-Reuyl, D., and C.A. Towngeůd (1992), J. Am. Chem. Soc.

114: 2762 - 63, a Jane, j-_fW. eť. al., (1936)7/ Bioorg. Med. Chem.

Lett. 3 : 2313 - 16) . ..... '

Příklady 5S klavamů zahrnují klavam-2-karboxylat (C2C),

2-hydroxymethylklavam (2HMC), 2-(3-alanyl)klavam, valklavam a kyselinu klavaminovou (GB 1585661, Rohl, F. et al., Arch. Microbiol. 147: 315 - 320, US 4202819). Existuje, nicméně, několik příkladů 5R klavamů a nej známějším je inhibitor beta-laktamasy, kyselina klavulanová, která je produkována fermentací Streptomyces clavuligerus. Kyselina klavulanová, ve formě klavulanatu draselného, je kombinována s beta.laktamovým antibiotikem amoxycillinem v antibiotiku AUGMENTIN (obchodní značka SmitKline Beecham). Vzhledem k tomuto komerčnímu významu se výzkum biosyntézy klavamů zaměřil na biosyntézu 5R klavamů, kyseliny klavulanové, S. clavuligerus. Bylo identifikováno a publikováno mnoho enzymů a jejich genl spojených s biosyntézou kyseliny klavulanové. Příklady takových publikací jsou Hodgson, J.E. et al., Gene 166: 49 - 55 (1995), Aidoo, K.A: et al., Gene 147: 41 - 46 (1994), Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5):

1307 - 14 (1995). Oproti tomu není nic známo o biosyntéze a genetice 5S klavamů jiných než kyselina klavaminová, která je prekursorem kyseliny klavulanové produkovaným působením syntásy kyseliny klavaminové v biochemické dráze kyseliny klavulanové v S. clavuligerus.

Genové klonovací pokusy identifikovaly, že S. clavuligerus obsahuje dva izoenzymy syntasy kyseliny klavaminové, casl a cas2 (Marsh, E.N. et al., Biochemistry 31, 12684-657 (1992)), které mohou oba způsobovat produkci kyseliny klavulanové za určitých nutričních podmínek (Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5):

1307 - 14 (1995). Aktivita syntasy kyseliny klavaminové byla také identifikována v jiných mikroorganismech produkujících kyselinu klavulanovou, t.j. v S. jumonjinensis (Vídal, C.M., ES 550549 (1987)) a S. katsurahamanus (Kitano, K. et al., JP 53-104796 (1978)), stejně jako v S. antibioticos, což je producent 5S klavamu, valklavamu (Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron Letts. 35(17): 2783 - 86 (1994). Poslední uvedená studie také uvádí, že S. antibioticos má amidino-hydrolasovou aktivitu pro proklavaminovou kyselinu, t.j. aktivitu dalšího ennzymu, který se účastní biosyntézy kyseliny klavulanové. Všechny další geny identifikované v S. clavuligerus, která participují na biosyntese klavamů, se účastní biosyntesy kyseliny klavulanové (Hodgson,

J.E. et al., Gene 166: 49 - 55 (1995), Aidoo, K.A: et al., Gene 147: 41 - 46 (1994)) a nebyl popsán žádný gen, který je specifický pro biosyntézu 5S klavamů.

Podstata vynálezu

Nyní jsme identifikovali některé geny, které jsou specifické pro biosyntézu 5S klavamů, jako jsou například C2C a 2HMC u S. clavuligerus. V souladu s tím poskytuje předkládaný vynnález DNA obsahující jeden nebo dva geny, které jsou specifické pro biosyntézu 5S klavamů u S. clavuligerus a které nejsou zásadní pro biosyntézu 5R klavamu (například kyseliny klavulanové).

Termín gen, jak je zde použit, zahrnuje také jakýkoliv regulační region nutný pro funkci a expresi genu. Ve výhodném provedení má DNA sekvenci uvedenou na obr. 1. Výhodně obsahuje DNA sekvence nukleotidů uvedené na obr. 1 a označené jako orfup3, orfup2, orfupl, orfdwnl, orfdwn2 a orfdwn3. Předkládaný vynález také poskytuje proteiny kódované uvedenou DNA. Předkládaný vynález také poskytuje vektory obsahující DNA podle předkládaného vynálezu a hostitele obsahující takové vektory.

•9 99·· • *

Překvapivě jsme zjistili, že pokud je alespoň jeden z genů podle předkládaného vynálezu defektní, tak je množství kyseliny klavulanové produkované organismem zvýšeno. V souladu s tím předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro zvýšení množství kyseliny klavulanové produkovaného vhodným mikroorganismem. V jednom aspektu vynálezu mohou být identifikované geny upraveny tak, že vznikne organismus, který je schopen produkce zvýšeného množství klavamu, výhodně kyseliny klavulanové. Tyto objevy také zlepšují způsoby pro identifikaci organismů s vyšší produkci kyseliny klavulanové, včetně předběžného vyhledávání organismů s nízkou nebo žádnou produkcí 5S klavamu (například hplc a/nebo klavamový biotest, jak je popsán dále v příkladech).

Vhodné geny pro 5S klavamy podle předkládaného vynálezu mohou být získány běžnými technikami klonování (jako je PCR) na základě sekvencí, které jsou zde uvedené. Funkce genu může být změněna nebo eliminována/deletována genetickými technikami jako je narušení genu ( Aidoo, K.A: et al., Gene 147: 41 - 46 (1994)), náhodná mutagenese, místně cílená mutagenese a protismyslná DNA.

V dalším aspektu vynález poskytuje plasmidy obsahující jeden nebo více defektních genů, výhodně plasmidy pCEC060, pCEC061, pDES3, pCEC056 a pCEC057, jak jsou popsány dále. Geny mohou být učiněny defektními různými způsoby. Například inserce fragmentu DNA kódujícího gen resistence na antibiotika může zcela zrušit aktivitu tohoto genu. Alternativně mohou být použity jiné strategie pro výrobu defektních genů, včetně inserce DNA nekódující gen resistence na antibiotika, delece části genu, delece celého genu nebo alterace nukleotidové sekvence genu adicí a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů. Defektní geny podle předkládaného vynálezu mohou být defektní v různém rozsahu. Mohou být defektní tak, že jejich aktivita je zcela zrušena, nebo může být část původní aktivity zachována.

Výhodně jsou plasmidy podle předkládaného vynálezu použity pro transformaci organismů jako je S. clavuligerus, například kmen ATCC 27064 (což odpovídá S. clavuligerus NRRL 3585). Vhodné techniky pro transformaci mohou být vyhledány v literatuře, například v Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Hopwood, D.A: et al., (1985), Genetic manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, a Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5): 1307 - 14 (1995) .

Kmeny druhu S. clavuligerus jsou průmyslově využívány pro výrobu kyseliny klavulanové. V Britském a Americkém Lékopise pro draselnou sůl kyseliny klavulanové (British Pharmacopoeia 1993, Addendum 1994, str. 1362-3 a U.S. Pharmacopoeia Official Monographs 1995, USP 23 NF18 str. 384-5) je konkrétně kontrolováno množství toxického 5S klavamu, klavam-2-karboxylatu.

Proto v dalším aspektu vynález poskytuje organismus, který je schopný produkovat velká množství kyseliny klavulanové, ale který není schopen produkovat C2C nebo který je schopen produkovat velká množství kyseliny klavulanové, ale produkuje pouze malé množství C2C. Výhodně obsahuje organismus produkující kyselinu klavulanovou jeden nebo více defektních klavamových genů, a výhodně jím je S. clavuligerus kmene 56-1A, 56-3A, 57-2B, 57-1C, 60-1A, 60-2A, 60-3A, 61-1A, 61-2A, 61-3A a 61-4A, které jsou popsány dále. Takové organismy jsou vhodné pro produkci kyseliny klavulanové bez produkce 5S klavamu, klavam-2-karboxylatu nebo s významně sníženou produkcí klavam-2-karboxylatu.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech jsou všechny metody provedené způsobem podle • · »

I · · · · • · • · · · » » »

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989)

Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Hopwood, D.A: et al., (1985), Genetic manipulation of Streptomyces. A Cloning

Manual, a Paradkar, A.S. and Jensen, S.E., J. Bacteriol. 177(5): 1307 - 1314 (1995), pokud není uvedeno jinak.

Příklad 1: DNA sekvencování chromosomu S. clavuligerus ve smyslu sekvence a proti smyslu sekvence genu casl klavaminat syntasy

A. Izolace casl

Pro izolaci fragmentů chromosomální DNA Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 kódujících gen pro klavaminat syntasu izoenzym 1 (casl) byla syntetizovány oligonukleotidová sonda RMO1 na základě nukleotidů 9-44 známé sekvence casl genu (Marsh, E.N., Chang, M.D.T. and Townsend, C.A. (1992), Biochemistry 31: 12648 12657) . Oligonukleotidy byly vyrobeny za použití běžných technik na Applied Biosystems 391 DNA Synthetiser. Sekvence RMOl,

36-meru, byla syntetizována v opačném směru, než publikoval Marsh et al., (1992). RMOl byl radioaktivně značen ³²P za použití standardních technik pro koncové značení DNA oligonukleotidů (Sambrook et al., 1989) a byl použit pro vyšetřování kosmidové banky genomové DNA Streptomyces clavuligerus Southern hybridizaci, jak jí popisuje Stáhl and Amann (Nucleic acid technigues in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, Toronto: John Wiley and Sons, str. 205 - 248, 1991). Genomová banka DNA S. clavuligerus, připravená v kosmidu pLAFR3, byla stejná, jak jí popisuje Doran, J.L. et al., (1990), J.

Bacteriol. 172(9): 4909 - 4918.

Skvrny kolonií kosmidové banky S. clavuligerus byly inkubovány přes noc s radioaktivně značeným RMOl při 60 °C v roztoku • 9 • 9 · · · · · 9 9 9 * ♦9·· 99 9 9 9* 9

99 9* 99 999999

9 · 9 9 ·* skládajícím se z 5 x SSC, 5 x Denhartův roztok a 0,5% SDS (1 x SDS: 0,15 M NaCl + 0,015 M Na₃citrat; 1 x Denhartův roztok: 0,02% BSA, 0,02% Ficoll a 0,02% PVP). Skvrny byly potom promyty při 68 °C po dobu 30 minut v roztoku 0,5 x SSC + 0,1% SDS. Byl izolován jeden kosmidový klon, 10D7, který silně hybridizoval s RMO1 a dával hybridizační signály po trávení restrikčními endonukleasami Sací a EcoRI, které odpovídaly hybridizačním signálům detekovaným v podobných pokusech s trávením genomové DNA S. clavuligerus.

B. DNA sekvencování regionů chromosomu S. clavuligerus sousedících s casl

Částečná restrikční mapa kosmidu 10D7 byla vyrobena za použití restrikčních endonukleas Sací, Ncol a KpnI. Southern hybridizace mezi RMO1 a různými produkty trávení 10D7 DNA ukázala, že casl je s největší pravděpodobností umístěn na jednom konci 7-kb SacI-SacI DNA subfragmentu. Tento fragment se skládá z casl otevřeného čtecího rámce a přibližně 6 kb DNA ve směru kódujícího řetězce. 7-kb fragment byl potom subklonován z produktu trávení 10D7 Sací ve fagenidovém vektoru pBluescriptlI SK+ (2,96 kb; Stratagene), za vzniku rekombinantního plasmidu pCEC007.

Pro usnadnění sekvencování chromosomu proti směru kódujícího řetězce od casl byl 3-kb Ncol-Ncol subfragment 7-kb SacI-SacI fragmentu subklonován v pUC120 (3,2 kb; Vieirra and Messing, Methods Enzymol. 153: 3 - 11, 1987) v obou orientacích, za vzniku rekombinantních plasmidů pCEC026 a pCEC027. 3-kb subfragment se skládal z amino-koncové kódující části casl a přibližně 2,6 kb DNA proti směru kódujícího řetězce.

Komplementární, přesahující delece byly vytvořeny jak v pCEC026, tak v pCEC027, za použití trávení exonukleasou III a SI nukleasou (Sambrook et al., 1989) a DNA sekvence 3-kb Ncol-Ncol • ·♦ • · 9 · • 99 9 999 » · • · 9 9 fragmentu byla určena v obou řetězcích Sangerovým sekvencováním (Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, A.R. (1977), Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 74: 5493 - 5467) za použití Tag dye-deoxy^aterminátor kitu a Applied Biosystems 373A Sequencer.

Pro určení DNA sekvence chromosomu bezprostředně po směru kódující sekvence od casl byl 4,3 kb KpnI-EcoRI DNA fragment subklonován z kosmidového klonu 10D7 v pBluescript SK+, za vzniku pCEC018. Z pCEC018 byl 3,7 kb SacI-SacI subfragment klonován v pSL1180 (3,422 kb, Pharmacia); jeden Sací konec tohoto fragmentu částečně přesahoval TGA stop kodon casl, druhý byl kodován vektorem. Během subklonování byly získány obě orientace a vzniklé rekombinantní plasmidy byly označeny pCEC023 a pCEC024. Komplementární, přesahující delece byly vytvořeny v obou plasmidech a DNA sekvence 3,7-kb fragmentu byla určena pro oba řetězce. Sekvence nukleotidů chromosomu S. clavuligerus získaná v tomto pokusu, včetně sekvence sousedící s casl, je uvedena na obr. 1.

Příklad 2: Funkční analýza otevřených čtecích rámců obklopuj ících casl

Počítačová analýza DNA sekvence ve směru kódující sekvence od casl předpověděla přítomnost dvou kompletních orf a jednoho nekompletního orf. Všechny tři orf byly umístěny na opačném DNA řetězci než casl a byly proto opačně orientované. První otevřený čtecí rámec, orfupl, byl umístěn 579 bp ve směru kódující sekvence od casl a kodoval polypeptid o 344 aminokyselinách (aa). Druhý otevřený čtecí rámec, orfup2, byl umístěn 437 bp za 3' koncem orfupl a kodoval polypeptid o 151 aminokyselinách (aa). Za orfup2 byl orfup3. Start kodon orfup3 přesahuje translační stop kodon orfup2, což naznačuje, že tyto dva orf jsou translačně spřaženy. Žádný translační stop kodon pro orfup3 nebyl umístěn na

Λ 0 0 «000 0000

0000 00 0 »'0 0 0

00 00 00 000000

0 0 0 0 0 0 0 • 000 000 000 00 00 00

3-kb Ncol-Ncol fragmentu.

Podobná analýzy DNA sekvence proti směru kódující sekvence od casl předpověděla přítomnost dvou kompletních orf a jednoho nekompletního orf. Dva orf byly umístěny na opačném DNA řetězci než casl a byly proto tak orientovány k casl. Třetí orf byl umístěn na stejném DNA řetězci jako casl a byl tak orientován od casl. První otevřený čtecí rámec ve směru po kódujícím řetězci, orfdwnl, byl umístěn 373 bp po směru kódujícího řetězce od casl a kodoval polypeptid o 328 aa. Druhý otevřený čtecí rámec, orfdwn2, byl umístěn 55 bp proti směru kódujícího řetězce od casl a kodoval polypeptid o 394 aa. 315 bp ve směru kódujícího řetězce od orfdwn2 a na opačném řetězci byl orfdwn3. Jelikož pro orfdwn3 nebyl na 3,7 kb fragmentu zjištěn žádný stop kodon, je jasné, že kóduje nekompletní polypeptid o 219 aa.

Genové narušení orfup a orfdwn otevřených čtecích rámců

Pro hodnocení možného významu otevřených čtecích rámců obklopujících casl v biosynteze kyseliny klavulanové a jiných klavamů produkovaných S. clavuligerus byly technikou genových náhrad vytvořeny inserční inaktivační nebo deleční mutanty. Technika pro narušení genů a náhradu genů byla stejná, jak jí popisuje Paradkar a Jensen (1995).

A. orfupl

1,5 kb Ncol-Ncol fragment nesoucí gen resistence na apramycin (apr^r) vyrobený způsobem, který popsali Paradkar a Jensen (1995) reagoval s Klenow fragmentem pro vyropení lepivých konců (Sambrook et al., 1989) a byl ligován do pCEC026, který byl tráven BsaBI a také Klenow fragmentem. pCEC026 má BsaBI místo umístěné v orfupl 636 bp od translačního start kodonu. Ligační ·· ··· 4 · 4 4 ·· 4 4

4 4 4444 44·· • 444 44 4 4 44 4 • 4 4 44 44 ······ • · 4 4 4 4 4 směs byla použita pro transformaci kompetentních buněk E. coli GM 2163 (dostupných od New England Biolabs, USA, Marinus, M.G. et al., M G G (1983), svazek 122, str. 288 - 9) pro získání resistence na apramycin. Z výsledných transformantů byly izolovány dva klony obsahující plasmidy pCEC054 a pCEC055; při restrikční analýze pCEC054 bylo zjištěno, že obsahuje apr^-fragment insertovaný ve stejné orientaci jako orfupl, zatímco pCEC055 jej obsahuje v opačné orientaci.

Pro vložení pCEC054 do S. clavuligerus byla plasmidová DNA trávena BamHI a HindiII a byla ligována do Streptomyces vektoru pIJ486 s vysokým počtem kopií (6,2 kb; Ward et al., (1986), Mol.

Gen. Genet. 203: 468 - 478). Ligační směs byla použita pro transformaci kompetentních buněk E. coli GM 2163 pro získání resistence na apramycin. Z výsledných transformantů byl izolován jeden klon obsahující kyvadlový plasmid pCEC061. Tento plasmid byl potom použit pro transformaci S. clavuligerus NRRL 3585. Výsledné transformanty se nechaly dvakrát sporulovat na neselektivním mediu a potom byly duplicitně umístěny na mediu obsahujícím antibiotikum pro identifikaci resistence na apramycin a pro identifikaci transformantů sensitivních na thiostrepton.

Pro další analýzu byly vybrány čtyři domnělé mutanty (61-1A, -2A, 3A a -4A).

Pro potvrzení toho, že tyto domnělé mutanty obsahují narušení orfupl, byla připravena genomová DNA z izolátů 61-1A a 61-2A, byla trávena Sací a byla podrobena Souther blot analýze. Výsledky Southern blot analýzy byly v souladu s dvojnásobným crossing-overem a potvrdily, že tyto mutanty skutečně obsahují narušení orfupl.

Mutanty 61-IA, -2A, -3A a -4A byly kultivovány v mediu ze sojové moučky a supernatanty kultur byly testovány HPLC na

4 4 ·4 · • · • 4 44

4 4 4 · 4 • · 4 4 4 4 • 44 44 44 444444

4 4 4 4 4 4 produkci kyseliny klavulanové a jiných klavamů. Složení media ze sojové moučky a postupu pro testování na přítomnost klavamů pomocí HPLC byly stejné, jak byly popsány dříve (Paradkar a Jensen, 1995) s tou výjimkou, že pracovní pufr pro HPLC se skládal z 0,1 M NaH₂P0₄ + 6% methanol, pH 3,68 {upraveno ledovou kyselinou octovou). HPLC analýza ukázala, že žádný z mutantů neprodukoval detekovatelné koncentrace klavam-2-karboxylatu nebo 2-hydroxymethylklavamů. Dále, když byly supernatanty kultur biologicky testovány proti Bacillus sp. ATCC 27860, za použití techniky, kterou popsali Pruess a Kellett (1983, J. Antibiot.

36: 208 - 212), neprodukoval žádný z těchto mutantů detekovatelné hladiny alanylklavamu. Naopak, HPLC testy supernatantů kultur ukázaly, že mutanty produkují vyšší koncentrace kyseliny klavulanové než přirozené organismy (tabulka 1).

Tabulka 1: Titr klavulanové kyseliny (CA) pro orfupl mutanty v kulturách

Kmen	70 hodin CA gg/ml	70 hodin CA gg/mg DNA	93 hodin CA /xg/ml	93 hodin CA /xg/mg DNA
NRRL 3585#1	87	915	166	1963
NRRL 3585#2	66	790	159	1842
61-1A	272	2894	439	6113
61-2A	199	2148	225	2928
61-3A	54	692	221	2585
61-4A	0	0	226	2422

« orfupl delece

Byly provedeny klonovací pokusy pro vyrobení genové delece 654 nukleotidů mezi AAtlI místy orfupl. PCR produkty byly

vyrobeny za použití oligonukleotidových primerů uvedených dále a výše uvedeného pCEC061 jako templátu. Původní nukleotidová sekvence byla pozměněna tak, aby obsahovala Pstl v oligo 11 a

Sphl místo v oligol4.

Pár 1 oligonukleotidů použitý k výrobě PCR produktu 1

Primer 11: 5'- dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC - 3'

Primer 12: 5'- dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC - 3'

Pár 2 oligonukleotidů použitý k výrobě PCR produktu 2

Primer 13: 5'- dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC - 3'

Primer 14: 5'- dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG - 3'

Standardní PCR reakce byly provedeny za použití PTC-200 Peltier termálního cyklovače od GRI (Felsted, Dunmow, Essex, CM6 3LD) .

PCR produkt 1 byl vyroben za použití primerů 11 a 12. Tento produkt má délku přibližně 1 kb a obsahuje karboxy-konec orfupl od druhého AatlI místa a regiony po směru kódující sekvence.

PCR produkt 2 byl vyroben za použití primerů 13 a 14. Tento produkt má délku přibližně 1,1 kb a obsahuje amino-konec orfupl od druhého AatlI místa a regiony proti směru kódující sekvence.

PCR produkt 2 byl ligován do pCR-Script Amp SK( + ) tráveného Srfl podle návodu výrobce (Stratagene Ltd., Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 4GF). Ligační směs byla použita pro transformaci Epicurian E. coli XLl-Blue MRF' Kan superkompetentních buněk (dostupných od Stratagene) pro vyvolání resistence na ampicilin (podle návodu výrobce). Plasmidová DNA • · • · « · · · byla izolována z výsledných transformantů a restrikční analýza DNA ukázala, že 7 klonů obsahuje plasmid, do kterého byl ligován PCR produkt 2. Jeden z těchto plasmidů byl označen pDESl.

PCR produkt 1 byl tráven Pstl a AatlI a vzniklá DNA byla frakcionována agarosovou gelovou elektroforesou. 1 kb fragment byl excidován a eluován z gelu pomocí Sephaglass band prep kitu (Pharmacia, St. ALbans, Herts, ALI3AW). Izolovaný fragment byl potom ligován do AatlI a Pstl tráveného pDESl. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli XLl-Blue kompetentních buněk (dostupných od Stratagene) pro vyvolání resistence na ampicilin (podle návodu výrobce). Plasmidová DNA byla izolována z výsledných transformantů a restrikční analýza DNA ukázala, že 1 klon obsahuje plasmid, do kterého byl ligován PCR produkt l. Tento plasmid byl označen pDES2.

Pro vložení pDES2 do S. clavuligerus byl plasmid dále upraven tak, aby obsahoval element rozpoznávající počátek replikace, který účinkuje v Streptomyces. Za tímto účelem byla plasmidová DNA pDES2 trávena EcoRI a HindlII a potom byla ligována do Streptomyces vektoru pIJ486 s vysokým počtem kopií (6,2 kb; Ward et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 203: 468 - 478), který byl také tráven EcoRI a HindlII. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli (JM-109) kompetentních buněk (Stratagene) pro vyvolání resistence na ampicilin. Plasmidová DNA byla izolována z výsledných transformantů a restrikční analýza DNA ukázala, že 6 klonů obsahuje pDES2 obsahující pIJ486. Jeden z těchto plasmidů byl označen pDES3. Plasmid pDES3 byl použit pro transformaci S. clavuligerus, ve kterém byl gen pro orfupl již i dříve narušen insercí genu pro resistenci na apramycin (jak je uvedeno výše). Byly selektovány transformanty resistentní na thiostrepton a tyto transformanty se nechaly 3-krát sporulovat na neselektivním mediu a vyšetřovaly se na ztrátu resistence na

• 0 • · ··· • · apramycin. Při tomto postupu bylo identifikováno 45 mutantů, které ztratily resistenci na apramycin. Tyto mutanty byly potom analyzovány HPLC, která potvrdila, že tyto kmeny, podobně jako kmeny 61-1A, 61-2A, 61-3A a 61-4A s narušeným orfupl, nebyly schopné produkovat klavam-2-karboxylát a 2-hydroxymethylklavam při kultivaci za takových podmínek, při kterých jsou tyto klavamy normálně produkovány.

B. orfdwnl a orfdwn2

Deleční/substituční mutanty orfdwnl a orfdwn2 byly vytvořeny nejprve trávením pCEC018 (7,3 kb) Ncol a uvolněním 1-kb fragmentu obsahujícího většinu orfdwnl a část orfdwn2. Fragment byl frakcionován agarosovou gelovou elektroforesou a 6,3-kb fragment byl excidován a eluován z tohoto gelu. Tento fragment byl ligován do Ncol-Ncol DNA fragmentu nesoucího apr^r a byl použit pro transformaci E.coli XLl-Blue pro získání resistence na apramycin. V tomto pokusu byl získán jeden klon, ale restrikční analýza výsledného rekombinantního plasmidu ukázala, že dvě kopie fragmentu resistence na apramycin byly ligovány do delece plasmidu. Pro eliminaci extrakopie apr^r-fragmentu byl plasmid tráven Ncol a samoligován. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli GM2163 pro získání resistence na apramycin,

Z těchto transformantů byly izolovány dva klony, které obsahovaly plasmidy pCEC052 a pCEC053, které měly oba pouze jednu kopii apr^r-fragmentu; pCEC052 obsahoval apr^r-fragment v opačné orientaci vzhledem k orfdwnl a 2, zatímco pCEC053 obsahoval apr^r-fragment ve stejné orientaci vzhledem k orfdwnl a 2.

Kyvadlový plasmid pCEC052 byl vyroben ligací BamHI-tráveného pCEC052 se stejně tráveným pIJ486 a transformací E. coli GM2163 pro vyvolání resistence na apramycin. Z tohoto pokusu byl izolován jeden klon, který obsahoval kyvadlový plasmid pCEC060.

φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ

Φ· ·· £

φφ φφφφ » φ φ φφφφ

Tento plasmid byl použit pro transformaci přirozeného S. clavuligerus 3585 pro vyvolání resistence na apramycin a thiostrepton. Výsledné transformanty se nechaly dvakrát sporulovat na neselektivním mediu a potom byly duplicitně umístěny na mediu obsahujícím antibiotikum pro identifikaci resistence na apramycin a pro identifikaci transformantů sensitivních na thiostrepton. Pro další analýzu byly vybrány tři domnělé mutanty (60-1A, -2A a 3A).

Pro určení identity těchto domnělých mutantu byla připravena genomová DNA z izolátů 60-1A a 60-2A a byla trávena Sací nebo BstEII a byla podrobena Souther blot analýze. Hybridizační proužky v tomto pokusu odpovídaly tomu, že u obou kmenů proběhl dvojnásobný Crossing-over a potvrdily, že tyto mutanty skutečně obsahují narušení orfdwnl/2.

Při kultivaci těchto mutantu na mediu ze sojové moučky a testování supernatantů kultur HPLC neprodukoval žádný z mutantu detekovatelné koncentrace klavam-2-karboxylatu nebo

2-hydroxymethylklavamu. Biologický test supernatantů kultur také neukázal žádnou produkci detekovatelných hladin alanylklavamu. Stejně jsko orfupl mutanty jsou orfdwnl/2 mutanty schopné produkce vyšších koncentrací kyseliny klavulanové než přirozené organismy (tabulka 2) .

i.-'·· ί··.· • 0 0··· • 000 0 · · ·

V* 0 ·

0 0 «0 0

000 000

0

00

Tabulka 2: Titr klavulanové kyseliny (CA) pro orfdwnl/2 mutanty v kulturách

Kmen	70 hodin CA Mg/ml	70 hodin CA p.g/mg DNA	93 hodin	93 hodin CA ^g/mg DNA
NRRL 3585#1	87	915	166	1963
NRRL 3585#2	66	790	159	1842
60-1A	164	1872	OCA u v	OQ1 1 J_
60-2A	187	2013	i n q _u v w	i aon .A. V
60-3A	79	994	214	-I Z“ Z161

orfdwn3

Pro narušení orfdwn3 byl pCEC023 (skládající se z 3,7 kb fragmentu DNA ve směru řetězce od casl subklonováného do pSLllSO) tráven Ncol a potom samo-ligován. Po transformaci E. coli ligační směsí byl izolován klon, který obsahoval plasmid pCEC031. Tento plasmid si zachoval pouze 1,9 kb NcoI-EcoRI fragmentu kódujícího část orfdwn2 a nekompletní orfdwn3. Analýza DNA sekvence ukázala, že pCEC031 obsahuje jedinečné BstEII místo v 158 bp od translačního start místa pro orfdwn3. Proto byl pCEC031 tráven BstlI, zpracován Klenow fragmentem pro vytvoření lepivých konců a potom byl ligován do kazety apramycinové resistence opatřené lepivými konci. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli GM2163 pro získání resistence na apramycin a ampicilin. Byly vybrány dva transformanty, které obsahovaly pCECOSO a pCEC05l, v příslušném pořadí. Restrikční analýza ukázala, že kazeta apramycinové resistence je orientována stejně jako orfdwn3 v pCEC050 a opačně v pCEC051. Oba tyto plasmidy byly potom tráveny KindlII a ligovány do stejně tráveného pIJ486. Ligační směsi byly potom použity pro transformaci E. coli GM2163 » · 9 9

99 99 pro získání resistence na apramycin a ampicilin. Z výsledných transformantů byly izolovány kyvadlové plasmidy pCEC056 (pCECQSO + pIJ486) a pCEC057 (pCEC051 + pIJ486). Oba plasmidy byly potom použity pro transformaci S. clavuligerus NRRL 3585.

Z každého pokusu byl vybrán jeden transformant nechal se dvakrát sporulovat na neselektivním mediu a potom byl duplicitně umístěn na mediu obsahujícím antibiotikum pro identifikaci resistence na apramycin a pro identifikaci transformantů sensitivních na thiostrepton. Z tohoto pokusu byly vybrány dva domnělé mutanty z potomstva každého primárního transformantů (56-1A a 56-3A pro pCEC056 a 57-1C a 57-2E pro pCEC057).

Pro určení identity těchto domnělých mutantů byla připravena genomová DNA z těchto kmenů a byla trávena Sací nebo Acc65I a byla podrobena Souther blot analýze. Hybridizační proužky v tomto pokusu odpovídaly tomu, že u obou kmenů proběhl dvojnásobný crossing-over a potvrdily, že tyto mutanty skutečně obsahuj í narušení orfdwn3.

Při kultivaci těchto mutantů na mediu ze sojové moučky a testování supernatantů kultur HPLC produkovaly mutanty významně redukované koncentrace klavam-2-karboxylatu nebo

2-hydroxymethylklavamu. Biologický test supernatantů kultur také neukázal žádnou produkci detekovatelných hladin alanylklavamu. Stejně jako orfupl a orfdwnl/2 mutanty jsou orfdwnS mutanty schopné produkce vyšších koncentrací kyseliny klavulanové než přirozené organismy (tabulka 3).

Claims

1. DNA obsahující jeden nebo více genů specifických pro biosyntézu 5S klavamu v S. clavuligerus, které nejsou zásadní pro biosyntézu 5R klavamu.

2. DNA zvolená ze souboru sestávajícího z

a) DNA podle nároku 1, jak je uvedena na obr. 1 (SEQ ID No: 1),

b) DNA podle nároku 1, která má sekvenci stejnou nebo v podstatě stejnou jako je sekvence uvedená na obr. 1 a označená jako orfup3, orfup2, orfupl, orfdwnl, orfdwn2 nebo orfdwn3 (SEQ ID No: 2-7),

c) DNA podle nároku 1, která má sekvenci stejnou nebo v podstatě stejnou jako je sekvence uvedená na obr. 1 označená jako orfupl (SEQ ID No: 4) a

d) DNA, která hybridizuje za podmínek vysoké přísnosti s DNA podle a) až c) výše nebo s DNA podle nároku 1.

3. Vektor zvolený ze souboru sestávajícího z

a) vektoru obsahuj ícího DNA podle nároku 1 nebo 2,

b) vektoru obsahujícího DNA podle nároku 1 nebo 2, ve kterém byl jeden nebo více genů specifických pro biosyntézu 5S klavamu narušen nebo jinak vyřazen z činosti a

c) vektoru pCEC060, pCEC061, pCEC056, pCEC057 nebo pDES3.

4. Hostitel zvolený ze souboru sestávajícího z (náhradní strana) • 4 4444

4 4 4

44 44 44

4 4 4 4 4 4

4 44 444 444

4 4 4 4

44 44 44

a) hostitele obsahujícího vektor podle nároku 3, . b) hostitele obsahujícího vektor podle nároku 3, který je schopen produkce zvýšeného množství kyseliny klavulanové,

c) hostitele obsahujícího vektor podle nároku 3, který je schopen produkce sníženého nebo žádného množství 5S klavamů a

d) hostitele obsahujícího vektor podle nároku 3, kterým je S. clavuligerus.

5. S. clavuligerus obsahující DNA odpovídající otevřenému čtecímu rámci .obklopujícímu casl, kde uvedená DNA byla narušena nebo jinak vyřazena z činnosti.

6. S. clavuligerus podle nároku 5, kde otevřeným čtecím rámcem je orfup3, orfup2, orfupl, orfdwnl, orfdwn2 nebo orfdwn3.

7. Způsob pro zlepšení produkce 5R klavamů ve vhodném mikroorganismu, vyznačující se tím, že obsahuje použití DNA podle nároku 1 nebo 2 a její vložení do uvedeného mikroorganismu.

8. Způsob podle nároku 7,vyznačuj ící se tím, že uvedeným vhodným mikroorganismem je S. clavuligerus.

9. Způsob pro zlepšení produkce 5R klavamů ve S. clavuligerus, vyznačující se tím, že obsahuje narušení nebo i jiné vyřazení DNA regionů sousedících s casl.

10. Způsob podle některého z nároků 7 až 9,vyznačuj ící se t í m, že uvedená DNA odpovídá otevřeným čtecím rámcům orfup3, orfup2, orfupl, orfdwnl, orfdwn2 nebo orfdwn3.

(náhradní strana) φφ φφφφ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφφ φ φ φφ φ φφφ φφφφ φ φ φφ φφφ φφφ φφφ · φ φφφ ·Φ φφ φφ

11. Způsob podle některého z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že uvedeným 5R klavamem je kyselina klavulanová.

12. Způsob pro identifikaci mikroorganismu vhodného pro produkci 5R klavamu ve vysokém množství, vyznačující se tím že obsahuje předběžné vyhledávání mikroorganismů s nízkou nebo žádnou produkcí 5S klavamu.

13. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že mikroorganismem je S. clavuligerus.

14. Způsob podle nároku 12 nebo 13,vyznačuj ící se tím, že 5R klavamem je kyselina klavulanová.

15. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že jeden nebo více genů specifických pro produkci 5S klavamů je defektní.

16. Mikroorganismus, který je vybrán ze souboru sestávajícího z

a) mikroorganismu, který je schopen produkce 5R klavamu a nízké nebo žádné produkce 5S klavamu, který je možno získat způsobem podle jakéhokoliv z nároků 7 až 15,

b) mikroorganismu, který je schopen produkce 5R klavamu a nízké nebo žádné produkce 5S klavamu, který je možno získat způsobem podle nároku 12, který je schopen produkce kyseliny klavulanové, ale neprodukuje klavam-2-karboxylát a/nebo 2-hydroxymethylklavam,

c) mikroorganismu, který je možno získat způsobem podle nároku 12, kterým je kmen 56-1A, 56-3A, 57-2B, 57-1C, 60-1A, 60-2A, (náhradní strana) • tt ···· • · · • tttttt • · « • · • tttt ·· tttt ·· · · tttttttt • · · · tt · · • · tttt tttttt tttttt tttttt tttt • tttt ·· · tttt tttt

60-3A, 61-1A, 61-2A, 61-3A nebo 61-4A.

17. Kyselina klavulanová, kterou je možno získat fermentací mikroorganismu podle nároku 16.

18. Kyselina klavulanová podle nároku 17, která neobsahuje nebo má významně snížený obsah klavam-2-karboxylatu.

19. Kyselina klavulanová podle nároku 18, která je ve formě draselné soli.

20. Kyselina klavulanová, která neobsahuje nebo má významně snížený obsah 5S klavamů.

21. Kyselina klavulanová, která neobsahuje nebo má významně snížený obsah klavam-2-karboxylatu.

22. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje klavulanat draselný podle nároku 19 v kombinaci s beta-laktamovým antibiotikem.

23. Prostředek podle nároku 22,vyznačuj ící se tím, že beta-laktamovým antibiotikem je amoxycillin.

24. Způsob přípravy prostředku obsahujícího klavulanat draselný a amoxycillin, vyznačující se tím, že zahrnuje produkci kyseliny klavulanové mikroorganismem podle nároku 12 a potom přeměnu na formu draselné soli a kombinování s draselnou solí amoxycillinu.